KR100630489B1 - 면역반응을 조절하는 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역반응을 조절하는 펩타이드에 관한 것으로, 상기 펩타이드는 FPR 또는 FPRL1에 작용하여 면역반응을 조절한다.
면역 조절 펩타이드, FPR(formyl peptide receptor), FPRL1(formyl peptide receptor like 1)

Description

면역반응을 조절하는 펩타이드{Peptides for modulating immune response}
도 1은 본 발명의 펩타이드의 및 WKYMVm에 의한 FPRL1에 결합된 125I-표지된 WKYMVm의 치환정도(displacement)를 보인 도면이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드의 혈장내 안정성을 살펴본 결과이다.
1. Le, Y., Li, B., Gong, W., Shen, W., Hu, J., Dunlop, N. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2000) Immunol Rev. 177, 185-194.
2. Le, Y., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (2001) Cytokine Growth Factor Rev. 12, 91-105.
3. White, J. R., Lee, J. M., Young, P. R., Hertzberg, R. P., Jurewicz, A. J., Chaikin, M. A., Widdowson, K., Foley, J. J., Martin, L. D., Griswold, D. E., and Sarau, H. M. (1998) J. Biol. Chem. 273, 10095-10098.
4. Zagorski, J., and Wahl, S. M. (1997) J. Immunol. 159, 1059-1062.
5.Prossnitz, E. R., and Ye, R. D. (1997) Pharmacol. Ther. 74, 73-102.
6.Su, S. B., Gong, W. H., Gao, J. L., Shen, W. P., Grimm, M. C., Deng, X., Murphy, P. M., Oppenheim, J. J., and Wang, J. M. (1999) Blood 93, 3885-3892.
7.Walther, A., Riehemann, K., and Gerke, V. (2000) Mol. Cell. 5, 831-840.
8.Baek, S. H., Seo, J. K., Chae, C. B., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1996) J. Biol. Chem. 271, 8170-8175.
9.Seo, J. K., Choi, S. Y., Kim, Y., Baek, S. H., Kim, K. T., Chae, C. B., Lambeth, J. D., Suh, P. G., and Ryu, S.H. (1997) J. Immunol. 158, 1895-1901.
10. Bae, Y. S., Ju, S. A., Kim, J. Y., Seo, J. K., Baek, S. H., Kwak, J. Y., Kim, B. S., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 65, 241-248.
11. Bae, Y. S., Kim, Y., Kim, Y., Kim, J. H., Suh, P. G., and Ryu, S. H. (1999) J. Leukoc. Biol. 66, 915-922.
12. Le, Y., Gong, W., Li, B., Dunlop, N. M., Shen, W., Su, S. B., Ye, R. D., and Wang, J. M. (1999) J. Immunol. 163, 6777-6784.
13. Le Y, Murphy PM, Wang JM.(2002) Trends Immunol. 23(11):541-8.
14. Le Y, Yang Y, Cui Y, Yazawa H, Gong W, Qic C, Wang JM. (2002) Int. Immunopharmacol. 2(1):1-13.
본 발명은 면역반응을 조절하는 펩타이드에 관한 것이다.
G 단백질은 외부의 신호로부터 체내세포까지 전달하는 데 있어서 중요한 기능을 하는 단백질 중의 하나이다. 외부에서 들어온 신호는 세포 내 G 단백질과 연결된 수용체(G protein coupled receptor)에 결합하며, G 단백질이 활성화가 이루어지고, 2차 매개체의 도움으로 신호가 증폭되며 복잡하고 다양한 세포신호전달과정을 통하여 반응하게 된다. 특히 G 단백질과 연결된 수용체 중 FPR(formyl peptide receptor) 혹은 FPRL1(formyl peptide receptor like 1)은 항세균 펩타이드의 수용체로써 면역조절과정에 관계가 있는 것으로 알려져 있다.(13,14)
면역 반응 중 대부분이 침입 병균을 제거하기 위한 숙주 세포의 적합한 기능에 필수적으로 필요하지만, 몇몇 반응은 면역 반응에서 바람직하지 않은 부작용이 될 수도 있기 때문에 약제 개발 분야에서 약제 후보물질의 부작용을 감소시키거나 제거하는 것이 주요 관심사이다. 이를 위하여 선택적인 면역반응 조절인자 또는 몇 개의 접근경로를 통한 선택적인 대항제(antagonists)를 개발하기 위한 많은 연구가 진행되고 있다.(3,4)
FPR의 다양한 작용제는 내인성 공급원(endogenous source) 또는 인공합성으 로 확인되었다.(1,2) 이들의 예로는 박테리아 펩타이드(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine(fMLF)), HIV-외피 도메인(T20 및 T21), 및 숙주-유도성 작용제(host-derived agonists; Annexin I 및 Aβ 42 )(5-7)등이 있다. 최근 모노사이트 및 호중구(neutrophil)와 같은 백혈구 세포를 증가시키는(stimulate) 펩타이드 리간드(Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met-NH2)(이하에서는 ‘WKYMVm’이라 함)를 인공적으로 합성하여 발표하였다.(8-11) 또한 Wang ji ming을 비롯한 다양한 그룹들에 의해 FPRL1과 연관된 질병들에 대하여 활발한 연구가 진행 중이다. Le 등은 WKYMVm이 FPR(formyl peptide receptor) 및 FPRL1(formyl peptide receptor-like 1)에 결합한다고도 발표하였다.(12) WKYMVm은 넓은 범위의 수용체에 대하여 높은 친화도를 가지는 짧은 펩타이드이므로 FPR- 또는 FPRL1-매개된 시그널링의 연구에 유용할 수 있다.
그러나 FPR 또는 FPRL1에 특이적으로 결합하여 선택적인 면역 조절인자 또는 선택적인 대항제를 개발하는 일은 아직 미약하며, 또한 이전의 그룹에서 발명된 화합물들은 분자 스크리닝을 통하여 면역조절 관계를 알아보기에는 다소 제한적이다. 백신의 개발이 증가함에 따라서 그 작용을 향상시킬 수 있는 치료제의 개발이 필요하며 그 치료제의 개발을 위해서는 다양한 화합물을 이용하여 면역 세포들의 작용기전에 대한 연구가 요구되고 있는 실정이다
이런 배경하에, 본 발명자는 다양한 종류의 펩타이드를 제조하고 본 발명의 펩타이드가 WKYMVm보다 FPR 또는 FPRL1에 보다 강한 결합력으로 결합하고 낮은 농 도에서도 면역조절 효과를 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 면역반응을 조절하는 펩타이드를 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 면역반응을 조절하는 조성물을 제공하기 위함이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 하나 이상의 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 면역반응을 조절하는 방법을 제공하기 위함이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 면역반응을 조절하는 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에서, "펩타이드(peptide)"란 아미드 결합(또는 펩티드 결합)으로 연결된 아미노산으로 이루어진 아미노산 폴리머를 의미하고 다양하게 변형된 구조를 가진다. 본 발명의 펩타이드는 FPR 또는 FPRL1를 활성화시켜 면역반응을 조절하는 펩타이드로, 기존의 면역조절 펩타이드인 WKYMVm보다 FPR 수용체 족에 강하게 결합하고 우수한 면역반응 조절 효과를 가지는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에서 용어, "면역반응 조절"이란 펩타이드가 세포에 작용하여 면역반응을 증가시키는 것을 의미한다. 본 발명의 펩타이드는, FPR 또는 FPRL1을 활성화시킨다. 호중구(neutrophil) 및 모노사이트와 같은 식세포(phagocytic cell)에서 발현되는 포르밀 펩타이드 수용체 족(formyl peptide receptor (FPR) 및 formyl peptide receptor-like 1(FPRL1))은 병원균 감염에 대한 숙주의 대항에서 중요한 역할을 한다고 알려졌으며 FPR의 활성화는 복잡한 하부(downstream) 시그널링을 유도하여 주화성 이동(chemotactic migration), 탈과립화(degranulation), 및 수퍼옥사이드 생성(superoxide generation)와 같은 세포 반응을 유도한다고 알려져 있다. 따라서, 본 반응의 펩타이드가 작용하는 면역 반응은 상기 기작을 포함할 뿐만 아니라 상기 기작에 의해 직, 간접적으로 유발되는 면역 반응까지 포함한다.
하나의 구체적인 양태로서, 본 발명은 화학식 1의 아미노산 서열을 포함하는 면역반응을 조절하는 펩타이드에 관한 것이다.
화학식 1
X1-(Nle)-X2-m
상기식에서, Nle은 L-노오루이신(L-Nor-Leu); X1은 L-페닐알라닌(L-phe), L-티로신(L-Try), L-트립토판(L-Trp), L-글리신(L-Gly), L-히스티딘(L-His), L-글루타믹산(L-Glu), L-아르기닌(L-Arg) 또는 L-아스파틱산(L-Asp); X2는 L-발린(L-Val), L-티로신(L-Tyr), L-페닐알라닌(L-Phe), L-트립토판(L-Trp) 또는 L-글리신(L-Gly); 및 m은 D-메치오닌(D-Met)을 나타낸다.
상기 화학식 1의 펩타이드는, N 말단의 잔기에서 1 내지 3개의 아미노산을 추가로 포함하는 화학식 2 내지 화학식 4 의 펩타이드일 수 있다.
