KR20110015571A - 펩티딜 디아실글리세라이드 - Google Patents

Abstract

본 발명은 지질에 공유적으로 연결될 수 있는 펩티드 및 펩티드류와 질병 예방 또는 치료를 위하여 그러한 펩티드류 및 지질펩티드류의 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

펩티딜 디아실글리세라이드{PEPTIDYL DIACYLGLYCERIDES}

본원발명은 펩티딜 디아실글리세라이드에 관한 것이다. 본 출원은 2008 년 4 월 24 일에 제출된 "펩티딜 디아실글리세라이드류"라는 제목의 미국 가출원 번호 61/047,464 호의 우선권을 주장하며, 그 공개물은 본 명세서에 참고로 포함된다.

디아실글리세롤류의 생물학적 역할은 참고 문헌에 잘 기술되어 있다. 예를 들면, 디아실글리세롤류는 트리글리세라이드로서 지질의 수송에 참여하고, 콜레스테롤의 수송체로서 아포리포단백질(apolipoproteins)과 같은 가용성 단백질과의 회합(association)에 참여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 디아실글레세롤류는 세포내 신호전달 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 세포내 막결합 포스파티딜 이노시톨-4,5-비포스페이트(phosphatidyl inositol-4,5-biphosphate)는 포스포리파아제 C 효소의 작용에 의하여 절단되어 2 개의 세포내 메신저(messenger) 분자들, 이노시톨 트리포스페이트 및 막 결합 디아실글리세롤(구체적으로는 1-스테아로일-2-아라치도노일 글리세롤(1-stearoyl-2-arachidonoyl glycerol)을 방출한다. 디아실글리세롤은 전사 인자 NFκB를 활성화시켜 다양한 시토카인류 및 케모카인류의 유전자 발현을 상향 조절하는 단백질 키나아제 C를 활성화시킨다. 펩티딜-2,3-디아실글리세라이드(peptidyl-2,3-diacylglyceride) 또는 PDAG는 면역 기능에 연관되어 있다. 더 구체적으로는, PDAG는 면역 반응을 자극하는 역할을 갖는다. 미국 출원 번호 11/459,772 호(미국 공개 번호. 2007/0197436) 및 본 발명의 배경을 설명하거나 생물학적 메커니즘에 관한 다른 상세한 사항을 제공하기 위하여 본 명세서에 사용된 다른 발간물들은 참고로 포함되어 있다.

본 명세서에 기술된 본 발명의 실시예는 지질에 공유적으로 연결된 약 5 내지 약 25 개의 아미노산의 면역-반응성 펩티드를 포함하는 면역 반응을 자극할 수 있는 화합물들을 포함한다.

일부 실시예에서, 상기 지질은 하기 일반식 (I)의 글리세라이드일 수 있다:

(I)

여기서, X₁, X₂ 및 X₃는 수소, C₂ 내지 C₂₅ 지방산 및 펩티드로부터 선택되고, X₁, X₂ 및 X₃ 중 적어도 하나는 펩티드이다. 실시예의 지방산은 포화, 불포화 또는 폴리불포화(polyunsaturated) 지방산류일 수 있으며, 상기 펩티드는 펩티드의 C-말단의 에스테르 결합에 의하여 지질에 공유적으로 연결될 수 있다.

특정 실시예에서, 상기 면역-반응성 펩티드는 XLYDKGYTSKEQKDCVGIX 또는 XLYDKGYTPKEQKDCVGIX 또는 그 역위 또는 모방체로서, X는 부재하거나 자연발생적 아미노산 또는 그 모방체, 유도화된 아미노산 또는 비-아미노산 보결기(prosthetic group)이다.

본 발명의 실시예의 화합물들은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함할 수 있고 상기 화합물의 유효량과 부합되는 단위 용량 형태로 제공될 수 있으며, 이러한 실시예들은 약학적 조성물로 간주될 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는 지질에 공유적으로 연결된 약 5 내지 약 25 개의 아미노산을 갖는 펩티드로 이루어진 작용제의 유효량을 이를 필요로 하는 피검자에게 투여하는 단계 및 면역 반응을 자극하는 단계를 포함할 수 있는 방법을 포함한다. 본 발명의 실시예의 펩티드는 아미노산 서열 XLYDKGYTSKEQKDCVGIX 또는 XLYDKGYTPKEQKDCVGIX의 펩티드 또는 펩티드 단편 또는 그 역위 또는 모방체를 포함하며, X는 부재하거나 자연발생적 아미노산 또는 그 모방체, 유도화된 아미노산 또는 비-아미노산 보결기이다.

본 발명의 실시예의 작용제는 일반식 (I)의 글리세라이드를 포함할 수 있다:

(I)

여기서, X₁, X₂ 및 X₃는 수소, C₂ 내지 C₂₅ 지방산 및 펩티드로부터 선택되고, X₁, X₂ 및 X₃ 중 적어도 하나는 펩티드이다. 실시예의 지방산은 포화, 불포화 또는 폴리불포화 지방산류일 수 있다. 상기 펩티드는 펩티드의 C-말단의 에스테르 결합에 의하여 지질에 공유적으로 연결될 수 있다. 상기 작용제는 투여되어 선천성 면역 반응을 자극할 수 있으며, γδ T 세포, 단핵 세포, NK 세포, 호중구, CD5+ B-세포 및 그 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 조직 내재성 면역 세포(tissue resident immune cells)는 자극될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 조직 내재성 면역 세포는 상기 펩티드와 접촉되는 경우 자극된다.

본 발명의 실시예의 작용제는 일반식 (I)의 글리세라이드를 포함할 수 있으며, 상기 작용제는 투여되어 선천성 면역 반응을 자극할 수 있고, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 각질형성세포, 간세포 및 그 조합을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 비-면역 세포는 자극될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 조직 세포는 상기 펩티드와 접촉하는 경우 자극된다.

본 발명의 특정 실시예에서, 자극받은 면역 반응은 상기 작용제를 투여한 이후 적어도 1 내지 3 일 동안 면역 반응을 자극하는 단계를 포함할 수 있으며, 특정한 다른 실시예에서 상기 면역 반응은 1 주일 이상 자극될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 작용제는 피검자의 지방 조직에 침적될 수 있으며, 상기 작용제는 장관, 비경구 및 국소 전달을 포함하는 임의의 방법, 유방 주입(mammary infusion) 및 이의 조합에 의하여 투여될 수 있다. 비경구 투여는 관절내, 활액내, 수막강내, 동맥내, 정맥내, 근육내, 피하 및 그 조합을 포함할 수 있지만 여기에 한정되지 않는다. 장관 투여는 경구, 경구(peoral), 직장 및 그 조합을 포함할 수 있지만 여기에 한정되지 않으며, 국소 투여는 비강내, 폐내(intrarespiratory), 피내(epicutaneous), 경피 전달 및 그 조합을 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.

본 발명의 일부 실시예에서, 상기 작용제는 질병 형성제(disease forming agent)에 노출되기 이전에 투여될 수 있으며, 이러한 실시예에서, 질병 발병 또는 진행을 실질적으로 예방할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 작용제는 질병 발생 이전에 투여될 수 있다. 또한, 상기 작용제는 질병 형성제에 노출된 이후에 전달될 수 있으며, 이러한 실시예에서 질병 진행을 실질적으로 억제할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 작용제는 질병 발병 이후 피검자에게 전달되어 상기 질병의 중증도를 감소시키거나 상기 질병의 진행을 역전시킬 수 있다.

본 발명의 실시예의 다른 방법은 상술한 본 발명의 작용제 및 조성물을 사용한 질병 치료 및 제 2 감염 예방 방법과 같은 감염치료방법, 면역 반응 자극방법, 질병 예방방법, 감염 예방방법 및 이의 조합을 포함한다.

본 발명의 실시예는 본 발명의 화합물에 관련된 항체 및 본 발명의 실시예의 항체를 투여하여 전신성 감염, 만성 감염 질병 및 부패증(sepsis), 비-부패성 손상, 외상, 수술 또는 그 조합으로 인한 감염에 한정되지 않은 감염의 치료방법을 더 포함한다. 본 발명의 실시예의 항체는 장관, 비경구 및 국소 전달을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 업계에 공지된 방법에 의하여 피검자에게 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예의 항체는 단백질과 같은 형광 표지에 한정되지 않은 선발 표지 또는 프로브를 제작할 수 있는 퀀텀 도트 및 펩티드와 상호작용하는 생물학적 세포 또는 조직 표본 및 세포들 또는 단백질들과 같이 표본 내에서 펩티드들 검출하고 확인하기 위한 프로브의 사용방법과 연결될 수 있다.

