JP2005500393A5 - - Google Patents
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Description
【書類名】明細書
【発明の名称】抗菌剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は植物クロマチンから単離されるタンパク質成分の使用に関する。より正確には、本発明は、植物クロマチンが解離された後に、当該植物クロマチンから単離されるタンパク質成分の抗微生物剤としての使用及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
真核生物のほとんどが、感染因子に対して多種多様な防御機構を備え持っている。いくつかの機構は、微生物と複雑な多細胞生物の細胞との間の、膜組成や組織に存在する、それらの根本的な相違に基づいており、すなわち、それらの機構は、感知できる微生物の外膜に対して向けられる。これらの膜は外側に向いている負電荷を帯びた頭部を有する脂質から構成されており、それらの膜組成や組織を変えて、その影響に対抗することは、微生物には明らかに困難であるようだ。よって、抗菌活性を有する物質は抗生物質の代用品の候補になりうると考えられる。
【0003】
1つの例は、リン脂質を膜の間を転移させることが可能なリン脂質転移タンパク質である。抗微生物性リン脂質転移タンパク質は、穀物を含む様々な植物種から報告されており、これらのタンパク質は異なる病原体に対して活性が変化する。例えば、米国特許第5698200号において、麦芽入り穀物から得られた水性抽出物を用いると植物の一部を植物病原菌から保護できることが示されている。
【0004】
しかし、保護剤として最も研究がされている種類は抗微生物性ペプチドである。それらは、植物や昆虫から軟体動物、甲殻類、両生類、鳥類、魚類、哺乳類そしてヒトを含む動物に到るまで、全ての生命種に存在する。
【0005】
これらのペプチドは細菌と直接相互作用してそれらを殺す。それらは、グラム陰性及びグラム陽性の細菌または菌類(酵母を含む)、寄生虫(プラナリアや線虫など)、癌細胞、そしてHIVや単純ヘルペスウイルスなどのエンベロープウイルスまでも殺すか、または中和する能力を含む、独自の広範囲な活性スペクトルを有するために、抗微生物剤と称される。一般的に、これらの薬剤はわずか12個のアミノ酸から70個を超える残基を有する分子まで長さに幅がある。500を超えるこのようなペプチドが発見されている。
【0006】
メリチン、マゲイニン、グラミシジン、セクロピン(cecropin)及びディフェンシンなどのペプチドのうちで、ほぼ全ての場合においてカチオン性の抗微生物性ペプチドの抗微生物活性の態様が詳細に研究されてきた。抗微生物分子は、通常それらが攻撃する生物の膜をも損傷する。カオチン性の抗微生物性ペプチドは、in vitroだけでなくin vivoにおいても殺菌作用を保持することが発見されている。それらは迅速に殺し、容易には耐性変異体を選択せず、従来の抗菌剤、他のペプチド並びにリゾチームと相乗作用を有し、動物モデル中の細菌を殺すことが可能である。
【0007】
結果として、動物由来の抗微生物性ペプチドは新たな抗生物質として現在開発されている。例としては、合成されたマゲイニン(ぺクシガナン(Pexiganan))やプロテグリン(protegrin)の類似体や元々豚の好中球から単離された抗微生物性ペプチドがある。
【0008】
しかしながら、天然資源が、新しい代替的な抗生物質の産生に経済的に有益であるかは証明されていない。その唯一の例外が、抗微生物性ペプチドであるニシン(nisin)に高い耐性を有するラクトコッカス・ラクティス株で効率的に産生することが可能な抗微生物性ペプチドのニシンである。
【0009】
非常にたくさんのより大きなタンパク質またはそれらの断片が抗微生物活性を有することも判明している。例えば、マウスマクロファージタンパク質であるユビキチジン(ubiquicidin)は、リボソームタンパク質S30と同じであると考えられる。また、ウシガエル(ラナ・カテスベイナ(Rana・catesbeina))の胃における2つの抗微生物性ペプチドは、ペプシノゲンのN末端由来である。同様に、ブフォリンI(BuforinI)という名称の抗微生物性ペプチドは、アジアカエル(Asian toad)の胃の組織から単離された(BBRC 218:408、1996)。39アミノ酸長のペプチドのアミノ酸配列は、アフリカツメガエルのヒストンH2Aの39個のアミノ末端残基のうち37個と同じであることが判明した。
【0010】
加えて、全体としてのタンパク質分子が抗微生物性の潜在能力を示し得る。大西洋サケの肝臓、腸及び胃中の酸抽出物において、抗微生物性活性が検知された(BBRC 284:549、2001)。対応する抗微生物性タンパク質は、酸抽出物を使用し、硫酸アンモニウム沈降、大規模ゲルクロマトグラフィー(ゲルろ過)、逆相HPLC及びサイズ排除クロマトグラフィーを行うことでサケの肝臓から単離させることができる。サケ抗微生物性(SAM)タンパク質は、27.7kDの分子量を有することが判明し、これはヒストンH1タンパク質として同定された。WO 200110901において、ウシの胸腺由来の哺乳類ヒストンH1タンパク質は、様々な真核生物における微生物感染を治療するための抗微生物性組成物に用いられる。このようにして、他の周知の確立された機能を有するタンパク質が抗微生物性であることによって第2の性質を示すようである。
【0011】
しかしながら、ウシのタンパク質、とりわけウシの胸腺由来のタンパク質の使用は、材料が有害なウイルス、特に肝炎ウイルスや例えばプリオンなどのその他の病原体によって汚染され得るので、避けなければならない。ウシ由来の材料は、汚染されていようがなかろうが、ヒトに関連して使用することを意図する場合には非常に厳重に検査が行われなければならない。
【0012】
さらに、ヒトまたは家畜に関連して使用できる産物を得るために、新しい代替的な抗生物質の単離には、特定の動物の器官または組織を収集し、続いて複雑な精製作業が関与する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明の目的は、上記の問題を解消する新しい抗微生物剤を提供することである。
【0014】
本発明の別の目的は、ヒト及び/または動物に対して病原性を有する感染因子を伝播するリスクを回避する、抗微生物剤を提供することである。
【0015】
もう1つの別の目的は、食品に関連して使用される場合に味の無い抗微生物剤を提供することである。
【0016】
本発明のさらなる目的は、安価な出発原料を利用する、抗微生物剤を製造する方法を提供することである。
【0017】
その上、更なる目的は、実質的に無制限な規模で抗微生物剤を製造する方法を提供することである。
【0018】
その上、いっそう更なる目的は、細菌発酵に関して植物で製造するのに投資を必要としない抗微生物剤を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0019】
これらの目的は、請求項に記載の本発明の使用並びに方法によって達成される。
【0020】
本発明にしたがって、簡単で合理的な方法で、例えば、薬物、製造及び輸送の間の完全な保存剤、機能性食品及び/または栄養補助添加物ならびに動物飼料の添加物としての抗微生物製品として使用できるタンパク質成分の製造を可能にする方法が提供される。
【0021】
タンパク質成分は、植物クロマチンを含む元々は不活性な出発原料から驚くべき容易さで製造できる。本発明の方法において、DNAは塩基性核植物クロマチンから分離される。植物クロマチンは、植物の種子から得ることが好ましい。適切な植物の種子は、オート麦、雑実用モロコシ、ミロ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、米、菜種、大豆、粟または蕎麦から得られる。しかし、海草やその他の海洋植物などの植物材料から構成されるいずれのクロマチンもが、抗微生物性タンパク質成分の大規模な製造に用いることができる。
【0022】
タンパク質成分を単離させるのに用いる植物クロマチンは、ヘテロクロマチン(サイレントクロマチンまたは「ジャンク」DNA)であるべきである。ヘテロクロマチンは、低アセチル化された(アセチル基が取り除かれた)クロマチンで、これはより高い陽性電荷を有するために、高アセチル化されたクロマチンよりもより凝縮された構造を推測させる。
【0023】
それに加えて、さらなる特定のタンパク質抽出のためのクロマチン出発原料の選択は、植物細胞組織の位置と分化状態によっても決まる。例えば、小さな細胞から構成される組織は、より細胞密度が高くなるので、より大きな細胞サイズから構成される別の同量の組織よりも、多くの核酸とそれに付随する抗菌性タンパク質成分を含むであろう。
【0024】