화학식 2
A1-X1-(Nle)-X2-m
화학식 3
A2-A1-X1-(Nle)-X2-m
화학식 4
A3-A2-A1-X1-(Nle)-X2-m
상기 화학식 2 내지 4에서, A1은 L-라이신(L-Lys), L-아르기닌(L-Arg), L-히스티딘(L-His), L-글루타믹산(L-Glu) 또는 L-아스파틱산(L-Asp); A2는 L-트립토판(L-Trp), D-트립토판(D-Trp), L-아스파틱산(L-Asp), L-히스티딘(L-His) 또는 L-알라닌(L-Ala); 및 A3는 L-라이신(L-Lys), L-아스파틱산(L-Asp), L-히스티딘(L-His) 또는 L-알라닌(L-Ala)을 나타낸다.
화학식 1 내지 4의 펩타이드는, N 말단의 잔기에서 L-시스테인(L-Cys) 또는 D-시스테인(D-Cys)를 추가로 포함할 수 있다.
시스테인을 포함한 펩타이드는 디설피드 결합을 통하여 다이머를 형성할 수 있다. 펩타이드 다이머는 동일한 2개의 펩타이가 디설피드 결합을 한 호모다이머(homodimer)이거나 상이한 2개의 펩타이드가 디설피드 결합을 한 헤테로다이머(heterodimer)의 형태일 수 있다.
상기 모든 펩타이드의 C 말단의 카복실기는 아미드기, 에스테르기,싸이오에스터기 등으로 치환될 수 있다. 상기는 모든 펩타이드의 N 말단의 아미노기가 아세틸기, 포밀기, 팔미토일기, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐기로 등으로 치환될 수 있다.
상기한 펩타이드의 구체적인 예로서, 화합물 1인 WKF(Nle)Vm-NH2, 화합물 3인 WKY(Nle)Ym-NH2, 화합물 5인 WKY(Nle)Fm-NH2, 화합물 7인 WKY(Nle)Wm-NH2, 화합물 9인 WRY(Nle)Vm-NH2, 화합물 11인 WHY(Nle)Vm-NH2, 화합물 13인 WKW(Nle)Vm-NH2, 화합물 15인 WKG(Nle)Vm-NH2, 화합물 17인 WKY(Nle)Gm-NH2, 화합물 19인 WEY(Nle)Vm-NH2, 화합물 21인 WDY(Nle)Vm-NH2, 화합물 23인 WKH(Nle)Vm-NH2, 화합물 25인 WKE(Nle)Vm-NH2, 화합물 27인 WKR(Nle)Vm-NH2, 화합물 29인 WKD(Nle)Vm-NH2, 화합물 30인 KY(Nle)Vm-NH2, 화합물 32인 Y(Nle)Vm-NH2, 화합물 34인 WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 98인 KWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 99인 DWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 100인 HWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 101인 AWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 102인 DKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 103인 HKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 104인 AKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 106인 wKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 40인 CWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 41인 CWKF(Nle)Vm-NH2, 화합물 42인 CWKY(Nle)Ym-NH2, 화합물 43인 CWKY(Nle)Fm-NH2, 화합물 44인 CWKY(Nle)Wm-NH2, 화합물 45인 CWRY(Nle)Vm-NH2, 화합물 46인 CWHY(Nle)Vm-NH2, 화합물 47인 CWKW(Nle)Vm-NH2, 화합물 48인 CWKG(Nle)Vm-NH2, 화합물 49인 CWKY(Nle)Gm-NH2, 화합물 50인 CWEY(Nle)Vm-NH2, 화합물 51인 CWDY(Nle)Vm-NH2, 화합물 52인 CWKH(Nle)Vm-NH2, 화합물 53인 CWKE(Nle)Vm-NH2, 화합물 54인 CWKR(Nle)Vm-NH2, 화합물 55인 CWKD(Nle)Vm-NH2, 화합물 56인 CKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 57인 CY(Nle)Vm-NH2, 화합물 105인 cWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 2인 [sCWKF(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 4인 [sCWKY(Nle)Ym-NH2]2, 화합물 6인 [sCWKY(Nle)Fm-NH2]2, 화합물 8인 [sCWKY(Nle)Wm-NH2]2, 화합물 10인 [sCWRY(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 12인 [sCWHY(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 14인 [sCWKW(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 16인 [sCWKG(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 18인[sCWKY(Nle)Gm-NH2]2, 화합물 20인 [sCWEY(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 22인 [sCWDY(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 24인 [sCWKH(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 26인 [sCWKE(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 28인 [sCWKR(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 31인 [sCKY(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 33인 [sCY(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 35인 [sCWKY(Nle)Vm-NH2]2 또는 화합물 58인 [sCWKD(Nle)Vm-NH2]2 을 예시할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태로서, 본 발명은 화학식 5의 아미노산 서열을 포함하는 면역반응을 조절하는 펩타이드에 관한 것이다.
화학식 5
Z1-V-(Nle)-Y-K-Z2
상기식에서, Nle은 L-노오루이신(L-Nor-Leu); V는 L-발린(L-Val); Y는 L-티로신(L-Tyr); K는 L-라이신(L-Lys); Z1은 L-메치오닌(L-Met) 또는 D-메치오닌(D-Met); 및 Z2는 L-트립토판(L-Trp) 또는 D-트립토판(D-Trp)을 나타낸다.
화학식 5의 펩타이드는, N 말단의 잔기에서 L-시스테인(L-Cys)을 추가로 포함할 수 있다.
시스테인을 추가로 포함한 펩타이드는 디설피드 결합을 통하여 다이머를 형성할 수 있다. 펩타이드 다이머는 동일한 펩타이가 디설피드 결합을 한 호모다이머이거나 상이한 2개의 펩타이드가 디설피드 결합을 한 헤테로다이머의 형태일 수 있다.
상기 모든 펩타이드의 C 말단의 카복실기는 아미드기, 에스테르기,싸이오에스터기 등으로 치환될 수 있다. 상기는 모든 펩타이드의 N 말단의 아미노기가 아 세틸기, 포밀기, 팔미토일기, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐기로 등으로 치환될 수 있다.
상기 펩타이드의 구체적인 예시로서, 화합물 36인 mV(Nle)YKW-NH2, 화합물 38인 MV(Nle)YKw-NH2, 화합물 77인 CmV(Nle)YKW-NH2, 화합물 78인 CMV(Nle)YKw-NH2, 화합물 37인 [sCmV(Nle)YKW-NH2]2 또는 화합물 39인 [sCMV(Nle)YKw-NH2]2 의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 예시할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태로서 본 발명은 화학식 6의 아미노산 서열을 포함하는 면역반응을 조절하는 펩타이드에 관한 것이다.
화학식 6
W-K-Y-B1-V-m
상기식에서, W는 L-트립토판(L-Trp); K는 L-라이신(L-Lys); Y는 L-티로신(L-Tyr); V는 L-발린(L-Val); m은 D-메치오닌(D-Met); 및 B1은 L-아스파틱산(L-Asp), L-이소루이신(L-Ile), L-라이신(L-Lys), L-트레오닌(L-Thr) L-발린(L-Val) 또는 L-노오루이신(L-Nor-Leu)을 나타낸다.
또한, 화학식 6의 펩타이드는 N 말단의 잔기에서 L-시스테인(L-Cys)을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 화학식 6의 펩타이드 또는 화학식 6의 N 말단 잔기에서 L-시스테인을 추가로 포함한 펩타이드는, 펩타이드의 N 말단 잔기에서 L-라이신(L-Lys), 당(sugar), 사이클릭 유레아(cyclin urea), 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9를 추가로 포함할 수 있다.
화학식 7
m-V-Nle-B2
상기식에서, Nle는 노오루이신(L-Nor-Leu); V는 L-발린(L-Val); m은 D-메치오닌(D-Met); 및 B2는 L-티로신(L-Tyr), L-라이신(L-Lys), L-트립토판(L-Trp), L-시스테인(L-Cys) 및 L-프롤린(L-Pro) 중에서 1 내지 5개 선택된 아미노산을 나타내고,
화학식 8
N-Palm-NH-(CH2)n-NH-C(=O)-NH
상기식에서, Palm은 팔미토일기; 및 n은 1 내지 5를 나타내고,
화학식 9
Figure 112006001772771-pat00001
상기식에서, 상기식에서, n은 0 내지 5; X는 C, N 또는 O; 및 Y는 치환되지 않거나 치환된 알킬, 아릴을 나타낸다.
당은 (i)D-자일로우스(D-xylose), L-자일로우스(L-xylose), D-리보우즈(D-ribose), L-리보우즈(L-ribose), D-아라비노스(D-arabinose), L-아라비노스(L-arabinose) 인 오탄당 및 D-갈락토즈(D-glactose), L-갈락토즈(L-glactose), D-만노즈(D-mannose), L-만노즈(L-mannose), D-글루코스(D-glucose), L-글루코스(L-glucose)인 육탄당인 단당류, 및 (ii)락토즈(lactose), 말토즈(maltose) 및 셀로비오즈(cellobiose)인 이당류 중에서 선택될 수 있다. 이 때, 당은 펩타이드와 직접적으로 연결되거나 링커를 통하여 연결된다. 이 때, 사용될 수 있는 링커는 특별히 제한되지 않지만, 에테르 또는 에스테르 형태의 링커에서 선택된다.
상기한 펩타이드 중, 라이신을 가지는 펩타이드는 L-라이신(L-Lys)의 측쇄반응기가 당 또는 화학식 10으로 치환될 수 있다.
화학식 10
(CH2)n-B3-B4-Nle-Vm
상기식에서, B3는 NH2 또는 NHCO; B4는 L-티로신(L-Try), L-트립토판(L-Trp), L-라이신(L-Lys), L-아스파틱산(L-Asp) 및 L-글루타믹산(L-Glu) 중에서 1 내지 5개 선택된 아미노산; 및 n은 1 내지 5를 나타낸다.
