JPH04504730A

JPH04504730A - プロテイナーゼ阻害剤およびその使用法

Info

Publication number: JPH04504730A
Application number: JP91502777A
Authority: JP
Inventors: ブロードウェイ、ロクサン・エム
Original assignee: コーネル・リサーチ・ファウンデーション・インコーポレイテッド
Priority date: 1989-12-11
Filing date: 1990-12-11
Publication date: 1992-08-20
Also published as: WO1991009060A1; EP0457898A1; EP0457898A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ブロテイナーセ阻害剤およびその使用法ニューヨーク州のキャベツ栽培家にとっての主要な害虫である草食性昆虫は、フレアビートルｇＩ（フィロトレタ・クルシフエラエ）、輸入キャベジワーム（ビニリス・ラバ二）およびキャベジルーバー（トリコブルシア・二）である。これらの害虫の中で、輸入キャベジワームとキャベジルーパーは成熟中期、すなわち、植物が６−８葉成長期に達し栽培者がキャベツ作物の全損失を最も受け易い時に、植物を攻撃する。この成熟期に植物が死滅すると、成育期中に２回目の移植を行なう機会はほとんどない。それ故、農業的および環境的に許容され、これらの害虫を駆除する手段を見出すことは重要である。

現在までの文献は、広範囲の植物にみられる蛋白またはポリペプチドである植物性プロテイナーゼ阻害剤が草食性昆虫からのかなりの保護を植物にもたらしているという仮説を支持する。これまで最もよく研究されているプロテイナーゼ阻害剤は、動物に広くみられる消化酵素であるが植物にはみられないセリンプロテイカーゼ類（例えばトリプシン、キモトリプシン）を阻害するものである。植物はセリンプロテイナーゼを含まないので、植物中にセリンプロテイナーゼが存在することは、これらが草食性昆虫に対する防御手段として作用していることを示唆する。

植物におけるセリンプロテイナーゼ阻害剤の保護作用を示唆する研究は、（１）実験室飼育害虫の人工餌に対する植物性プロテイナーゼ阻害剤の混入、（２）プロテイナーゼ阻害活性をもつかまたはもたない植物組織を用いた給餌実験および（３）プロテイナーゼ阻害剤の遺伝子で形質転換した植物の使用に基づく実験から開始された。

特異的プロテイナーゼ阻害剤の強さは、（１）標的生物における感受性プロテイナーゼ、および（２）他の食餌性因子（すなわち蛋白の性質、ポリフェニルオキシダーゼ活性）の存在に応じて異なる。

特定のプロテイナーゼ蛋白の感受性は、（１）そのプロテイナーゼ活性の型（例えばトリプシン、キモトリプシン、カルボキシペプチダーゼ）および（２）活性部位（酵素とその阻害剤間の相互作用部位）の構造上の配置によって異なる。阻害剤と酵素間の相互作用が強いほど、阻害剤は効果が大きい。

したがって、ブロティナーゼ阻害剤は一般的に害虫の攻撃に対する植物の防御に寄与し得るが、個々の植物種の特異的阻害剤の効果は、（１）その植物性プロテイナーゼ阻害剤の特徴的な構造、および（２）標的生物中のプロテイナーゼの感受性によって変る。各植物種は、特徴的な構造のプロテイナーゼ阻害剤を産生ずるようであり、また１つの植物型が産生ずるプロテイナーゼ阻害剤はその植物型を食害する害虫に対して保護作用を有し得るが別の植物型を食害する草食性害虫に対してはほとんどまたは全く効果をもたないようである。

最近、本発明者は、他の多くのあぶらな科栽培植物に較べてキャベツは顕著に高レベルのトリプシン阻害活性をもつこと［野生および栽培あぶらな植物におけるトリプシン阻害活性。フィトケミストリー２８巻７５５頁（１９８９年）〕および幼虫期のトリコブルシア・二およびビニリス・ラバ二の両者は蛋白の消化にトリプシンおよびキモトリプシンを利用すること「幼虫期のトリコブルシア・二およびビニリス・ラバ二における腸内蛋白溶解活性の確認と生態学的関係。ジャーナル・オブ・ケミカル・エコロジー１５巻２１０１頁（１９８９年）］を報告した。これらの知見に基づく本発明の最初の科学的方向づけは、トリコブルシア・二およびビニリス・ラバ二に対してキャベツが身にまとうプロテイナーゼ阻害剤を分離し、精製し、確認し、その効果を測定することであった。

