KR101708945B1

KR101708945B1 - 인간 호중구 세포의 활성을 조절하는 신규한 펩타이드

Info

Publication number: KR101708945B1
Application number: KR1020110119149A
Authority: KR
Inventors: 배외식; 이하영; 배건호
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-15
Filing date: 2011-11-15
Publication date: 2017-02-22
Also published as: KR20130055043A

Abstract

본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 호중구 세포의 활성을 조절하는 신규한 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명자들은 합성 펩타이드 라이브러리를 탐색하여 신규한 서열의 활성 펩타이드를 동정하였다. 본 발명에 따른 신규한 펩타이드들은 호중구 내 인지질 가수분해 효소인 포스포리파제 C의 활성화를 통해서 세포 내 칼슘이온 유리를 촉진하며, 백혈구 세포에 특이적으로 작용한다. 또한, 호중구 세포의 이동성이 상기 펩타이드에 의해 촉진되어 이들 펩타이드가 chemoattractant로 작용한다. 뿐만 아니라, 호중구의 중요한 기능인 반응성 산소 생성이 촉진되고, FPR1 또는 FPR2에 작용함을 규명하였다. 본 발명은 호중구의 활성을 조절할 수 있는 신규한 물질로서, 호중구 활성이 중요하게 연관된 질병에 대한 치료제 개발 등에 이용될 수 있다. 또한, FPR1 또는 FPR2가 관련된 질병에 대한 치료제 개발에도 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인간 호중구 세포의 활성을 조절하는 신규한 펩타이드{Novel peptides that stimulate human neutrophils}

본 발명은 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 호중구의 활성을 조절하는 신규한 펩타이드에 관한 것이다.

호중구(neutrophil)는 선천적 면역반응의 조절에 중요한 역할을 한다. 호중구는 병원균의 감염시에 감염부위로 화학주성에 따라 이동하게 되어 병원균을 효과적으로 탐식하며, 탐식된 병원균을 죽임으로써 감염으로 인한 염증질환 치료에 핵심 기능을 담당하고 있다. 이러한 감염균의 제거는 호중구 활성화에 따라 생성되는 반응성 산소에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 선천 면역반응에서 핵심기능을 담당하는 호중구의 활성화는 세포 밖 자극에 의해 유도될 수 있다.

호중구 자극을 단순화하여 설명하면, 호중구 활성 리간드가 상기 호중구 막 상의 특정의 수용기에 부착된 후, 구아노신 트리포스페이트(guanosine triphosphate, GTP)가 활성화되고, 이는 차례로 포스파티딜-이노시톨-4,5-비포스페이트(phosphatidyl-inositol-4,5-biphosphate, PIP₂)와 특정의 포스포리파아제 C(Phospholipase C, PLC)를 활성화시킨다. 포스포리파아제 C는 포스파티딜-이노시톨-4,5-비포스페이트의 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트(inositol-1,4,5-triphosphate, IP₃) 및 디아실글리세롤(diacylglycerol, DG)로의 가수분해를 촉매한다. IP₃는 칼슘이온(Ca²⁺)의 세포 내 저장으로부터의 방출을 자극한다.

호중구의 활성은 화학주성인자 등과 같은 다양한 자극에 의해 유도될 수 있는데, 화학주성인자는 특정한 세포 표면의 리셉터와 바인딩하고, 세포내 칼슘이온 모빌리제이션, 세포 이동, 엑소시토시스(exocytosis), 점착(adhesion), 및 반응성 산소종 생산 등에 영향을 준다.

호중구의 활성을 조절할 수 있는 활성물질에는 인터루킨-8을 포함한 다양한 것들이 있으나, 저분자 펩타이드 물질은 N-formyl-Met-Leu-Phe를 포함하여 제한적으로 보고되어 있을 뿐이다.

본 발명자들은 PS-SPCLs의 스크리닝을 통하여 동정한 호중구 세포의 활성을 조절할 수 있는 신규한 서열의 활성 펩타이드를 제공하고자 한다. 또한, 상기 신규한 서열의 활성 펩타이드를 이용하여 호중구 활성 및 FPR1 또는 FPR2와 관련된 질병의 치료제로 응용할 수 있는 약학적 조성물을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 측면은 서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 펩타이드는 호중구 세포의 활성을 조절하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 펩타이드는 (a) 세포 내 칼슘이온 증가를 유도하는 특성, (b) 세포 주화성 운동을 자극하는 특성, 및 (c) 백혈구에 특이적으로 작용하는 특성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 것일 수 있다.

