JP2003529371A - ヒトセリンラセマーゼ - Google Patents

ヒトセリンラセマーゼ

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Abstract

(57)【要約】 本発明はヒトセリンラセマーゼのポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。前記ポリヌクレオチド及びポリペプチドは更に発現ベクター、前記ベクター、プローブ及びプライマーを含む宿主細胞、セリンラセマーゼタンパク質及びそのポリペプチドに対する抗体、セリンラセマーゼの存在または発現のためのアッセイ、セリンラセマーゼと相互作用する化合物を同定するためのアッセイ、及びヒトセリンラセマーゼを発現するトランスジェニック動物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ヒトセリンラセマーゼ、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、
及びヒトセリンラセマーゼによるセリンのラセミ化の生成を測定するアッセイに
関する。
【０００２】 （発明の背景） Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体の活性化を防止すること
は、卒中、てんかん、慢性疼痛、パーキンソン病及びハンチントン病、うつ病、
不安症や緑内障を含めた数種の臨床適応症に対する有力な治療方法と考えられる
。ＮＭＤＡ受容体上にグルタメート部位及びグリシン部位の２つのアゴニスト結
合部位があり、両部位は受容体を活性化するためにアゴニストを結合しなければ
ならない。活性化の阻止方法には、競合的グルタメート部位アンタゴニストの使
用及び受容体イオンチャネルブロッカーの使用が含まれる。グリシン部位をブロ
ックすることにより受容体の活性化を拮抗させる代替方法も有望であり、この方
法ではグルタメート部位アンタゴニストと比較して副作用が少ない。
【０００３】 セリンラセマーゼは、Ｌ−セリンのＤ−セリンへの変換を触媒する酵素である
。インビトロで、Ｄ−セリンはグリシンリガンド部位に選択的に結合することに
よりＮＭＤＡ受容体複合体の活性化に対するコアゴニストとして機能すると理解
されている（Ｉｖａｎｏｖｉｃら，１９９８；Ｍｉｙａｚａｋｉら，１９９９）
。グリシンとは対照的に、Ｄ−セリンはストリキニン非感受性部位のみを活性化
し、ストリキニン感受性部位を活性化しない。
【０００４】 高濃度のＤ−セリンがヒト神経系を含めた哺乳動物中枢神経系中で検出された
（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ及びＯｋａ，１９９７）。免疫組織化学的研究及びｉｎ
ｓｉｔｕハイブリダイゼーション研究は、脳ではＤ−セリン分布がグリシンより
もＮＭＤＡ受容体（ＮＲ２Ａ／ＮＲ２Ｂ）の発現により良く相関していると報告
している（Ｓｃｈｅｌｌら，１９９７ａ，１９９７ｂ）。
【０００５】 ＮＲ２ＡやＮＲ２ＢのようなＮＭＤＡ受容体はかなりカルシウム透過性である
。卒中及び幾つかのニューロン疾患のような病理学的状態では、多くのグルタメ
ートが放出されると星状細胞からＤ−セリンが放出され、ＮＭＤＡ受容体が長く
活性化される。このカスケードにより、細胞内でカルシウムがオーバーロードす
るためにしばしばニューロン細胞死を招く恐れがある。
【０００６】 Ｄ−セリン濃度の変動が生理学的及び病理学的プロセス中のＮＭＤＡ受容体活
性化の程度を決定する際に重要な役割を果たす（Ｄａｌｋａｒａら，１９９０）
。Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの適用により内因性Ｄ−セリンを選択的に除去する
と脳切片研究及び細胞培養調製物においてＮＭＤＡ受容体活性化が非常に低くな
ると報告された（Ｗｏｌｏｓｋｅｒら，１９９９）。この所見は、Ｄ−セリンレ
ベルを低下させるとＮＭＤＡ受容体の活性化を抑制し得ることを示している。
【０００７】 セリンラセマーゼは細胞中のＤ−セリン濃度の重要な調節剤であるので、この
酵素を阻害するとＮＭＤＡ受容体の活性化に利用し得るＤ−セリンの濃度が低下
すると予想される。受容体それ自体上の部位を拮抗させるよりもむしろ受容体リ
ガンドを調節することは上流調節ポイントであるという利点を有し、容易にコン
トロールし得る。
【０００８】 最近、マウスセリンラセマーゼがクローン化され、発現された（Ｗｏｌｏｓｋ
ｅｒら，１９９９）。マウスセリンラセマーゼは３６．３ｋＤａの予想分子量を
有する３３９アミノ酸のタンパク質である。ウェスタンブロット分析は約３８ｋ
Ｄａで単一バンドタンパク質を示した。ピリドキサル−５’ホスフェート（ＰＬ
Ｐ）依存性アミノ酸ラセマーゼのメンバー１つであるセリンラセマーゼ中にはＰ
ＬＰ結合領域がある。ＰＬＰはその活性のために必要である（Ｗｏｌｏｓｋｅｒ
ら，１９９９ｂ）。しかしながら、生理学的及び病理学的状態のときに前記酵素
を調節することは現在考えられていない。
【０００９】 （発明の要旨） 本発明は、ヒトセリンラセマーゼをコードするポリヌクレオチド、セリンラセ
マーゼポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞、セリンラセマーゼポリペプチド
、及びセリンラセマーゼ活性のアッセイを実施するための前記したポリヌクレオ
チド、ポリペプチド及び宿主細胞の使用方法を提供する。
【００１０】 特に、ヒトセリンラセマーゼの組換えポリヌクレオチド及び組換えポリペプチ
ドを提供する。組換えセリンラセマーゼ酵素はセリンのラセミ化において触媒的
に活性である。前記酵素は、セリンラセマーゼ活性を変更する、酵素と相互作用
するまたはセリンラセマーゼの発現を変化させる化合物をスクリーニングするた
めにインビトロ及び全細胞アッセイにおいて使用される。本発明は、組換えポリ
ヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドによりコードされる組換えタンパク質、組
換え酵素を発現する宿主細胞、組換え酵素を発現する宿主細胞、プローブ及びプ
ライマーから作成される抽出物、並びに前記分子のアッセイにおける使用を包含
する。
【００１１】 本発明の１態様は、セリンラセマーゼタンパク質をコードする配列または相補
的配列を有するポリヌクレオチドである。特定実施態様では、コード化タンパク
質は配列番号２に相当する配列を有する。他の実施態様では、コード化タンパク
質はタンパク質の自然に存在する突然変異体または多型形態であり得る。好まし
い実施態様では、前記ポリヌクレオチドはＤＮＡ及び／またはＲＮＡであり得、
一本鎖または二本鎖のいずれであってもよい。特定実施態様では、前記ポリヌク
レオチドは自然、非自然または修飾ヌクレオチドから構成されている。幾つかの
実施態様では、ヌクレオチド間結合は自然に存在する結合である。他の実施態様
では、ヌクレオチド間結合は非自然結合であるかまたは自然結合と非自然結合結
合の混合であり得る。最も好ましい実施態様では、前記ポリヌクレオチドは配列
番号１に含まれるコード配列を有する。別の好ましい実施態様では、前記ポリヌ
クレオチドは自然に存在する突然変異または多型セリンラセマーゼポリペプチド
の同等配列を有する。
【００１２】 本発明の態様は、セリンラセマーゼタンパク質をコードする自然ポリヌクレオ
チドに特異的な少なくとも２５個の隣接ヌクレオチドの配列を有するポリヌクレ
オチドである。特に好ましい実施態様では、この態様のポリヌクレオチドはセリ
ンラセマーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在の特異的検出のた
めのプローブとして有用である。他の特定実施態様では、この態様のポリヌクレ
オチドはセリンラセマーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在の特
異的検出のための核酸増幅アッセイで使用するためのプライマーとして有用であ
る。好ましい実施態様では、この態様のポリヌクレオチドは追加の成分を含んで
いてもよく、この成分にはプローブまたはプライマーを検出するための化合物、
アイソトープ、タンパク質または配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００１３】 本発明の態様は、セリンラセマーゼタンパク質をコードするポリヌクレオチド
または相補的配列及び調節領域を含む発現ベクターである。特定実施態様では、
コード化タンパク質は配列番号２に相当する配列を有する。特定実施態様では、
前記ベクターはベクターを使用し得る宿主細胞のタイプに対して適当であるとし
て当業界で公知であり、使用されている各種調節領域を有し得る。最も好ましい
実施態様では、前記ベクターはヒト宿主細胞におけるコード化タンパク質の発現
のために好適な調節領域を有する。他の実施態様では、前記ベクターはバクテリ
ア、シアノバクテリア、放線菌、または酵母や昆虫細胞を含めた各種真核細胞に
おけるコード化タンパク質の発現のために適当な調節領域を有する。幾つかの好
ましい実施態様では調節領域は誘導的発現を与え、他の好ましい実施態様では調
節領域は構成的発現を与える。最後に、この態様によれば、発現ベクターはプラ
スミド、ファージ、ウイルス、人工染色体またはその組合せから誘導され得る。
【００１４】 本発明の態様は、セリンラセマーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドまたはその相補的配列及び適当な調節領域を含む発現ベクターを含む宿主細胞
である。特定実施態様では、前記ベクターによりコードされるポリペプチドは配
列番号２に相当するアミノ酸配列を有する。好ましい実施態様では、宿主細胞は
真核細胞、酵母、昆虫細胞、グラム陽性バクテリア、シアノバクテリアまたは放
線菌である。最も好ましい実施態様では、宿主細胞はヒト細胞である。
【００１５】 本発明の態様は、宿主細胞におけるセリンラセマーゼタンパク質の発現方法で
ある。この態様では、宿主細胞をセリンラセマーゼタンパク質をコードするポリ
ヌクレオチドまたはその相補的配列を含む発現ベクターを用いて形質転換または
トランスフェクトする。この態様によれば、宿主細胞をコード化セリンラセマー
ゼタンパク質の発現に対して誘導的な条件下で培養する。特定実施態様では、発
現は誘導的または構成的である。特定実施態様では、コード化タンパク質は配列
番号２に相当する配列を有する。
【００１６】 本発明の態様は、配列番号２のアミノ酸配列またはタンパク質の自然に存在す
る突然変異体または多型形態の均等配列を有する組換えセリンラセマーゼポリペ
プチドである。
【００１７】 本発明の態様は、候補化合物がセリンラセマーゼポリペプチドの活性を変更し
得るかどうかを調べる方法である。この態様によれば、ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドは特定宿主細胞にとって適当な発現ベクターを構築するため
に使用される。前記宿主細胞を発現ベクターで形質転換またはトランスフェクト
し、セリンラセマーゼポリペプチドの発現に対して誘導的な条件下で培養する。
細胞を場合により破壊し、場合により膜を遠心により回収する。所望によりセリ