본 발명의 성질 및 장점들을 모두 이해하기 위하여, 첨부한 도면과 연계하여 채용된 하기 상세한 설명에 대해 참조하여야 한다:
도 1은 PDAG(도 1a) 및 본 발명의 본 정제된 1-펩티딜-2,3-디아실글리세라이드(도 1b)를 함유하는 혈청 단편의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 도시한다.
도 2는 카프린 유도된 PDAG로부터 얻은 단편의 ESI 질량 스펙트럼(도 2a) 및 본 발명의 아미노산 서열을 확인하는 다전하(multi-charged) 이온종(m/z 845.45)의 MS/MS 질량 스펙트럼(도 2b)을 도시한다.
도 3은 디히드록시벤조산 매트릭스에서 정제된 PDAG의 PSD MALDI-TOF 질량 스펙트럼을 도시한다.
도 4는 약산 가수분해 이후 PDAG 가수분해 생성물의 PSD MALD-TOF 질량 스펙트럼을 도시한다. 표는 본 발명에서 전체 PDAG 분자에 해당하는 중요 펩티드 단편에 대한 주요한 이온 할당(ion assignments)을 도시한다.
도 5는 PDAG로 배양된 섬유아 세포에서 IL-6 mRNA 및 IL-6 단백질 발현의 자극을 도시한다.
도 6은 PDAG는 NFκB가 아닌 섬유아 세포에서의 NALP3 mRNA 발현을 자극한다는 것을 도시한다.
도 7은 PDAG 및 PDAG 펩티드(25 ng/㎖ 및 50 ng/㎖)는 감염된 단핵세포로부터 클라미디아 폐렴균(Chlamydia pneumoniae) 제거를 유도한다는 것을 도시한다.
도 8은 PDAG는 HepDES 19 세포에서 B형 간염 바이러스 복제를 억제한다는 것을 도시한다.
도 9는 PDAG는 열 사멸된 결핵균(M. tuberculosis)로 배양된 토끼에서 항원 특이적인 IgM 생성의 2 배 증가를 유도한다는 것을 도시한다.
도 10은 PDAG 투여로 인해 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 치사량으로 감염된 마우스에서 질병 진행을 현저히 지연시키는 것을 도시한다.

또한, 본 명세서에 사용되고 있으며 특허청구범위에서 "하나" 및 "상기"의 단수 형태는 문맥이 명시적으로 지시하지 않는 한 복수의 언급을 포함한다는 것을 알아야 한다. 따라서, 예를 들면, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포들에 대한 언급 및 당업자에게 공지된 그 균등물 등이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 방법 및 물질과 동일하거나 균등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시예의 수행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법, 기구 및 물질이 지금 기술되어 있다. 본 명세서에 언급된 모든 발간물은 참고로 포함되어 있다. 본 명세서에서 그 어떤 것도 본 발명이 이전 발명에 의하여 그러한 공개물보다 선행한다는 권리가 없다는 허용으로 해석되어서는 안 된다.

"보조제"는 항원의 면역-자극 특성 또는 약물의 약리학적 효과를 향상시키는 임의의 물질을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "약"이라는 용어는 사용되고 있는 숫자의 수치적 값의 10% 내외를 의미한다.

"모방체", "펩티드 모방체" 및 "펩티도모방체"라는 용어는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 일반적으로 선택된 천연 펩티드 또는 단백질 기능 영역(예컨대, 결합 모티프 또는 활성 부위)의 3차 결합 구조 또는 활성을 모방하는 펩티드, 부분 펩티드 또는 비-펩티드 분자를 지칭한다. 이러한 펩티드 모방체는 하기에 더 기술하는 소 분자 약물 모방체와 같은 비-펩티드제뿐만 아니라 재조합으로 또는 화학적으로 변형된 펩티드류를 포함한다.

본 명세서에 사용된 "약학적으로 허용가능한 염류, 에스테르류, 아미드류 및 전구약물"이라는 용어는 가능하다면 본 발명의 화합물의 양쪽성이온 형태뿐만 아니라 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기성 반응 등이 없이 환자의 조직과 접촉하여 사용하는데 적합하고, 적당한 이익/위험 비율에 비례하며 의도된 용도에 대하여 효과적인 본 발명의 화합물의 그러한 카르복실산염류, 아미노산 부가염류, 에스테르류, 아미드류 및 전구약물을 지칭한다.

본 명세서에 사용된 "생리학적으로 허용가능한(physiologically tolerable)" 및 그 문법적 변형은 이들이 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 지칭하는 바와 같이, 상호교환가능하게 사용되며 상기 물질은 오심, 현기증, 발진 또는 위장 전도(gastric upset)와 같은 바람직하지 않은 생리학적 효과가 최소한 생성되거나 생성되지 않으면서 포유류에 투여가능하다는 것을 나타낸다. 바람직한 일 실시예에서, 치료 조성물은 치료 목적을 위하여 인간 환자 또는 다른 동물에 투여시에 비항원적이다.

"제공하는"은 치료제와 연계하여 사용되는 경우 표적 조직으로 또는 표적 조직상으로 직접 치료제를 투여하거나 환자에게 치료제를 투여하여 이로 인하여 상기 치료제가 표적되는 조직에 긍정적으로 영향을 주는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용된 "피검자" 또는 "환자"는 인간, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 원숭이, 토끼, 생쥐, 마우스 등을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 동물 또는 포유류를 지칭한다.

본 발명의 목적을 위한 "질병"은 예를 들면, 바이러스 입자, 박테리아성 병원균 등과 같은 임의의 감염체일 수 있다. "병든 피검자"라는 언급에 사용된 "병든"은 감염체로 감염된 임의의 인간 또는 동물을 지칭할 수 있다. 상기 "병든 피검자"는 예를 들면 알려진 증상과 같은 감염의 징후를 보일 수 있거나 보이지 않을 수 있다.

본 명세서에 사용된 "표본"은 본 발명의 방법에 의하여 시험될 수 있는 생물학적 표본을 포함하며, 혈청, 혈장, 전혈, 뇌척수액, 림프액, 다양한 외부 분비물(뇨, 호흡기, 비뇨생식관 분비물, 누액, 등) 등과 같은 체액을 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용된 "치료제"라는 용어는 환자의 원하지 않는 상태 또는 질병의 치료, 질병과의 싸움, 질병의 완화, 예방 또는 개선에 활용되는 작용제를 의미한다. 본 발명의 실시예는 선천성 면역 반응 또는 염증성 반응의 완화를 자극하는데 있다. 본 명세서에서의 사용 방법은 기존 상태의 치료에 있어서 치료적 용도뿐만 아니라 예방적 용도를 고찰한다.

본 명세서에 사용된 "치료적으로 유효한" 또는 "유효한"이라는 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 본 발명의 치료 조성물 실시예-예컨대, 하나 이상의 펩티딜 디아실글리세라이드류 또는 그 모방체의 양을 지칭한다. 예를 들면, 1-펩티딜-2,3-디아실글리세라이드 또는 그 모방체를 포함하는 조성물의 치료적 유효량은 바람직한 효과를 달성하기 위하여, 즉, 상기 조성물이 투여되는 동물에 있어서 선천성 면역 반응을 효과적으로 자극하기 위하여 계산된 소정량이다.

본 발명의 치료 조성물의 언급에 사용된 "단위 용량(unit dose)"이라는 용어는 피검자에 대한 단위 투여량(unitary dosage)으로 적당한 물리적으로 불연속적인 단위들을 지칭하는 것으로서, 각 단위는 필요한 희석제; 즉, 부형제, 담체 또는 운반체와 혼합하여 소기의 치료 효과를 생성하기 위하여 계산된 활성 물질의 소정량을 포함한다.

본 발명의 일 실시예는 1-펩티딜-2,3-디아실글리세라이드 또는 PDAG에 관한 것일 수 있다. 본 발명의 다른 실시예는 PDAG를 함유하는 조성물, PDAG의 부분을 함유하는 조성물, PDAG 펩티드의 유사체를 함유하는 조성물 및 PDAG의 펩티드 모방체를 함유하는 조성물을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체는 피검자에게 제공될 수 있으며 면역 반응과 같지만, 여기에 한정되지 않은 치료 효과를 자극할 수 있으며, 특정 실시예에서 상기 면역 반응은 그렇게 제공되는 피검자에서의 선천성 면역 반응일 수 있다. 본 발명의 다른 실시예에서, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체는 질병 치료를 받고 있는 피검자, 건강한 피검자 또는 건강하고 질병, 질병 형성 입자 또는 병든 인간 및/또는 동물에 노출될 수 있는 피검자에게 투여될 수 있다. PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체 및 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체를 함유하는 치료제가 건강한 피검자에게 제공되는 본 발명의 실시예에서, 상기 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체는 상기 피검자의 면역 시스템의 예방적 활성화 및 특정 실시예에서 선천성 면역성의 예방적 활성화를 촉진시킬 수 있다.

이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 본 발명의 실시예에서 상기 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체가 피검자에게 제공되는 경우, 상기 피검자에 있어서 조직 내재성 면역 세포를 활성화시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체는 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 다른 실시예에서, 상기 면역 반응은 선천성 면역 반응일 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예는 비경구, 장관 또는 국소 투여와 같지만, 여기에 한정되지 않은, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체 및 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체를 함유하는 치료제의 투여방법을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예는 상기 PDAG에 대한 특이성을 갖는 항체 및 피검자에 있어서 PDAG의 전신 또는 국부 농도의 고갈에의 그러한 항체의 사용 방법을 포함한다. 특정 실시예에서, PDAG에 특이적인 항체가 제공된 피검자는 전신 염증, 만성 염증성 질환, 아테롬성 동맥 경화 질환(atherosclerotic disease), 류마티스성질환, 자가면역질환 등과 같지만, 여기에 한정되지 않는 면역 질환의 증상을 보일 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예는 형광 표지된 PDAG, PDAG의 유사체 및 PDAG에 특이성을 갖는 형광 표지된 항체 또는 항체 단편 및 그러한 형광 표지된 PDAG, PDAG의 유사체 및 항체의 생성방법을 포함한다. 본 발명의 실시예에서, 형광 표지된 PDAG, PDAG의 유사체 및 항체는 시험관내 및 체내에서 면역 시스템 및 면역병리현상의 태양을 평가하는 진단 도구로서 사용될 수 있으며, 일부 실시예에서, 피검자는 만성 염증성 질환, 자가면역질환, 아테롬성 동맥 경화 질환, 당뇨병 등과 부합하는 증상을 보이는 피검자를 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지 않는다.

