KR100831633B1 - Ｆｐｒ 계열 수용체 매개 신호전달에 대하여 길항작용 하는펩티드 - Google Patents

Ｆｐｒ 계열 수용체 매개 신호전달에 대하여 길항작용 하는펩티드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 FPR 계열 수용체의 활성을 저해하는 데 유용한 W-풍부 펩티드에 관한 것이다.
FPR 계열 수용체, W-풍부 펩티드

Description

ＦＰＲ 계열 수용체 매개 신호전달에 대하여 길항작용 하는 펩티드{PEPTIDES THAT ANTAGONIZE FPR CLASS RECEPTOR MEDIATED SIGNALING}
본 발명은 환자의 면역 또는 염증 반응을 억제하는 분자의 발견과 관련된 것이다. 본 발명은 또한 신경변성 질병 (neurodegenerative disease)의 치료와 관련된 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 FPR 계열 수용체 (FPR class receptor)와 상호작용하는 분자와 관련된 것이다.
FPR (Formyl peptide receptor) 계열 수용체는 G-단백질과 결합되어 있고, 주화성유인물질 (chemoattractant)인 fMLP에 결합하는 7 개의 막통과 수용체이며, 단핵세포 주화성(chemotaxis)과 숙주 면역반응을 병원체로 유도하는 것에 관여한다. 원형 FPR 계열 수용체인 FPR는 fMLP에 높은 친화성으로 결합하고, 낮은 fMLP 농도에 의하여 활성화된다. fMLP에 의한 FPR의 결합은 MAP 키나아제 활성화 및 유전자 전사뿐만 아니라 포식성 세포 부착, 주화성, 산소 중간체(oxygen intermediates),방출, 포식성 증진 및 박테리아 사멸 등을 유발하는 G 단백질 매개 신호 반응을 유도한다.
FPRL1 (Formyl peptide receptor like 1)은 전형적인 주화성유인물질 수용체, 즉, 7 개의 G 단백질 결합 막통과 수용체 중 하나이다. FPRL1은 처음에는 인 간 FPR cDNA 프로브와의 엄한 정도가 낮은 혼성화 (stringency hybridization)에 의하여 FPR 상동체(homolog)로서 클로닝되었다 (1). FPRL1는 아미노산 수준에서 FPR과 69%의 서열 상동성을 갖는다 (1). FPR은 포식성 세포에 제한되어 발현되지만, FPRL1은 식세포, 상피세포, 내피세포, 간세포 및 성상세포종 (astrocytoma) 세포 등을 포함하는 다양한 세포 유형에서 발현된다 (2-5). 이와 같이 광범위한 수용체 발현 스펙트럼은 FPR1이 다양한 세포 반응의 조절에 관여할 수 있음을 나타내는 것이다.
FPRL1은 식세포의 활성을 조절함으로써 면역 반응의 조절에 중요한 역할을 한다 (6). 박테리아 주화성 포르밀 펩티드에 결합 가능한 FPR 계통의 일원으로서, FPRL1은 병원체 감염에 대항하는 숙주의 방어 기작에 관여할 것이라고 간주된다 (6, 7). 특히, FPRL1는 식세포 주화성을 매개한다고 보고되어 있으며 (8, 9), FPRL1의 활성화는 인간 호중구에서의 세포외유출 (exocytosis) 및 과산화물의 생성을 초래하는 것으로 나타났다. HIV-1 감염의 조절과 관련하여, FPRL1은 바이러스 감염의 공수용체(co-receptors)로서 작용하는 중요한 케모카인 수용체를 탈감작화시키거나, 선천성 면역 및 이의 획득성 면역으로의 전이를 강화시켜, HIV-1 감염을 감쇠시키는 것으로 보고되어 있다 (10). CCR5와 CXCR4는 인산화 의존 기작에 있어서 FPRL1 활성화에 의하여 탈감작화된다 (10). FPRL1는 면역계 뿐aks 아니라 신경세포계에서도 중요한 작용을 한다. FPRL1는 아밀로이드증 및 신경변성 질환과 같은 몇 가지 질병 상태에 중요한 영향을 미친다 (11, 12). FPRL1은 또한 알츠하이머병 환자의 뇌조직에 침윤되는 단핵 식세포에서 고도로 발현되는 것으로 나타났다 (12). FPRL1은 또한 프리온 질병(prion diseases)의 염증전 상태 (pro-inflammatory aspects)에 관여하는 것으로 생각된다 (13).
최근 들어, 몇 가지 신규한 FPRL1 작용제(agonist)가 동정되었다. 이러한 FPRL1 작용제에는 LL-37, 호중구 과립 유래 카테리시딘 (cathelicidin)의 효소적 절단 단편, 및 NADH 탈수소효소 서브유닛 I로부터 절단된 미토콘드리아 펩티드 단편 MYFINILTL (SEQ ID NO:1)과 같은 숙주 유래 작용제 등이 있다 (8, 14). HIV 외피 단백질에서 유래하는 일부 펩티드 또한 FPRL1에 결합하는 것으로 나타났다 (15-17). HIV-1의 gp41로부터 유래하는 펩티드들 중에서, T21/DP107가 FPRL1의 효과적 리간드인 것으로 나타났다 (15). F 펩티드 및 V3 펩티드라고 명명된 두 개의 상이한 펩티드 또한 FPRL1 작용제이다 (16, 17). 무작위 펩티드 라이브러리 (Baek et al.)로부터, 효과적 백혈구 자극 펩티드인 Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Met-CONH2 (WKYMVM, SEQ ID NO:2)를 분리하고, 'Seo et al.'에 의하여 펩티드의 C 말단에 있는 L-메티오닌을 D-메티오닌으로 치환하여 변형시킴으로써, 보다 효과적인 리간드인 Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-CONH2 (WKYMVm, SEQ ID NO:3)를 생산하였다 (18, 19). 최근 들어, 'Le et al.'에 WKYMVm (SEQ ID NO:3)이 FPRL1의 효과적 펩티드 리간드인 것으로 보고되어 있다 (20).
정상 생리적 반응에 있어서, 포식성 세포는 조직 손상 부위로 보충되어야 한다. 보충된 세포들은 병원체를 공격하거나 손상된 세포들을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 그러나, 감염 부위로 보충되는 포식성 세포가 과다하면, 몇 가지 부작용을 초래하는데, 이러한 부작용에는 예컨대 조직 손상 및 염증 질병이 있다 (21).
대부분의 작용제가 복잡한 세포 반응을 이에 특이적인 세포 표면 수용체를 통하여 조절하는 많은 세포 신호를 유도하기 때문에, 특정 수용체에 대하여 선택적인 길항제를 개발하는 것이 항염 분자를 생성하기 위한 유효한 접근이다. FPRL1의 관점에서, 상기 수용체는 포식성 세포의 감염 부위로의 보충에 중요한 역할을 하고, 몇 가지 FPRL1 작용제가 보고되어 있기는 하지만, FPRL1의 길항제에 대해서는 보고된 바가 없다. FPRL1의 생리적 및 병리적 증상에 있어서의 역할을 밝히기 위하여, 특정 FPRL1 길항제가 매우 유용할 것이다.
발명의 요약
FPRL1에 대한 리간드로서 알려진 것들 중에서, WKYMVm (SEQ ID NO:3)는 FPRL1 길항제 스크리닝의 측면에서 몇 가지 장점을 갖는다. 상기 펩티드는 효과적 식세포 보충 활성을 가지며, 6 개의 아미노산으로 구성된 소펩티드이다. 헥사펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의하여, 전통적인 주화성유인물질 수용체인 FPRL1의 펩티드 길항제를 동정하였으며, 요오드 표지된 WKYMVm (SEQ ID NO:3)가 FPRL1에 결합하는 것을 억제하는 펩티드를 동정하였다. 상기 펩티드는 FPRL1 유도 세포 신호 및 세포 반응을 차단하였다.
FPRL1의 활성화는 숙주 방어 기작에 있어서의 염증 반응과 신경변성 장애와 밀접하게 연관되어 있다. 본 발명의 펩티드 중에서, Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-CONH2 (WRWWWW, WRW4, (SEQ ID NO:4))는 WKYMVm (SEQ ID NO:3)가 FPRL1에 결합하는 것을 억제하여 세포간 칼슘 ([Ca2+]i) 증가를 완전히 억제하는 것과 관련하여 가장 효과적인 활성을 보였다. WRW4 (SEQ ID NO:4)는 또한 WKYMVm (SEQ ID NO:3)에 의한 세포의 주화성 이동과 ERK의 활성화를 억제한다. FPR 계통에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4)의 수용체 특이성과 관련하여, WRW4 (SEQ ID NO:4)는 FPRL1 작용제 (MMK-1, 아밀로이드 β42 (Aβ42) 펩티드, F 펩티드)에 의하여 [Ca2+]i 증가를 특이적으로 억제하지만, FPR 작용제 (fMLF)에 의하여는 그렇지 않다. 내부 FPRL1 리간드 유도 세포 반응에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4)의 효과를 조사하기 위하여, 이의 인간 호중구의 Aβ42 펩티드에 대한 효과를 측정하였다. WRW4 (SEQ ID NO:4)는 또한 Aβ42 펩티드 유도 과산화물 생성 및 호중구의 주화성 이동을 억제하고, 뿐만 아니라, 인간 대식세포에서의 Aβ42 펩티드의 내재화(internalization)를 완전하게 억제한다.
본 발명은 W-풍부 폴리펩티드와 이의 보존적 변이체 또는 기능적 단편에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 약 4 내지 15개의 아미노산, 4개 내지 10개의 아미노산, 4 내지 7개의 아미노산 또는 6 개의 아미노산을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 35 또는 7로 표현되는 것일 수 있다. 특히, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30로 표현되는 것일 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27로 표현되는 것일 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 25로 표현되는 것일 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 16, 18, 20, 21 또는 22로 표현되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 4, 16, 18 또는 20로 표현되는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NOS: 4 또는 16로 표현되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, W-풍부 펩티드 작용유사체 (W-rich peptide mimic)가 제공된다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 환자의 염증을 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기된 W-풍부 폴리펩티드 또는 W-풍부 펩티드 작용유사체를 이를 필요로 하는 환자에게 염증 예방을 위한 유효량으로 제공하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 환자의 관절염을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 폴리펩티드 또는 상기 W-풍부 펩티드 작용유사체를 이를 필요로 하는 환자에게 염증 예방을 위한 유효량으로 제공하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 환자의 자가 면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 폴리펩티드 또는 상기 W-풍부 펩티드 작용유사체를 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량으로 제공하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 Aβ42가 인간 호중구에 결합하는 것을 예방하는 방법에 관한 것으로, 호중구를 상기 폴리펩티드 또는 상기 W-풍부 펩티드 작용유사체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 폴리펩티드 또는 상기 W-풍부 펩티드 작용유사체를 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 FPR 계열 수용체 길항제를 동정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 FPR 계열 수용체를 갖는 세포를 준비하고; 상기 세포를 길항제 후보 화합물과 접촉시키고; 상기 후보 화합물이 FPR 계열 수용체에 결합하고 그 활성을 억제할 때, 상기 후보 길항제 화합물을 길항제 화합물로 동정하는 단계를 포함한다. 상기 FPR 계열 수용체는 FPRL1일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 폴리펩티드 또는 상기 W-풍부 펩티드 작용유사체를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 목적과 또 다른 목적들은 하기하는 발명의 상세한 설명, 첨부된 도면 및 청구의 범위에서 보다 상세하게 설명될 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명에 있어서, 'a'와 'an'은 단수와 복수를 모두 의미하는 것으로 사용된다.
본 명세서에 사용된 바로서, '약' 또는 '실질적으로'는 일반적으로 정확한 숫자에 의한 한정에 여지를 제공하기 위한 것이다. 예컨대, 폴리펩티드 서열의 길이를 나타내는 문장에 사용되는 경우, '약' 또는 '실질적으로'는 폴리펩티드는 기재된 아미노산 개수에 한정되지 않음을 나타내는 것이다. 결합 활성 등의 기능적 활성이 존재하는 한, N-말단 또는 C-말단에 첨가되거나 제거된 약간의 아미노산이 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, '담체(carriers)'는 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제로서, 사용된 농도 및 용량에서 상기 물질에 노출된 세포 또는 포유류에 대하여 독성이 없는 것을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 수용성 pH 버퍼 용액인 경우도 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예로서 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같은 버퍼; 아스코르브산 등의 항산화제; 저분자량 폴리펩티드 (약 10 잔기 이하); 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 폴리머; 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린과 같은 단당류, 이당류 또는 기타 탄화수소류; EDTA와 같은 킬레이팅제; 만니톨 또는 소르비톨 등의 당알코올; 소듐 등의 염 형성 카운터이온; 및 또는 TWEEN_, 폴리에틸렌글리콜 (REG) 및 PLURONICS_와 같은 비이온성 계면활성제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 바로서, "유효량(effective amount)"은 이롭거나 소망하는 임상적 또는 생화학적 결과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 유효량은 1회 또는 2회 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 억제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 완화, 개선, 안정화, 역전, 감속화 또는 지연시키기에 충분한 양이다. 본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, '유효량'은 FPR 계열 수용체 및 이의 작용제의 결합을 억제할 수 있는 화합물의 양으로서 정의된다. 바람직하게는, FPR 계열 수용체는 FPRL1이다.