ンラセマーゼを精製してもよく、細胞抽出物を直接使用してもよい。細胞、細胞
抽出物、膜、または細胞から精製したセリンラセマーゼポリペプチドを候補化合
物と接触させる。最後に、候補化合物の存在下でセリンラセマーゼポリペプチド
の活性を測定する。活性が候補化合物の非存在下での酵素の活性と比して低い場
合には、該候補化合物はセリンラセマーゼポリペプチトの阻害剤である。好まし
い実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質またはその自然に存在する突然変異体または多型形態をコードする。他の好
ましい実施態様では、ポリヌクレオチドは配列番号１の配列を有する。特定実施
態様では、セリンラセマーゼの相対活性をセリンラセマーゼの活性を対照と比較
して求める。幾つかの実施態様では、宿主細胞を候補化合物と接触させ、セリン
ラセマーゼタンパク質の活性をセリンラセマーゼ機能（例えば、ＮＭＤＡ受容体
の活性化）に依存する細胞表現型を測定することにより求める。本発明のこの態
様によれば、複数の条件下でのセリンラセマーゼ活性について以前に測定した活
性値または予想活性値と比較することにより相対活性を求めることができる。し
かしながら、好ましい実施態様では、候補化合物と接触させていない対照サンプ
ル中のセリンラセマーゼ活性を測定することにより相対活性を求める。特定実施
態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞であり、阻害されるタンパク質は哺乳動物細
胞により産生される組換えセリンラセマーゼである。
【００１８】 「約」は特定値よりも１０〜２０％の範囲内で多いまたは少ないことを意味す
る。
【００１９】 本明細書中、「アゴニスト」はセリンラセマーゼと相互作用し、セリンラセマ
ーゼの活性を刺激する化合物または分子である。
【００２０】 本明細書中、「アンタゴニスト」はセリンラセマーゼと相互作用し、セリンラ
セマーゼの活性を干渉する化合物である。
【００２１】 本明細書中、「阻害剤」はセリンラセマーゼと相互作用し、セリンラセマーゼ
によるセリンのラセミ化の触媒からセリンラセマーゼを阻害または防止する化合
物である。
【００２２】 本明細書中、「モジュレーター」は、細胞中、細胞の表面上またはペリプラズ
ム中、或いは周囲の血清または媒体中に存在するセリンラセマーゼのポリペプチ
ドの量の増加または減少に影響を与えるように細胞生化学的に相互作用する化合
物である。セリンラセマーゼポリペプチドの量の変化はタンパク質の発現に対す
るモジュレーターの影響、例えばタンパク質の転写、翻訳、翻訳後プロセッシン
グ、トランスロケーションまたはホールディングにより、またはタンパク質の発
現に直接的もしくは間接的に関わる細胞生化学の成分に影響を与えることにより
媒介され得る。或いは、モジュレーターは、タンパク質と直接相互作用すること
によりまたは前記変化に直接的もしくは間接的に影響を及ぼす細胞生化学の別の
成分と相互作用することによりタンパク質のターンオーバーを促進または減速さ
せることにより作用し得る。
【００２３】 本発明の態様は、組織研究及び動物におけるセリンラセマーゼ遺伝子の一時性
特異的発現または活性の研究のために有用なヒト以外のトランスジェニック動物
である。前記動物は、インビボではセリンラセマーゼの活性または発現のアゴニ
スト、アンタゴニストまたは阻害剤としての各種化合物の作用能力を研究するた
めに、或いはインビトロで培養またはアッセイのための細胞を用意することによ
り使用される。本発明のこの態様の実施態様では、動物は機能的内因性セリンラ
セマーゼ遺伝子を欠いている。別の実施態様では、動物は内因性遺伝子の発現の
非存在下で非自然セリンラセマーゼ遺伝子を発現する。特定実施態様では、非ヒ
ト動物はマウスである。更なる実施態様では、非自然セリンラセマーゼ遺伝子は
野生型ヒトセリンラセマーゼ遺伝子または突然変異セリンラセマーゼ遺伝子であ
る。
【００２４】 本明細書で引用されている文献はすべて援用により背景材料として本明細書に
含まれるとする。
【００２５】 （発明の詳細説明） 本発明は、本明細書中で「セリンラセマーゼ」と称するヒトセリンラセマーゼ
のポリヌクレオチド及びペリペプチドを提供する。前記ポリヌクレオチド及びポ
リペプチドは、更に発現ベクター、前記ベクター、プローブ及びプライマーを含
む宿主細胞、セリンラセマーゼタンパク質及びそのポリペプチドに対する抗体、
セリンラセマーゼの存在または発現に関するアッセイ、並びにセリンラセマーゼ
と相互作用する化合物を同定するためのアッセイを提供するために使用される。
【００２６】 Ｌ−セリンはタンパク質中に存在するアミノ酸である。Ｄ−セリンは通常タン
パク質中に含まれていないが、人体、特に神経系の組織中に僅かに分布している
。Ｄ−セリンはＮＭＤＡ受容体のリガンドであり、ＮＭＤＡ受容体の活性化に必
要であると考えられている。Ｄ−セリン及びＬ−セリンはセリンラセマーゼによ
り相互に変換可能である。従って、セリンラセマーゼの活性を変化させることは
ＮＭＤＡ受容体の活性化を変えることを意味すると考えられる。
【００２７】 本発明は、ＥＳＴデーターベースの検索及びＤＮＡ配列決定を組み合わせた方
法を用いてクローン化したヒトセリンラセマーゼ酵素をコードするｃＤＮＡを提
供する。完全長ｃＤＮＡの配列から、セリンラセマーゼの３４１アミノ酸のタン
パク質をコードする１０２３ヌクレオチドのオープンリーディングフレームが予
測される。予測されたタンパク質は、Ｗｏｌｏｓｋｅｒら，１９９９が報告して
いるマウスセリンラセマーゼと８９％の同一性を示す。このヒト酵素のｍＲＮＡ
発現のノーザンブロット分析から、脳、心臓、骨格筋、腎臓及び肝臓で発現され
ることが示された。ヒトセリンラセマーゼ遺伝子は、ＧＥＮＥＢＲＩＤＧＥ ４
ラジエーションハイブリッドパネル及びＳｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ラジエーション
ハイブリッドパネルを用いることにより染色体１７ｐ１３にマッピングされた。
【００２８】 Ｄ−セリンのＮＭＤＡ受容体グリシン部位に作用する薬物が現在開発されてい
る（Ｄａｎｙｓｚ及びＰａｒｓｏｎｓ，１９９８）。適応される治療用途には、
卒中、うつ病及び慢性疼痛に対する治療が含まれる。ヒトセリンラセマーゼの発
見から病状に対する別の治療方法が提供される。Ｄ−セリンはＮＭＤＡ受容体（
グリシン部位）に対する内因性アクチベーターであると報告されており、Ｄ−セ
リンのレベルは大うつ病（Ａｌｔａｍｕｒａら，１９９５）、発作（Ｒｏｎｎｅ
ｅｎｇｓｔｒｏｍ，１９９２）及び虚血（Ｈｉｒａｉ及びＯｋａｄａ，１９９３
）のような病的状態のときに変化する。従って、セリンラセマーゼ活性の調節は
前記病状に対する合理的なアプローチである。
【００２９】 慢性疼痛状態及び疼痛過敏におけるＮＭＤＡ受容体の重要な役割は公知である
（Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，１９９０；Ｃｏｄｅｒｒｅ，１９９３）。しかしながら
、ＮＭＤＡ受容体ブロッカーは２つの潜在的に重大な副作用、すなわち帯状束／
後方板状皮質における神経変性変化及び精神異常様副作用を有する。最近の知見
で、Ｄ−セリンも痛覚過敏及び疼痛において重要な役割を果たすことが示唆され
ている。Ｊｕｎら（１９９８）及びＣａｒｌｔｏｎら（１９９８）は、Ｄ−セリ
ンがｇａｂａｐｅｎｔｉｎ抗痛覚過敏活性の効果を逆転させたことを知見した。
Ｄ−セリンを鞘内投与すると結腸直腸(coloretal)拡張に対する多受容性脊髄ニ
ューロンの侵害受容応答が強化された（Ｋｏｌｅｋａｒ及びＧｅｂｈａｒｔ，１
９９６）。従って、Ｄ−セリン濃度を低下させ、グリシン部位での活性化を抑え
るセリンラセマーゼの阻害剤は副作用を殆ど生じない用量で慢性疼痛の発生を阻
止する。セリンラセマーゼ阻害剤と他のＮＭＤＡ受容体アンタゴニストの組合せ
はそれぞれの単独治療よりも優れたより効果的な治療である。
【００３０】 卒中後に見られるグルタメートの大量放出に続くＮＭＤＡ受容体の活性化はニ
ューロパシー事象を伴う神経損傷に関与すると考えられている。Ｋａｎｔｈａｎ
ら（１９９５）は、インビボ微量透析法でモニターしたときセリン、グルタミン
及びグリシンの細胞外濃度はヒト脳の側頭葉の刺激虚血モデルにおいて劇的に上
昇したと報告した。従って、セリンラセマーゼの阻害はＮＭＤＡ媒介卒中及びグ
ルタメート興奮毒性が病態生理学役割を果たす神経変性疾患に対する治療標的を
与える。
【００３１】 ＰＣＰのような高アフィニティーＮＭＤＡチャネルブロッカーはヒトにおいて
神経分裂病の陽性及び陰性症状を呈する（Ｊａｖｉｔｔ及びＺｕｋｉｎ，１９９
１）。更には、Ｄ−セリンで抑えると、精神分裂病患者の陽性、陰性及び認識症
状がかなり改善された（Ｔｓａｉら，１９９８）。従って、精神分裂病の病態生
理はＮＭＤＡ受容体の機能低下に結びつけられ得、セリンラセマーゼのアゴニス
トは精神分裂病の治療のために有用であろう。
【００３２】 脊髄小脳運動失調は最も一般的な神経疾患の１つである。しかしながら、この
疾患に有効な化合物は数少ない。Ｓａｉｇｏｈ（１９９８）は最近、Ｄ−セリン
エチルエステルを腹腔内投与するとマウス小脳中の内因性Ｄ−セリンの細胞外含
量が増加し、シトシンアラビノシド誘発運動失調を有するマウスの下降指数(fal
ling index)は低下すると報告した。従って、セリンラセマーゼのアゴニストは
脊髄小脳運動失調の治療において有用であり得る。
【００３３】 ポリヌクレオチド 本発明において有用なポリヌクレオチドには、本明細書に記載されているポリ
ヌクレオチド及び本明細書の教示に従って当業者が本明細書に記載されているポ
リヌクレオチドから誘導し得るものが含まれる。本発明の好ましい態様は、ヒト
セリンラセマーゼポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドである。１
つの好ましい実施態様は、配列番号１に開示されており、以下に示す配列を有す
る核酸である。
【００３４】
【化１】
【００３５】 特に好ましい実施態様は、配列番号１のセリンラセマーゼの全コード配列を含
むポリヌクレオチドである。
【００３６】 本発明の単離核酸分子には、１本鎖（コーディングまたは非コーディング鎖）
または２本鎖であり得るリボ核酸またはデオキシリボ核酸分子、並びに合成した
１本鎖ポリヌクレオチドのような合成核酸が含まれ得る。
【００３７】 本発明はまた、本明細書に開示の組換え核酸分子を含む真核及び原核の組換え
ベクター及び組換え宿主に関する。
【００３８】 本明細書中、「ポリヌクレオチド」は２つ以上のヌクレオチドの核酸である。
ポリヌクレオチドは、まとめて“単位”と称する複数のポリヌクレオチド単位か
ら構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドはその境界内にコード配列を有する
ポリヌクレオチド、調節領域であるポリヌクレオチド及び／または当業界で慣用
されている他のポリヌクレオチド単位を含み得る。
【００３９】 「発現ベクター」は、宿主細胞中にあるとき調節領域がコード配列を発現し得
るように前記コーディング領域に操作的に結合している調節領域を有するポリヌ
クレオチドである。発現ベクターの使用は当業界で公知である。発現ベクターは