본 발명의 다양한 실시예에서 기술된 PDAG는 지질 모이어티에 공유적으로 부착된 적어도 하나의 펩티드 모이어티를 갖는 펩티딜 디아실글리세라이드를 포함할 수 있으며 1-펩티딜-2,3-디아실글리세라이드의 일반식이다. 특정 실시예에서, 상기 지질 모이어티는 1-스테아로일-2-아라치도노일 글리세롤이다.

본 발명의 실시예에 기술된 PDAG는 일반식 (I)일 수 있으며:

(I)

여기서, X₁, X₂ 및 X₃는 수소, 펩티드, 펩티드 모방체 또는 펩티드 유사체 또는 약 1 내지 약 20 개의 탄소 원자를 갖는 포화, 불포화 또는 폴리불포화 지방산일 수 있다. 본 발명의 일부 실시예에서, X₁, X₂ 및 X₃중 적어도 하나는 펩티드, 펩티드 모방체 또는 펩티드 유사체일 수 있으며, 다른 실시예에서, X₁, X₂ 및 X₃중 2 이상은 펩티드, 펩티드 모방체, 펩티드 유사체일 수 있다.

본 발명의 실시예의 펩티드 모이어티는 약 5 내지 약 25 개 사이의 아미노산으로 구성될 수 있으며 하나 이상의 자연발생적, 비-자연 발생적 및 화학적으로 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 펩티드 모이어티는 약 1000 내지 약 3000 원자질량단위(amu)일 수 있다. 본 발명에 포함된 펩티드류 또는 그 모방체는 면역성을 활성화시키는 소기의 효과를 부여하는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 펩티드 모이어티는 지질 모이어티에 부착되기 이전에 제작되고/되거나 분리될 수 있으며 예를 들면, 인간, 동물, 박테리아 원천 등과 같은 천연 원천으로부터 합성 및 분리될 수 있거나 업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 합성될 수 있다. 그렇게 합성 및 분리된 펩티드류, 펩티드 모방체류 및 펩티드 유사체류는 예를 들면, 여과, 크로마토그래피 등과 같은 당업자에게 알려진 방법에 의하여 정제 또는 농축될 수 있다. 상기 펩티드 모이어티는 펩티드의 카르복시 말단 카르복시산에서의 에스테르화에 의하여 지질 모이어티에 공유적으로 접합될 수 있으며, 일부 실시예에서, 상기 펩티드 모이어티는 펩티드의 카르복시 말단 카르복시산의 인산에스테르를 통해 지질 모이어티에 공유적으로 접합될 수 있다.

상기 PDAG의 펩티드 부분의 서열은 실시예들 사이에서 다양할 수 있다. 예를 들면, 일 실시예에서, 펩티드 서열은 XLYDKGYTSKEQKDCVGIX 또는 XLYDKGYTPKDCVGIX 또는 그 합성 균등물, 펩티드 유사체 또는 펩티드모방체일 수 있다. 그러한 실시예에서, X는 부재하거나 임의의 자연발생적 아미노산 또는 그 모방체, 유도화된 아미노산류 또는 비-아미노산 보결기들일 수 있으며 특정 실시예에서, N-최말단 아미노산은 N-아세틸 알라닌(acA)일 수 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, 상기에 제시된 펩티드 서열은 예를 들면, 단독으로 투여되거나 PDAG로서 지질 모이어티와 접합되는 경우 포유류, 특히 인간에게서 면역 반응을 촉발시킬 수 있는 대형 펩티드류 종류의 대표적인 것일 수 있다. 따라서, 거의 모든 원천으로부터 분리된 상기 기능을 수행하는 임의의 펩티드는 예를 들면, 동물, 포유류, 인간, 영장류, 소, 말, 돼지, 조류, 파충류, 곤충류, 미생물, 박테리아 등과 같지만, 여기에 한정되지 않은 원천으로부터 분리된 PDAG와 회합된 펩티드류를 포함하는 본 발명의 실시예에 의해 포함될 수 있다.

지질 모이어티와 공유적으로 접합되어 PDAG를 구성하는 펩티드류, 펩티드 모방체류 또는 펩티드 유사체류는 고려될 수 있으며 이하 "PDAG 지질펩티드류"라고 지칭될 것이다.

예를 들면, PDAG는 하기와 같이 합성될 수 있다. PDAG 펩티드류 또는 PDAG 펩티드 모방체류는 예를 들면, 연장된 HBTU/HOBt 커플링 사이클 및 사전-장약된(pre-loaded) Wang 수지를 갖는 FMOC 합성 프로토콜과 같은 고체상 합성 방법을 이용하여 제작될 수 있다. 합성 이후에, 펩티드 측쇄 보호기는 절단될 수 있으며 펩티드는 시약-K (Reagent-K)를 사용하여 상기 수지로부터 방출될 수 있다. 이후, 상기 펩티드는 예를 들면, 디에틸 에테르 추출 및 동결건조를 이용하여 합성 완충액으로부터 추출될 수 있다. 역상 C-18 정제를 이용하여 그 결과로 발생되는 정제되지 않은 펩티드류를 더 정제할 수 있으며 이후 MALDI-TOF 특성화를 거쳐 아미노산 서열을 확인할 수 있다.

PDAG 펩티드 또는 펩티드 모방체는 2 단계 공정으로서, 우선 상기 PDAG 펩티드가 탈-보호(de-protection) 단계 없이 상술한 바와 같이 합성되는 공정을 이용하여 상기 PDAG의 지질 부분에 공유적으로 부착될 수 있다. 이후 C-말단 카르복시산은 예를 들면, 디시클로헥실카르비미드(dicyclohexylcarbimide)로 활성화될 수 있으며, 상기 펩티드는 디아실글리세롤 및 디메틸아미노피리딘(DMAP)와 같은 촉매제의 존재하에 배양될 수 있다. 에스테르화는 상기 배양 단계 중에 발생하여 펩티딜 디아실글리세라이드가 형성하도록 할 수 있다. 이후, 펩티드 측쇄 보호기는 시약 K로 절단될 수 있으며, 펩티딜 디아실글리세라이드 생성물은 크로마토그래피에 의하여 분리 및 정제될 수 있다. 이후, MALDI-TOF 또는 ESI-MSⁿ 특성화를 이용하여 상기 정제된 생성물의 구조를 확인할 수 있다.

본 발명의 실시예의 PDAG의 펩티드 부분은 예를 들면, 20 개의 유전학적으로 인코딩된 아미노산류(또는 D 아미노산류)의 자연발생적 측쇄 중 하나 이상을 예를 들면, 알킬, 저급 알킬, 4-, 5-, 6- 내지 7 원 알카릴(alkaryl), 아미드, 아미드 저급 알킬, 아미드 디(저급 알킬), 저급 알콕시, 히드록시, 카르복시 및 그 저급 에스테르 유도체를 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 비-자연발생적 측쇄와 같은 비-자연발생적 측쇄로 교체하고 4-, 5-, 6- 내지 7 원 헤테로사이클릭류로 교체하여 펩티드 모방체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 프롤린 유사체는 프롤린 잔기의 고리 크기가 5 원 내지 4, 6 또는 7 원에서 바뀌는 프롤린 유사체가 제작될 수 있다. 사이클릭기는 포화 또는 불포화될 수 있으며, 불포화인 경우 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 헤테로사이클릭기는 예를 들면, 질소, 산소 및/또는 황 등과 같은 하나 이상의 헤테로원자를 함유할 수 있으며 퓨라자닐(furazanyl), 퓨릴(furyl), 이미다조리디닐(imidazolidinyl), 이미다졸릴(imidazolyl), 이미다조리닐(imidazolinyl), 이소티아졸릴(isothiazolyl), 이속사졸릴(isoxazolyl), 모르포리닐(morpholinyl)(예컨대, 모르폴리노(morpholino)), 옥사졸릴(oxazolyl), 피페라지닐(piperazinyl)(예컨대, 1-피페라지닐), 피페리딜(piperidyl)(예컨대, 1-피페리딜, 피페리디노(piperidino)), 피라닐(pyranyl), 피라지닐(pyrazinyl), 피라졸리디닐(pyrazolidinyl), 피라졸리닐(pyrazolinyl), 피라졸릴(pyrazolyl), 피리다지닐(pyridazinyl), 피리딜(pyridyl), 피리미디닐(pyrimidinyl), 피롤리디닐(pyrrolidinyl)(예컨대, 1-피롤리디닐), 피롤리닐, 피롤릴, 티아디아졸릴(thiadiazolyl), 티아졸릴(thiazolyl), 티에닐(thienyl), 티오모르폴리닐(thiomorpholinyl)(예컨대, 티오모르폴리노(thiomorpholino)) 및 트리아졸릴(triazolyl)을 포함하지만, 여기에 한정되지 않은 기들을 형성할 수 있다. 이러한 헤테로사이클릭기는 포화 또는 불포화될 수 있다. 치환된 헤테로사이클릭기는 알킬, 알콕시, 할로겐, 산소 또는 치환 또는 비치환 페닐과 같지만 여기에 한정되지 않은 치환체를 함유할 수 있다. 또한, PDAG 펩티드류의 펩티도모방체는 예를 들면, 인산화, 술폰화, 비오틴화 등에 의하여 화학적으로 변형된 아미노산 잔기를 가질 수 있다.