以下に示す記載および実施例は本発明をさらに完全に理解させるものである。これらの実施例はいかなる意味でも本発明の限定を意図し提供するものではなく、そのような理解は不適当である。

実施例１キャベツ栽培変種スーパーパック（商標）の種子を２ガロンプラスチツクポツトに入れたコーネルミックス（商標）に播いた。実生を間引きして１ポツトあたり１本にし、２８℃、ｌｋｗ金属ハライドランプの温室条件で育成した。植物に毎日かん水し、週１回水溶性肥料（１６−３２−１６）混合物を施肥した。

２種の異なる全植物生物試験を実施した。（１）各植物を大形のかごに入れ、トリコブルシア・二およびビニリス・ラバ二の幼虫を全植物上に自由に動きまわらせた。（２）幼虫を直径２インチのかご内の特定の葉内に拘束し、かご内の葉が消費されると動かした。

冬型の生物試験において、若い植物（１０−１２枚の真葉）と成熟植物（９−１１枚の外葉をもち少なくとも直径３インチの植物）を使用した。さらに、幼虫害なしの対照植物を処理植物と同一条件に置き、試験終了時化学分析した。

第１の生物試験では、昆虫種あたり２本の成熟植物の各々にトリコブルシア・二の卵４０個またはビニリス・ラバ二の卵１００個を適用した。ビニリス・ラバ二の卵を植物上に多く置いたのは、おそらく群生の影響のためと思われる実験中のビニリス・ラバ二幼虫の損失が多いことを補うためである。昆虫が隣の植物へ移動するのを防ぐため、各植物を個々に昆虫防護かごに入れた。１つの型の植物体（例えば若い植物の若い葉の組織）が実質的に消費されたとき全試験を終了した。全幼虫を秤量し、植物をトリプシン阻害活性、キモトリプシン阻害活性、総蛋白および総ゲルコシル−トについて化学分析した。

幼虫を植物の特定の葉に拘束する実験の場合、ビニリス・ラバ二の卵５０個を小さなかごの内側に置き（幼虫回収１Ｏ−２０）、成長するにしたがって幼虫をかごあたり３−５匹に分けた。トリコブルシア・二の卵３０個を小さなかご内に入れ、幼虫が成長するとかごあたり３−５匹に分けた。かごを開いた葉（葉の数３ −５）の上に、各若い植物上の最も若い開いた葉を１番とし以下の番号を次の古い葉につけた番号に基づいて置いた。各成熟植物の場合、１つのかごを１枚の若い開いた葉（葉の番号２−４）上に置き、また１つのかごを成熟葉（葉の番号８ −１０）上に置いた。１つの型の植物体（例えば若い植物上の若い植物組織）が実質的に消費されたとき全試験を終了した。全幼虫を秤量し、植物をトリプシン阻害活性、キモトリプシン阻害活性、総蛋白および総ゲルコシル−トについて化学分析した。

総植物蛋白の生物試験については、３種の異なるキャベツ植物体すなわち（１）成熟植物からの若い葉（葉の番号１−４）、（２）成熟植物の葉からの成熟した葉または（３）若い植物の葉から総蛋白フラクションを分離した。植物体（７００ｇ）を０．　ＯＬＭ＜えん酸ナトリウム、１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ４，５の緩衝液５００ｍ１中でホモジナイズした。上溝をとり、ホモジネートをチーズクロス２枚を通してプレスし、液体を氷上に集めた。葉の組織を緩衝液５００ｍ１中で２回目のホモジナイズに付し、チーズクロスに通し、集めた液体を最初の上清と合わせて保存した。液体を４℃、４２００ｘｇで１５分間遠心した。上清を集め、硫酸アンモニウムを７０％飽和まで加えた。溶液を４°Ｃで一夜保存し、４ ℃、４２００Ｘｇで１５分間遠心した。ベレットを少量の蒸留水に再懸濁し、ついで蒸留水に対して透析（１２，０００−１４，ＯＯＯＭＷＣ○）した。

透析物を４℃、４２００Ｘｇで１５分間遠心し、上清を凍結乾燥した。透析乾燥粉末をトリプシン阻害活性、キモトリプシン阻害活性および総蛋白につき化学分析した。分析後に残った粉末を幼虫の成長および発達に対するこの植物体総蛋白の効果の測定のため麦芽ベース食餌６００ｍ１の製造に用いた。この実験に用いた食餌は、カゼイン濃度を３．２％から１．６％（重量／容量）に減らした以外はビニリス・ラバ二幼虫育成マスに用いたのと同じものである。両昆虫種に対する生物試験は２種の処理、各処理あたり３カツプ、１カツプあたり卵３０個を含むものであった。再生物試験は２連で行った。