各種宿主細胞中で使用され得、従って調節領域は特定宿主細胞にとって適切なよ
うに選択されることが好ましい。
【００４０】 「調節領域」は、コード配列の転写または翻訳の開始または停止を促進または
強化し得るポリヌクレオチドである。調節領域はＲＮＡポリメラーゼ、リボソー
ムまたは宿主細胞の関連転写または翻訳の開始または停止因子により認識される
配列を含む。転写または翻訳を開始させる直接領域はコーディング領域の構成的
または誘導的発現を指向し得る。
【００４１】 本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されているセリンラセマーゼ遺
伝子配列の完全長または部分長配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは一本鎖
または二本鎖であってもよい。一本鎖では、ポリヌクレオチドはコーデイング、
すなわち「センス」鎖または相補的、すなわち「アンチセンス」鎖であり得る。
アンチセンス鎖は、セリンラセマーゼタンパク質をコードするＲＮＡと相互作用
させることにより遺伝子のモジュレーターとして有用であり得る。アンチセンス
鎖は、好ましくはタンパク質をコードするＲＮＡに対してユニークなまたは特異
的な配列を有する完全長鎖よりも短い。
【００４２】 前記ポリヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチド及び／またはリボヌクレ
オチドが含まれ得る。前記ポリヌクレオチドは、細胞により、無細胞生化学反応
によりまたは化学合成により作成され得る。非限定的にイノシン、メチル−シト
シン、デアザ−グアノシン等を含む非自然または修飾ヌクレオチドも存在し得る
。自然ホスホジエステルのヌクレオチド間結合が適当でもある。しかしながら、
ポリヌクレオチドはヌクレオチド間に非自然結合を有し得る。非自然結合は当業
界で公知であり、その例にはメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホ
ロジチオネート、ホスホルアミダイト及びリン酸エステル結合が含まれるが、こ
れらに限定されない。デホスホ結合もヌクレオチド間架橋として公知である。そ
の例にはシロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミダ
イト、カルバメート及びチオエステル架橋が含まれる。例えばＮ−ビニル、メタ
クリルオキシエチル、メタクリルアミドまたはエチレンヌクレオチド間結合を有
する「プラスチックＤＮＡ」も使用し得る。「ペプチド核酸」（ＰＮＡ）も有用
であり、ヌクレアーゼによる分解に対して耐性である。前記結合はポリヌクレオ
チド中に混合し得る。
【００４３】 本明細書中、「精製された」または「単離された」は、当該ポリヌクレオチド
、タンパク質及びポリペプチドまたはその各断片が自然界では見られない形態ま
たは純度で存在するようにインビボ環境から除去されたことを表すために互換可
能に使用されている。精製または単離された核酸分子は当業者により操作される
が、この操作の例には配列決定、制限消化、部位特異的突然変異誘発、核酸断片
の発現ベクターへのサブクローニング、ポリクローナルもしくはモノクローナル
抗体を作成したり、アミノ酸配列決定したり、ペプチド消化する機会を得るため
の完全または部分精製タンパク質またはタンパク質断片の入手が含まれるが、こ
れらに限定されない。従って、本発明の核酸は全細胞、細胞ライゼート、または
部分的もしくは実質的に精製された形態で存在し得る。好ましくは、分子は自然
界で見られるものよりも少なくとも約５〜約１０倍高い濃度で存在する。ポリヌ
クレオチドは、標準的方法により自然界で見られるものよりも少なくとも約１０
０倍高い濃度で細胞成分から精製された状態で得られたとき実質的に純粋である
と見做される。ポリヌクレオチドは、自然で見られるものよりも少なくとも約１
０００倍高い濃度で得られたとき本質的に純粋であると見做される。相同まで、
すなわち少なくとも１０，０００〜１００，０００倍に精製されたポリヌクレオ
チドが最も好ましい。化学合成した核酸配列は、上記の標準方法によりその化学
的前駆体から精製したとき実質的に精製されていると見做される。
【００４４】 用語「組換え体」は、ヒトが手を加えて作成したポリヌクレオチド調製物、構
築物、発現ベクター、組込み配列及びそれを含む細胞系を指す。
【００４５】 本発明には更に、緊縮条件下でセリンラセマーゼ配列にハイブリダイズする新
規ポリヌクレオチドを用いるアッセイが包含される。非限定的例として、高緊縮
条件を用いる方法は以下の通りである。ＤＮＡ含有フィルターのハイブリダイゼ
ーションを、６×ＳＳＣ、５×デンハート溶液及び１００μｇ／ｌの変性サケ精
子ＤＮＡから構成される緩衝液において６５℃で２時間〜一晩実施する。フィル
ターを、１００μｇ／ｌの変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０６ｃｐｍの３ ２ Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物において６５℃
で１２〜４８時間ハイブリダイズする。フィルターの洗浄を２×ＳＳＣ、０．１
％ ＳＤＳ含有溶液中で３７℃で１時間実施する。次いで、０．１×ＳＳＣ、０
．１％ ＳＤＳ中で５０℃で４５分間洗浄した後オートラジオグラフィーを実施
する。
【００４６】 高緊縮条件を用いる他の方法には、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、５０％ ホルムアミド中４２℃で１２〜４８時間実施するハイブリダイゼーションステ
ップまたは０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ ＳＤＳ中６５℃で３０〜６０分間実施
する洗浄ステップが含まれる。
【００４７】 高緊縮ハイブリダイゼーションを実施するための上記方法に挙げた試薬は当業
界で公知である。これらの試薬の組成の詳細は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ、第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ出版に見つけることができる。上記に加えて、使用可能な他の高緊縮
条件は当業界で公知である。
【００４８】 「同一性」はヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。通
常、配列は最高オーダーのマッチが得られるようにアラインされる。「同一性」
そのものは当業界で認められている意味を有し、公開されている技術を用いて算
出することができる。例えば、ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，ニューヨークに所在のＯｘｆｏｒ
ｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）発行；ＢＩＯＣＯＭＰＵ
ＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＡＮＤ ＧＥＮＯＭＥ ＰＲＯＪＥＣＴＳ
，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９３年）発行；ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＯＦ ＳＥＱＵ
ＥＮＣＥ ＤＡＴＡ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆ
ｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，ニュージャージに所在のＨｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９
４年）発行；ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９８７年）発行；及びＳＥＱＵＥＮＣＥ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ＰＲＩＭＥ
Ｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，ニューヨークに所
在のＭ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）発行を参照されたい。２
つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は多数
あるが、用語「同一性」は当業者に公知である（Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉ
ｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３
（１９８８））。２つの配列間の同一性または類似性を測定するために慣用され
ている方法には、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔ
ｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編，サンジェゴに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
（１９９４年）発行並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｔｏｎ，Ｄ．，ＳＩ
ＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８））に記載
されている方法が含まれるが、これらに限定されない。同一性及び類似性の測定
方法はコンピュータープログラムでコード化されている。２つの配列間の同一性
及び類似性を測定するための好ましいコンピュータープログラムには、ＧＣＧプ
ログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２（１）：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴ？，ＢＬ
ＡＳＴＩＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏ
ｌ．，２１５：４０３（１９９０））が含まれるが、これに限定されない。
【００４９】 例として、ポリヌクレオチドが配列番号１の参照ヌクレオチド配列に対して少
なくとも例えば９５％同一性を有するヌクレオチド配列を有するときには、ポリ
ヌクレオチド配列が配列番号１の参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあ
たり最高５個の点突然変異を含み得る以外ポリヌクレオドのヌクレオチド配列は
参照配列と同一であると意図される。換言すると、参照ヌクレオチド配列に対し
て少なくとも９５％同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
を得るためには、参照配列中の最高５％のヌクレオチドを欠失させても別のヌク
レオチドで置換してもよく、参照配列の全ヌクレオチドの最高５％の複数のヌク
レオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列の突然変異は参照ヌクレオチド
配列の５または３末端位または末端位の間の任意の位置で起こり得、参照配列の
ヌクレオチド間に個々にまたは参照配列内の１つ以上の隣接基中に散在し得る。
【００５０】 同様に、ポリペプチドが配列番号２の参照アミノ酸配列に対して少なくとも例
えば９５％同一性を有するアミノ酸配列を有するときには、ポリペプチドが配列
番号２の参照アミノ酸配列の１００アミノ酸あたり最高５個のアミノ酸改変を含
み得る以外ポリペプチドのアミノ酸配列は参照配列と同一であると意図される。
換言すると、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ
酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列中の最高５％のアミノ酸
残基を欠失させても別のアミノ酸で置換してもよく、参照アミノ酸配列の全アミ
ノ酸残基の最高５％の複数のアミノ酸を参照配列中に挿入してもよい。参照配列
の改変は参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位または前記末端位の
間の任意の位置で起こり得、参照配列の残基間に個々にまたは参照配列内の１つ
以上の隣接基中に散在し得る。
【００５１】 ポリペプチド 本発明の好ましい態様は実質的に精製された形態のヒトセリンラセマーゼタン
パク質である。好ましい実施態様は、配列番号２に開示されており、以下の１文
字コードで示されるアミノ酸配列を有する。
【００５２】
【化２】
【００５３】 ＢＬＯＣＫＳバイオインフォマティックソフトウェアを用いて検索した下線を
付した配列はピリドキサル５’ホスフェートに対してコンセンサス配列を有する
（ＢＬＯＣＫＳ受託番号ＢＬ００１６５Ａ及びＢＬ００１６５Ｂ）。
【００５４】 本発明は、配列番号２として記載のセリンラセマーゼポリペプチド配列の生物
活性断片及び突然変異または多型形態に関するが、この中には前記突然変異が診
断、治療または予防用のタンパク質またはタンパク質断片を提供し、セリンラセ
マーゼ機能のモジュレーター及び／または阻害剤のスクリーニングのために有用
であるようなアミノ酸置換、欠失、付加、アミノ末端切断及びカルボキシル末端
切断が含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】 自然形態のセリンラセマーゼをコードするポリヌクレオチドを単離するために
本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列の開示を用いて、当業者は配列
比較により前記の自然形態がセリンラセマーゼの突然変異体または多型形態であ
るかを調べることができる。更に、セリンラセマーゼタンパク質の生物学的活性
に関するインビトロまたはインビボアッセイにおいてタンパク質または断片をル
ーチンに試験することによりコード化タンパク質またはセリンラセマーゼタンパ
ク質の断片が生物学的に活性であるかどうかを調べることができる。例えば、宿
主細胞においてＮ末端またはＣ末端切断、内部付加または欠失を発現し、セリン
のラセミ化を触媒する能力を試験することができる。
【００５６】 特定アミノ酸をコードする各種コドンが非常に多くあることは公知である。従
って、本発明は、同一アミノ酸の翻訳をコードする代替コドンを含むＲＮＡをコ
ードするＤＮＡ配列に関する。
【００５７】 従って、本発明は同一タンパク質をコードする別のＤＮＡ分子を得ることがで
きるコドン縮重性を開示する。本発明では、１つ以上の縮重コドンを有する配列
を変質変異として定義される。また、発現タンパク質の最終的物理的特性を実質
的に変化させないＤＮＡ配列または翻訳タンパク質の突然変異も本発明の範囲に
含まれる。例えば、ロイシンをバリン、リシンをアルギニンまたはグルタミンを
アスパラギンで置換してもポリペプチドの機能に変化は生じ得ない。しかしなが
ら、所与の変化は、未改変セリンラセマーゼタンパク質と比較したセリンのラセ
ミ化を触媒する能力を簡単にアッセイすることにより生物学的機能に対する影響
について試験することができる。
【００５８】 ペプチドをコードするＤＮＡ配列を自然ペプチドとは異なる特性を有するペプ
チドをコードするように改変し得ることは公知である。ＤＮＡ配列の改変方法に
は、部位特異的突然変異誘発が含まれるが、これに限定されない。変更した特性
の例には、酵素の基質に対するアフィニテイーの変化が含まれるが、これに限定
されない。
【００５９】 本明細書中のセリンラセマーゼ遺伝子またはコード化タンパク質に関連して、
「多型」セリンラセマーゼは一般的に動物集団中に元々見られるセリンラセマー
ゼである。通常、セリンラセマーゼの多型の遺伝子はプローブとしてセリンラセ
マーゼ遺伝子を用いる高緊縮ハイブリダイゼーションにより検出され得る。セリ
ンラセマーゼの多型形態は配列番号１として本明細書に記載されている特定セリ
ンラセマーゼ遺伝子とは異なるヌクレオチド配列によりコードされ得る。しかし
ながら、サイレント突然変異のために、多型セリンラセマーゼ遺伝子は本明細書
に記載されているものと同一または異なるアミノ酸配列をコードし得る。更に、
幾つかの多型形態のセリンラセマーゼは野生型セリンラセマーゼ活性由来の形態
を区別する生物学的特性を示す。野生型の場合、多型形態は突然変異体でもある
。
【００６０】 本発明は、野生型酵素中の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、付加、修飾または
置換により修飾されたセリンラセマーゼポリポプチドを包含する。本発明は、ア
レリック及び多型変異体、及び例えば異なるタンパク質、ポリペプチドまたは部
分（融合パートナー）に対して側鎖基または末端残基を介して共有結合している
ようなポリペプチドの全部または一部を含む融合タンパク質を包含する。
【００６１】 数個のアミノ酸置換は好ましくは残基が生理化学的に類似の残基で置換されて
いる「保存的」であり、例えばＧｌｙ／Ａｌａ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｖａｌ／Ｉｌ
ｅ／Ｌｅｕ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｎ／Ｇｌｎ及びＰｈｅ／Ｔｒｐ／Ｔｙｒであ
る。保存的置換を有する酵素のアナログは通常実質的な酵素活性を保持している
。Ａｓｎ／Ｇｌｕ、Ｖａｌ／Ｔｙｒ及びＨｉｓ／Ｇｌｕのような非保存的置換を
有する他のアナログは酵素活性を実質的に持たない。しかしながら、前記アナロ
グは、免疫学的能力宿主において抗体産生を引き出すための抗原として使用され
得るので有用である。前記アナログは誘導元の野生型酵素の多くの抗原決定基を
保持しているので、該アナログに対して産生した抗体は活性コンフォメーション
または変性野生型酵素に結合し得る。従って、抗体は例えば野生型酵素の免疫精
製またはイムノアッセイのために使用され得る。
【００６２】 特定アナログがセリンラセマーゼ活性を示すかどうかは本明細書に記載されて
いるルーチン実験により調べられ得る。
【００６３】 幾つかのアナログは、特徴的なセリンラセマーゼ活性を実質的に維持しながら
アミノ末端及び／またはカルボキシル末端から残基が逐次欠失されている切断変
異体である。
【００６４】 アミノ酸残基の修飾には、カルボキシ末端またはカルボキシ側鎖含有残基の脂
肪エステルまたはアミド、ヒドロキシ基含有残基のＯ−アシル誘導体、及びアミ
ノ末端アミノ酸またはアミノ基含有残基（例えば、リシンまたはアルギニン）の
Ｎ−アシル誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】 本発明は、時にアナログと称するセリンラセマーゼポリペプチドのアミノ酸配
列と実質的に相同のアミノ酸配列を有する物理的変異体も包含する。本発明では
、アミノ酸配列の相同性または同一性は残基マッチを最適化し、所要によりギャ
ップを導入することにより測定される。相同性アミノ酸配列は通常それぞれの配
列に自然アレリック、多型及び種間変異を含めるべく意図されている。
【００６６】 典型的な相同性タンパク質またはペプチドは、セリンラセマーゼのアミノ酸配
列と２５〜１００％（ギャップが導入されているならば）乃至５０〜１００％（
保存的置換が含まれているならば）の相同性を有する。
【００６７】 観察される相同性は通常少なくとも約３５％、好ましくは少なくとも約５０％
、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも８５％以上で
ある。Ｎｅｅｄｌｅｈａｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３
（１９７０）；Ｓａｎｋｏｆｆら，Ｔｉｍｅ Ｗａｒｐｓ，Ｓｔｒｉｎｇｓ Ｅ
ｄｉｔｓ，ａｎｄ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａ
ｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，マ
サチューセツツ州レディングに所在のＡｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ（１９８３
年）発行；及びカリフォルニア州マウンテンビューに所在のＩｎｔｅｌｌｉＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ及びウィスコンシン州マジソンに所在のＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏ
ｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐｓ
のソフトウェアパッケージ参照。本発明の特に好ましい実施態様では、セリンラ
セマーゼポリペプチドは配列番号２のセリンラセマーゼと比較して少なくとも９
０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９
９％またはそれ以上の相同性を有する。
【００６８】 本発明の幾つかの好ましい実施態様では、当業界で公知のマウスセリンラセマ
ーゼ配列から開始し、ガイドとして配列番号２のセリンラセマーゼを用いてヒト
配列に非常に似たセリンラセマーゼポリペプチドを設計することができる。例え
ば、ヒト配列とは異なるマウス配列中の位置を決め、前記した位置の１つ以上で
アミノ酸配列をマウス配列中に存在するアミノ酸からヒト配列中に存在するアミ
ノ酸に変化させることができる。或いは、ヒト配列から開始し、マウス配列中に
見られるアミノ酸に変換させる。下記する幾つかの実施態様では、生じたセリン
ラセマーゼポリペプチドは配列番号２のセリンラセマーゼと比較して少なくとも
９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％またはそれ以上の相同性を有する。マウス及びヒト配列を比較し、本明細
書に教示されているように適切に変化させることにより設計され得るアミノ酸配
列の異なる順列は多数あるので、ポリペプチドの各サブセットを相同％により指
す。ここで、９０％相同基はメンバーの最大数を有し、９９％相同基はメンバー
の最小数を有する。
