CZ139496A3 - Endothelin-converting enzyme - Google Patents

Endothelin-converting enzyme Download PDF

Info

Publication number
CZ139496A3
CZ139496A3 CZ961394A CZ139496A CZ139496A3 CZ 139496 A3 CZ139496 A3 CZ 139496A3 CZ 961394 A CZ961394 A CZ 961394A CZ 139496 A CZ139496 A CZ 139496A CZ 139496 A3 CZ139496 A3 CZ 139496A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
leu
seq
glu
asn
ala
Prior art date
Application number
CZ961394A
Other languages
English (en)
Inventor
Burkhard Dr Kroger
Harald Dr Seulberger
Thomas Dr Meyer
Martin Dr Schmidt
Elard Dr Jacob
Rainer Dr Otter
Thomas Dr Subkowski
Heinz Dr Hillen
Original Assignee
Basf Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19934339100 external-priority patent/DE4339100A1/de
Priority claimed from DE19944403665 external-priority patent/DE4403665A1/de
Priority claimed from DE19944412372 external-priority patent/DE4412372A1/de
Application filed by Basf Ag filed Critical Basf Ag
Publication of CZ139496A3 publication Critical patent/CZ139496A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6497—Endothelin-converting enzyme (3.4.24.71)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24071—Endothelin-converting enzyme 1 (3.4.24.71)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)

Description

Oblast techniky
Předložený vynález se týká enzymů, způsobů jejich výroby a endothelin konvertujících jej ich použití.
Dosavadní stav techniky
Zvýšená hladina endothelinu se vyskytuje v souvislosti s mnoha chorobami jako je základní hypertonie, srdeční infarkt, akutní selhání ledvin, šok a srdeční selhání. Na takové souvislosti je možno také usuzovat podle výsledků dosažených s endothelin-proti látkami. Ve zvířecích modelech mohla tak být snížena velikost srdečního infarktu v závislosti na dávce (Watanabe a spol., Nátuře 344, 114 (1990), pozitivně ovlivněna funkce ledvin (Kon a spol., J.Clin.Invest. 83, 1762 (1989)) a snížena nefrotoxicita cyklosporinu (Kon a spol., Kidney Int. 37, 1487 (1990)).
Endothelin konvertující enzym (ECE-1) uvolňuje endothelin 1 ze 38 aminokyselin složené prekurzorové molekuly Big-endothelin-1. Proti endothelinem-1 působeným nežádoucím biologickým účinkům je možno např. působit inhibici endothelin konvertujíčího enzymu a tím biosyntézy endothelinu.
Existují enzymové aktivity, které uvolňují endothelin popř. endothelinu podobné molekuly z odpovídajících prekurzorových molekul, big-endothelinu, které byly izolovány z různých buněčných linií (Takeda a spol., Biochem.Biophys.
Res.Comm..176, 860 (1991), Ohnaka a spol.,
Biochem.Biophys.Res.Comm. 168, 1128 (1990), Matsumura a spol., FEBS Lett. 293, 45 (1992), Ahn a spol., Proč.Nat1.Acad.Sci.
USA 89, 8606 (1992), PCT WO 92/13944, Ohnaka a spol., Clin.Exp.Hypertension A 14; č. 4 (1992), Okada a spol., Biochem.Biophys.Res.Comm. 180, 1019 (1991), Takada a spol., Biochem.Biophys.Res.Comm. 182, 1383 (1992), Opgenorth a spol FASEB 6, 2653 (1992)).
Tyto enzymové aktivity jsou však dosud nedostatečně charakterizovány. Jsou považovány za málo bohaté enzymové směsi. Takové nečisté enzymové směsi jsou však pro použití ve zkušebních postupech pro zjištění specifických ECE-inhibitorů málo vhodné, protože jiný, fyziologicky nerelevantní cizí proteásy významně ruší enzymový test.
Například se tak štěpí big-endothelin také serinproteásou chymotrypsinem jakož i papainem, thermolysinem a NEP 24.11 na endothelin a endothelinu podobné produkty, které ve zkušebním postupu byly falešně přiřazeny enzymu ECE. Proto je popis endothelin konvertujíčího enzymu v literatuře rozporuplný.
údaje o molekulové hmotnosti endothelin konvertujíčího enzymu se mění od 65 kDalton do 540 kDalton; údaje o hodnotách Km a vmax se rovněž vzájemně liší (Opgenorth a spol., FASEB 6, 2653 (1992); Sawamura a spol., Biochem.Biophys.Act 1161, 295 (1993)). Je tak rozpor v tom, zda endothelin konvertující enzym zařadit do rodiny aspartatproteas nebo metaloproteas (Sawamura a spol., Biochem.Biophys.Acta 1161, 295 (1993); Biochem. Pharmacol. 43, 845 (1992). Dále jsou v literatuře rozporuplné údaje o charakteristických údajích, zda se u metaloproteas jedná o cytoplasmatický nebo membránově navázaný enzym a které substráty jsou příslušným ECE přeměňovány (Big-Et-1; Big-Et-3: Matsumura a spol. (FEBS Lett. 293, 45 (1992)): Takahashi a spol., (J.Biol.Chem. 268; 21394 (1993)); Okada a spol., (Biochem.Biophys.Res.Comm. 180, 1019 (1991));Ohnaka a spol. (Clin.Exp.Hypertension A 14; č. 4 (1992)); Matsumura a spol. (FEBS Lett. 305; 86 (1992)).
Dosud nebyl uveden jednoznačný popis ECE, který by umožňoval jednoznačně definovat ECE. Takovou definici bude možno provést teprve určenín primární struktury, aminokyselinové sekvence, ECE. Proto je nutné ECE nejprve vyrobit v čisté formě.
Vyvstala tak úloha připravit endothelin konvertující enzym v čisté formě.
Podstata vynálezu
Byl nalezen endothelin konvertující enzym, který se vyznačuje molekulovou hmotností 250 000 Dalton a parciální aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO; 1.
Endothelin konvertující enzym podle předloženého vynálezu vykazuje následující znaky: vykazuje molekulovou hmotnost stanovenou pomocí SDS-polyakrylamid-gelové elektroforézy za neredukčních podmínek přibližně 250000 Dalton.
Za redukčních podmínek vykazuje při SDS-polyakrylamidové elektroforéze pruh 125000 Dalton; sestává podle všeho z homodimeru.
Endothelin konvertující enzym je glykosylován.
Enzymatické odstranění zbytku cukru působí změnu zjevné molekulové hmotnosti ze 125000 Dalton na asi 82000 Dalton.
Sekvencování tryptických peptidů endothelin konvertujícího enzymu poskytuje následující aminokyselinové parciální sekvence SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6.
Další charakterizace endothelin konvertujíčího enzymu podle předloženého vynálezu je uvedena v příkladech.
Další podstatou vynálezu jsou endothelin konvertující enzymy, vyznačující se molekulovou hmotností asi 250000 Dalton a aminokyselinovou parciální sekvencí, která vykazuje alespoň 50% homologii se SEQ ID NO: 1.
Takové endothelin konvertující enzymy je možno izolovat z jiných organismů než je hovězí dobytče, například z lidských buněk.
Vynález se týká dále endothelin konvertujících enzymů, které obsahují v SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 36 popsanou polypeptidovou sekvenci nebo její funkční fragment.
Funkčními fragmenty se rozumí takové parciální sekvence, které ještě vykazují enzymatickou aktivitu endothelin konvertujíčího enzymu, antigenní vlastnosti nebo afinitu k ligandům, například vazebným proteinům.
Další funkční fragmenty jsou takové polypeptidové sekvence, které jsou připravítelné ze SEQ ID NO: 30 nebo NO:
inzercí, delecí nebo substitucí aminokyselin nebo peptidů a které ještě v podstatě vykazují enzymatickou aktivitu endothelin konvertujíčího enzymu a/nebo imunologicky křížově reagují s endothelin konvertujícím enzymem vzorce SEQ ID NO:30 nebo NO:36.
Další podstatou vynálezu jsou DNA-sekvence, které kódují endothelin konvertující enzym a které jsou zvoleny ze skupiny
a) DNA-sekvence se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 29 nebo SEQ ID NO: 35,
b) DNA-sekvence, které kódují protein se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 30 nebo SEQ ID NO: 36 a
c) DNA-sekvence, které za standardních podmínek hybridizují s DNA-sekvencemi a) nebo b),
d) DNA-sekvence, které kódují proteinový produkt, který může být rozpoznáván protilátkami, které se vytvoří proti proteinu SEQ ID NO: 30 nebo 36 nebo z něj generovaným fragmentům.
Standardními podmínkami jsou například míněny teploty mezi 42 a 58 0C ve vodném tlumivém roztoku s koncentrací mezi 0,1 a 1 x SSC (1 x SSC; 0,15M NaCI, 15 mM citrát sodný pH 7,2). Experimentální podmínky pro DNA-hybridizaci jsou uvedeny v učebniůích genové techniky, například v práci Sambrooka a spol., Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Výroba takových DNA sekvencí je popsána v příkladu 8. DNA sekvence, jejichž proteinové produkty jsou rozpoznávány protilátkami, které byly generovány proti proteinům SEQ ID NO: 30 nebo 36 nebo jejich fragmentům, je možno získat podle dobře známých metod.
Výroba protilátek proti takovým proteinům je např. popsána v práci Hudsona L. a Haye F.C., Practical Immunology, Blackwell Sci.Pub., Oxford, 1980.
Použití protilátek k vyhledání cDNA-sekvencí, které kódují s těmito protilátkami křížově reagující proteiny, je například popsáno v: DNA Cloning Vol.I, Glover D.M.,Ed., IRL
Press Oxford, 1985.
Vynález se dále týká způsobů výroby endothelin konvertujícího enzymu, které se vyznačují tím, že se savčí buňky, výhodně endothelové buňky, stimulují s inhibitorem endothelin konvertujícího enzymu k nadměrné produkci endothelin konvertujícího enzymu a z těchto buněk se endothelin konvertující enzym izoluje běžnými prostředky proteinové chemie.
Pro indukci ECE v savčích buňkách mohou být použity všechny ECE inhibitory. Jsou proto vhodné ECE-inhibitory například popsané v JP-146737; JP 05148277-A1; Jpn.J.Biochem. 64; (8) Abst.2367 (1992); Derwent NCE-93-0956 (1993); Derwent NCE-93-0971 (1993); J.Med.Chem. 36, 173 (1993); EP518299-A2. Výhodně se používá fosforamidon. Stimulují se buňky v kultuře přídavkem těchto inhibitorů k mediu pro kultivaci buněk po 6 hodin až 6 dnů. Výhodně se však stimulace provádí po 2-3 dny. Použité koncentrace inhibitorů činí 10-2 M až ΙΟ7 M, výhodně 10-3 až ΙΟ-·* m.
Výroba endothelin konvertujícího enzymu podle předloženého vynálezu je však také možná genově technickou cestou. Na základě popsaných aminokyselinových parciálních sekvencí je možno vyrobit syntetické oligonukleotidy, které kódují tyto sekvence nebo jsou komplementární k těmto kódujícím sekvencím. Tyto oligonukleotidy mohou být použity jako hybridizační sondy k izolaci odpovídajících genů nebo cDNA-molekul z genového poolu jako jsou genové banky nebo cDNA-pooly. Tento typ genové izolace je znám odborníkovi z učebnic molekulární biologie jako je Sambrook, Fritsch, Maniatis; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Ί
Press, 1989, USA.
Za pomoci vhodných syntetických oligonukleotidů a polymerasové řetězové reakce (PCR) mohou být získány rovněž části genů například z cDNA-bank nebo prvního řetězce cDNA (PCR-protokoly); Academie Press; San Diego; USA; 1990). Oligonukleotidy, které jsou k tomuto vhodné je možno odvodit z peptidů popsaných pod SEQ ID NO.l až 6 převedením aminokyselinové sekvence do dvoj řetězcové DNA sekvence (sense a antisense). Přitom mohou na základě degenerovaného genetického kódu být odvozeny degenerované oligonukleotidové směsi z peptidů a nalézt pak použití jako primer.
Oligonukleotidy mohou být odvozeny z peptidů také s ohledem na takzvané codon usage; preferenčně užitého u jednoho druhu, v tomto případě hovězího dobytka, z určitých nukleotid-tripletů pro aminokyselinu. PCR se pak provádí se dvěma odlišnými oligonukleotidy jako primery, přičemž mohou být pro PCR potřebné dva primery složeny ze řetězce (sense) a protiřetězce (antisense) oligonukleotidu. Rovněž použití mohou nalézt oligonukleotidy, které jsou odvozeny z částí cDNA-vektorú, nebo oligo-dT pro 3' část mRNA.
Tyto genové části mohou pak být opět použity pro získání kompletního genu nebo úplné cDNA způsobem genové izolace.
Tímto způsobem je možno nejen izolovat geny pro endothelin konvertující enzym , ale také geny popř. varianty endothelin konvertujícího enzymu z jiných organismů, například lidí, které vykazují nejméně 80% homologii v oblasti proteinů vzhledem k SEQ ID NO:1.
Endothelin konvertující enzymy podle předloženého vynálezu je možno zvláště dobře připravit tak, že se izoluje odpovídající gen a tento gen se exprimuje v hostitelském organismu obvyklými genovětechnickými metodami.
ECE podle předloženého vynálezu nebo z nich odvozené peptidy mohou být použity pro výrobu protilátek nebo fragmentů ptotilátek jako jsou např. Fv-fragmenty, které například mohou být použity ke stanovení ECE, ve zkušebních postupech pro identifikaci látek, potlačujících ECE nebo jako inhibitory ECE.
Takové protilátky jsou obecně užívané v diagnostice chorob, na kterých se podílí endothelin konvertujicí enzym, jako cenná pomocná činidla.
Pro tyto účely mohou být také použity PCR-primery, které jsou odvozeny od DNA sekvencí podle předloženého vynálezu, například pro měření ECE-transkripce nebo stanovení genotypu.
Za pomoci získaných genů mohou být odborníkovi známým typem a způsobem zvířata změněna ve své genové podstatě tak, že obsahují jednu nebo více extrakopií tohoto genu nebo že normální ECE-gen byl vypnut. Tato transgenní zvířata jsou mezi jiným vhodná k pokusným účelům.
Samy endothelin konvertujicí enzymy jsou vhodné také jako účinná látka pro výrobu léčiv, například u onemocnění, která jsou provázena zvýšenou hladinou ECE-substrátů jako je např. bradykinin, substance P, somatostatin, neuropeptid Y. Takové choroby jsou například záněty, astma, migréna, rheuma, celulární procesy a buněčná proliferace, které probíhají za účasti peptidu jako růstových faktorů. Použití mohou ECE nalézt také jako léčivo při chorobách, na kterých se podílí vasodilatace, která může být potlačena podáním ECE, např.
septickém šoku, migréně, poruchách potence.