또한, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 3의 펩타이드는 인간의 호중구에서 슈퍼옥사이드 생성을 유도하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 서열번호 1 또는 서열번호 3의 펩타이드는 FPR1(formyl peptide receptor 1)에 작용하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 서열번호 2의 펩타이드는 FPR2(formyl peptide receptor 2)에 작용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 제 1항의 펩타이드를 약학적 유효량 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 펩타이드들은 호중구 내 인지질 가수분해 효소인 포스포리파제 C의 활성화를 통해서 세포 내 칼슘이온 유리를 촉진하며, 백혈구 세포에 특이적으로 작용한다. 또한, 호중구 세포의 이동성이 상기 펩타이드에 의해 촉진되어 이들 펩타이드가 화학주성인자로 작용한다. 뿐만 아니라, 호중구의 중요한 기능인 반응성 산소 생성이 촉진되고, FPR1 또는 FPR2에 작용함을 규명하였다. 본 발명은 호중구의 활성을 조절할 수 있는 신규한 물질로서, 호중구 활성이 중요하게 연관된 질병에 대한 치료제 개발 등에 이용될 수 있다. 또한, FPR1 또는 FPR2가 관련된 질병에 대한 치료제 개발에도 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 인간 호중구 세포에서 세포내 Ca² ⁺ 증가를 자극하는 펩타이드를 선별하기 위하여 PS-SPCLs의 초기 스크리닝 결과를 도시한 도면으로, 각 판넬에서 정의하는 헥사펩타이드는 여섯 개의 포지션 중 어느 하나가 19개의 L-amino acids중 하나에 의하여 정의되고(O1 내지 O6), 나머지 다섯 개의 포지션은 19개의 L-amino acids(시스테인 제외)의 혼합으로 구성된다.
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드들이 인간 호중구 세포에서 Ca² ⁺ 증가에 미치는 영향을 실험한 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩타이드들의 세포특이성을 실험한 결과를 도시한 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 펩타이드들의 화학주성을 실험한 결과를 도시한 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드들의 인간 호중구에서 슈퍼옥사이드 음이온의 생성에 미치는 영향을 측정한 결과를 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드들의 FPR1 또는 FPR2의 자극 효과를 실험한 결과를 도시한 도면이다.

호중구 세포는 침입한 병원체와 다른 위험한 물질에 빠르게 방어하는데에 중요한 역할을 한다. 따라서, 본 발명자들은 4천7백만 개 이상의 다른 펩타이드 서열을 포함하는 헥사펩타이드 조합 라이브러리(PS-SPCLs)를 스크리닝하여 인간 호중구 세포에서 세포 내 칼슘이온 증가를 자극하는 신규한 헥사펩타이드를 동정함으로써, 호중구 세포활성과 관련된 질병 및 FPR1 또는 FPR2에 관련된 질병에 대한 치료제의 개발에 응용할 수 있는 물질을 개발하고자 하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 선천 면역 반응에서 중요한 기능을 담당하는 호중구 세포의 활성을 조절할 수 있는 활성물질을 동정하기 위하여 호중구 활성화시에 수반되는 칼슘이온의 유리를 측정함으로써, 합성 펩타이드 라이브러리(47,000,000 서열 포함)를 탐색하였고, 이로써, 신규한 서열의 활성 펩타이드인 GMMWAI(Gly-Met-Met-Trp-Ala-Ile-CONH₂), MMHWAM(MEt-Met-His-Trp-Ala-Met-CONH₂), 및 MMHWFM(Met-Met- His-Trp-Phe-Met-CONH₂)를 동정하였다. 동정된 신규한 펩타이드의 서열번호 및 명칭은 표 1과 같다.

서열번호	명칭	서열
서열번호 1	GMMWAI	Gly-Met-Met-Trp-Ala-Ile
서열번호 2	MMHWAM	Met-Met-His-Trp-Ala-Met
서열번호 3	MMHWFM	Met-Met- His-Trp-Phe-Met

상기 펩타이드는 (a) 세포 내 칼슘이온 증가를 유도하는 특성, (b) 세포 주화성 운동을 자극하는 특성, 및 (c) 백혈구에 특이적으로 작용하는 특성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 가진다.

