JPH06510757A - 広域スペクトル抗菌剤及びその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 広域スペクトル抗菌剤及びその利用方法この発明は、ナシ冒ナル　インスティチ １−ト　オブ　ヘルス（Ｎ　Ｉ　Ｈ）によって承認されているグランドナンバー Ａｌ−２２９３１なる番号のもとにて政府の支持によってなされた。

発　明　の　利　用　分　野 本発明は一般に殺菌性の化合物に関するものである。特に作用スペクトルが広く 、トリプトファンに富むイントリジジンと呼ばれるペプチドに関するものである 。

発　明　の　背　景 感染性の疾病は、ヒトにおいても動物においても疾患および死亡の主な原因にな っている。たとえば８百万から１子方人がこれまでにＡＩＤＳウィルスに感染し ており、さらに１９９０年だけで見ると２６３．０００人が新たに感染したと報 告されている。ＡＩＤＳウィルスに感染したヒトの多（は、さらにムＺ茗ｌアル ビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉΩ皿）のような日和見感染にかかり、これ が皮膚粘膜上のカビによる感染症を引き起こしている。これ以外の微生物感染症 にはたとえば、Ｅ、　ｅｏｌｉによる下痢症があり、これは汚染された食品や飲 料を摂取することで引き起こされる。先進国から開発途上国を訪れる旅行者の４ ０％から５０％が　・この感染症にかかつている。淋病はグラム陰性のバクテリ アの感染によって引き起こされるが、アメリカでは１９９０年に７千１万５千例 以上の報告があり、アフリカでは毎年、人口１０万人あたり３千人から１万人が 新たに淋病と診断されている。

抗生物質に抵抗性を示すストレイン（ｓｔｒａｉｎｓ）は、Ｅ、　ｃｏｌｌだけ でなくその他のバクテリア、ウィルス、カビなどの病原性微生物にもあり、その 抵抗性ゆえにこれらによって引き起こされる疾病の治療は困難でかつ高額になる 。もともと抗生物質によって治療できる疾病であっても、抗生物質を保管、貯蔵 しておく設備がないところでは、特に低開発国のような場合、疾病が風土病であ ることが多いので、抗生物質を使って感染症徹者を有効に治療することが難しく なる。

を椎動物においては、多形核白血球、すなわち好中球と顆粒球とが感染症との闘 いにおいて中心的な役割を果たす。これらの白血球には膜に結合した原形質顆粒 があり、ここにさまざまな殺菌性の化合物が貯蔵されている。感染がおこると好 中球は侵入してきた微生物を膜結合型の小胞に飲み込む。するとこれらの小胞は 原形１［顆粒と融合し、顆粒中のトキノ７ノクな内容物にこれらの微生物をさら す。このような微生物を殺す顆粒球の作用機構のひとつとして、天然に存在する 抗生物質として作用する一連のペプチドがある。これらのペプチドは一般にカチ オ／性で、そのトキノンティーはさまざまな微生物の細胞膜に作用し、膜の浸透 性を高めることによるものである。

２種類の殺菌性ペプチドがこれまでに顆粒球から単離されている。バクテネンノ （ｂａｅｔｅｎｅｃｉｎｓ）はＧｅｎａｒｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、５７：　３＋４２−４６　＜１９８９１、Ｒn ｎｅｏ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３：　９５７３ −７５　（１９８８）、およびＭａｒｚａｒｉ　ｅｔ　ａｌA、　Ｉｎ ｆｅｅｔ、Ｉｍｍｕｎ、　５６：　２＋９３−９７　（１９８ｇ）に記載されて おり、プロリンとアルギニンｌ：富んだペプチドで、分子量は１，６００ダルト ンから８，０００ダルトンの範囲にあり、顆粒タンパク質抽出物に対して作成し たモノクローナル抗体との反応性を使って部分的に同定されている。バクテネン ノはカビとグラム陰性／＜クチリアに対するトキ／ティーを示し、幾分弱いなが ら、グラム陰性のバクテリアに対するトキ／ティーもある。

ディフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）は１５種類のペプチドからなる化合物の 一族であり、さまざまな種の好中球に含まれる細胞性タンパク質の５％から１８ ％を占める。このクラスの分子はＧａｎｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　 ）ｌａｅｗｏｔｏｌ、　４４：　Ｉ−８（１９９０）、　Ｌｅｈｒｅｒ　Ｃ４ａ ｌ、、　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、　４５４３２５２．５ ｅｌｓｔｅｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃ煤A１ｍ５ｕ ｎ、　４５：　１５０−＋５４　Ｌ１９δ４）に記載されている。デイフエンシ ノベブチドは２９個から３４個のアミノ酸から成っており、４個から１０個のア ミノ酸残基はアルギニンである。さらにディフェノ／ノベブチドは、すべて７ス テイン残基が共通でコン叶−ヴ（ｅｏｎｓｅｒｖ＋Ｊ）されており、この部分が 分子内ジスルフィド結合に関与している。ディフェンシンはグラム陰性およびグ ラム陽性１（クチリア、ならびにカビやある種のエンヴエローブウィルス（ｅｎ ｖｅｌｏｐｅｄ　ｖｉｒｕｓｅｓ）に殺菌性を示す。

天然に存在する抗生物質ペプチドは、もし利用できれば合成抗生物質を適用でき ない感染性疾もの治療に対して利用価値がきわめて高いが、バクテネシンやディ フェンシンの膏用性にはさまざまな制限がある。たとえば、バクテネシンもディ フェンシンも免疫原性があり、それゆえこれらの化合物を用いる治療はアナフィ ラキンーや遅延型過敏症反応を引き起こすおそれがある。ディフェンシンはまた 、ユ上■匹で哺乳動物の細胞に対してかなりの細胞毒性を示すこともわかってい る。さらに、活性なディフェンノン分子は分子内の３箇所にジスルフィド結合を 有するため、活性なディフェンシンを合成するには適切なジスルフィド結合を作 らなければならず、その合成収率は低くなる。