Pro použití ECE jako léčiva může být za určitých okolností nutné část ECE mutačně změnit. Tyto mutační změny mohou například vést s ECE-derivátu, který není glykosylován nebo který neobsahuje žádnou membránovou kotvu (rozpustný ECE). Takový rozpustný ECE, který již neobsahuje žádnou membránovou kotvu, může například být vyroben expresí ECE-fragmentu, který obsahuje extracelulární, katalyticky účinnou doménu. Mohou být například získány takové ECE-fragmenty, ve kterých je kódující sekvence mezi aminokyselinami 20 a 703 ze SEQ ID NO: 25, výhodně mezi aminokyselinami 27 a 703 ze SEP ID NO: 25 spojena se DNA sekvencí in vivo odštěpítelného signálního peptidu a zavedena ve vhodném expresním vektoru do eukaryotických buněk. Jako signální peptid je vhodná např. sekvence lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru (Tissue Plasminogen Activator) mezi polohami aminokyseliny -35 a -4 (Collen D., Nátuře 301, 214 až 221 (1983)). Změny přitom mohou ovlivňovat například specifičnost, dobu působení, příjem. Dále mohou funkční části ECE být kopulovány s částmi jiných proteinů pro získání nových proteinů, které mohou nalézt použití jako léčiva. Změněna mohou být také ECE kovalentní modifikací s nepeptidickými molekulami jako např. je PEG, dextran, mastné kyseliny.
DNA-sekvence podle předloženého vynálezu jsou vhodné také pro použití v genové terapii, například pro výrobu genověterapeutických léčiv. Choroby se zvýšenými hodnotami endothelinu mohou být také léčeny oligonukleotidy odvozenými od ECE-DNA-sekvence. Tyto oligonukleotidy jsou odvozeny z nekódujícího DNA-řetězce (anti-sense) a mohou být použity jako léčiva. Na nich založená anti-sense-terapie výhodně využívá stabilnější chemické deriváty odvozené od oligonukleotidů.
Mohou být například použity anti-sense-oligonukleotidy, které byly syntetizovány vhodně z oblasti, která je definována polohami 31 až 100 Seq ID 35. Anti-sense-oligonukleotidy výhodně mají délku 15 až 30 zbytků. Anti-sense terapie nebo prevence nachází použití u chorob se stejnými indikacemi jako ECE-inhibitory, např. cerebrální ischemie; subarachnoidální krvácení; vasospasmy; koronární ischemie; choroby, které jsou spojeny s buněčnými proliferačními procesy jako hyperplasie prostaty, jako atheroskleroza, jako restenoza; astma; hypertenze; pulmonální krevní vysoký tlak; orgánové selhání jako srdeční selhání a ledvinové selhání; ledvinová ischemie; nefrotoxicita; infarkt myokardu; koronární srdeční onemocnění; sepse.
Z DNA-sekvence ECE mohou být také odvozeny sekvence, s nimiž mohou být vyrobeny katalytické RNA-molekuly, takzvané ribozymy. Tyto katalytické RNA-molekuly působí tím, že se po aplikaci ECE-RNA nebo ECE-DNA štěpí nebo inaktivují a tak brání proteinové syntéze ECE.
ECE-DNA-sekvence mohou být využity pro ustavení vhodných expresních vektorů do buněk, které exprimují tento enzym. Tyto buňky nacházejí použití mezi jiným jako léčiva.
Výhodně nacházejí endothelin konvertující enzymy použití v analytických postupech k identifikaci ECE potlačujících látek. Tyto analytické postupy jsou obvykle enzymatické reakce, při kterých se měří ECE-katalyzované štěpení substrátu za přítomnosti potenciálních potlačujících látek.
Další podstatou vynálezu jsou látky, potlačující endothelin konvertující enzym, které jsou identifikovány enzymovým testem za použití endothelin konvertujíčího enzymu podle předloženého vynálezu.
K vynálezu také patří způsob výroby léčiv, která inhibují konverzi endothelin konvertujícího enzymu, vyznačující se tím, že se známé chemické sloučeniny použijí v enzymovém testu zy použití endothelin konvertujícího enzymu podle předloženého vynálezu a identifikují se ty, které mají inhibující účinek a takto identifikované sloučeniny se formulují s běžnými nosičovými nebo pomocnými látkami jako léčivo.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Stimulace ECE-1 v primárních buňkách hovězího endothelu FBHE fosforamidonem trubičky se zmrazenými FBHE-hovězími endothelovými buňkami (ATCC CRL 1395) se ve 14.pasáži roztaví a umístí do 3 T175-lahví pro buněčnou kultivaci (fa. Sarstedt) se 40 ml růstového media DMEM (Gibco č. 041-01965) + 5 ml/500 ml glutaminu (200 mM; Gibco 043-05030) + 1 ml/500 ml gentamycinu (Gibco 043-05750) + neesenciální aminokyseliny; konečná koncentrace: 1 x (Gibco č. 043-01140) + 10 % FCS (Gibco č. 011-06290; inaktivováno 37 minut při 56 °C) + 25 ng/ml bázického FGF (Intergen 4125-80)).
Tyto buNky se inkubují standardním způsobem při 37 °C; v atmosféře ze 7 % CO2; 100% vzdušné vlhkosti. Následující den se provede výměna media. Při dosažení konfluence - v tomto případě po 4 dnech - se buňky pasážují standardním způsobem zpracováním trypsinem a rozdělí se do 9 T-175-lahví a inkubují za účelem růstu při 37 °C jak bylo popsáno. Po 3 dnech a dosažení konfluence se buňky znovu po standardním zpracování s trypsinem rozdělí do 20 T-lahví. Po dalších 3 dnech mohou být buňky rozděleny do 40 T-lahví. Po dalších 3 dnech se těchto 39 T-lahví rozdělí do 78 T-lahví. Protože se těchto 78 T-lahví použije ke sklizení buněk, jsou zapotření lahve vhodné pro buněčnou kultivaci (fa. Costar; Accell; č. 3155). Den po naočkování těchto T-lahví se do 68 lahví přidá fosforamidon (fy Peptide Institute; č. 4082; zkráceně PHAM) v konečné koncentraci 10-4M (+PHAM). Toto ošetření vede k vyvolání ECE-aktivity. Zbylých 10 T-lahví představuje neindukované kontrolní buňky (-PHAM). Po dalších 2 dnech inkubace za ppsaných podmínek se PHAM-indukované buňky a kontrolní buňky (-PHAM) odděleně sklidí. Za tím účelem se lahve otevřou a medium se vyklopí. Buňky se v T-lahvích promyjí vždy s 10 ml PBS (Boehringer Mannheim č. 210331) (tj. nad buněčnými rasami opatrně natáčí). PBS se vyklopí. Znovu se přidá 5 ml PBS na T-lahev. Buňky se odtrhnou ode dna kultivační buňky pomocí buněčného škrabáku (Cel1-Scraper, fa Costar č. 3010) a jako buněčná suspenze se převedou do 150ml odstředivkových zkumavek (Falcon č. 2076), a uloží se na led. Každá T-lahev se pak vypláchne 10 ml PBS. Buněčná suspenze se po vypláchnutí spojí s předchozí buněčnou suspenzí v odstředivkových zkumavkách. Buňky sedimentují odstředěním (1200 ot./min, 10 minut, Heraeus Christ Minifuge GL č. 4400, rotor 2150). Buněk prostý supernatant se odloží a peleta vyjme do 3-násobných objemů PBS buněčného sedimentu. Po novém odstředění se buněk prostý supernatant znovu odloží. Peleta se až do zpracování uloží na led.
Příklad 2
Srovnávací obohacení nestimulovaných a fosforamidem stimulovaných buněk hovězího endothelu; identifikace proteinu
Podle příkladu 1 získané FBHE-buňky s nebo bez fosforamidonové indukce (vždy 500 μ vlhké hmoty) byly zpracovávány ultrazvukem v 15 ml PBS-pufru, 0,5 mM diisopropylfluofosfátu 20 minut v ledové lázni. Po odstředění (20 min, 1000 g) se-membrány přídavkem 5 % Pluriolu F68R vysráží do supernatantu a získají novým odstředěním při 10000 g. Membrány se digerují se 2 ml 100 mM Tris-pufru, pH 8,0 a solubilizují s 1 % Tritonu X-100R. Solubilizáty (vždy 2,5 ml) se odstředí, zbytky se odloží.
Mono-Q + -chromatografi e
Solubilizáty +/- -fosformaidonem indukovaných buněk se oddělí na sloupci mono Q+ HR 5/5 (fa Pharmacia) za přesně stejných podmínek chromatografie. Sloupce se ekvilibrují 50 ml Tris-pufru, pH 8,0, 0,1 % Triton X-100 (A-pufr). Po nanesení solubilizátů se 15 min promývá A-pufrem a 50 min gradientem lineárně B-pufrem (A pufr + 1 M NaCI (průtok 0,2 ml/min). 20 frakcí po 0,5 ml se odebere a testuje s lidským Big Et-1 jako substrátem. Vytvořený Et-1 se prokazuje pomocí HPLC s reverzní fází popsaným způsobem (příklad 3) a kvantifikuje se. Obě frakce s nejvyšší enzymovou aktivtou se vždy spojí.
Superose 12R-gelová chromatografie
Eluáty z Mono G-chromatografií se koncentrují pomocí CentriconR-trubiček (Fa.Amicon) na 250 μί a vždy gelově chromatografují přes Superosu 12 HR10/36.
Podmínky: pufr:
tok: f rakce:
mM fosforečnan sodný 250 mM NaCI, pH 7,4 0,05 % Triton X 100 0,5 ml/min 0,5 ml
Podle testu popsaného v příkladu 3 se testují frakce a vždy se spojí 2 frakce s nejvyšší enzymovou aktivitou.
Stanovení proteinu všech frakcí se provede metodou podle Bradforda (Anal.Biochem. 72, 248 (1976)).
Výsledky
Čištění stimulovaných a nestimulovaných buněk poskytlo následující výsledky v různých stupních čištění:
Stupeň čištění spec.akt.(pj/mg) FBHE-buňky + fosforamidon Pg/mg FBHE-buňky - fosforamidon
membrány 129 44
solubi1 i zát 188 22
Mono Q-chromat. 1470 78
Superose 12-chromat. 4500 130
Obě aktivní frakce Superose 12R-chromatografie se pro porovnání vloží na 8% SDS-polyakrylamidový gel. Průběh na gelu u přečištěného ECE-1 z fosforamidonem zpracovaných buněk ukazuje ve srovnání s neošetřenými bňkami přídavné pásy při 250000 Dalton. Při nanesení proteinů s redukčním činidlem dithiothreitolem (DTT), ukazuje se ve srovnání přídavný pás při 125000 Dalton.
Příklad 3
Test ECE-l-aktivity pomocí HPLC
Přeměna Big-endothelinu-1 na endothelin-1 pomocí endothelin konvertujícího enzymu (ECE-1) μΐ roztoku enzymu získaného podle příkladu 4 se smísí se 21 μΐ 50 mM Tris, 50 mM imidazolu, 250 mM NaCI, pH 7,4 pufru a 2,5 μΐ lidského Big-endothelinu (2 mg/ml v 0,1% kyselině octové ve vodě). Po 2 hodinách se reakce za účelem analýzy vytvořeného endothelinu ukončí 72 μΐ 0,5% kyseliny trifluoroctové. Vzorky se odstředí a supernatant seidentifikuje analýzou pomocí vysokotlakové chromatografie s reverzní fázi (RP-HPLC), jak je popsáno (J.Takada a spol., Biochem.Biophys.Res.Comm. 176, 860 (1991), K.Ohnaka a spol., Biochem. Biophys.Res.Comm. 168, 1128 (1990)) a kvantifikuje se porovnáním s endothelinovými standardy pomocí UV-detekce (205 nm) .
Enzymová aktivita se pak spočte jako aktivita 10~μΜ endothelin
ECE[pj] = min
Po tomto způsobu se stanoví ECE-aktivita zpracování PBHE-buněk k různým stupňům čištění. Současně se stanoví množství proteinu metodou podle Bradforda (Anal.Biochem. 72, 248 (1976)).
Příklad 4
Čištění ECe-1 z buněk hovězího endothelu, FBHE
a) Získání membrán, trypsinizace cizího proteinu ml FBHE-buněčných pelet (podle příkladu 1) se digeruje ve 25 ml PBS-pufru a 15 min uzavře v ultrazvukové lázni za chlazení ledem. Buněčné zlomky se odstraní odstředěním při 10000 g, 20 min. Supernatant se smísí za míchání s 3,6 g trypsinu a 1,5 h míchá při teplotě místnosti. Vzorky se odstředují 1 h při 100000 g a ve zbytku se nacházející membrány se suspendují se 25 ml 100 mM Tris-pufru, pH 8,0.
b) Solubilizace ECE-1 ml membránové suspenze se upraví na 0,5 mM diisopropylfluorfosfátu a pak 0,5 % Tritonu X-100R a uchovávají se přes noc v ledové lázni.
c) Mono-QR-chromatografie
Mono QR-FPLC-sloupec, HR16/10, fa Pharmacia se ekvilibruje s 50 mM Tris-pufru, pH 8,0; 0,05 % Tritonu X 100R (A-pufr).
Po nanesení solubilizátů se 30 min promývá A-pufrem a pak lineárními gradienty během 100 minut až do pufru B (pufr A + 1 M NaCI). Odebere se 30 frakcí po 10 ml. Obsah proteinu ve vzorcích se stanoví Bradfordovou metodou, ECE-1 aktivita jako v příkladu 1.
Obě frakce s nejvyššími specifickými aktivitami se spojí.
d) Gelová filtrace
Spojené Mono QR-eluáty podle 4c) se koncentrují přes 30 KDa-Centricon-membránu (fa Amicon) na 500 μϊ.
Sloupec Superosy 12R, HR 10/30 (fy Pharmacia) se ekvilibruje se 20 mM Na-fosfátového pufru, pH 7,4, 250 mM NaCI, 0,05 % Tritonu X 100 a koncentrované vzorky se nanesou Při průtoku 0,5 ml se chromatografuje ekvi1ibračním pufrem a odebírají se frakce 0,5 ml.
Stanovení specifické aktivity frakcí se provede jako ve 4c). Frakce s nejvyšší specifickou aktivitou je uvedena pod
e); eluuje při asi 250000 Dalton, kalibrováno na standardní proteiny za stejných chromatografických podmínek.
e) Výsledky
Stupeň čištění membrány solubi1izát Mono Q-eluát Superose 12-eluát protein (mg)
6,6
0,35 spec.aktivita (Uj/mg)
410
360
3760
15100
Příklad 5
SDS-gel-analýza přečištěného ECE-1 z FBHE-buněk
Podle příkladu 4 přečištěný ECE-1 se analyzuje na 8% SDS-gelu podle Lámmliho (Nátuře 227, 680 (1979)) za neredukujicích a redukujících podmínek (+DTT). ECE-1 má v neredukovaném stavu molekulovou hmotnost 250000 Dalton a rozpadá se po redukci na široký pás kolem 125000 Dalton.
Příklad 6
Deglykosylace ECE-1 μΐ podle příkladu 4 přečištěného ECE-l-roztoku se upraví 10% SDS-roztokem na obsah 0,25 %-SDS. Vzorky se inkubují 20 min při teplotě místnosti a upraví na 1 % Tritonu X-100. Po 20 min při teplotě místnosti se přidá 5 μΐ 250 mM Na-fosfátového pufru, pH 7,4. Potom se přidá 0,25 μΐ PNGasy a přidá se 0,5 pg Endo F. Vzorky se inkubují při 37 °C 8 h. Potom se znovu přidají stejná množství enzymu a inkubuje se dalších 8 hodin při 37 °C. Pak se vzorky koncentrují na 50 μΐ a analyzují ve 4-12% SDS gelu.