同様に、多くの植物は高ヘテロクロマチンを含有するために、非常に大きな基底(basal)ゲノムサイズを担持し、それは、さらに倍数性の可能性によって増加される。これに関連して、1倍体細胞あたりの、塩基対の数で測定されるDNAの量(C値)が参照される。生物のDNA含有量におけるバラツキは、そのDNAのC値または基底ゲノムの大きさが反映する。C値は、生物の細胞内に存在するDNAの完全な配列の単一のコピー中の塩基対の重さまたは数によって測定されるDNAの含有量として定義される。C値とは、分類群の倍数性のレベルとは関係なく、複製されていない1倍体細胞または配偶子核における核DNAの量である。このように、C値は2倍体種におけるゲノムの大きさと同等であるが、倍数性種におけるゲノムの大きさよりも常に大きい。
【0025】
また、植物の自己再生型で未分化の幹細胞を用いることも好ましい。これらは、新芽や根端において新たな成長を促す領域である分裂組織中に見出される。従って、植物の苗木の根端は、本発明によるクロマチン抽出及びそれに続いて行なわれるタンパク質成分の単離を行なうにあたって優れた出発原料となる。このような原料は、醸造用麦芽や小麦の胚種油を製造する間における廃棄物なので、無制限的な量をたやすく手に入れることができる。
【0026】
最適な成長条件下にある有糸分裂性細胞を有するその他の植物原料もまた、本発明によるタンパク質成分の調製に適する。発芽段階にあるどのような発芽新芽や細根または胚芽でも使用できる。好ましくは、上記で挙げた穀物4種の内の1つの種子を用いて、発芽させるとよい。
【0027】
本発明において用いるのに安価な原料は、ビール製造の出発原料となる緑麦芽と呼ばれる物である。醸造産業では、緑麦芽は大麦を湿らせた後、6日間発芽させて製造される(麦芽製造)。この工業的に製造される緑麦芽またはその副産物(根っこや小枝の塊、ルートリングス(rootlings))は、本発明にしたがって、抗微生物性タンパク質成分を製造するのに用いることができる。
【0028】
従って、2倍体のトウモコロシや大麦(DNA C値5000Mbp)や玉ねぎ(DNA C値18000Mbp)の根っこや小枝の塊は、適切な抽出用出発原料である。好ましくは、抗菌性タンパク質成分は、DNAのC値が3000Mbpを超えるクロマチン源から抽出される。
【0029】
精製作業における出発原料は、S期にある増殖する植物細胞から単離された植物クロマチンを含むことが特に好ましい。発芽した種子(穀物)やそれに根っこや小枝の塊ならびに若葉は、このように、大量のS期にある細胞を含む。
【0030】
抗微生物活性を有する植物性タンパク質成分を製造する本発明の方法において、その方法は下記の工程:
植物クロマチンを露呈させるために植物材料をホモジナイズする工程、
疎水条件下で植物クロマチンを解離剤を用いて解離する工程、及び
上記の解離された植物クロマチン(植物性タンパク質成分を含む)を、疎水相互作用による分離手段を用いて、個々のフラクション(分画)に分離する工程
を含む。
【0031】
従って、まず植物材料はホモジナイズされる。これと関連して「ホモジナイズ化」という用語は、植物のクロマチンが露呈され、ホモジネートがスラリーとして得られるような態様での、植物材料の細胞壁の破壊を意味する。細胞壁は、限定する訳ではないが、高剪断混合、超音波処理、機械的破壊、圧力による破裂などを含む当業者には周知である任意の多くの方法によって破壊されてもよい。細胞壁は、ホモジネートが得られる適切な装置を用いて破壊される。
【0032】
次いで、ホモジネート中の植物クロマチンは、疎水条件下において、解離剤水溶液中の、解離剤によって解離される。かかる条件とは、疎水相互作用を促進させる条件である。
【0033】
適切な解離剤は、尿素、塩化グラニジン及び塩化物塩である。塩化物塩は、好ましくは高イオン強度を有する塩化ナトリウムである。
【0034】
植物材料のホモジナイズが解離剤中で行なわれると有利である。こうすることで、精製作業が単純化され、精製工程数が少なくて済む。
【0035】
緑麦芽の精製作業は、4Mの塩化ナトリウムを含むほとんど飽和化した食塩水における緑麦芽のホモジナイズ化によって開始される。高イオン強度は、クロマチンだけでなくヌクレオソームを解離させ、それと同時にプロテアーゼによるタンパク性物質の同時的な分解を防ぐ。ホモジナイズ化は、疎水性マトリックスの存在下で行なわれることが好ましい。
【0036】
次いで、ホモジネートは、ふるいやワイヤー網などの上で濾されることにより、それらの上に残っている細胞残留物や植物クロマチン由来のその他の粒子が取り除かれる。こうすることにより、これに続く解離されたクロマチンの精製を容易にする澄明な溶液が得られる。
【0037】
次いで、解離された植物クロマチン(抗微生物活性を有する植物性タンパク質成分を含む)は、個々のフラクション(分画)に分離(分取)される。上記の分離は、疎水相互作用による分離工程によって行なわれることが好ましい。上記の疎水相互作用による分離工程として、好ましくは疎水クロマトグラフィーがよい。
【0038】
好適な分離手段の他の例としては、分配クロマトグラフィー、向流分配、及びガスアフロン(gas aphron)分配などの高分子システムによる分配がある。解離されたクロマチン成分の分離は、代替的に、金属キレートゲルまたは固定化へパリンが施されたカラムで行なってもよい。
【0039】
疎水相互作用及び/または分離工程に用いるマトリックスの機能性リガンドは、エーテル、イソプロピル、ブチルまたはオクチル基であるべきであろう。フェニル基は避けなければならない。機能性リガンドは、好ましくは、4%が架橋したアガロースマトリックス上のブチル基である。40から50μmol/mlのリガンド密度を得ることができ、結果として1mlにつき7mg IgGの結合能が得られる。
【0040】
例えば、スラリーとしての緑麦芽のホモジネートのスクリーニングを行なった後、活性ブチル基を含む疎水相互作用クロマトグラフィーゲル(HIC)である疎水性マトリックスが、得られた溶液にバッチ式で加えられる。適切なマトリックスは、スウェーデン国、ブロマ、イノバータAB(InovataAB、Bromma、Sweden)によるノバローズ(Novarose)(登録商標)S−ブチル 1000/40及びスウェーデン国、アマシャム ファーマシア バイオテック(Amersham Pharmacia Biotech)によるブチルセファローズ(Sepharose)(登録商標)4である。次いで、疎水性マトリックスは高イオン強度の食塩水で洗浄され、DNAが洗い落とされる。
【0041】
次いで、マトリックスはカラム中に流し入れられ、低イオン強度の塩化ナトリウムを用いた段階的な勾配溶離にかけられる。はっきりと区別できる抗微生物性タンパク質成分が、1M NaClの濃度で溶離される。
【0042】
タンパク質成分は、ペプチド/タンパク質の精製に適切な従来的な方法によって更に精製されてもよい。上記の方法としては、遠心分離法、等電点での沈殿法、相分離法、限外濾過法、ゲルクロマトグラフィー(サイズ排除クロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィーまたはHPCL、ならびにこのような方法の組み合わせが挙げられる。これに続く分取工程としてゲルクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーが好ましい。
【0043】
分取ゲルクロマトグラフィーの工程は、100kDの排除限界を有するゲルが詰められたカラム内で行なわれることがより好ましい。カラムは、抗生物質作用を示す1M NaClのフラクションがロードされる前に、蒸留水で平衡化される。次いで、カラムは蒸留水または酢酸アンモニウムで溶離される。こうすることによって、1つの同じ工程において脱塩と精製が同時に行なわれる。こうして、タンパク質成分は、任意の更なる精製工程がなくとも、例えば凍結乾燥によって、乾燥状態まで濃縮されてよい。
【0044】
抗微生物的特性を示す、10から20kDの見かけ分子量を有するタンパク質フラクションが単離された。
【0045】
タンパク質成分の精製が、当業者に周知の他のたくさんの方法によって達成できることを当業者は理解するし、それらの方法のすべてが本発明によって企図されるものである。
【0046】
植物クロマチンを個々の成分に解離することを条件として、へパリン、アルギン酸、フィチン酸またはバナジウム化合物などの錯化剤を解離剤として用いることも可能である。抗生物質的に活性なタンパク質成分とでアルギン酸複合体が形成されるため、解離剤として、アルギン酸が特に好ましい。このような複合体は、精製の目的で使用され、またはそこから抗微生物活性を徐放させるものとして使用されてよい。
【0047】
本発明にしたがって、解離した植物クロマチンを、例えば疎水相互作用による分離作業によって個々のフラクションに分離する前には、解離された植物クロマチンの出発原料には抗微生物活性は全く発見することができなかった。本発明にしたがって植物性タンパク質成分を精製すると、ヘテロクロマチンが自動的に利用できる。このように、クロマチン成分の物理的な分離によって生物学的活性が引き続いて生じる。理論上、この分離工程は、成分の分子構造に結果として変化を生じさせ得るであろう。
【0048】