라이신의 측쇄 반응기에 결합하는 당(sugar)의 종류는 상기한 바와 같다.
이 때, 당 또는 화학식 10으로 치환되는 L-라이신의 개수는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 1 내지 2의 라이신 잔기가 치환된다.
상기한 펩타이드 중 L-시스테인(L-Cys)을 가지는 펩타이드는 디설피드 결합을 통하여 다이머를 형성할 수 있다. 펩타이드 다이머는 동일한 펩타이가 디설피드 결합을 한 호모다이머 또는 상이한 펩타이드가 디설피드 결합을 한 헤테로다이머의 형태이다.
상기 모든 펩타이드의 C 말단의 카복실기는 아미드기, 에스테르기,싸이오에스터기 등으로 치환될 수 있다. 상기는 모든 펩타이드의 N 말단의 아미노기가 아세틸기, 포밀기, 팔미토일기, 9-플루오레닐메틸옥시카보닐기로 등으로 치환될 수 있다.
상기 펩타이드의 구체적인 예시로서, 화합물 62인 WKYDVm-NH2, 화합물 64인 WKYIVm-NH2, 화합물 66인 WKYKVm-NH2, 화합물 68인 WKYTVm-NH2, 화합물 70인 WKYVVm-NH2, 화합물 72인 CWKYDVm-NH2, 화합물 73인 CWKYIVm-NH2, 화합물 74인 CWKYKVm-NH2, 화합물 75인 CWKYTVm-NH2, 화합물 76인 CWKYVVm-NH2, 화합물 63인 [sCWKYDVm-NH2]2, 화합물 65인 [sCWKYIVm-NH2]2, 화합물 67인 [sCWKYKVm-NH2]2, 화합물 69인 [sCWKYTVm-NH2]2, 화합물 71인 [sCWKYVVm-NH2]2, 화합물 59인 mV(Nle)YKWWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 60인 mV(Nle)YKWCCWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 61인 mV(Nle)YKWPWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 79인 N-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 80인 N-Ac-WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 81인 N-f-CWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 82인 N-f-WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 83인 WK[(CH2)4NH2-Y(Nle)Vm-NH2]-Y(Nle)Vm-NH2, 화합물 84인 WK[(CH2)4NH2-WKY(Nle)Vm-NH2]-Y(Nle)Vm-NH2, 화합물 85인 N-palm-WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 86인 Fmoc-CWKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 87인 N-Palm-NHCH2CH2NHC(=O)NH-WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 88인 Cyclic-(urea)-WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 89인 K[(CH2)4NHCO-DWKY(Nle)Vm-NH2]-WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 90인 K[(CH2)4NHCO-EWKY(Nle)Vm-NH2]-WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 91인 D-Glucose-Ac-WKY(Nle)Vm-NH2, 화합물 92인 D-Glucose-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH2 , 화합물 93인 WK(Glucose-Ac)Y(Nle)Vm-NH2, 화합물 94인 CWK(Glucose-Ac)Y(Nle)Vm-NH2, 화합물 95인 [sGlucose-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH2]2, 화합물 96인 Piperazine-CH2CONH-WKY(Nle)Vm-NH2 또는 화합물 97인 Piperazine-CONH-WKY(Nle)Vm-NH2 인 펩타이드를 예시할 수 있다.
본 발명자는 FPR 또는 FPRL-1을 활성화시키는 펩타이드를 제조하고 FPRL1- 발현 세포주에서의 [Ca2 +]i 증가에 따른 활성을 비교 측정하고 FPRL1과의 결합력을 기존의 WKYMVm 펩타이드와 비교한 결과, 기존의 펩타이드보다 낮은 농도에서 면역 반응을 유발하고 FPRL1과의 결합력도 우수한 것을 알 수 있었다. 특히, 글루코스 등의 당, 피페라진 등으로 치환시킨 펩타이드의 경우 안정성이 우수한 것으로 확인되었다.
상기의 펩타이드는 표적화 서열, 표지된 잔기 또는 펩타이드의 안정성을 증가시키기 위한 목적으로 고안된 추가의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 펩타이드의 세포내 이동을 촉진하는 세포 투과성 펩타이드(cell permeable peptide)를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 염의 형태가 가능하다. 본 발명에 사용가능한 염은 화합물의 최종 분리 및 정제 동안에 또는 아미노 그룹을 적합한 산과 반응시킴에 의해 별도로 제조될 수 있다. 대표적인 산 부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 포르메이트, 푸마레이트, 하이드로 클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시에탄설포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메시틸렌설포네이트, 메탄설포네이트, 나프틸렌설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, 파라-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트를 포함한다. 또한, 부가염을 형성하기 위해 사용될 수 있는 산의 예는 염산, 브롬 화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산 및 옥살산, 말레산, 숙신산 및 시트르산과 같은 유기산을 포함한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 중 하나 이상 선택되는 펩타이드를 포함하는 면역반응을 조절하는 조성물에 관한 것이다.
면역반응을 조절하는 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 미생물 및 바이러스 감염증, 암, 면역질환 등의 다양한 질환에서 면역 반응 유도제로, 질환의 예방 및 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로 사용될 수도 있을 뿐만 아니라 기존의 항균제, 항생제, 항암제 등의 치료제와 함께 사용될 수 있다. 이 경우, 펩타이드는 면역반응을 자극하여 치료제의 효능을 극대화시키는 면역보조제로 사용된다. 예를 들어, 본 발명은 박테리아 및 바이러스 질병을 위한 백신의 면역학적 보조제로 동시투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 인간뿐만 아니라 면역계를 가지고 본 발명의 펩타이드 투여에 의해 면역반응이 조절되는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 가축에게도 사용될 수 있다.
상기 발명의 조성물은 상기 펩타이드를 한 종류 이상 포함하며, 상기 펩티드는 당 사슬 화합물, 지질 화합물, 핵산 화합물, 다른 종류의 펩티드 또는 단백질 등을 포함할 수 있다.　 예를 들어, 지질 화합물에는 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 팔미토일올레일포스파티딜글리세롤(POPG), 포스파티딜글리세롤(PG), C18 포 화 지방산, C16 불포화 지방산, C18 불포화 지방산 등이 있다.　
본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 허용 가능한 담체를 포함하여 적절한 제제로 제조된다.　 투여 방식에 적합한 제제는 공지되어 있고, 전형적으로 막을 통과한 이동을 용이하게 하는 제제를 포함할 수 있다.
상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.　 비경구용 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.　 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다.　 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드 중 하나 이상 선택되는 펩타이드를 투여하는 것을 포함하는 면역반응을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입되는 일반적인 경로를 통하여 투여된다.　 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.　 그러나 경구 투여시, 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다.　 또한, 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.　 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스텔(예, 올레인산에칠 등), 알코올류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 또는 이를 포함하는 조성물은 약학적으로 유효량으로 투여한다. 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 언급되는 펩타이드는 보편적으로 공지된 많은 합성 기술들(예를 들어 고체상 및 용액상 합성 기술)에 의해 합성될 수 있다. 고체상 펩타이드 합성을 위한 많은 기술은 문헌[J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, (1963) W.H. Freeman Co. (San Francisco); J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, (1973) vol. 2, p. 46, Academic Press (New York)]에서 찾을 수 있다. 또한, 통상적인 용액 합성에 대한 기술적인 사항은 문헌[G. Schroder and K. Lupke, The Peptides, (1965) vol. 1, Academic Press (New York)]을 참조할 수 있다.
일반적으로, 본 발명에서 명시하는 펩타이드의 합성 방법은 고체상에 일정하게 결합된 아미노산 골격에 하나 이상의 아미노산 또는 적합하게 보호된 아미노산을 연속적으로 아미드 결합을 형성하는 방식으로 이루어 진다.
정상적으로, 제1 아미노산의 아미노 또는 카복실 그룹은 적합한 보호 그룹에 의해 보호된다. 보호된 또는 유도체화된 아미노산은 고체 지지체에 부착될 수 있거나 아미드 결합을 형성하기에 적합한 조건하에서 다음의 아미노산을 첨가함으로써 용액중에서 반응이 이루어질 수 있다. 또한, 보호 그룹은 적합한 보호기로 보호된 아미노산을 첨가하기 이전에 완전히 제거한다. 모든 목적 아미노산이 적당한 서열로 연결된 후, 임의의 잔류 보호 그룹 또는 임의의 고형 지지체로부터 연속적으로 또는 동시에 제거하여 최종 목적하는 펩타이드를 얻는다.