Výsledky:
V redukovaném stavu se změní zjevná molekulová hmotnost ze 125000 Dalton odštěpením cukrového zbytku se směsí PNasy F/Endo F na asi 82000 Dalton.
Příklad 7
Parciální sekvence ECE-1 z buněk hovězího endothelu x 25 pg podle příkladu 4 získaného ECE-l-roztoku se preparativně nanese na 4-12% SDS-polyakrylamid-gradientové gely. Po obvyklém vybarvení pomocí Coomassie blue se gel odbarví a zavodní po 4 x 40 minut v čisté vodě. Při 250 kDa vybarvené pásy se vyříznou skalpelem a digerují se 200 μΐ 100 mM NHáHCCb-roztoku. Po přídavku 0,5 pg trypsinu se inkubují přes noc, supernatant se pak odloží. Zbytek se znovu inkubuje s 0,6 pg trypsinu 5 h při teplotě místnosti ve 200 pl NHáHCOs-pufru. Potom se vzorky odtáhnou dosucha ve speed-vac-zahušťovači. Zbytek se vyjme do 40 μϊ vody a míchá se 4 μϊ 40 mM roztoku dithiothreitolu. Potom se přidá při 37 °C 4 μϊ 100 mM roztoku jodacetamidu. Po 2 hodinách se vzorek odtáhne dosucha.
Vzniklé peptidy se oddělí přes 1 mm x 15 cm HPLC-sloupec s reverzní fází v lineárních 3-hodinových gradientech 0,5 % kyseliny trifluoroctové ve vodě po 0,5% kyselinu trifluoroctovou v 90% acetonitrilu. UV-aktivní frakce se spojí a stanoví se primární sekvence na sekvenátoru v plynné fázi.
Výsledky:
Byly stanoveny následující parciální sekvence:
SEQ ID NO: 1:
Xaa-Xaa-Pro-Asn-Ala-Leu-Asn-Phe-Gly-Gly-Ile-Gly-ValVal-Val-Gly-His-Glu-Leu-Thr-His-Ala-Phe...
SEQ ID NO: 2:
Xaa-Tyr-Xaa-Lys-Xaa-Gly-Asn-Leu-Arg-Pro
SEQ ID NO: 3:
Xaa-Ile-Ala-Xaa-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-Ile...
(Ile) (Ile)
SEQ ID NO: 4:
Xaa-Pro-Glu-Phe-Leu-Leu-Glu-Gly-Leu-Ile-Thr-Asp-Pro...
SEQ ID NO: 5:
Xaa-(Gln)-(Ala)“(Glu)“Asn~Val-Ile-Gln-Val-Xaa-Gln...
SEQ ID NO: 6:
Val-Glu-Ile-Val-Phe-Pro-Ala-Gly-Ile-Leu-Gln-Ala-Pro-(Phe)-Tyr-Thr (Thr)
V závorkách uvedené aminokyseliny nebyly absolutně jistě ident i f ikovány.
SEQ ID NO:1 dokládá, že se u ECE-1 jedná o nový protein z rodiny metaloproteás, protože ve srovnání se sekvencemi metalendopeptidasami NEP 24.11 a thermolysinu vykazuje významné homologie 72 % a 40 %.
Příklad 8
Výroba cDNA-sekvence, která kóduje endothelin konvertující enzym
a) Izolace RNA a výroba cDNA-banky
Celková RNA z FBH-buněk, které podle příkladu 1 byly stimulovány s fosforamidonem, nebo z HeLa-buněk, které podle příkladu 1 byly stimulovány s fosforamidonem, byla získána rozkladem ve guanidiumthiokyanátu. Přitom se pracovalo s materiály a podle návodu RNA Isolation Kit firmy Stratagene,
La Jolla, CA, USA (katalogové číslo 200345).
Polyadenylovaná messenger RNA byla selektována z celkové RNA z FBHE-buněk oligo(dT)-afinitní separací. Tento způsob byl prováděn s materiály a podle návodu PolyATract mRNA Isolation System firmy Promega, Madison, WI, USA (katalogové číslo
Z5200). Z polyadenylované messenger RNA byla s materiály a podle návodu ZAP-cDNA Synthesis Kit firmy Stratagene, La Jolla, CA, USA (katalogové číslo 200400) syntetizována cDNA, která pak byla s materiály a podle návodu Uni-ZAP XR GigapacklI Cloning Kit firmy Stratagene, La Jolla, CA, USA (katalogové číslo 237611) umístěna do lambda fágů.
b) Výroba oligonukleotidových sond pro RCE-PCR
Při klonování cDNA-fragmentů za pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR, viz Molecular Cloning, 2.vyd (1989), Sambrook J, a spol., CSH-Press, str.14.1 a dále) se vycházelo z peptidů uvedených v příkladu 7 se SEQ ID NO: 1 a NO:6.
Na základě genetického kódu se nechá ze SEQ ID NO: 1, poloha 16 až 22 odvodit oligonukleotidová směs s nukleokyselinovou sekvencí SEQ ID NO: 7:
5'-GGSCAYGARYTNACNCAYGC-3'.
Stejně je možno odvodit ze SEQ ID NO: 6, poloha 2 až 8 oligonukleotidovou směs se SEQ ID NO: 8:
5'-GARATYGTSTTYCCZGCZGG-3', jakož i ze SEQ ID NO:6, polohy 9 až 16 oligonukleotidovou směs se SEQ ID NO: 9:
5'-ATYCTSCAGGCYCCYTTYTAYAC-3'.
SEQ ID NO: 7 až NO:9 přitom odpovídají sekvenci kódujícího DNA-řetězce. Z důvodu degenerace genetického kódu může na různých polohách být přítomno více nukleotidů. Tím se získává pro SEQ ID NO:7 až 9 až 512násobná směsná komplexnost. Uvedené sekvence se syntefczují jako oligonukleotidy.
Následující oligonukleotidy byly přídavně syntetizovány jako 3' primer v RACE-PCR:
jakož i
A (z A-B-T18) (SEQ ID NO: 11):
jakož i
B (z A-B-T18) (SEQ ID NO: 12):
Syntézy se provádějí s DNA-syntetizérem Applied Biosystems Typ 360A. 01igonukleotidy se přečistí po odstranění chránících skupin elektroforeticky přes gel akrylamid/močovina.
c) Výroba DNA-templátů pro PCR pg celkové RNA nebo 1 pg Póly(A(+-RNA pod a) uvedených RNA-preparátů z fosforamidonstimulovaných FBHE buněk se převedou s 1 pg oligonukleotidu A-B-T18 (SEQ ID NO: 10) a za pomoci enzymu reverzní transkriptázy, do jednořetězcové DNA (i°cDNA). Pracuje se přitom s materiály a podle návodu SuperScript Preamplification System firmy Gibco BRL, Eggenstein, Německo (katalogové číslo 8089SA). Po ukončení reakce se produkty syntézy pomocí Geneclean II Kitu firmy BIO 101, La Jolla, CA, USA, vyčistí od menších molekul a přebytečných oligonukleotidů.
d) PCR a klonování části cDNA-sekvence
Polymerasová řetězová reakce se provede podle známých protokolů (viz Molecular Cloning, 2.vydání (1989), Sambrook J. a spol., CSH-Press, str. 14.1 a další). K tomu se použije princip proloženého primeru podle Frohmana M.A. a spol., (Proč.Nati.Acad.Sci. USA (1988) 85, 8998-9002) a mdifikovaný podle Fritze J.D. a spol. (Nucl.Acids Res. (1991) 19, 3747).
Jednotlivě se l°cDNA z c) amplifikuje vždy se 20 pmol oligonukleotidu SEQ ID NO: 8 a A (z A-B-T18). Podmínky přitom byly: 1’ 95 °C, 2* 55 °C, 3' 72 °C pro 35 cyklů.
PCR-produkty byly elektroforeticky rozděleny na 1,2% LMP-agarosa/TBE-gelu.
Z gelu bylo vyříznuto po celé délce skvrny asi 10 gelových lístků a tyto byly roztaveny jako separátní frakce s DNA-fragmenty stoupající molekulové hmotnosti.
Podíly těchto frakcí pak byly odděleně použity ve dvou PCR vždy se 20 pmol oligonukleotidu SEQ ID NO: 9 a B (s A-B-T18). Podíl agarosy přitom nepřekročí 1/10 objemu PCR-vsádky. Reakční podmínky: 1' 95 °C; 2' 50 °C; 3' 72 °C pro 35 cyklů.
Elektroforetické dělení amplifikačních produktů této frakce umožňuje rozpoznat významnou redukci komplexního spektra produktu první PCR k definovanému pásu délky asi 1000 bp po druhé PCR.
Takovým způsobem selektovaný PCR-produkt se eluuje standardními metodami. Identita 1000 bp velkého pásu jako fragment hovězí endothelin konvertující enzym cDNA se nejprve přezkouší další, třetí PCR-amplifikací s oligonukleotidy SEQ ID NO: 7 a 8 ( z A-B-T18). Produkt této PCR byl pás velikosti asi 950 bp.
Po subklonování 1000 bp velkých pásů ze druhé PCR-reakce do vektoru pCR II (TA Cloning Kit, Invitrogen Corp., San Diego, kat.č. K2000-01) a pomnožení plasmidu v E.coli DH5alfa poskytne sekvenční analýza klonu otevřený čtecí rámec 189 aminokyselin SEQ ID NO: 13, NO:14). Ve stejném čtecím rámci se také nacházejí sekvence peptidů SEQ ID NO: 1, NO:2 a NO:4, čímž je jednoznačně definována identita cDNA fragmentů.
e) Klonování hovězí cDNA pro endothelin konvertující enzym
Podle protokolu uvedeného v příkladu la) se generuje cDNA-knihovna se statistickou směsí primerů ve stupni syntézy prvního řetězce. Primery byly syntetizovány jako sekvence:
5'-GAGAGAGAGTCGACGGTACCN7; SEQ ID NO: 15.
Odlišně od uvedeného protokolu cDNA-syntézy se dvojřetězcová cDNA frakcionuje přes 2 ml sloupec S-1000 Sephakrylu (kvalitaSuperfine; Pharmacia, Freiburg; kat.číslo 17-0476-01). Frakce s cDNA-fragmenty velikosti alespoň 1 kb se koncentrují známým způsobem alkoholovým srážením a dále zpracovávají podle návodu v cDNA-Synthese Kitu, přičemž se cDNA-preparáty následně štěpí s restrikční endonukleásou Sáli místo Xhol a integruji se do lambda vektoru.
x 106 klonů banky hybridizováno s DNA-sondou, která byla vyrobena s oligonukleotidy 5’-CGGCCCTGGTGGAAGAACTCG-3' (SEQ ID NO: 16) a 5'-TGCGGACGGAACACCAGACCT-3' (SEQ ID NO: 17) z parciálních hovězích cDNA (SEQ ID NO 13), poloha 136 až 156, popř. 391 až 412, po transferu na nylonových membránách.
DNA-sondy byly značeny v polymerasové řetězové reakci (PCR) za přítomnosti digoxigenin-dUTP, jak je popsáno v příkladu lf). Hybridizace byla prováděna za přísných podmínek (viz příklad lf)), přičemž poslední promývací krok byl prováděn po provedené hybridizaci v 0,1 x SSC, 60 °C a pak byl proveden imunologický průkaz navázané DNA-sondy. Sekvenování zvolených klonů poskytlo hovězí cDNA-sekvenci C60, SEQ ID NO: 18, s otevřeným čtecím rámcem, SEQ ID NO: 19.
Potom bylo za stejných podmínek hybridizováno 2 x 106 klonů banky s DNA-sondou, která byla vyrobena s oligonukleot idy
5'-GCCAGCGCCGTCTCAAAGTCCAG-3' (SEQ ID NO: 20) a
5'-TGGGGGACCTTCAGCAACCTCT-31 (SEQ ID NO: 21) z cDNA-klonu C60, SEQ ID NO: 18, poloha 500 až 522, popř. 14 až 35, jak je popsáno výše, za stejných podmínek. Sekvenování zvolených klonů poskytlo hovězí cDNA-sekvenci SEQ ID NO: 22 s otevřeným čtecím rámečkem 708 aminokyselin (SEQ ID NO: 23).
x 108 plakotvorných jednotek obchodně dostupné cDNA banky hovězích plic v lambda gtíl (Clontech Laboratories, lne.; 4030 Fabian Way; Palo Alto CA 94303-4607, USA; katalogové číslo BL1006b) se po vysrážení s 10% polyethylenglykolem 6000, 1 M NaCl koncentrují ve 100 μΐ dvakrát destilované vody resuspendují a 5 min se zahřívají na 70 °C. 5 μΐ tohoto lyzátu se použije v 50 μΐ standardní PCR reakci (příklad 8d) s primery gtll fwd a
5'-GGTGCTTGATGATGGCTTGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 26). Primer gtll fwd odpovídá polohám 2979-3003 β-galaktosidasového genu (genová banka: ECLACZ) a leží v klonovacím vektoru lambda gtll bezprostředně před jediným EcoRI-integračním místem, které bylo použito při konstrukci banky (Young R.A. a Davis R.W.
(1985) Genetic Engineering, vyd. Setlow J. a Hollander A., Plenům Press, N.Y. 29-41). Primer SEQ ID NO: 26 odpovídá poloze 280-303 SEQ ID NO: 22.
Vzniklé PCR-fragmenty se sekvenují po subklonování v plasmidovém vektoru pUC18 (Yanisch-Perron D., Vieira J. a Messing J. (1985) Gene 33, 103-119)(SEQ ID NO: 28).
Tyto sekvence se překrývají s nukleotidy 175-324 SEQ ID NO: 22 v polohách 1-150 a prodlužují se o 14 nukleotidů ve směru 5'.
f) Klonování lidské cDNA pro endothelin konvertující enzym
Protože endothelin-1 byl prokázán v lidské placentě, bylo přijato, že se endothelin konvertující enzym exprimuje také v plasmě. Byla proto screenována za použití značené hovězí-cDNA-sondy lambda gt-11 placentová cDNA banka. Pro výrobu digoxigenin-dUTP značené hovězí-cDNA-sondy se v PCR reakci (viz Molecular Cloning, 2.vydání (1989), Sambrook J. a spol., CSH-Press, str, 14.1 a další) použije jako 'templát' ng (1 ng/ml) parciální hovězí-cDNA-sekvence (SEQ ID NO: 13).
'Sense'-oligonukleotid (SEQ ID NO: 16) zahrnuje nukleotidy od polohy 136 do 156 v SEQ ID NO: 13, 'antisense'-oligonukleotid SEQ ID NO: 17) polohy 392 až 412 v SEQ ID NO: 13. v 'DNA Therma Cycler' (Perkin Elmer) proběhnou 35krát následující cykly: 2 min 94 °C, 2 min 60 °C a 3 min 72 °C. Značená cDNA-sonda se pak přečistí přes agarosový gel a denaturuje se povařením. Za použití méně přísných podmínek se touto sondou screenuje asi 650000 kSQ,nů lidské lambdagt-11 cDNA-banky (Clontech, HL 1008b). Hybridizace filtrových odtahů se sondou provádí přes noc v 5 x SSC, 2 % blokovacího činidla (Boehringer Mannheim; č. 1096176), 0,1 % Na-laury1sarkosin,
2Ί
0,02 % SDS při 60 °C. Filtry se pak promývají 20 min při 60 °C s 0,5 x SSC, 0,1 % SDS. Další vyvíjení filtrů pro identifikaci navázaných DIG-sond se provádí podle protokolu Boehringer Mannheim (DIG - detekční kit pro nukleové kyseliny, č.