抗微生物性ペプチドは、陽電荷によって原核生物にそれらの作用を及ぼすことが一般的に認められている。本発明によって得られるタンパク質成分の最も可能性のある作用機序は、他のカチオン性ポリペプチドについて知られていることと異なるものであるとは予期されない。しかし、既知の塩基性ペプチドは、細胞膜との相互作用を可能にし、それは洗浄剤による相互作用を擬態する。タンパク質成分のこのような作用機序は、グラム陽性菌だけでなくグラム陰性菌に対して及ぼすその作用によって確認される。
【0049】
本発明にしたがって、抗微生物的に活性な他のタンパク質成分は、疎水性マトリックスから溶離された後の他の精製工程を用いて、その他の植物材料から得ることもできる。これは、異なる生物材料由来のタンパク質が、植物材料の細胞活性を反映する、異なった合成後の修飾パターンを示すという事実による。このように、分離のパターンは、本発明によって得られるタンパク質成分の、例えば、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、グリコシル化及びADP−リボシル化の程度によって影響されるのである。
【0050】
これに対応して、植物クロマチン由来の単離されたタンパク質成分は、これに続いて、化学的に修飾されてよい。このような修飾は、分子量の変化及び/またはアセチル化レベルの変化を含み、結果として、より特異的な生物的活性を有する調製形態をもたらすであろう。
【0051】
本発明の方法で得られるタンパク質成分の抗微生物効果は、対照物質として使用されるニシン(nisin)を用いた、標準化されたバイオスクリーン(Bioscreen)(登録商標)法で決定することができる。ニシンと比較して、2から4mg/mlに相応するタンパク質成分で殺菌効果が得られた。さらに、ニシンでは有さない、グラム陰性菌に対する効果が得られた。
【0052】
単純な本発明の精製法は、抗微生物性タンパク質成分の製造を実質的に無制限の規模で可能にする。かかる工程による収量は、1kgの原料(例えば根っこや小枝の塊)からタンパク質約1gである。例えば6日間麦芽にすることによって示されるように、最大のタンパク質合成を伴う発芽種子を用いると収量は最大となり得る。S期にある増殖している植物細胞を用いると、天然クロマチンタンパク質の合成は最大となり、最大で、合成された全タンパク質の80%を示し得る。
【0053】
本発明にしたがって植物クロマチンから単離される、抗微生物剤としてのタンパク質成分は、1つまたは複数の相乗効果を有する抗微生物剤と共に用いることで増強可能である。上記の相乗効果を有する抗微生物剤の例は、リゾチーム、プロタミン、キレート剤、第2銅化合物及びバクテリオシンである。
【0054】
植物クロマチンのタンパク質成分は、微生物感染を治療するための医薬組成物の製造に適している。また、本発明は、治療に有効量のタンパク質成分を投与することによる、ヒトを含む哺乳類における微生物感染を治療する方法にも関する。
【0055】
タンパク質成分は、歯及び歯茎の疾患(不調)を治療するための経口適用、皮膚科的疾患、皮膚及び髪の異常、及び、耳及び眼科的疾患などの、外部的な使用のための局所適用に用いることができる。植物クロマチンタンパク質成分は、口、喉、肺、膣及び直腸などの体腔、並びに、病原性微生物の消化による胃腸疾患の治療のための経口用に使用することもできる。
【0056】
タンパク質成分を抗微生物剤として使用する場合、様々な塩や緩衝液を含む緩衝化された水性媒体中に製剤化してもよい。塩は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、または硫酸ナトリウムなどのアルカリ及びアルカリ土類ハロゲン化物であることが好ましい。緩衝液の目的のために緩衝液が生理学的に許容できる限り、クエン酸塩、リン酸塩、HEPES、トリスなどの様々な緩衝液を使用してもよい。
【0057】
タンパク質成分が凍結乾燥粉として剤形化される場合、引き続いて溶液で使用するために、様々な賦形剤またはその他の添加剤を使用してもよい。賦形剤には、様々なポリオール、不活性粉末またはその他の増量剤を挙げてもよい。
本発明の使用法には、細菌または菌類を殺すために有効量の精製されたタンパク質成分及び適切な担体を含む組成物も含まれる。かかる組成物は、細菌や菌類を退治するために様々な態様で、例えば当該技術分野で周知の担体を用いた、家庭内または実験室用の抗微生物製剤において、使用してよい。
【0058】
異なる組成物は、異なる生物に対して異なる活性度を有するであろう。細菌や菌類などの有害な微生物を殺すために使用される有効量、及びその他の有害物質は、当業者にはたやすく決定できる。
【0059】
また、本発明によるタンパク質成分は、タンパク質分解からタンパク質成分を保護するための予防剤として作用する他のタンパク質と組み合わせられてもよい。代わりに、本発明のタンパク質成分または組成物は、保存剤または殺菌剤として、コンタクトレンズの溶液、軟膏、シャンプー、医薬、食品などの、多種多様な製剤中に用いられてよい。タンパク質成分の量は、その他の成分の性質、必要とされる抗微生物保護の程度、及び組成物の意図する用途に応じて変動し得る。
【0060】
タンパク質成分は、例えば、適切な担体と共に、表面の消毒及び冷滅菌用組成物において、及び食品の高圧低温殺菌の補助剤として、並びに、例えば養魚における、水質保全剤としての組成物において、使用することが可能である。また、タンパク質成分は、包装材料に包装された場合に、そこから徐放されるように、細菌を殺すのに有効量で使用されてもよい。
【実施例】
【0061】
本発明は、これより、以下に記載の実施例を参照して、さらに記述されかつ描写される。しかし、これらの実施例はいかなる態様においても本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことを留意されたい。
【0062】
実施例1.抗菌性アッセイ
マイクロタイタープレートのウェルを、300μlの成長培地(栄養培地(Nutrient Broth)+1%のブドウ糖)の濃度の2倍の濃度で充たした。デュプリケート(duplicate)の試料を、最終濃度が、それぞれ、2、0.5及び0.2mg/mlのタンパク質であるタンパク質成分に添加した。
【0063】
シュードモナス・フローレセンス(Fluorescens)(グラム陰性の好気性細菌)とリステリア・イノキュア(Innocua)(グラム陽性の好気性細菌)の2つの実験生物を用いた。
【0064】
細菌株の一晩培養物をペプトン水で希釈し、50μlの各株を104 細胞/mlの濃度でウェルに添加した。テスト材料が含まれていない、参照ウェル(陽性対照)を使用した。
【0065】
プレートは30℃で72時間、バイオスクリーン(登録商標)分析装置において培養され、細菌の成長は可視光における吸光度の増加として毎15分おきに記録された。
【0066】
実施例2.抽出及び分画
植物タンパク質及びポリペプチドを抽出及び分画する場合に、植物組織の構造、生理及び生化学が異なるために、現在または従来の動物緩衝液及び/または浸漬の技術を適用できないことはよくあることである。植物組織内の高分子組成物及び相互作用がより複雑であって(例としてフェノール、炭水化物及び炭化水素の化合物)、かつ細胞壁がより緻密であればあるほど、ポリペプチドの完全性(integrity)を確保するために、植物抽出物の調製におけるより厳密な浸清及び単離法が必要となる。
【0067】
大麦の葉(生葉の重量で1kg)に、Langenbuch et al、Plant Molecular Biology2、207−220(1983)に記載の抽出及び分画工程を実施した。0.4Nの硫酸を用いて、10から20mgの標準的な収量で大麦の核クロマチンが得られた。
【0068】
次いで、タンパク質成分の大規模な分取単離を可能とする、特別な亜分画(サブフラクショネーション(subfractionation))技術を行なった。エタノール(80%):HCl(0.25N)における異なる溶解性によって、特定のタンパク質成分(MW17,300)が得られた。
【0069】
標準的な、社内の(in house)リステリア及びシュードモナス株に対する抗微生物活性に関して、タンパク質成分をアッセイした。
【0070】
エタノールと水の両方に溶解するフラクションを用いることにより、両方の生物の全体的な成長阻害が得られた。効果は濃度依存性であった、言い換えれば、所定の閾値に達しなければならない(希釈1:1では効果は得られない)。
【0071】
抗微生物活性は、MW17,300の特定のタンパク質成分に専ら限定される。これより大きなタンパク質成分では、活性は得られなかった。
【0072】
実施例3.代替的な抽出及び分画
2週齢のエンドウ豆、小麦、ライ麦及び綿の苗木に、Sidorova & Konarev、Biokhimiia 46、1298(1981)に従って、亜分画手順を実施した。
【0073】
MW17,300の特定のタンパク質成分だけでなく、それより大きなタンパク質成分が得られた。
【0074】
抗微生物活性に関してタンパク質成分をアッセイし、その結果は実施例1で得られたものと同じであった。