このような理由から、活性体の合成が容易であって、広範囲のスペクトルの微生 物に効果があり、望ましくない副作用がない有効な殺菌性ペプチドの需要がある わけである。本発明はこれらの要求を満たし、関連する利点も合わせもつもので ある。

発　明　の　要　約 本発明は、トリプトファンに富み、殺菌活性を有するペプチドから成る広域スペ クトル殺菌剤を提供するものである。本発明はまた、微生物の増殖を殺菌的なら びに静菌的に阻害する方法を提供するものである。その方法には微生物の増殖を 維持できる環境に、殺菌あるいは静菌的に有効な量だけトリプトファン−リッチ な殺菌性ペプチドを投与する段階が含まれる。

図面の簡単な説明 第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、インドリンジンの精製を示したものであ る。

第１Ａ図は、ウソの好中球から抽出した顆粒を、バイオゲルＰ−６０（Ｂｉｏ　 Ｇｅｌ　Ｐ−６０）を用いて実施例Ｈに記載したような方法でクロマトグラフィ ー分離したところである。ピーク６から得られたペプチドは、実施例ｎに記載し たように、凍結乾燥後、０．１％ＴＦＡを含む水−アセトニトリルグラジェント 系でＲＰ−ＨＰｌ、Ｃを用いて精製を行った（挿入画参照）。ブラケットは集め たピーク部分を示している。

第】８図は、第１Ａ図の挿入図に示したＲＰ−ＨＰＬＣから得られたペプチドを 実施例■に示したようにして０．１％ＴＦＡ含有水−アセトニトリル溶媒系で二 度目のＲＰ−ＨＰＬＣを行うことによって詳細に分析したものである。

第１Ｃ図は、第１Ａ図に示したＲＰ−ＨＰＬＣで得られたペプチドを実施例■に 示したようにして０．１３％ＨＦＢＡ含有水−ア七ト二トリル溶媒系で二度目の ＲＰ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃを行うことによってさらに詳細に分析したものである。

第２図は、好中球の顆粒抽出物および精製インドリンジ／のア／ドーウレアＰＡ ＧＥを示している。この１２．５％アクリルアミドゲルは、直接溶解するか（レ ーン１）、あるいは最初に２ｍＭのＤＦＰで処理するか（レーン２）したｌ。

５ＸＩ０７個の好中球から得た顆粒抽出物をロードしたものである。；レーン３ はＰ−６０カラムを用いたカラムクロマトグラフィーのビーク６から得られた４ ゜３μｇのインドリンジンをロードしたものである。：レーン４は２．９μｇの ＲＰ−ＨＰＬＣ精製イ精製インドリ／ジードしたものである。

第３Ａ図及び第３Ｂ図は、インドリ／）ンの抗菌活性を示したものである。

第３Ａ図は、実施例■に記載したように、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＬ−３５（・印） またはＳ、　ａｕｒｅｕｓ　（△印）を０から２５μｇのインドリンジンととも にインキュベートしたものである。殺菌力は常用対数で表したコロニー形成ユニ ｙ）（ＣＦＵ）が、緩衝液ならびにインドリ／ジン希釈液として使用する０、０ １％酢酸の適当量のみを含むコントロールインキュベー／ヨ／に比べてどれだけ 減少したかで表現している。

第３Ｂ図は、実施例■に記載したように、Ｅ、　ｃｏｌｉを２５μｇ　／　ｍ　 Ｉのインドリ／ジンとともに最長４０分までインキュベートし、等間隔にＣＦＵ を測定してインドリ／ジンの殺菌作用のキネティックスを決定したものである。

発明の詳細な説明 本発明は広域スペクトルの抗菌剤を提供するものである。またこれらの抗菌剤を 、微生物増殖を阻害または抑制するために利用する方法を提供するものでもある 。ひとつの実施例では、本発明による抗菌剤はウソの好中球顆粒から単離精製さ れた１３個のアミノ酸から成るペプチドである。そのペプチドはトリプトファン とプロリンに富んでおり、カルボキン末端がアミド化されている点に特徴がある 。このペプチドはインドール−リッチで、殺菌性があるため、このような性質を 持つ化合物という意味を込めてイントリジジン（ｉｎｄｏｌ＋ｅｉｄｉｎ）と名 付けた。このインドリンジンのさらなる特徴は、免疫原性が低いことである。ホ ストに免疫反応を起こすことなく治療に利用できるところが抗菌剤イントリジジ ンの利点である。

この明細書の中で「トリプトファン−リッチ」という言葉は抗菌剤にアミノ酸で あるトリプトファンが多く発現しているという意味で使用している。タン／（り 質中の個々のアミノ酸の含有率は２０個の天然に存在するアミノ酸それぞれによ って異なっており、なかでもトリプトファンは最も出現頻度が少ないアミノ酸で ある。たとえばタンパク質中のトリプトファンの平均出現傾度は約１％であるが 、同じアミノ酸であるアラニンは一般にタンパク質中に約９％はど出現する。た とえばＣ１ａｐｐｅｒ、　Ｍ、Ｒ，、Ｂｌｏｃｈｅ＋＋、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　 Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｅ、　７ｇ＋ｌ０１８−１０２４．　４！９V７）参照 のこと。これ以外のアミノ酸にもそれぞれに個有の出現頻度がある。しかしなが ら数多くの例の中には、あるアミノ酸だけがあるタンノ（り質中、あるいはタン ノ４り質のあるドメインに多く発現していることもある。あるアミノ酸がどれく ら（１多く発現するかはタンパク質、あるいは調べられたドメインの大きさによ って（飄ろいろ変化しうる。たとえばあるアミノ酸残基がタンノ＜り質全体では けっして多く発現しているわけではなくても、単離したドメインだけ見るとかな り多（１ように見えることもある。トリプトファン−リッチな抗菌タン／（り質 中に見（萌されるトリプトファンの含有率は一般に約２０％以上あり、望ましく は約３０％以上である。トリプトファン−リッチなタンパク質の実例としてＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ：　１で表されるインドリンジンタンパク質があり、そのトリプ トファン含有率は約３８％である。