즉, 상기 세 펩타이드들은 호중구 내 인지질 가수분해 효소인 포스포리파아제 C(PLC)의 활성화와 PTX-민감성 G-단백질을 통하여 세포 내 칼슘이온 유리를 촉진한다. 또한, 상기 세 펩타이드들은 호중구 세포와 단핵구 세포를 포함하는 인간 포식 세포에 특이적으로 작용하고, 섬유아세포나 신경세포와 같은 비 백혈구 세포에는 작용하지 않는다.

본 발명자들은 PTX-민감성 G-단백질을 통하여 상기 세 가지 신규한 펩타이드들이 세포내 Ca² ⁺ 증가뿐만 아니라 세포 주화성 운동도 자극하는 것을 발견하였다. 상기 세 펩타이드에 의해 호중구 세포의 이동성이 촉진되었는바, 이들 펩타이드가 화학주성인자로 작용함을 알 수 있다.

호중구 세포는 세포 밖 자극으로 많은 양의 슈퍼옥사이드 음이온을 생산함으로써, 선천성 면역 반응에 중요한 역할을 한다. 인간 호중구 세포에 의해 이용되는 슈퍼옥사이드 음이온은 침입한 병원체를 사멸시키는 것으로 잘 알려져 있다. 상기 펩타이들 중 MMHWAM, 및 MMHWFM은 슈퍼옥사이드 음이온의 생성을 증가시켰으므로, 호중구의 중요한 기능인 반응성 산소 생성을 촉진함을 알 수 있다.

또한, 상기 세 가지 펩타이드들은 FPR1(formyl peptide receptor 1) 또는 FPR2(formyl peptide receptor 2)에 작용한다. FPR은 호중구, 모노사이트, 매크로파지 및 수지상 세포와 같은 식균세포에서 발견되는 오래된 화학주성물질의 수용체로서 G-단백질과 결합한다. 3종류의 FPR(FPR, FPR-유사 FPRL1, 및 FPRL2)과 두 종류 FPR(사람의 FPR에 대응되는 FPR1과, 사람의 FPRL1에 대응되는 FPR2)이 사람과 마우스에서 각각 동정되었다. FPR 패밀리 일원의 활성화는 백혈구의 화학주성에 따른 이동을 유도하고, 호중구와 모노사이트에서 수퍼옥사이드 음이온 생성을 통해 살균활성을 유도한다. 상기 펩타이들 중에서 GMMWAI 및 MMHWFM은 FPR1에 작용하고, MMHWAM은 FPR2에 작용한다.

본 발명은 상기 펩타이드 GMMWAI, MMHWAM, 및 MMHWFM을 약학적 유효량 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 감염, 류마티스 관절염, 패혈증, 궤양성 대장염, 전장염, 골다공증, 만성 비전염성 폐렴, 이식거부반응, 이식편대 숙주질환(GVHD), 기관지 천식, 동맥경화증, 건선, 파종성혈관내응고증후군(DIC), 페렴, 후천성 호흡장애증후군을 예방 및 치료하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 약제학적 투여 형태는 이들의 약제학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 다른 약제학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 염은 약제학적으로 허용 가능한 염이 바람직하며, 본 발명에 따른 화합물에 무기염기, 유기염기, 무기산, 유기산, 염기성, 또는 산성 아미노산을 첨가하는 것과 같은 현재 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 화합물은 국소 적용을 위해서 연고나 크림으로 제형화 할 수 있고, 일반적인 식염수, 5% 덱스트로스와 같은 수용성 용매, 또는 식물성 오일, 합성 지방산 글리세라이드, 고급 지방산 에스테르, 또는 프로필렌글리콜과 같은 비수용성 용매에 화합물을 용해시키거나, 현탁시키거나, 또는 유화시켜 주사제로 제형화할 수 있다. 본 발명의 제형은 용해제, 등장화제(isotonic agents), 현탁화제, 유화제, 안정화제, 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 “약제학적 유효량”은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 본 발명의 화합물을 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러 번 나누어 투여할 수 있다. 약학 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재하여야 한다. 본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 실시예의 재료 준비 및 방법

1-1. 재료

말초혈액 단핵세포(PBMC) 분리 배지(Hictopaque-1077)와 사이토크롬 c는 시그마에서 구매하였다(St. Louis, MO). 퓨라-2펜타아세톡시메틸에스터(fura-2/AM)는 몰레큘라 프로브에서(Eugene, OR), PTX는 칼바이오캠에서 구매하였다(San Diego, CA).