본 발명에서는 일반적으로 키랄 센터가 라세미화되지 않는 조건하에서 적합하게 보호된 테트라펩타이드를 적절하게 보호된 또 다른 디펩타이드와 축합시켜 아미드결합을 형성시킨 후 탈 보호하여 목적하는 헥사펩타이드를 합성하여 얻는 절편 축합반응 기술을 이용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 화합물을 제조하기 위한 가장 바람직한 합성 방법으로는 고체상 폴리머 지지체를 이용하여 합성하는 고체상 펩타이드 합성 방법이며 특히 α-아미노 작용기는 산 또는 염기 민감성 그룹에 의해 보호된다. 보호기는 펩타이드 축합 반응 조건에서 안정한 성질을 가져야만 하고 연장되는 펩타이드 쇄의 파괴 없이 또는 거기에 함유된 임의의 키랄 센터의 라세미체화 없이 용이하게 제거가능한 성질을 가져야만 한다. 이와 같이 적합한 보호기들로는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc), t-부톡시카보닐(Boc), 벤질옥시카보닐(Cbz), 비페닐이소프로필-옥시카보닐, t-아밀옥시카보닐, 이소보르닐옥시카보닐, (α,α)-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카보닐, O-니트로페닐설페닐, 2-시아노-t-부틸옥시카보닐 등이다. 본 발명의 펩타이드 합성에서 가장 바람직한 보호기로는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc) 보호기이며 대부분 Fmoc 보호기로 보호된 아미노산을 합성 원료로 이용하는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명에서 바람직하게 판단되는 아미노산 잔기의 보호기로는 아르기닌의 경우, 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐(Pmc) 및 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-S-설포닐(Pbf)이고; 아스파라긴의 경우, 트리틸(Trt)이고; 아스파틱산의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 글루타민의 경우, 트리틸(Trt)이고; N-메틸글루타민산의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 히스티딘의 경우, 트리틸(Trt)이고; 라이신의 경우, t-부톡시카보닐(Boc)이고; 세린의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 트레오닌 및 알로트레오닌의 경우, t-부틸(t-Bu)이고; 트립토판의 경우, t-부톡시카보닐(Boc)이고; 티로 신의 경우, t-부틸(t-Bu)이다.
고체상 펩타이드 합성 방법에서, C-말단 아미노산은 적합한 고형 지지체 또는 수지에 부착된다. 상기 합성을 위해 유용한 적합한 고형 지지체는 단계적 축합-탈보호 반응의 시약 및 반응 조건에 불활성이고 사용되는 매질에 불용성인 물질이어야 한다. C-말단 아미드 펩타이드의 합성을 위해 사용되는 고형 지지체는 링크 아미드(rink amid) 또는 링크 아미드 4-메틸벤질히드릴아민(MBHA) 수지(rink amid MBHA resin)이다. 특히, C-말단 아미드 펩타이드에 대해 바람직한 고형 지지체는 제조원(Novabiochem Corporation)으로부터 시판되는 링크 아미드 4-메틸벤질히드릴아민(MBHA) 수지 수지이다.
C-말단 아미드은 디클로로메탄, N-메틸피리돈(NMP)또는 DMF과 같은 용매중에서 10℃ 내지 50 ℃의 온도에서, 바람직하게는 30 ℃의 온도조건에서, 약 1 내지 24 시간 동안 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt), N-메틸모르폴린 (NMM), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄-헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는 비스(2-옥소-3-옥사졸리디닐)포스핀클로라이드(BOPCI)의 존재 또는 부재하에서 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC), N,N'-디이소프로필카보디이미(DIC), [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루로포스페이트](HATU) 또는 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU)에 카르복실산을 활성화시켜 축합을 이루어 수지 또는 고체상 지지체에 커플링된다.
고형 지지체가 rink amide MBHA 수지인 경우, 바람직한 보호기로서 Fmoc 그 룹은 C-말단 아미노산으로 커플링하기 전에 2급 아민 용액, 바람직하게는 20%의 피페리딘 DMF 용액을 과량 사용하여 절단한다. 이상의 방법으로 탈보호된 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노메틸)페녹시아세트아미도에틸 수지에 목적하는 제1 아미노산을 축합시키는데 사용되는 바람직한 시약들로는 적합하게 보호된 제1 아미노산 (1당량)에 대하여 DMF 용매중에서 N-메틸모르폴린(NMM, 1당량), 1-하이드록시벤조트리아졸 (HOBt, 1당량) 및 [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트] (HATU, 1당량), O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU, 1당량), N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC) 또는 N,N'-디이소프로필카보디이미드(DIC)과 같은 축합 반응 시약들이다.
본 발명에서 수행되는 연속적인 아미노산의 축합은 관련 기술 분야에서 널리 알려져 있는 자동 펩타이드 합성기 또는 본 발명의 자동 펩타이드 합성기[대한민국 특허, KP 10-2000-0049344]로 수행할 수 있다. 바람직한 합성 반응의 조건으로는 Fmoc 그룹으로 보호된 α-아미노산을 2급 아민 용액, 바람직하게 피페리딘으로 처리하여 탈보호 시킨후, 충분히 과량의 용매로 세척하고 커플링을 원하는 또다른 각각의 보호된 아미노산을 이어서 약 5배 몰 과량 첨가하여 바람직하게는 DMF 용매 중에서 반응을 수행한다.
본 발명에서 고체상 수지를 이용한 펩타이드의 합성 마지막 단계에서는 펩타이드를 연속적으로 또는 1회 조작으로 수지로부터 얻고자 하는 펩타이드를 제거하고 각각 아미노산의 잔기를 보호하고 있는 보호 그룹들을 탈보호 시킨다. 수지로부터 펩타이드의 제거 및 잔기에 존재하는 보호기들의 탈보호 조건으로는 일반적으 로 수지-펩타이드 간의 결합을 절단하는 절단 시약 칵테일, 예를 들어, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS), 티오아니졸, 물 또는 에탄디티올(EDT)등으로 구성된 디클로로메탄 혼합 칵테일 용액을 처리하여 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리하므로써 침전물을 생성시킨다. 이상과 같이 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전 시키고 과량의 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실란, 티오아니졸, 물 및 에탄디티올 등을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻는다.
완전히 탈보호된 펩타이드 염은 물과 아세트나이트릴 용매로 구성된 혼합 용매를 흘리고 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리 정제한다. 분리 정제된 펩타이드 용액은 동결건조 시켜 완전히 농축 건조 시킴으로써 고형의 펩타이드 얻는다.
명세서 전반에서 표기어는 다음과 같은 의미를 가진다.
'D' 접두사에 의해 달리 특정되지 않는 경우(예를 들어, D-Ala 또는 NMe-D- Ile), 명세서 및 청구항에 기재된 펩타이드내 아미노산 및 아미노아실 잔기의 α-탄소의 입체화학은 천연 또는 'L' 배위이다. 카흔-인골드-프레로그 'R' 및'S' 명명을 사용하여 본 발명의 펩타이드의 N-말단에서 특정 아실 치환체내 키랄 센터의 입체화학을 표기할 수 있다.
'R, S'의 명명은 2개의 에난티오머 형태의 라세믹 혼합물을 지칭한다. 당해 명명법은 문헌 [R.S. Cahn, et al., Angew . Chem . Int . Ed . Engl ., (1966) 5, 385- 415 ]에 기재된 명명에 따른다.
모든 펩타이드 서열은 α-N-말단 아미노산 잔기를 좌측에 α-C-말단을 우측상에 기재하는 일반적으로 허용되는 협약에 따라 기재된다. 본원에 사용된 바와 같이, 'α-N-말단'은 펩타이드내 아미노산의 유리 α-아미노 그룹을 언급하고 용어 'α-C-말단'은 펩타이드내 아미노산의 유리 α-카복실산 말단을 언급한다. 대부분, 본원에 사용되는 천연적으로 존재하고 비천연적으로 존재하는 아미노아실 잔기에 대한 명명은 유기화학의 명명에 대한 IUPAC 위원회 및 문헌 ['Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974)' Biochemistry, (1975) 14(2)]에 제시된 바와 같은 생화학 명명에 관한 IUPAC-IUB 위원회에 의해 제안된 명명법 협약에 따른다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용되는 천연적으로 존재하거나 비천연적으로 존재하는 아미노산의 명명 및 약어는 아래와 같이 표기한다.
Ala, A: 알라닌; Arg, R: 아르기닌; Asn, N: 아스파라긴; Asp, D: 아스파틱산; Cys, C: 시스테인; Glu, E: 글루타믹산; Gln, Q: 글루타민; Gly, G: 글리신; His, H: 히스티딘; Ile, I: 이소루이신; Leu, L: 루이신; Lys, K: 라이신; Met, M: 메치오닌; Nle: 노오루이신; Phe, F: 페닐알라닌; Pro, P: 프롤린; Ser, S: 세린; Thr, T: 트레오닌; Trp, W: 트립토판; Tyr, Y: 티로신; Val, V: 발린. 또한, D-형의 아미노산 표기는 각각 D 접두사를 사용하여 3자의 영문 약어를 이용하거나 또는 1자의 소문자 영문 약어를 이용하여 표기할 수 있다. 예를 들어 D형 알라닌의 약어 표기는 "D-Ala" 또는 "a"로 표기될 수 있으며 비천연적으로 존재하는 특수 아미노산 노르루이신의 경우는 "D-Nle"로 단독 표기한다.
N-Ac-: N-말단에 아세틸기로 보호된 것을; N-f-: N-말단에 포밀기로 보호된 것을; pY: 티로신의 잔기인 페녹시기에 포스포릴레이션된 것을; N-palm-: N-말단에 팔미토일기로 보호된 것을 의미한다; DMF: N,N-디메틸포름아미드; DCC: N,N'-디사이클로헥실카보디이미드; DIC: N,N'-디이소프로필카보디이미드; DIEA: 디이소프로필에틸아민; EDT: 에틸 디티올; HOBt: 1-하이드록시벤조 트리아졸; HBTU: O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N',-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트; MC: 디클로로메탄; NMM: N-메틸모르폴린 NMP: N-메틸피리돈; TIS: 트리이소프로필실란 및 TFA: 트리플루오로아세트산.