본 명세서에 사용된 바로서, 'FPR 계열 수용체 길항제 (FPR class receptor antagonist)'는 FPRL1과 같은 FPR 계열 수용체에 특이적 및 길항적으로 결합하는 화합물을 의미하는 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 FPR 계열 수용체에 특이적 및 길항적으로 결합하는 능력을 보유하는 것으로 용이하게 알 수 있는 길항제에 대한 변이체들도 범위에 포함된다.
본 명세서에 사용된 바로서, '리간드'는 폴리펩티드와 같은 분자에 공유적 또는 일시적으로 특이적으로 결합하는 모든 분자, 작용제 또는 화합물을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바로서, 치료 대상으로서의 "포유류"는 포유류로 분류된 모든 동물을 의미하는 것으로, 인간, 가축 및 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물, 또는 애완동물 등을 포함하며, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 등이 있다. 바람직하게는, 상기 포유류는 인간이다.
본 명세서에 사용된 바로서, '정제된 (purified)' 또는 '분리된 (isolated)' 분자는 천연 환경으로부터 제거되어 분리 (isolated 또는 separated)되고, 원래 결합되어 있던 다른 성분들로부터 유리된 생물학적 또는 합성 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바로서, "특이적 결합 (specifically binds)"은 두 분자간, 예컨대, FPR 계열 수용체에 결합하는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 작용유사체 간의 무작위적이지 않은 결합을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바로서, "환자 (subject)"는 척추동물, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바로서, "치료(treatment)"는 유익하거나 소망하는 임상적 결과를 얻기 위한 접근을 의미한다. 본 발명에 있어서, 유익하거나 소망하는 임상적 결과는, 탐지 가능하건 가능하지 않건 간에, 증상의 개선, 질병의 정도의 경감, 질병 상태의 안정화 (악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 감속화, 질병 상태의 완화 또는 개선 및 진정 (부분적 또는 전체적으로)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우 예측된 경우와 비교하여 생존 기간을 연장시키는 것을 의미하기도 한다. "치료"는 치료적 처치 및 예방 또는 방지 조치를 모두 의미한다. 질병의 "완화(Palliating)"는 질병 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후를 경감시키거나 및/또는 진행의 시간추이를 치료하지 않은 상태와 비교하여 감속화시키거나 지연시키는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바로서, 'W-풍부 펩티드 (W-rich peptide)'는 올리고펩티드로서, 4 내지 15개의 아미노산 길이일 수 있으며, 아미노산 함량 중 적어도 50% 이상이 트립토판 (L-형 및 D-형 모두 포함)인 것을 의미한다. 또한, W-풍부 펩티드는 FPR 계열 수용체에 대한 길항제이고, 보다 구체적으로, FPRL1 수용체이다.
FPR 계열 수용체에 결합하는 길항제의 스크리닝
한 구체예에 있어서, 본 발명은 작용제가 FPR 계열 수용체에 결합하는 것을 억제하는 폴리펩티드, 펩티드 작용유사체 또는 화학적 화합물 등의 화합물에 대한 스크리닝에 관한 것이다. 상기 억제 화합물이 신경변성 장애 또는 다른 일반적인 염증 증상과 같이 FPR 수용체의 자극에 적어도 일부 기인하는 질병을 앓고 있는 환자를 치료할 것이 기대된다.
파아지 디스플레이 라이브러리 또는 화학적 라이브러리를 포함하는 다양한 라이브러리를 FPR 계열 수용체에 결합하여 작용제에 의한 활성화를 억제하는 화합물의 스크리닝에 사용할 수 있다. 또 다른 접근에 의하여, 분자들의 무작위 라이브러리를 FPR 계열 수용체를 발현하는 세포에 접촉시키고, 다양한 검정법을 이용하여 FPR 계열 수용체의 작용제 활성화를 억제하는 화합물을 동정한다. 또 다른 접근으로서, 두 개의 하이브리드 시스템 (예컨대, 효모 또는 포유류의 두 개의 하이브리드 시스템)을 사용하여, FPR 계열 수용체의 활성화를 억제함으로써, 자가 면역 질환을 치료하고, 염증과, 류마티스 관절염 및 골관절염 등의 관절염과 같은 염증, 및 알츠하이머병을 포함하는 신경변성 질환과 관련된 질환을 예방하는 화합물을 동정하는 것이다. 이들 접근들 중 많은 것들은 고처리율 검정법에 의하여 수행될 수 있다.
또한, FPR 계열 수용체의 추가적 길항제 화합물의 동정을 가능하게; 하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 또한 자가면역질환, 알츠하이머병과 같은 신경변성 질환을 치료 및/또는 예방하고, 염증 및 류마티스 관절염 또는 골관절염과 같은 염증에 의하여 기인하거나 그 결과인 증상의 예방 또는 경감 방법이다. 한 접근은 이론적 약물 설계의 기술의 사용을 수반한다. 따라서, 컴퓨터를 사용하여 상동성 검색, 단백질 모델링 및 복합 화학에 기초하여 동정된 길항제 화합물과 유사한 분자, 및 상기 분자의 단편 또는 유도체를 설계 및 생성할 수 있다. 예컨대, 상동 리간드를 동정하기 위하여, W-풍부 펩티드에 대응하는 핵산 서열 또는 단백질 서열, 또는 상기 분자의 단편 또는 유도체를 포함하는 데이터베이스를 상기 서열을 공지되거나 상업적으로 입수 가능한 데이터베이스의 다른 서열과 비교하는 검색 프로그램을 사용하여 분석한다. 다른 이론적 접근으로서, 단백질 모델링에 사용되는 기술 (예컨대, x-선 결정학, NMR, 및 컴퓨터 모델링)을 사용하여 길항제 화합물 모델을 구축할 수 있다. 이러한 모델로부터, 이론적 약물 설계를 완성할 수 있다. 또한, FPR 계열 수용체를 포함하는 단백질 모델을 생산하고, 리간드 결합 부위를 동정하고, 보다 확실한 길항제 후보 화합물을 이론적으로 설계하는 데 이러한 정보를 이용 수 있다.
일단, 길항제 후보 화합물을 설계하고 생산하면, 이들의 FPR 계열 수용체에 결합하여 작용제가 FPR 계열 수용체에 결합하는 것을 억제하는 능력을 평가하는 것이 바람직하다. 길항제 후보 화합물 또는 길항제 화합물의 FPR 계열 수용체와 상호작용하고, 이로 인하여 FPR 계열 수용체의 활성화를 억제하고, 그 결과 염증의 완화시키는 능력을 평가하는 접근은 주화성 검정법 및 Ca+2 이동 검정법과 같은 다양한 검정법을 사용하여 수행할 수 있다.
FPR 계열 수용체에 결합하는 길항제
길항제 화합물은 상기 화합물이 작용제가 FPR 계열 수용체와 결합하는 것을 감소시키고 상기 수용체의 활성화를 방지하는 한, 경합적, 비경합적(non-competitive) 또는 무경합(uncompetitive) 억제 등의 모든 생화학적 또는 효소적 억제 동력학에 의하여 작용제와 FPR 계열 수용체 (예컨대, FPR 또는 FPRL1) 간의 상호작용을 감소시킬 것으로 생각된다. 대표적인 폴리펩티드를 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다:
FPR 계열 수용체 길항제
길항제
W R W W W W (SEQ ID NO:4)
R R W W W W (SEQ ID NO:5)
R H W W W W (SEQ ID NO:6)
D R W W W W (SEQ ID NO:8)
(D/R/W) (H/K/R) R W W M (SEQ ID NO:12)
(D/R/W) (H/K/R) R W W W (SEQ ID NO:13)
(D/R/W) (H/K/R) W W W M (SEQ ID NO:14)
(D/R/W) (H/K/R) W W W W (SEQ ID NO:15)
w W R W W M (SEQ ID NO:16)
W W R W W W (SEQ ID NO:17)
W W R W W M (SEQ ID NO:18)
w W R W W W (SEQ ID NO:19)
W W W W W M (SEQ ID NO:20)
W W W W W R (SEQ ID NO:21)
W W W R W W (SEQ ID NO:22)
L W W W W W (SEQ ID NO:23)
R W W W (SEQ ID NO:24)
R W W M (SEQ ID NO:25)
W W W W (SEQ ID NO:26)
L R W W W W (SEQ ID NO:27)
W W W W R W (SEQ ID NO:28)
W W W W M R (SEQ ID NO:29)
W W W M (SEQ ID NO:30)
W W W W W W (SEQ ID NO:31)
W W W W W w (SEQ ID NO:32)
W R R W W W (SEQ ID NO:33)
W R W W (SEQ ID NO:34)
W W W w (SEQ ID NO:35)
R W W w (SEQ ID NO:36)
W R W (SEQ ID NO:7)
"W"는 L-아미노산을 나타내고, "w"는 D-아미노산을 나타냄.
리펩티드 변형체 (Variants) 및 돌연변이체 (Mutant)
FPR 계열 수용체의 유도를 증진 또는 억제 ("변조")시킴으로써, 신호 전달, 백혈구 이동, 면역계 반응 및 염증 반응 등과 같은 세포 반응을 선택적으로 변경시킬 수 있다. 본 발명의 구체예들은 FPR 계열 수용체의 유도를 변조시키는 분자를 사용하는 것을 포함한다. 본 명세서를 통하여, "FPR 계열 수용체(FPR class receptor)"는 fMLP에 의하여 활성화될 수 있고, FPR 및/또는 FPRL1과 적어도 80% 이상의 상동성을 갖는 수용체를 의미한다.
길항제 폴리펩티드의 특성을 개선시키거나 변조시키기 위하여, 아미노산 공학이 사용될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 결실, 부가 또는 융합 단백질을 포함하는 신규한 돌연변이체 폴리펩티드를 제작할 수 있다. 또한, 특히 짧은 펩티드의 경우에는 화학적 합성에 의하여 유사한 돌연변이체 폴리펩티드를 제작할 수 있다. 이러한 변형된 폴리펩티드는 예컨대 증가/감소된 활성 또는 증가/감소된 안정성을 나타낼 수 있다. 또한, 이들은 높은 수율로 정제할 수 있으며, 적어도 특정 정제 및 저장 조건하에서 대응하는 천연 폴리펩티드보다 우수한 가용성을 나타내는 것일 수 있다.
W-풍부 펩티드와 유사한 길항제 화합물 및 상기 분자의 단편 또는 유도체 (예컨대, W-풍부 펩티드 작용유사체)는 천연에서 발견되는 W-풍부 펩티드, 이의 단편 또는 유도체의 모든 또는 일부 아미노산 서열을 1차적인 아미노산 서열로서 포함하는 분자들 뿐 아니라 무증상 변화를 초래하는 범위 내의 아미노산 잔기가 기능적으로 등가인 아미노산 잔기로 치환되어 있는 변형된 서열을 포함하는 것일 수도 있다. W-풍부 펩티드, 이의 단편 또는 유도체의 서열 내의 하나 이상의 아미노산은 기능적 등가물로서 작용하는 유사한 극성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 무증상 변화를 일으킬 수 있다. 상기 서열 내의 아미노산에 대한 치환기는 상기 아미노산이 속하는 계열의 다른 아미노산들로부터 선택된 것일 수 있다. 예컨대, 비극성 (소수성) 아미노산에는 알라닌, 루신, 이소루신, 발린, 푸롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌 등이 있다. 무전하 극성 천연 아미노산에는 글라이신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민 등이 있다. 양전하로 하전된 (염기성) 아미노산에는 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘 등이 있다. 음전화로 하던된 (산성) 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산 등이 있다. 방향족 아미노산에는 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신 등이 있다. 본 발명의 다른 측면에 있어서, 예컨대 인산화, 글리코실화, 교차 결합, 아실화, 단백질 분해 절단, 항체 분자, 멤브레인 분자 또는 다른 리간드와의 결합 등과 같은 번역 동안 또는 번역 후에 상이하게 변형된 W-풍부 펩티드, 이의 단편 또는 유도체가 포함된다.
따라서, W-풍부 펩티드, 이의 단편 또는 유도체에 대응하는 단백질 서열을 알려진 서열과 비교할 수 있다. 상기 길항제 후보 화합물은 W-풍부 펩티드에 대하여 다음과 같은 정도의 상동성을 갖는 것일 수 있는데, 예컨대: 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%. 50% 이상의 상동성을 갖는 길항제 후보 화합물을 동정하고 이어서 길항제 화합물 특성 검정법을 사용하여 시험한다. 그리고 나서, FPR 계열 수용체, 특히 FPRL1 수용체의 작용제 활성화를 억제하여 자가 면역 질환, 또는 신경변셩 질환을 치료 및/또는 예방하거나, 염증 및 이와 관련된 다양한 질환을 예방 또는 경감시킬 수 있는 길항제 화합물을 동정할 수 있다.