1-2. 백혈구의 분리

말초혈액 백혈구(Peripheral blood leukocytes)는 건강한 기증자로부터 수득하였다. 인간 호중구(neutrophil)는 덱스트란 침전, 적혈구의 저침투성 분해 및 임파구 분리 배지 구배를 이용하여 분리하였다. 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 Histopaque-1077 구배를 이용하여 분리하였고, 칼슘과 마그네슘을 포함하지 않은 HBSS로 2번 세척한 후, 10% FBS가 포함된 RPMI 배지에서 부유시킨 다음 단핵 백혈구가 배양용기에 고착할 수 있도록 37℃에서 60분간 배양하였다. 고착된 단혈 백혈구가 모아진 후에 임파구를 씻어내기 위하여 상기 세포들을 따뜻한 RPMI 배지에서 다섯 번 세척하였다. 이 분리된 인간 백혈구는 즉시 사용되었다.

1-3. 세포 배양

NIH3T(NIH Swiss mouse embryo fibroblasts), 3Y1(Rat embryonic fibroblasts), 3T3L1(preadipocytes), 및 PC12(rat adrenal pheochromocytoma) 세포를 American type Culture Collection(Rockville, ME)에서 얻어서, humidified atmosphere, 5% CO₂, 95% air, 및 37℃ 조건에서 ml당 약 1ⅹ10⁶개의 세포수로 배양하였다.

실시예 2. 본 발명에 따른 펩타이드의 동정 및 특성

2-1. 인간 호중구 세포에서 Ca ²⁺ 증가를 자극하는 펩타이드의 식별을 통한 호중구 세포 활성 펩타이드의 동정

헥사펩타이드 PS-SPCLs(Positonal Scanning Synthetic Peptide Combinational Library)로부터 모두 114 펩타이드 풀(약 4천 7백만 펩타이드)을 인간 호중구 세포에서 Ca² ⁺ 증가를 자극하는 펩타이드를 선별하기 위하여 스크린하였고, 초기 스크리닝으로부터 각각의 위치에 고정된 각각의 아미노산이 유도하는 Ca² ⁺ 증가 수준을 관찰하였다. 구체적으로 헥사펩타이드 라이브러리는 포항공과대학교의 Peptide Library Support Facility로부터 얻었다. 결과적으로, 114 펩타이드 풀(시스테인(Cys)은 상기 라이브러리들의 구성에서 제외되었다.)이 각각의 풀에 펩타이드 시퀀스당 27nM의 농도로 개별적으로 물에 용해되었다. PS-SPCLs의 초기 스크리닝을 위하여 fura-2/AM을 사용하여 Grynkiewicz 방법으로 [Ca² ⁺]i의 수준을 측정하였다. 제조된 세포를 신선한 무혈청 RPMI 1640 배지에서 계속 교반하면서 3μM의 fura-2/AM로 37℃에서 50분간 배양하였다. 2 x 10⁶ 세포를 Ca² ⁺가 없는 Locke's 용액(154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 5 mM HEPES, pH 7.3, 10 mM 글루코오스, 및 0.2 mM EGTA)에서 각 분석에 사용되도록 분취(aliquote)하였고, 각각의 농도의 펩타이드 풀을 이용하여 배양하였다(초기 스크리닝을 위하여 펩타이드 시퀀스당 50pM). 340nm 및 380nm에서의 이중 여기 파장의 형광 변화 및 500nm의 발광 파장을 측정하여 보정된 형광율을 [Ca² ⁺]i로 바꾸었다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 각각의 위치에서 가장 활성화되는 펩타이드는 첫 번째 위치에서는 메티오닌(M) 또는 글리신(G)이었고, 두 번째 위치에서는 메티오닌(M)이었으며, 세 번째 위치에서는 히스티딘(H) 또는 메티오닌(M), 네 번째 위치에서는 트립토판(W), 다선 번째 위치에서는 알라닌(A), 그리고 여섯 번째 위치에서는 메티오닌(M) 또는 이소루이신(I)이었다.