【００６９】 グリコシル化変異体には、例えば各種の真核宿主発現系における合成及び処理
中または更なる処理ステップ中グリコシル化パターンを修飾することにより作成
したアナログが含まれる。グリコシル化修飾をするための特に好ましい方法には
、前記処理を実施する細胞から誘導したグリコシル化酵素、例えば哺乳動物グリ
コシル化酵素にポリペプチドを曝すことが含まれる。或いは、脱グリコシル化酵
素は真核発現系での産生中に結合した炭水化物を除去するために使用され得る。
【００７０】 他のアナログは修飾、例えば非自然アミノ酸残基またはリン酸化アミノ酸残基
（例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホスレオニン残基）の取り
込みを含むセリンラセマーゼポリペプチドである。他の考えられる修飾には、ス
ルホン化、ビオチニル化、または他の部分、例えばリン酸基に似た分子形態を有
する部分の付加が含まれる。
【００７１】 ヒトセリンラセマーゼのアナログは化学合成により、部位特異的突然変異誘発
（Ｇｉｌｌｍａｎら，Ｇｅｎｅ，８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎ
ａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）またはＩｎｎｉｓ編，ＰＣＲ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ，ニューヨーク州ニューヨークに所在のＡｃａｄｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ（１９９０年）発行）を用いて、または完全酵素をコードする核酸を修飾する
ためにＤａｕｇｈｅｒｔｙら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，．１９：
２４７１（１９７１））が例示するようなポリメラーゼ連鎖反応方法（ＰＣＲ；
Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７（１９８８））を用いて生成さ
れ得る。組換え産物を生成または検出するためにエピトープタグを付けることが
考えられる。
【００７２】 タンパク質またはその断片は、自然界に存在しない組成及び純度の点で自然環
境を少なくとも部分的に含まずに得られたときに精製または単離されていると見
做される。好ましくは、分子は自然界に存在するものよりも少なくとも５〜１０
倍高い濃度で存在する。タンパク質またはその断片は、自然界に存在するものよ
りも少なくとも約１００倍高い濃度で得られるならば実質的に純粋であると見做
される。タンパク質またはその断片は、自然界に存在するものよりも少なくとも
約１０００倍高い濃度で得られるならば本質的に純粋であると見做される。最も
好ましいタンパク質は相同性、すなわち少なくとも１０，０００〜１００，００
０倍に精製されたものである。
【００７３】 本発明のポリペプチドに関して用語「組換え体」は組換え方法により作成した
、組換え宿主細胞が発現したまたは本明細書に記載されているかたまたは当業界
度公知の自然細胞から精製したポリペプチドのみを指す。部分精製したセリンラ
セマーゼポリペプチドを有する調製物は用語「組換え体」の範疇に含まれるとす
る。
【００７４】 セリンラセマーゼの発現 宿主細胞において組換えセリンラセマーゼポリペプチドを発現するために各種
の発現ベクターを使用することができる。本明細書中、発現ベクターはクローン
化ＤＮＡの転写及びそのｍＲＮＡの適当な宿主での翻訳のための調節配列を含む
核酸配列として定義される。前記ベクターは酵母、バクテリア、藍藻、植物細胞
、昆虫細胞及び動物細胞を含めた各種宿主において遺伝子を発現するために使用
され得る。特別設計されたベクターにより、バクテリア−酵母やバクテリア−動
物細胞のような宿主間の遺伝子をシャトルすることができる。適切に構築された
発現ベクターは宿主細胞での自律複製のための複製起源、選択マーカー、少数の
有用な制限酵素部位、高コピー数のためのポテンシャル及び調節配列を含んでい
なければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、
ＲＮＡ合成を開始させる調節配列として定義される。強力なプロモーターは高頻
度でｍＲＮＡを開始させるものである。発現ベクターには、クローン化ベクター
、修飾クローン化ベクター、特別設計されたプラスミドまたはウイルスが含まれ
るが、これらに限定されない。
【００７５】 特に、各種のバクテリア発現ベクターをバクテリア細胞において組換えセリン
ラセマーゼを発現させるために使用することができる。組換えセリンラセマーゼ
発現のために好適な市販されているバクテリア発現ベクターには、ｐＱＥ（ＱＩ
ＡＧＥＮ）ｐＥＴ１１ａまたはｐＥＴ１５ｂ（ＮＯＶＡＧＥＮ）、ラムダｇｔ１
１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）及びｐＫＫ２２３−３（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）が含
まれるが、これらに限定されない。
【００７６】 或いは、無細胞転写−翻訳系においてセリンラセラマーゼＤＮＡを発現するこ
とも、無細胞翻訳系においてセリンラセマーゼＲＮＡを発現することもできる。
セリンラセマーゼポリペプチドの無細胞合成は当業界で公知のバッチ式または連
続式フォーマットで実施し得る。
【００７７】 セリンラセマーゼを化学合成することもできるが、この方法は好ましくない。
【００７８】 各種の宿主細胞をセリンラセマーゼタンパク質を合成するために発現ベクター
と共に使用することができる。この宿主細胞には、大腸菌、バチルス及びサルモ
ネラが含まれ得る。昆虫及び酵母細胞も適当であり得る。しかしながら、最も好
ましい宿主細胞はヒト宿主細胞である。
【００７９】 宿主細胞においてセリンラセマーゼを発現後、セリンラセマーゼポリペプチド
を回収し得る。幾つかのタンパク質精製方法が利用可能であり、使用に適してい
る。セリンラセマーゼタンパク質及びポリペプチドは細胞ライゼート及び抽出物
からまたは培地から洗剤可溶化、限外濾過、酸抽出、アルコール沈降、塩分別、
イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、レシチ
ンクロマトグラフィー、アフィニティー（例えば、抗体またはＨｉｓ−Ｎｉ）ク
ロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト吸着
クロマトグラフィー、及び疎水性または親水性相互作用に基づくクロマトグラフ
ィーを含めた方法を個別にまたは組み合わせて適用することにより精製すること
ができる。場合により、タンパク質変性及び再生ステップを使用することができ
る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び逆相ＨＰＬＣも有用であり得
る。透析も最終緩衝液組成を調整するために使用することができる。
【００８０】 セリンラセマーゼそのものも、酵素の活性を変える化合物、例えば酵素の活性
を阻害または刺激する化合物を同定するためのアッセイにおいて有用である。セ
リンラセマーゼタンパク質もタンパク質に対する抗体の作成、タンパク質の構造
研究及びタンパク質の構造／機能関係のためにも有用である。
【００８１】 セリンラセマーゼのモジュレーター、アゴニスト、アンタゴニスト及び阻害剤 本発明は、セリンラセマーゼタンパク質の発現を調節し、セリンラセマーゼタ
ンパク質の活性を刺激または阻害する化合物のスクリーニング方法にも関する。
セリンラセマーゼを調節、刺激または阻害する化合物はＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチ
ド、タンパク質、非タンパク質の有機もしくは無機化合物または他の種類の分子
であり得る。セリンラセマーゼをコードするＤＮＡまたはＲＮＡの発現を調節す
る化合物またはセリンラセマーゼの生物学的機能のアゴニスト、アンタゴニスト
または阻害剤である化合物は各種アッセイにより検出し得る。このアッセイは、
発現または活性の変化があるかどうかを調べるための単純な定性“イエス／ノー
”アッセイであり得る。前記アッセイは試験サンプルの発現または活性を標準サ
ンプル中の発現または活性のレベルまたは程度を比較することにより、例えば対
照と比較することにより定量的になし得る。モジュレーターである化合物は、化
合物の存在下で産生するｍＲＮＡ及び／またはセリンラセマーゼの量を測定する
ことにより検出し得る。アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤である化合物
は、化合物の存在下及び非存在下でのセリンラセマーゼタンパク質の特異的活性
を測定することにより検出し得る。対照アッセイは、試験化合物をアッセイから
省略している以外は試験アッセイと同一条件下で実施する。
【００８２】 タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子及び抗体により、セリンラセマーゼの検
出及び分析に適したキットが処方される。前記キットは少なくとも１つの容器を
閉じこめて保持するのに適した区画化担体を含む。前記担体は更に、セリンラセ
マーゼを検出するのに適した組換えセリンラセマーゼまたは抗セリンラセマーゼ
抗体のような試薬を含む。前記担体は標識化抗原、酵素基質等のような検出手段
をも含み得る。
【００８３】 アッセイ 本発明のアッセイは、生物学的活性または酵素に対する結合について化合物を
スクリーニングする業界で通常公知の多くのフォーマットで設計され得る。本発
明のアッセイは、有利にはＬ−セリンのＤ−セリンへの変換の際のセリンラセマ
ーゼの活性を利用することができる。Ｄ−セリンを直接検出することができ、ま
たは第２信号、例えばＮＭＤＡ受容体のＤ−セリン誘導活性化を検出することも
できる。
【００８４】 本発明は、セリンラセマーゼポリペプチドと特異的に相互作用する化合物の同
定方法を包含する。前記酵素と相互作用する化合物はセリンラセマーゼの活性を
刺激したり阻害し得る。セリンラセマーゼに対してアフィニティーを有する化合
物の結合の特異性は、セリンラセマーゼポリペプチドを発現する組換え細胞から
単離したセリンラセマーゼに対する化合物のアフィニティーを測定することによ
り明らかにすることができる。セリンラセマーゼポリペプチドの発現並びにセリ
ンラセマーゼに結合するかＬ−セリンのＤ−セリンへの変換を抑制する化合物の
スクリーニングにより、セリンラセマーゼに対してアフィニティーを有する化合
物を迅速に選択するための効果的方法が提供される。Ｌ−セリンは当業界で公知
の手段（例えば、放射性標識）により標識され得、その後セリンラセマーゼ活性
のアッセイにおいて標識Ｌ−セリンのＤ−セリンへの変換を追跡するために使用
され得る。
【００８５】 セリンラセマーゼのアナログ、断片、またはセリンラセマーゼの突然変異体、
多型またはアレリック変異体を産生したい場合には、下記するアッセイにおいて
ポリペプチドを試験し、その結果を配列番号２を有する活性なセリンラセマーゼ
ポリペプチドを用いて得た結果と比較することができる。このようにして、前記
したアナログ、断片、突然変異体、多型またはアレリック変異体の化合物を結合