【0075】
実施例4.改良された分画手順
緑麦芽は地元の醸造所から入手した。その麦芽は、従来の麦芽製造法で6日間発芽されたものだった。
【0076】
緑麦芽(100g)は4M NaCl中に懸濁され、ブラウンミキサー(Braun mixer)で約10分間ホモジナイズされた。ホモジネートは20μmのふるいを通して濾過され、次いで、得られた溶液は、4M NaClで平衡化された、20gの疎水性マトリックス(Novarose(登録商標) S−Butyl 1000/40 Inovata AB、Sweden)に添加された。この混合物は10分間攪拌され、マトリックスは40μmのふるいを通して濾過された。
【0077】
次いで、マトリックスはカラム(25×50mm)中に詰められ、溶離される前に4M NaClで洗浄された。254nmでの溶離液の増加した吸光度によって決定されたように、この高イオン強度では、DNAはマトリックスに結合せず、したがって、カラムに詰めて洗浄する工程の間に溶離されたのであろう。
【0078】
2M NaCl、1M NaCl及び水で、それぞれ、順次溶離した後に、はっきりと区別できるタンパク質のピークが、276nmでの紫外線の吸収を利用することによって記録された。これは、2M NaClでの非クロマチン物質の脱着に相当する。
【0079】
実施例5.亜分画(サブフラクショネーション)の手順
実施例4で1M NaClにおいて脱着したフラクションは、ノヴァローズ(Novarose)(登録商標)SE−100/40(Inovata AB、Sweden)のカラム(25×500mm)上で、0.1M酢酸アンモニウムで分取ゲルクロマトグラフィーによって更に亜分画された。
【0080】
3つのタンパク質フラクションが得られ、凍結乾燥された。真ん中のタンパク質フラクションは、10から20kDの分子量に相当する保有量を有していた。
【0081】
従って、植物クロマチンは、高い陽性電荷を有する、かかる分子量範囲の低アセチル化された疎水性塩基タンパク質における単離のための都合の良い供給源である。
【0082】
ノヴァローズ(登録商標)SE−100/17(Inovata AB、Sweden)のカラム(8×300mm)上で、0.1Mのリン酸緩衝液pH7.0において分析的ゲルクロマトグラフィーを行なった結果、かかるフラクションは約14kDの平均分子量に相当することが分かった。
【0083】
実施例6.代替的な分画手順
実施例4におけるのと同じ条件だが、疎水性マトリックスとしてノヴァローズ(登録商標)S―フェニル(Inovata AB、Sweden)を用いた、比較実験を実施した。1M NaClでカラムを溶離した場合にはタンパク質の脱着は何ら検出できず、水で溶離した後にはただ1つのフラクションが得られた。水に22%のエタノールが含まれた溶液を用いても、疎水性マトリックスからタンパク質物質の脱着が生じなかったことは、マトリックスとタンパク質物質との間の結合はきわめて疎水性であることを示している。
【0084】
実施例7.抗微生物活性の確立
実施例5に従って得られた真ん中のフラクションは、その抗微生物活性に関連して更に調べられた。凍結乾燥されたフラクションをリン酸緩衝液(pH7.0)において4mg/mlの濃度まで溶解することによって、試料を調製した。次いで、これらの溶液はリン酸緩衝液を用いて4倍から10倍に希釈された。
【0085】
得られた結果は、実施例4及び5におけるプロトコルにしたがって調製した場合の、MW17,300の特定のタンパク質成分によって実施例5で得られた結果と切り離せないものである。
【0086】
ゲルクロマトグラフィー工程によって得られたその他のフラクションでは何らの抗微生物活性もまったく示されなかったことに留意されたい。
【0087】
実施例8.C値の効果
同様の抗微生物活性を有するタンパク質成分が、実施例4及び5で記述されたのと同じ工程を用いて、72時間のシロイヌナズナ及び小麦の苗木のクロマチンから単離された。これらの種由来の、10から20kDを有する真ん中のフラクションの平均収量は著しく異なっており、小麦は非常に好適な抽出源である。大麦と比べると、所望のフラクションは約2倍の量で存在する。
【0088】
実施例9.分析的電気泳動
標準的なプロトコルに次いで行なわれる分析的電気泳動(Panyim & Chalkley、Biochem、8:3972、1969)により、MW17,300を有する特定のタンパク質成分の多数のバリアントが示され、28,000から35,000の分子量を有する、より高分子量のタンパク質成分の亜分画(サブフラクション)は何ら存在しない。
【0089】
これらの結果は、植物種間でのゲノムの大きさの相違をも反映する。シロイヌナズナは小さな200Mbpの2倍体ゲノムを有し、これに対応して、17,000Mbpの大きな6倍体ゲノムを有する小麦よりも収量は低くなる。
【0090】
従って、抽出収量はC値として表されるゲノムの大きさに密接に関連する。
【0091】
比較例1. 動物のヒストンとの比較
実施例5にあるように、緩衝化した分離用媒体における分析的クロマトグラフィーにより、子牛のヒストンH2A及びH2Bの分子量に相当する約14kDの分子量が得られたので、本発明によるタンパク質成分と動物ヒストンとの間での比較を実施した。
【0092】
市販の子牛のヒストンH2A及びH2B(Sigma、USA)と、実施例4において得られた10から20kDの分子量を有する真ん中のフラクションとの、並行的な比較実験を、ノヴァローズ(登録商標)SE−100/17(Inovata AB、Sweden)のカラム(8×300mm)上で、0.1MのpH7.0のリン酸緩衝液において、分析的ゲルクロマトグラフィーを用いて実施した。
【0093】
得られた全てのフラクションを抗菌活性に関してアッセイしたところ、植物クロマチンから単離されたタンパク質成分において肯定的な結果が繰り返し得られた。
【0094】
別の比較実験では、植物ヒストンH1であると予期される位置での、第1のフラクションによる抗微生物活性は示されず、ほとんど皆無に近かった。さらに、食塩水におけるヌクレオソームの解離パターンは動物と植物とで異なり、動物に用いられる標準プロトコルが植物には使用できないことが再確立される。
【0095】
比較例2. 水性溶媒の抽出
植物組織の全ポリペプチドの抽出を可能にする方法はほとんど利用できない。使用される方法は、亜細胞成分が豊富な様々な組織のフラクションの分取に好ましい。対照的に、多数の多かれ少なかれ「普遍的な」分取技術が動物系に関して記述されてきた。
【0096】
かかる技術はカレン・バレット(Karen Barrett)によって米国特許第5698200号において研究されており、麦芽入り穀物のいくつかの単純な水性溶媒抽出物が調べられている。
【0097】
米国特許第5698200号における実施例1及び2で開示されるのと同様の、下流の(downstream)方法が、大麦の葉(参照:実施例2)を出発原料として用いて使用された。
【0098】
10から20kDの範囲にある貯蔵タンパク質のみが同定された。これらのタンパク質は、抗菌活性を全く示さない。
【0099】
出発原料が細胞性物質である、米国特許第5698200号に記述されるどの方法によっても、クロマチンは放出できないと結論付けられる。最も多くは、2から3kDという低分子量の細胞傷害性硫黄ポリペプチドとして特徴付けられる、周知の植物ディフェンシンであるチオニンが得られた。
【発明の名称】抗菌剤
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は植物クロマチンから単離されるタンパク質成分の使用に関する。より正確には、本発明は、植物クロマチンが解離された後に、当該植物クロマチンから単離されるタンパク質成分の抗微生物剤としての使用及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
真核生物のほとんどが、感染因子に対して多種多様な防御機構を備え持っている。いくつかの機構は、微生物と複雑な多細胞生物の細胞との間の、膜組成や組織に存在する、それらの根本的な相違に基づいており、すなわち、それらの機構は、感知できる微生物の外膜に対して向けられる。これらの膜は外側に向いている負電荷を帯びた頭部を有する脂質から構成されており、それらの膜組成や組織を変えて、その影響に対抗することは、微生物には明らかに困難であるようだ。よって、抗菌活性を有する物質は抗生物質の代用品の候補になりうると考えられる。
【0003】
1つの例は、リン脂質を膜の間を転移させることが可能なリン脂質転移タンパク質である。抗微生物性リン脂質転移タンパク質は、穀物を含む様々な植物種から報告されており、これらのタンパク質は異なる病原体に対して活性が変化する。例えば、米国特許第5698200号において、麦芽入り穀物から得られた水性抽出物を用いると植物の一部を植物病原菌から保護できることが示されている。
【0004】
しかし、保護剤として最も研究がされている種類は抗微生物性ペプチドである。それらは、植物や昆虫から軟体動物、甲殻類、両生類、鳥類、魚類、哺乳類そしてヒトを含む動物に到るまで、全ての生命種に存在する。