해당 천연 펩티드와 동일 또는 유사한 소기의 생물학적 활성을 갖지만 더 나은 용해도, 안정도 및/또는 가수분해 또는 단백질 가수 분해에 대한 감수성을 갖는 펩티드 모방체의 구축에 다양한 기법이 이용가능하다. 그러므로, 펩티도모방체 화합물의 이러한 특성으로 인하여 세포 투과성을 향상시키고 세포 수용체에 대한 더 높은 친화도 및/또는 결합도(avidity) 및 연장된 생물학적 반감기를 가질 수 있기 때문에 이러한 특성은 치료적 응용에의 용도를 장려한다. 특정 펩티도모방체 화합물은 본 발명의 펩티드의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 종종, 펩티도모방체 화합물은 선택된 펩티드의 3 차원 구조를 기반으로 하는 3 차원 구조(즉, "펩티드 모티프")를 갖는 합성 화합물이다. 상기 펩티드 모티프는 펩티도 화합물에 소기의 생물학적 활성, 즉, 모방체 화합물의 결합 활성이 실질적으로 감소되지 않으며 모방체가 모델이 된 천연 펩티드의 활성 이상인 면역 반응의 향상 또는 자극을 제공한다.

펩티도모방체 설계 전략은 업계에 용이하게 이용가능하다. 펩티도모방체의 일 종류는 부분적 또는 전체적으로 비-펩티드이지만, 펩티드 골격 원자-대-원자(atom-for-atom)를 모방하고 천연 아미노산 잔기들의 측기들(side groups)의 기능성을 유사하게 모방하는 측기들을 포함하는 골격을 함유한다. 에스테르, 티오에스테르, 티오아미드, 레트로아미드, 환원된 카르보닐, 디메틸렌 및 케토에틸렌 결합과 같은 화학 결합의 일부 유형은 프로테아제-내성 펩티도모방체의 구축에의 펩티드 결합을 위한 일반적으로 유용한 치환체로 업계에 공지되어 있다. 다른 종류의 펩티도모방체는 다른 펩티드 또는 단백질과 결합하지만 항상 천연 펩티드의 구조적 모방체는 아닌 소형 비-펩티드 분자이다. 펩티도모방체들의 또 다른 종류는 조합 화학 및 대규모 화학 라이브러리들의 발생으로부터 생성한다. 일반적으로 이것은 구조적으로는 천연 펩티드와 관련되어 있지 않지만, 비-펩티드 뼈대(scaffold)상에 위치된 필요한 기능기들을 갖고 있어서 원본 펩티드의 "지형학적(topographical)" 모방체로 작용하는 신규한 주형이다.

이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 또는 PDAG의 모방체는 표적 조직 내에서 활성화되어 활성화된 PDAG("PDAG")를 생성한다. 이후 "PDAG" 모이어티는 상기에서 주목한 바와 같이 면역 세포 및/또는 비-면역 세포 내 또는 그 위의 특이적인 수용체 분자들과 결합하고 IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1α 및 β, INF-γ, TNF-α, 그랜자임(Granzyme) 및 RANTES와 같지만, 여기에 한정되지 않은 시토카인류의 방출을 촉발시켜 매크로파지, 식세포 NK 세포 또는 호중구를 보충하고 다른 자극성 시토카인류 및 펩티드류의 방출을 자극한다. 또한, 시토카인 방출로 인하여 CD5+ B-세포(조직 내재성 B1 세포라고도 함)를 자극하여 면역글로불린(IgM, 강력한 옵소닌화 면역글로불린) 및 IgA 또는 IgG, 시토카인류 및 케모카인류와 같은 다른 B-세포 유도 면역글로불린류를 생성할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 실시예는 피검자에게 투여되는 경우 비활성화된 형태로(즉, 지질 모이어티에 공유적으로 부착된) 표적 조직 내에 존재하며 시간에 걸쳐서 지질단백질 리파아제의 작용에 의하여 활성화되어 이로 인해 상기 피검자의 표적 조직 내에서 증가된 PDAG 펩티드 농도 및 면역-활성화를 시간에 걸쳐서 유지하게 되는 PDAG 펩티드, PDAG 펩티드의 부분, PDAG 펩티드의 유사체 및 PDAG 펩티드의 펩티드 모방체를 포함한다. 활성 PDAG 펩티드의 지속 방출은 지속된 선천성 면역 시스템 활성화를 가능하게 하여 이로 인하여 예방적으로 처리된 피검자에게 시간에 걸쳐서 면역학적으로 도전된(immunologically challenged) 경우 질병과 싸우는 향상된 능력를 부여하거나 치료적으로 처리된 피검자에게 상기 PDAG의 장기간 작용 제형을 부여한다.

본 발명의 다른 실시예에서, 하나 이상의 PDAG 펩티드가 지질 모이어티에 공유적으로 접합될 수 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, PDAG 펩티드 또는 펩티드 모방체의 효과적인 방출의 기간은 지질 모이어티에 접합된 PDAG 펩티드 또는 펩티드 모방체의 숫자에 직접 연관될 수 있다. 그러므로, 단일 지질 모이어티에 접합된 3 개의 PDAG 펩티드 모이어티를 갖는 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 또는 PDAG의 모방체를 투여하면 하나의 지질에 접합된 유일한 PDAG 모이어티를 갖는 유사하게 투여된 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 또는 PDAG의 모방체보다 더 오랜 기간에 걸쳐서 PDAG 펩티드를 방출할 수 있다.

일부 실시예에서, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체는 피검자에게 직접 전달될 수 있고, 다른 실시예에서, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 또는 PDAG의 모방체는 약학적으로 허용가능한 담체와 조합되어 피검자에게 전달 또는 제공될 수 있는 약학적 조성물을 제작할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 다양한 투여 경로가 이용가능하다. 선택된 특정 모드는 선택된 특정 화학치료 약물, 치료되는 상태의 중증도 및 치료 효능에 필요한 투여량에 의존할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 임상적으로 허용가능하지 않은 부작용을 유발하지 않으면서 유효 수준의 활성 화합물을 생성하는 임의의 모드를 의미하는 의료적으로 허용가능한 임의의 투여 모드를 이용하여 수행될 수 있다. 그러한 투여 모드로는 경구, 직장, 국소, 비강, 피내, 흡입, 복강내 또는 비경구 경로를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. "비경구"라는 용어는 피하, 정맥내, 근육내 또는 주입을 포함한다. 정맥내, 피하 또는 근육내 경로는 본 발명의 목적에 특히 적합하다.

본 발명의 실시예의 약학적 조성물은 예를 들면, 염 내의 아세트산, 염 내의 시트르산, 염 내의 붕산, 염 내의 인산 등과 같은 완충제 및 선택적으로는 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤류, 티메로살 등과 같은 보존제를 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 단위 투여량 형태로 용이하게 제시될 수 있으며 약학 업계에 공지된 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 모든 방법은 활성제를 하나 이상의 부가 성분을 구성하는 담체와 혼합시키는 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 조성물은 활성 화합물을 액체 담체, 곱게 나눈 고체 담체 또는 양쪽 모두와 균일하고 밀접하게 혼합시키고, 이후 필요하다면 생성물을 형성하여 제조될 수 있다.

또한, 유리하게는 다양한 다른 담체 물질이 적당한 양으로 비강 스프레이에 존재할 수 있다. 용액은 수용성 배지에 소량의 염화나트륨을 용해시켜 약한 식염수로 제조될 수 있다. 염 농도는 약 0.1 내지 2.0%의 범위 내에 있을 수 있으며, 바람직하게는 약 0.65% 정도이다. 또한, 계면 활성제, 비타민류 및 비타민 유도체, 항히스타민류, 습윤제, 보존제, 보습제, 유화제, 취기제(odorant) 등과 같은 다른 물질은 종래 농도로 존재할 수 있다. 적절한 물질을 공개한 수많은 공개물이 수용성 배지에서의 유효한 농도의 설명과 함께 참고 문헌에서 찾을 수 있다. 당업자는 적당한 물질과 농도를 그 공지된 기능에 대해 결정하는 것에 있어서 어려움이 없을 것이다. 비강으로의 스프레이의 전달은 종래 임의의 스프레이 기법 또는 장치에 의할 수 있다.

또한, 본 발명의 실시예는 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체의 멸균 제제가 바람직하게는 수혈인의 혈액과 등장인 비경구 투여에 적합한 조성물을 제공한다. 이 수용성 제제는 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하는 공지된 방법에 따라 제형될 수 있다. 또한, 멸균 주사가능 제제는 예를 들면, 1,3-부탄디올에 용해된 용액과 같은 비-독성의 비경구적으로 허용가능한 희석제 또는 용매에 용해된 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액일 수 있다. 채용될 수 있는 허용가능한 운반체 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 고정유가 용매 또는 현탁화 배지로서 종래 채용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이드류를 포함하는 임의의 무자극성(bland) 고정유가 채용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산류는 주사제 제조에 사용될 수 있다. 경구, 피하, 정맥내, 근육내 등의 투여에 적당한 담체 제형은 본 명세서에 그대로 참고로 포함된 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA에서 찾을 수 있다.