작용 유사체( mimetics )
본 발명에 사용가능한 펩티드는 또한 변형될 수 있으며, 예를 들면, 펩티드는 펩티드에 정상적으로 발견되지 않는 치환체를 포함하거나, 정상적인 펩티드에서 발견되기는 하나, ㅊ정상적인 펩티드 위치에서는 발견되지 않는 치환체를 가질 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 사용가능한 펩티드는 아세틸화, 아실화, 아민화될 수 있다. 상기 펩티드를 변형시키는 치환체들이 상기 펩티드에 포함될 수 있으나, 수소, 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 방향족, 에테르, 에스테르, 치환 또는 치환되지 않은 아미, 아미드, 할로겐 또는 치환 또는 치환되지 않은 설포닐 또는 5원 또는 6월 사슬형 또는 방향족 고리들을 포함하나 이에 한정되는 것을 아니다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항 화합물(antagonist compound)", "길항제(antagonist agent)" 또는 "길항 펩티드(antagonist peptide)"는 3차원적 또는 2차원적인 구조가 변형된 또는 변형되지 않은 W-풍부 펩티드, 이들의 단편 또는 유도체와 유사한, 변형되거나 변형되지 않은 펩티드, 및 화학제 또는 펩티드 작용유사체를 의미한다. "W- 리치(rich) 펩티드 작용 유사체(W-rich peptide mimetics)"는 W-풍부 펩티드와 유사한(resemble) 길항 화합물이다. W-풍부 펩티드 작용유사체는 펩티도미메틱(peptidomimetics), 펩티드, 변형된 펩티드, 및 유도체 펩티드일 수 있으며, 따라서 길항 화합물의 클래스에 속하는 물질이다.
추가적인 길항 화합물 유도체로는 목적 폴리펩티드와 유사한 펩티도미메틱을 포함한다. 펩티드의 생물학적 생산에 사용되는 천연 아미노산은 모두 L-형(configuration)이다. 합성 펩티드는 L-형 아미노산, D-형아미노산 또는 상기 두가지 형태를 갖는 다양한 아미노산의 조합을 이용하여 종래의 합성방법으로 제조할 수 있다. 예컨대 올리고펩티드등의 특정 펩티드의 형태(conformation) 및 바람직한 특징을 모방하고, 일단 발견이 된다면, 바람직하지 못한 특성, 예컨대 유연성(flexibility)(형태 상실) 및 결합 분해특성을 가지고 있지 않는 합성 화합물이 펩티도미메틱(peptidomimetics)로 알려져 있다.
일반적으로, 펩티도미메틱의 고안 및 합성은 바람직한 펩티드(예,가장 가능성이 큰 가상 펩티드)의 3차원 구조(conformation)자료 (예, 결합길이 및 각도 등과 같은 기학학적 자료) 및 펩티드의 서열로 시작하고, 상기 자료를 이용하여 펩티도미메틱으로 반드시 고안되어야 하는 기하학적 특성을 결정하는 것을 포함한다. 상기 단계를 수행하는 다양한 방법과 기술이 알려져 있다((예., Farmer, P. S., Drug Design, (Ariens, E. J. ed.), Vol. 10, pp. 119-143 (Academic Press, New York, London, Toronto, Sydney and San Francisco) (1980); Kemp, D. S., "Peptidomimetics and the Template Approach to Nucleation of.beta.-sheets and alpha.-helices in Peptides," Tibech, Vol. 8, pp. 249-255 (1990).
본 발명의 일예에서, 펩티드 작용유사체는 펩티드 인식자리에 의해 인식되는 비-펩티드 리간드(non-peptide ligand)로 정의한다. 상기 펩티드 작용유사체는 구조적으로 상기 펩티드와 다를 수 있다. 펩티드 작용유사체의 잘 알려진 예는 몰핀이다. 천연 오피오이드 알칼로이드는 사람 신체에 존재하는 펩티드인 β-엔돌핀의 작용유사체이다. 펩티드 작용유사체의 상기 정의가 비-펩티드성 리간드로서 작용유사체를 특징화하는 것인 반면에, 천연 아미노산으로 구성된 실제 펩티드와 펩티드 작용유사체간에 어딘가에 많은 구조가 존재한다. 이러한 정의에 포함되는 대부분의 화합물은 또한 펩티드 작용유사체이다. 예를 들면, 합성 요소로만 구성되는 트리 펩티드(tripeptide)도 펩티드 작용유사체로 간주될 수 있다. 몇몇 HIV 단백질 분해효소 저해제들은 아민 결합과 아미노산을 가지고 있음에도 불구하고 펩티드 작용유사체로 간주된다. 펩티드 작용유사체에 포함여부에 대한 논쟁은 여전히 계속되고 있으나, 본 기술분야의 통상의 전문가는 펩티드와 펩티드 작용유사체를 구별할 수 있다. 펩티드 작용유사체는 일반적으로 개량된 펩티드로 간주될 수 있다. 펩티드의 화학적 변형, 예컨데 펩티드 결합의 환원은 효소활성을 증가시킨다. 또한 합성 아미노산을 포함시킴으로써 펩티드의 활성과 선택도를 증가시킬 수 있다. 펩티드를 구조적 및/또는 화학적으로 많이 변형시킬수록, 진정한 펩티드 작용유사체가 된다.
펩티드 작용유사체는 펩티드, 단백질, 및 비펩티드성 유기그룹을 함유하는 펩티드, 아미노산 및/또는 펩티드 결합을 포함하거나 포함하지 않는 합성 펩티드등과 같은 상기 펩티드 및 단백질의 유도체를 포함하고, 펩티드 리간드, 펩토이드 , mon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367 (1992)에 기재된 화합물과 같은 N- 치환 글리신을 포함하는 분자 및 항-면역유전자형 항체를 포함하는 항체를 포함하는 올리고펩토이드의 구조적 및 기능성 특성을 보류한다.
본 발명의 또다른 일예에서, 본 발명의 화합물은 다양한 선택 화합물의 합성적 도입, 예컨데 골격(scaffold), turn-mimetics, 및 펩티드-결합 치환을 도입하여 제조할 수 있다. 펩티드 골격(backbone)의 위치에 다양한 선형 및 헤테로시클로 골격를 사용하여 아미노산 합성을 할 수도 있다. 화학적 방법 및 절차는 헤테로시클로 고리, 올레핀, 및 플루오로올레핀, 케토메틸렌과 같은 그룹으로 펩티드 결합을 치환 및 개선된 혈액-뇌 통과를 위한 천연 전구약물(prodrug)으로서 전하를 띤 펩티드의 일시적인 보호를 포함한다.
본 발명의 일예에서, 상기 작용유사체는 표적에 매우 특이적이며 독성이 낮고, 혈액-뇌 장벽을 통과하는 펩티드 작용유사체로서 뇌에서 베타-아밀로이드 단백질이 FPR 계열 수용체에 결합하는 것에 대한 길항작용을 한다.
치료학적 조성물(therapeutic composition)
FPR 계열 수용체에 대한 몇몇 새로운 길항 화합물을 본 발명에서 제공한다. 이들 약물은 종래의 알려진 경로, 경피, 국소, 비경구, 위장, 경기관지,및 경폐포(transalveolar)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 적용예는 의료장치의 코팅에 길항 화합물을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체예는 생물공학적 도구, 예방의학, 치료의학, 및 이들을 위한 용도로 사용방법, 자가 면역질환의 연구, 치료 및/또는 예방, 퇴행적 신경질환, 예컨대 알츠하이머 질환, 및 염증의 예방 및/또는 감소, 류마티스 관절염 및 골관절염과 같은 염증 관련 질병의 예방 및/또는 치료를 포함한다.
본 발명의 일예에서,본 발명은 FPR 계열 수용체의 활성화가 특징인 다양한 질병의 치료에 관한 것이다. FPR 수용체는 염증상태 및 알츠하이머와 같은 퇴행성 신경질환에서 활성화되는 것으로 알려져 있으며, 플라크 단백질 Aβ42 가 FPRL1의 작용제이다.
본 발명에 따른 치료 화합물을 퇴행성 신경질환이 걸렸거나 걸릴 가능성이 있는 사람에게 FPR 계열 수용체에 대한 다양한 작용제를 저해하는 화합물을 제공함으로써 투여할 수 있다. 특히, 상기 질환은 치매, 뇌의 만성 퇴행성 신경질환, 특히 해마 및 대뇌 피질에서의 신경세포의 상실, 신경전달물질의 감소, 뇌혈관 감소, 및/또는 지각력의 상실과 관련된다.
추가로, 본 발명은 알츠하이머 질환의 치료에 관한 것이다. 바람직하게는, 혈액-뇌 장벽을 상기 화합물이 통과할 수 있다. 또한, 본 발명은 FPR 계열 수용체 또는 FPRL1 수용체의 활성화와 관련된 다른 질환의 치료를 위한 치료 화합물에 관한 것으로서, 상기 질환은 자가-면역 질환, 염증, 염증 관련 질병, 예컨대 류마티스 관절염 및 골관절염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
염증의 감소방법, 퇴행성 신경질환의 경감 또는 예방하는 방법, 자가-면역질환의 치료 또는 예방하는 방법도 또한 본 발명의 구체적 일예이다. 따라서, 염증의 감소방법은 FPR 계열 수용체와 상호작용하는 화합물을 필요로 하는 대상에게 치료학적 유효량의 W-풍부 펩티드, 또는 단편, 유도체, 변형체, 및 작용유사체를 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 퇴행성 신경질환의 예방 또는 경감방법은 퇴행성 신경질환, 예컨대 알츠하이머 질환으로 진전될 위험이 있는 대상 또는 퇴행성 신경질환을 가진 대상을 확인하고, 치료학적으로 충분한 양의 FPR 계열 수용체의 길항 화합물, 예컨데 W-풍부 펩티드 또는 이의 작용 유사체를 상기 대상에게 공급하는 것을 포함한다.
치료 화합물의 제형은 일반적으로 본 기술분야에서 알려져 있으며 Remington's Pharmaceutical Science, 17판, Mack Publishing Co, Easton, Pa, USA를 참고문헌으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 1일, 체중 1Kg당 약 0.05㎍ 내지 약 20㎎을 투여할 수 있다. 투여량은 최적 치료반응으로 조절할 수 있다. 예를 들면, 수개로 나눠진 투여량을 매일 투여할 수도 있고, 치료상황에 맞추어 비례적으로 감소시킬 수도 있다. 활성 화합물을 편리한 방식, 예컨데 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 비강내, 경피 또는 좌약 또는 이식(예, 복강내 경로 또는 세포, 예를 들면 모노사이트 또는 시험관내에서 감수성화시키고 수용체에 적절히 전달되는, 수지상 세포를 사용하여 서서히 방출되는 분자)등의 방법을 포함하는 통상적인 방법으로 투여할 수 있다. 투여경로에 따라서, 효소, 산, 활성성분을 불활성화하는 다른 자연조건으로부터 펩티드를 보고하는 물질로 펩티드를 코팅할 필요가 있을 수도 있다.
예를 들면, 펩티드의 낮은 지용성으로 인해 위장관에서는 펩티드 결합을 절단하는 효소에 의해서 분해되거나, 위에서는 산에 의해 분해될 수 있다. 비경구 투여 이외의 방법으로 펩티드를 투여하기 위해서는, 불활성화를 방지하기 위해서 코팅할 수도 있다. 예를 들면, 부형제 또는 효소저해제와 함께 투여되거나, 리포좀 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명에서 사용가능한 부형제는 레조시놀, 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 및 n-헥사데실폴리에틸렌 에테르를 포함한다. 효소 저해제는 췌장이 트립신 저해제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤을 포함한다. 리포좀은 W/O/W CGF 에멀젼, 및 통상의 리포좀일 수 있다.
또한, 활성 화합물을 비경구 또는 복강내로 투여할 수도 있다. 글리세롤 액상 폴리에틸렌 글리콜에 분산시킬 수도 있고 이들과 오일이 혼합물을 제조할 수도 있다. 저장 및 사용의 일반적인 조건에서, 이들 제제는 미생물 증식을 방지하기 위한 방부제를 포함할 수도 있다.
주사제로 적합한 약제학적 제형은 멸균용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액을 제조하기 위한 임시제제로서 멸균 분말을 포함할 수도 있다. 상기 제형은 제조 및 보관조건에서 멸균상태여야 하며, 주사가 용이하도록 유동성이 있어야 한다. 제조 및 보관조건하에서 안정해야 하며, 세균 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염을 방지할 수 있도록 보관되어야 한다. 전달체를 용매 또는 분산매질일 수 있으며, 예컨데 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜, 기타등등), 이들의 혼합물, 식물오일 등을 포함한다. 적합한 유동성이 유지되어야 하며, 예를 들면 레시틴과 같은 코팅을 사용할 수도 있고, 분산액인 경우에 필요한 입자크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유동성이 유지될 수도 있다. 미생물이 증식을 방지하고자, 다양한 항박테리아 및 항곰팡이제를 사용할 수 있으며, 예컨데 클로로부탄올, 솔브산, 테오메르살(theomersal) 등을 포함한다. 많은 경우에, 등장제, 예컨데 설탕 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 흡수 지연제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트, 및 젤라틴을 포함하여 주사제의 장기 흡수를 달성할 수 있다.