幼虫は、対照が絡合に達した時点まで新生時から自由に食餌を与え、上記時点で全幼虫を秤量した。

化学分析については、キャベツ植物体のトリプシン阻害活性の存否の測定に標準的分光光学的測定法を用いた。うしトリプシン（０゜１ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭＨＣ１）を植物体を乳鉢と乳棒ですりつぶし、組織を遠心し、上清をとり、上清を１ｍＭＨｃｌで０．１倍に希釈して得たキャベツ葉ジュースに混合した。得られた物質を室温で１０分間インキュベートした。ついで、混合物１００μｌを１０゜４Ｍｐ−トルエンスルホニル−し−アルギニンメチルエステル含有緩衝液（０，０５Ｍ　トリス、ｐＨ８，０）２．９ｍｌに加えた。トリプシン活性は、非阻害トリプシン活性の測定にトリプシン５０μｍアリコートを使用し、２４７％ｍで３分間モニターした。

キモトリプシン阻害活性は、上記のように製造した希釈葉ジュースをＴＬＣＫ− 処理うしキモトリプシン（０，１ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭＭＣＩ）と混合（１：１容量／容量）し室温で１０分間置くことにより測定した。ついで混合物１００μｍを基質（０，，０５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８，０と１・１混合した５０％ＭｅＯＨ中１ｍＭベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステル）２．９ｍｌに加え、２５６％ｍで３分間分光光度計でモニターした。キモトリプシン５０μｍアリコートを非阻害キモトリプシン活性の測定に使用した。

キャベツ植物体中のゲルコシル−トの定量には、累を乳鉢と乳棒ですりつぶし、液体を１ｍｌのＤＥＡＥセファデックスＡ２５カラムにかけた。カラムを蒸留水ついで０．５ｍ　１０．０２Ｍピリジン／酢酸緩衝液で２回洗浄した。カラムにミロシナーゼ（２５ｍｇ／ｍ１ピリジン緩衝液２５０μ］）を適用し、室温で２時間インキュベートした。ついでカラムを蒸留水で溶出し、溶離液１．２５ｍ　１を集めた。溶離２５０μｌアリコート３つを、シリグリンを標準としてグルコースについて検定した。

総蛋白濃度については、標準としてキャベツ植物からの精製蛋白を用いビシンコニン酸試薬を使用して測定した。

これらの実験手順にしたがって、幼虫かご内の植物上でふ化した幼虫は摂食部位を選択するに任せた。トリコブルシア・二の幼虫は若い植物および成熟植物の何れでも最も古い葉の下側を摂食し、最も古い葉が消費されると完全に開いた成熟葉へ向がって植物をはい上がった。ビニリス・ラバエが好む摂食部位は植物の最も若い葉であった。それは、植物の頂端分裂組織をまず消費し、ついで最も若い葉の基部の非維管組織を食害しながら下方へ移動した。それは一般に、若い食物でも成熟植物でも完全に開いたまたは最も古い葉を摂取しなかった。

トリコブルシア・二の幼虫に摂食部位を自由に選択させると（すなわち植物の最も古い葉を摂食する）、若い植物または成熟した植物を摂食するトリコブルシア・二の幼虫間に有意の差が認められなかった（ｐ＝０．４６０、ｎ＝２２０）。

葉の組織の化学分析は、若い植物と成熟した植物の最も古い葉においてトリプシン阻害活性（ｐ＝０．３８３、ｎ＝３５）　、キモトリプシン阻害活性（ｐ＝０゜３８９、ｎ＝３５）、総蛋白（ｐ＝０．５６３、ｎ＝３５）または総ゲルコシル−ト（ｐ＞０．０５、ｎ＝３５）に有意の差がないことを示した。植物の化学的組成を比較すると、成熟した植物上の若い葉におけるトリプシン阻害活性とキモトリプシン阻害活性は若い植物のそれより有意に高いことがわかった（ｐ＜０．００１、ｎ＝３５゜トリプシンおよびキモトリプシン両者とも）。