위에서 약어로서 표기되지 않은 경우, 명명법 및 약어는 문헌[Calbiochem-Novabiochem Corp. 1999 Catalog and Peptide Synthesis Handbook or the Chem-Impex International, Inc. Tools for Peptide amp; Solid Phase Synthesis 1998-1999 Catalogue]을 참조하여 추가할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1
화합물번호 001: WKF(Nle)Vm-NH2의 합성:
Novabiochem corporation으로부터 구입한 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지)을 50 mg(0.03 mmol)측량하여 반응용기에 넣었다. 수지를 3 ml의 DMF로 용매화시키고 5분간 충분히 sweeling시켰다. Swelling된 수지에 20% 피페리딘 DMF 용액을 3 ml 첨가하고 10분간 shaking시키고 피페리딘 용액을 제거한 후 다시 20% 피페리딘 DMF 용액을 첨가하여 10분간 반응시켜 수지에 보호되어 있는 Fmoc 보호기를 완전히 제거하고 10 ml의 DMF 용매를 이용하여 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Fmoc 보호기의 탈보호 반응 여부를 Kaiser test[E. Kaiser et al. Anal. Biochem. (1970) 34, 595]를 실시하여 확인하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 이 단계에서 Kaiser test를 위와 동일하게 실시하여 Fmoc-아미노산의 커플링 여부를 확인하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) 20% 피페리딘 DMF 용액을 처리시킨다.
합성 종결 즉시, 펩타이드가 커플링된 수지를 3 시간 동안 TFA/티오아니졸/EDT/TIS/물(95:5:2.5:2.5:2.5)의 혼합물을 사용하여 수지로부터 절단한다. 이렇게 얻어진 혼합 용액은 냉장 보관된 디에틸에테르 용매를 과량 처리하므로써 침전물을 생성시킨다. 얻어진 침전물을 원심분리 시켜 완전히 침전 시키고 과량의 트리플루오로아세트산, 티아니졸 및 에탄디티올 등을 일차 제거하고 이상의 절차를 2회 정도 반복하여 고형화시킨 침전물을 얻었다.
얻어진 펩타이드를 C-18 칼럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 WKF(Nle)Vm-NH2을 얻었다. 또한 위와 동일한 방법으로 분리 정제한 화합물 중 CWKF(Nle)Vm-NH2(화합물 041) 10 mg을 0.1 ml의 DMSO에 완전히 용해시키고 pH 7.5의 암모늄클로라이드 물 버퍼 용액 0.1 ml을 첨가하여 실온에서 3시간 가량 shaking해 주었다. 반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 [sCWKF(Nle)Vm-NH2]2(화합물 002)을 얻었다.
화합물 002의 구조 표현에서 "s" 아래첨자(s)는 시스테인 잔기인 티올이 중합되어 형성된 디설피드 결합 구조를 나타낸다.
화합물 001: WKF(Nle)Vm-NH 2 : Rt=11.43 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 822.
이상과 동일한 제조 과정을 이용하여 아래와 같은 펩타이드를 제조하였다. 화합물 002: [ s CWKF(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=19.62 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1848.
화합물 003: WKY(Nle)Ym-NH 2 : Rt=13.39 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 902.
화합물 004: [ s CWKY(Nle)Ym-NH 2 ] 2 : Rt=17.01 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 2008.
화합물 005: WKY(Nle)Fm-NH 2 : Rt=17.12 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 886.
화합물 006: [ s CWKY(Nle)Fm-NH 2 ] 2 : Rt=22.25 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100% 의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1975.
화합물 007: WKY(Nle)Wm-NH 2 : Rt=16.83 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 925.
화합물 008: [ s CWKY(Nle)Wm-NH 2 ] 2 : Rt=21.62 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 2053.
화합물 009: WRY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=14.89 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 866.
화합물 010: [ s CWRY(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=13.14 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1935.
화합물 011: WHY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=14.87분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 847.
화합물 012: [ s CWHY(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=19.83 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100% 의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1897.
화합물 013: WKW(Nle)Vm-NH 2 : Rt=8.18 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 861.
화합물 014: [ s CWKW(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=15.86 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1925.
화합물 015: WKG(Nle)Vm-NH 2 : Rt=5.88 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 732.
화합물 016: [ s CWKG(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=18.17 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1667.
화합물 017: WKY(Nle)Gm-NH 2 : Rt=5.62 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 795.
화합물 018: [ s CWKY(Nle)Gm-NH 2 ] 2 : Rt=19.34 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1795.
화합물 019: WEY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=7.45 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 839.
화합물 020: [ s CWEY(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=14.21 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1883.
화합물 021: WDY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=15.81 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 825.
화합물 022: [ s CWDY(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=9.95 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1854.
화합물 023: WKH(Nle)Vm-NH 2 : Rt=11.78 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아 세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 812.
화합물 024: [ s CWKH(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=14.66 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1827.
화합물 025: WKE(Nle)Vm-NH 2 : Rt=13.18 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 790.
화합물 026: [ s CWKE(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=19.14 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1811.
화합물 027: WKR(Nle)Vm-NH 2 : Rt=12.06 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 831.
화합물 028: [ s CWKR(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=6.76 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1865.
화합물 029: WKD(Nle)Vm-NH 2 : Rt=13.18 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아 세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 790.
화합물 030: KY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=5.01 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 652.
화합물 031: [ s CKY(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=15.92 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1506.
화합물 032: Y(Nle)Vm-NH 2 : Rt=12.10 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 524.
화합물 033: [ s CY(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=17.24 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1250.
화합물 034: WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=14.81 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 838.
화합물 035: [ s CWKY(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=8.58 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1880.
화합물 036: mV(Nle)YKW-NH 2 : Rt=13.85 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 838.
화합물 037: [ s CmV(Nle)YKW-NH 2 ] 2 : Rt=17.25 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1879.
화합물 038: MV(Nle)YKw-NH 2 : Rt=12.44 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 838.
화합물 039: [ s CMV(Nle)YKw-NH 2 ] 2 : Rt=15.20 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1879.
화합물 040: CWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=14.95 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 941.
화합물 041: CWKF(Nle)Vm-NH 2 : Rt=21.25 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 925.
화합물 042: CWKY(Nle)Ym-NH 2 : Rt=19.87 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1005.
화합물 043: CWKY(Nle)Fm-NH 2 : Rt=20.45 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 989.
화합물 044: CWKY(Nle)Wm-NH 2 : Rt=20.56 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1028.
화합물 045: CWRY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=13.18 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 969.
화합물 046: CWHY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=6.95 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 949.
화합물 047: CWKW(Nle)Vm-NH 2 : Rt=8.33 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 963.
화합물 048: CWKG(Nle)Vm-NH 2 : Rt=9.41 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 835.
화합물 049: CWKY(Nle)Gm-NH 2 : Rt=5.86 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 899.
화합물 050: CWEY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=7.83 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 942.
화합물 051: CWDY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=7.74 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 928.
화합물 052: CWKH(Nle)Vm-NH 2 : Rt=12.23 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 915.
화합물 053: CWKE(Nle)Vm-NH 2 : Rt=13.46 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 907.
화합물 054: CWKR(Nle)Vm-NH 2 : Rt=15.86 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 934.
화합물 055: CWKD(Nle)Vm-NH 2 : Rt=17.43 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 893.
화합물 056: CKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=12.66 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 755.
화합물 057: CY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=12.99 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 627.
화합물 058: [ s CWKD(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=16.44 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1783.
화합물 059: mV(Nle)YKWWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=10.36 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1657.
화합물 060: mV ( Nle ) YKWCCWKY (Nle) Vm - NH 2 : Rt=9.82 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1864.
화합물 061: mV(Nle)YKWPWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=9.51 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1755.
화합물 062: WKYDVm-NH 2 : Rt=12.67 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 840.
화합물 063: [ s CWKYDVm-NH 2 ] 2 : Rt=12.87 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1883.
화합물 064: WKYIVm-NH 2 : Rt=14.28 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 838.
화합물 065: [ s CWKYIVm-NH 2 ] 2 : Rt=14.73 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1879.
화합물 066: WKYKVm-NH 2 : Rt=10.37 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 853.
화합물 067: [ s CWKYKVm-NH 2 ] 2 : Rt=11.71 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1909.
화합물 068: WKYTVm-NH 2 : Rt=17.78 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 826.
화합물 069: [ s CWKYTVm-NH 2 ] 2 : Rt=13.31 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1857.
화합물 070: WKYVVm-NH 2 : Rt=18.84 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 824.
화합물 071: [ s CWKYVVm-NH 2 ] 2 : Rt=8.88 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA 를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1851.
화합물 072: CWKYDVm-NH 2 : Rt=17.80 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 943.
화합물 073: CWKYIVm-NH 2 : Rt=20.43 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 941.
화합물 074: CWKYKVm-NH 2 : Rt=17.06 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 956.
화합물 075: CWKYTVm-NH 2 : Rt=21.02 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 930.
화합물 076: CWKYVVm-NH 2 : Rt=14.02 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 928.
화합물 077: CmV(Nle)YKW-NH 2 : Rt=15.62 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 941.
화합물 078: CMV(Nle)YKw-NH 2 : Rt=17.56 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 941.
실시예 2
화합물 079: N-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val- OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) Fmoc-Cys(Trt)-OH, 2 시간 커플링; (8) 20% 피페리딘 DMF 용액; (9) Ac2O와 디이소프로필에틸아민(DIEA)을 실온에서 30 분간 처리한다.
반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 N-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 079: N-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=19.04 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 983.
화합물 080: N-Ac-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=11.89 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 880.
실시예 3
화합물 081: N- f -CWKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) Fmoc-Cys(Trt)-OH, 2 시간 커플링; (8) 20% 피페리딘 DMF 용액; (9) 포믹에시드(10 당량), 2 시간 커플링 시킨다.