활성 화합물을 필요한 양의 적합한 용매에 상기 기재한 다른 성분을 혼합하여 멸균 주사액을 제조하며, 필요하면 여과하여 멸균할 수 있다. 일반적으로 다양한 멸균 활성성분을 기본적은 분삭매질과 다양한 다른 성분을 포함하는 멸균 운반체에 멸균 활성 성분을 투입함으로서 분산액을 제조할 수 있다. 멸균 주사액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 진공건조 및 동결건조 방법이 바람직하며, 활성성분과 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 얻어진 추가적인 바람직한 성분을 혼합한 분말을 제조한다.
상기한 바와 같이 펩티드를 적합하게 보호한 경우에, 활성성분을 예를 들면 불활성 담체 또는 식용가능한 전달체와 함께 경구로 투여할 수 있으며, 단단하거나 부드러운 젤라틴 캡슐에 밀봉하거나, 정제로 제조하거나, 직접 식품에 첨가될 수도 있다. 경구 투여의 경우, 활성 화합물을 부형제와 함께 포함하고, 삼킬 수 있는 정제, 구강 정제, 트로취(troch), 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 기타등등의 형태로 사용할 수 있다. 상기 조성물 및 제형은 적어도 1 중량%의 활성성분을 포함해야 한다. 조성물 및 제제의 퍼센트는 단위 Kg당 약 5 내지 80 중량%범위에서 다양하게 할 수 있다. 치료학적으로 유용한 조성물중 활성 화합물의 함량은 적합한 제형으로 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 조성물 및 제제는 활성 화합물 0.1㎍ 내지 2000㎎ 범위로 경구용 단위 제형에 포함되도록 제조될 수 있다.
정제, 알약, 캡슐,등은 또한 다음 물질을 포함할 수 있다: 트라가칸스 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제; 수크로스, 락토스 또는 사카린과 같은 감미제; 페파민트, 노루발풀 오일, 또는 체리향과 같은 향료를 첨가할 수 있다. 단위 투여량 형태가 캡슐인 경우에, 상기 물질이외에 액상 전달제를 포함할 수 있다. 여러 가지 다른 성분들을 코팅제 또는 단위투여량 제제의 물리적인 형태를 변형시키기 위해서 추가할 수 있다. 예를 들면, 정제, 알약, 또는 캡슐을 쉘락, 슈가 또는 이들의 혼합물로 코팅할 수도 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성성분, 감미제로서 슈가, 방부제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 체리향 또는 오렌지향과 같은 향료를 포함할 수 있다. 물론, 단위투여 제제에는 약학적으로 순수하고 실질적으로 독성이 없는 양으로 상기 물질이 포함되어야 한다. 추가로, 활성성분은 서방성 제제에 포함될 수도 있다.
본 명세서에서 "약제학적으로 허용가능한 전달체 및/또는 담체(pharmaceutically acceptable carrier and/or diluent)" 라 함은 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항박테리아 및 항곰팡이제, 등장제, 흡수 지연제, 기타등등을 포함한다. 약제학적으로 활성인 성분에 대해, 상기 분산제 및 물질들은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 종래의 매질 또는 물질이 활성성분과 양립가능성이 없다면, 치료 조성물에 그들 화합물을 사용하는 것을 고려해야 한다. 보조적 활성성분도 또한 상기 조성물에 포함시킬 수 있다.
비경구 조성물로 단위 투여 제제를 제조하는 것은 투여가 용이하고 일정한 양을 투여할 수 있어 특히 바람직하다. 본 명세서에서 사용된 단위 투여 제제는 치료대상 포유동물에 대해 단위 투여량으로 적합한, 물리적으로 구별되는 단위를 말한다; 각 단위는 필요한 약제학적 전달체와 혼합하여 바람직한 치료효과를 달성할 수 있도록 계산된 소정의 활성물질을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 제제에 대한 자세한 설명은 (a) 활성 성분의 독특한 특징 및 달성될 특정의 치료효과, 및 (b) 신체 건강을 손상시키는 질병을 갖는 생명체에 질병을 치료할 활성 물질을 혼합하는 분야에서 본질적인 제한에 의존적이다.
단위 투여 제제에서 적합한 약제학적으로 허용가능한 전달체와 투여 유효량의 주요 활성성분을 혼합한다. 예를 들면, 단위 투여제제는 0.5㎍ 내지 약 2000㎎ 범위의 주요 활성성분을 포함한다. 비율로 나타내면, 일반적으로 활성성분은 전달체 lml당 0.5㎍으로 포함된다. 보조 활성성분을 포함하는 경우, 성분의 일반적인 투여량 및 투여방법을 참고하여 투여량을 결정한다.
전달 시스템
본 발명의 화합물을 투여하기 위하여 다양한 알려진 전달 시스템을 사용할 수 있으며, 예를 들면 리포솜에 캡슐화, 마이크로 입자, 마이크로 캡슐, 수용체-매개 엔도사이토시스등이다. 도입방법은 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외, 및 경구 경로을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 화합물 또는 조성물은 종래의 모든 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 주입, 환약주입으로, 상패 또는 점막을 통한 흡수(예, 구강점막, 직장 및 장내 점막등), 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수도 있다. 전신 투여 또는 국소투여를 할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 약제 조성물 또는 화합물을 적절한 경로, 측뇌실내, 예를 들면 오마야 저장액(Ommaya reservoir)에 연결되어 잇는 심실내 도관에 의해 투여될 수 있다. 폐 투여도 또한 사용될 수 있으며, 예를 들면 흡입기 또는 분무기를 사용하여 분무 주입제를 이용한 제제로 투여될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일예에서, 본 발명의 약제 조성물 또는 화합물을 치료가 필요한 국소영역에 투여하는 것이 바람직할 수도 있다; 이러한 투여는 예를 들면 외과적 수술을 통한 국소 주입, 국소적용 (외과적 수술수에 상처 드레싱과 병용), 주사, 카테터, 좌약, 이식 (다공성, 비다공성, 또는 젤라틴물질, 시알래스틱(sialastic) 멤브레인등의 멤브레인, 또는 섬유등 일 수 있다)등이다. 바람직하게는, 펩티드 또는 본 발명에 다른 펩티드 작용유사체 화합물을 포함하는 단백질을 투여하는 경우에, 단백질이 흡수되는 않는 물질을 사용하는 경우에는 주의가 필요하다. 또 다른 구체예에서, 상기 화합물 또는 조성물을 운반체, 예를 들면 리포좀을 이용하여 전달할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 화합물 또는 조성물은 방출 제어 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 본 발명의 일예에서, 펌프가 사용될 수 있다. 방출 제어 시스템은 치료 표적, 예컨데 뇌에 가장 근접하여 사용할 수 있으며, 따라서 전신 투여량의 일부만 필요하다.
"약리학적, 또는 생리학적으로 허용가능한(pharmacologically or physiologically acceptable)"이라 함은 상기 조성물의 투여가 수용대상에게 허용가능하고 적합한 것을 의미한다. 상기 작용제의 "치료학적 유료량(therapeutically effective amount)"라 함은 상기 작용제(agent)의 투여량이 샐리적으로 유의한 것을 의미한다. 상기 작용제의 존재결과 수용대상에서 탐지할만한 생리적 변화를 가져오는 경우 상기 작용제는 생리적으로 유의한다.
FPRL1 길항제 및 W-풍부 펩티드
자가 면역질환,및 퇴행성 신경질환을 치료 및 예방하고, 이와 관련된 염증 및 질환을 예방 또는 경감시키기 위해서, 이를 필요로 하는 대상에게 W-풍부 펩티드, 이의 단편 또는 유도체를 제공할 수 있다. FPR 계열 수용체의 길항제와 유사한 화학제 및 펩티도미메틱스 또는 이의 단편, 그리고 FPR 계열 수용체 길항체 또는 이의 단편의 단백질 분해효소에 안정한 유도체 또는 이의 단편을 자가 면역 질환, 및 퇴행성 신경질환을 치료 및 예방하기 위해서, 그리고 이와 관련된 질병 및 염증을 예방 및 경감시키기 위해서 사용할 수 있다.
본 발명에서, W-풍부 펩티드의 예로 헥사펩티드(hexapeptide)을 들 수 있다. 그러나, 본 발명이 상기 헥사펩티드로 한정되는 의도는 아니다. 상기 펩티드는 약각 더 길거나 더 짧을 수 있다. 상기 펩티드가 포르밀 펩티드 수용체 유사-1 메개 신호전달을 길항하는 한, 펩티드는 4 내지 15개 아미노산으로 이루어지거나, 바람직하게는 4 내지 10개 아미노산으로, 더욱 바람직하게는 4 내지 7개 아미노산, 또는 약 6개 아미노산으로 이루어질 수 있다.
추가로, 본 발명의 W-풍부 펩티드는 적어도 약 50% 트립토판 함량 (W-L-아미노산 형태 및/또는 W-D-아미노산 형태)을 가진다. 바람직하게는 상기 트립토판 함량은 적어도 약 60%, 62%, 65%, 66%, 67%, 70%, 75%, 77%, 80%, 85%, 88%, 90%, 95% 또는 100%일 수 있다.
펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 FPRL1 신호전달을 길항하는 몇몇 헥사펩티드를 동정하였다. W-풍부 펩티드, 예컨대 WRW4 (SEQ ID NO:4), RHW4 (SEQ ID NO:6), RRW4 (SEQ ID NO:5), 및 DRW4 (SEQ ID NO:8) 가 FPRL1과 직접적으로 상호작용하고 농도의존적인 방식으로 세포 표면 수용체에 WKYMVm (SEQ ID NO:3) 가 결합하는 것을 저해하는 것을 규명하였다. 더욱이, WRW4 (SEQ ID NO:4) 는 WKYMVm (SEQ ID NO:3)-유도 ,FPRL1 신호전달에 길항적 효과를 미치며, 사람 호중구에서 주화성 이동뿐만 아니라, Aβ42 펩티드에 의해 생성된 수퍼옥사이드 주화성 이동을 차단한다.
주화 인자(chemoattractant)의 면역 조절 활성과정에서, 감염된 조직에서 포식 세포(phagocytic cell) 축적을 유도하는 것은 주요하다(6, 7). 과량의 포식세포는 염증반응과 같은 역효과를 초래하기는 하지만, 주화인자-유도 반응의 음성 조절(negative regulation)에 대한 몇몇 보고가 있다. 상기 주화인자 신호전달의 직접적인 음성조절은 작용제-수용체 결합을 저해함으로써 유도될 수 있다. 이러한 연구에 의하면, 다수의 W-풍부 펩티드가 WKYMVm (SEQ ID NO:3) 이 FPRL1에 결합하는 것을 차단한다는 것을 나타낸다 (도 2). 펩티드, WRW4 (SEQ ID NO:4) 측면에서, FPRL1을 발현하는 RBL-2H3 세포에서 조사된 WKYMVm (SEQ ID NO:3) 에 의해 유도되는 모든 측정한 세포활성이 차단됨을 본 발명자들은 알았다. 더욱 자세하게는, WRW4 (SEQ ID NO:4) 가 WKYMVm (SEQ ID NO:3)-유도 [Ca2+]i 증가, ERK 활성화 및 주화성 이동을 차단한다(도 2, 도 3 및 도 4). 이러한 발견은 WRW4 (SEQ ID NO:4) 가 WKYMVm (SEQ ID NO:3)의 수용체 결합을 차단함으로써 WKYMVm (SEQ ID NO:3)가 개시한 FPRL1 신호전달을 차단함을 나타낸다. FPRL1은 병원체 감염에 대항하는 숙주의 방어 기작에 관여하는 중요한 주화성 인자이기 때문에, W-풍부 펩티드는 항-염증 약물의 개발에 유용하게 사용될 수 있다. wWRWWM (SEQ ID NO:16) 는 WRW4 (SEQ ID NO:4)보다 WKYMVm (SEQ ID NO:3)-유도 [Ca2+]i 증가를 더욱 강력히 차단하는 길항제이다.
FPR 패밀리 수용체가 염증 반응에 있어서 중요한 역할을 가지기 때문에, 많은 연구그룹들은 상기 수용체 패밀리에 대한 수용체 길할제를 동정하려는 시도가 계속되었다. 오늘날까지, 몇몇 FPR 길항제가 보고되었다(30-32). 0.44-3.7 mM의 IC50 값을 가지는, 두 가지 FPR 길항제 (tBOC-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-OH (SEQ ID NO:10) 및 이소프로필유레이도(isopropylureido)-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-OH (SEQ ID NO:11))가 fMLF의 포르밀기를 t-부틸옥시카르보닐 (tBOC) 또는 이소프로필우레이도기로 치환하여 개발하였다 (30, 31). 강력하고 선택적인 FPR 길항제로서 시클릭 운데카펩티드인 사이크로스포린 H(CsH)를 개발하였다 (32). CsH는 FPR-매개 Ca2+ 이동, 주화성, 및 호염증성 조절자를 저해하는 것으로 보고되었다(32-34). 몇몇 FPR-특이적 길항제가 개발되고 염증반응의 조절자에 대한 이들의 치료제로서의 기능에 대햇 조사괴었으나, FPRL1-특이적 길항제는 아직까지 보고된 바 없다. FPRL1 길항제로서 몇몇 합성 헥사펩티드를 본 발명에서 제시되었다. 특히, WRW4 (SEQ ID NO:4) 는 fMLE-유도 반응뿐만 아니라, 모든 측정된 FPRL1 작용제 (MMK-1, Ab42 펩티드 및 F 펩티드)-유도 [Ca2+]i 증가를 특이적으로 저해하였다(도 6). 추가로, 상기 펩티드는 개선된 FPR 계열 수용체 특이적 또는 FPRL-1 특이적 길항제의 생산에 사용될 수 있다.