この明細書の中で「実質的に同じシーケンス」というときは、ペプチドのシーケ ンスがＳＦ、０１０　ＮＯ：　１で表されるトリプトファン−リッチなペプチド とまったく同じか、あるいはかなりの相同性（ｈｏｍｏｌｏｒｙ）を持って℃λ ると（１うことを意味する。ごく限られた構造上の修飾ならばそれによってペプ チドの機能を高めることができると考えてよい。同様にまた、ごく限られた構造 上の修飾ならばペプチドの生物学的な機能を損なうことがないということ、なら びに、全体の一次構造のある部分だけが活性発現にとって必要であることなども 知られている。たとえばアミノ酸シーケンスのマイナーな修飾によって、その活 性が完全になくなってしまわない場合には、そのような修飾はいまの定義に該当 し、そのような活性を示すものとしてクレームした化合物の範囲に含まれる。構 造上の修飾にはたとえば、アミノ酸残基の付加、削除、および置換のほか、アミ ノ酸の構造または機能をミミック（閣１組ｃ）　した化合物による置換や、アミ ７基やアセチル基のような官能基の付加なども含まれる。修飾は意図して行うこ ともあれば、たとえば抗菌活性を有するトリプトファン−リッチなペプチドを産 生ずるホスト側に突然変位が起こるというような偶発的な原因によることもある 。抗菌活性が失われない限り、そのような修飾はすべて本発明の範囲内で許され るものとする。

この明細書で「抗菌活性」とは、化合物が微生物の増殖を阻害または不可逆的に 抑制することを意味する。そのような阻害あるいは抑制は、殺菌作用ないしは静 菌作用によって行われる。それゆえここで言う「殺菌的阻害作用」とは、抗菌剤 が標的となる微生物を殺すかあるいは回復不能な損傷を与えるという意味である 。またここで言う［静菌作用Ｊという言葉は、抗菌剤が標的となる微生物を殺す ことなくその増殖を阻害するという意味である。殺菌作用ないしは静菌作用は現 に微生物が増殖している環境（すなわち治療目的の処置の場合）または微生物が 増殖するおそれがある環境（すなわち予防的処置の場合）のいずれにも適用され うる。

この明細書中で用いられている「微生物の増殖を維持することができる環境」と いう言葉は、微生物が増殖できるかまたは微生物が存在できるような液体、物質 ないしは生物を意味する。そのような環境としては、たとえば動物の組織または 体液、水およびその他の液体、食物、食品、ないしは食物エキス、穀物、および ある種の無機物質が挙げられる。そのような環境中では微生物の増殖が必ず促進 されなければならないというごとでは決してなく、単に微生物が生存できるとい う書味である。

本発明は抗菌作用を示すトリプトファン−リッチなペプチドを含む広域スペクト ル抗菌剤を規定するものである。本発明による抗菌剤はＳＥＱ　ＩＤ　１１０： 　１で表されるペプチドと実質的に同じアミノ酸シーケンスを持っている。ここ に記載されている広域スペクトルの抗菌剤は、たとえばウシの好中球顆粒から単 離精製することができる。他の細胞成分や顆粒成分を除去してペプチドを単離す る方法については実施例Ｉに詳しく記載しである。加えて、実験手順を変更ある いは修正してｉｎ　ｖｉｖｏでの顆粒球の産生を増加させ、それによってイント リジジンペプチドの収率を上げることも可能である。そのような変更ないし修正 には、たとえばホストとなる生物に、グラニュロサイトーコロニーステイミュレ イテイングファクタ−（ｇｒａｎｕ！ｏｅｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ　ｓｔｉｍｕｌ ａｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　：　Ｇ−ＣＳＦ）のようなある種の成長因子を投与 して顆粒球の増殖を促進することなどがある。

トリプトファン−リッチな抗菌ペプチドは、当業者には既知の合成法によって化 学的に合成することもできる。それにはＭｌｌｌｉｇｅｎ、　Ｍｏｄｅｌ　９０ ５０　（Ｍｉｌｌｌｇｅｎ、ｋｌｉ１１ｉｆｏｒｄ０Ｍ＾）のような自動ペプチ ドシンセサイザーを使用し、ポリエチレングリコール−ポリスチレングラフト樹 脂（ＰＥＧ−ＰＳ）上にてＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸を反応させて合成するのが好 ましい。ペプチドアミドリンカ−（ＰＡＬ）のような適当なり７カーを使って、 たとえばカルボキシアミド末端を合成することができる。

抗菌活性を示すトリプトファン−リッチなペプチドのアミノ酸シーケンスはＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ・１と表される。当業者に知られている他の抗菌ペプチドと異な り、このインドリンジンペプチドはトリプトファン残基に富んでおり、またトリ プトファンはどではないにしてもプロリン残基にも富んでいる。このペプチドは １３個のアミノ酸残基から成り、見かけの分子量は約２０００ダルトンである。

１３個のアミノ酸残基のうち５個がインドール環を持つトリプトファンで、３個 がプロリンである。このペプチドのこの他の特徴はカルボキシ末端にアルギニン を持つことである。