반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 N-f-CWKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 081: N- f -CWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=11.88 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 969.
화합물 082: N- f -WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=17.43 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 866.
실시예 4
화합물 083: WK [( CH 2 ) 4 NH 2 -Y( Nle )Vm- NH 2 ]-Y( Nle )Vm- NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Mtt)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) 20% 피페리딘 DMF 용액; (8) Lys의 Boc 보호반응: Boc2O (10당량), 디이소프로필에틸아민(DIEA), DMF 용액, 2 시간 반응; (9) Lys의 Mtt 탈보호반응: 1% TFA 디클로로메탄 용액, 10분, 4회 반응; (10) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (11) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (12) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (13) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (14) 20% 피페리딘 DMF 용액에서 처리시킨다.
반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 WK[(CH2)4NH2-Y(Nle)Vm-NH2]- Y(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 083: WK[(CH 2 ) 4 NH 2 -Y(Nle)Vm-NH 2 ]-Y(Nle)Vm-NH 2 : Rt=19.45 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1343.
화합물 084: WK[(CH 2 ) 4 NH 2 -WKY(Nle)Vm-NH 2 ]-Y(Nle)Vm-NH 2 : Rt=12.76 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1658.
실시예 5:
화합물 085: N-palm-WKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) 20% 피페리딘 DMF 용액; (8) 팔리토일클로라이드(10당량)와 디이소프로필에틸아민(DIEA)을 실온에서 30 분간 처리한다.
반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 N-palm-WKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 085: N-palm-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=24.67 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1076.
실시예 6
화합물 086: Fmoc-CWKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) Fmoc-Cys(Trt)-OH, 2 시간 커플링시킨다.
반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 Fmoc-CWKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 086: Fmoc-CWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=15.14 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1164.
실시예 7
화합물 087: N-Palm-NHCH 2 CH 2 NHC(=O)NH-WKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) Fmoc-Cys(Trt)-OH, 2 시간 커플링; (8) 20% 피페리딘 DMF 용액; (9) 카보닐디이미다졸(CDI, 10당량) 디클로로메탄 용액, 1 시간 커플링; (10) 디에틸아민(20 당량) 디클로로메탄 용액, 1 시간 커플링; (11) 팔리토일클로라이드(10당량)와 디이소프로필에틸아민(DIEA)을 DMF 용액중 실온에서 30 분간 처리한다.
반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 N-Palm-NHCH2CH2NHC(=O)NH-WKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 087: N-Palm-NHCH 2 CH 2 NHC(=O)NH-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=25.48 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1162.
실시예 8
화합물 088: Cyclic-(urea)-WKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) 20% 피페리딘 DMF 용액; (8) 카보닐디이미다졸(CDI, 10당량) 디클로로메탄 용액, 1 시간 커플링시킨다.
반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 Cyclic-(urea)-WKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 088: Cyclic-(urea)-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=16.87 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 864.
실시예 09
화합물 089: K[(CH 2 ) 4 NHCO-DWKY(Nle)Vm-NH 2 ]-WKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) Fmoc-Lys(Mtt)-OH, 2 시간 커플링; (8) 20% 피페리딘 DMF 용액; (9) Lys의 Boc 보호반응: Boc2O (10당량), 디이소프로필에틸아민(DIEA), DMF 용액, 2 시간 반응; (10) Lys의 Mtt 탈보호반응: 1% TFA 디클로로메탄 용액, 10분, 4회 반응; (11) Fmoc-Asp-OtBu, 2 시간 커플링; (12) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (13) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (14) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (15) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (16) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (17) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (18) 20% 피페리딘 DMF 용액에서 처리시킨다.
반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 K[(CH2)4NHCO-DWKY(Nle)Vm-NH2]-WKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 089: K[(CH 2 ) 4 NHCO-DWKY(Nle)Vm-NH 2 ]-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=8.08 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1901.
화합물 090: K[(CH 2 ) 4 NHCO-EWKY(Nle)Vm-NH 2 ]-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=16.64 분(15 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 25분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 19196.
실시예 10
화합물 091: D-Glucose-Ac-WKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) 20% 피페리딘 DMF 용액; (8) Diacetone-D-glucosyl acetic acid, 2시간 커플링 시킨다. 반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 D-Glucose-Ac-WKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 091: D-Glucose-Ac-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=17.12 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1058.
화합물 092: D-Glucose-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=18.10 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1161.
화합물 093: WK(Glucose-Ac)Y(Nle)Vm-NH 2 : Rt=11.71 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1058.
화합물 094: CWK(Glucose-Ac)Y(Nle)Vm-NH 2 : Rt=12.58 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 1161.
화합물 095: [ s Glucose-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH 2 ] 2 : Rt=7.52 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 2321.
실시예 11
화합물 096: Piperazine-CH 2 CONH-WKY(Nle)Vm-NH 2 의 합성:
실시예 1의 제조 과정과 동일하게 DMF 용매로 swelling된 rink amid MBHA resin(g당 0.6 mmol이 로딩된 수지, 50 mg(0.03 mmol))을 20% 피페리딘 DMF 용액 (3 ml)으로 2회 10분간 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다.
Fmoc-D-Met-OH(56 mg, 0.15 mmol), HOBt(20 mg, 0.15 mmol) 및 DIC(0.02 ml, 0.15 mmol)를 2 ml의 DMF 용매에 완전히 녹인 후, Fmoc 보호기가 탈보호된 수지에 첨가하였다. 반응액를 실온에서 2 시간 정도 shaking시킨 후, 10 ml의 DMF 용매로 5회 이상 세척하였다. 다음으로는 아래와 동일한 합성 주기에 따라 연속적으로 커플링시켰다:
(1) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (2) 20% 피페리딘 DMF 용액(3 ml)을 사용하여 10분간 2회 탈보호; (3) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척; (4) Fmoc-아미노산의 첨가; (5) 커플링 시약을 첨가하여 아미노산 활성화 및 2 시간 커플링; (6) DMF 용매(10 ml)로 5회 이상 세척.
Fmoc으로 보호된 아미노산(3당량 이상)은 다음에 기술된 순서로 수지 반응용기에 첨가하여 커플링시킨다: (1) Fmoc-D-Met-OH, 2 시간 커플링; (2) Fmoc-Val-OH, 2 시간 커플링; (3) Fmoc-Nle-OH, 2 시간 커플링; (4) Fmoc-Tyr(t-But)-OH, 2 시간 커플링; (5) Fmoc-Lys(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (6) Fmoc-Trp(Boc)-OH, 2 시간 커플링; (7) 20% 피페리딘 DMF 용액; (8) Piperazine 유도체, 2시간 커플링 시킨다. 반응 종결후, 동결 건조하여 물을 제거하고 얻어진 DMSO 용액을 C-18 컬럼을 사용하고 50분에 걸쳐 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물 농도 구배 용매 시스템을 사용하는 HPLC로 정제하였다. 순 수 정제된 분획물을 동결건조시켜 백색 분말형의 트리플루오로아세테이트염으로서 Piperazine-CH2CONH-WKY(Nle)Vm-NH2을 얻었다.
화합물 096: Piperazine-CH 2 CONH-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=16.51 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 977.
화합물 097: Piperazine-CONH-WKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=17.21 분(0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 30분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 963.
화합물 098: KWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=8.73 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 966.
화합물 099: DWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=9.31 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 953.
화합물 100: HWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=8.73 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구 배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 975.
화합물 101: AWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=9.21 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 909.
화합물 102: DKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=7.59 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 767.
화합물 103: HKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=7.30 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 789.
화합물 104: AKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=7.62 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 732.
화합물 105: cWKY(Nle)Vm-NH 2 : Rt=9.80 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 941.
화합물 106: wKY ( Nle )Vm- NH 2 : Rt=8.58 분(5 cm의 C-18 컬럼을 이용하고 0.01% TFA를 함유하는 5% 내지 100%의 아세토니트릴/물로부터 15분에 걸쳐 다양한 농도 구배); MS(ESI)m/e, [M+H]+= 838.