1175041).
Izolují se klony s cDNA-sekvencí uvedenouv SEQ ID NO: 24. Nukleotidy v poloze 1 až poloze 2109 cDNA-sekvence se SEQ ID NO: 24, kódují v SEQ ID NO: 25 uvedené aminokyselinové sekvence. Aminokyselinová sekvence odpovídá největší části primární sekvence endothelin konvertujícího enzymu, protože peptidy SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 6 ze trypsinpeptidového sekvenování izolovaného endothelin konvertujícího enzymu je možno v sekvenci opět najít. Také metaloproteinasa-konsensussekvence HEXXH může být také jako HELTH identifikována na polohách 540 až 544 v aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 25.
Ze 3 pg placenta póly A(+) RNA se vyrobí jak popsáno v příkladu 8 e) s oligonukleotidem
5' -gagagagagagagagagagaactagtctcgagccaagcaggccaccagtcctg-3 1 (SEQ ID NO: 31) jako první řetězec cDNA syntézní primer cDNA-knihovna. Nukleotidy 32 až 53 odpovídají polohám 32 až 53 SEQ ID NO: 24. cDNA-preparát se integruje jak popsáno v příkladu 8a) do lambda-vektoru Uni-ZAP XR. Výsledné 4 x 105 nezávislé klony se amplifikují a 5 x 108 plakotvorných jednotek se, jak popsáno v příkladu 8 e), nasadí do 100 μΐ PCR-reakce. Primer C leží v lambda-vektoru v Bluescript SK(-)-části, pol. 881-904, Sequenzf i 1 e· Genbank: ARBLSKM.
PCR-reakce se provádí 40 cyklů při hybridizační teplotě 65 °C. 1 pl reakčního produktu se vloží do čerstvých 50 μΐ
PCR-reakční vsádky a provádí se 40 cyklů při hybridizační teplotě 60 °C. Jako primer byly použity oligonukleotidy D a
5--CCTGCCGCCAGAAGTACCACCAACA-3' (SEQIDNO: 32)
Primer D leží v Bluescript SK(-)-části lambda Uni-ZAP XR-vektoru (pol. 857-880, Sequenzfile Genbabk: ARBLSKM), příměrová SEQ ID NO: 32 odpovídá polohám 11-35 v SEQ ID NO:
24. Reakční produkt se subklonuje v plasmidovém vektoru pUC18 jak popsáno výše. Vybrané klony se sekvenují.
Jako sekvence se získá nový 5'- podíl lidské ECE cDNA (SEQ ID NO: 33, jehož 3'-terminální oblast (pol.188-222) se překrývají s polohami 1-35 SEQ ID NO: 24. Prodlužuje se o 187 nukleotidů v 5'-směru a poskytuje celkovou lidskou ECE-sekvenci SEQ ID NO: 35, která kóduje otevřený čtecí rámec 753 aminokyselin (SEQ ID NO: 36).
Příklad 9
Výroba rekombinantního ECE v savčích buňkách
1. Konstrukce expresního vektoru pro membránový lidský ECE
Pro expresi úplného lidského ECE se zavede cDNA-sekvence (SEQ ID NO: 35) od nukleotidu 29 do 2720 se vhodnými adaptory do expresního vektoru pcDNA3neo fy. Invitrogen (3985 B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121, USA; produkt č. V790-20) mezi místa Κρη I a Xba I. ECE-sekvence nese své vlastní translačni start- a stgosekvence jakož i konsensus-Kozak-sekvenci (Kozák M. (1989), J.Cell Biol. 108, 229-241). Transkripce ECE-messenger RNA probíhá v tomto viru pod kontrolou silného cytomegalievirového promotoru. Selekce transfikovaných buněk se provádí přes gen neomycinové rezistence, ležící v plasmidu, který umožňuje růst jen G418-rezistentních kolonií.
2. Konstrukce expresního systému pro secernovaný lidský ECE
a) Klonování se provádí v obchodně dostupném eukaryotickém expresním vektoru pcDNA3neo fy Invitrogen (3985 Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA, 92121, USA; produkt č. V790-20. Proto se vektor nejprve štěpí s restrikčními enzymy Eco RI a Eco RV.
b) Potom se z cDNA lidského ECE (SEQ ID NO: 35) získá fragment nukleové kyseliny poloha 241 - poloha 2396 polymerasovou řetězovou reakcí se vhodnými oligonukleotidprimery. Podle volby sekvence 5' primeru se změní sekvence nukleové kyseliny mezi polohami 241 a 245 (SEQ ID NO: 35) ve sledu bází 5'-ACGCG-3'. Za zahrnutí polohy 246 se tímto krokem generuje rozpoznávací sekvence pro restrikční endonukleasu Mlu I. Vzniklý ECE-fragment se štěpí v dalším kroku s Mlu I.
c) Jako další fragment se vyrobí ze dvou syntetických oligonukleotidů (řetězec/protiřetězec) kódující sekvence lidského tkáňového plasminogenového aktivátoru (t-PA) mezi nukleotidem 74 a nukleotidem 176 publikované sekvence (D.Collen, Nátuře 301, 214-221 (1983)). Přídavně k uvedené sekvenci byly syntetické oligonukleotidy opatřeny adaptory, které vedou ke 5' Eco RI a 3' Mlu I přesahu.
Ligace fragmentů generovaných pod b) a c) přes společné Mlu I místo restrikčního štěpeni vede k fúzi čtecího rastru signálního peptidu lidského t-PA genu a extracelulární domény lidského ECE genu. Ligace tohoto fuzního proteinu do Eco RI a Eco RV štěpeného pcDNA3 vektoru z a) vede k expresnímu systému pro secernovaný lidský ECE.
3. Exprese v savčích buňkách
DNA expresní vektory byly transfikovány s 1ipofektaminem (fa Gibco; Life Technologies GmbH; Dieselstrape 5, 76334 Eggenstein, Německo; č. 530-8324SA) do savčích buněk. Použité buňky byly CHO-K1 (ATCC CCL 61); BHK-21 (ATCC CCL 10); 293 (ATCC CEL 1573) a C127I (ATCC CEL 1616).
Vždy 2xl05 buněk se nasaje ve 3 ml růstového media na jamku 6-jamkové kultivační plotny. Další den se provede transfekce. Za tím účelem se buňky jednou promyji PBS. Transfekce 1ipofektinaminem se provede podle pokynů výrobce, firmy Gibco (Focus (1993), 15 č.3, 73-78). Každá jamka obsahuje 1 pg DNA a 6 μΐ 1ipofektaminu, které byly uvedeny do celkem 1000 μΐ sera prostého buněčného kultivačního media. Po 6-hodinové inkubaci při 37 °C se buňky promyji jednou s PBS a inkubují v normálním růstovém mediu. Další den se buňky z jedné jamky po oddělení trypsinem rozdělí na 1, 5 nebo 10 Petriho misek (průměr 10 cm). Den na to se transfektované buňky selektují zpracováním s G418 (fa Gibco; kat.č.
066—01811Y; obchodní označení: Geneticin), tj. růstové medium se vymění za medium, které obsahuje 1,2 mg/ml G418. Po 7 až 10 dnech byly v Petriho miskách pozorovány kolonie G418-rezistentních buněk. Tyto byly izolovány metodou clonin-cylinder (DNA-cloning Vol.III; vyd. D.M.Glover, IRL press, 1985; str.220). Izolované kolonie byly umístěny vždy do jedné jamky 24-jamkové misky s asi 1,5 ml růstového media (včetně G418). Při dosažení konfluence byly buňky tryptinizací převedny do větších kultivačních nádob.
a) Membránový ECE
Buňky, které exprimují membránový ECE, byly zkoušeny na přítomnost ECE po rozbití buněk a frakcionaci jak je popsáno v příkladu 1 a 2. (Fosforamidonová stimulace není provedena). Specifická aktivita analyzovaných kolonií činí na membránové bázi až 1550 pj/mg proteinu. Membrány kolonie 38 byly dále zpracovávány. Byly přitom získány následující výsledky:
Stupeň čištění spec.akt ivita membrány solubi1 i zát mono-Q-chromatograf i e (M-j/rng proteinu) 1550 2010 12000
b) Secernovaný ECE
Buňky, které exprimují ECE bez membránové kotvy a secernují jej do buněčného kultivačního media, byly testovány na přítomnost rekombinantního ECE, přičemž byl zkoušen buněčný supernatant konfluentních buněk na ECE-aktivitu. Buněčný supernatant byl po 2 dnech kultivace odebrán a odstředováním při 1000 g zbaven buněčných zlomků. 6 ml supernatantu bylo pak koncentrováno pomocí zařízení Centricon 10.000 (fy Amicon, W.R.Grace + Co., Danver, Ma. 01923, USA; produkt č. 4206) a odstředěním při 3220 g (asi 30 min). Vytékající kapalina s nízkomolekulárními substancemi byla odebrána (Centricon-Eluat). Centricon byl promyt jednou s 1 ml PBS + 10 mM Tris + 150 mM NaCI; pH 7,5. Koncentrát byl vyjmut do 300 μΐ Centricon-Eluates.
pl koncentrátu bylo použito v ECE-testu jak je popsán v příkladu 3.
Objemová aktivita secernovaného ECE činila podle zkoušené kolonie rekombinantních buněk až 10 pjednotek/ml buněčného kultivačního media.
Sekvenční protokol (1) Obecná informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: BASF Aktiengesellschaft (B) Ulice: Car1-Bosch-Strasse 38 (C) Místo: Ludwigshafen (E) Země: Spolková republika Německo (F) Poštovní směrovací číslo: D-67056 (G) Telefon: 0621/6048526 (H) Telefax: 0621/6043123 (I) Telex: 1762175170 (ii) Název přihlášky: Endothelin konvertující enzym (ECE) (iii) Počet sekvencí: 25 (iv) Počítačově čtecí forma:
(A) Nosič dat: floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPA) (2) Informace o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 23 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Typ tkáně: endotheliálnl (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (xi): Popis ekvence: SHQ II) NO: 1:
Xaa Xaa Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly 1 5 10- 15
His Glu Leu Thr His Ala Phe 20 (2) lnL>i íitace o SHQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Setězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Typ tkáně: endotheliální (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (xi): Popis ekvence: SEQ ID NO: 2:
Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Gly Asn Leu Arg Pro
5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: modifikované místo (B) Poloha: 8 (D) Zvláštní údaje: /pozn.=Xaa = Leu nebo Ile (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: modifikované místo (B) Poloha: 7 (D) Zvláštní údaje: /pozn.=Xaa = Glu nebo Ile (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
Xaa Ile Ala Xaa Glu Thr Xaa Xaa Glu Ile 1 5. 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 13 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Xaa Pro Glu Phe Leu Leu Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro 1 -5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Xa'a Gin Ala Glu Asn Val Ile Gin Val Xaa Gin
5 10 (2) Informace o SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 16 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (H) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: modifikované místo (B) Poloha: 7 (D) Zvláštní údaje: /pozn.=Xaa = Ala nebo Thr (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Val Glu Ile Val Phe Pro Xaa Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr 15 10 15 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (denomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
COSCAYGARY tnacncaygc (2) Informace o SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
garatygtst tyccygcygg (2) Informace o SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
atyctscagg cyccyttyta yac (2) Informace o SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 45 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
QGAGGGGGAT GGTCGACGGA AGCGACCTTT TTTTTTTTTT TTTTT
45' (2) Informace o SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 19 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence
CGÁGGGGGAT GGTCGACGG (2) Informace o SEQ ID NO
SEQ ID NO:
12:
okvence:
(A) Délka: 20 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
GATGGTCGAC GGAAGCGACC (2) Informace o SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 570 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mENS (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 1..567 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
ATC Ile 1 CTG CAG GCG CCA TTC TAC ACC CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC 48
Leu Gin Ala Pro 5 Phe Tyr Thr Arg Ser 10 Ser Pro Asn Ala Leu 15 Asn
TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC GTG GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT 96
Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe
20 25 30
GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC GAC AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGG 144
Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp
35 40 45
TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG GCG TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG 192
Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met
50 55 60
GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC 240
Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly
65 70 75 80
CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG 288
Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala
85. 90 95
GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC TGG GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG 336
Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin
100 105 110
ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC ACC AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG AGT 384
Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser
115 120 125
TTT GCA CAG GTC TGG TGT TCC GTC CGC ACC CCC GAG AGT TCG CAC GAA 432
Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu
130 135 140
GGT CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCC CGC TTC CGG GTC ATC GGC 480
Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly
145 150 155 160
TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC TCG GAA CAC TTC CAC TGC CCG CCC 528
Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe His Cys Pro Pro
165 170 175
GGC TCA Gly Ser
CCC ATG Pro Met
180
AAC CCG Asn Pro
CAT CAC His His
AAG TGT Lys Cys 185
GAA GTC Glu Val
TGG TGA Trp
57C (2)
Informace o SEQ ID NO: l(f· (i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: l£> párů bázi (B) Typ' nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO:
Ile 1 Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu 15 Asn
5 10
Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe
20 25 30
Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp
35 40 45
Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met
50 55 60
Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly
65 70 75 80
Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala
85 90 95
Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin
100 105 110
Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser
115 120 125
Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu
130 135 140
Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly
145 150 155 160
Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe His Cys Pro Pro
165 170 175
Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp 180 185 · (2) Informace o SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 27 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Hypotetická: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 15: GAGAGAGAGT cgacggtacc nnnnnnn
2) Informace o SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
CGGCCCTGGT GGAAGAACTC G (2) Informace o SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 17: TGC<?GÁČGGA acaccagacc t (2) Informace o SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 1703 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 2..1703 (xi)
Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
T GGC CAC TCG CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC 46
Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn
5 10 15
CAA GCC ATC ATC AAG CAC CTC CTT GAA AAC TCC ACG GCC AGC GTG Val 30 AGC Ser 94 (
Gin Ala Ile Ile Lys 20 His Leu Leu Glu Asn 25 Ser Thr Ala Ser
GAG GCA GAG AGG AAG GAC CAG GAG TAC TAC CGA GCC TGC ATG AAC GAA 142
Glu Ala Glu Arg Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu
35 40 45
ACC AGG ATT GAG GAG CTC AAG GCC AAA CCC GTG ATG GAG CTC ATT GAG 190
Thr Arg Ile Glu Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu
50 55 60
AAG CTC GGC GGC TGG AAC ATC ACG GGG CCC TGG GAC AAG GAC AAC TTC 238
Lys Leu Gly Gly Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe
65 70 75
CAG GAC ACC CTG CAG. GTG GTC ACA TCC CAC TAC CAC ACC TCC CCC TTC 286
Gin Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe
80 85 90 95
TTC TCC GTC TAC GTC AGT GCC GAC TCC AAG AAT TCC AAC AGC AAC GTG 334
Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn val
100 105 110
ATC CAA GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC TTA CCC TCA AGA GAT TAT TAC 382
Ile Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr
115 120 125
CTG AAC AAA ACC GAG AAT GAG AAG GTG CTG ACG GGA TAC CTG AAC TAC 430
Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly iyr Leu Asn Tyr
130 135 140
ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGA GGA GGG GCC GAG GAC ACC ATC 478
Met Val Gin Leu Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Thr Ile
145 150 155
> CGG CCC CAG Arg Pro Gin 160 ATG CAG CAG ATC CTG GAC TTT GAG ACG GCG CTG GCC AAC Ala Asn 175 526
Met Gin Gin 165 Ile Leu Asp Phe Glu 170 Thr Ala Leu
ATC ACC ATC CCC CAG GAG AAG CGC CGG GAC GAG GAA CTC ATC TAC CAC 574
Ile Thr Ile Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His
180 185 190
AAA GTG ACG GCG GCT GAG TTG CAG ACC TTG GCG CCC GCC ATC AAC TGG 622
Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala Ile Asn Trp
195 200 205
CTG CCC TTC CTC AAC ACC ATC TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCA 670
Leu Pro p.ie Leu Asn Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser
210 215 220
v GAG CCT ATT GTC ATC TAC GAC AAA GAA TAC CTG AGC AAG GTC TCC ACC 718
Glu Pro Ile Val Ile Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr
225 230 235
CTC ATC AAC AGC ACA GAC AAA TGC CTG CTG AAC AAC TAC ATG ATC TGG 766
Leu Ile Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp
240 245 250 255
AAC CTG GTA CGG AAG ACG AGC TCC TTC CTC GAT CAG CGC TTC CAG GAC 814
Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp
260 265 270
GCC GAC GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAT GGG ACC AAG AAG ACG TGT 862
Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys
275 280 285
CTT CCC CGC TGG AAG TTT TGT GTG AGT GAT ACA GAG AAC ACC TTG GGC 910
Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly
290 295 300
TTC GCC CTG GGC CCC ATG TTC GTC AAA GCG ACC TTC GCT GAG GAC AGC 958
Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser
w 305 310 315
AAG AAC ATA GCC AGC GAG ATC ATC CTG GAG ATC AAG AAG GCG TTT GAA 1006
, Lys Asn Ile Ala Ser Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Glu
320 325 330 335
GAG AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAA GAT ACT CGG AAA TCG 1054
Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser
340 345 350
GCC AAG GAA AAG GCG GAC GCG ATC TAC AAC ATG ATA GGC TAC CCC AAC 1102
Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn
355 360 365
τττ Phe ATC ATG GAC CCC Pro AAG GAG CTG GAC AAA GTG TTC AAT GAC TAC ACC 1150
Ile Met 370 Asp Lys Glu Leu 375 Asp Lys Val Phe Asn 380 Asp Tyr Thr
GCT GTG CCA GAC CTC TAC TTC GAG AAC GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC 119£
Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe
385 390 395
TCC TGG AGG GTC ACT GCC GAC CAG CTC CGG AAA GCG CCC AAC AGA GAT 1246
Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp
400 405 410 415
CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC 1294
Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr
420 425 430
AAG AAC GAG ATC GTG TTT CCG GCC GGA ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC 1342
Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr
435 440 445
ACC CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC . 139C
Thr Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val
450 455 460
GTG GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC 143Ě
Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr
465 470 475
GAC AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGG TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG 1486
Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu
480 485 490 495
GCG TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT 1534
Ala Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr
500 505 510
AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC 158?
Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn
515 520 525
ATC GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC 1631
Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn
530 535 540
TGG GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC 167
Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu
545 550 555
ACC AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG A 170
Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu
560 565
(2) Informace o SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 567 párů bází (B) Typ: aminokyselina (C) Eetězec: jeden (D) Topologie: lineární
(ii) Typ molekuly: protein
(xi): Popi: 3 sekvence: SEQ ID NO: 19:
Gly His 1 Ser Arg Trp 5 Gly Thr Phe Ser Asn Leu 10 Trp Glu His Asn Gin 15
Ala Ile Ile Lys His 20 Leu Leu Glu Asn 25 Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu 30
Ala Glu Arg Lys Asp 35 Gin Glu Tyr 40 Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr 45
Arg Ile 50 Glu Glu Leu Lys Ala Lys 55 Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Lys 60
Leu Gly 65 Gly Trp Asn Ile Thr Gly 70 Pro Trp Asp 75 Lys Asp Asn Phe Gin 80
Asp Thr Leu Gin Val 85 Val Thr Ser His Tyr His 90 Thr Ser Pro Phe Phe 95
Ser Val Tyr Val Ser 100 Ala Asp Ser Lys *105 Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile 110
Gin Val Asp Gin Ser 115 Gly Leu Gly 120 Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu 125
Asn Lys 130 Thr Glu Asn Glu Lys Val 135 Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met 140
Val Gin 145 Leu Gly Lys Leu Leu Gly 150 Gly Gly Ala 155 Glu Asp Thr Ile Arg 160
Pro Gin Met Gin Gin 165 Ile Leu Asp Phe Glu Thr 170 Ala Leu Ala Asn Ile 175
Thr Ile Pro Gin Glu 180 Lys Arg Arg Asp 185 Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys 190
Val Thr Ala Ala Glu 195 Leu Gin Thr 200 Leu Ala Pro Ala Ile Asn Trp Leu 205
Pro Phe 210 Leu Asn Thr Ile Phe Tyr 215 Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu 220
Pro 225 Ile Val Ile Tyr Asp 230 Lys Glu Tyr Leu Ser 235 Lys val ser Thr Leu 240
Ile Asn Ser Thr Asp 245 Lys Cys Leu Leu Asn 250 Asn Tyr Met Ile Trp 255 Asn
Leu Val Arg Lys 260 Thr Ser Ser Phe Leu 265 Asp Gin Arg Phe Gin 270 Asp Ala
Asp Glu Lys 275 Phe Met Glu Val Met 280 Tyr Gly Thr Lys Lys 285 Thr Cys Leu
Pro Arg 290 Trp Lys Phe Cys Val 295 Ser Asp Thr Glu Asn 300 Thr Leu Gly Phe
Ala 305 Leu Gly Pro Met Phe 310 Val Lys Ala Thr Phe 315 Ala Glu Asp Ser Lys 320
Asn íle Ala Ser Glu 325 Ile Ile Leu Glu Ile 330 Lys Lys Ala Phe Glu 335 Glu
Ser Leu Ser Thr 340 Leu Lys Trp Met Asp 345 Glu Asp Thr Arg Lys 350 Ser Ala
Lys Glu Lys 355 Ala Asp Ala Ile iyr 360 Asn Met Ile Gly Tyr 365 Pro Asn Phe
Ile Met 370 Asp Pro Lys Glu Leu 375 Asp Lys Val Phe Asn 380 Asp Tyr Thr Ala
val 385 Pro Asp Leu Tyr Phe 390 Glu Asn Ala Mét Arg 395 Phe Phe Asn Phe Ser 400
Trp Arg Val Thr Ala 405 Asp Gin Leu Arg Lys 410 Ala Pro Asn Arg Asp 415 Gin
Trp Ser Met Thr 420 Pro Pro Met Val Asn 425 Ala Tyr Tyr Ser Pro 430 Thr Lys
Asn Glu Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr
435 440 445
Arg Ser 450 Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val
455 460
Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp
465 470 475 480
Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala
485 490 495
Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser
500 505 510
Val Asn Gly 515 Glu Pro Val Asn Gly 520 Arg' His Thr Leu Gly 525 Glu Asn Ile
Ala Asp 530 Asn Gly Gly Leu Lys 535 Ala Ala Tyr Arg Ala 540 Tyr Gin Asn Trp
Val 545 Lys Lys Asn Gly Ala 550 Glu Gin Thr Leu Pro 555 Thr Leu Gly Leu Thr 560
Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu
565 (2) Informace o SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 23 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (i i i)Ant isense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 20: GCCAGCGCCG TCTCAAAGTC CAG (2) Informace o SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 22 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (i i i) Ani; i sense : ne (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
TGGGGGACCT TCAGCAACCT CT 22 (2) Informace o SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 2129 párů bází (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (i i) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Buněčná linie: buněčná linie endothelu fetálního hovězího srdce (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 3..2126 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:
GG ACC CCG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG CTG GTG GCG CTC CTG GCG Thr Pro Val Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Ala Leu Leu Ala 1 5 10 15
GCG GCA TTG GTG GCC TGT TTG GCA GTA CTG GGC Leu Gly 25 ATC CAA TAC CAG ACA
Ala Ala Leu Val Ala Cys Leu 20 Ala Val Ile Gin Tyr Gin 30 Thr
AGA ACG CCC TCG GTG TGC CTA AGT GAG GCC TGC ATC TCG GTG ACC AGC
Arg Thr Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys Ile Ser Val Thr Ser
35 40 45
TCC ATC TTG AGT TCC ATG GAC CCC ACG GTG GAC CCC TGC CAG GAC TTC
Ser Ile Leu Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys Gin Asp Phe
50 55 60
TTC. ACC TAT GCC TGT GGC GGC TGG ATC AAA GCC AAC CCC GTG CCG GAT
Phe Thr Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Ile Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp
65 70 75
GGC CAC TCG CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC CAA
Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin
80 85 90 95
GCC ATC ATC AAG CAC CTC CTT GAA AAC TCC ACG GCC AGC GTG AGC GAG
Ala Ile Ile Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu
100 105 110
GCA GAG AGG AAG GAC CAG GAG TAC TAC CGA GCC TGC ATG AAC GAA ACC
Ala Glu Arg Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr
115 120 125
AGG ATT GAG GAG CTC AAG GCC AAA CCC CTG ATG GAG CTC ATT GAG AAG
Arg Ile Glu Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Lys
130 135 140
CTC GGC GGC TGG AAC ATC ACG GGG CCC TGG GAC AAG GAC AAC TTC CAG
Leu Gly Gly Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin
145 150 155 >
GAC ACC CTG CAG GTG GTC ACA TCC CAC TAC CAC ACC TCC CCC TTC TTC
Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe
160 165 170 17:5
143f
191
239
287
335
383
431
479
527
TCC GTC TAC GTC AGT GCC GAC TCC AAG AAT TCC AAC AGC AAC GTG Ser Asn Val 190 ATC lle · 575
Ser Val Tyr Val' 'Ser Ala Asp 180 Ser Lys Asn 185 Ser Asn
CAA GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC TTA CCC TCA AGA GAT TAT TAC CTG 623
Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu
195 200 205
AAC AAA ACC GAG AAT GAG AAG GTG CTG ACG GGA TAC CTG AAC TAC ATG 671
Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met
210 215 220
GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGA GGA GGG GCC GAG GAC ACC ATC CGG 719
Val Gin Leu Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Thr lle Arg
225 230 235
CCC CAG ATG CAG CAG ATC CTG GAC TTT GAG ACG GCG CTG GCC AAC ATC 767
Pro Gin Met Gin Gin lle Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn lle
240 245 250 255
ACC ATC CCC CAG GAG AAG CGC CGG GAC GAG GAA CTC ATC TAC CAC AAA 815
Thr lle Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu lle Tyr His Lys
260 265 270
GTG ACG GCG GCT GAG TTG CAG ACC TTG GCG CCC GCC ATC AAC TGG CTG 863
Val Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala lle Asn Trp Leu
275 280 285
CCC TTC CTC AAC ACC ATC TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCA GAG ,911
Pro Phe Leu Asn Thr lle Phe Tyr Pro Val Glu lle Asn Glu Ser Glu
290 295 300
CCT ATT GTC ATC TAC· GAC AAA GAA TAC CTG AGC AAG GTC TCC ACC CTC 959
Pro lle Val lle Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu
305 310 315
ATC AAC AGC ACA GAC AAA TGC CTG CTG AAC AAC TAC ATG ATC TGG AAC 1007
lle Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met lle Trp Asn
320 325 330 335
CTG GTA CGG AAG ACG AGC TCC TTC CTC GAT CAG CGC TTC CAG GAC GCC 1055
Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala
340 345 350
GAC- GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAT GGG ACC AAG AAG ACG TGT CTT 1103
Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu
355 360 365
CCC CGC TGG AAG TTT TGT GTG AGT GAT ACA GAG AAC ACC TTG GGC TTC 1151
Pro Arg Trp Lys 'Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe ·
370 375 380
GCC CTG Ala Leu GGC Gly CCC Pro ATG Met TTC Phe GTC AAA GCG ACC TTC GCT GAG GAC Asp AGC Ser AAG Lys 1
Val 390 Lys Ala Thr Phe Ala 395 Glu
385
AAC ATA GCC AGC GAG ATC ATC CTG GAG ATC AAG AAG GCG TTT GAA GAG i;
Asn Ile Ala Ser Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Glu Glu
400 405 410 415
AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAA GAT ACT CGG AAA TCG GCC i;
Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser Ala
420 425 430
AAG GAA AAG GCG GAC GCG ATC TAC AAC ATG ATA GGC TAC CCC AAC TTT 12
Lys Glu Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe
435 440 445
ATC ATG GAC CCC AAG GAG CTG GAC AAA GTG TTC AAT GAC TAC ACC GCT 13
Ile Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala
450 455 460
GTG CCA GAC CTC TAC TTC GAG AAC GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC TCC 14
Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser
465 470 475
TGG AGG GTC ACT GCC GAC CAG CTC CGG AAA GCG CCC AAC AGA GAT CAG 14
Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gin
480 485 490 495
TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC AAG 15
Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys
500 505 510
AAC GAG ATC GTG TTT CCG GCC GGA ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC ACC 15
Asn Glu Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr
515 520 525
CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC GTG 16
Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val
530 535 540
GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC GAC
Gly His 545 Glu Leu Thr His Ala 550 Phe Asp Asp Gin Gly 555 Arg Glu Tyr Asp
AAG GAT GGG .AAC CTC CGG CCC TGG TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG GCG
Lys 560 Asp Gly Asn Leu Arg 565 Pro Trp Trp Lys Asn 570 Ser Ser Val Glu • Ala '575
TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT AGC
Phe Lys Gin Gin Thr 580 Ala Cys Met Val Glu 585 Gin Tyr Gly Asn Tyr 590 Ser
BHŠBW í>3
GTG AAC GGG GAG CCG GTG Val AAC Asn GGC CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC ATC 1823
val Asn Gly Glu 595 Pro Gly Arg 600 His Thr Leu Gly Glu 605 Asn Ile
GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC TGG 1871
Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn -Trp
610 615 620
GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC ACC 1919
Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr
625 630 635
AAC AAC CAG CTC TTC TTC GTG AGT TTT GCA CAG GTC TGG TGT TCC GTC 1967
Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val
640 645 650 655
CGC ACC CCC GAG AGT TCG CAC GAA GGT CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC 2015
'Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser
660 665 670
CCC TCC CGC TTC CGG GTC ATC GGC TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC 2063
Pro Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe
675 680 685
TCG GAA CAC TTC CAC TGC. CCG CCC GGC TCA CCC ATG AAC CCG CAT CAC 2111
Ser Glu His Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His
690 695 700
AAG TGT GAA GTC TGG TGA 2129
Lys Cys Glu Val Trp
(2) Informace ο SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 708 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:
Thr Pro Val Glu Lys Arg Leu Val Val Leu val Ala Leu Leu Ala Ala ! 5 1θ 15
Ala Leu Val Ala Cys Leu Ala Val Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg
25 30
Thr Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys Ile Ser Val Thr Ser Ser
Ile Leu 50 Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys Gin Asp Phe Phe
55 60
Thr Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Ile Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly
65 70 75 80
His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Ala
85 90 95
Ile Ile Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala
100 105 110
Glu Arg Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg
115 120 125
Ile Glu Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Lys Leu
130 135 140
Gly Gly Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin Asp
145 150 155 160
Thr Leu Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe Ser
165 170 175
Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin
180 185 190
Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val
210 215 220
Gin Leu Gly Lys Leu· Leu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Thr Ile Arg Pro
225 230 235 240
Gin Met Gin Gin Ile Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn Ile Thr
245 250 255
Ile Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val
260 265 270
Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala Ile Asn Trp Leu Pro
275 280 285
Phe Leu Asn Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro
290 295 300
Ile Val Ile Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu Ile
305 310 315 320
Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu
325 330 335
8BB
Val Arg Lys Thr 340 Ser Ser Phe Leu Asp 345 Gin Arg Phe Gin Asp 350 Ala Asp
Glu Lys Phe 355 Met Glu Val Met Tyr 360 Gly Thr Lys Lys Thr 365 Cys Leu Pro
Arg Trp 370 Lys Phe Cys Val Ser 375 Asp Thr Glu Asn Thr 380 Leu Gly Phe Ala
Leu 385 Gly Pro Met Phe Val 390 Lys Ala Thr Phe Ala 395 Glu Asp Ser Lys Asn 400
Ile Ala Ser Glu Ile 405 Ile Leu Glu Ile Lys 410 Lys Ala Phe Glu Glu 415 Ser
Leu Ser Thr Leu 420 Lys Trp Met Asp Glu 425 Asp Thr Arg Lys Ser 430 Ala Lys
Glu Lys Ala 435 Asp Ala Ile Tyr Asn 440 Met Ile Gly Tyr Pro 445 Asn Phe Ile