ペプチドの活性は、−次構造を修飾しても修飾次第では完全にはなくならないよ うにできることが知られている。そのような修飾としては、カルボキシ末端のア ミドやアルギニン残基を除去することなどがある。さらにはトリプトファン残基 のインドール環を含む側鎖を酸化して、ひとつまたはふたつ以上のインドール誘 導体に導き、しかも生じるペプチドが充分な抗菌活性を維持し、微生物増殖を阻 害するようにもできる。さらにこれ以外の修飾を施したペプチドも当業者には合 成できるであろう。そのようにして合成したペプチドが抗菌活性を維持している か、あるいは増強しているかは以下に述べる方法で調べることができる。このよ うなわけで、イントリジジンペプチドの薬効はアミノ酸シーケンスや構造をいろ いろ変えることによって調節することができる。

本発明は、グラム陽性バクテリアやグラム陰性バクテリア、菌類、およびウィル スなどに対して抗菌活性を示す広域スペクトル抗菌剤を提供することを目的とす る。ここに記載するトリプトファン−リッチなペプチドが予想を越える優れた性 質を示すことから、このペプチドは当業者に既知の従来からある抗菌ペプチドと は異なる作用機構を持ち、より広い活性スペクトルを示すことが示唆される。

インドール環を含む側鎖が多く、それが膜に馴染みやすい性質を持つものである ことを勘案すると、インドリ／ジンペプチドの抗菌活性は、それが標的細胞のエ ンヴエローブに作用する機能に由来すると想像することができる。トリプトファ ン−リッチなペプチドの抗菌活性は、たとえばス　フィロコツカス　アラレラス トなどのような多様な微生物に対して有効である。ウィルス、特にエンヴエロー プウィルスのような他の微生物の増殖もトリプトファン−リッチな抗菌剤によっ て阻害することができる。当然、このトリプトファン−リッチな抗菌剤は他の種 の微生物も同じように阻害すると期待することができる。

本発明はまた、微生物増殖を維持できる環境中において殺菌または静菌的に微生 物増殖を阻害する方法を提供することを目的とする。その方法には、抗菌活性を 示すトリプトファノーリノチなペプチドを環境中に有効量投与する段階が含まれ るっ ここに記載するトリブトファノーリノチなペプチドは微生物の増殖を抑え、ある いは予防するためにさまざまな手法で用いることができる。そのような手法とし ては、微生物の生存を完全に、かつ不可逆的に阻害する増殖の殺菌的阻害と、微 生物の増殖だけを阻害する静菌的阻害とが含まれる。いずれの作用機構も微生物 の増殖を抑え、あるいは予防するのに有効である。

トリプトファン−リッチな抗菌剤は、たとえば治療薬、食品の防腐剤あるいは消 毒剤として使用することができる。特に治療薬としての用途には、たとえば抗バ クテリア、抗かび、抗ウィルス剤としての用途がある。このペプチドは種々の生 理的バッファーのどれかに混ぜてヒトまたは動物に投与することができる。その ようなバッファーとしてはイオン強度が低い中性ｐＨの１０ｍＭリン酸ナトリウ ムのような溶液が好ましい。しかしほかのいろいろなパラファー中でも同じよう に強い殺菌活性や静菌作用の大部分がそのまま保持される。そのようなバッファ としては、たとえばリン酸バッファー生理食塩水、通常の生理食塩水、およびク レブスリノゲル液などがある。さらに、カルシウムやマグネシウムのような二価 カチオンはディフェンノン抗菌ペプチドの働きを阻害することが知られているが 、インドリ／ジンペプチドの抗菌活性はこれらによって阻害されない。このよう なわけで、もし微生物増殖を治療目的で抑えるに当り、これらのカチオンが有効 ならばインドリンジンペプチドのプレパレーシ璽ンにこれらのカチオンを加えて も差し支えない。他の化合物または組成物もイントリジジンペプチドの抗菌活性 をさらに増強するために一緒に投与することができる。たとえばバクテネシン（ ｂａｅｔｅｎｅｃｉｎｓ）　、デイフエンノン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）　、ある いは抗生物質をインドリンノンペプチドと一緒に投与することができる。ＥＤＴ Ａのような微生物の膜を破壊する化合物も一緒に投与することができる。

ペプチドはたとえば静脈内注射や腹腔内注射、経口投与、あるいはエアロゾルス プレィ組成物の薬剤形態ででも被験者に投与することができる。ペプチドを含む リビドヴエンクル（ｌｉｐｉｄ　ｖｅｓｉｅｌｅｓ）またはりピドエマルジッン （ｌｉｐｉｄ　ｅ璽ｕｌｓｉｏｎ）のブレバレー／ｇンもペプチドをヒトや動物 に投与するのに用いることができる。投与方法は標的とする病原菌によって変え るべきものである。当業者には個々のケースにどの方法が最も適しているかわか るであろう。

インドリ／ジンペプチドは防腐剤または殺菌剤として食物および食品を処理する のに使うこともできる。たとえば貝類および鳥肉製品では、通常腸内細菌が繁殖 しており、これがヒトに重篤な病気を引き起こす場合がある。果物や野菜、穀類 などの作物もインドリ／ジンペプチドで処理することにより、微生物によって被 る収穫の後での損傷を減少させたり、または完全になくしたりすることができる 。ペプチドはたとえば局所的に投与することもできるが、リコンビナントのペプ チド（ｒｅｅｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ）をトランス’；　ｘ　二ｙり （ｔｒａｎｓｇｅｍｉｅ）に発現させてもよい。トランスジェニ、りな発現は当 業者には既知の手法であり、ここに記載したトリプトファン−リッチなペプチド （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２）をコードする核酸さへ与えられれば容易に実現でき る。