이전에 보고된 바에 의하면, 염증이 알츠하이머 질환의 병원성에 주요하게 관련된다(35). 더욱이, Ab42 펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질의 효소적 절단 단편중 하나이고(36), 전신의 아밀로이드증(amyloidosis), 예컨대 알츠하이머 질환의 호염증성 반응성에 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고되었다(35, 36). 최근에, Aβ42 펩티드가 FPRL1에 결합하고, 사람 호중구에서 FPRL1을 통하여 활성산소종의 생산 및 세포 주화성 이동을 조절하는 것을 본 발명자들이 규명하였다 (29). 도 7은 Aβ42 처리전에 WRW4 (SEQ ID NO:4) 로 사람 호증구를 전배양함으로써 Aβ42-유도 호중구 주화성 이동 및 ROS 생성을 완전히 저해함을 보여준다.
알츠하이머 질환에 있어서, Aβ42 펩티드는 신경독성의 조절 및 노화 플라크(plaque)의 생성에 있어서 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다(35,36). 뇌에서 단핵 포식세포(mononuclear phagocyte)는 FPRL1을 발현하고, FPRL1 유전자 발현은 CD11b-양성 단핵 포식세포에서 증가하고 알츠하이머 질환 환자의 뇌조직에서 노화 플라크로 침투한다(12). Aβ42 펩티드는 또한 뇌의 소교세포 및 말초혈액의 단핵 포식세포에서 신경손상성 활성산소종 및 활성 질소, 종양괴사 인자 α를 중가시킨다(37). 이들 분자들은 알츠하이머 질환에서 증가된다(35-37). 더욱 최근에, Yazawa 등의 보고에 의하면, Aβ42 펩티드가 대식세포에서 FPRL1을 통해 흡수되고 섬유상 응집체를 형성한다(27). 본 명세서에서, WRW4 (SEQ ID NO:4)는 사람 대식세포에서 Aβ42 펩티드의 흡수를 차단하는, FPRL1-특이적 길항제이다(도 8). 따라서, WRW4 (SEQ ID NO:4) 는 Aβ42 펩티드의 흡수 및 섬유형성을 차단하는 약물의 개발도구를 제공한다.
Aβ42 펩티드에 더하여, HIV-1 외피 도메인 또는 숙주-유래 길항제로부터 유래된 몇몇 다른 리간드가 FPRL1에 결합하는 것으로 보고되었다(14-17). 다른 FPRL1 작용제-관련 세포반응 및 질환에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4) 의 효과를 추가적으로 연구할 필요가 있다. WRW4 (SEQ ID NO:4) 가 WKYMVm (SEQ ID NO:3) 및 Ab42에 의한 FPRL1 활성화를 저해함을 규명하기는 했지만, 다른 FPRL1 길항제에 의한 FPRL1 활성화에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4) 의 효과를 규명하는 연구가 필요하다. 요약하면, FPR 계열 수용체, 특히 FPRL1 수용체에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4)등의 길항제는 FPRL1이 중요한 역할을 수행하는 몇몇 질환의 치료를 위한 약물 개발에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기의 발명의 상세한 설명, 본 발명을 예시하는 것인 첨부된 도면으로부터 보다 완전하게 이해될 것이나, 이들 기재로부터 제한되지는 않는다.
도 1은 FPRL1 발현 RBL-2H3 세포에서의 125I 표지된 WKYMVm (SEQ ID NO:3)의 결합을 억제하는 펩티드에 대한 PS-SPCLs의 처음 스크리닝을 나타내는 것이다. 각 패널은 상기 헥사펩티드의 각각의 6개의 위치에 알려진 아미노산의 펩티드 풀을 사용하여 얻은 결과를 보여주는 것이다. 상기 6개의 위치는 19 L-아미노산 중 하나 의 위치화 (positioning)에 의하여 개별적으로 정의하였다 (01, 02 등). 남은 5 개의 위치는 19 L-아미노산 (시스테인 제외)의 혼합물 (X)로 구성된다. FPRL1 발현 RBL-2H3 세포 (1x105 cells/200 ml)를 결합 에세이 (binding assay)에 사용하였다. 상기 리간드 결합 에세이를 실시예 부분에서 설명된 바에 따라서 모니터링하였다. 본 도면에 나타난 결과는 4 개의 독립적인 실험을 대표하는 것이다.
도 2는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에 있어서의 WKYMVm (SEQ ID NO:3) 결합의 억제에 대한 PS-SPCL 스크리닝 결과에 기초한 몇 가지 후보 펩티드의 효과를 보여주는 것이다. FPRL1-발현 RBL-2H3 세포 (1x105 세포s/200 ml)을 결합 에세이에 사용하였으며, 125I-표지된 WKYMVm (SEQ ID NO:3) (50 pM)의 첨가 전에, 다양한 농도의 각각의 비표지된 펩티드 [RRWWWW, RRW4 (SEQ ID NO:5); RHWWWW, RHW4 (SEQ ID NO:6); WRWWWW, WRW4 (SEQ ID NO:4); DRWWWW, DRW4 (SEQ ID NO:8)]를 전처리하였다. 특이적으로 결합된 125I-표지된 WKYMVm (SEQ ID NO:3)를 측정하였다. 본 도면에 나타낸 결과는 4 개의 실험을 대표하는 것이다.
도 3A 내지 3B는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서의 WKYMVm (SEQ ID NO:3)-유도 [Ca2+]i 증가에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4)의 효과를 보여주는 것이다. Fura-2-가지는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포을 운반체 또는 WRW4 (SEQ ID NO:4) (10 mM)로 자극시킨 후, WKYMVm (SEQ ID NO:3) (10 nM)로 자극하거나; 또는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포을 fura-2와 함께 로딩된 DNP 특이적 IgE로 감작화시키고, 항원 DNP-HSA (1 mg/ml)를 사용하여 활성화시켰다. 340 nm/380 nm에서의 변화를 모니터링하였다. 얻어진 결과는 3 개의 독립적인 실험을 대표하는 것이다 (A). WKYMVm (SEQ ID NO:3) 10 nM 또는 DNP-HSA 1 mg/ml를 첨가하기 전에, 세포들을 다양한 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4)로 자극하였다. [Ca2 +]i 증가의 피크 수준을 모니터링하였다. 얻어진 결과는 4 개의 실험의 평균 ±표준오차이다 (B).
도 4A 내지 4B는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서의 WKYMVm (SEQ ID NO:3) 자극 ERK 활성화에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4)의 효과를 나타낸 것이다. FPRL1-발현 RBL-2H3 세포을 다양한 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4)로 5 분 동안 처리한 후 (A, 왼쪽), 다양한 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4) 또는 10 mM의 대조 펩티드 LFMYHP (SEQ ID NO:9)로 1분 동안 자극시킨 후, 비히클 또는 10 nM WKYMVm (SEQ ID NO:3)를 5 분동안 첨가하였다 (A, 오른쪽). 각 샘플 (단백질 30 mg)에 대하여 8% SDS-PAGE를 수행하고, 항-포스포-ERK 항체를 사용하는 면역블라트 분석에 의하여 인산화된 ERK를 측정하였다 (A). 농도계측기를 이용하여 ERK 인산화를 정량하였다. 얻어진 결과는 5 개의 독립적인 실험의 평균 ±표준오차로서 나타내었다.
도 5A 및 5B는 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서의 WKYMVm (SEQ ID NO:3)-유도 세포 주화성에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4)의 효과를 보여주는 것이다. 하기의 실시예에 기재된 바와 같은 변형된 Boyden 챔버 에세이를 사용하여 분석을 수행하였다. 배양된 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포 (무혈청 RPMI 1x106 세포/ml)을 96-웰 주화성 챔버의 상단 웰에 첨가하고, 37℃에서 4시간동안 배양한 후, 기공 크기가 8 mm인 폴리카보네이트 멤브레인을 가로지르는 이동 정도를 측정하였다. 고전력장(400X)에서 카운팅하여 이동된 세포 수를 측정하였다. 본 에세이에 다양한 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4) 또는 WKYMVm (SEQ ID NO:3)을 사용하였다 (A). 몇 가지 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4) 또는 10 mM의 LFMYHP (SEQ ID NO:9)를 첨가한 후, 10 nM WKYMVm (SEQ ID NO:3)를 사용하여 주화성 에세이를 수행하였다 (B). 얻어진 결과는 각각 두 번씩 수행된 3 개의 독립적인 실험의 평균 ±SE로서 나타내었다.
도 6A 및 6B는 인간 호중구에서의 WRW4 (SEQ ID NO:4)에 의한 FPRL-1-유도 [Ca2+]i 증가의 특이적 억제를 보여주는 것이다. Fura-2-loaded 인간 호중구를 비히클 또는 WRW4 (SEQ ID NO:4) (10 mM)로 처리한 후, Aβ42 (40 mM) 또는 fMLF (1 mM)로 자극하였다. 340 nm/380 nm에서의 변화를 모니터링하였다. 나타낸 결과는 3 개의 독립적인 실험을 대표하는 것이다 (A). 호중구를 비히클 또는 WRW4 (SEQ ID NO:4) (10 mM)로 자극한 후, MMK-1 (1 mM), Aβ42 (40 mM), F 펩티드 (30 mM), fMLF (1 mM), 또는 ATP (500 mM)롤 자극하였다 (B). 340 nm/380 nm에서의 변화를 모니터링하고, 조정된 형광 비율을 [Ca2+]i로 변환하였다. 얻어진 결과를 각각 두 번씩 수행된 3 개의 독립된 실험의 평균 ±SE로서 나타내었다 (B).
도 7A 및 7B는 인간 호중구에서의 주화성 및 Aβ42-유도 과산화물 생성에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4)의 효과를 나타낸 것이다. 인간 호중구 (1x106 cells/100 ml)를 다양한 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4) 또는 Aβ42로 자극하였다 (A). 다양한 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4) 또는 10 mM의 대조 펩티드 (LFMYHP, SEQ ID NO:9)와 함께 1분 동안 전배양한 후, 40 mM의 Aβ42를 첨가하였다 (B). 하기의 실시예에 기재된 바와 같이, 시토크롬 C 환원을 모니터링하였다. 나타낸 결과는 4 개의 독립 적인 실험을 대표하는 것이다 (A, B). 실시예에 기재된 바와 같이 변형된 Boyden 챔버 에세이를 사용하여 주화성 검정을 수행하였다. 다양한 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4) 또는 Aβ42를 검정법에 사용하였다 (C). 몇 가지 농도의 WRW4 (SEQ ID NO:4) 또는 10 mM의 대조 펩티드 (LFMYHP, SEQ ID NO:9)를 전처리한 후, 40 mM Aβ42를 사용하여 주화성 검정을 수행하였다 (D). 데이터는 각각 두 번씩 수행된 3 개의 독립적인 실험의 평균 ±SE로서 나타내었다 (C, D).
도 8은 인간 대식세포에서의 Aβ42 펩티드의 내재화에 대한 WRW4 (SEQ ID NO:4)의 효과를 보여주는 것이다. 인간 대식세포는 챔버 슬라이드 상에서 배양하고, 10 mM의 WRW4 (SEQ ID NO:4)의 부재 또는 존재하에서, 다양한 시간동안 37℃에서 10 mM의 Aβ42와 함께 인큐베이팅하였다. 그리고 나서, 상기 세포를 세척하고, 투과성화시키고(permeabilized), 항-Aβ42 항체로 염색하였다. 샘플을 FITC 접합된 염소 항-마우스 IgG와 함께 더 인큐베이팅하였다. 공초점 현미경 하에서 Aβ42 염색을 측정하였다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 구체적인 예에 의해 그 권리범위가 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 것에 더하여, 상기 상세한 설명과 첨부된 도면으로부터 다양한 변경이 가능함은 본 기술분야의 전문가에게 명백할 것이다. 그러한 변형은 제한적인 의미가 아니라 모두 본 발명의 예시적인 수단으로 제공된다.