成熟した植物上の最も古い葉上に摂食を制限したトリコブルシア・二の幼虫は、若い植物の若い葉上で摂食する幼虫より有意に大きかった（ｐ＜０．００１、ｎ＝４５）。成熟した植物上の若い葉で摂食するように制限した幼虫は、摂食を試みたが、第２令で幼虫の死亡率が１００％となった。植物の葉の化学分析を調べると、幼虫の成長とトリプシンまたはキモトリプシン阻害活性レベルとの間に明らかな逆の相関関係が認められた。トリプシンおよびキモトリプシン阻害活性は、成熟植物上の若い葉で有意に最も高＜　（ｐ＜０．００１、ｎ＝３５）、若い植物の若い葉で中位レベルであり（ｐ　＜　０゜００１、ｎ＝３５）　、成熟植物上の古い葉で有意に最低レベルであった（ｐ＜０．００１、ｎ＝３５゜）実施例１で得た知見を基に、トリコブルシア・二およびビニリス・ラバ二の幼虫の成長および発達に対するキャベツプロテイナーゼ阻害剤の作用を以下の実施例にしたがってさらに詳細に試験した。

実施例２プロテイナーゼ阻害剤は、ｐＨ４，５にて、０．０１ク工ン酸ナトリウムＩＭ塩化カリウム緩衝液中で、葉をホモジナイズし、ホモジナイズを４２００ｘｇ、１０分間４℃にて遠心分離し、上清を集めて、キャベツから抽出した。上清は１０分間７０℃にてインキュベートし、氷上で冷却し、６０００ｘｇ、６０分間遠心分離した。上清をｐＨ８，０に調整し、硫酸アンモニウムを７０％飽和濃度になるまで添加し、得られた溶液を一夜４℃に保った。ついで、溶液を６０００ｘｇにて遠心分離し、ペレットを蒸留水に懸濁させ、水に対して透析しくＭＷＣ○１２０００−１４０００）　、塩を除去した。透析物を６０００ｘｇ、２０分間遠心分離し、上清を凍結乾燥し、「手積製プロテイナーゼ阻害剤」と名付けた。

手積製プロテイナーゼ阻害剤を２段階工程で精製した。最初に、手積製物質１’ ００ｍｇをあらかじめ平衡化したセファデックス−６７５カラム（２，２ｘ５０ｃｍ）にかけ、０．０５Ｍ　）リスｐ　Ｈ９。

Ｏ緩衝液で溶出し、２８０ｎｍでモニターした。トリプシン阻害活性を有するプロティン留分を集め、蒸留水に対して透析した、凍結乾燥し、「セファデックス精製ブロティナーゼ阻害剤」と名付けた。

精製工程の第２段階はトリプシン−結合ブロモシアン活性化セファローズ４Ｂアフイニテイークロマトグラフイーを含む。プロテイナーゼ阻害剤をｐＨ８，１の０．０１Ｍトリス０．１Ｍ塩化カルシウム緩衝液中でアフィニティーカラム（１，５ｘ３３ｃｍ）にかけた。

カラムを光学密度が０　（２８０ｎｍにて）になるまで緩衝液で洗浄した。ついでトリプシン阻害剤をｐＨ３，０にて８Ｍ尿素で溶出させ、蒸留水に対して透析し、凍結乾燥し、「アフィニティー−精製プロテイナーゼ阻害剤」と名付けた。

上記で調製したプロテイナーゼ阻害剤の純度を測定するために、各調製物のサンプル（４ｍｇ／ｍｌ）を４％スタックの不連続不変性１２．５％ポリアクリルアミドゲルにかけた。電気泳動の後、ゲルを２０％ＭｅＯＨ，３０％酢酸中０．１％クーマシーブリリアントブルーＲで染色し、３０％ＭｅＯＨ，１０％酢酸で脱色した。

サンプル調製物中のトリプシンおよびキモトリプシン阻害活性の存在は実施例１に記載の方法をわずかに変えた方法を用いて測定した。

キャベツ抽出物および精製留分中のトリプシン阻害活性の存在は雄牛トリプシン（０，１ｍｇ／ｍＬ　１ｍＭＨＣ１）と植物抽出物（２ｍｇ／ｍｌ、１　ｍＭＨＣｌ　）の１　：　１　（’／、）を混合し、得られた混合物を室温で１０分間インキュベートし、ついで緩衝液（０゜０５Ｍトリス、ｐＨ８，０，１，０４Ｍｐ−トルエンスルホニル−し−アルギニン含有）２．９ｍｌを混合物１００μｍに添加した。トリプシン活性は３分間、２４７ｎｍでモニターした。トリプシン５０μｍ部をトリプシン非阻害活性の測定に用いた。