Met Asp 450 Pro Lys Glu Leu Asp 455 Lys Val Phe Asn Asp 460 Tyr Thr Ala Val
Pro 465 Asp Leu Tyr Phe Glu 470 Asn Ala Met Arg Phe 475 Phe Asn Phe Ser Trp 480
Arg Val Thr Ala Asp 485 Gin Leu Arg Lys Ala 490 Pro Asn Arg Asp Gin 495 Trp
£ r Met Thr Pro 500 Pro Met Val Asn Ala 505 Tyr Tyr Ser Pro Thr 510 Lys Asn
Glu Ile Val 515 Phe Pro Ala Gly Ile 520 Leu Gin Ala Pro Phe 525 Tyr Thr Arg
Ser Ser 530 Pro Asn Ala Leu Asn 53 5 Phe Gly Gly Ile Gly 540 Val Val Val Gly
His 545 Glu Leu Thr His Ala 550 Phe Asp Asp Gin Gly 555 Arg Glu Tyr Asp Lys 560
Asp Gly Asn Leu Arg 565 Pro Trp Trp Lys Asn 570 Ser Ser Val Glu Ala 575 Phe
Lys Gin Gin Thr 580 Ala Cys Met Val Glu 585 Gin Tyr Gly Asn Tyr 590 Ser Val
Asn Gly Glu 595 Pro Val Asn Gly Arg 600 His Thr Leu Gly Glu 605 Asn Ile Ala
Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val 610 615 620
Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn
625 630 635 640
Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg
645 650 655
Thr Pro Glu Ser Sar His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro
660 665 670
Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser
675 680 685
Glu His Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys
690 695 700
Cys Glu Val Trp
705 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 2533 aminokyselin (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Původ:
(A) Organismus: Homo sapiens (B) Typ tkáně: placenta (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 1..2109 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:
CGG Arg 1 CTG Leu GTG GTG TTG GTG Val GTA CTT CTG GCG GCA GGA CTG GTG GCC TGC Leu Ala Ala Gly Leu Val Ala Cys 48
Val Val Leu 5 Val Leu
10 15
TTG GCA GCA CTG GGC ATC CAG TAC CAG ACA AGA TCC CCC TCT GTG TGC 96
Leu Ala Ala Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys
20 25 30
CTG AGC GAA GCT TGT GTC TCA GTG ACC AGC TCC ATC TTG AGC TCC ATG 144
Leu Ser Glu Ala Cys Val Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Met
35 40 45
GAC CCC ACA GTG GAC CCC TGC CAT GAC TTC TTC AGC TAC GCC TGT GGG 192
ASP Pro Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala Cys Gly
55 60
GGC TGG ATC AAG GCC AAC CCA GTC CCT GAT GGC CAC TCA CGC TGG GGG Gly 80 240
Gly Trp 65 Ile Lys Ala Asn 70 Pro Val Pro Asp Gly 75 His Ser Arg Trp
ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC CAA GCA ATC ATC AAG CAC CTC 288
Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Ala Ile Ile Lys His Leu
85 90 95
CTC GAA AAC TCC. ACG GCC AGC GTG AGC GAG GCA GAG AGA AAG GCG CAA 336
Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Gin
100 105 110
GTA TAC TAC CGT GCG TGC ATG AAC GAG ACC AGG ATC GAG GAG CTC. AGG 384
Val Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu Leu Arg
115 120 125
GCC AAA CCT CTA ATG GAG TTG ATT GAG AGG CTC GGG GGC TGG AAC ATC 432
Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn Ile
130 135 140
ACA GGT CCC TGG GCC AAG GAC AAC TTC CAG GAC ACC CTG CAG GTG GTC 480
Thr Gly Pro Trp Ala Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val
145 150 155 160
ACC GCC CAC TAC CGC ACC TCA CCC TTC TTC TCT GTC TAT GTC AGT GCC 528
Thr Ala His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala
165 170 175
GAT TCC AAG AAC TCC AAC AGC AAC GTG ATC CAG GTG GAC CAG TCT GGC 576
Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin Val Asp Gin Ser Gly
180 185 190
CTG GGC TTG CCC TCG AGA GAC TAT TAC CTG AAC AAA ACT GAA AAC GAG 624
Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu
195 200 205
AAG GTG CTG ACC GGA TAT CTG AAC TAC ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG 672
Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu
210 215 220
CTG GGC GGC GGG GAC GAG GAG GCC ATC CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC 720
Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala Ile Arg Pro Gin Met Gin Gin Ile
225 230 235 240
TTG GAC TTT GAG ACG GCA CTG GCC AAC ATC ACC ATC CCA CAG GAG AAG 768
Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn Ile Thr Ile Pro Gin Glu Lys
245 250 255
CGC CGT GAT GAG GAG CTC ATC TAC CAC AAA GTG ACG GCA GCC GAG CTG 816
Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu
260 265 270
CAG Gin ACC TTG GCA CCC GCC Ala ATC Ile AAC TGG TTG CCT TTT CTC AAC ACC Thr ATC Ile 8
Thr Leu 275 Ala Pro Asn 280 Trp Leu Pro Phe Leu 285 Asn
TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCC GAG CCT ATT GTG GTC TAT GAC 9
Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val Tyr Asp
290 295 300
AAG GAA TAC CTT GAG CAG ATC TCC ACT CTC ATC AAC ACC ACC GAC AGA 9
Lys Glu Tyr Leu Glu Gin Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr Thr Asp Arg
305 310 315 320
TGC CTG CTC AAC AAC TAC ATG ATC TGG AAC CTG GTG CGG AAA ACA AGC 10
Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser
325 330 335
TCC TTC CTT GAC CAG CGC TTT CAG GAC GCC GAT GAG AAG TTC ATG GAA 10
Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu
340 345 350
GTC ATG TAC GGG ACC AAG AAG ACC TGT CTT CCT CGC TGG AAG TTT TGC 11
Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys
355 360 365
GTG AGT GAC ACA GAA AAC AAC CTG GGC TTT GCG TTG GGC CCC ATG TTT 11
Val Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe
370 375 380
GTC AAA GCA ACC TTC GCC GAG GAC AGC AAG AGC ATA GCC ACC GAG ATC 12
Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser Ile Ala Thr Glu Ile
385 390 395 400
ATC CTG GAG ATT AAG AAG GCA TTT GAG GAA AGC CTG AGC ACC CTG AAG 12
Ile Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys
405 410 415
TGG ATG GAT GAG GAA ACC CGA AAA TCA GCC AAG GAA AAG GCC GAT GCC 12
Trp Met Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala
420 425 430
ATC TAC AAC ATG ATA GGA TAC CCC AAC TTC ATC ATG GAT CCC AAG GAG 13
Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu
435 440 445
CTG GAC AAA GTG TTT AAT GAC TAC ACT GCA GTT CCA GAC CTC TAC TTT 13
Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe
450 455 460
GAA AAT GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC TCA TGG AGG GTC ACT GCC GAT 14
Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp
465 470 475 480
CAG CTC AGG AAA GCC CCC Pro AAC Asn AGA Arg GAT CAG TGG AGC ATG ACC CCG Pro 495 CCC Pro 1488
Gin Leu Arg Lys Ala 485 Asp Gin 490 Trp Ser Met Thr
ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC AAG AAT GAG ATT GTG TTT CCG 1536
Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro
500 505 510
GCC GGG ATC CTG CAG GCA CCA TTC TAC ACA CGC TCC TCA CCC AAG GCC 1584
Ala Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe iyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala
515 520 525
TTA AAC TTT GGT GGC ATA GGT GTC GTC GTG GGC CAT GAG CTG ACT CAT 1632
Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His
530 535 540
GCT TTT GAT GAT CAA GGA CGG GAG TAT GAC AAG GAC GGG AAC CTC CGG 1680
Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg
545 550 555 560
CCA TGG TGG AAG AAC TCA TCC GTG GAG GCC TTC AAG CGT CAG ACC GAG 1728
Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gin Thr Glu
565 570 575
TGC ATG GTA GAG CAG TAC AGC AAC TAC AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG 1776
Cys Met Val Glu Gin Tyr Ser Asn iyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val
580 585 590
AAC GGG CGG CAC ACC CTG GGG GAG AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGT CTC 1824
Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu
595 600 605
AAG GCG GCC TAT CGG GCT TAC CAG AAC TGG GTG AAG AAG AAC GGG GCT 1872
Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala
610 615 620
GAG CAC TCG CTC CCC ACC CTG GGC CTC ACC AAT AAC CAG CTC TTC TTC 1920
Glu His Ser Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe
625 630 635 640
CTG GGC TTT GCA CAG GTC TGG TGC TCC GTC CGC ACA CCT GAG AGC TCC 1968
Leu Gly Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser
645 650 655
CAC GAA GGC CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCT CGC TTC CGG GTC 2016
His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val
660 665 670
ATC GGC TCC CTC TCC AAT TCC AAG GAG TTC TCA GAA CAC TTC CGC TGC 2064
Ile Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys
675 680 685
CCA CCT GGC TCA CCC ATG AAC CCG Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro 690 695
CCT CAC AAG TGC GAA GTC TGG Pro His Lys Cys Glu Val Trp 700
2109
TAAGGACGAA GCGGAGAGAG CCAAGACGGA GGAGGGGAAG GGGCTGAGGA CGAGACCCCC 2169 ATCCAGCCTC CAGGGCATTG CTCAGCCCGC TTGGCCACCC GGGGCCCTGC TTCCTCACAC 2229 TGGCGGGTTT' TCAGCCGGAA CCGAGCCCAT GGTGTTGGCT CTCAACGTGA CCCGCAGTCT 2289 GATCCCCTGT GAAGAGCCGG ACATCCCAGG CACACGTGTG CGCCACCTTC AGCAGGCATT 2349 CGGGTGCTGG GCTGGTGGCT CATCAGGCCT GGGCCCCACA CTGACAAGCG CCAGATACGC 2409 CACAAATACC ACTGTGTCAA ATGCTTTCAA GATATATTTT TGGGGAAACT ATTTTTTAAA 2469 CACTGTGGAA TACACTGGAA ATCTTCAGGG AAAAACACAT TTAAACACTT TTTTTTTTAA 2529 (2) Informace o SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 703 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:
Arg Leu Val Val Leu 1 5
Leu Ala Ala Leu Gly 20
Val Leu Leu Ala 10 Ala Gly Leu val Ala 15
Gin Tyr Gin 25 Thr Arg Ser Pro Ser 30 Val
Ser val Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser
35 40
Asp Pro 50 Thr Val Asp Pro Cys 55 His Asp
Gly 65 Trp Ile Lys Ala Asn 70 Pro Val Pro
Thr Phe Ser Asn Leu 85 Trp Glu His Asn
Leu Glu Asn Ser 100 Thr Ala Ser val Ser 105
Val Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu
110
125
120
115
Ala Lys 130 Pro Leu Met Glu Leu 135 Ile Glu Arg Leu Gly 140 Gly Trp Asn ixe
Thr Gly Pro Trp Ala Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val
145 150 155 160
Thr Ala His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala
165 170 175
Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin Val Asp Gin Ser Gly
180 185 190
Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu
195 200 205
Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu
210 215 220
Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala Ile Arg Pro Gin Met Gin Gin Ile
225 230 235 240
Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn Ile Thr Ile Pro Gin Glu Lys
245 250 255
Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu
260 265 270
Gin Thr Leu Ala Pro Ala Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr Ile
275 280 285
Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val Tyr Asp
290 295 300
Lys Glu Tyr Leu Glu Gin Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr Thr Asp Arg
305 310 315 320
Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser
325 330 335
Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu
340 345 350
Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys
355 360 365
Val Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe
370. 375 380
Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser Ile Ala Thr Glu Ile
385 390 395 400
Ile Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys
405 410 415
Trp Met Asp Glu 420 Glu Thr Arg Lys Ser 425 Ala Lys Glu Lys Ala 430 Asp Ala
Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu
435 440 445
Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe
450 455 460
Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp
465 470 475 480
Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro
485 490 495
Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro
500 505 510
Ala Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala
515 520 525
Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His
530 535 540
Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg
545 550' 555 560
Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gin Thr Glu
565 570 575
Cys Met Val Glu Gin Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val
580 585 590
Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu
595 600 605
Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala
610 615 620
Glu His Ser Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe
625 630 635 640
Leu Gly Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser
645 650 655
His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val
660 665 670
Ile Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys
675
680
685
Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp 690 695 700 (2) Informace o SEQ ID NO: 26:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:
GGTGCTTGAT GATGGCTTGG TTGT 24 (2) Informace o SEQ ID NO: 27:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 27:
AGATGGAGCT GGTCACCGAG ATGC (2) Informace o SEQ ID NO: 28:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 324 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: ne (vi) Původ:
(A) Organismus: Bos taurus (B) Typ tkáně: plíce (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 28:
GGGAGCGCGG CGCGGGGCCG GAGCGGAGCG CGCGAGCGAT GATGTCTACC TACAAGCGGC
2213
GGT Gly 710 CTC ATC ACC GAT Asp CCC CAC AGC CCC TCC CGC TTC CGG GTC ATC GGC Gly 725
Leu Ile Thr Pro His 715 Ser Pro Ser Arg Phe 720 Arg Val Ile
TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC TCG GAA CAC TTC CAC TGC CCG CCC
Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe His Cys Pro Pro
730 735 740
GGC TCA CCC' ATG AAC CCG CAT CAC AAG TGT GAA GTC TGG T GAAGGGCCAG
Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp
745 750
GCA
(2) Informace o SEQ ID NO: 30:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 754 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 30:
2261
2311 • 2314
Met 1 Met Ser Thr Tyr 5 Lys Arg Pro Thr Leu 10 Asp Glu Glu Asp Leu 15 Val
Asp Ser Leu Ser 20 Glu Ser Asp Val Tyr 25 Pro Asn His Leu Gin 30 Val Asn
Phe Arg Gly 35 Pro Arg Asn Gly Gin 40 Arg Cys Trp Ala Ala 45 Arg Thr Pro
Val Glu 50 Lys Arg Leu Val Val 55 Leu Val Ala Leu Leu 60 Ala Ala Ala Leu
Val 65 Ala Cys Leu Ala Val 70 Leu Gly Ile Gin Tyr 75 Gin Thr Arg Thr Pro 80