< 실시예 1>
FPRL1 길항제(antagonist) 펩티드 특징 분석을 위한 물질 및 방법
Fmoc 아미노산은 밀리포어(Millipore, Bedford, MA), 라피드아미드 레진은 듀폰트(Dupont, Boston, MA), 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell) 분리 배지(Histopaque-1077)와 사이토크롬 c는 시그마(Sigma, St. Louis, MO), fura-2 펜타마세톡시메틸레스터(pentaacetoxymethylester, fura-2/AM)는 분자 프로브(Molecular probe, Eugene, OR), RPMI1640은 인비트로젠사(Invitrogen Corp. Carlsbad, CA) 및 투석된 우태아혈청(fetal bovine serum)과 보충된 우혈청은 하이클론사(Hyclone Laboratories Inc. Logen, UT)로부터 각각 입수하였다. 방사선 동위원소로 표지된 WKYMVm(125I-표지된 SEQ ID NO: 3)은 Amersham Pharmacia 바이오텍(Buckinghamshire, UK), 아밀로이드 β42(Amyloid β4, Aβ42)는 벡켐 바이오사이언스(Bechem Bioscience, King of Prussia, PA), 항-인산화-ERK 및 항-ERK 항체는 Cell Signaling사(Cell Signaling Technology, Inc. Beverly, MA), 항-Aβ42 항체는 자이메드사(Zymed Laboratories, Inc. South San Francisco, CA)로부터 각각 입수하였다.
<1-2> 위치 스캐닝 합성 펩티드 조합 라이브러리(Positional scanning synthetic peptide combinatorial library, PS- SPCL )
헥사펩티드(hexapeptide) 라이브러리는 Peptide Library Support Facility of Pohang University of Science and Technology로부터 입수하였다(Baek, S. H., et al., J. Biol. Chem. 271: 8170, 1996 및 Seo, J. K., et al., J. Immunol. 158:1895, 1997). 114 펩티드 풀(시스테인은 라이브러리 제조시 제외 됨)은 각 펩티드 풀에서 펩티드 서열당 17 nM의 최종 농도로 각각 용해시켰다. 펩티드는 앞서 설명한 고상법(solid-phase method)을 이용하여 합성하였다(Baek, S. H., et al., J. Biol. Chem. 271: 8170). 간단히 설명하면, 상기 펩티드는 라피드아미드 보조 레진을 이용하여 합성하였고, 산에 약한 연결자(acid-labile linker)상에서 표준 Fmoc/t-butyl법을 수행하여 조합하였다. 펩티드 조성은 아미노산 분석으로 확인하였다(Baek, S. H., et al., J. Biol. Chem. 271: 8170, 1996 및 Seo, J. K., et al., J. Immunol. 158:1895, 1997).
<1-3> 세포 배양
FPRL1-발현 PBL-2H3 세포 및 벡터로 형질도입된 PBL-2H3 세포는 앞서 설명한 바와 같이 배양하였다(He, R., et al., Blood 101:1572, 2003). 이때, 상기 세포는 표준 배양 조건인 37℃, 5% CO2에서 ml당 약 1ⅹ106개의 세포수로 배양하였다. 말초혈액(Peripheral blood)은 건강한 기증자로부터 수득하였고, 인간 호중구(neutrophil)는 덱스트란 침전, 적혈구의 저침투성 분해 및 임파구 분리 배지 구배를 이용하여 분리하였다(Bae, Y. S., et al., Blood 97:2854, 2001). 인간 호중구는 상기에서 언급한 것처럼 배지 구배를 이용하여 즉시 분리하였고(Bae, Y. S., et al., Blood 97:2854, 2001), 인간 적혈구는 분리한 후 곧바로 사용하였다. 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 Histopaque-1077 구배를 이용하여 분리하였고, 칼슘과 마그네슘을 포함하지 않은 HBSS로 2번 세척한 후, 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 부유시킨 다음 상기 세포가 배양 용기에 고착할 수 있도록 37℃에서 60분간 배양하였다. 이어, 고착된 세포를 앞서 설명한 바와 같이 수취한 후(Bae, Y. S., et al., Blood 97:2854, 2001), 0.1% BSA, 0.01M HEPES(Ph 7.4), 20 ng/ml의 단핵세포 콜로니 촉진 인자(PeproTech, RockyHill, NJ)를 포함한 RPMI1640 배지로 채워진 4-웰 쳄퍼 슬라이드(Nalge Nunc International, Rochester, NY)상에 배양하여 대식세포로 분화시켰다.
<1-4> 펩티드 라이브러리 스크리닝 및 리간드 결합 분석
PS-SPCL의 초기 스크리닝을 위하여, 본 발명자들은 125I-WKYMVm(SEQ ID NO: 3)와 RBL-2H3 세포에 존재하는 펩티드에 특이적인 수용체인 FPRL1과의 결합에 대한 각 펩티드 풀의 효능을 측정하였다. 리간드 결합 분석은 앞서 설명한 바와 같이 측정하였다(Hu, J. Y., et al., J. Leukoc. Biol. 70:155, 2001). 간략히 설명하면, FPR-발현용 PBL-2H3 세포는 24-웰 플레이트에 웰 당 1ⅹ105개의 세포로 분주한 후 밤새도록 배양하였다. 블로킹 버퍼[33 mM HEPES(pH 7.5), 0/1% BSA를 포함한 RPMI]를 이용하여 상기 세포를 2시간 동안 중화시킨 후, 50 pM로 표지된 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)를 비표지된 펩티드(초기 스크리닝을 위해 펩티드 서열 당 최종 농도가 0.5 nM임)의 부재 또는 존재하에서 결합 용액(0.1% BSA를 포함한 PBS)에 부유시킨 세포에 첨가한 다음, 4℃, 3시간 동안 지속적으로 흔들어주면서 배양하였다. 이어, 상기 반응물을 차가운 결합 용액으로 5번 세척한 후, 200 ul의 분쇄 용 액[20 mM Tris(pH 7.5), Triton X-100] 을 각 웰에 첨가하여 상온에서 20분간 반응시킨 후, 상기 분쇄물을 수취하여 γ계수기(γ-ray counter)를 이용하여 측정하였다(Hu, J. Y., et al., J. Leukoc. Biol. 70:155, 2001).
<1-5> 세포내 칼슘 농도 측정
세포내 칼슘 농도 비율은 fura-2/AM을 이용한 Grynkiewicz's 법(Grynkiewicz, G., et al., J. Biol. Chem. 260:3440, 1985)으로 측정하였다. 간략히 설명하면, 준비된 세포를 3 uM fura-2/AM이 첨가된 신선한 무혈청 RPMI1640 배지(37℃, 50분간)에서 지속적으로 흔들어주면서 배양하였다. DNP-HAS을 촉진시키기 위하여, PBL-2H3 세포는 fura-2를 로딩하기 전 1 ug/ml의 마우스 DNP-특이적 IgE으로 감광시켰고, 각 분석을 위하여 칼슘이 첨가되지 않은 Locke's 용액[154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5mM HEPES(pH 7.3), 10 mM 글루코스, 0.2 mM EGTA] 에 2ⅹ106개의 세포수로 나누었다. 면역형광분석은 340 nm 및 380 nm의 여기파장(excitation wavelength)과 500 nm의 일반적인 방출파장(emission wavelength)에서 측정하였고, 측정된 형광도를 칼슘 농도로 전환시켰다.
<1-6> 펩티드에 대한 세포의 자극을 웨스턴 블랏으로 측정
FPRL1-발현용 PBL-2H3 세포 또는 분리된 인간 호중구(2ⅹ106)는 미리 정한 시간과 지시된 농도의 펩티드를 처리하여 자극하였다. 자극 후, 상기 세포를 무혈 청 RPMI로 세척하였고, 분쇄 용액[20 mM HEPES(pH 7.2), 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 50 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 10 g/ml leupeptin, 10 g/ml aprotinin, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)]에서 분쇄하였다. 상기 용액에 비용해성 물질은4℃, 12,000g에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛으로 남게 하였고, 용해성 상층액은 분리하여 -80℃ 또는 즉각적으로 사용하였다. 분쇄물의 단백질량은 Bradford 단백질 분석 시약을 이용하여 측정하였다.
<1-7> 전기영동 및 웨스턴 블랏 분석
단백질은 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 분리하였고, 니트로셀룰로오스 막에 전달한 다음 5% 탈지분유를 포함한 TTBS(Tris-buffered saline, 0.05% Tween-20)로 중화시켰다. 이어, 상기 막을 특이적인 항체와 반응시켰고, TBS로 세척하였다. 항원-항체 복합체는 1:5000으로 희석된 HRP가 결합된 고트 항-레빗 IgG 또는 고트 항-마우스 IgG 항체와 상기 막을 반응시킨 후 강화된 화학발광을 통해 검출하였다.
<1-8> 주화 이동( chemotaxis ) 분석
주화 이동 분석은 멀티웰 챔퍼(Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD, Bae, Y. S., et al., Blood 97:2854, 2001)를 이용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 폴리카르보네이트 필터(8 um 미세구멍)는 50 ug/ml의 랫트 타입 I 콜라겐(Collaborative Biomedicals)을 첨가한 HEPES로 완충화시킨 RPMI1640 배지를 이 용하여 미리 코팅하였다. 건조시킨 상기 코팅된 필터는 서로 다른 농도의 펩티드를 포함한 96-웰 챔퍼상에 위치시켰다. 이어, FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포를 ml당 1ⅹ106세포수로 RPMI에서 부유시킨 후, 25　μl의 부유액을 상기 챔버의 상측 웰에 분주하였다. 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 이주되지 않은 세포는 스크랩핑하여 제거하였고, 필터를 통해 이주된 세포는 탈수, 고정 및 헤마톡실린(Sigma, St. Louis, MO)으로 염색하였다. 고배율(high power field, HRF: 400배)에서 5개의 영역을 무작위적으로 선택하여 염색된 세포수를 측정하였다. 호중구 주화 이동 분석을 위하여, 준비된 인간 호중구를 ml 당 1ⅹ106세포수로 RPMI에서 부유시켰고, 25 ul의 부유액을 상기 챔버의 상측 웰에 분주한 후 90분 동안 배양하였다(Bae, Y. S., et al., Blood 97:2854, 2001). 이때, 상기 챔버의 상측 웰은 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)으로 코팅되지 않은 3 μm의 필터에 의해 하측 웰과 분리되어 있다.
<1-9> 활성산소 생성 측정
활성산소 음이온 생성은 마이크로타이터 96-웰 플레이트 ELISA 분석기(Bio-Tekinstruments, EL312e, Winooski, VT)를 이용하여 사이토크롬 c 감소를 측정함으로써 분석하였다(Bae, Y. S., et al., Blood 97:2854, 2001). 인간 호중구(1ⅹ106 세포/96-웰 플레이트의 웰 당 100 ul의 RPMI1640 배지)를 50 uM의 사이토크롬 c와 함께 37℃에서 1분간 미리 배양한 다음 지시된 펩티드 농도와 함께 배양하였 다. 활성산소 생성은 1분 간격으로 5분간 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
<1-10> 형광 공초점 현미경 측정
형광 공초점 현미경 측정은 항-Aβ42 항체를 이용하여 수행하였다(Yazawa, H., et al., FASEB J. 15: 2454-2462, 2001). 간략히 설명하면, 4-웰 챔버 슬라이드에 배양한 인간 대식세포를 37℃, 서로 다른 시간 동안 10 uM의 WRWWWW(SEQ ID NO: 4)의 부재 또는 존재하에서 10 μM의 Aβ42 항체를 처리하였다. 이어, 상기 세포를 실온에서 10분간 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰고, 비특이적 결합 및 투과성을 막기 위하여 5% 염소 혈청(Sigma)이 첨가된 0.05% 트윈-20을 포함한 PBS로 배양하였다. 이후, 상기 슬라이드를 실온에서 1시간 동안 항-Aβ42 항체와 배양시킨 후, PBS로 3번 세척한 후, FITC-접합된 고트 항-마우스 IgG(Sigma, 3% BSA를 포함한 TBS에서 1:500으로 희석)으로 30분간 반응시켰다. 표본화된 반응물은 레이저 스캐닝 공초점 형광 현미경(a laser scanning confocal fluorescence microscope, Zeiss)을 이용하여 관찰하였다.
< 실시예 2>
FPRL1 길항제 펩티드 특성의 결과
<2-1> FPRL1 과 WKYMVm ( SEQ ID NO: 3)의 결합을 억제하는 펩티드 동정
본 발명에 있어서, 헥사펩티드인 PS-SPCL로부터 전체 114개의 펩티드 풀(4천 7백만 개의 펩티드로 구성)은 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)과 세포 표면 수용체의 결합을 억제하는 펩티드를 동정하기 위하여 스크린되었다. 도 1은 초기의 스크리닝 결과를 나타내는 것으로서, 본 발명자들은 서로 다른 위치에 있는 아미노산은 FPRL1에 대한 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 결합을 다양한 값으로 유도함을 관찰하였다. 가장 강한 활성을 가진 펩티드 및 위치는 하기와 같다: 헥사펩티드의 첫번째 위치에서는 Lys(K), Arg(R) 또는 Trp(W); 두번째 위치에서는 His(H), Lys(K) 또는 Arg(R); 세번째 위치에서는 Arg(R) 또는 Trp(W); 네번째 위치에서는 Trp(W); 다섯번째 위치에서는 Trp(W) 및 여섯번째 위치에서는 Met(M) 또는 Trp(W).