본 발명의 실시예의 전달 시스템은 시간-방출(time-released), 지연 방출(delayed release) 또는 지속 방출(sustained release) 전달 시스템을 포함하도록 설계될 수 있다. 또한, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체는 다른 면역자극제 또는 면역향상제와 연계하여 사용될 수 있다. 그러한 시스템을 사용하면, 피검자에 대한 편의성을 향상시켜 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체의 반복 투여는 회피될 수 있으며, 본 발명의 특정 조성물에 특히 적절할 수 있다.

PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체, PDAG의 모방체 및 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체를 포함하는 약학적 조성물은 면역 반응을 향상시키거나 자극하는 유효량 및 특정 실시예에서는 선천성 면역 반응을 자극하는 유효량으로 투여될 수 있다.

일반적으로, 임상 시험에 있어서의 일상적인 실험을 이용하여 각각의 작용제 또는 약학적 조성물 및 투여 프로토콜에 대한 최적 효과를 위한 특이적인 범위를 측정할 수 있다. PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체, PDAG의 모방체 및 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체를 포함하는 약학적 조성물을 특이적인 피검자에 대한 투여는 피검자의 상태 및 최초 투여에 대한 반응성에 따라 유효하고 안전한 범위 내로 조정될 수 있다. 그러나, 최종 투여 프로토콜은 피검자의 연령, 상태 및 크기, 상기 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체, PDAG의 모방체 및 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체를 포함하는 약학적 조성물의 역가, 치료 기간 및 치료되는 질병의 중증도와 같은 인자들을 고려하여 주치 의료인의 판단에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 실시예에서, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체, PDAG의 모방체 및 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체를 포함하는 약학적 조성물의 투약 계획(dosage regimen)은 비강 스프레이 또는 흡입기에 의하여 투여될 수 있다. 비강 스프레이 또는 흡입기 제형에 대하여, 상기 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체, PDAG의 모방체 및 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 및 PDAG의 모방체를 포함하는 약학적 조성물의 효과적인 용해 또는 분산을 위한 가루로 만든(ground) 입자 크기는 약 0.1 내지 약 20 마이크론, 약 0.2 내지 약 10 마이크론 및 특정 실시예에서는, 약 0.2 내지 약 5 마이크론 정도일 수 있다. PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 또는 PDAG의 모방체의 수용성 담체로의 혼입은 예를 들면, 락톤 용액 내의 4% 농도와 같이 용액 내에 상기 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 또는 PDAG의 모방체를 우선 분산시켜서 보조받을 수 있다. 일단 완전히 혼합, 분산 및/또는 용해되면, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 또는 PDAG의 모방체는 약 0.0015 내지 약 2.0%, 약 0.015 내지 약 0.35% 및 특정 실시예에서, 약 0.10%(본 명세서의 모든 백분율은 달리 지시되지 않으면 중량비이다.)의 농도로 존재할 수 있다.

다른 실시예에서, PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체 또는 PDAG의 모방체는 2 내지 4 분할 용량으로 경구로 투여되어 일당 약 25 ㎍ 내지 약 2000 ㎍, 일당 약 25 내지 500 ㎍ 또는 특정 실시예에서, 일당 약 50 내지 약 250 ㎍ 범위의 총 혈중 농도에 도달할 수 있다. 일부 실시예에서, 간헐 요법(예컨대, 3 주 중에서 1 주 또는 4 주 중에서 3 주)이 이용될 수 있다.

피검자에서의 반응이 최초 적용 용량에서 불충분한 경우, 환자 내성이 허용하는 정도까지 더 높은 용량(또는 다른 더 국소화된 전달 경로에 의한 유효하게 더 높은 용량)이 채용될 수 있다. 일당 복수회의 용량이 사용되어 적당한 화합물의 전신 농도에 도달할 수 있다. 일반적으로, 최대 용량이 사용될 수 있다. 최대 용량은 정상적인 의학적 판단에 따라 최상 안전 용량으로 간주될 수 있다. 그러나, 당업자는 피검자가 의료적 이유, 심리적 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 인하여 더 낮은 용량 또는 허용가능한 용량을 주장할 수 있다는 것을 알 것이다.

본 발명의 다른 실시예에서, 적어도 하나의 PDAG, PDAG의 부분, PDAG의 유사체, PDAG의 모방체 또는 PDAG 펩티드는 항원성 펩티드에 공유적으로 부착되거나 상기 항원성 펩티드 또는 백신과 단순하게 혼합될 수 있다. 이론에 구속되고자 하는 것은 아니지만, PDAG 또는 PDAG 펩티드를 첨가하면 상기 항원성 펩티드 또는 백신의 투여시에 선천성 면역 시스템을 자극하여 상기 항원성 펩티드 또는 백신의 면역원성을 향상시킬 수 있다. 공유적으로 부착된 하나 이상의 PDAG 또는 PDAG 펩티드 또는 PDAG 또는 PDAG 펩티드 항원 또는 백신 부가혼합물을 갖는 합성 항원은 피검자에게 투여되어 상기 피검자에게서 장기간의 적응성 면역 반응을 유도할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서, 항체는 자연 발생적 PDAG 및 PDAG 펩티드로 배양될 수 있으며, 또 다른 실시예에서, 그렇게 배양된 항체는 피검자에게 투여되어 상기 항체가 배양된 PDAG의 농도를 고갈시킬 수 있다. 이론에 구속되자 하는 것은 아니지만, 항체를 고갈시키는 PDAG 및/또는 PDAG 펩티드의 투여는 예를 들면, 부패증, 아테롬성 동맥 경화증, 류마티스성 질환, 자가면역 질환, 염증성 장 질환, I 형 당뇨병 등과 같은 비조절성 전신 염증을 보이는 피검자를 위한 이로운 치료 전략일 수 있다. 유사한 실시예에서, 항체를 고갈시키는 PDAG 및 PDAG 펩티드가 사용되어 예를 들면, 외상, 광범위한 수술 절차로 인한 염증 등과 같은 비-부패성 부상을 치료할 수 있다.

본 발명의 PDAG 및 PDAG 펩티드에 대한 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의하여 토끼, 마우스, 염소, 말 또는 다른 종에서 배양될 수 있다. 예를 들면, PDAG 또는 PDAG 펩티드에 대한 단일클론성 항체는 융합 세포 주입 기법을 활용하여 배양될 수 있으며, 선택된 융합 세포는 세포 배양액 내에서 또는 단일클론성 항체의 연속 생산을 위해 생물반응기 내에서 유지될 수 있다. 일부 실시예에서, 단일클론성 항체의 PDAG 펩티드 특이적 결합 영역은 전체 항체의 특이적인 화학적 절단 또는 업계에 공지된 재조합 방법에 의하여 선택적으로 생성될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 특이적인 PDAG 결합 영역은 인간 항체의 Fc 영역으로 접합되어 PDAG 고갈 항체를 인간 피검자에게 투여하기 위한 인간화된 키메라를 생성할 수 있다. 키메라 항체는 업계에 공지되어 있으며, 합성, 반-합성 또는 재조합 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 인간화된 PDAG 키메라 항체는 인간 피검자에게서 2차 항체 반응이 실질적으로 유발될 수 없기 때문에 인간 피검자에서의 사용에 유리할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서, 형광 표지된 PDAG, PDAG 펩티드 또는 PDAG 항체가 제작될 수 있다. 그런 실시예에서, 피코에리트린(PE), 붉은 형광 염료, 플루오로세인이소티오시아네이트(fluorosceinisothiocyanate: FITC), 녹색 형광 염료와 같은 형광 염료는 활성화되어 PDAG, 자유 설프히드릴(sulfhydryl) 또는 상기 PDAG 펩티드에서의 아미노 또는 카르복실의 펩티드 부분의 N-말단 또는 PDAG 항체의 자유 아미노기에 접합될 수 있다.

그러한 접합체의 제작방법은 예를 들면, PDAG 또는 PDAG 펩티드는 숙신이미딜트랜스-4-(말레이미딜메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyltrans-4-(maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate: LC-SMCC)의 티올 반응성 연장된-사슬 유사체를 부착시키고 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 미반응 LC-SMCC를 유도화된 PDAG 펩티드로부터 분리시켜 펩티드를 활성화시킴으로써 N-말단을 통하여 형광 염료에 접합될 수 있다. 상기 자유 티올에 R-PE 또는 FITC의 피리딜디설파이드 유도체는 상기 R-PE 또는 FITC를 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀(tris-(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP)에서 10 내지 15 분 동안 배양시켜 활성화될 수 있다. 이후, 정제된 LC-SMCC-PDAG 펩티드 유도체는 활성화된 R-PE 또는 FITC와 조합되고 4℃에서 하룻밤 동안 혼합된다. 임의의 남아있는 티올기들을 캡핑하는 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide: NEM)를 첨가하여 중단될 수 있다. R-PE 또는 FITC-PDAG 접합체는 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있으며 동결건조되어 최종 생성물을 수득할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에서, 형광 표지된 PDAG 또는 PDAG 펩티드는 조직 표본들의 분석에 사용될 수 있다. 예를 들면, 형광 표지된 PDAG 또는 PDAG 펩티드는 피검자의 표본과 체외에서 혼합되어 상기 형광 표지된 PDAG 또는 PDAG 펩티드를 포함하는 면역 세포를 검출 및 수량 평가(quantitiate)할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 PDAG 또는 PDAG 펩티드에 대한 형광 표지된 항체는 형광현미경법, ELISA 등과 같은 방법을 이용하여 피검자로부터 얻은 체외 표본에서 PDAG 또는 PDAG 펩티드의 농도를 검출하고 수량 평가할 수 있다. 그러한 분석 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

실시예 1

본 실시예는 본 발명에 있어서 PDAG의 분리 및 구조 분석을 기술한다. PDAG는 7-10 kDa 분자량 컷-오프(cut-off) 투석 카세트(Slide-A-Lyzer, Pierce Biotechnology 사)를 통하여 증류수에 대한 투석 및 진공 증발에 의한 농축 및 투석액의 동결건조에 의하여 응고된 혈액의 혈청 부분으로부터 연구급 양으로 통상적으로 분리될 수 있다.