する能力、セリンラセマーゼのアゴニストにより活性化される能力、またはセリ
ンラセマーゼのアンタゴニストにより不活化または阻害される能力を容易に評価
することができる。
【００８６】 従って、本発明は、セリンラセマーゼアゴニスト、アンタゴニスト及び阻害剤
である化合物を同定し得るアッセイを包含する。本発明のアッセイ方法は従来技
術のアッセイ方法とは異なる。なぜならば、本発明のアッセイは本発明のセリン
ラセマーゼポリペプチドを該アッセイで使用する少なくとも１つのステップを含
んでいるからである。
【００８７】 リガンド、アゴニスト及びアンタゴニストを同定するための一般的方法は当業
界で公知であり、セリンラセマーゼのアゴニスト及びアンタゴニストを同定する
ように改変し得る。所与の方法におけるステップの順序はアッセイ業界の当業者
が認識しているように変更可能であり、同時に実施してもよい。以下は、本発明
のアッセイを実施するために使用し得る各種フォーマットのサンプリングである
。
【００８８】 従って、本発明は、候補化合物がセリンラセマーゼのアゴニストまたは阻害剤
であるかどうかを調べる方法を包含し、その方法は、 （ａ）細胞にセリンラセマーゼポリペプチドをコードする発現ベクターをトラン
スフェクトするステップ、 （ｂ）トランスフェクトした細胞を、細胞においてセリンラセマーゼを発現させ
るのに十分な時間成長させるステップ、 （ｃ）細胞の一部を候補化合物の非存在下及び存在下で標識Ｌ−セリンに曝すス
テップ、 （ｄ）細胞の一部における標識Ｌ−セリンのＤ−セリンへの変換を測定するステ
ップ、及び （ｅ）化合物の存在下及び非存在下でのＬ−セリンのＤ−セリンへの変換量を比
較するステップ を含み、化合物の存在下でＬ−セリンのＤ−セリンへの変換量が低下していれば
化合物はセリンラセマーゼの阻害剤であり、Ｌ−セリンのＤ−セリンへの変換量
が増加していれば化合物はセリンラセマーゼのアゴニストである。
【００８９】 上記方法のステップ（ｃ）を実施する条件は、タンパク質−リガンド相互作用
の研究のために当業界で通常使用されている条件、例えば生理学的ｐＨ、ＰＢＳ
のような慣用されている緩衝液または組織培地が示すような塩濃度、約４〜約４
５℃の温度である。このステップで、Ｌ−セリン及び候補化合物は細胞に対して
逐次または同時に適用され得る。化合物を最初に適用することまたは化合物及び
Ｌ−セリンを同時に適用することが好ましい。
【００９０】 上記した全細胞方法は、セリンラセマーゼと相互作用させるべく化合物が細胞
膜を横切ることができるかどうかを評価したいときにアッセイで使用され得る。
しかしながら、試験細胞を候補化合物に曝すよりむしろ細胞から抽出物を調製し
、その抽出物を試験化合物に曝すことができるように上記方法を修飾してもよい
。細胞ではなく抽出物を用いる前記修飾は当業界で公知である。特定のアッセイ
方法を下記実施例に示す。
【００９１】 従って、本発明は、候補化合物が抽出物において候補化合物がセリンラセマー
ゼポリペプチドのアゴニストまたは阻害剤であるかどうかを調べるためにセリン
ラセマーゼとＬ−セリンの相互作用を用いる方法を提供し、その方法は、 （ａ）細胞に該細胞においてセリンラセマーゼを発現させる発現ベクターをトラ
ンスフェクトすることによりテスト細胞を用意するステップ、 （ｂ）テスト細胞からセリンラセマーゼを含有する抽出物を作成するステップ、
（ｃ）リガンドが抽出物中のポリペプチドに結合するような条件下で抽出物を候
補化合物に曝すステップ、 （ｄ）化合物の存在下及び非存在下で抽出物中のＬ−セリンのＤ−セリンへの変
換量を測定するステップ、及び （ｅ）化合物の存在下及び非存在下でのＬ−セリンのＤ−セリンへの変換量を比
較するステップ を含み、化合物の存在下でＬ−セリンのＤ−セリンへの変換量が低下していれば
化合物はセリンラセマーゼの阻害剤であり、Ｌ−セリンのＤ−セリンへの変換量
が増加していれば化合物はセリンラセマーゼのアゴニストである。
【００９２】 上記した方法の更なる改変として、セリンラセマーゼをコードするＲＮＡを、
例えばバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下でセリンラセマーゼを含有
するプラスミドを用いるインビトロ転写により作成し、ＲＮＡを卵母細胞におい
てセリンラセマーゼを発現させるためにクセノプス卵母細胞に微量注入し得る。
その後、化合物をセリンラセマーゼへの結合または卵母細胞で発現したセリンラ
セマーゼの活性の阻害について試験し得る。本発明のアッセイのように、本明細
書に記載されているセリンラセマーゼポリペプチドを用いるステップをアッセイ
に含める。
【００９３】 トランスジェニック動物 本発明のトランスジェニック動物に関して、導入遺伝子及び遺伝子を説明する
。本明細書中、「導入遺伝子」は遺伝子を含む遺伝子構築物である。導入遺伝子
は通常当業界で公知の方法により動物またはその祖先の細胞中の１つ以上の染色
体に組込まれる。一旦組込まれると、導入遺伝子はトランスジェニック動物の染
色体の少なくとも１つの場所に運ばれる。遺伝子はタンパク質をコードするヌク
レオチド配列である。遺伝子及び／または導入遺伝子は当業界で公知の遺伝調節
要素及び／または構造要素をも含み得る。
【００９４】 本明細書中、用語「動物」はヒト以外のすべての哺乳動物を含む。動物には胚
及び胎児段階を含めたすべての発達段階の動物も含まれる。好ましい動物はげっ
歯動物であり、最も好ましい動物はマウスまたはラットである。「トランスジェ
ニック動物」は、サブ細胞レベルでの計画的な遺伝子操作、例えば組換えウイル
スの微量注入または感染により直接的または間接的に受け取った遺伝情報を有す
る１つ以上の細胞を含む動物である。こうして導入されたＤＭＡ分子は染色体内
に組込まれるかまたは染色体外複製ＤＮＡであり得る。特記しない限りまたは動
物の説明内容から理解されない限り、本明細書中、「トランスジェニック動物」
は、遺伝情報が生殖細胞系に導入されており、よってその情報を子孫に伝達する
能力を有しているトランスジェニック動物を指す。実際子孫が遺伝情報の一部ま
たは全部を有しているならば、その子孫もトランスジェニック動物である。遺伝
情報は通常トランスジェニック動物が持っている導入遺伝子の形態で提供される
。
【００９５】 非ヒト動物が受け取る遺伝情報は、レシピエントが属する動物の種に対して異
物であるかまたは特定のレシピエントにとってのみ異物であり得る。後者の場合
、情報は変更され得るかまたは自然遺伝子とは異なるように発現され得る。或い
は、変更または導入された遺伝子により自然遺伝子が非機能性となり、「ノック
アウト」動物が作成され得る。
【００９６】 本明細書中、「標的遺伝子」または「ノックアウト（ＫＯ）」導入遺伝子はヒ
トインターベンションにより非ヒト動物の生殖細胞系に導入されるＤＮＡ配列で
あり、前記ヒトインターベンションには本明細書に記載されている方法が非限定
的に含まれる。本発明の標的化遺伝子には、非ヒト動物のコグネート内在性アレ
レを特定的に改変するように設計された核酸配列が含まれる。
【００９７】 改変されたセリンラセマーゼ遺伝子は宿主細胞に内因する同一タンパク質を完
全にコードすべきでなく、その発現産物は程度の差こそあれ改変され得るかまた
は全く存在しない。内因性セリンラセマーゼタンパク質の非存在下でトランスジ
ェニック動物において非自然セリンラセマーゼタンパク質を発現するのに有用で
ある場合には、改変セリンラセマーゼ遺伝子を動物のヌル「ノックアウト」表現
型に導入することが好ましい。しかしながら、より控えめに修飾したセリンラセ
マーゼ遺伝子も有用であり得、本発明の範囲内に含まれる。
【００９８】 導入遺伝子導入のための標的細胞のタイプは胚性（ＥＳ）細胞である。ＥＳ細
胞はインビボで培養した挿入前胚から得られ、胚に融合され得る（Ｍ．Ｊ．Ｅｖ
ａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４−１５６（１９８１）；Ｂｒａｄｌｅ
ｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：２５５−２５８（１９８４）；Ｇｏｓｓｌｅｒら
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：９０６５−９０６９
（１９８６）；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３２２：４４５−４
４８（１９８６））。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション、微量注入ま
たはレトロウイルス媒介導入のような各種の標準方法を用いてＥＳ細胞に効率的
に導入され得る。その後、形質転換したＥＳ細胞を非ヒト動物由来の未分化胎細
胞と混合し得る。その後、導入したＥＳ細胞は胚をコロニー化し、生じたキメラ
動物の生殖細胞系に寄与する（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：
１４６８−１４７４（１９８８））。動物を生殖細胞系形質転換体を生じるもの
についてスクリーニングする。動物を交雑すると、導入遺伝子に対してホモ接合
の動物が生成する。
【００９９】 標的化組換え及び生じたノックアウトマウスを評価する方法は当業界で容易に
利用し得、公知である。前記方法には、標的化アレレを検出するためのＤＮＡ（
サザン）ハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、及びＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を検
出するためのウェスタンブロットが含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】 本発明の特に好ましい実施態様は、ヒトセリンラセマーゼを動物の内因性セリ
ンラセマーゼの非存在下で発現させたトランスジェニック動物である。最も好ま
しくは、内因性セリンラセマーゼをノックアウトし、ヒトセリンラセマーゼをノ
ックインしたラットまたはマウスである。動物の表現型は、ヒト遺伝子がマウス
遺伝子の活性を置換しているので野生型表現型に類似している。しかしながら、
ヒトセリンラセマーゼが機能性マウスセリンラセマーゼの非存在下で動物におい
て検出され得るので野生型動物とは異なる。
【０１０１】 これは治療目的を有し得る。生物の細胞内に突然変異体、アレレ遺伝子または
変異体配列が存在すると、特に相同内因性配列の代わりに存在すると、インビボ
でコード化ポリペプチド及び／またはプロモーターの活性を調節するかまたは治
療可能性があるセリンラセマーゼ遺伝子または物質の役割を試験及び／または研
究する際のモデルとして前記生物を使用することができる。
【０１０２】 本発明の特定態様を説明するために下記実施例を提示する。これらの実施例は
本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の保護範囲は請求の範囲によって
のみ限定される。
【０１０３】 実施例１ ヒトセリンラセマーゼの同定及びｃＤＮＡクローニング ＧｅｎＢａｎｋ Ｈｕｍａｎ ＥＳＴ（発現配列タグ）をサーチするためにマ
ウスセリンラセマーゼのＤＮＡ配列を使用した。サーチの結果、部分ヒトセリン