キモトリプシン阻害活性は試験液（２ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭＨＣ］）を１０分間、室温で混合（１：１”／、）を混合して測定した。ついで、混合物１００μｍを基質（５０％ＭｅＯＨ中１ｍＭベンゾイル−し−トリプシンエチルエステルをｐＨ９，０にて０．０５Ｍ）リスと１・１で混合した）２．９ｍｌに添加し、光学光度計で３０分間、２５６ｎｍにてモニターした。キモトリプシン５０μｍ部を用いて非阻害活性を測定した。

幼虫の生長および発育に対するキャベツプロテイナーゼ阻害剤の作用を測定するために、幼虫を植物性プロテイナーゼ阻害剤を配合した小麦胚芽ベースの食餌で飼養した。基本食餌は実施例１で用いたものと同じである。初めの実験は手積製プロテイナーゼ阻害剤を用いて行った。大豆トリプシン阻害剤を比較のための基準に用いた。

各バイオアッセイは、５処理群、３カツプ／処置、３０卵／カツプからなる。手積製プロテイナーゼによる結果が、調製物中の阻害剤によるものであり、不純物によるものでないことを確認するために、バイオアッセイをセファデックス精製プロテイナーゼ阻害剤を用いて繰り返した。幼虫のトリコブルシア・二およびビニリス・ラバエに対するキャベツトリプシン阻害剤の毒性を最終的な確認のために、アフィニティ精製トリプシン阻害剤を用いるパイオアッセインも行った。すべての試験につき、幼虫は新生虫から同じ食餌で始め、対照が最終的齢に到達するまでこの食餌で飼養した。ついで幼虫の体重を測定した。さなぎ化率および成虫化は各食餌毎に体重測定した幼虫の総数を基礎とした。

人口食餌中に異なるプロテイナーゼ阻害剤を配合した後、大豆トリプシン阻害剤は、食餌中０．５％（７，）の濃度でもトリコブルシア・二（ｐ＝０．２２５、ｎ＝８２５）またはビニリス・ラバエ（ｐ＝０．２０６、ｎ＝９９１）の幼虫の生長に顕著な効果を示さなかった。これは食餌源としての寄生主植物を利用する幼虫種に対して寄生生植物自身が防衛するに必要な、トリプシンおよびキモトリプシン阻害に特異的なプロテイナーゼ阻害剤自体を産生ずる各植物種の適応を示すものである。

しかしながら、トリコブルシア・二およびビニリス・ラバエの幼虫の生長は手積製（トリコブルシア・二につき、ｐ＜０．００１、ｎ＝１２５２　；ビニリス・ラバエにつき、ｐ＜０．００１、ｎ＝１５５７）；セファデックス精製（トリコブルシア・二につき、ｐく０、００１、ｎ＝２６４：ビエリス−ラバ二ニつき、ｐ＜０．００１、ｎ＝２７０）；アフィニティ精製プロテイナーゼ阻害ファクターの食餌への補足により著しく減少した。さらにプロティナーゼ阻害剤の食餌濃度は幼虫の成長の予報になる。

幼虫のさなぎ化の相対比率は食餌のキャベツ阻害剤の存在により著しく影響されることが判明した。さらに、プロティナーゼ阻害剤含有食餌を摂取している幼虫にもさなぎ化が普通に起こることも判明した。プロテイナーゼ阻害剤の食餌中の濃度はトリコブルシア・二およびビニリス・ラバエのさなぎ化率の予報としても作用しつる。

多くの植物性プロテイナーゼ阻害剤が昆虫の成長および発育を減じることは示されて来たが、実施例１および２からの結果の大きな特徴は、幼虫の成長および発育を顕著に減じるに必要な食餌中のキャベツプロテイナーゼ阻害剤の濃度である。キャベツプロテイナーゼ阻害剤に関して、０．１％食餌濃度では、成長を６６％阻害し、さなぎ化を９３％、成長化を６０％阻害する。すなわち、これらのプロテイナーゼ阻害剤は、幼害虫の成長および発育に著しく有害な作用を有し、商品化し得る殺虫剤お、よび殺幼虫剤として十分利用可能なものとする。

しかしながら、プロテイナーゼ阻害剤は草食性昆虫による攻撃に対する植物の防衛としての役目を果すものと考えられているから、特異的プロテイナーゼ阻害剤の詳細な性質を特異的攻撃有機体に対する作用を調査しなければならない。防衛剤としてのプロテイナーゼ阻害剤の作用は直接、その安定性（ｐＨおよび温度）、特異性、結合定数および濃度にに関係する。このような情報は、さや、ソラナム（ｓｏｌａｎｕｍ）　、および豆からのプロテイナーゼ阻害剤につき、報告されている。