정제되지 않은 혈청 부분은 크기 배제 크로마토그래피 또는 크기 배제 수지 또는 필터 통과에 의한 여과에 의하여 더 정제되어 염류 및 다른 저 분자량 오염물질을 제거한다. 최종 정제는 유기 용매 추출 및 역상 HPLC에 의하여 수행된다. 이 절차는 정제 이후 충분한 물질을 제공하여 생물학적 활성 연구를 수행하고 생물활성 성분(들)의 화학적 특성화를 개시한다. LC/MS 분석은 상기 PDAG 성분을 2-3 kDa 지질펩티드로서 특성화한다. 총 질량 존재비(abundance)에 기반한 수량 분석에 의하면 PDAG 순도는 HPLC 이후 98%를 초과한다는 것을 나타내고 있다. HPLC/ESI 이중 질량 분석법(tandem mass spectrometry)를 이용하여 펩티드의 아미노산 서열을 확인하고 본 발명에서 상기 PDAG의 지질 부분을 확인할 수 있다. 정제된 비-영장류 PDAG의 대표적인 HPLC 프로파일은 도 1에 도시되어 있다. HPLC 크로마토그래피는 Ultimate 3000 HPLC(Dionex, sunnyvale, CA) 상에서 수행되었다. 칼럼은 Zorbax C8 1x150 ㎜(Agilent, Santa Clara, CA)였다. 물에 용해된 표본 200 ul은 200 ul 루프(loop)에 주사되었다. 구배는 60 분에 걸쳐서 5 내지 60% 용매 A 대 용매 B이고, 이후 5 분 동안 세척하여 90% 용매였다. 50 ul/분의 유량으로 용매 A는 5% 아세토니트릴 + 0.1% TFA였으며 용매 B는 90% 아세토니트릴 + 0.1% TFA였다. 검출은 214 ㎚ 및 280 ㎚에서 수행되었다.

카프린 혈청(2 L)을 추출하여 약 100 ㎍의 정제된 PDAG를 수득하였다. 도 1A는 메탄올:클로로포름 가용 분획(Technical Grade PDAG)의 대표적인 크로마토그램이다. 명목상 10.4 분에서 용출하는 피크는 원조(parent) PDAG인 것으로 결정되었으며 명목상 9.4 분 및 4.8 분 사이에 용출하는 피크들은 원조 PDAG의 가수분해 생성물들이다. 2.9 분에서 용출하는 피크는 주로 올리고당류를 주로 함유하는 것으로 특성화되었다(데이타 미도시). 정제된 PDAG(10.4 분 피크)는 예비 역상 크로마토그래피에 의하여 수거되었으며 용매는 진공에서 제거되었다. 이 결과는 도 1A 및 1B에 도시되어 있다.

실시예 2

이 실시예는 천연 PDAG의 구조적 설명을 기술한다. 정제된 PDAG의 에드만(Edman) 분해 서열 분석으로 인하여 추정된 PDAG 펩티드에 대한 아미노산 서열 (X₁)LYDKGYTSKEQKDCVGI(X₂)과 1883.57 amu의 계산된 분자량을 확인하였다. X₁ 및 X₂는 미확인 유도화된 아미노산들 또는 비-아미노산 보결기들이었다. 액체 크로마토그래피/이중 질량 분석법(LC/MSⁿ)을 활용하여 정제된 PDAG를 분석함으로써 (a) N-말단 및 C-말단 보결기들의 확인 및 (b) 펩티드의 아미노산 서열을 확인하였다. PDAG 원조 피크(10.4 분)의 ESI-MS는 3 개의 주요한 이온 단편들을 밝혀내었다. 가장 많은 존재(단편 A)은 PDAG-트립토판 부가물로서 PDAG와 함께 용출하는 트립토판(m/z 205)인 것으로 결정되었다.

두번째로 가장 많이 존재하는 이온인 단편 B(분자량 1688.8)의 질량 스펙트럼은 2 개의 다전하 이온들을 갖는다. m/z 564.00에서의 이온은 [M+3H]³⁺이며 845.45에서의 이온은 [M+2H]²⁺이다. 상기 m/z 845.5 이온의 MS/MS 생성물 이온 스펙트럼은 acALYDKGYTSKEQKD(m/z 1688.8)의 아미노산 서열을 가졌다. 이 서열은 X₁이 N-아세틸 알라닌(acA)인 에드만 분해 서열 분석으로부터 얻은 최초 13 개 아미노산과 부합한다. 단편 B에 대한 질량 스펙트럼들은 도 2a 및 2b에 제시되어 있다.

PDAG에 할당된 구조에 대한 다른 실험 증거로서, 일련의 MALDI-TOF 질량 분석법 실험들이 수행되었다. PDAG는 트립토판:PDAG 부가물(200:1 추정)로 분리되었기 때문에, PDAG는 첨가된 기질이 있는 경우와 없는 경우로 MALDI-TOF MS에 의하여 분석되었다. 그러나, 손상되지 않은 PDAG 분자에 해당하는 분자 이온은 어떤 것도 관찰되지 않았으며, 전체 PDAG 분자를 설명하는 4 개의 주요한 이온 단편들은 첨가된 기질(트립토판은 기질로서 역할을 하였다) 없이 양성 이온 스펙트럼에서 검출되었다. 높은 질량 단편(m/z 1282.71)은 N-말단 단편 이온[acALYDKGYTSKE]⁺로부터 중성 NH₃의 손실로부터 야기한다. 낮은 질량 단편(m/z 1133.30)은 C-말단 디아실글리세롤("DAG") [DCVGI-(DAG)]⁺를 함유하는 y-이온과 부합한다. 기저 피크(m/z 1208.47)는 내부 z-이온 단편[KEQKDCVGI]W⁺의 트립토판 부가물과 부합한다. 이에 해당하는 y-이온(+15 amu)은 m/z 1223.61에서 관찰된다. m/z 1207.53에서의 y-이온은 C-말단 단편[TSKEQKDCVGI]⁺이다.

트립토판:PDAG 부가물과 디히드록시벤조산(DHB)의 공통-결정화 및 MALDI-TOF 질량 스펙트럼측정법에 의한 재분석은 PDAG의 전체 구조를 설명하는 확장된 일련의 이온 단편들을 보였다(도 3).

혈청 유도 PDAG 생성물은 산성 조건하에서 가수분해에 특히 감수성이 있으며 이는 ESI 또는 MALDI 이온화 조건하에서 분자 이온의 획득에 어려움이 있음을 설명한다고 할 수 있다. 도 1A에서 4.83 분 및 9.36 분 사이에서 용출하는 피크들은 10.42 분에서 용출하는 원조 PDAG 피크의 가수분해 생성물들이다(데이터 미도시). 그러므로, 정제된 PDAG는 약 산성 가수분해인 제자리(in situ) N-말단 술폰화를 거치고 이후 가수분해 생성물을 분석하면 전체 PDAG 구조를 설명하였다. PDAG의 약 산성 가수분해 이후 생성된 N-말단 술폰화 펩티드 단편들을 PSD MALDI-TOF 분석하면 이전에 관찰된 펩티드 단편들과 부합하는 복수개의 y-이온들을 보여주고 PDAG의 전체 구조를 설명하였다(도 4). 따라서, 추정 PDAG 구조인 acALYDKGYTSKEQKDCVGI-DAG는 천연 생성물의 에드만 분해 서열 분석, ESI-MS/MS 서열 분석 및 PSD MALDI-TOF MA 분석들과 부합한다.

PDAG에서 펩티드에 대한 추정 서열이 주어진 가운데, 비-이중화(non-redundant) 서열 데이타베이스는 NCBI BLAST 검색 도구 BLASTP(Altshul, 1997)을 사용하여 상동 서열들에 대하여 검색되었다. PDAG 펩티드는 과도(transient) 수용체 잠재성 채널-관련 단백질 1(TRPC1)에서의 558 내지 574 위치에 있는 아미노산들의 내부 서열과 동일한 서열 상동성을 갖는다. 다른 공지된 단백질들 또는 펩티드들과 현저한 상동성은 주목되지 않았다. 소, 말 및 인간 TRPC1으로부터 557 내지 574 위치에서의 아미노산 서열과 추정 PDAG 펩티드 서열을 비교하면 소 PDAG에서의 9-세린은 프롤린으로 교체되었다는 것을 제외하고는 동일한 아미노산 서열들로 밝혀졌다.