Ser Val Cys Leu Ser 85 Glu Ala Cys Ile Ser 90 Val Thr Ser Ser Ile 95 Leu
Ser Ser Met Asp 100 Pro Thr Val Asp Pro 105 Cys Gin Asp Phe Phe 110 Thr Tyr
Ala Cys Gly 115 Gly Trp Ile Lys Ala 120 Asn Pro Val Pro Asp 125 Gly His Ser
Arg Trp 130 Gly Thr Phe Ser Asn 135 Leu Trp Glu His Asn 140 Gin Ala Ile Ile
Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg
145 150 155 160
Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg lle 175 Glu
165 170
Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu lle Glu Lys Leu Gly Gly
180 185 190
Trp Asn lle Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu
195 200 205
Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr
210 215 220
Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val lle Gin Val Asp
225 230 235 240
Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr
245 250 255
Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu
260 265 270
Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Thr lle Arg Pro Gin Met
275 280 285
Gin Gin lle Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn lle Thr lle Pro
290 295 300
Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu lle Tyr His Lys Val Thr Ala
305 310 315 320
Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala lle Asn Trp Leu Pro Phe Leu
325 330 335
Asn Thr lle Phe Tyr Pro Val Glu lle Asn Glu Ser Glu Pro lle Val
340 345 350
lle Tyr ASp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu lle Asn Ser
355 360 365
Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met lle Trp Asn Leu Val Arg
370 375 380
Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys
385 390 395 400
Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp
405 410 415
Lys Phe Cys val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe Ala Leu Gly
420 425 430
Pro Met Phe Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Asn lle Ala
435 440 445
Ser Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys 450 455
Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp 465 470
Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Met Ile 485
Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe 500
Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg 515 520
Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys Ala 530 535
Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr 545 550
Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gin 565
Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly 580
Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin 595 600
Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn 610 615
Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin 625 630
Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr 645
Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg 660
Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro 675 680
Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin 690 695
Glu Ser Ser His Glu Gly Leu Ile 705 710
Phe Arg Val Ile Gly Ser Ile Ser 725
Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser
460
Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys 475 480
Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp 490 495
Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp 505 510
Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val 525
Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met 540
Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile 555 560
Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser '570 57 5
Ile Gly Val Val Val Gly His Glu 585 590
Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly 605
Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Gin 620
Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly 635 640
Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn 650 655
Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys 665 670
Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin 685
Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro 700
Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg 715 .720
Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His 730 735
Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu 740 745 750
Val Trp (2) Informace o SEQ ID NO: 31:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 53 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 31:
(2) Informace o SEQ ID NO: 32:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 32:
GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA ACTAGTCTCG AGCCAAGCAG GCCACCAGTC CTG (2) Informace o SEQ ID NO: 33:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 222 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: ne (iii) Antisense: ano (vi) Původ:
(A) Organismus: Homo sapiens (B) Typ tkáně: placenta (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 38..222 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 33:
CGCCCCCCCG GTGTCCGCCC TGCTGTCGGC GCTGGGG ATG TCG ACG TAC AAG CGG 55
Met Ser Thr Tyr Lys Arg
5
GCC Ala ACG CTG GAC GAG GAG Glu GAC CTG GTG GAC TCG CTC TCC GAG GGC GAC 103
Thr Leu Asp Glu 10 Asp Leu Val 15 Asp Ser Leu Ser Glu 20 Gly Asp
GCA TAC CCC AAC GGC CTG CAG GTG AAC TTC CAC AGC CCC CGG AGT GGC 151
Ala Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe His Ser Pro Arg Ser Gly
25 30 35
CAG AGG TGC TGG GCT GCA CGG ACC CAG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG 199
Gin Arg Cys Trp Ala Ala Arg Thr Gin Val Glu Lys Arg Leu Val Val
40 • 45 50
TTG GTG GTA CTT CTG GCG GCA GG 222
Leu Val Val Leu Leu Ala Ala
60 (2) Informace o SEQ ID NO: 34:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 61 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 34:
« Met 1 Ser Thr Tyr Lys 5 Arg Ala Thr Leu Asp 10 Glu Glu Asp Leu Val 15 Asp
Ser Leu Ser Glu 20 Gly Asp Ala Tyr Pro 25 Asn Gly Leu Gin Val 30 Asn Phe
His Ser Pro 35 Arg Ser Gly Gin Arg 40 Cys Trp Ala Ala Arg 45 Thr Gin Val
Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Val Leu Leu Ala Ala
55 60 (2) Informace o SEQ ID NO: 35:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 2720 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: ne (vi) Původ:
(A) Organismus: Homo sapiens (B) Typ tkáně: placenta (ix) Znaky:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Poloha: 38..2297 (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 35:
CGCCCCCCCG GTGTCCGCCC TGCTGTCGGC GCTGGGG ATG TCG ACG TAC AAG CGG 55
Met Ser Thr Tyr Lys Arg
5
GCC ACG CTG GAC GAG GAG GAC CTG GTG GAC TCG CTC TCC GAG GGC GAC Asp 103
Ala Thr Leu Asp Glu Glu Asp Leu Val 15 Asp Ser Leu Ser Glu 20 Gly
10
GCA TAC CCC AAC GGC CTG CAG GTG AAC TTC CAC AGC CCC CGG AGT GGC 151
Ala Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe His Ser Pro Arg Ser Gly
25 30 35
CAG AGG TGC TGG GCT GCA CGG ACC CAG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG 199
Gin Arg Cys Trp Ala Ala Arg Thr Gin Val Glu Lys Arg Leu Val Val
40 45 50
TTG GTG GTA CTT CTG GCG GCA GGA CTG GTG GCC TGC TTG GCA GCA CTG 247
Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Gly Leu Val Ala Cys Leu Ala Ala Leu
55 60 65 70
GGC ATC CAG TAC CAG ACA AGA TCC CCC TCT GTG TGC CTG AGC GAA GCT 295
Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala
75 80 85
TGT GTC TCA GTG ACC AGC TCC ATC TTG AGC TCC ATG GAC CCC ACA GTG 343
Cys Val Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Met Asp Pro Thr Val
90 95 100
GAC CCC TGC CAT GAC TTC TTC AGC TAC GCC TGT GGG GGC TGG ATC AAG 391
Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Ile Lys
105 110 115
GCC AAC Ala Asn CCA Pro GTC Val CCT Pro GAT GGC CAC TCA CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC Asn 42
Asp Gly 125 His Ser Arg Trp Gly 130 Thr Phe Ser
120
CTC TGG GAA CAC AAC CAA GCA ATC ATC AAG CAC CTC CTC GAA AAC TCC 48
Leu Trp Glu His Asn Gin Ala íle Ile Lys His Leu Leu Glu Asn Ser
135 140 145 150
ACG GCC AGC GTG AGC GAG GCA GAG AGA AAG GCG CAA GTA TAC TAC CGT 53
Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Gin Val Tyr Tyr Arg
155 160 165
GCG TGC ATG AAC GAG ACC AGG ATC GAG GAG CTC AGG GCC AAA CCT CTA 58.
Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu Leu Arg Ala Lys Pro Leu
170 175 180
ATG GAG TTG ATT GAG AGG CTC GGG GGC TGG AAC ATC ACA GGT CCC TGG 632
Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp
185 190 195 (
GCC AAG GAC AAC TTC CAG GAC ACC CTG CAG GTG GTC ACC GCC CAC TAC 67S
Ala Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ala His Tyr
200 205 210
CGC ACC TCA CCC TTC TTC TCT GTC TAT GTC AGT GCC GAT TCC AAG AAC - , 727
Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn
215 220 225 230
TCC AAC AGC AAC GTG ATC CAG GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC TTG CCC 775
Ser Asn Ser Asn Val ile Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro
235 240 245
TCG AGA GAC TAT TAC CTG AAC AAA ACT GAA AAC GAG AAG GTG CTG ACC 823
Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr
250 255 260
GGA TAT CTG AAC TAC ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGC GGC GGG 871
Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly
265 270 275
GAC GAG GAG GCC ATC CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC TTG GAC TTT GAG 919
Asp Glu Glu Ala Ile Arg Pro Gin Met Gin Gin Ile Leu Asp Phe Glu
280 285 290
ACG GCA CTG GCC AAC ATC ACC ATC CCA CAG GAG AAG CGC CGT GAT GAG 967
Thr Ala Leu Ala Asn Ile Thr Ile Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu
295 300 305 310
GAG CTC ATC TAC CAC AAA GTG ACG GCA GCC GAG CTG CAG ACC TTG GCA 1015
Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala
315 320 325
CCC Pro GCC. Ala ATC Ile AAC Asn. 330 TGG Trp TTG Leu CCT Pro TTT Phe CTC Leu 335 AAC Asn ACC Thr ATC Ile TTC Phe TAC Tyr 340 CCC Pro Val
GAG ATC AAT GAA TCC GAG CCT ATT GTG GTC TAT GAC AAG GAA TAC CTT 1111
Glu Ile Asn 345 Glu Ser Glu Pro Ile 350 Val Val Tyr Asp Lys 355 Glu Tyr Leu
GAG CAG ATC TCC ACT CTC ATC AAC ACC ACC GAC AGA TGC CTG CTC AAC 1159
Glu Gin 360 Ile Ser Thr Leu Ile 365 Asn Thr Thr Asp Arg 370 Cys Leu Leu Asn
AAC TAC ATG ATC TGG AAC CTG GTG CGG AAA ACA AGC TCC TTC CTT GAC 1207
Asn 375 Tyr Met Ile Trp Asn 380 Leu Val Arg Lys Thr 385 Ser Ser Phe Leu Asp 390
CAG CGC TTT CAG GAC GCC GAT GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAC GGG 1255
Gin Arg Phe Gin Asp 395 Ala Asp Glu Lys Phe 400 Met Glu Val Met Tyr 405 Gly
ACC AAG AAG ACC TGT CTT CCT CGC TGG AAG TTT TGC GTG AGT GAC ACA 1303
Thr Lys Lys Thr 410 Cys Leu Pro Arg Trp 415 Lys Phe Cys Val Ser 420 Asp Thr
GAA AAC AAC CTG GGC TTT GCG TTG GGC CCC ATG TTT GTC AAA GCA ACC 1351
Glu Asn Asn 425 Leu Gly Phe Ala Leu 430 Gly Pro Met Phe Val 435 Lys Ala Thr
TTC GCC GAG GAC AGC AAG AGC ATA GCC ACC GAG ATC ATC CTG GAG ATT 1399
Phe Ala 440 Glu Asp Ser Lys Ser 445 Ile Ala Thr Glu Ile 450 Ile Leu Glu Ile
AAG AAG GCA TTT GAG GAA AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAG 1447
Lys 455 Lys Ala Phe Glu Glu 460 Ser Leu Ser Thr Leu 465 Lys Trp Met Asp Glu 470
GAA ACC CGA AAA TCA GCC AAG GAA AAG GCC GAT GCC ATC TAC AAC ATG 1495
Glu Thr Arg Lys Ser 475 Ala Lys Glu Lys Ala 480 Asp Ala Ile Tyr Asn 485 Met
ATA GGA TAC CCC AAC TTC ATC ATG GAT CCC AAG GAG CTG GAC AAA' GTG 1543
Ile Gly Tyr Pro 490 Asn Phe Ile Met Asp 495 Pro Lys Glu Leu Asp 500 Lys Val
TTT AAT GAC TAC ACT GCA GTT CCA GAC CTC TAC TTT GAA AAT GCC ATG 1591
Phe Asn Asp 505 Tyr Thr Ala val Pro 510 Asp Leu Tyr Phe Glu 515 Asn Ala Met
CGG TTT TTC AAC TTC TCA TGG AGG GTC ACT GCC GAT CAG CTC AGG AAA 1639
Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys
520 525 530
GCC CCC AAC AGA GAT CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC Ala 550 168
Ala 535 Pro Asn Arg Asp Gin 540 Trp Ser Met Thr Pro 545 Pro Met Val Asn
TAC TAC TCG CCC ACC AAG AAT GAG ATT GTG TTT CCG GCC GGG ATC CTG 173
Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu
555 560 565
CAG GCA CCA TTC TAC ACA CGC TCC TCA CCC AAG GCC TTA AAC TTT GGT 178
Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala Leu Asn Phe Gly
570 575 580
GGC ATA GGT GTC GTC GTG GGC CAT GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT 183:
Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp
585 590 595
CAA GGA CGG GAG TAT GAC AAG GAC GGG AAC CTC CGG CCA TGG TGG AAG 187S
Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys
600 605 610
AAC TCA TCC GTG GAG GCC TTC AAG CGT CAG ACC GAG TGC ATG GTA GAG 1927
Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gin Thr Glu Cys Met Val Glu
615 620 625 630
CAG TAC AGC AAC TAC AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGG CGG CAC 1975
Gin Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg His'
635 640 645
ACC CTG GGG GAG AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGT CTC AAG GCG GCC TAT 2023
Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr
650 655 660
CGG GCT TAC CAG AAC TGG GTG AAG AAG AAC GGG GCT GAG CAC TCG CTC 2071
Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu His Ser Leu
665 670 675
CCC ACC CTG GGC CTC ACC AAT AAC CAG CTC TTC TTC CTG GGC TTT GCA 2119
Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Gly Phe Ala
680 685 690
CAG GTC TGG TGC TCC GTC CGC ACA CCT GAG AGC TCC CAC GAA GGC CTC 2167
Gin Val Trp Cys Ser val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu Gly Leu
695 700 705 710
ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCT CGC TTC CGG GTC ATC GGC TCC CTC 2215
Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly Ser Leu
715 720 725
TCC AAT TCC AAG GAG TTC TCA GAA CAC TTC CGC TGC CCA CCT GGC TCA 2263
Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys Pro Pro Gly Ser
730 735 740
CCC ATG AAC CCG CCT CAC AAG TGC GAA GTC TGG T AAGGACGAAG
Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp 745 750