본 발명자들은 상기 펩타이드 라이브러리의 초기 스크리닝 결과에 기초하여, 세 가지 대표적인 헥사펩타이드를 합성하였다. 상기 세 가지 헥사펩타이드는 GMMWAI, MMHWAM, 및 MMHWFM이다.

2-2. G- proteins 과 PLC 로 매개되는 Ca ² ⁺ 증가를 유도하는 펩타이드

본 발명자들은 0.01 내지 10μM의 다양한 농도의 상기 세 가지 펩타이드들을 이용하여 호중구 세포들의 자극하고 Ca² ⁺농도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 상기 세 가지 펩타이드들은 농도 의존적으로 Ca² ⁺의 증가를 유도한다는 것을 확인하였다. 최고의 활성은 0.5 내지 5μM의 농도에서 나타났다(도 2A 내지 도 2C 참조).

한편, 세포 내 Ca² ⁺ 증가는 몇 가지 다른 경로로 유도될 수 있다. 일례로 Ca²⁺채널의 활성은 백혈구 세포 내 Ca² ⁺ 증가를 이끌어낸다. 본 발명자들은 상기 세 가지 펩타이드가 세포 내 Ca² ⁺ 수준을 증가시키는 것을 확인하였는바, 이것이 세포 표면의 Ca² ⁺ 채널의 관련성이 있는지 확인하고자 하였다. 따라서, 몇몇의 다른 Ca² ⁺ 채널 선택적인 억제제를 사용하여 전배양한 후에 세포 내 Ca² ⁺ 증가에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 2D에 나타난 바와 같이, 인간 호중구 세포를 1μM nifedifine(voltage-sensitive L type Ca² ⁺ 채널 억제제), 10μM diltiazem(voltage-sensitive L type Ca² ⁺ 채널 억제제), 및 10μM SK&F를 사용하여 전배양한 경우, MMHWAM으로부터 유도된 세포 내 Ca² ⁺ 증가는 영향을 받지 않았다. 이는 MMHWAM가 인간 호중구 세포에서 Ca² ⁺ 채널의존적인 경로와 독립적으로 Ca² ⁺ 농도를 증가시킨다는 것을 시사한다.

세포 내 Ca² ⁺ 증가의 다른 경로는 포스포리파아제 씨(Phospholipase C, PLC)의 활성에 의해 이루어진다. MMHWAM에 의해 유도된 Ca² ⁺ 증가에서 PLC의 역할을 규명하기 위하여, PLC 억제제 U-73122(5μM) 또는 그것의 비활성 유사체 U-73343(5μM)와, 2-아미노에톡시다이페닐보레이트(2-APB, 5μM)를 사용하여 세포를 사전 처리하고, 세포 내 Ca² ⁺ 증가에 미치는 영항을 확인하였다.

그 결과, 도 2E에 나타난 바와 같이, U-73122는 MMHWAM으로부터 유래된 Ca² ⁺ 증가를 완전히 억제하였다. 다만, U-73343은 영향을 미치지 않았다. 또한, 2-아미노에톡시다이페닐보레이트(2-APB)도 인간 호중구 세포에서 MMHWAM으로부터 유래된 Ca² ⁺ 증가를 완전히 억제하였다. 이는 MMHWAM은 인간 호중세포에서 PLC 활성에 의해 Ca² ⁺ 증가를 자극한다는 것을 시사한다. 따라서, MMHWAM은 세포 밖 Ca² ⁺의 존재뿐만 아니라, 부재의 경우에도 PLC의 활성에 의하여 세포 내 Ca² ⁺ 증가를 유도할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 PTX(G_i _/o 타입 G 단백질의 억제제)가 상기 펩타이드로부터 유래된 Ca² ⁺ 증가에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 따라서, 인간 호중구 세포를 MMHWAM(5μM)을 사용하여 자극을 주기 전에, 100ng/ml의 PTX를 이용하여 8시간 동안 사전배양을 하였다. 그리고, PTX를 이용하지 않은 것과 Ca² ⁺ 증가여부를 비교하였다.

그 결과, 도 2F에 나타난 바와 같이, 상기 펩타이드로부터 유도된 Ca² ⁺ 증가는 거의 완전히 억제되었다. 이는 MMHWAM은 PTX-민감성 G-단백질에 의하여 Ca² ⁺ 증가를 자극한다는 것을 시사한다.