さらにまた、インドリンジンペプチドは消毒剤として消毒用に、あるいは無菌状 管を維持するために使用することもできる。本質的に微生物の繁殖が望ましくな いどのような製品においても、たとえば動物またはヒトに接触する可能性のあル 物などは、インドリンジンペプチドで処理して微生物が増殖するのを防ぐことが できる。そのような製品としてはたとえば、あかちゃん用の布巾、おむつ、バン ドエイド、タオル、化粧品、洗眼液、コンタクトレンズ洗浄液などがある。イン ドリンジンペプチドは局所的に、また適当なバッファーに溶かして投与すること ができる。

上述のどの用途においても効果的な投与量は、樟的となる病原菌の種類と感染の 種度、あるいは菌の繁殖の程麿によって変わってくる。病原菌の繁殖をアンタゴ ナイズするように抗ｍ剤を用いようとする場合には高濃度で使用する必要がある 。典型的な投与量は約１０　’ｃｅｌｌｓ／ｍｌのＥ、　ｃｏＨの増殖を阻害す るためには約０゜５から５００μｇ／ｍｌであり、好ましくは約１から１０μｇ 　／　ｍ　１である。そして約２から５μｇ／ｍｆのペプチドを投与することが より好ましい。インドリ／ジンペプチドは他の菌、たとえばＳ、　ａｕｒｅｕｓ ％Ｃ，ａｌｂｉｅａｎｓ％Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＣ，ｎｅｏｆ ｏｒｓａｎｓに対しても同様な効果がある。病原菌の量に多少があればそれに応 じて投与量を加減すればよい。ここに記載した内容を見れば当業者ならば目的と する用途にどのくらいの量のペプチドを用いれば良いかわかるであろう。

あるいは実施例■に記載の方法に従って効果的な投与量を決定することができる であろう。

以下の実施例は本発明を具体的に説明するためのものであって、発明の範囲を制 限するためのものではない。

実　施　例　Ｉ この実施例は、インドリ／ジンペプチドのウシ顆粒球からの精製について示すも のである。

純度９７％以上のウシ顆粒球は新鮮な血液から、本質的には以下に述べるＣ１ｒ ｌｓｏｎ　ａｎｄ　Ｋａｎｅｅｋｏ、　Ｐｒｏｅ、　Ｓｏｅ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｍｅｄ、　１４２：８５３−１１５６　（１９７３）■■@にし たがって精製した。なお、この文献は参照としてこの明細書に組み入れられる。

抗凝固剤としてクエン酸塩化した５００ｍ１のウシの血液を、７００Ｘｇで４０ 分遠心する。赤血球を含むカラムを集め、蒸留水を加えて低張性にし、これを１ ２０Ｘｇで１５分遠心して顆粒球を集める。この処理を２回繰り返し、赤血球を 完全に除去する。顆粒球を２０ｍ１の［Ｉａｎｋｓ　ｂａｌａｎｃｅｄ　５ａｌ ｔｌ　（ＨＢ　Ｓ　Ｓ　）に懸濁する。実験によっては顆粒球をセリンプロテア ーゼインヒビターであるジイソプロピルフルオロフ者スフエート（ＤＦＰ）の２ ｍＭのＨｓｓｓ溶液で５分間処理する。

顆粒に富む半細胞状態（ｓｕｂｃｅｌｌａｌａｒ）のフラクンｇンは、Ｂｒｒｅ ｇａｒｄ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９７＋５２−６１　（１９ｇ３）に従ッテ、鑑 別遠心の後、ナイトロジエ７　＋　ヤピテー７ｇン（ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｃａｖ ｉｔａＮｏｎ）によって得られる０なお、この文献は参照としてこの明細書に組 み入れられる。顆粒球をＨＢＳ　Ｓに懸濁し、窒素ボンベ中にて一定に撹拌しつ つ、窒素ガスで２０分間、７５０ｐ８目こ加圧する。キャビチーシランは水冷し た容器に向けて２分かけて一度に圧を抜くことによって行う。

低速遠心で細胞残渣を除いた後、上澄みにある顆粒を４℃で２０分間、２７，０ ００Ｘｇで遠心沈降させて集め、−８０℃で保存する。顆粒は典型的には平均４ ×１０９個のＰＭＮを含むｌリットルのつ／の血液から調製される。

ｔｘｔｏｌｅから５×１０１′１個のＰＭＮから集めた顆粒はｉｏから５０ｍ１ の水冷した１０％酢酸（ｐＨ＜３）で抽出し、１８時間、溶解しつつある氷の中 で撹拌する。懸濁液は２７，０００Ｘｇで遠心してクリアーにし、上澄ろを凍結 乾燥する。凍結乾燥した酸抽出物はｌ×１０１′１個の細胞に相当し、これを２ ０ｍ１の５％酢酸に溶解し、４℃で５％酢酸と平衡させた４、８ｘｌｌＯｃｍの バイオゲルＰ−６０カラム（ＢｉｏＧｅｌ　Ｐ−６０ｃｏｌｕｍｎ　：　Ｂｉｏ Ｒａｄ　Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｓｏｎｄ、　Ｃ＾）にかけて分 画した。カラムは２５ｍ１／時間で溶出させ、２８０ｎｍで連続的にモニターし た。第１Ａ図は、Ｐ−６０カラムから溶出されるタンパクの分画パターンを示し たものである。インドリ／ジンは最後のビーク（ビーク６）にあり、排除体積（ ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）の５．９倍の溶出容積をもっている。ビーク６の溶出 容積は総体積を５０％近く越えており、これはペプチドがゲルマトリックスと強 く帽互作用していることを示すものである。