CGGAGAGAGC CAAGACGGAG GAGGGGAAGG GGCTGAGGAC GAGACCCCCA TCCAGCCTCC AGGGCATTGC TCAGCCCGCT TGGCCACCCG GGGCCCTGCT TCCTCACACT GGCGGGTTTT CAGCCGGAAC CGAGCCCATG GTGTTGGCTC TCAACGTGAC CCGCAGTCTG ATCCCCTGTG AAGAGCCGGA CATCCCAGGC ACACGTGTGC GCCACCTTCA GCAGGCATTC GGGTGCTGGG CTGGTGGCTC ATCAGGCCTG GGCCCCACAC TGACAAGCGC CAGATACGCC ACAAATACCA CTGTGTCAAA TGCTTTCAAG ATATATTTTT GGGGAAACTA TTTTTTAAAC ACTGTGGAAT ACACTGGAAA TCTTCAGGGA AAAACACATT TAAACACTTT TTTTTTTAAG CCC
2307
2367
2427
2487
2547
2607
2667
2720 (2) Informace o SEQ ID NO: 36:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 753 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi): Popis sekvence: SEQ ID NO: 36:
Met 1 Ser Thr Tyr Lys 5 Arg Ala Thr Leu Asp 10 Glu Glu Asp Leu Val 15 Asp
Ser Leu Ser Glu Gly Asp Ala Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe
20 25 30
His Ser Pro Arg Ser Gly Gin Arg Cys Trp Ala Ala Arg Thr Gin Val
35 40 45
Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Gly Leu Val
50 55 60
Ala Cys Leu Ala Ala Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser
65 70 75 80
Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys Val Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser
85 90 95
Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala
100 105 110
Cys Gly Gly Trp Ile Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg
115
120
125
Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Ala Ile Ile Lys 130 135 140
His Leu Leu 145 Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val 150 Ser 155 Glu Ala Glu Arg Lys 160
Ala Gin Val Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu
165 170 175
Leu Arg Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp
180 185 190
Asn Ile Thr Gly Pro Trp Ala Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin
195 200 205
Val Val Thr Ala His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val
210 215 220
Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin Val Asp Gin
225 230 235 240
Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu
245 250 255
Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly
260 265 270
Lys Leu Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala Ile Arg Pro Gin Met Gin
275 280 285
Gin. Ile Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn Ile Thr Ile Pro Gin
290 295 300
Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Ala Ala
305 310 315 320
Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn
325 330 335
Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val
340 345 350
Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Glu Gin Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr Thr
355 360 365
Asp Arg Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys
370 375 380
Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe
385 390 395 400
Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys
405 410 415
Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro
420 425 430
•Ί»
Met Phe Val 435 Lys Ala Thr Phe Ala 440 Glu Asp Ser Lys Ser 445 Ile Ala Thr
Glu Ile 450 Ile Leu Glu Ile Lys 455 Lys Ala Phe Glu Glu 460 Ser Leu Ser Thr
Leu 465 Lys Trp Met Asp Glu 470 Glu Thr Arg Lys Ser 475 Ala Lys Glu Lys Ala 480
Asp Ala Ile Tyr Asn 485 Met Ile Gly Tyr Pro 490 Asn Phe Ile Met Asp 495 Pro
Lys Glu Leu Asp 500 Lys Val Phe Asn Asp 505 Tyr Thr Ala Val Pro 510 Asp Leu
Tyr Phe Glu 515 Asn Ala Met Arg Phe 520 Phe Asn Phe Ser Trp 525 Arg Val Thr
Ala Asp 530 Gin Leu Arg Lys Ala 535 Pro Asn Arg Asp Gin 540 Trp Ser Met Thr
Pro 545 Pro Met Val Asn Ala 550 Tyr Tyr Ser Pro Thr 555 Lys Asn Glu Ile Val 560
Phe Pro Ala Gly Ile 565 Leu Gin Ala Pro Phe 570 Tyr Thr Arg Ser Ser 575 Pro
Lys Ala Leu Asn 580 Phe Gly Gly Ile Gly 585 Val Val Val Gly His 590 Glu Leu
Thr His Ala 595 Phe Asp Asp Gin Gly 600 Arg Glu Tyr Asp Lys 605 Asp Gly Asn
Leu Arg 610 Pro Trp Trp Lys Asn 615 Ser Ser Val Glu Ala 620 Phe Lys Arg Gin
Thr 625 Glu Cys Met Val Glu 630 Gin Tyr Ser Asn Tyr 635 Ser Val Asn Gly Glu 640
Pro Val Asn Gly Arg 645 His Thr Leu Gly Glu 650 Asn Ile Ala Asp Asn 655 Gly
Gly Leu Lys Ala 660 Ala Tyr Arg Ala Tyr 665 Gin Asn Trp Val Lys 670 Lys Asn
Gly Ala Glu 675 His Ser Leu Pro Thr 680 Leu Gly Leu Thr Asn 685 Asn Gin Leu
Phe Phe 690 Leu Gly Phe Ala Gin 695 Val Trp Cys Ser Val 700 Arg Thr Pro Glu
Ser Ser His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe
705
710
715
720
Arg Val Ile Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe
725 730 735
Arg Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val
740 745 750
Trp
< O
* u r~ JQ í\>
F' ω G .v ! OO
• Ή · < Xt > :>< σ o c/x cr: n<
- o D r—
.—| < 1 m to O
< □- cn
• -5 O H-*
E A T E NT O v 13 N A R O K Y
1. Endothelin konvertující enzym, vyznačující se t í m, že obsahuje v SEQ ID NO: 30 nebo SEQ ID NO: 36 popsanou polypeptidovou sekvenci nebo její funkční fragment.
2. DNA sekvence, která kóduje endothelin konvertující enzym podle nároku 1 a je vybrána ze skupiny, zahrnující
a) DNA-sekvence se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 29 nebo SEQ ID NO: 35,
b) DNA-sekvence, které kódují protein se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 30 nebo SEQ ID NO: 36 a
c) DNA-sekvence, které za standardních podmínek hybridizují s DNA-sekvencemi a) nebo b),
d) DNA-sekvence, které kódují proteinový produkt, který může být rozpoznáván protilátkami, které se vytvoří proti proteinu SEQ ID NO: 30 nebo 36 nebo z něj generovaným fragmentům.
3. Způsob genově technické výroby endothelin konvertujících enzymů za použiti DNA sekvencí podle nároku 2.
4. Způsob výroby endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1,vyznačující se tím, žese savčí buňky stimulují inhibitorem endothelin konvertujícího enzymu pro nadměrnou produkci endothelin konvertujícího enzymu a z těchto buněk se izoluje endothelin konvertující enzym běžnými způsoby.
5. Způsob podle nároku 4,vyznačuj ící se t í m, že se jako inhibitor použije fosforamidon.
6. Způsob výroby endothelin konvertujíčího enzymu podle nároku 1,vyznačující se tím, že se použije parciální sekvenci SEQ ID NO: 36 kódující nebo sekvenčně komplementární oligonukleotid jako hybridizační sonda, pro izolaci genu pro endothelin konvertující enzym z genového poolu a tento gen se běžnými genovětechnickými metodami exprimuje v hostitelském organismu.
7. Použití endothelin konvertujíčího enzymu podle nároku 1 pro identifikaci inhibitorů endothelin konvertujících enzymů.
8. Inhibitory endothelin konvertujících enzymů, které jsou identifikovány s enzymovým testem za použití endothelin konvertujících enzymů podle nároku 1.
9. Použití inhibitorů podle nároku 8 jako léčiv.
10. Způsob výroby léčiv, která inhibují endothelin konvertující enzym, vyznačující se tím, že se známé chemické sloučeniny použijí v enzymovém testu za použití endothelin konvertujících enzymů podle nároku 1 a identifikují se ty, které mají inhibující působení a takto identifikované sloučeniny se formulují s běžnými nosičovými a pomocnými látkami jako léčivo.
11. Použití endothelin konvertujíčího enzymu podle nároku 1 pro výrobu protilátek.
12. Použití protilátek podle nároku 11 k diagnóze chorob.
13. Použití DNA-sekvenze podle nároku 2 pro výrobu transgenních zvířat, která tuto DNA-sekvenci obsahují v jedné nebo více extrakopiích nebo u kterých je normální EXE-gen vypnut.
14. Použití endothelin konvertujíčího enzymu podle nároku 1 pro výrobu léčiv.
15. Použití parciálních sekvencí sekvence SEQ ID NO 35 pro výrobu anti-sense oligonukleotidů.
16. Použití parciálnícch sekvencí podle nároku 15 pro výrobu léčiv.
změněný list
RATENTOVÉ

Claims (10)

  1. NÁROKY
    1. Endothelin konvertující enzym, vyznačující se t í m, že obsahuje v SEQ ID NO: 36 popsanou polypeptidovou sekvenci nebo parciální sekvenci, která ještě vykazuje enzymatickou aktivitu endothelin konvertujícího enzymu, antigenní vlastnosti nebo afinitu k ligandům.
  2. 2. DNA sekvence, které kódují endothelin konvertující enzym podle nároku 1 a jsou vybrány ze skupiny, zahrnující
    a) DNA-sekvence se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 35,
    b) DNA-sekvence, které kódují protein se strukturou popsanou v SEQ ID NO: 36.
  3. 3. Způsob genovětechnické výroby endothelin konvertujících enzymů za použití DNA sekvencí podle nároku 2.
  4. 4. Způsob výroby endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1,vyznačující se tím, že se savčí buňky stimulují inhibitorem endothelin konvertujícího enzymu pro nadměrnou produkci endothelin konvertujícího enzymu a z těchto buněk se izoluje endothelin konvertující enzym běžnými způsoby.
  5. 5. Způsob podle nároku 4,vyznačuj ící se t í m, že se jako inhibitor použije fosforamidon.
  6. 6. Způsob výroby endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se použije parciální změněný list sekvenci SEQ ID NO: 36 kódující nebo sekvenčně komplementární hybridizační sonda, pro izolaci genu pro endothelin konvertující enzym z genového poolu a tento gen se běžnými genovětechnickými metodami exprimuje v hostitelském organismu.
  7. 7. Použití endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1 pro identifikaci inhibitorů endothelin konvertujícího enzym.
    *
  8. 8. Použití endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1 pro výrobu protilátek.
    *
  9. 9. Použití DNA-sekvenze podle nároku 2 pro výrobu transgenních zvířat, která tuto DNA-sekvenci obsahují v jedné nebo více extrakopiích nebo u kterých je normální EXE-gen vypnut.
  10. 10. Použití endothelin konvertujícího enzymu podle nároku 1 pro výrobu léčiv.
CZ961394A 1993-11-16 1994-11-10 Endothelin-converting enzyme CZ139496A3 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19934339100 DE4339100A1 (de) 1993-11-16 1993-11-16 Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1)
DE19944403665 DE4403665A1 (de) 1994-02-07 1994-02-07 Endothelinkonversionsenzym (ECE)
DE19944412372 DE4412372A1 (de) 1994-04-12 1994-04-12 Endothelinkonversionsenzym (ECE)
PCT/EP1994/003706 WO1995014095A1 (de) 1993-11-16 1994-11-10 Endothelinkonversionsenzym (ece)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ139496A3 true CZ139496A3 (en) 1997-10-15

Family

ID=27205762

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ961394A CZ139496A3 (en) 1993-11-16 1994-11-10 Endothelin-converting enzyme

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6066502A (cs)
EP (1) EP0728209B1 (cs)
JP (1) JPH09505733A (cs)
KR (1) KR960705934A (cs)
CN (1) CN1141651A (cs)
AT (1) ATE315656T1 (cs)
AU (1) AU8107094A (cs)
BR (1) BR9408077A (cs)
CA (1) CA2176507A1 (cs)
CZ (1) CZ139496A3 (cs)
DE (1) DE59410427D1 (cs)
FI (1) FI962047A (cs)
HU (1) HUT75554A (cs)
NO (1) NO962023L (cs)
NZ (1) NZ275817A (cs)
PL (1) PL314480A1 (cs)
SK (1) SK59896A3 (cs)
WO (1) WO1995014095A1 (cs)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6255468B1 (en) * 1998-05-07 2001-07-03 Smithkline Beecham Plc MPROT12 polynucleotides and methods thereof
WO2001021773A2 (en) * 1999-09-24 2001-03-29 Lexicon Genetics Incorporated Human endothelin converting enzyme-like proteins and polynucleotides encoding the same
ES2255003T3 (es) * 2004-02-13 2006-06-16 B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft Procedimiento para determinar la formacion de endotelinas con fines diagnostico medico, y anticuerpos y kits para realizar un procedimiento de este tipo.
US9062347B2 (en) 2007-07-27 2015-06-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Endothelin single nucleotide polymorphisms and methods of predicting β-adrenergic receptor targeting agent efficacy

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2966939B2 (ja) * 1990-12-07 1999-10-25 日清製粉株式会社 ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素
WO1992013944A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 Berlex Laboratories, Inc. Endothelin converting enzyme

Also Published As

Publication number Publication date
EP0728209A1 (de) 1996-08-28
CN1141651A (zh) 1997-01-29
BR9408077A (pt) 1997-08-12
NO962023D0 (no) 1996-05-15
ATE315656T1 (de) 2006-02-15
HUT75554A (en) 1997-05-28
US6066502A (en) 2000-05-23
NZ275817A (en) 1997-02-24
CA2176507A1 (en) 1995-05-26
FI962047A (fi) 1996-07-12
EP0728209B1 (de) 2006-01-11
JPH09505733A (ja) 1997-06-10
WO1995014095A1 (de) 1995-05-26
AU8107094A (en) 1995-06-06
SK59896A3 (en) 1997-07-09
NO962023L (no) 1996-07-16
HU9601298D0 (en) 1996-07-29
KR960705934A (ko) 1996-11-08
FI962047A0 (fi) 1996-05-14
PL314480A1 (en) 1996-09-16
DE59410427D1 (en) 2006-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Galjart et al. Human lysosomal protective protein has cathepsin A-like activity distinct from its protective function
KR101126423B1 (ko) 보체 활성화를 억제하는 변형된 프로테아제
Faucheu et al. A novel human protease similar to the interleukin‐1 beta converting enzyme induces apoptosis in transfected cells.
KR101476458B1 (ko) 프로테아제 스크리닝 방법 및 이에 의해 확인된 프로테아제
US20020064856A1 (en) Novel proteases
CN101517074B (zh) 蛋白酶筛选方法及由此鉴别的蛋白酶
US20030108998A1 (en) Aggrecan degrading metallo proteases
Fumagalli et al. Human NRD convertase: a highly conserved metalloendopeptidase expressed at specific sites during development and in adult tissues
JPH09149790A (ja) 新規セリンプロテアーゼ
CZ139496A3 (en) Endothelin-converting enzyme
EP0842280A2 (en) Mammalian pro-hormone convertase
US6548284B1 (en) Membrane-bound metalloprotease and soluble secreted form thereof
JP2002034566A (ja) ミミズ由来セリンプロテアーゼの遺伝子、当該遺伝子を含むプラスミドベクター及び形質転換体
EP1895002B1 (en) Novel trypsin family serine proteases
JPH11225765A (ja) 新規セリンプロテアーゼ
JP2004256436A (ja) アグリカナーゼ−１阻害剤
JP2001286289A (ja) トロンボスポンジンドメインを有する新規メタロプロテアーゼとこれをコードする核酸組成物
JP2001046065A (ja) 新規セリンプロテアーゼ
JP2001046072A (ja) Ａｃｅ類似遺伝子
JP2003146905A (ja) アグリカナーゼ活性を有する新規な金属プロテアーゼ
Pesquero et al. Expression and localization of N-domain ANG
CA2235575A1 (en) Novel human cysteine protease