しかしながら、本発明のなされる前に、キャベツからのプロテイナーゼの化学的構造および生物学的活性に関しては知られていなかった。従って、下記の実施例は、実施例１および２で分離され、試験されたプロティン阻害剤の化学的構造および特徴を知るという特定の目的をもって行われたものである。

実施例３プロテイナーセ阻害剤は、ｐＨ４，５にて０．０１Ｍクエン酸ナトリウム、ＩＭＫＣＩ緩衡液９緩衝ｍ１中、新鮮葉５００グラムをホモジナイズして抽出した。

ホモジナイズを二重層チーズクロスにかけて絞り、液を４２００ｘｇ、１０分間４℃にて遠心分離し、上清を１０分間７０℃にて遠心分離し、ついで、氷上で２０分間冷却し、６０００ｘｇにて６０分間遠心分離した。上清をＮａＯＨにてｐＨ８，０に調整し、蛋白質を硫酸アンモニウム（７０％飽和液）で４℃にて一夜沈殿させた。サンプルは６０００ｘｇにて２０分間遠心分離し、ペレットを蒸留水（ｄ　ｗａｔｅｒ）中に懸濁させ、蒸留水に対して透析しくＭＷＣＯ１２０００−１４０００）Ｌ、［ｔ［去した。

ついで、この透析物を凍結乾燥し、「手積製プロテイナーゼ阻害剤」と名付けた。

この手積製プロテイナーゼ阻害剤をカラムクロマトグラフィーにより精製した。

阻害剤のサンプル２００ｍｇｆｅＤＥＡＥ−セファデックス層を有する陰イオン交換４．５Ｘ９ｃｍカラにかけ、カラムの１０倍８の０．０５Ｍ　トリスｐＨ９，０緩衝液で（２８０ｎｍの光学密度がゼロになるまで）洗浄した。これにより、サンプルからクロロフィル成分の大部分を除いた。ついで、９ｍｌのフラクションを集め、プロテイナーゼ阻害剤成分を０．２Ｍ　トリス、ｐＨ８，５緩衡液にて溶出した（別の蛋白のピークが０．５Ｍｈリス、ｐＨ７，８緩衝液で溶出したが、プロテイナーゼ阻害活性は示さなかった）。カラムからの蛋白阻害活性留分はトリプシン結合ブロムシアン活性化セファローズ４Ｂのアフィニティーカラムにに６℃にてかけた。カラムを１０倍カラム容の０．０１Ｍトリス０．１塩化カルシウムｐＨ８，１緩衝液で（０，Ｄ、が３００−５００ｍｌで平衡化になるまで）。プロテイナーゼ阻害剤を８Ｍ尿素にて、ｐＨ３，０で（０，Ｄ、が＜１００ｍ１になるまで）溶出させ、全部の蛋白ピーク（２８０ｎｍ）を集めた。蛋白ピーク（５０−６０ｍｌ）を蒸留水（１６−２０リツトル）に対して一夜透析し、２ｍｌに濃縮し、トリプシンおよびキモトリプシン活性につき分析した。

プロテイナーゼ阻害活性の熱安定性を手積製プロテイナーゼ阻害剤溶液（２ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭＨＣＩ）の１部を、特定時間ニラき所定の温度でインキュベートして検討した。ついで各溶液を、雄牛トリプシンまたはアルファキモトリプシン（０，１ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭＨｃ］）と（１・１°／、）混合し、室温で１０分間インキュベートし、酵素活性を調べた。