본 발명자들은 또한, 다른 두 펩타이드인 GMMWAI 및 MMHWFM도 Ca² ⁺ 채널이 아닌, Gi 단백질과 PLC에 의하여 Ca² ⁺ 증가를 자극한다는 것을 확인하였다.

2-3. 상기 새로운 펩타이드의 백혈구 특이성

본 발명자들은 인간 호중구 세포를 자극하는 상기 GMMWAI, MMHWAM 및 MMHWFM은 단핵구와 같은 다른 백혈구에도 동일한 효과를 가지는지 확인하고자 하였다. 따라서, 상기 세 가지 펩타이드를 이용하여 단핵구를 자극하고, Ca² ⁺ 수준을 측정한 결과, Ca² ⁺를 증가시킨다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 세 가지 펩타이드는 호중구 세포와 유사한 농도 의존성을 가지는 것을 확인하였다.

뿐만 아니라, 본 발명자들은 상기 세 가지 펩타이드가 몇 가지 백혈구 외 세포에서 세포 내 Ca² ⁺ 증가에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 실험을 실시하였다. 상기 세 가지 펩타이드(5μM)를 이용하여 NIH3T3(NIH Swiss Mouse 배아섬유아세포), 3Y1(Rat 배아섬유아세포), 3T3L1(지방전구세포), 및 PC12(Rat 부신 크롬친화성세포종)세포를 자극하고, Ca² ⁺ 수준을 측정하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 모두 Ca² ⁺ 증가에 영향을 미치지 않았다. 이로써, 상기 세 가지 펩타이드는 인간 백혈구에 특이적임을 확인할 수 있었다.

2-4. 인간 호중구 세포에서 새로운 펩타이드의 화학주성

펩타이드와 화학주성물질로부터 유래된 호중구 세포의 활성은 서로 유사하므로, 상기 펩타이드들이 인간 호중구에서 화학주성 활성을 나타내는지 여부를 조사하였다. 구체적으로 화학주성 분석은 멀티웰 챔퍼(Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD)를 이용하여 수행하였다. 간단히 설명하면, 준비된 인간 호중구를 ml 당 1ⅹ10⁶세포수로 RPMI에서 부유시켰고, 25㎕의 부유액을 3μm의 포어 사이즈(pore size)를 가지는 폴리하이드로카본(polyhydrocarbon) 필터에 의해 펩타이드들을 포함하고 있는 하측 웰로부터 분리된 상기 챔버의 상측 웰에 분주하였다. 이를 37℃에서 90분 동안 배양한 후, 이주되지 않은 세포는 스크랩핑하여 제거하였고, 필터를 통해 이주된 세포는 탈수, 고정 및 헤마톡실린(Sigma, St. Louis, MO)으로 염색하였다. 고배율(high power field, HPF: 400배)에서 5개의 영역을 무작위적으로 선택하여 염색된 세포수를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4A 내지 4C에 나타난 바와 같이, GMMWAI, MMHWAM, 및 MMHWFM은 0.1-5μM 농도 내에서 인간 호중구 세포의 이동성을 유도하였다. 이는 상기 세 가지의 펩타이드들이 인간 호중구에서 주화성을 유도한다는 것을 시사한다.

다양한 화학주성인자들을 포함하여 다양한 세포 밖 자극은 PTX-민감성 G-단백질을 통하여 호중구 세포를 활성화시킨다. 본 발명자들은 펩타이드로부터 유도된 호중구 화학주성에 PTX-민감성 G-단백질의 관련성을 확인하고자 하였다. 인간 호중구 세포들을 PTX(1㎍/ml)에서 8시간 동안 전배양하고, 각각 5μM의 GMMWAI, MMHWAM, 및 MMHWFM를 사용한 후, 화학주성을 분석한 결과, 펩타이드로부터 유래된 호중구 세포의 화학주성이 완전히 억제되었다(도 4D 내지 4F 참조). 이로써, GMMWAI, MMHWAM, 및 MMHWFM는 PTX-민감성 G-단백질을 통하여 호중구 세포 주화성을 자극함을 확인할 수 있었다.