ビーク６のペプチドは凍結乾燥し、ｌＸ２５ｃｍのバイダｙりＣ−１８ＣＶｙｄ ａｃ　Ｃ−１８：　Ｔｈｅ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ、　Ｈｅ５ｐ ｅｒｉａ、　Ｃ＾）カラム上にて、逆相の高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ− ＨＰＬＣ）で精製した。カラムは０．　１％のトリフルオロｆＦ酸（ＴＦＡ）を 含む水−アセトニトリルグラノエント溶媒系を使って３．０ｍｌ／時間で溶出さ せた。グラジェントは０％から３０％アセトニトリルまで５分間で上げ、つづい て３０％から４５％アセトニトリルまで３０分間で上げた。第１Ａ図の挿入図は 、ビーク６のインドリ／ノンを含むペプチドが、ＨＰＬＣカラムからジノグルビ ークとして溶出したところを示したものである。約１゜５ｍｇのインドリンジン が、ｌＸｌ０”個の細胞に相当するつ／顆粒球の抽出顆粒から精製できる。

実　施　例　■ 本実施例は、Ｐ−６０カラムで得られたインドリシジンベブチドプレバレー／ヲ ノのキャラクタリゼー／ヨンについて述べたものである。

ＲＰ　−＋（Ｐ　Ｌ　Ｃで／ングルピークが得られたことからインドリシジンブ レパレー／ヲンが比較的純粋であることが示唆される（第１Ａ図における挿入画 参照）。

ブレバレー／Ｗンの均一さは、さらに二度目のＲＰ−ＨＰＬＣを行って確認する ことができる。あるプロトフールでは、−回目のＲＰ−ＨＰＬＣで得られたイン ゛トリ／ジンフラクン曹７を０．４×２５ｃｍのバイダックＣ−１８ＣＶｙｄｓ ｃ　Ｃ−１８）カラム上、Ｏ１％のＴＦＡを含む水−アセトニトリル溶媒系を使 って分析した。

１０μｇのインドリシジンフラク／３ノを、流速１　ｍ　ｌ　１分で、２０分間 にアセトニトリル２０％から４０％までグラジェントをかけてクロマトグラフィ ーを行った。第１Ｂ図に示すように、イノトリジジンがシングルビークとして溶 出している。

二番目のプロトコールでは最初のＲＰ−ＨＰＬＣで得られたインドリシジンフラ クシ碧ンを０．１３％のへブタフルオロブチリ１クアンド（ＨＦＢＡ）を含む水 −アセトニトリル溶媒でＩＸ２５ＣｍのバイダックＣ−１８カラムにかけて分析 した。１０μｇのインドリシジンフラクン璽ンを３０分間に３０％から６０％ま でのグラジェントをつけて流速１ｍｌ／分でクロマトグラフィーを行った。この 場合もインドリンジンはシングルビークとして溶出した。

ＲＰ−ＨＰＬＣで精製したインドリンジンはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ ＰＡＧＥ）によっても純度を確認することができる。イントリジジンは１２゜５ ％アクリルアミドゲル上でアンドウレア−ＰＡＧＥを行い、クマージーブル−（ Ｃｏｏ冒ａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色をするとシングルバンドとして現れる（第 ２図におけるレーン４）。顆粒を単離するときＤＦＰを用いようと用いまいと同 様のバンドパターンが得られることから、インドリジノンは単離操作の間に起こ るプロテオリティックなデグラデー／ツン（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ　ｄｅｇｒ ａｄａｔｉｏｎ）の産物ではないことがわかる（第２図におけるレーン１と２を 比較することによる。）。イントリジジンの見かけの分子量は５ＤＳ−ＰＡＧＥ で決定したところでは約２０００ダルトンである。

ＲＰ−ＨＰＬＣで精製したイントリジジンのアミノ酸分析は、Ｂｉｄｄｉｎｇ曹 ｅｙｅｒ　ｅｔ　ｅｌ、、　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　３３６：９３−１ ０４　（１９８４）の方法を使って、気相で塩化水素（ＨＣｌ）で加水分解物と した後、フェニルチオカルバミル誘導体として測定を行った（２４時間、１１０ ℃）。なお、この文献は参照としてこの明細書に組み入れられる。簡単に述べる と、５μｇのインドリンジンサンプルを沸騰するＨＣｌ中で加水分解した後、Ｍ ＣＩを真空下で除去する。加水分解されたサンプルはエタノールニトリエチルア ミン：水：フェニルインチオシアネート（７：１：１：ｌ）を含む試薬をｔＩＪ 、することによって誘導体に導かれる。室温にて２０分インキュベートした後、 アミノ酸誘導体の相対的な量比を分析用のＲＰ−ＨＰＬＣを用いて決定した。イ ンドリ／ジンは、最低ふたつのアルギニンと三つのプロリン、ひとっのインロイ シン、ひとつのロイシン、およびひとつのリジンからなる組成を持っている。

トリプトファンは、Ｅｄｅｌｈｏｅｂ、　Ｂｉｏｅｂｅｍｉｓｔｒｙ　６：１９ ４ｇ−１９５４（１９６７困記述されているように、６Ｍ塩酸グアニジン塩、２ ０ｍＭのリン酸ナトリウム塩（ｐＨ６゜５）として分光学的な方法で決定した。

なお、この文献は参照文献としてこの明細書中に組み入れられる。インドリンジ ンはｌリジン残基当り４．６個のトリプトファンを含んでいる。

インドリンジンの組成はＡＢ＋モデル　４７５Ａ装置（ＡＢＩ　Ｍｏｄｅｌ　４ ７５＾１ｎ８ｔｒｕｌｅｎｔ：　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ｌｎ ｅ、、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を使って自動アミノ酸シーケンス分 析を行って確認した。ペプチドはトリプトファン残基を、酸加水分解物として検 出した８個以外にさらに５個含んでいた。

カルボキン末端の状態は、カルボキンペプチダーゼＹ　（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ ｔ　Ｃｏ、、　Ｒ。

ｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）　、およびカルボキシペプチダーゼＢ　（Ｂｏｅｒｉｎｇ ｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｗｔｅａｌｓ、Ｉｎｄｌａｎａｐｏｌｉ ｓ、ＩＮ）で酵素分解して調べた。カルレボキン末端蓚こアルギニンのアミドが あることは、インドリンジンを３０分間、ＰＭＳＦで処理したカルボキシペプチ ダーゼＢとインキュベートしたとき、カルボキン末端のアルギニンカ（遊離して こないことから初めて示唆された。カルボキンペプチダーゼＹを使ったときはア ルギニンが遊離するが、これはおそらく、この酵素のブレ／くレー／日ンにはし ばしばトリプノン様のエンドペプチダーゼまたはアミダーゼカジコンタミするの で、その活性によるものであろう。

カルボキンアミドが存在することは、ＪＥＯＬ　ＨＸｌｏｏ　ＨＦ　ダブルフオ ーカンノグ　マグネティックセクター　マススペクトロメーター（ＪＥＯＬ　Ｈ Ｘｌｏｏ　［ＩＦ　ｄｏｕｂｌｅ　ｆＯｃｕｓｓＩｎｇ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　５ ｅｃｔｏｒ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｅｔｒｏｍｅｔａｅｒ）を加速電圧５　ｋ　u。

ノミナルレゾリ、Ｓ−ンヨン（ｎｏｍｉｎａｌ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）をａｏ ｏｏ＋こ設定し、アトムボンバートメメトマススペクトル（ａｔｏｍ　ｂｏｍｂ ａｒｄｍｅｎｔ　ｍａｓｓ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）をＩＮ１定することに よって初めて確認できた。凍結乾燥したインドリンジンを５％酢酸に溶解し、ス テンレス製のステージに載せる。５ｋｅＶのキセノン原子ビームラ当ててサンプ ルをイオン化する。スペクトルを記録し、ＪＥＯＬ　ＤＡ５０００データンステ ム（ＪＥＯＬ　ＤＡ５ＱＯＯｄａｔａ　ｓｙｓｔｅｍ）を使って１ノアルタイム でマスをアサインした。プロトン化した分子イオンの単一同位体質量は１９０６ ．２４に観測され、これはフリーアシッドについて計算した値１９０７．０４よ り０．８μｍＵだけ小さかった。さらに、Ｃ末端フラグメントはすべてＣ末端が アシッドになっているとして計算した値より１マスユニツト（會ａｓｓ　ｕｎｉ ｔ）だけ小さかった。これらのデータから、インドリンジンは親ペプチドのアミ ン末端とカルボキシ末端の両方がプロセノンングを受けて生成したものであると 考えられる。

このようにして決定したインドリシジンペプチドの構造はトリデカペプチドアミ ドであり、シーケンスリストにＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　Ｉと表されている。この 構造ゆえにこのペプチドは免疫原性が極端に低いのである。２０回におよぶ実験 のうち、このペプチドに対する抗体が生じたことは一度もなかった。シーケンス ンミラリテイーサーチ（ｓｅｑｕｌｅｅｅ　５１ｍ１ｌａｒｉｔｙ　５ｅａｒｃ ｈ）を行ってペプチドの構造をさらに詳しく分析した。このサーチは、非−リダ ンダントＢＬＡＳＴＰデータベース（ｎ。

ｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ　ＢＬＡＳＴＥＰ　ｄａｔａ　ｂａｓｅ）を使って行っ た。インドリジノンよりはるかに大きなタンパクの構造中に最大６アミノ残基ま での一致が見られたが、それらのタンパクの機能はインドリンジンに関係がない か、あるいは機能が特定されていないかのいずれかであった。

実　施　例　■ この実施例は、イントリジジンの抗菌活性を示している。

イントリジジンの抗菌活性のタイムコース（作用時間）、およびドースディベン ゾン／−（容量依存性）はグラム陰性バクテリアストレインである玉ヱ五ユ±− −ユ４　ＭＬ３５　（Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａｅｏ　ＭＬ３５）％およびグラム 陽性バクテリアストレインである二ノ力ス　アウレウス　５０２　Ａ　（Ｓｔａ 　ｈ　ｏｃｏｅｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　５Ｏ２Ａ）を使って決定した。アッセイ は、５ｅｌｓｔｅｄ　ｅｔ　ａｌ、、　ＩｎｆｅｃｔＩｌｕｎ。

４Ｓ：１５０−１５４　（１９８５）に従って１０ｍＭ、ｐＨ７，４のリン酸ナ トリウムバッファー中、３７°Ｃにて行った。なお、この文献は参照文献として この明細暑中に組み入れる。どちらの菌も低濃度のインドリンジンにきわめて敏 感であった。２×１０６個のコロニーを生じる対数増殖期のバクテリアをＯから ２５μｇ／ｍｌのインドリンジンとともに２時間インキュベートした後、階段希 釈法を施し、寒天培地に植え付ける。ｌＯμｇ　／　ｍ　Ｉのインドリンジンと インキユベートしたものでは生菌率が対数値で４からそれ以上減少していた（第 ３Ａ図参照）。Ｅ　ｅｏｌｉはＬ」当よりも抗菌作用を受けやすく、植え付けた 菌の９６％以上が、２．５μｇ／ｍｌのインドリンジンと２時間インキュベート することにより死滅した。０．０１％までインドリ／ジンの濃度を下げた酢酸溶 液はどちらの菌種に対しても無効であった。

殺菌作用のキネティックスは２ＸＩＯ’個のＥ、　ｃｏ■を２５μｇ／ｍｌのイ ンドリ／ジンとともに１から４０分間インキコベートして測定した。Ｅ、　ｅｏ ■のコロニー形成能は５分以内に対数値で３はど減少した。２５μｇ／ｍｌのイ ントリジジン存在下にて２０分間インキコベートすることにより、培地は事実上 殺菌された（第３Ｂ図参照）。