실시예 3

pDAG 펩티드는 AAPPTEC 348 Sigma(Advanced Automated Peptide Protein Technologies, Inc., Louisville, KY) 펩티드 합성기를 사용하여 H-이소류신-2-클로로트리틸(H-Isoleucine-2-Chlorotrityl) 수지상에서 연장된 HBTU 커플링을 갖는 표준 고체상 합성 프로토콜에 의하여 합성되었다. 수지에 접합된 전체 보호된 펩티드 서열 [Ala-Leu-Tyr(But)-Asp(OBut)-Lys(Boc)-Gly-Tyr(But)-Thr(But)-Ser(But)-Lys(Boc)-Glu(OBut)-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Asp(OBut)-Cys(Trt)-Val-Gly-Ile-RESIN]은 디클로로메탄으로 세척한 이후에 회수되었다. 상기 펩티드 접합된 수지는 N,N-디이소프로필에틸아민(20%) 및 N,N-디메틸아세트아미드(70%)에 10% 아세트 무수화물을 첨가하여 펩티드의 N-말단 알라닌에서 아세틸화되었다. 상온에서 2 시간 이후에, 상기 수지는 여과되고 N,N-디메틸아세트아미드 및 디클로로메탄으로 연속적으로 세척된 다음 동결건조되었다. 아세틸화되고 전체 보호된 펩티드는 디클로로메탄에 용해된 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로-2-프로판올의 1:4 용액 20 ㎖를 사용하여 상기 수지로부터 절단되었다. 상온에서 2 시간 이후에, 상기 수지는 여과되고 상기 절단 용액 2 ㎖로 세척되었다. 여과액은 회전 증발기를 사용하여 진공에서 증발되었다. 표본은 질량 스펙트럼측정법에 의하여 분석되어 m/z 3286에서 예상된 질량을 확인하였다(데이타 미도시).

1-스테아로일-2-아라치도노일-sn-글리세롤(Sigma Aldrich)은 디시클로헥실카르보디이드/디메틸아미노피리딘(dicyclohexylcarbodiimide/dimethylaminopyridine: DCC/DMAP) 커플링 반응을 잉요하여 전체 보호된 아세틸화 펩티드의 C-말단 이소류신 카르복실에 접합되었다. 1-스테아로일-2-아라치도노일-sn-글리세롤(5 ㎎)은 2 ㎖의 디클로로메탄에 용해되며 2 ㎖의 디클로로메탄에 용해된 전체 보호된 아세틸화 펩티드 2 당량과 또한 2 ㎖의 디클로메탄에 용해된 DMAP 1 당량과 혼합되었다. 반응은 상온에서 하룻밤 동안 진행되도록 하였다. 반응 혼합물은 진공에서 건조되었으며 보호기들은 8 ㎖의 탈보호 용액(2.5% 1,2-에탄디올, 94% 트리플루오로아세트산, 0.1% 트리이소프로필실란 및 2.5% 물)을 첨가하여 제자리에서 제거되었다. 탈보호 용액의 존재하에 상온에서 2 시간 배양 기간을 거친 후에, 반응 혼합물은 여과되고 여과액은 회전 증발기상에서 진공으로 증발되었다.

정제되지 않은 생성물의 정제는 Jupiter® Proteo(Phenomenex 사, Torrance, CA) 칼럼 및 1 ㎖/분의 유량으로 20 분에 걸쳐서 5%에서 95% 용매 B로부터 형성된 2성분 이동상 구배(용매 A: 물에 용해된 0.1% TFA 및 용매 B: 아세토니트릴에 용해된 0.15 TFA)를 이용한 역상 예비 등급 HPLC에 의하여 수행되었다. 이 조건하에서 pDAG 생성물은 22.9 분에 용출하였다. 정제되지 않은 생성물(63 ㎎)은 4 ㎖의 아세토니트릴 및 2 ㎖의 물에 용해되었고 상기 예비 등급 칼럼으로 옮겨졌다. 22.9 분에 용출하는 피크는 22.5 ㎖의 이동상(95% 아세토니트릴/0.1% TFA)에 채집되었다. 용출액은 진공에서 증발되었으며 pDAG 펩티드의 최종 질량은 HPLC 분석에 의하여 측정된 98.9%의 순도를 갖는 2.5 ㎎(4% 수율)으로 측정되었다.

실시예 4

섬유아세포는 합성 PDAG로 24 시간 동안 자극되었다. RNA는 상기 섬유아세포로부터 추출되었으며 IL-6 전사체는 실시간 PCR에 의하여 측정되었으며 IL-6 단백질은 배지내에서 ELISA에 의하여 측정되었다. PDAG 100 pg/㎖는 섬유아세포를 자극하여 대조군(미처리 세포)와 비교하여 IL-6 mRNA 농도를 증가시켰다, P = 0.001. 마찬가지로 상기 PDAG 처리된 섬유아세포의 배지 내에서 약 2-배 이상의 IL-6 단백질(P=0.0001)이 측정되었다. 이 결과들은 도 5에 제시되어 있다.

실시예 5

mRNA는 100 pg/㎖의 합성 PDAG로 하룻밤 동안 배양된 1차 인간 섬유아세포로부터 추출되었다. NALP3 및 NFκB 전사체가 측정되었다. NALP3 전사체는 1.75 배 증가(P = 0.007)한 것을 보인 반면에, NFκB 전사체는 그러지 않았다(P=0.4). 이 결과들은 도 6에 제시되어 있다.

실시예 6

THP-1 단핵구(5 x 10⁴ 세포/웰)은 24-웰 마이크로플레이트 내에서 10% FBS로 보충된 Hank's 완충 식염수 1에서 배양되었다. 세포들은 2.5 x 10⁴ AR39 Chlamydia pneumoniae(CPn) 박테리아 세포로 감염되어 MOI=1을 나타내었으며, 상기 감염된 세포들은 일일 배지 변화로 감염된 이후 72 시간 동안 유지되었다. 세포들은 감염 전 24 시간 또는 감염 후 24 시간에 PDAG 운반체(DMSO에 용해된 0.01% 트윈-20) 또는 PDAG(25 ng/㎖ 및 50 ng/㎖)중 어느 하나로 처리되었다. 72 시간의 배양 기간 이후에, 세포들은 수확되었으며 Cytofix/Cytoperm(BD Pharmingen)으로 침투되었고 마우스 α-CPn 단일클론성 IgG(클론 61C75)가 첨가되었으며 상기 침투된 세포들은 1 시간 동안 배양되었다. 배양 이후에, 세포들은 세척되었고 FITC 표지된 α-마우스 IgG가 첨가되어 1 시간 동안 배양되었다. 세포들은 다시 수거되어 세척되었다. 감염된 세포들의 수량 평가는 유동 세포분석법에 의하여 측정되었다. 세포들의 생존 능력은 트립판 블루 배제에 의하여 측정되었다. 이 결과들은 도 7에 제시되어 있다.

실시예 7

테트라사이클린(tetracycline) 유도성 HBV-안정 세포주로서 HepDES19 세포들(Guo, 2007)은 페니실린 및 스트렙토마이신(Invitrogen), 10% FBS, 500 ㎍/㎖ G418(Invitrogen) 및 1 ㎍/㎖ 테트라사이클린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)로 보충된 DMEM/F-12 배지 내에서 유지되었다. HepDES19 세포 내에서 HBV 복제를 개시하기 위하여, 테트라사이클린은 상기 배지로부터 뽑아내어 상기 세포는 바이러스 DNA 분석 이전에 4 내지 5 일 동안 배양되었다. 상기 세포들을 pDAG로 처리하기 위하여, 펩티드는 테트라사이클린이 없는 배지에 첨가되었으며 매일 상기 세포 배양액상에 공급되었다. 용매 DMSO의 농도는 매 처리시에 0.01%로 조정되었다.

HBV 코어 DNA는 이전에 기술된 바와 같이(Guo, 2009) pDAG-처리된 HepDE19 세포들로부터 추출되었다. 간략히 말해서, 35 ㎜ 접시 하나로부터 나온 세포들은 용해 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA, 1% NP40 및 2% 수크로스)으로 37℃에서 10 분 동안 용해되었다. 세포 잔사물(cell debris)과 핵들은 원심분리에 의하여 제거되었으며, 상청액은 1.5 M NaCl을 함유하는 35% 폴리에틸렌 글리콜(PEG-8000) 130 ℓ와 혼합되었다. 얼음에서 1 시간 동안 배양한 이후에, 바이러스 뉴클레오캡시드는 4℃에서 5 분 동안 10,000 rpm으로 원심분리에 의하여 펠릿된 이후에 200 ㎕의 소화 완충액[0.5 ㎎/㎖ 프로나제(Calbiochem), 0.5% SDS, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 8.0 및 10 mM EDTA] 내에서 37℃로 1 시간 동안 소화시켰다. 소화 혼합물은 페놀로 2 회 추출되었고, DNA는 에탄올로 침전되었으며 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 용해시켰다. DNA 표본은 전기영동에 의하여 1.5% 아가로스젤로 용해시켰다. 이후 젤은 상온에서 10 분 동안 0.2 N HCl 내에서 탈퓨린반응을 거치게 하고, 이후 0.5 M NaOH 및 1.5 M NaCl을 함유하는 용액 내에서 1 시간 동안 변성시키고 1 M Tris-HCl(pH 7.4) 및 1.5 M NaCl을 함유하는 완충액에서 1 시간 동안 중화 시켰다. 이후 DNA는 20X SSC 완충액 내에서 Hybond-XL 막(GE Healthcare) 상으로 블롯팅되었다. 막들은 α-³²P-UTP(800Ci/mmol, Perkin Elmer)-표지된 HBV 마이너스(minus) 가닥-특이적 전장 리보프로브(riboprobe)로 탐침되었다. 5 ㎖의 EKONO 혼성화 완충액(Genotech)에서 65℃로 1 시간 예비-혼성화하고 65℃에서 하룻밤 동안 혼성화한 이후에 65℃에서 0.1X SSC 및 0.1% SDS로 1 시간 동안 세척하여 혼성화가 수행되었다. 상기 막은 포스포르이미저 스크린에 노출되었으며 혼성화 신호는 QuantityOne 소프트웨어(Bio-Rad)를 사용하여 밝혀지고 수량 평가되었다.