펩티드 라이브러리의 첫번째 스크리닝 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 반복적인 합성을 통하여 각각 9개의 개별적인 헥사펩티드를 포함하는 4개의 펩티드 풀을 생산하였다. 각 펩티드 혼합물은 (D/R/W)(H/K/R)RWWM(SEQ ID NO: 12), (D/R/W)(H/K/R)RWWW(SEQ ID NO: 13), (D/R/W)(H/K/R)WWWM(SEQ ID NO: 12) 또는 (D/R/W)(H/K/R)WWWW(SEQ ID NO: 15)를 포함하고 있다. 각 펩티드 혼합물의 효능은 FPRL1에 대한 표지된 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 결합능을 분석하여 조사하였다. 아미노산 서열 (D/R/W)(H/K/R)WWWW(SEQ ID NO: 15)을 가지고 있는 펩티드 혼합물은 FPRL1에 대한 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 결합과 경쟁적으로 작용함으로써 가장 강한 활성을 나타내었다. 펩티드 혼합물은 C18 컬럼(Vydac, 218TP1022, 22X50 nm)을 이용한 역-상 HPLC에 의해 4개의 절편으로 동정되었다. RBL-2H3 세포에서 FPRL1과 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 결합을 억제하는 펩티드의 효능은 초기의 스크리닝에서 사용한 방법을 이용하여 평가하였다. 가장 큰 활성을 가진 절편내에 있는 펩티드는 질량분석법에 의해서 동정되었다.
표지된 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 억제에 있어서 합성된 단일 펩티드의 효능을 확인한 후, 본 발명자들은 RBL-2H3 세포에서 FPRL1에 대한 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 결합을 억제하는 가장 높은 활성을 가진 펩티드로서 최종적으로 Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-CONH2 [WRWWWW, WRW4 (SEQ ID NO:4)], Arg-His-Trp-Trp-Trp-Trp-CONH2 [RHWWWW, RHW4 (SEQ ID NO:6)], Asp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-CONH2 [DRWWWW, DRW4 (SEQ ID NO:8)] 및 Arg-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-CONH2 [RRWWWW, RRW4 (SEQ ID NO:5)]을 동정하였다. 4개의 헥사펩티드의 억제능은 다양한 농도에서 실시하였다(도 2). 그 중, 펩티드 WRW4(SEQ ID NO: 4)는 125I-WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 결합을 가장 효과적으로 억제하였다. 세개의 다른 페티드인 RHW4(SEQ ID NO: 6), DRW4(SEQ ID NO: 8) 및 RRW4(SEQ ID NO: 5) 또한 표지된 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 결합을 효과적으로 억제하였다(도 2). 음성 대조군 실험에서 헥사펩티드의 무작위 서열[Leu-Phe-Met-Tyr-His-Pro-CONH2, LFMYHP (SEQ ID NO:9)]을 이용할 경우, 10 μM이상에서도 어떠한 억제능을 관찰할 수 없었다(도 2). FPRL1에 대한 125I-WKYMVm(SEQ ID NO: 3)의 IC50값은 각각 WRW4(SEQ ID NO: 4)는 0.23 μM, RHW4(SEQ ID NO: 6)는 3.2 μM, RRW4(SEQ ID NO: 5)는 2.4 μM 및 DRW4(SEQ ID NO: 8)은 3.4 μM이었다.
<2-2> 활성화된 FPRL1 에 의해 증가된 칼슘을 억제하는 WRW4( SEQ ID NO: 4)
WKYMVm(SEQ ID NO: 3)에 의한 FPRL1의 자극은 FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포에 서 칼슘 증가를 유도하였다. 본 발명의 펩티드가 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도된 칼슘 증가를 억제하는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 다양한 농도의 WRW4(SEQ ID NO: 4)로 fura-2 로딩된 FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포를 자극하였고, 이어 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)을 효과적인 농도로 자극하였다. 도 3A에서와 같이, 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)를 단독으로 처리한 경우에는 세포내 칼슘 농도를 변화시키지 않았지만, 10 nM의 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)로 자극하기 전 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)를 전처리할 경우에는 FPRL1-발현용 PBL-2H3 세포에서 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)에 의해 유도된 칼슘 증가를 완전하게 억제하였다. FPRL1-유도된 신호전달에서 WRW4(SEQ ID NO: 4)에 의한 특이적인 억제능을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 다른 세포외 신초전달-유도된 칼슘 증가에서 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 효능을 조사하였다. FcεRI 교차결합은 RBL-2H3 세포에서 칼슘 증가를 유도하는 것으로 보고되고 있다(Narenjkar, J., et al., Cell. Calcium. 26:261, 1999). 1 ug/ml의 DNP-HAS로 FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포(1 ug/ml의 마우스 DNP-특이적인 IgE에 감수성을 지님)를 자극할 경우에는 칼슘 농도를 현저하게 증가시켰지만(도 3A), DNP-HAS를 자극하기 전 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)로 전처리할 경우에는 RBL-2H3세포에서 DNP-HAS-유도된 칼슘 증가를 현저하게 변화시키지 않았다. 이러한 결과는 WRW4(SEQ ID NO: 4)-유도된 칼슘 증가의 억제가 FPRL1-특이적인 현상임을 의미한다.
WKYMVm(SEQ ID NO: 3)에 의한 칼슘 증가를 WRW4(SEQ ID NO: 4)가 농도-의존적으로 억제하는지를 조사했을 때, 본 발명자들은 WRW4(SEQ ID NO: 4)가 농도-의존 적으로 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-연관된 과정을 억제함을 관찰할 수 있었다. 이때, 10 uM에서는 가장 높은 억제능을 보였고(도 3B), 1 uM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)에서는 약 55% 까지 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도된 칼슘 증가를 억제하였다(도 3B). 이러한 결과는, 본 발명의 WRW4가 FPRL1에 특이적인 길항제임을 의미한다.
<2-3> FPRL1 에 의한 ERK 활성을 억제하는 WRW4
WRW4(SEQ ID NO: 4) 펩티드가 FPRL1의 신호전달을 억제한다는 본 발명의 관점을 보충하기 위하여, 본 발명자들은 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도된 ERK 활성에 대한 상기 펩티드의 효능을 조사하였다. 따라서, 본 발명자들은 다양한 농도의 WRW4(SEQ ID NO: 4)로 FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포를 자극하였고, 항-인산화-ERK 항체를 이용한 웨스턴 블랏으로 ERK 인산화 정도를 측정하였다. 도 4A에서와 같이, 상기 세포에WRW4(SEQ ID NO: 4)를 단독으로 처리한 경우에는 어떠한 ERK 활성도 나타내지 않은 반면, 10 nM의 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)을 2분간 상기 세포에 처리한 경우에는 ERK 인산화 정도가 현저하게 증가함을 관찰할 수 있었다(도 4A). 더욱이, WRW4(SEQ ID NO: 4)를 전처리한 경우에는 농도-의존적으로 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도된 ERK 인산화를 억제하였다(도 4A). 비활성 대조군 펩티드인 LFMYHP(SEQ ID NO: 9)를 전처리한 경우에는 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)와 달리 ERK 인산화를 억제하지 못했다(도 4A). 더욱이, 본 발명의 항-ERK 항체를 이용한 웨스턴 블랏에서는 동일한 양의 단백질이 사용되었다(도 4A). 도 4B에서는 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)에 의한 ERK 활성에 있어서 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 정량적인 억제 효과를 나타낸 것이다. 이는, 본 발명의 WRW4(SEQ ID NO: 4)가 칼슘 증가 및 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)에 의한 FPRL1의 하위 단계인 ERK 활성을 억제한다는 것을 의미한다.
<2-4> FPRL1 -관련 세포의 주화 이동를 억제하는 WRW4 ( SEQ ID NO: 4)
FPRL1은 전통적인 화학유인물질 수용체로서, WKYMVm(SEQ ID NO: 3)은 FPRL1의 가장 중요한 생리적 기능 중 하나인 FPRL1을 통한 세포의 주화 이동를 유도한다고 종래에 보고되어져 있다(Le, Y., et al., J. Immunol. 163:6777, 1999). 따라서, 본 발명자들은 FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포의 주화 이동에서 WRW4(SEQ ID NO: 4) 펩티드를 다양한 농도로 처리하여, WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도된 주화이동에서 본 발명의 FPRL1 길항제인 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 효능을 조사하였다. 도 5A에서와 같이, WKYMVm(SEQ ID NO: 3)은 종-형태와 같이 농도-의존적으로 FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포에서 케모탁시스를 유도하였지만, 1 nM - 10　μM 농도의 WRW4(SEQ ID NO: 4)만으로는 FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포에 주화이동에 어떠한 효과도 주지 못했다(도 5A). 이때, 본 발명자들은 FPRL1-발현용 RBL-2H3 세포에서 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도된 세포 주화이동에 대한 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 효능을 관찰하였고, 10 nM의 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)을 이용하여 주화 이동 분석을 실시하기 전 여러 농도의 WRW4(SEQ ID NO: 4)을 첨가할 경우 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도된 세포 주화 이동을 농도-의존적으로 억제할 수 있음을 확인하였다(도 5B). 즉, 1 uM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)는 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도 주화 이동의 약 60% 정도를, 10 uM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)는 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도된 상기 과정을 거의 완전하게 억 제한 반면(도 5B), 10 uM의 비활성 대조군 펩티드인 LFMYHP(SEQ ID NO: 9)은 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도 주화이동에 어떠한 영향도 주지 못했다(도 5B). 이러한 결과는 본 발명의 WRW4(SEQ ID NO: 4)가 WKYMVm(SEQ ID NO: 3)-유도 주화 이동을 억제한다는 것을 의미한다.
<2-5> 인간 호중구에서 FPRL1 -유도된 세포 신호전달을 특이적으로 억제하는 WRW4(SEQ ID NO: 4)
세포내 리간드-유도된 FPRL1 신호전달에 대한 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 효능은 인간 호중구에서 조사하였다. Aβ42가 FPRL1에 대한 세포내 리간드로 작용한다는 것은 이미 알려져 있다(Le, Y., et al., J. Neurosci. 21: RC123, 2001). 본 발명자들은 40 μM의 Aβ42 펩티드를 인간 호중구에 처리한 경우 현저하게 칼슘을 변화시킨다는 것을 확인하였고(도 6A), WRW4(SEQ ID NO: 4) 단독으로는 인간 호중구에서 칼슘 증가를 나타내지 않은 반면(도 6A), 40 uM의 Aβ42 펩티드로 자극하기 전 상기 호중구에 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)를 전처리한 경우, Aβ42 펩티드-유도된 칼슘 증가가 완전하게 억제되었다(도 6A). FPRL1신호전달에서 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 특이성을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 인간 호중구에서 fMLF-촉진된 칼슘 증가에 대한 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 효능을 조사하였다. 1 μM의 fMLF로 자극한 경우에는 일시적으로 칼슘을 증가시켰지만, 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)로 인간 호중구를 전처리한 경우에는 fMLF에 의한 칼슘 증가에 어떠한 영향도 끼치지 않았다(도 6A). 또한, 본 발명자들은 다른 FPRL1-특이적 작용제(MMK-1 및 F 펩티 드)-유도된 칼슘 증가에 있어서 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 효능을 조사하였다. 도 6B에 나타낸 바와 같이, 1μM의 MMK-1 및 30 μM의 F 펩티드로 자극하기 전 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)로 자극한 경우, 두개의 FPRL1 작용제에 의한 칼슘 증가는 완전하게 억제되었다. 500 uM의 ATP로 자극한 경우에는 일시적으로 칼슘을 증가시켰으나, 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)로 인간 호중구에 전처리한 경우에는 ATP에 의한 칼슘 증가에 어떠한 영향도 끼치지 못했다(도 6B). 이러한 결과는 본 발명의 WRW4(SEQ ID NO: 4)가 인간 호중구에서 FPRL1-유도된 세포 신호전달을 특이적으로 억제할 뿐, FPR-유도된 세포 신호전달은 억제하지 않음을 의미한다.
<2-6> Aβ42 펩티드-유도된 호중구 활성을 억제하는 WRW4 ( SEQ ID NO: 4)
활성산소 생성은 호중구와 같은 식균작용을 하는 백혈구의 중요한 기능 중 하나이다(Hampton, M. B., et al., Blood 92:3007, 1998). 본 발명자들은 인간 호중구에서 Aβ42가 활성산소 생성을 증가시킴을 확인하였다. 더욱이, 본 발명의 Aβ42 펩티드-유도된 활성산소 생성 활성은 농도-의존적이며, 특히 40 uM의 펩티드 농도에서 가장 높은 활성을 나타내었다(도 7A). 인간 호중구에 100 uM 이상으로 WRW4(SEQ ID NO: 4)를 첨가한 경우에는 활성산소 생성에 어떠한 영향도 끼치지 않았지만(도 7A), 상기 호중구를 다양한 농도의 WRW4(SEQ ID NO: 4)로 전처리한 경우, Aβ42 펩티드-유도된 활성산소 생성은 농도-의존적으로 억제되었다(도 7B). 예를 들면, 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)에서는 Aβ42 펩티드에 의한 활성산소 생성을 거의 완전하게 억제시켰다(도 7B). 대조군 실험에서, 본 발명자들은 인간 호 중구에서 Aβ42 펩티드-유도된 활성산소 생성에 대한 비활성 대조군 펩티드[LFMYHP(SEQ ID NO: 9)]의 효능을 조사하였다. Aβ42 펩티드로 자극하기 전 여러 농도의 LFMYHP(SEQ ID NO: 9)로 전처리한 경우에는 인간 호중구에서 Aβ42 펩티드-촉진된 활성산소 생성에 어떠한 영향도 끼치지 않았다(도 7B).