ラセマーゼ配列（５’末端に３５３ｂｐ）を含むヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ受
託番号ｈ７３０９７）を得た。このヒトＥＳＴ（ｈ７３０９７）をＲｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．から購入した。クローンを１００ｕｇ／ｍｌ
のアンピシリン含有のＬＢ寒天プレート（Ｒｅｍｅｌ）において３７℃で一晩培
養した。５つの単一コロニーを選び、５０ｕｇ／ｍｌのアンピシリン含有のＬＢ
培地（５ｍｌ）において３７℃で１６時間培養した。この特定クローンのプラス
ミドＤＮＡをＷＩＺＡＲＤ ＰＬＵＳ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製システ
ム（ＰＲＯＭＥＧＡ）を用いて単離した。
【０１０４】 精製ＤＮＡの配列を普遍Ｔ３プロモータープライマー、Ｔ７プロモータープラ
イマー及びＭ１３／ｐＵＣ逆２３塩基配列プライマー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を
用いて決定した。配列決定はＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシーケンサー
（ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ）で実施した。更に、２つの内部プライマーを消化
し（前進プライマー：５’−ＣＴＴ ＧＣＡ ＡＴＡ ＣＡＡ ＧＣＣ ＴＡＣ ＧＧＡ ＧＣ−３’（配列番号３）及び逆プライマー：５’−ＧＴＴ ＣＡＡ ＧＣＣ ＡＡＴ ＧＣＴ ＧＧＡ ＴＴＴ ＧＡＣ−３’（配列番号４））、
前記クローンの内部領域を配列決定するために使用した。前記クローンの配列を
５’及び３’方向で決定した。ＤＮＡ配列を集合して、バイオインフォマティッ
クコンティグ道具を用いてヒトセリンラセマーゼの完全長配列を作成した。セリ
ンラセマーゼのアミノ酸配列をＤＮＡ配列から推定した。
【０１０５】 実施例２ ヒトセリンラセマーゼの発現の分析 ヒトの脳、心臓、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺及
び末梢血白血球から単離したポリ（Ａ＋）−ＲＮＡのノーザンブロットはＣＬＯ
ＮＴＥＣＨ（カリフォルニア州パロアルト）から購入した。ヒトセリンラセマー
ゼ由来のｃＤＮＡ断片（５７３ｂｐ）のプローブをＭＵＬＴＩＰＲＩＭＥ ＤＮ
Ａ標識システム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）を用いて標識した。ハイブリダイゼーショ
ンは５×ＳＳＰＰＥ、１０×デンハート溶液、５０％ ホルムアミド、２％ Ｓ
ＤＳ、２０ｕｇ／ｍｌの変性サメ精子ＤＮＡ及び１０８ｃｐｍの３２Ｐ標識プロ
ーブ中において４２℃で１８時間実施した。膜を４２℃で２×ＳＳＣ、０．０５
％ ＳＤＳを含有する溶液を用いて４０分間、次いで５０℃で１×ＳＳＣ、０．
０５％ ＳＤＳを用いて４０分間段階的に洗浄した。高緊縮洗浄を５０℃で０．
１×ＳＳＣ、０．０５％ ＳＤＳを用いて２０分間実施した。次いで、ブロット
をコダックＸＡＲ Ｘ線フィルム膜に暴露することにより膜を検出した。ヒトラ
セマーゼに対するｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析から、ｍＲＮＡがヒトの
脳、心臓、骨格筋、腎臓及び肝臓において発現することが立証された。
【０１０６】 実施例３ 染色体マッピング研究 染色体マッピング研究をＧＥＮＥＢＲＩＤＧＥ ４ ラジエーションハイブリ
ッドパネル及びＳｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ ラジエーションハイブリッドパネルを
用いて実施し、ヒトセリンラセマーゼ遺伝子が染色体１７ｐ１３にマッピングさ
れることが判明した。
【０１０７】 ヒトセリンラセマーゼを、ＧＥＮＥＢＲＩＤＧＥ ４ ラジエーションハイブ
リッドパネル及びＳｔａｎｆｏｒｄ Ｇ３ ラジエーションハイブリッドパネル
（ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＧＥＮＥＴＩＣＳ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ス
クリーニングによりマッピングした。増幅用プライマーは、ヒトセリンラセマー
ゼのヌクレオチド４４６〜４６８及び５４９〜５７１に相当する５’−ＴＣＡ
ＴＧＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＣＣＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＧ−３’（配列番号５）
及び５’−ＣＡＡ ＧＣＡ ＴＴＣ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＡ ＣＡ−
３’（配列番号６）であった。更に、Ｇ３ＰＤＨ（５’−ＣＣＴ ＧＧＣ ＣＡ
Ａ ＧＧＴ ＣＡＴ ＣＣＡ ＴＧＡ ＣＡＡ Ｃ−３’（配列番号７）及び５
’−ＴＧＴ ＣＡＴ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＡＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＧＡ Ｃ−
３’（配列番号８））のプライマーをＰＣＲ反応用ポジティブコントロールとし
て使用する。ＰＣＲ結果を、ｈｔｔｐ：／／ｃａｒｂｏｎ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄ
ｕ：８００／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｒｈｍａｐｐｅｒ ｎｏｕｐｌｏａｄ．ｐｌ及び
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｈｇｃ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ＲＨ／ｒｈｓｅ
ｒｖｅｒｆｏｒｍｎｅｗ．ｈｔｍｌ／で分析した。
【０１０８】 実施例４ セリンラセマーゼの分析 セリンラセマーゼ活性を上記（Ｗｏｌｏｓｋｅｒら，１９９９ｂ）したように
アッセイする。発現セリンラセマーゼを以下の手順に従ってトランスフェクトし
た細胞から抽出する。トランスフェクトした細胞を５００×ｇで５分間遠心して
収集し、４℃で５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭ ２−メル
カプトエタノール、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含む
溶解緩衝液に再懸濁する。次いで、細胞を氷上で簡単な音波処理により破壊する
。ホモジネートを１０，０００×ｇで１０分間遠心する。上清を新しいチューブ
に移し、タンパク質濃度についてＰｉｅｒｃｅクーマシー試薬（イリノイ州ロッ
クフォードに所在のＰＩＥＲＣＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．）を用いて測定し
た。
【０１０９】 細胞抽出物を１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、１５ｕＭ ＰＬＰ及び２０
ｍＭ Ｌ−セリンを含有するトリス（５０ｍＭ，ｐＨ８．０）緩衝液において３
７℃で０．５〜８時間インキュベートした。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ；最終濃度
５％）を添加して反応を停止した後遠心する。ＴＣＡを上清から水−飽和シセエ
チルエーテル（１ｍｌ）を用いて２回抽出する。Ｄ−セリン生成物の量をＤ−ア
ミノ酸オキシダーゼとインキュベートしてα−ケト酸、ＮＨ３及び過酸化水素を
発生させることにより測定する。過酸化水素の生成をペルオキシダーゼ及び光を
発するルミノールを用いて定量する。ルミネセンスをルミノメーターを用いてカ
ウントする。
【０１１０】 酵素活性を（各チューブからのカウント）マイナス（沸騰抽出チューブからの
カウント）として算出する。ヒトセリンラセマーゼに関するＫｍ（ミハエル定数
）、Ｖｍａｘ（速度）及び他のキネティック定数を当業界で一般的に用いられて
いる標準方法を用いて測定する。
【０１１１】 実施例５ セリンラセマーゼの活性を変える化合物のスクリーニング 化合物ライブラリーから化合物を特異的に発見するためのスクリーニング方法
を開発する。本発明のアッセイは、微量滴定プレート、マイクロウェル及びドロ
ップレットフォーマットでの高処理能力スクリーニングに適合し得る。
【０１１２】 最も簡単なアッセイでは、セリンラセマーゼ活性を含むサンプルを調製し、セ
リンラセマーゼ活性の測定前及び／またはその間に化合物とインキュベートする
。形質転換細胞、トランスフェクト細胞またはトランスジェニック動物由来の細
胞を含めた組換えセリンラセマーゼを発現する細胞からサンプル、例えば細胞、
破壊細胞または細胞抽出物を調製し得る。使用する化合物の濃度は多数のサンプ
ルで異なり得る。プレインキュベーションが好ましい場合には、前記ステップを
異なる時間実施し得、多くの場合５〜１０分間が適当である。次いで、サンプル
をセリンラセマーゼ活性についてアッセイする。所望により、セリンラセマーゼ
酵素の活性を測定するために実施例４に記載の方法を用いることができる。
【０１１３】 セリンラセマーゼ活性の基本レベルは、形質転換もトランスフェクトも受けて
いない細胞を含めた適当な細胞から調製したサンプルで測定し得る。セリンラセ
マーゼ活性の阻害％を化合物の存在下で組換えセリンラセマーゼを発現する細胞
から調製したサンプルにおいて測定し、化合物の非存在下のサンプルで測定した
最大活性と比較する。典型的には、ＩＣ５０、すなわちサンプルの酵素活性を半
分に低減させるのに必要な化合物の濃度を用いて化合物の効力を比較する。
【０１１４】 組換え細胞及び所望により非組換え細胞から調製したサンプルを用いて対照ア
ッセイを実施し得る。１つの対照アッセイでは、セリンラセマーゼ活性を持たな
いと公知の細胞系を化合物と接触させ得る。或いは、セリンラセマーゼ活性を発
現する組換え細胞由来のサンプルを用い、このサンプルに化合物を接触させずに
アッセイを実施してもよい。また、セリンラセマーゼを発現しない細胞系由来の
サンプル及び組換えセリンラセマーゼを発現するように形質転換またはトランス
フェクトした同じ細胞系由来のサンプルを用いることも好ましい。前記した対照
及び他の対照は当業者に自明である。
【０１１５】 実施例６ ＮＭＤＡ受容体活性を測定するアッセイ セリンラセマーゼより産生したＤ−セリンはグリシン部位で作用するＮＭＤＡ
受容体のコアクチベータである。従って、ＮＭＤＡ受容体の活性化を測定するこ
とによりセリンラセマーゼ活性に影響を与える化合物についてアッセイすること
ができる。カルシウムのような細胞内第２メッセンジャーを測定するために使用
される各種アッセイがＮＭＤＡ受容体の活性化を測定するために適用可能である
ことは当業者に自明である。特に、カルシウム流入を生成するＮＭＤＡ受容体の
活性化時に蛍光信号を発生するエクオリン、緑色蛍光タンパク質またはカルシウ