本発明は現在までにわかっている好ましい実施例を引用しながら説明したが、当 業者には本発明の範囲内でさまざまな修飾や変更ができることを理解しておかな ければならない。したがって本発明は請求の範囲によってのみその範囲が制限さ れるものである。

シーケンスリスト （１）ジェネラル　インフォメーシ冒ン（１）　出願人：セルステブド、マイケ ル　イー。

（■）　発明の名称：広域スペクトル抗菌剤及びその利用方法（０１）　連続番 号：１ （ｉｖ）　通信のための住所 （Ａ）宛先：ブレティー、シュローダ−、プルエツジマン及びクラーク （Ｂ）通り名：４４４　Ｓｏ、フラワーストリートスート　２０００ （Ｃ）車名：ロサンゼルス （Ｄ）州名：カリフォルニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９００７１ （Ｖ）　コンビ二一タのり−タフルフォーム（Ａ）メディアムタイブ：フロッピ ーディスク（Ｂ）フンピニータ：ＩＢＭＰＣコンパチブル型（Ｃ）オペレーティ ングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）ソフトウェア：パチンティ ン　レリース　＃１．　０゜バージラン　＃１．　２５ （ｖｉ）　カレント　アブリケーンツン　データ（Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼： （Ａ）　氏名：　４−ヤンベル、キャスリン（Ｂ）登録番号：３１，８１５ （Ｃ）参照／書類番号：Ｐ３１　８９６３（１買）　過信情報 （Ａ）電話：　６１９−５３５−９００１（Ｂ）ファックス：６１９−５３５− ８９４９（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１に関する情報（１）　シーケンスの特 徴 （Ａ）長さ：１３個のアミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：線形 （Ｈ）　分子の型：ペプチド （買１）　シーケンスの表示：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ｅｚｖ 舟３吟閏ζ分） もホ晴間　（分２ 第２図 ・・ イシドリシジンｆ奴ｇ／ｒｎｌＬツ インちＩべ−１−Ｌ、ｆ’Ｑ晴ｈｎ　Ｃ分ン

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．抗菌活性を有しトリプトファン−リッチのペプチドを含むことを特徴とする 単離された広域スペクトル抗菌剤。
2. ２．前記広域スペクトル抗菌剤がさらに、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ペプチドと実 質的に同一の配列及び同ペプチドと同一の抗菌活性を有することを特徴とする請 求の範囲第１項記載の広域スペクトル抗菌剤。
3. ３．前記広域スペクトル抗菌剤がさらに、プロリン−リッチのペプチドを含むこ とを特徴とする請求の範囲第１項記載の広域スペクトル抗菌剤。
4. ４．前記広域スペクトル抗菌剤がきらに、カルボキシル末端がアミドになってい る化合物を含むことを特徴とする請求の範囲第１項記載の広域スペクトル抗菌剤 。
5. ５．前記トリプトファン−リッチのペプチドが低免疫原性であることを特徴とす る請求の範囲第１項記載の広域スペクトル抗菌剤。
6. ６．前記抗菌活性が、グラム陽性のバクテリア、グラム陰性のバクテリア、カピ 、及びウイルス類からなるグループから選択される菌類に対して有効であること を特徴とする請求の範囲第１項記載の抗菌剤。
7. ７．前記菌類がＳ．アウレス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｉｉ） 、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｓ．タイフィムリウム（Ｓ．ｔ ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、及びＣ．ネオフォーマンス（Ｃ．ｎｅｏｆｏｍａｎｓ ）からなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第６項記載の抗 菌剤。
8. ８．抗菌活性を持つトリプトファン−リッチのペプチドを、殺菌あるいは静菌を 行うのに有効な量だけ環境中に投与することによって環境中における菌類の生育 を殺菌的に阻害あるいは静菌的に阻害する方法。
9. ９．前記トリプトファン−リッチのペプチドがさらに、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１ ペプチドと実質的に同一の配列及び同ペプチドと同一の抗菌活性を有することを 特徴とする請求の範囲第８項記載の阻害方法。
10. １０．前記トリプトファン−リッチのペプチドがさらに、カルボキシル末端がア ミドになっている化合物を含むことを特徴とする請求の範囲第８項記載の阻害方 法。
11. １１．前記トリプトファン−リッチのペプチドがさらに、プロリンに富んだペプ チドを含むことを特徴とする請求の範囲第８項記載の阻害方法。
12. １２．前記トリプトファン−リッチのペプチドがさらに、低免疫原性であること を特徴とする請求の範囲８項記蔵の阻害方法。
13. １３．前記トリプトファン−リッチのペプチドがさらに、グラム陽性のバクテリ ア、グラム陰性のバクテリア、カビ、及びウイルス類からなるグループから選択 される菌類に対して有効であることを特徴とする請求の範囲第８項記載の阻害方 法。
14. １４．前記菌類がＳ．アウレウス、Ｅ．コリ、Ｃ．アルビカンス、Ｓ．タイフィ ムリウム、及びＣ．ネオフォーマンスからなるグループから選択さ札ることを特 徴とする請求の範囲第１３項記載の阻害方法。
15. １５．前記環境が、ヒトあるいは動物であることを特徴とする請求の範囲第８項 記載の阻害方法。
16. １６．前記環境が、食物及び食物生産物であることを特徴とする請求の範囲第８ 項記載の阻害方法。
17. １７．前記環境が、水分供給源であることを特徴とする請求の範囲第８項記載の 阻害方法。
18. １８．前記環境が、菌類の生育が望ましくない無生物物質であることを特徴とす る請求の範囲第８項記載の阻害方法。
19. １９．前記有効量が、０．５から５００μｇ／ｍｌの間の最終濃度であることを 特徴とする請求の範囲第８項記載の阻害方法。