인간 호중구에서 Aβ42 펩티드는 FPRL1을 통한 주화성 이동를 유도한다고 보고되고 있다(Tiffany, H. L., et al., J. Biol. Chem. 276:23645, 2001). 따라서, 본 발명자들은 호중구 주화성 이동에서 Aβ42 의 효능을 조사하였고, Aβ42 펩티드가 농도-의존적으로 호중구 주화이동을 유도한다는 것을 확인하였다(도 7C).
즉, 40 μM의 Aβ42 는 10배 정도 세포의 이주를 증가시켰다(도 7C). WRW4(SEQ ID NO: 4)는 1 μM - 100 μM 농도에서는 호중구 주화이동에 어떠한 영향도 주지 못했다(도 7C). 따라서, Aβ42 펩티드-유도된 호중구 주화이동에 대한 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 효능을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 40 uM의 Aβ42 주화이동을 분석하기 전 인간 호중구에 다양한 농도의 WRW4(SEQ ID NO: 4)를 전처리 하였다. 그 결과, Aβ42 펩티드-유도된 호중주 주화이동을 농도-의존적으로 억제함을 관찰하였고(도 7D), 10 μM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)에서는 Aβ42 펩티드에 의해 유도된 호중구 주화이동을 거의 완전하게 억제시켰다(도 7D). 한편, 대조군 펩티드인 LFMYHP(SEQ ID NO: 9)는 Aβ42 펩티드에 의해 유도된 호중구 주화이동에 어떠한 영향도 끼치지 못했다(도 7D). 이러한 결과는 선택적인 FPRL1 길항제인 WRW4(SEQ ID NO: 4)가 두 개의 Aβ42 펩티드에 의해 유도된 세포 반응 즉, 인간 호중구에서 활성산소 생성 및 주화이동을 억제한다는 것을 의미한다.
<2-7> 인간 대식세포에서 Aβ42 펩티드의 유입을 억제하는 WRW4 ( SEQ ID NO: 4)
Aβ42 펩티드는 FPRL1을 통해 인간 대식세포로 유입되는 것으로 알려져 있다(Yazawa, H., et al., FASEB J. 15: 2454-2462, 2001). 인간 호중구에서 WRW4(SEQ ID NO: 4)는 Aβ42 펩티드에 의해 유도된 세포내 신호전달을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명자들은 Aβ42의 유입에 대한 WRW4(SEQ ID NO: 4)의 효능을 조사하였다. 10 uM의 Aβ42 를 인간 대식세포와 함께 배양했을 때, Aβ42 유입(internalization)은 시간-의존적으로 유도되었다(도 8). 즉, 5분 경과 후 발생된 Aβ42의 유입은 배양 후 30분에서 최대로 유입되었다(도 8). 인간 대식세포에 Aβ42 펩티드를 배양하기 전 10 uM의 WRW4(SEQ ID NO: 4)로 전처리했을 때, 본 발명자들은 Aβ42의 유입이 WRW4(SEQ ID NO: 4)에 의해 완전하게 억제됨을 관찰하였다(도 8). 이러한 결과는 WRW4(SEQ ID NO: 4)에 의한 FPRL1의 선점이 인간 대식세포에서 FPRL1을 통한 Aβ42 펩티드의 유입을 억제할 수 있음을 의미한다.
< 실시예 3> 추가적인 FPRL1 길항제 펩티드의 특성
<3-1> FPRL1 -관련된 칼슘 증가를 억제하는 추가적인 펩티드
FPRL1 작용제를 첨가하기 전 FPRL1를 가지고 있는 세포와 펩티드를 접촉시킬 때 세포내 칼슘 농도에 대한 다양한 펩티드계의 효능을 분석하는 방법 및 원리는 상기 실시예 <1-5>에서, 펩티드를 이용한 초기 실험의 보다 자세한 설명은 실시예 <2-2>에 기재하였다. 본 발명에서 사용된 길항제 펩티드계로부터 얻은 칼슘 값은 <표 2>에 기재하였다.
상기 실시예 <2-2>에서, 펩티드 WRWWWW는 FPRL1 수용체에 대한 높은 길항제의 효능을 가지고 있다.하나의 펩티드인 wWRWWM(SEQ ID NO: 16)은 세포내 칼슘 농도의 증가에 대한 펩티드의 억제능의 관점에서 보면 100배 이상의 억제 활성을 가지고 있다고 볼 수 있다. 즉, 이들의 IC50 값을 비교해 보면, wWRWWM(SEQ ID NO: 16)에서는 8.2 ±0.6 nM이고, WRWWWW(SEQ ID NO: 4)에서는 1000 ± 210 nM이다.
세포내 칼슘 농도에 대한 FPRL1 길항제의 효능 요약
길항제 칼슘(FPRL1) IC50 (nM)
w W R W W M (SEQ ID NO: 16) 8.2±0.6
W W R W W W (SEQ ID NO: 17) 58 ± 31
W W R W W M (SEQ ID NO: 18) 83 ± 22
w W R W W W (SEQ ID NO: 19) 110 ±29
W W W W W M (SEQ ID NO: 20) 130 ±15
W W W W W R (SEQ ID NO: 21) 220 ± 25
W W W R W W (SEQ ID NO: 22) 470 ± 100
L W W W W W (SEQ ID NO: 23) 500 ±120
R W W W (SEQ ID NO: 24) 600 ±180
R W W M (SEQ ID NO: 25) 650 ±120
W W W W (SEQ ID NO: 26) 860 ± 180
W R W W W W (SEQ ID NO: 4) 1000 ±210
L R W W W W (SEQ ID NO: 27) 1100 ±940
W W W W R W (SEQ ID NO: 28) 2700
W W W W M R (SEQ ID NO: 29) 5700
W W W M (SEQ ID NO: 30) 5900 ± 230
W W W W W W (SEQ ID NO: 31) >10000
W W W W W w (SEQ ID NO: 32) >10000
W R R W W W (SEQ ID NO: 33) >10000
W R W W (SEQ ID NO: 34) >10000
W W W w (SEQ ID NO: 35) >10000
R W W w (SEQ ID NO: 36) >10000
W R W (SEQ ID NO: 7) >10000
<References>
1. Murphy, P. M., et al., J. Biol. Chem. 267: 7637, 1992
2. Prossnitz, E. R., & R. D. Ye., Pharmacol. Ther. 74:73, 1997
3. Le, Y., et al., J. Neuroimmunol. 111:102, 2000
4. Ye, R. D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 184:582, 1992
5. Gronert, K., et al., J. Exp. Med. 187:1285, 1998
6. Le, Y., Cytokine Growth Factor Rev. 12:91, 2001
7. Le, Y., et al., Int. Immunopharmacol. 2:1, 2002
8. Yang, D., et al., J. Exp. Med. 192:1069, 2000
9. Dahlgren, C., et al., Blood 95:1810, 2000
10. Li, B. Q., et al., Blood 97:2941, 2001
11. Le, Y., et al., Trends Immunol. 23:541, 2002
12. Le, Y., et al., J. Neurosci. 21: RC123, 2001
13. Le, Y., et al., J. Immunol. 166:1448, 2001
14. Chiang, N., et al., J. Exp. Med. 191:1197, 2000
15. Su, S. B., et al., J. Immunol. 162:5924, 1999
16. Deng, X., et al., Blood 94:1165, 1999
17. Shen, W., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 272:276, 2000
18. Baek, S. H., et al., J. Biol. Chem. 271: 8170, 1996
19. Seo, J. K., et al., J. Immunol. 158:1895, 1997
20. Le, Y., et al., J. Immunol. 163:6777, 1999
21. Libby P., Nature 420:868, 2002
22. He, R., et al., Blood 101:1572, 2003
23. Bae, Y. S., et al., Blood 97:2854, 2001
24. Hu, J. Y., et al., J. Leukoc. Biol. 70:155, 2001
25. Grynkiewicz, G., et al., J. Biol. Chem. 260:3440, 1985
26. Narenjkar, J., et al., Cell. Calcium. 26:261, 1999
27. Yazawa, H., et al., FASEB J. 15: 2454-2462, 2001
28. Hampton, M. B., et al., Blood 92:3007, 1998
29. Tiffany, H. L., et al., J. Biol. Chem. 276:23645, 2001
30. Freer, R. J., et al., Biochemistry 19:2404, 1980
31. Dalpiaz, A., et al., Boll. Chim. Farm. 138:44, 1999
32. Wenzel-Seifert, K., et al., J. Immunol. 147:1940, 1991
33. Wenzel-Seifert, K., & R. Seifert., J. Immunol. 150:4591, 1993
34. de Paulis, A., et al., J. Allergy Clin. Immunol. 98:152, 1996
35. Vagnucci, A. H. Jr, & W. W. Li., Lancet 361:605, 2003
36. Checler, F., & B. Vincent., Trends. Neurosci. 25: 616, 2002
37. Schubert, P., et al., J. Neural. Transm. Suppl. 54:167, 1998
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  1. 삭제
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  6. 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 및 35로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 폴리펩티드.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4, 5, 6, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 및 30으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 폴리펩티드.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4, 5, 6, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 폴리펩티드.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 25로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 폴리펩티드.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4, 16, 18, 20, 21 및 22로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 폴리펩티드.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열이 SEQ ID NO:4 또는 16인 폴리펩티드.
  12. 삭제
  13. 제6항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 염증 치료 또는 예방용 조성물.
  14. 제6항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 관절염 치료 또는 예방용 조성물.
  15. 제6항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 자가 면역질환의 치료 또는 예방용 조성물.
  16. 삭제
  17. 제6항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 알츠하이머 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
  18. FPR (formyl peptide receptor) 계열 수용체를 갖는 세포와 서열번호 3의 폴리펩티드를 제공하고,
    FPR 계열 수용체의 길항제(antagonist)의 후보 화합물과 상기 세포를 접촉시키고,
    상기 후보 화합물이 FPR 계열 수용체에 결합하여 상기 FPR 계열 수용체와 상기 서열번호 3의 폴리펩티드의 결합을 억제하여 상기 FPR 계열 수용체의 활성을 저해하면 상기 후보 화합물을 길항제로 동정하는 단계를 포함하는
    FPR 계열 수용체의 길항제를 동정하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 FPR 계열 수용체가 FPRL 1(formyl peptide receptor like 1)인 방법.
  20. 삭제
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007007985A2 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 Postech Foundation Ligand of regulating immune response, and use thereof in treating an immune response-related disease
KR100630489B1 (ko) 2006-01-10 2006-10-04 주식회사 펩트론 면역반응을 조절하는 펩타이드
WO2008039843A2 (en) * 2006-09-26 2008-04-03 Lipid Sciences, Inc. Novel peptides that promote lipid efflux
KR20100123240A (ko) 2009-05-15 2010-11-24 포항공과대학교 산학협력단 호흡기 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위한 호흡기내 투여용 약학 제제 및 상기 질환의 치료 또는 예방 방법
WO2011073918A2 (en) 2009-12-16 2011-06-23 Actelion Pharmaceuticals Ltd Peptides as modulators of fprl1 and/or fprl2
WO2013050346A1 (en) * 2011-10-07 2013-04-11 Polyphor Ag Template -fixed peptidomimetics as inhibitors of fpr1
WO2014153241A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of staphylococcal disorders
CN104274817B (zh) * 2014-09-25 2016-06-15 中山大学 Wrw三肽在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途
CN104258371B (zh) * 2014-09-25 2016-06-15 中山大学 Www三肽在制备治疗阿尔茨海默症药物中的用途
CN109679981A (zh) * 2019-02-21 2019-04-26 武汉大学 一种甲酰基肽定向进化噬菌体及其制备方法与应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5324716A (en) * 1991-06-14 1994-06-28 Regents Of The University Of California Broad spectrum antimicrobial compounds and methods of use
AU4988900A (en) * 1999-05-05 2000-11-17 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The T20/dp178 and t21/dp107 are activators of human phagocyte formyl peptide receptors
US20030096260A1 (en) * 2001-10-09 2003-05-22 Zhenhua Miao Compositions useful as ligands for the formyl peptide receptor like 1 receptor and methods of use thereof
AU2003267347A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-29 Galapagos Genomics N.V. Method of identifying a compound that changes the amyloid-beta precursor protein processing in a cell

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
미국특허공보 2003-0096260 A1 (2003.05.22. 공고)*

Also Published As

Publication number Publication date
US7671028B2 (en) 2010-03-02
US20080274978A1 (en) 2008-11-06
KR20060114030A (ko) 2006-11-03
WO2005075505A1 (en) 2005-08-18

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