ム感受性染料を使用することが興味深い。
【０１１６】 セリンラセマーゼ活性の指標としてＮＭＤＡ受容体活性化を測定するアッセイ
において、ＮＭＤＡ受容体及びセリンラセマーゼの両方に対する組換え体である
細胞系を作成することが有用であり得る。エクオリンベースの信号発生システム
を使用しようとするときには、出発細胞系はエクオリンを生成するように発現構
築物で安定的にトラクスフェクトしたものであり得る。
【０１１７】 実施例７ トランスジェニック動物 導入遺伝子としてセリンラセマーゼを発現するトランスジェニック動物を以下
のように用意する。セリンラセマーゼヌクレオチド配列（例えば、完全長セリン
ラセマーゼをコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列）を有
するポリヌクレオチド、またはラセマーゼの部分配列及び／またはコード配列に
隣接する配列をコードするポリヌクレオチドを動物のゲノムにポリヌクレオチド
を組込むためのベクターに組み入れ得る。セリンラセマーゼ配列はヒトセリンラ
セマーゼまたは動物セリンラセマーゼ由来であり得る。
【０１１８】 この実施例では、導入遺伝子導入のための標的細胞はマウス胚性幹細胞（ＥＳ
）である。ＥＳ細胞はインビトロで培養したヒト以外の各種動物の挿入前胚から
入手し、胚と融合し得る（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５
４−１５６（１９８１）；Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３０９：２５５−
２５８（１９８４）；Ｇｏｓｓｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，８３：９０６５−９０６９（１９８６）及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎら
，Ｎａｔｕｒｅ，３２２：４４５−４４８（１９８６））。
【０１１９】 導入遺伝子は微量注入によりマウスＥＳ細胞に導入するが、ＤＮＡトランスフ
ェクションまたはレトロウイルス媒介形質導入のような各種の標準方法を使用す
ることができる。次いで、注入したＥＳ細胞をヒト以外の動物由来の芽細胞と混
合する。導入したＥＳ細胞は胚をコロニー化し、生じたキメラ動物の生殖系列に
寄与する（Ｒ．Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１４６８−１４７
４（１９８８））。キメラマウスを、生殖系統の形質転換が生じた個体について
スクリーニングする。前記マウスを交雑して、導入遺伝子に対してホモ接合の動
物を作成する。
【０１２０】 標的化組換え及び得られたマウスを当業界で公知の方法により評価する。その
方法には標的化アレレを検出するためのＤＮＡ（サザン）ハイブリダイゼーショ
ン、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡ
ＧＥ）、及びＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を検出するためのウェスタンブロッ
トが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２１】 導入遺伝子ベクターの構築に応じて３つの基本タイプのトランスジェニック動
物が作成される。完全長ヒトセリンラセマーゼをコードするヌクレオチド配列を
含め且つ動物の内因性セリンラセマーゼ遺伝子以外の部位で組込まれるようにベ
クターを設計するならば、生じたトランスジォニック動物は自然及びヒトセリン
ラセマーゼの両方を発現する。コグネートセリンラセマーゼを含まず且つ組込み
後内因性遺伝子を動物が機能性セリンラセマーゼを欠く程度に変更するように動
物の内因性セリンラセマーゼ遺伝子の部位で組込まれるように設計するならば、
ノックアウトマウスが得られる。最後に、ベクターを内因性セリンラセマーゼ遺
伝子をヒト遺伝子で置換させるべく設計するかまたはヒト遺伝子のアミノ酸配列
をコードするように内因性遺伝子の配列を変化させるべく設計、すなわちヒト化
するならば、生じた動物は自然セリンラセマーゼを欠き、ヒトセリンラセマーゼ
を発現する。ヒト遺伝子を有し、内因性遺伝子を欠く動物は、ノックアウトに対
して同型遺伝子接合であり、追加ヒトセリンラセマーゼ遺伝子に対して同型遺伝
子接合である動物が得られるように第１タイプの動物をノックアウト動物と交雑
させることによっても作成し得る。これは、内因性セリンラセマーゼ遺伝子を有
する染色体とは異なる染色体にヒト遺伝子を組込む場合に容易であり得る。
【０１２２】 トランスジェニック動物はセリンラセマーゼモジュレーション、活性化または
阻害のアッセイにおいて使用するための細胞及び組織源である。細胞を動物から
除去し、細胞系として樹立し、都合がよければ培養物中に維持され得る。
【０１２３】
【表１】
【０１２４】 実施例は本発明を実施する際のガイドラインとして提示したのであって、請求
の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものではない。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 9/99 9/00 Ｃ１２Ｑ 1/02 9/99 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ａ Ｂ (72)発明者 リウ，ユアン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 (72)発明者 シア，メンハン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065−0907、ローウエイ、イースト・リ ンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA07 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA04 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA18 QQ08 QR01 QR67 QS31 4B065 AA91X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA27 CA44 CA46

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリ
    ヌクレオチド、（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的な
    ポリヌクレオチド、及び（ｄ）緊縮条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリ
    ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる群から選択される
    組換えポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドが自然、非自然及び修飾ヌクレオチドから
    なる群から選択されるヌクレオチドからなる請求の範囲第１項に記載のポリヌク
    レオチド。
  3. 【請求項３】 ヌクレオチド間結合が自然結合及び非自然結合からなる群か
    ら選択される請求の範囲第１項に記載のポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
    ードするポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリ
    ヌクレオチド、（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的な
    ポリヌクレオチド、及び（ｄ）緊縮条件下で（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリ
    ヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドからなる群から選択される
    ポリヌクレオチドを発現する発現ベクター。
  5. 【請求項５】 請求の範囲第４項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  6. 【請求項６】 （ａ）適当な宿主を請求の範囲第４項に記載の発現ベクターを用いて形質転換さ
    せるステップ、 （ｂ）ステップ（ａ）の宿主細胞を発現ベクターからセリンラセマーゼタンパク
    質を発現させ得る条件下で培養するステップ を含む組換え宿主細胞からセリンラセマーゼタンパク質を発現させる方法。
  7. 【請求項７】 配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えポリペプチド。
  8. 【請求項８】 候補化合物がセリンラセマーゼポリペプチドの阻害剤である
    かどうかを調べる方法であって、 （ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチド及び（ｉｉ）配列番号１由来のコード配列を有するポリヌクレオチ
    ドからなる群から選択されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを有する少な
    くとも１つの宿主細胞を用意するステップ、 （ｂ）前記の少なくとも１つの宿主細胞を、候補化合物がセリンラセマーゼポリ
    ペプチドと相互作用し得るように候補化合物と接触させるステップ、及び （ｃ）前記候補化合物の存在下でのポリペプチドの相対活性を確かめることによ
    り該候補化合物がセリンラセマーセポリペプチドの阻害剤であるかどうかを調べ
    るステップ を含む前記方法。
  9. 【請求項９】 ステップ（ｃ）で、ステップ（ｂ）前の少なくとも１つの細
    胞のセリンラセマーゼポリペプチド活性の測定値とステップ（ｂ）後の少なくと
    も１つの細胞のセリンラセマーゼポリペプチド活性の測定値を比較することによ
    り相対活性を測定する請求の範囲第８項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 更に、候補化合物と接触していないセリンラセマーゼポリ
    ペプチドを用いる対照アッセイを含む請求の範囲第８項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 機能的内因性セリンラセマーゼ遺伝子を欠くトランスジェ
    ニック動物。
  12. 【請求項１２】 更に、ヒトセリンラセマーゼ遺伝子を含む請求の範囲第１
    ２項に記載の動物。
  13. 【請求項１３】 ヒトセリンラセマーゼの活性が内因性セリンラセマーゼの
    活性の非存在下での神経組織のホモジネート中で検出可能である請求の範囲第１
    ２項に記載の動物。
  14. 【請求項１４】 請求の範囲第１３項に記載の動物に由来する細胞系。
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