【0005】
これらのペプチドは細菌と直接相互作用してそれらを殺す。それらは、グラム陰性及びグラム陽性の細菌または菌類(酵母を含む)、寄生虫(プラナリアや線虫など)、癌細胞、そしてHIVや単純ヘルペスウイルスなどのエンベロープウイルスまでも殺すか、または中和する能力を含む、独自の広範囲な活性スペクトルを有するために、抗微生物剤と称される。一般的に、これらの薬剤はわずか12個のアミノ酸から70個を超える残基を有する分子まで長さに幅がある。500を超えるこのようなペプチドが発見されている。
【0006】
メリチン、マゲイニン、グラミシジン、セクロピン(cecropin)及びディフェンシンなどのペプチドのうちで、ほぼ全ての場合においてカチオン性の抗微生物性ペプチドの抗微生物活性の態様が詳細に研究されてきた。抗微生物分子は、通常それらが攻撃する生物の膜をも損傷する。カオチン性の抗微生物性ペプチドは、in vitroだけでなくin vivoにおいても殺菌作用を保持することが発見されている。それらは迅速に殺し、容易には耐性変異体を選択せず、従来の抗菌剤、他のペプチド並びにリゾチームと相乗作用を有し、動物モデル中の細菌を殺すことが可能である。
【0007】
結果として、動物由来の抗微生物性ペプチドは新たな抗生物質として現在開発されている。例としては、合成されたマゲイニン(ぺクシガナン(Pexiganan))やプロテグリン(protegrin)の類似体や元々豚の好中球から単離された抗微生物性ペプチドがある。
【0008】
しかしながら、天然資源が、新しい代替的な抗生物質の産生に経済的に有益であるかは証明されていない。その唯一の例外が、抗微生物性ペプチドであるニシン(nisin)に高い耐性を有するラクトコッカス・ラクティス株で効率的に産生することが可能な抗微生物性ペプチドのニシンである。
【0009】
非常にたくさんのより大きなタンパク質またはそれらの断片が抗微生物活性を有することも判明している。例えば、マウスマクロファージタンパク質であるユビキチジン(ubiquicidin)は、リボソームタンパク質S30と同じであると考えられる。また、ウシガエル(ラナ・カテスベイナ(Rana・catesbeina))の胃における2つの抗微生物性ペプチドは、ペプシノゲンのN末端由来である。同様に、ブフォリンI(BuforinI)という名称の抗微生物性ペプチドは、アジアカエル(Asian toad)の胃の組織から単離された(BBRC 218:408、1996)。39アミノ酸長のペプチドのアミノ酸配列は、アフリカツメガエルのヒストンH2Aの39個のアミノ末端残基のうち37個と同じであることが判明した。
【0010】
加えて、全体としてのタンパク質分子が抗微生物性の潜在能力を示し得る。大西洋サケの肝臓、腸及び胃中の酸抽出物において、抗微生物性活性が検知された(BBRC 284:549、2001)。対応する抗微生物性タンパク質は、酸抽出物を使用し、硫酸アンモニウム沈降、大規模ゲルクロマトグラフィー(ゲルろ過)、逆相HPLC及びサイズ排除クロマトグラフィーを行うことでサケの肝臓から単離させることができる。サケ抗微生物性(SAM)タンパク質は、27.7kDの分子量を有することが判明し、これはヒストンH1タンパク質として同定された。WO 200110901において、ウシの胸腺由来の哺乳類ヒストンH1タンパク質は、様々な真核生物における微生物感染を治療するための抗微生物性組成物に用いられる。このようにして、他の周知の確立された機能を有するタンパク質が抗微生物性であることによって第2の性質を示すようである。
【0011】
しかしながら、ウシのタンパク質、とりわけウシの胸腺由来のタンパク質の使用は、材料が有害なウイルス、特に肝炎ウイルスや例えばプリオンなどのその他の病原体によって汚染され得るので、避けなければならない。ウシ由来の材料は、汚染されていようがなかろうが、ヒトに関連して使用することを意図する場合には非常に厳重に検査が行われなければならない。
【0012】
さらに、ヒトまたは家畜に関連して使用できる産物を得るために、新しい代替的な抗生物質の単離には、特定の動物の器官または組織を収集し、続いて複雑な精製作業が関与する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0013】
本発明の目的は、上記の問題を解消する新しい抗微生物剤を提供することである。
【0014】
本発明の別の目的は、ヒト及び/または動物に対して病原性を有する感染因子を伝播するリスクを回避する、抗微生物剤を提供することである。
【0015】
もう1つの別の目的は、食品に関連して使用される場合に味の無い抗微生物剤を提供することである。
【0016】
本発明のさらなる目的は、安価な出発原料を利用する、抗微生物剤を製造する方法を提供することである。
【0017】
その上、更なる目的は、実質的に無制限な規模で抗微生物剤を製造する方法を提供することである。
【0018】
その上、いっそう更なる目的は、細菌発酵に関して植物で製造するのに投資を必要としない抗微生物剤を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0019】
これらの目的は、請求項に記載の本発明の使用並びに方法によって達成される。
【0020】
本発明にしたがって、簡単で合理的な方法で、例えば、薬物、製造及び輸送の間の完全な保存剤、機能性食品及び/または栄養補助添加物ならびに動物飼料の添加物としての抗微生物製品として使用できるタンパク質成分の製造を可能にする方法が提供される。
【0021】
タンパク質成分は、植物クロマチンを含む元々は不活性な出発原料から驚くべき容易さで製造できる。本発明の方法において、DNAは塩基性核植物クロマチンから分離される。植物クロマチンは、植物の種子から得ることが好ましい。適切な植物の種子は、オート麦、雑実用モロコシ、ミロ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、米、菜種、大豆、粟または蕎麦から得られる。しかし、海草やその他の海洋植物などの植物材料から構成されるいずれのクロマチンもが、抗微生物性タンパク質成分の大規模な製造に用いることができる。
【0022】
タンパク質成分を単離させるのに用いる植物クロマチンは、ヘテロクロマチン(サイレントクロマチンまたは「ジャンク」DNA)であるべきである。ヘテロクロマチンは、低アセチル化された(アセチル基が取り除かれた)クロマチンで、これはより高い陽性電荷を有するために、高アセチル化されたクロマチンよりもより凝縮された構造を推測させる。
【0023】
それに加えて、さらなる特定のタンパク質抽出のためのクロマチン出発原料の選択は、植物細胞組織の位置と分化状態によっても決まる。例えば、小さな細胞から構成される組織は、より細胞密度が高くなるので、より大きな細胞サイズから構成される別の同量の組織よりも、多くの核酸とそれに付随する抗菌性タンパク質成分を含むであろう。
【0024】
同様に、多くの植物は高ヘテロクロマチンを含有するために、非常に大きな基底(basal)ゲノムサイズを担持し、それは、さらに倍数性の可能性によって増加される。これに関連して、1倍体細胞あたりの、塩基対の数で測定されるDNAの量(C値)が参照される。生物のDNA含有量におけるバラツキは、そのDNAのC値または基底ゲノムの大きさが反映する。C値は、生物の細胞内に存在するDNAの完全な配列の単一のコピー中の塩基対の重さまたは数によって測定されるDNAの含有量として定義される。C値とは、分類群の倍数性のレベルとは関係なく、複製されていない1倍体細胞または配偶子核における核DNAの量である。このように、C値は2倍体種におけるゲノムの大きさと同等であるが、倍数性種におけるゲノムの大きさよりも常に大きい。
【0025】
また、植物の自己再生型で未分化の幹細胞を用いることも好ましい。これらは、新芽や根端において新たな成長を促す領域である分裂組織中に見出される。従って、植物の苗木の根端は、本発明によるクロマチン抽出及びそれに続いて行なわれるタンパク質成分の単離を行なうにあたって優れた出発原料となる。このような原料は、醸造用麦芽や小麦の胚種油を製造する間における廃棄物なので、無制限的な量をたやすく手に入れることができる。
【0026】
最適な成長条件下にある有糸分裂性細胞を有するその他の植物原料もまた、本発明によるタンパク質成分の調製に適する。発芽段階にあるどのような発芽新芽や細根または胚芽でも使用できる。好ましくは、上記で挙げた穀物4種の内の1つの種子を用いて、発芽させるとよい。
【0027】
本発明において用いるのに安価な原料は、ビール製造の出発原料となる緑麦芽と呼ばれる物である。醸造産業では、緑麦芽は大麦を湿らせた後、6日間発芽させて製造される(麦芽製造)。この工業的に製造される緑麦芽またはその副産物(根っこや小枝の塊、ルートリングス(rootlings))は、本発明にしたがって、抗微生物性タンパク質成分を製造するのに用いることができる。
【0028】