실시예 12
FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서의 [Ca 2+ ] i 증가에 대한 펩타이드의 효과
FPRL1-발현 RBL-2H3 세포에서, WKYMVm을 대조군으로 하여, 변형된 펩타이드가 [Ca2+]i 증가에 미치는 활성을 비교하여 측정하였다. FPRL1-발현 RBL-2H3 세포는 1 nM의 펩타이드로 자극하였으며, [Ca2+]i의 수준은 fura-2/AM을 이용하여 Grynkiewicz방법[Grynkiewicz, G. et al. J. Biol. Chem. (1986) 260, 3440-3450]으로 형광을 측정하였다. 10 uM fura-2/AM으로 처리되어 준비된 세포는 신선한 무혈청 DMEM 배지에서 계속 교반하면서 37 ℃에서 50분 동안 배양하였다. 1X106 세포를 Ca2+가 없는 Locke's 용액(154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, pH 7.3, 10 mM 글루코오스 및 0.2 mM EGTA)에서 분석할 수 있도록 분취(aliquote) 하였다. 340 nm 와 380 nm의 이중 여기 파장의 형광 및 500 nm의 발광 파장의 변화 는 보정된 형광비율 농도값([Ca2+]i)으로 전환하여 증가된 [Ca2+]i 피크 수준으로 측정되었다. 데이터는 대부분 1nM에서 활성을 보인 화합물 106개 중 구조적으로 의미가 있는 몇개 화합물의 실험값을 나타냈고, 그 중 몇몇 화합물을 세 개의 독립적인 실험의 대표값으로 EC50를 나타냈다.(표1)
No. EC 50 (nM) No. EC 50 (nM)
화합물001 < 1 화합물067 0.49 ± 0.07
화합물003 < 1 화합물069 0.19 ± 0.02
화합물006 0.16 ± 0.07 화합물070 < 1
화합물007 < 1 화합물071 0.15 ± 0.10
화합물010 0.10 ± 0.02 화합물075 < 1
화합물011 < 1 화합물082 < 1
화합물028 0.23 ± 0.09 화합물085 < 1
화합물035 0.13 ± 0.13 화합물089 0.39 ± 0.07
화합물052 < 1 화합물091 0.12 ± 0.03
화합물054 < 1 화합물096 0.03 ± 0.003
화합물057 < 1 화합물097 0.3 ± 0.12
화합물065 0.37 ± 0.28 WKYMVm 0.6 nM
실시예 13
FPRL1에 [ 125 I]WKYMVm 결합에 대한 펩타이드의 효과
실시예 12에서 선택된 펩타이드의 FPRL1에 대한 특이성은 FPRL1을 발현하지 않는 RBL-2H3 세포에서 [Ca2+]i 수준이 나타나지 않는 것으로 확인되었다(data not shown). 이러한 사실로부터 선택된 펩타이드가 FPRL1에 결합할 수 있는지를 알아보기 위해 125I-표지된 WKYMVm를 이용하여 결합의 치환정도를 알아보았다. 표지되지 않은 선택된 펩타이드가 존재하지 않도록 하여 FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 배양하였으며, 리간드 결합 분석은 기존에 알려진 방법을 변형하여 실시하였다. FPRL1-발현 RBL-2H3 세포를 96-웰 플레이트에 대해서 각 웰당 1X104 세포를 접종하고 하루 동안 배양하였다. 이후 블록킹 버퍼(blocking buffer; 33 mM HEPES, pH 7.5, 0.1% BSA in RPMI 1640)로 세포를 2시간 동안 블록킹한 후, 바인딩 버퍼 (binding buffer 0.1% BSA in PBS)와 함께 1 uM의 표지되지 않은 펩타이드가 존재 또는 부존재하는 상황에서 단일 농도의 125I-WKYMVm를 세포에 첨가하여 4 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그런 다음 시료가 처리된 세포를 차가운 바인딩 버퍼로 5번 세척한 후, 200 ul의 용해성 버퍼(lysis buffer; 20 mM Tris, pH 7.5, 1% Triton X-100)를 처리하였다. 상온에서 20분 용해한 후, 용해물(lysate)을 모아 결합된 125I-표지된 WKYMVm의 방사성 활성을 r-선 계수기를 이용하여 측정하였다. 결과에서 도시된 바와 같이, 기존에 알려진 FPRL1 작용제(agonist)로 알려진 WKYMVm 보다 변형되어 합성된 펩타이드들이 칼슘 증가 뿐만 아니라 수용체 결합력에서도 더 뛰어나다는 사실을 보여준다.(도1)
실시예 14
Rat plsma을 이용한 화합물들의 in vitro 안정성 효과
실시예 12에서 선택된 펩타이드들 중에서 혈장내에서의 화합물들의 안정성을 알아보기 위해서 다음과 같은 실험 방법으로 각 화합물의 혈장 내의 안정성을 알아보았다. :
(1) SD Rat 혈액을 채혈한 후 plasma를 모음; (2) Plasma 용액 500ul에 펩타이드를 증류수에 1mg/ml의 농도로 녹인 용액 500ul를 첨가;(3) 매 시간 마다 sampling하여 SDS(sodium dodecyl sulfate) 5%를 넣고 vortexing한 후 상온에서 1분정도 방치;(4) MeOH를 넣어 반응을 정지시키고, denaturing 시킴;(5) 상층액을 HPLC로 분석하였다. 결과에서 도시된 바와 같이 대조물질 WKYMVm보다 혈장내의 안정성이 훨씬 증가되었음을 알 수가 있다.(도2)
본 발명의 면역반응을 조절하는 펩타이드를 미생물 및 바이러스 감염증, 암, 면역질환 등의 다양한 질환에서 면역 반응 유도제로, 질환의 예방 및 치료에 이용할 수 있다.

Claims (26)

  1. 화학식 1의 아미노산 서열을 갖는 면역반응을 조절하는 펩타이드:
    화학식 1
    X1-(Nle)-X2-m
    상기식에서, Nle은 L-노오루이신(L-Nor-Leu); X1은 L-페닐알라닌(L-phe), L-티로신(L-Try), L-트립토판(L-Trp), L-글리신(L-Gly), L-히스티딘(L-His), L-글루타믹산(L-Glu), L-아르기닌(L-Arg) 또는 L-아스파틱산(L-Asp); X2는 L-발린(L-Val), L-티로신(L-Tyr), L-페닐알라닌(L-Phe), L-트립토판(L-Trp) 또는 L-글리신(L-Gly); 및 m은 D-메치오닌(D-Met)을 나타낸다.
  2. 제1항에 있어서, N 말단의 잔기에서 1 내지 3개의 아미노산을 추가로 포함하는 화학식 2 내지 화학식 4 중 하나인 펩타이드:
    화학식 2
    A1-X1-(Nle)-X2-m
    화학식 3
    A2-A1-X1-(Nle)-X2-m
    화학식 4
    A3-A2-A1-X1-(Nle)-X2-m
    상기 화학식 2 내지 화학식 4에서, A1은 L-라이신(L-Lys), L-아르기닌(L-Arg), L-히스티딘(L-His), L-글루타믹산(L-Glu) 또는 L-아스파틱산(L-Asp); A2는 L-트립토판(L-Trp), D-트립토판(D-Trp), L-아스파틱산(L-Asp), L-히스티딘(L-His) 또는 L-알라닌(L-Ala); 및 A3는 L-라이신(L-Lys), L-아스파틱산(L-Asp), L-히스티딘(L-His) 또는 L-알라닌(L-Ala)을 나타낸다.
  3. 제2항에 있어서, N 말단의 잔기에서 L-시스테인(L-Cys) 또는 D-시스테인(D-Cys)을 추가로 포함하는 펩타이드.
  4. 제3항에서 선택되는 동일하거나 동일하지 않은 2개의 펩타이드가 디설피드 결합을 통하여 다이머를 형성한 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에서 선택되는 펩타이드의 C 말단의 카 복실기가 아미드기, 싸이오에스테르기 또는 에스테르기로 치환된 펩타이드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에서 선택되는 펩타이드의 N 말단의 아미노기가 아세틸기, 포밀기, 팔미토일기 또는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐기로 치환된 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, WKF(Nle)Vm-NH2, WKY(Nle)Ym-NH2, WKY(Nle)Fm-NH2, WKY(Nle)Wm-NH2, WRY(Nle)Vm-NH2, WHY(Nle)Vm-NH2, WKW(Nle)Vm-NH2, WKG(Nle)Vm-NH2, WKY(Nle)Gm-NH2, WEY(Nle)Vm-NH2, WDY(Nle)Vm-NH2, WKH(Nle)Vm-NH2, WKE(Nle)Vm-NH2, WKR(Nle)Vm-NH2, WKD(Nle)Vm-NH2, KY(Nle)Vm-NH2, Y(Nle)Vm-NH2, WKY(Nle)Vm-NH2, KWKY(Nle)Vm-NH2, DWKY(Nle)Vm-NH2, HWKY(Nle)Vm-NH2, AWKY(Nle)Vm-NH2, DKY(Nle)Vm-NH2, HKY(Nle)Vm-NH2, AKY(Nle)Vm-NH2, wKY(Nle)Vm-NH2, CWKY(Nle)Vm-NH2, CWKF(Nle)Vm-NH2, CWKY(Nle)Ym-NH2, CWKY(Nle)Fm-NH2, CWKY(Nle)Wm-NH2, CWRY(Nle)Vm-NH2, CWHY(Nle)Vm-NH2, CWKW(Nle)Vm-NH2, CWKG(Nle)Vm-NH2, CWKY(Nle)Gm-NH2, CWEY(Nle)Vm-NH2, CWDY(Nle)Vm-NH2, CWKH(Nle)Vm-NH2, CWKE(Nle)Vm-NH2, CWKR(Nle)Vm-NH2, CWKD(Nle)Vm-NH2, CKY(Nle)Vm-NH2, CY(Nle)Vm-NH2, cWKY(Nle)Vm-NH2, [sCWKF(Nle)Vm-NH2]2, [sCWKY(Nle)Ym-NH2]2, [sCWKY(Nle)Fm-NH2]2, [sCWKY(Nle)Wm-NH2]2, [sCWRY(Nle)Vm-NH2]2, [sCWHY(Nle)Vm-NH2]2, [sCWKW(Nle)Vm-NH2]2, [sCWKG(Nle)Vm-NH2]2, [sCWKY(Nle)Gm-NH2]2, [sCWEY(Nle)Vm-NH2]2, [sCWDY(Nle)Vm-NH2]2, [sCWKH(Nle)Vm-NH2]2, [sCWKE(Nle)Vm-NH2]2, [sCWKR(Nle)Vm-NH2]2, [sCKY(Nle)Vm-NH2]2, [sCY(Nle)Vm-NH2]2, [sCWKY(Nle)Vm-NH2]2 또는 [sCWKD(Nle)Vm-NH2]2 인 펩타이드.