실시예 8

뉴질랜드 화이트 토끼 암컷에게 천연 PDAG와 함께 FCA를 접종하고(n=3), 천연 PDAG이 없이 FCA로 접종하였다(n=3). 접종하기 전 1 일에(배경) 혈액 표본들을 채혈하였으며 접종 후 3, 5, 7, 10, 12, 14 및 17 일에 다시 혈액 표본들을 채혈하였다. 혈청들은 M. tuberculosis IgM 생성 여부를 위해 ELISA에 의하여 3 벌씩 분석되었다. 접종 후 매일에 대한 항체 역가는 당해 일 -1 역가를 이용하여 차감된 배경이었다. 접종후 5일까지, FCA+PDAG로 접종된 토끼들에서의 IgM 역가는 FCA만을 받은 토끼들에서의 역가보다 현저히 높았다(P=0.0004). 이 결과들은 도 9에 도시되어 있다.

실시예 9

스위스 웹스터 마우스들은 Salmonella typhimurium을 마우스당 5 x 10³ cfu의 치사량으로 면역성 테스트를 받았다. 15 마리의 마우스들이 상기 치사 접종전 24 시간에 5 ㎍/㎖ PDAG로 처리되었다. 마우스들은 유지되고 10 일 동안 매일 모니터링되었다. 사망률은 대조군에서는 4 일째 되는 날에 관찰되었지만, PDAG 처리군에서는 7 일까지 관찰되지 않았다. 10 일까지 PDAG 처리군의 12 마리 마우스들은 생존을 유지한 반면에, 미처리군에서는 모두 사망하였다, P < 0.0001. 이 결과들은 도 10에 도시되어 있다.

본 발명은 특이적인 실시예를 참조하여 기술되었지만, 당업자는 이로부터 예를 들면, 본 명세서에 기술된 특정한 실험 조건에서 다양한 변경을 할 수 있다는 것을 알 것이며, 본 발명에 따른 개시물들은 본 발명의 더 광범위한 범위 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 발명의 일부 바람직한 실시예들과 목적 및 장점만을 보여준다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명에 따른 이러한 발견들은 당업자에 의하여 상상할 수 있는 화합물의 많은 다른 잠재적인 응용을 예시한 것뿐이며, 따라서 본 발명을 한정하는 것은 결코 아니라는 것을 알아야 한다. 그러므로, 본 발명의 다른 목적들과 장점들은 청구항과 함께 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다.

하기 서열목록은 본원

<110> THERIMUNEX PHARMACEUTICALS, INC. <120> PEPTIDYL DIACYLGLYCERIDES <130> SPI201011-0021 <150> PCT/US2009/041595 <151> 2009-04-24 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 1 Xaa Leu Tyr Asp Lys Gly Tyr Thr Ser Lys Glu Gln Lys Asp Cys Val 1 5 10 15 Gly Ile Xaa <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 2 Xaa Leu Tyr Asp Lys Gly Tyr Thr Pro Lys Glu Gln Lys Asp Cys Val 1 5 10 15 Gly Ile Xaa <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATOIN, <400> 3 Ala Leu Tyr Asp Lys Gly Tyr Thr Ser Lys Glu Gln Lys Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATOIN, <400> 4 Ala Leu Tyr Asp Lys Gly Tyr Thr Ser Lys Glu 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 5 Lys Glu Gln Lys Asp Cys Val Gly Ile Trp 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 6 Thr Ser Lys Glu Gln Lys Asp Cys Val Gly Ile 1 5 10 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> ACETYLATOIN, <400> 7 Ala Leu Tyr Asp Lys Gly Tyr Thr Ser Lys Glu Gln Lys Asp Cys Val 1 5 10 15 Gly Ile

Claims (35)

1. XLYDKGYTSKEQKDCVGIX 또는 XLYDKGYTPKEQKDCVGIX로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 포함하는 화합물.
2. 제 1 항의 상기 펩티드의 역위들, 모방체들, 합성 균등물들 및 펩티드 유사체들을 포함하는 화합물.
3. 제 1 항에 있어서,
   X는 자연발생적 아미노산, 부재(absent), 유도화된 아미노산, 비-아미노산 보결기(prosthetic group) 및 그 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
4. 제 1 항에 있어서,
   N-말단 X는 Q인 것을 특징으로 하는 화합물.
5. 제 1 항에 있어서,
   N-말단 X는 N-아세틸 아민(N-acetyl amine)인 것을 특징으로 하는 화합물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 화합물은 상기 펩티드에 접합된 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
7. 제 5 항에 있어서,
   상기 화합물은 일반식(I)을 가지며:
   

   

   (I)
   여기서, X₁, X₂ 및 X₃는 수소, C₂ 내지 C₂₅ 지방산 및 그 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, X₁, X₂ 및 X₃중 적어도 하나는 펩티드인 것을 특징으로 하는 화합물.
8. 제 1 항의 상기 화합물의 유효 용량(effective dose)을 포함하는 약학적 조성물.
9. 제 8 항에 있어서,
   약학적으로 허용가능한 완충제 또는 생리학적으로 허용가능한 담체를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 완충제는 염 내의 아세트산, 염 내의 시트르산, 염 내의 붕산, 염 내의 인산 및 그 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
11. 제 9 항에 있어서,
    상기 담체 제형은 구강, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 볼 또는 눈 경로, 직장, 비경구, 전신내, 질내, 국소, 경구 또는 비강 스프레이로서 경구 및 그 조합들에 적당한 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
12. 제 8 항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 알약, 정제, 로진지(lozenge), 당의정, 과립, 캡슐, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 수용액, 알코올 용액, 유성 용액, 시럽, 에멀젼, 현탁액, 방향제(pastille), 좌약, 주사용 용액, 연고, 팅크제(tincture), 크림, 로션, 분말, 스프레이, 경피 치료 시스템, 비강 스프레이, 에어로졸 혼합물, 마이크로캡슐, 임플란트 막대(rod) 또는 반창고(plaster)의 형태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
13. 제 11 항에 있어서,
    상기 비경구 제형은 습윤제, 현탁화제, 희석제, 용매 또는 그 조합들을 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
14. 제 13 항에 있어서,
    상기 희석제는 1,3-부탄디올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
15. 제 13 항에 있어서,
    상기 용매는 물, 링거액, 등장 염화나트륨 용액 및 멸균 고정유로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
16. 제 15 항에 있어서,
    상기 고정유는 무자극성(bland) 고정유인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
17. 제 12 항에 있어서,
    상기 주사용 용액은 지방산류를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
18. 제 8 항에 있어서,
    보존제를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
19. 제 18 항에 있어서,
    상기 보존제는 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤류, 티메로살 및 그 조합들을 함유하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
20. 제 11 항에 있어서,
    상기 담체는 상기 비강 스프레이 내에서 약한 식염수 용액을 제공하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
21. 제 20 항에 있어서,
    상기 식염수 용액은 약 0.1% 내지 2.0%인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
22. 제 20 항에 있어서,
    상기 식염수 용액은 약 0.65%인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
23. 제 11 항에 있어서,
    상기 스프레이 제형은 상기 화합물의 효과적인 분산을 위한 가루로 만든(ground) 입자 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
24. 제 23 항에 있어서,
    상기 입자 크기는 약 0.1 내지 20 마이크론인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
25. 제 23 항에 있어서,
    상기 입자 크기는 약 0.2 내지 10 마이크론인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
26. 제 23 항에 있어서,
    상기 입자 크기는 약 0.2 내지 5 마이크론인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
27. 제 8 항에 있어서,
    계면 활성제, 비타민류, 비타민 유도체, 항히스타민류, 습윤제, 보존제, 보습제, 유화제, 취기제(odorant) 및 그 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 첨가제들을 함유하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
28. a) 제 8 항의 약학적 조성물; 및
    b) 시간-방출(time-released), 지연 방출(delayed release), 지속 방출(sustained release) 및 그 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방출 수단을 함유하는 약학적 전달 시스템.
29. a) 상기 화합물을 획득하는 단계; 및
    b) 상기 화합물을 담체와 균일하게 혼합하는 단계를 포함하되,
    상기 담체는 하나 이상의 보조 성분들을 함유하며 상기 담체는 액체 또는 고체인 것을 특징으로 하는 제 8 항의 약학적 조성물의 제조방법.
30. 제 29 항에 있어서,
    상기 혼합하는 단계는 상기 화합물을 4% 락톤 용액에 분산시켜 보조되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 8 항의 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 항원성 펩티드의 면역원성의 향상 방법.
32. a) 탈-보호(de-protection) 단계를 포함하지 않는, 제 1 항의 화합물을 고체상 방법으로 합성하는 단계;
    b) C-말단 카르복실산을 활성화하는 단계;
    c) DAG 및 촉매제로 배양하는 단계로서, 상기 배양으로 인하여 PDAG를 생성하는 단계; 및
    d) 펩티드 측쇄 보호기들을 시약 K로 절단하는 단계를 포함하는 PDAG의 합성방법.
33. 제 32 항에 있어서,
    상기 활성화 단계는 디시클로헥실카르보디이미드를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 32 항에 있어서,
    상기 촉매제는 디메틸아미노피리딘인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 32 항에 있어서,
    PDAG는 크로마토그래피에 의하여 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.

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