従って、2倍体のトウモコロシや大麦(DNA C値5000Mbp)や玉ねぎ(DNA C値18000Mbp)の根っこや小枝の塊は、適切な抽出用出発原料である。好ましくは、抗菌性タンパク質成分は、DNAのC値が3000Mbpを超えるクロマチン源から抽出される。
【0029】
精製作業における出発原料は、S期にある増殖する植物細胞から単離された植物クロマチンを含むことが特に好ましい。発芽した種子(穀物)やそれに根っこや小枝の塊ならびに若葉は、このように、大量のS期にある細胞を含む。
【0030】
抗微生物活性を有する植物性タンパク質成分を製造する本発明の方法において、その方法は下記の工程:
植物クロマチンを露呈させるために植物材料をホモジナイズする工程、
疎水条件下で植物クロマチンを解離剤を用いて解離する工程、及び
上記の解離された植物クロマチン(植物性タンパク質成分を含む)を、疎水相互作用による分離手段を用いて、個々のフラクション(分画)に分離する工程
を含む。
【0031】
従って、まず植物材料はホモジナイズされる。これと関連して「ホモジナイズ化」という用語は、植物のクロマチンが露呈され、ホモジネートがスラリーとして得られるような態様での、植物材料の細胞壁の破壊を意味する。細胞壁は、限定する訳ではないが、高剪断混合、超音波処理、機械的破壊、圧力による破裂などを含む当業者には周知である任意の多くの方法によって破壊されてもよい。細胞壁は、ホモジネートが得られる適切な装置を用いて破壊される。
【0032】
次いで、ホモジネート中の植物クロマチンは、疎水条件下において、解離剤水溶液中の、解離剤によって解離される。かかる条件とは、疎水相互作用を促進させる条件である。
【0033】
適切な解離剤は、尿素、塩化グラニジン及び塩化物塩である。塩化物塩は、好ましくは高イオン強度を有する塩化ナトリウムである。
【0034】
植物材料のホモジナイズが解離剤中で行なわれると有利である。こうすることで、精製作業が単純化され、精製工程数が少なくて済む。
【0035】
緑麦芽の精製作業は、4Mの塩化ナトリウムを含むほとんど飽和化した食塩水における緑麦芽のホモジナイズ化によって開始される。高イオン強度は、クロマチンだけでなくヌクレオソームを解離させ、それと同時にプロテアーゼによるタンパク性物質の同時的な分解を防ぐ。ホモジナイズ化は、疎水性マトリックスの存在下で行なわれることが好ましい。
【0036】
次いで、ホモジネートは、ふるいやワイヤー網などの上で濾されることにより、それらの上に残っている細胞残留物や植物クロマチン由来のその他の粒子が取り除かれる。こうすることにより、これに続く解離されたクロマチンの精製を容易にする澄明な溶液が得られる。
【0037】
次いで、解離された植物クロマチン(抗微生物活性を有する植物性タンパク質成分を含む)は、個々のフラクション(分画)に分離(分取)される。上記の分離は、疎水相互作用による分離工程によって行なわれることが好ましい。上記の疎水相互作用による分離工程として、好ましくは疎水クロマトグラフィーがよい。
【0038】
好適な分離手段の他の例としては、分配クロマトグラフィー、向流分配、及びガスアフロン(gas aphron)分配などの高分子システムによる分配がある。解離されたクロマチン成分の分離は、代替的に、金属キレートゲルまたは固定化へパリンが施されたカラムで行なってもよい。
【0039】
疎水相互作用及び/または分離工程に用いるマトリックスの機能性リガンドは、エーテル、イソプロピル、ブチルまたはオクチル基であるべきであろう。フェニル基は避けなければならない。機能性リガンドは、好ましくは、4%が架橋したアガロースマトリックス上のブチル基である。40から50μmol/mlのリガンド密度を得ることができ、結果として1mlにつき7mg IgGの結合能が得られる。
【0040】
例えば、スラリーとしての緑麦芽のホモジネートのスクリーニングを行なった後、活性ブチル基を含む疎水相互作用クロマトグラフィーゲル(HIC)である疎水性マトリックスが、得られた溶液にバッチ式で加えられる。適切なマトリックスは、スウェーデン国、ブロマ、イノバータAB(InovataAB、Bromma、Sweden)によるノバローズ(Novarose)(登録商標)S−ブチル 1000/40及びスウェーデン国、アマシャム ファーマシア バイオテック(Amersham Pharmacia Biotech)によるブチルセファローズ(Sepharose)(登録商標)4である。次いで、疎水性マトリックスは高イオン強度の食塩水で洗浄され、DNAが洗い落とされる。
【0041】
次いで、マトリックスはカラム中に流し入れられ、低イオン強度の塩化ナトリウムを用いた段階的な勾配溶離にかけられる。はっきりと区別できる抗微生物性タンパク質成分が、1M NaClの濃度で溶離される。
【0042】
タンパク質成分は、ペプチド/タンパク質の精製に適切な従来的な方法によって更に精製されてもよい。上記の方法としては、遠心分離法、等電点での沈殿法、相分離法、限外濾過法、ゲルクロマトグラフィー(サイズ排除クロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィーまたはHPCL、ならびにこのような方法の組み合わせが挙げられる。これに続く分取工程としてゲルクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーが好ましい。
【0043】
分取ゲルクロマトグラフィーの工程は、100kDの排除限界を有するゲルが詰められたカラム内で行なわれることがより好ましい。カラムは、抗生物質作用を示す1M NaClのフラクションがロードされる前に、蒸留水で平衡化される。次いで、カラムは蒸留水または酢酸アンモニウムで溶離される。こうすることによって、1つの同じ工程において脱塩と精製が同時に行なわれる。こうして、タンパク質成分は、任意の更なる精製工程がなくとも、例えば凍結乾燥によって、乾燥状態まで濃縮されてよい。
【0044】
抗微生物的特性を示す、10から20kDの見かけ分子量を有するタンパク質フラクションが単離された。
【0045】
タンパク質成分の精製が、当業者に周知の他のたくさんの方法によって達成できることを当業者は理解するし、それらの方法のすべてが本発明によって企図されるものである。
【0046】
植物クロマチンを個々の成分に解離することを条件として、へパリン、アルギン酸、フィチン酸またはバナジウム化合物などの錯化剤を解離剤として用いることも可能である。抗生物質的に活性なタンパク質成分とでアルギン酸複合体が形成されるため、解離剤として、アルギン酸が特に好ましい。このような複合体は、精製の目的で使用され、またはそこから抗微生物活性を徐放させるものとして使用されてよい。
【0047】
本発明にしたがって、解離した植物クロマチンを、例えば疎水相互作用による分離作業によって個々のフラクションに分離する前には、解離された植物クロマチンの出発原料には抗微生物活性は全く発見することができなかった。本発明にしたがって植物性タンパク質成分を精製すると、ヘテロクロマチンが自動的に利用できる。このように、クロマチン成分の物理的な分離によって生物学的活性が引き続いて生じる。理論上、この分離工程は、成分の分子構造に結果として変化を生じさせ得るであろう。
【0048】
抗微生物性ペプチドは、陽電荷によって原核生物にそれらの作用を及ぼすことが一般的に認められている。本発明によって得られるタンパク質成分の最も可能性のある作用機序は、他のカチオン性ポリペプチドについて知られていることと異なるものであるとは予期されない。しかし、既知の塩基性ペプチドは、細胞膜との相互作用を可能にし、それは洗浄剤による相互作用を擬態する。タンパク質成分のこのような作用機序は、グラム陽性菌だけでなくグラム陰性菌に対して及ぼすその作用によって確認される。
【0049】
本発明にしたがって、抗微生物的に活性な他のタンパク質成分は、疎水性マトリックスから溶離された後の他の精製工程を用いて、その他の植物材料から得ることもできる。これは、異なる生物材料由来のタンパク質が、植物材料の細胞活性を反映する、異なった合成後の修飾パターンを示すという事実による。このように、分離のパターンは、本発明によって得られるタンパク質成分の、例えば、アセチル化、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、グリコシル化及びADP−リボシル化の程度によって影響されるのである。
【0050】
これに対応して、植物クロマチン由来の単離されたタンパク質成分は、これに続いて、化学的に修飾されてよい。このような修飾は、分子量の変化及び/またはアセチル化レベルの変化を含み、結果として、より特異的な生物的活性を有する調製形態をもたらすであろう。
【0051】
本発明の方法で得られるタンパク質成分の抗微生物効果は、対照物質として使用されるニシン(nisin)を用いた、標準化されたバイオスクリーン(Bioscreen)(登録商標)法で決定することができる。ニシンと比較して、2から4mg/mlに相応するタンパク質成分で殺菌効果が得られた。さらに、ニシンでは有さない、グラム陰性菌に対する効果が得られた。
【0052】