  8. 화학식 5의 아미노산 서열을 갖는 면역반응을 조절하는 펩타이드:
    화학식 5
    Z1-V-(Nle)-Y-K-Z2
    상기식에서, Nle은 L-노오루이신(L-Nor-Leu); V는 L-발린(L-Val); Y는 L-티로신(L-Tyr); K는 L-라이신(L-Lys); Z1은 L-메치오닌(L-Met) 또는 D-메치오닌(D-Met); 및 Z2는 L-트립토판(L-Trp) 또는 D-트립토판(D-Trp)을 나타낸다.
  9. 제8항에 있어서, N 말단의 잔기에서 L-시스테인(L-Cys)을 추가로 포함하는 펩타이드.
  10. 제9항에서 선택되는 동일하거나 동일하지 않은 2개의 펩타이드가 디설피드 결합을 통하여 다이머를 형성한 펩타이드.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에서 선택되는 펩타이드의 C 말단의 카복실기가 아미드기, 싸이오에스테르기 또는 에스테르기로 치환된 펩타이드.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에서 선택되는 펩타이드의 N 말단의 아미노기가 아세틸기, 포밀기, 팔미토일기 또는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐기로 치환된 펩타이드.
  13. 제8항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, mV(Nle)YKW-NH2, MV(Nle)YKw-NH2, CmV(Nle)YKW-NH2, CMV(Nle)YKw-NH2, [sCmV(Nle)YKW-NH2]2 또는 [sCMV(Nle)YKw-NH2]2 인 펩타이드.
  14. 화학식 6의 아미노산 서열을 갖는 면역반응을 조절하는 펩타이드:
    화학식 6
    W-K-Y-B1-V-m
    상기식에서, W는 L-트립토판(L-Trp); K는 L-라이신(L-Lys); Y는 L-티로신(L-Tyr); V는 L-발린(L-Val); m은 D-메치오닌(D-Met); 및 B1은 L-아스파틱산(L-Asp), L-이소루이신(L-Ile), L-라이신(L-Lys), L-트레오닌(L-Thr), L-발린(L-Val) 또는 L-노오루이신(L-Nor-Leu)을 나타낸다.
  15. 제14항에 있어서, N 말단에서 L-시스테인(L-Cys)을 추가로 포함하는 펩타이드.
  16. 제14항에 있어서, N 말단의 잔기에서 L-라이신(L-Lys), 당(sugar), 사이클릭 유레아(cyclin urea), 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9를 추가로 포함하는 펩타이드.
    화학식 7
    m-V-Nle-B2
    상기식에서, Nle는 노오루이신(L-Nor-Leu); V는 L-발린(L-Val); m은 D-메치오닌(D-Met); 및 B2는 L-티로신(L-Tyr), L-라이신(L-Lys), L-트립토판(L-Trp), L-시스테인(L-Cys) 및 L-프롤린(L-Pro) 중에서 1 내지 5개 선택되는 아미노산을 나타내고,
    화학식 8
    N-Palm-NH-(CH2)n-NH-C(=O)-NH
    상기식에서, Palm은 팔미토일기; 및 n은 1 내지 5를 나타내고,
    화학식 9
    Figure 112006039021319-pat00002
    상기식에서, n은 0 내지 5; X는 C, N 또는 O; 및 Y는 수소, C1-C4의 저급 알킬, 페닐 또는 벤질을 나타낸다.
  17. 제16항에 있어서, 당이 (i)D-자일로우스(D-xylose), L-자일로우스(L-xylose), D-리보우즈(D-ribose), L-리보우즈(L-ribose), D-아라비노스(D-arabinose) 또는 L-아라비노스(L-arabinose) 인 오탄당 및 D-갈락토즈(D-glactose), L-갈락토즈(L-glactose), D-만노즈(D-mannose), L-만노즈(L-mannose), D-글루코스(D-glucose) 또는 L-글루코스(L-glucose)인 육탄당인 단당류, 및 (ii)락토즈(lactose), 말토즈(maltose) 및 셀로비오즈(cellobiose)인 이당류 중에서 선택되는 펩타이드
    (상기에서, 당은 펩타이드와 직접적으로 연결되거나 링커를 통하여 연결된다).
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 1 또는 2개의 L-라이신(L-Lys)의 측쇄반응기가 당 또는 화학식 10으로 치환된 펩타이드:
    화학식 10
    (CH2)n-B3-B4-Nle-Vm
    상기식에서, B3는 NH2 또는 NHCO; B4는 L-티로신(L-Try), L-트립토판(L-Trp), L-라이신(L-Lys), L-아스타테이트(L-Asp) 및 L-글루타믹산(L-Glu) 중에서 1 내지 5개 선택되는 아미노산; 및 n은 1 내지 5를 나타낸다.
  19. 제18항에 있어서, 당이 (i)D-자일로우스(D-xylose), L-자일로우스(L-xylose), D-리보우즈(D-ribose), L-리보우즈(L-ribose), D-아라비노스(D-arabinose) 또는 L-아라비노스(L-arabinose) 인 오탄당 및 D-갈락토즈(D-glactose), L-갈락토즈(L-glactose), D-만노즈(D-mannose), L-만노즈(L-mannose), D-글루코스(D-glucose) 또는 L-글루코스(L-glucose)인 육탄당인 단당류, 및 (ii)락토즈(lactose), 말토즈(maltose) 및 셀로비오즈(cellobiose)인 이당류 중에서 선택되는 펩타이드
    (상기에서, 당은 펩타이드와 직접적으로 연결되거나 링커를 통하여 연결된다).
  20. 제17항 또는 제19항에 있어서, 링커는 에테르 또는 에스테르 형태인 펩타이드.
  21. 제14항, 제15항, 제16항, 제17항 및 제19항 중 어느 한 항에서 선택되는 동일하거나 동일하지 않은 2개의 펩타이드가 디설피드 결합을 통하여 다이머를 형성한 펩타이드.
  22. 제14항, 제15항, 제16항, 제17항 및 제19항 중 어느 한 항에서 선택되는 펩타이드의 C 말단의 카복실기가 아미드기, 싸이오에스테르기 또는 에스테르기로 치환된 펩타이드.
  23. 제14항, 제15항, 제16항, 제17항 및 제19항 중 어느 한 항에서 선택되는 펩타이드의 N 말단의 아미노기가 아세틸기, 포밀기, 팔미토일기 또는 9-플루오레닐메틸옥시카보닐기로 치환된 펩타이드.
  24. 제14항, 제15항, 제16항, 제17항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, WKYDVm-NH2, WKYIVm-NH2, WKYKVm-NH2, WKYTVm-NH2, WKYVVm-NH2, CWKYDVm-NH2, CWKYIVm-NH2, CWKYKVm-NH2, CWKYTVm-NH2, CWKYVVm-NH2, [sCWKYDVm-NH2]2, [sCWKYIVm-NH2]2, [sCWKYKVm-NH2]2, [sCWKYTVm-NH2]2, [sCWKYVVm-NH2]2, mV(Nle)YKWWKY(Nle)Vm-NH2, mV(Nle)YKWCCWKY(Nle)Vm-NH2, mV(Nle)YKWPWKY(Nle)Vm-NH2, N-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH2, N-Ac-WKY(Nle)Vm-NH2, N-f-CWKY(Nle)Vm-NH2, N-f-WKY(Nle)Vm-NH2, WK[(CH2)4NH2-Y(Nle)Vm-NH2]-Y(Nle)Vm-NH2, WK[(CH2)4NH2-WKY(Nle)Vm-NH2]-Y(Nle)Vm-NH2, N-palm-WKY(Nle)Vm-NH2, Fmoc-CWKY(Nle)Vm-NH2, N-Palm-NHCH2CH2NHC(=O)NH-WKY(Nle)Vm-NH2, Cyclic-(urea)-WKY(Nle)Vm-NH2, K[(CH2)4NHCO-DWKY(Nle)Vm-NH2]-WKY(Nle)Vm-NH2, K[(CH2)4NHCO-EWKY(Nle)Vm-NH2]-WKY(Nle)Vm-NH2, D-Glucose-Ac-WKY(Nle)Vm-NH2, D-Glucose-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH2, WK(Glucose-Ac)Y(Nle)Vm-NH2, CWK(Glucose-Ac)Y(Nle)Vm-NH2, [sGlucose-Ac-CWKY(Nle)Vm-NH2]2, Piperazine-CH2CONH-WKY(Nle)Vm-NH2 또는 Piperazine-CONH-WKY(Nle)Vm-NH2 인 펩타이드.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009057982A1 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 Postech Academy-Industry Foundation Composition and method for preventing and treating immune-related disorder

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004029080A1 (ja) 2002-09-27 2004-04-08 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. 白血球結合性化合物およびその標識化合物を有効成分とする医薬組成物
US20040248255A1 (en) 2003-02-07 2004-12-09 Sung-Ho Ryu Leukocyte stimulating peptides
WO2005075505A1 (en) 2004-02-04 2005-08-18 Postech Foundation Peptides that antagonize fpr class receptor mediated signaling

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004029080A1 (ja) 2002-09-27 2004-04-08 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. 白血球結合性化合物およびその標識化合物を有効成分とする医薬組成物
US20040248255A1 (en) 2003-02-07 2004-12-09 Sung-Ho Ryu Leukocyte stimulating peptides
WO2005075505A1 (en) 2004-02-04 2005-08-18 Postech Foundation Peptides that antagonize fpr class receptor mediated signaling

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009057982A1 (en) * 2007-11-02 2009-05-07 Postech Academy-Industry Foundation Composition and method for preventing and treating immune-related disorder
US8877203B2 (en) 2007-11-02 2014-11-04 Postech Academy-Industry Foundation Composition and method for preventing and treating immune-related disorder

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