アフィニティー精製プロテイナーゼ阻害剤の純度を測定するために、濃縮液７５ μｍを、４％スタックの垂直不連続不変性１２．５％ポリアクリルアミドゲルに（０，０２５Ｍ　ｌ−リス０．１９２ＭグリシンｐＨ８，３をため付き緩衝液として用いて）かけた。電気泳動後、ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ（２０％ＭｅＯＨ，３０％酢酸１％クーマシー）で染色し、３０％Ｍ　ｅ　Ｏ８１１０％酢酸で脱色し、すべての蛋白質バンドを検知した。トリプシン阻害活性を有する蛋白質バンドを決定するために、フィルホおよびモレイラに記載（１９７８年）の方法の変法を用いた。得られたゲルを３０％ＭｅＯＨ，２０％酢酸で３回洗浄し、蛋白質を固定し、ついで、蒸留水で２回すすいだ。ゲルを一夜ｐＨ７，８にて、０．１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液中で平衡化し、ついでトリプシン溶液（０，１ｍｌトリプシン／ｍｌ、０．１Ｍりん酸塩緩衝液、ｐＨ７，８）中、３０分、３７℃にてインキュベートした。ゲルを２回蒸留水で洗浄し、ついで新しく調製した、０．１Ｍりん酸塩緩衝液のｐＨ７，８のジメチルホルムアミド１ｍｌに０．５５ｍｇ／ｍｌのテトラゾール化（ｔｅｔｒａｚｏｔｉｚｅｄ）　Ｏ− ジアニシジンを添加したアセチルフェニルアラニン−β−ナフチルエステル２．５ｍｇの溶液で浸した。ゲルをアセチル−フェニルアラニン−β−ナフチルエステル溶液中、３０分間、３７℃にてインキュベートし、ついで、蒸留水で洗浄した。最終ゲル中の明確なバンドはトリプシン阻害剤の存在を示す。プロテイナーゼ阻害活性を有する蛋白質の分子量をＰＡＧＥ−３ＤＳ上で調べた。１５％アクリルアミド−０，３４％ビス−アクリルアミド分離ゲルおよび４％アクリルアミド−０，１％ビスアクリルアミド濃縮（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲルからなる１、５ｍｍ不連続ポリアクリルアミドゲルを用いた。サンプル７５μｍに分子量範囲１４０００−７００００の分子量マーカーを添加し、ＰＡＧＥ−ＳＤＳ法を用いた。

各トリプシン阻害剤の等電点も従来公知の方法を用いて測定した。

キャベツ抽出物および精製留分中のトリプシン阻害活性の存在を調べるために、標準的に分光光度検査を用いた。雄牛トリプシン（Ｏ１ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭＨｃ１）を植物抽出物と混合（１：１’／、）し、ついで、室温にて１０分間インキュベートした。ついで混合物１００μｍを１．０４Ｍｐ−トルエン−スルホニル −Ｌ−アルギニンメチルエステルを含む緩衝液（０，０５ＭトリスｐＨ８，０）２゜９ｍｌに添加した。トリプシン活性を２４７ｎｍにて３分間モニターした。

キモトリプシン阻活性は試験をＴＬＣＫ処理雄牛キモトリプシン（０，１ｍｇ／ｍｌ、１ｍＭＨＣ１）と１０分間室温にて混合（１：１°／、）シた。ついで、混合物１００μｌを基質（５０％Ｍｅ○Ｈ中１ｍＭベンゾイル−し−チロシンエチルエステルを０．０５Ｍトリス緩衝液ｐＨ８，０と１＝１で混合）２．９ｍｌに添加し、２５Ｑｎｍにて３分間モニターした。

実施例３に概説した方法に従い、成熟植物からのホモジナイズした葉の粗抽出物中のトリプシンおよびキモトリプシン阻害活性を調べた。しかしながら、各精製段階毎に、トリプシン阻害活性のキモトリプシン阻害活性に対する比率は、次の表に示すように増大した（すなわち、トリプシン活性の程度が増加した）：第１表阻害活性処理　トリプシン：キモトリプシン粗葉汁　２：１半精製プロテイナーゼ阻害剤　２：ＩＤＥＡＥ−精製プロテイナーゼ阻害剤　１０：１アフイニテイー精製プロテイナーゼ阻害剤　７０：１さらに、阻害活性の両方の型は高温、酸性環境においても非常に安定であり、凍結乾燥したときのみ、著しく減少することが判明した。

温度が不安定な蛋白質の最初の分離および除去後、ＤＥＡＥクロマトグラフィーは、クロロフィルの大部分および不純物蛋白質の比率の大部分を除去した。アフィニティクロマトグラフィーはトリプシン阻害剤の精製のために用いた。ＤＥＡＥ−精製トリプシン阻害剤サンプル３００−４００をアフィニティーカラムにかけるため、約５−６時間を要した。ついでカラムを、カラムが２８０ｎｍで吸収する物質を溶出しなくなるまで洗浄した。８Ｍ尿素ｐＨ３，０の＜１００ｍ１による次の溶出はトリプシン阻害活性を含む、単一の２８０ｎｍ唱収ビークを溶出させた。１ｍＭＭＣＩ、０．１ＭＣａＣ］２によるカラム洗浄は、トリプシン阻害活性を持たない第二の蛋白質ピークを溶出した。

本発明のアフィニティ精製トリプシン阻害剤についての３つの蛋白質バンドは、不変性、不連続１２．５％ポリアクリルアミドケル中で試験することにより検出可能であった。二つの主要なバンドは総蛋白質の約４５％づつを示し、残部がマイナーバンドのものであった。これら３種の蛋白質の分子量は、２３３００．２２２５０．１８３７０ドルトンであり；３種の蛋白質の等電点は５．０５．５．１３および５．９９であった。