単純な本発明の精製法は、抗微生物性タンパク質成分の製造を実質的に無制限の規模で可能にする。かかる工程による収量は、1kgの原料(例えば根っこや小枝の塊)からタンパク質約1gである。例えば6日間麦芽にすることによって示されるように、最大のタンパク質合成を伴う発芽種子を用いると収量は最大となり得る。S期にある増殖している植物細胞を用いると、天然クロマチンタンパク質の合成は最大となり、最大で、合成された全タンパク質の80%を示し得る。
【0053】
本発明にしたがって植物クロマチンから単離される、抗微生物剤としてのタンパク質成分は、1つまたは複数の相乗効果を有する抗微生物剤と共に用いることで増強可能である。上記の相乗効果を有する抗微生物剤の例は、リゾチーム、プロタミン、キレート剤、第2銅化合物及びバクテリオシンである。
【0054】
植物クロマチンのタンパク質成分は、微生物感染を治療するための医薬組成物の製造に適している。また、本発明は、治療に有効量のタンパク質成分を投与することによる、ヒトを含む哺乳類における微生物感染を治療する方法にも関する。
【0055】
タンパク質成分は、歯及び歯茎の疾患(不調)を治療するための経口適用、皮膚科的疾患、皮膚及び髪の異常、及び、耳及び眼科的疾患などの、外部的な使用のための局所適用に用いることができる。植物クロマチンタンパク質成分は、口、喉、肺、膣及び直腸などの体腔、並びに、病原性微生物の消化による胃腸疾患の治療のための経口用に使用することもできる。
【0056】
タンパク質成分を抗微生物剤として使用する場合、様々な塩や緩衝液を含む緩衝化された水性媒体中に製剤化してもよい。塩は、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、または硫酸ナトリウムなどのアルカリ及びアルカリ土類ハロゲン化物であることが好ましい。緩衝液の目的のために緩衝液が生理学的に許容できる限り、クエン酸塩、リン酸塩、HEPES、トリスなどの様々な緩衝液を使用してもよい。
【0057】
タンパク質成分が凍結乾燥粉として剤形化される場合、引き続いて溶液で使用するために、様々な賦形剤またはその他の添加剤を使用してもよい。賦形剤には、様々なポリオール、不活性粉末またはその他の増量剤を挙げてもよい。
本発明の使用法には、細菌または菌類を殺すために有効量の精製されたタンパク質成分及び適切な担体を含む組成物も含まれる。かかる組成物は、細菌や菌類を退治するために様々な態様で、例えば当該技術分野で周知の担体を用いた、家庭内または実験室用の抗微生物製剤において、使用してよい。
【0058】
異なる組成物は、異なる生物に対して異なる活性度を有するであろう。細菌や菌類などの有害な微生物を殺すために使用される有効量、及びその他の有害物質は、当業者にはたやすく決定できる。
【0059】
また、本発明によるタンパク質成分は、タンパク質分解からタンパク質成分を保護するための予防剤として作用する他のタンパク質と組み合わせられてもよい。代わりに、本発明のタンパク質成分または組成物は、保存剤または殺菌剤として、コンタクトレンズの溶液、軟膏、シャンプー、医薬、食品などの、多種多様な製剤中に用いられてよい。タンパク質成分の量は、その他の成分の性質、必要とされる抗微生物保護の程度、及び組成物の意図する用途に応じて変動し得る。
【0060】
タンパク質成分は、例えば、適切な担体と共に、表面の消毒及び冷滅菌用組成物において、及び食品の高圧低温殺菌の補助剤として、並びに、例えば養魚における、水質保全剤としての組成物において、使用することが可能である。また、タンパク質成分は、包装材料に包装された場合に、そこから徐放されるように、細菌を殺すのに有効量で使用されてもよい。
【実施例】
【0061】
本発明は、これより、以下に記載の実施例を参照して、さらに記述されかつ描写される。しかし、これらの実施例はいかなる態様においても本発明を限定するものとして解釈されるべきではないことを留意されたい。
【0062】
実施例1.抗菌性アッセイ
マイクロタイタープレートのウェルを、300μlの成長培地(栄養培地(Nutrient Broth)+1%のブドウ糖)の濃度の2倍の濃度で充たした。デュプリケート(duplicate)の試料を、最終濃度が、それぞれ、2、0.5及び0.2mg/mlのタンパク質であるタンパク質成分に添加した。
【0063】
シュードモナス・フローレセンス(Fluorescens)(グラム陰性の好気性細菌)とリステリア・イノキュア(Innocua)(グラム陽性の好気性細菌)の2つの実験生物を用いた。
【0064】
細菌株の一晩培養物をペプトン水で希釈し、50μlの各株を104 細胞/mlの濃度でウェルに添加した。テスト材料が含まれていない、参照ウェル(陽性対照)を使用した。
【0065】
プレートは30℃で72時間、バイオスクリーン(登録商標)分析装置において培養され、細菌の成長は可視光における吸光度の増加として毎15分おきに記録された。
【0066】
実施例2.抽出及び分画
植物タンパク質及びポリペプチドを抽出及び分画する場合に、植物組織の構造、生理及び生化学が異なるために、現在または従来の動物緩衝液及び/または浸漬の技術を適用できないことはよくあることである。植物組織内の高分子組成物及び相互作用がより複雑であって(例としてフェノール、炭水化物及び炭化水素の化合物)、かつ細胞壁がより緻密であればあるほど、ポリペプチドの完全性(integrity)を確保するために、植物抽出物の調製におけるより厳密な浸清及び単離法が必要となる。
【0067】
大麦の葉(生葉の重量で1kg)に、Langenbuch et al、Plant Molecular Biology2、207−220(1983)に記載の抽出及び分画工程を実施した。0.4Nの硫酸を用いて、10から20mgの標準的な収量で大麦の核クロマチンが得られた。
【0068】
次いで、タンパク質成分の大規模な分取単離を可能とする、特別な亜分画(サブフラクショネーション(subfractionation))技術を行なった。エタノール(80%):HCl(0.25N)における異なる溶解性によって、特定のタンパク質成分(MW17,300)が得られた。
【0069】
標準的な、社内の(in house)リステリア及びシュードモナス株に対する抗微生物活性に関して、タンパク質成分をアッセイした。
【0070】
エタノールと水の両方に溶解するフラクションを用いることにより、両方の生物の全体的な成長阻害が得られた。効果は濃度依存性であった、言い換えれば、所定の閾値に達しなければならない(希釈1:1では効果は得られない)。
【0071】
抗微生物活性は、MW17,300の特定のタンパク質成分に専ら限定される。これより大きなタンパク質成分では、活性は得られなかった。
【0072】
実施例3.代替的な抽出及び分画
2週齢のエンドウ豆、小麦、ライ麦及び綿の苗木に、Sidorova & Konarev、Biokhimiia 46、1298(1981)に従って、亜分画手順を実施した。
【0073】
MW17,300の特定のタンパク質成分だけでなく、それより大きなタンパク質成分が得られた。
【0074】
抗微生物活性に関してタンパク質成分をアッセイし、その結果は実施例1で得られたものと同じであった。
【0075】
実施例4.改良された分画手順
緑麦芽は地元の醸造所から入手した。その麦芽は、従来の麦芽製造法で6日間発芽されたものだった。
【0076】
緑麦芽(100g)は4M NaCl中に懸濁され、ブラウンミキサー(Braun mixer)で約10分間ホモジナイズされた。ホモジネートは20μmのふるいを通して濾過され、次いで、得られた溶液は、4M NaClで平衡化された、20gの疎水性マトリックス(Novarose(登録商標) S−Butyl 1000/40 Inovata AB、Sweden)に添加された。この混合物は10分間攪拌され、マトリックスは40μmのふるいを通して濾過された。
【0077】
次いで、マトリックスはカラム(25×50mm)中に詰められ、溶離される前に4M NaClで洗浄された。254nmでの溶離液の増加した吸光度によって決定されたように、この高イオン強度では、DNAはマトリックスに結合せず、したがって、カラムに詰めて洗浄する工程の間に溶離されたのであろう。
【0078】
2M NaCl、1M NaCl及び水で、それぞれ、順次溶離した後に、はっきりと区別できるタンパク質のピークが、276nmでの紫外線の吸収を利用することによって記録された。これは、2M NaClでの非クロマチン物質の脱着に相当する。
【0079】
実施例5.亜分画(サブフラクショネーション)の手順
実施例4で1M NaClにおいて脱着したフラクションは、ノヴァローズ(Novarose)(登録商標)SE−100/40(Inovata AB、Sweden)のカラム(25×500mm)上で、0.1M酢酸アンモニウムで分取ゲルクロマトグラフィーによって更に亜分画された。
【0080】
3つのタンパク質フラクションが得られ、凍結乾燥された。真ん中のタンパク質フラクションは、10から20kDの分子量に相当する保有量を有していた。
【0081】