2-5. 인간 호중구 세포의 슈퍼옥사이드 음이온 생성 효과

본 발명자들은 호중구의 중요한 기능인 반응성 산소 생성여부를 확인하고자, 상기 세 가지 펩타이드의 인간 호중구에서 슈퍼옥사이드 음이온의 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 구체적으로, 슈퍼옥사이드 음이온 생성은 마이크로타이터 96-웰 플레이트 ELISA 분석기(Bio-Tek instruments, EL312e, Winooski, VT, USA)를 이용하여 사이토크롬 c 감소를 측정함으로써 분석하였다(Bae, Y. S., et al., Blood 97:2854, 2001). 인간 호중구(2ⅹ10⁶ 세포/ RPMI 1640 배지)를 50μM 의 사이토크롬 c와 함께 37℃에서 5분간 미리 배양한 다음에, 각각의 펩티드와 함께 배양하였다. 슈퍼옥사이드 생성은 1분 간격으로 5분간 550 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5A에 나타난 바와 같이, 다양한 농도의 GMMWAI는 슈퍼옥사이드 음이온 생성에 실패하였다. 그러나, 도 5B 및 도 5C에 나타난 바와 같이, 다른 두 신규한 펩타이드(MMHWAM, MMHWFM)는 슈퍼옥사이드 음이온 생성이 매우 증가하였다.

2-6. FPR1 또는 FPR2 의 자극 효과

포밀 펩타이드 리셉터(Formyl peptide receptors)는 인간 호중구에서 대표적인 화학주성인자 리셉터이다. 본 발명자들은 상기 세 가지 펩타이드들이 FPR1과 그에 관련된 리셉터에 작용하는지 여부를 확인하고자 하였다. 이를 위하여 FPR1 안타고니스트(CsH)와 FPR2 안타고니스트(WRW⁴)를 사용하였다.

그 결과, 도 6A 및 도 6C에 나타난 바와 같이, Ca² ⁺ 증가를 유도하는 GMMWAI(5μM)와 MMHWFM(5μM)은 CsH(10μM)에 의해 완전히 억제되었으나, WRW⁴(10μM)에 의해서는 억제되지 않았다. 그러나, 도 6B에 나타난 바와 같이, Ca² ⁺ 증가를 유도하는 MMHWAM(5μM)은 CsH가 아닌 WRW⁴에 의해 완전하게 억제되었다. 이로써, GMMWAI 및 MMHWFM는 FPR1에 작용하고, MMHWAM는 FPR2에 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명자들은 또한 벡터, FPR1-, 또는 FPR2-발현 RBL-2H3 세포를 사용하여 FPR1 또는 FPR2에의 작용 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 6E에 나타난 바와 같이, GMMWAI(5μM) 및 MMHWFM(5μM)를 이용하여 FPR1-발현 RBL-2H3 세포를 자극한 경우에는 세포내 Ca² ⁺가 현격하게 증가하였다. 또한, 도 6D 및 도 6F에 나타난 바와 같이, 벡터-, 또는 FPR2-발현 RBL-2H3 세포에서는 세포내 Ca² ⁺ 증가가 유도되지 않았다.

반면, MMHWAM(5μM)는 FPR1-발현 RBL-2H3 세포에서는 세포내 Ca² ⁺ 증가가 유도되지 않았으나, FPR2-발현 RBL-2H3 세포에서 세포내 Ca² ⁺ 증가가 관찰되었다.

이로써, GMMWAI 및 MMHWFM는 FPR2가 아닌 FPR1에 작용하고, MMHWAM는 FPR2에 작용한다는 것을 다시 한 번 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Novel peptides that stimulate human neutrophils <130> PB11-09872 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GMMWAI <400> 1 Gly Met Met Trp Ala Ile 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMHWAM <400> 2 Met Met His Trp Ala Met 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MMHWFM <400> 3 Met Met His Trp Phe Met 1 5

Claims

서열번호 1 내지 3으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 인간 호중구 세포의 활성을 조절하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 (a) 인간 호중구 세포 내 칼슘이온 증가를 유도하는 특성, (b) 인간 호중구 세포 주화성 운동을 자극하는 특성, 및 (c) 백혈구에 특이적으로 작용하는 특성으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 특성을 가지는 것인, 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 서열번호 2 또는 서열번호 3의 펩타이드는 인간의 호중구에서 슈퍼옥사이드 생성을 유도하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 서열번호 1 또는 서열번호 3의 펩타이드는 인간 호중구에서 FPR1(formyl peptide receptor 1)에 작용하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
제 1항에 있어서,
상기 서열번호 2의 펩타이드는 인간 호중구에서 FPR2(formyl peptide receptor 2)에 작용하는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
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