本発明のプロテイナーゼ阻害剤はキャベツにつく害虫の殺虫剤として数多くの利用性を有する。キャベツの組織から分離されたこの分子量と等電点を有するプロテイナーゼ阻害剤はスプレー剤または粉剤（従来の殺虫剤、界面活性剤、緩衝液、賦形剤、結合剤、適用後の日光や細菌などの環境的要素によってプロテイナーゼ阻害剤の効果の減少を妨げる物質を含むところの通常、スプレー剤および粉剤の殺虫剤との配合剤と組み合わせ用いる他の物質と組み合わせて）として適用することができ、植物の害虫であるトリコブルシア・二およびビニリス・ラバエを退治し、防御する手段として生育中のキャベツに適用し得ることを意味する。勿論、生育中のキャベツに対するプロテイナーゼ阻害剤の物理的な適用よりも、本発明の概念の中には、生物工学的手段によってこのような阻害剤の利用も包含する。

例えば、従来の技術を用いて、阻害剤のアミノ酸配列を決定すること；植物によって阻害剤を産生ずるに必要な遺伝子配列を決定することができれば、適当な遺伝子プロモーターに組み込み、所望により、植物のゲノム中に発現させ、すなわち、これにより、つきやすい害虫による攻撃からすべての植物組織を保護する生来の能力を植物に与えることを含む。

すなわち、発明者は本発明の好ましい具体例を詳細に説明し、記載したが、本発明は変更および修正が可能であることが理解され、従って、ここに述べた用語を厳密に限定することを欲するものでなくまたその意図もないが、種々の利用および条件に本発明の変法および別法などをうま（利用することを意図するものである。従って、そのような変法および別法は下記の請求の範囲の範囲内に十分含まれる。既述の明細書内に採用した用語および表現は記述のために用いたものであり、限定のための用語ではなく、このような用語および表現中に示され、記載された特徴の均等物およびそれらの部分を排除することを意図するものでなく、本発明の範囲は下記の請求の範囲によってのみ定義され、限定されることを認識されねばならない。

本発明、およびその製造方法およびその利用を、十分に、はっきりと、明確かつ正確な用語で記載したのはこの分野に関連し、もっとも近接して関係する分野の当業者が本発明を製造し、利用することを可能にするためのものである。

要約書キャベツから分離されトリコブルシア・二およびビニリス・ラバ二の幼虫にみられるプロテイナーゼに対して特異的阻害応答を有する植物特異性植物化学物質およびこれら幼虫から植物を保護する手段としての上記植物化学物質の用途が記載されている。

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Claims

【特許請求の範囲】

（１）分子量が約１８，３７０−約２３，３００ダルトン、等電点が約５．０５ −約５．９９のペプチドであり、トリコプルシア・ニおよびピエリス・ラパエの幼虫で産生されるトリプシンおよびキモトリプシンに対して阻害作用を示す、プロテイナーゼ阻害剤。
（２）分子量が約１８，３７０ダルトン、等電点が約５．９９である、請求項１記載の阻害剤。
（３）分子量が約２３，３００ダルトン、等電点が約５．０５である、請求項１記載の阻害剤。
（４）分子量が約２３，２５０ダルトン、等電点が約５．１３である、請求項１記載の阻害剤。
（５）分子量が約１８．３７０−約２３，３００ダルトン、等電点が約５．９９ −約５．０５のプロテイナーゼ阻害剤を幼虫に供給し、上記剤を幼虫に摂取させることを含む、トリコプルシア・ニおよびピエリス・ラパエの幼虫の成長および発達の阻害方法。
（６）剤をキャベツ植物体の葉に適用することにより剤の供給を行う、請求項５記載の方法。
（７）剤が溶液中にあり、噴霧剤として適用される、請求項６記載の方法。
（８）剤が固体であり、粉剤として適用される、請求項６記載の方法。
（９）幼虫の体内にみられるプロテイナーゼに特異的なプロテイナーゼ阻害ペプチドの産生に関する遺伝子配列を植物体のゲノム中に挿入し、形質転換されたゲノムに上記配列の発現を開始させる手段を供給し、上記阻害ペプチドの発現を開始させることを含むトリコプルシア・ニまたはピエリス・ラパエの外寄生により生ずる損傷から自分を保護する能力をキャベツ植物体に付与する方法。