従って、植物クロマチンは、高い陽性電荷を有する、かかる分子量範囲の低アセチル化された疎水性塩基タンパク質における単離のための都合の良い供給源である。
【0082】
ノヴァローズ(登録商標)SE−100/17(Inovata AB、Sweden)のカラム(8×300mm)上で、0.1Mのリン酸緩衝液pH7.0において分析的ゲルクロマトグラフィーを行なった結果、かかるフラクションは約14kDの平均分子量に相当することが分かった。
【0083】
実施例6.代替的な分画手順
実施例4におけるのと同じ条件だが、疎水性マトリックスとしてノヴァローズ(登録商標)S―フェニル(Inovata AB、Sweden)を用いた、比較実験を実施した。1M NaClでカラムを溶離した場合にはタンパク質の脱着は何ら検出できず、水で溶離した後にはただ1つのフラクションが得られた。水に22%のエタノールが含まれた溶液を用いても、疎水性マトリックスからタンパク質物質の脱着が生じなかったことは、マトリックスとタンパク質物質との間の結合はきわめて疎水性であることを示している。
【0084】
実施例7.抗微生物活性の確立
実施例5に従って得られた真ん中のフラクションは、その抗微生物活性に関連して更に調べられた。凍結乾燥されたフラクションをリン酸緩衝液(pH7.0)において4mg/mlの濃度まで溶解することによって、試料を調製した。次いで、これらの溶液はリン酸緩衝液を用いて4倍から10倍に希釈された。
【0085】
得られた結果は、実施例4及び5におけるプロトコルにしたがって調製した場合の、MW17,300の特定のタンパク質成分によって実施例5で得られた結果と切り離せないものである。
【0086】
ゲルクロマトグラフィー工程によって得られたその他のフラクションでは何らの抗微生物活性もまったく示されなかったことに留意されたい。
【0087】
実施例8.C値の効果
同様の抗微生物活性を有するタンパク質成分が、実施例4及び5で記述されたのと同じ工程を用いて、72時間のシロイヌナズナ及び小麦の苗木のクロマチンから単離された。これらの種由来の、10から20kDを有する真ん中のフラクションの平均収量は著しく異なっており、小麦は非常に好適な抽出源である。大麦と比べると、所望のフラクションは約2倍の量で存在する。
【0088】
実施例9.分析的電気泳動
標準的なプロトコルに次いで行なわれる分析的電気泳動(Panyim & Chalkley、Biochem、8:3972、1969)により、MW17,300を有する特定のタンパク質成分の多数のバリアントが示され、28,000から35,000の分子量を有する、より高分子量のタンパク質成分の亜分画(サブフラクション)は何ら存在しない。
【0089】
これらの結果は、植物種間でのゲノムの大きさの相違をも反映する。シロイヌナズナは小さな200Mbpの2倍体ゲノムを有し、これに対応して、17,000Mbpの大きな6倍体ゲノムを有する小麦よりも収量は低くなる。
【0090】
従って、抽出収量はC値として表されるゲノムの大きさに密接に関連する。
【0091】
比較例1. 動物のヒストンとの比較
実施例5にあるように、緩衝化した分離用媒体における分析的クロマトグラフィーにより、子牛のヒストンH2A及びH2Bの分子量に相当する約14kDの分子量が得られたので、本発明によるタンパク質成分と動物ヒストンとの間での比較を実施した。
【0092】
市販の子牛のヒストンH2A及びH2B(Sigma、USA)と、実施例4において得られた10から20kDの分子量を有する真ん中のフラクションとの、並行的な比較実験を、ノヴァローズ(登録商標)SE−100/17(Inovata AB、Sweden)のカラム(8×300mm)上で、0.1MのpH7.0のリン酸緩衝液において、分析的ゲルクロマトグラフィーを用いて実施した。
【0093】
得られた全てのフラクションを抗菌活性に関してアッセイしたところ、植物クロマチンから単離されたタンパク質成分において肯定的な結果が繰り返し得られた。
【0094】
別の比較実験では、植物ヒストンH1であると予期される位置での、第1のフラクションによる抗微生物活性は示されず、ほとんど皆無に近かった。さらに、食塩水におけるヌクレオソームの解離パターンは動物と植物とで異なり、動物に用いられる標準プロトコルが植物には使用できないことが再確立される。
【0095】
比較例2. 水性溶媒の抽出
植物組織の全ポリペプチドの抽出を可能にする方法はほとんど利用できない。使用される方法は、亜細胞成分が豊富な様々な組織のフラクションの分取に好ましい。対照的に、多数の多かれ少なかれ「普遍的な」分取技術が動物系に関して記述されてきた。
【0096】
かかる技術はカレン・バレット(Karen Barrett)によって米国特許第5698200号において研究されており、麦芽入り穀物のいくつかの単純な水性溶媒抽出物が調べられている。
【0097】
米国特許第5698200号における実施例1及び2で開示されるのと同様の、下流の(downstream)方法が、大麦の葉(参照:実施例2)を出発原料として用いて使用された。
【0098】
10から20kDの範囲にある貯蔵タンパク質のみが同定された。これらのタンパク質は、抗菌活性を全く示さない。
【0099】
出発原料が細胞性物質である、米国特許第5698200号に記述されるどの方法によっても、クロマチンは放出できないと結論付けられる。最も多くは、2から3kDという低分子量の細胞傷害性硫黄ポリペプチドとして特徴付けられる、周知の植物ディフェンシンであるチオニンが得られた。
Claims (25)
- 植物クロマチンの解離後に前記植物クロマチンから単離した10から20kDの見かけ分子量を有することを特徴とするタンパク質成分の、抗菌剤としての使用(ただし、ヒトの治療に用いる場合を除く)。
- 前記植物クロマチンは分子量14,000または17,300であることを特徴とする請求項1に記載の使用。
- 前記植物クロマチンはヘテロクロマチンであることを特徴とする請求項1または2に記載の使用。
- 前記植物クロマチンは3000Mbpを超えるDNAのC値を有することを特徴とする請求項1から3のいずれか1項に記載の使用。
- 前記植物クロマチンは植物の種子から得られることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載の使用。
- 前記植物の種子はオート麦、小麦、大麦、ライ麦、とうもろこし、米、菜種、大豆、粟、または蕎麦の実から得られることを特徴とする請求項5に記載の使用。
- 前記植物クロマチンは発芽した状態の前記種子から得られることを特徴とする請求項5または6に記載の使用。
- 前記抗菌剤はグラム陽性菌ならびにグラム陰性菌に対して作用することを特徴とする請求項1から7のいずれか1項に記載の使用。
- 前記グラム陽性菌はリステリア・イノキュア(Listeria innocua)であることを特徴とする請求項8に記載の使用。
- 前記グラム陰性菌はシュードモナス・フローレセンス(Pseudomonas fluorescens)であることを特徴とする請求項8に記載の使用。
- 錯化剤と複合し、そこから徐放されることを特徴とする請求項1から10のいずれか1項に記載のタンパク質成分の使用。
- 前記錯化剤はアルギン酸であることを特徴とする請求項11に記載の使用。
- 食品添加物としての組成物における、適切な担体、及び細菌を殺すために有効量の請求項1から12のいずれか1項に記載のタンパク質成分の使用。
- 成長を促進する家畜飼料添加物としての組成物における、適切な担体、及び請求項1から12のいずれか1項に記載のタンパク質成分の使用。
- 表面の消毒及び冷滅菌用組成物における、または食品の高圧低温殺菌の補助剤としての、適切な担体、及び細菌を殺すために有効量の請求項1から12のいずれか1項に記載のタンパク質成分の使用。
- 包装材料に包装され、そこから徐放されることを特徴とする、細菌を殺すために有効量の請求項1から12のいずれか1項に記載のタンパク質成分の使用。
- 水質保全剤としての組成物における、適切な担体、及び細菌を殺すために有効量の請求項1から12のいずれか1項に記載のタンパク質成分の使用。
- 養魚における請求項17に記載の使用。
- 細菌感染を治療するための医薬組成物の製造における、植物クロマチンの解離後に前記植物クロマチンから単離した10から20kDの見かけ分子量を有するタンパク質成分の使用。
- 前記植物クロマチンは分子量14,000または17,300であることを特徴とする請求項19に記載の使用。
- 前記細菌感染が歯または歯茎の異常であることを特徴とする請求項19または20に記載の使用。
- 前記細菌感染が皮膚科の異常であることを特徴とする請求項19または20に記載の使用。
- 前記細菌感染が皮膚または毛の異常であることを特徴とする請求項19または20に記載の使用。
- 前記細菌感染が耳・眼科の異常であることを特徴とする請求項19または20に記載の使用。
- 前記細菌感染が病原性細菌の消化による胃腸の異常であることを特徴とする請求項19または20に記載の使用。
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