DE4339100A1 - Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1) - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Endothelinkonversionsenzyme, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Erhöhte Endothelinspiegel werden mit einer Vielzahl von Erkran­ kungen wie essentielle Hypertonie, Herzinfarkt, akutes Nierenver­ sagen, Schock oder Herzversagen in Zusammenhang gebracht. Auf einen solchen Zusammenhang lassen auch mit Endothelin-Antikörpern erzielbare Ergebnisse schließen. In Tiermodellen konnte damit die Größe eines Herzinfarktes dosisabhängig verringert (Watanabe et al., Nature 344, 114 (1990)), die Nierenfunktion positiv beein­ flußt (Kon et al., J. Clin. Invest. 83, 1762 (1989)), und die Nephrotoxizität von Cyclosporin herabgesetzt werden (Kon et al., Kidney Int. 37, 1487 (1990)).

Endothelinkonversionsenzym (ECE-1) setzt Endothelin 1 aus dem 38 Aminosäuren bestehenden Vorläufermolekül Big-Endothelin-1 frei. Den von Endothelin-1 hervorgerufenen unerwünschten biologischen Effekten läßt sich z. B. durch Inhibierung des Endothelinkonver­ sionsenzyms und damit der Endothelin-1 Biosynthese entgegenwir­ ken.

Es sind Enzymaktivitäten, die Endotheline bzw. endothelinähnliche Moleküle aus den entsprechenden Vorläufermolekülen, den Big-En­ dothelinen freisetzen, aus verschiedenen Zellinien isoliert wor­ den (Takeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, 860 (1991), Ohnaka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 168, 1128 (1990); Matsumura et al. FEBS Lett. 293, 45 (1992), Ahn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8606 (1992), PCT WO 92/13944, Ohnaka et al. Clin. Exp. Hypertension A 14; Nr. 4 (1992), Okada et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991), Takada et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 182, 1383 (1992), Opgenorth et al. FASEB 6, 2653 (1992)).

Diese Enzymaktivitäten sind jedoch bisher unzureichend charakte­ risiert worden. Sie liegen als wenig angereicherte Enzymmischun­ gen vor. Solche unreinen Enzymmischungen sind jedoch für die Ver­ wendung in Testverfahren zum Auffinden von spezifischen ECE- Inhibitoren schlecht geeignet, da andere, physiologisch nicht relevante Fremdproteasen den Enzymtest erheblich stören.

So wird Big-Endothelin beispielsweise auch durch die Serinpro­ tease Chymothrypsin sowie durch Papain und Thermolysin zu Endothelin und endothelinähnlichen Produkten gespalten, die in Testverfahren fälschlicherweise dem Enzym ECE zugeordnet werden. Infolgedessen ist die Beschreibung des Endothelinkonversionsen­ zyms in der Literatur widersprüchlich.

Die Angaben über das Molekulargewicht des Endothelinkonversions­ enzyms variieren von 65 KDalton bis 540 KDalton; die Angaben der Km und vmax Werte weichen ebenfalls erheblich voneinander ab (Op­ genorth et al. FASEB 6, 2653 (1992); Sawamura et al. Biochem. Biophys. Acta 1161,295 (1993)). Auch gibt es Widersprüche dar­ über, ob das Endothelinkonversionsenzym in die Familie der Aspar­ tatproteasen oder der Metalloproteasen einzuordnen ist (Sawamura et al. Biochem. Biophys. Acta 1161,295 (1993); Biochem. Pharma­ col. 43,845 (1992). Ferner finden sich in der Literatur wider­ sprüchliche Aussagen über charakteristische Angaben, ob es sich bei der Metalloprotease um ein cytoplasmatisches oder membrange­ bundenes Enzym handelt und welche Substrate von dem jeweiligen ECE umgesetzt werden (Big-Et-1; Big-Et-3):
Matsumura et al. (FEBS Lett. 293, 45 (1992));
Takahashi et al. (J. Biol. Chem. 268;21394 (1993));
Okada et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991));
Ohnaka et al. (Clin. Exp. Hypertension A 14; Nr. 4 (1992));
Matsumura et al. (FEBS Lett. 305;86 (1992)).

Bisher wurde keine eindeutige Beschreibung des ECE gezeigt, die es ermöglicht, ECE-1 einwandfrei zu definieren. Eine solche Definition kann möglicherweise erst durch das Bestimmen der Pri­ märstruktur, der Aminosäuresequenz, des ECE erfolgen. Hierzu ist es notwendig, ECE zunächst in reiner Form herzustellen.

Es bestand daher die Aufgabe, Endothelinkonversionsenzym in rei­ ner Form bereitzustellen.

Es wurde ein Endothelinkonversionsenzym, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von 250 000 Dalton und die Aminosäurepartialse­ quenz SEQ ID NO: 1 gefunden.

Das erfindungsgemäße Endothelinkonversionsenzym weist folgende Merkmale auf: Es besitzt ein mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelek­ trophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen ermitteltes Molekulargewicht von etwa 250 000 Dalton.

Unter reduzierenden Bedingungen zeigt es in der SDS-Polyacryla­ midgelelektrophorese eine Bande von 125 000 Dalton; es besteht vermutlich aus einem Homodimer.

Das Endothelinkonversionsenzym ist glykosyliert. Die enzymatische Entfernung der Zuckerreste bewirkt eine Veränderung des apparen­ ten Molekulargewichts von 125 000 Dalton auf etwa 82 000 Dalton.

Die Sequenzierung von tryptischen Peptiden des Endothelinkonver­ sionsenzyms liefert folgende Aminosäurepartialsequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5.

Eine weitere Charakterisierung des erfindungsgemäßen Endothelin­ konversionsenzyms ist in den Beispielen vorgenommen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Endothelinkonversions­ enzyme, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 250 000 Dalton und eine Aminosäurepartialsequenz, die mindestens 80% Homologie zu SEQ ID NO: 1 aufweisen.

Solche Endothelinkonversionsenzyme lassen sich aus anderen Organismen als Rind, beispielsweise aus menschlichen Zellen, iso­ lieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der Endothelinkonversionsenzyme, die dadurch gekennzeichnet sind, daß Säugerzellen, bevorzugt Endothelzellen, mit einem Inhibitor des Endothelinkonversionsenzyms zur Endothelinkonversionsenzym-Über­ produktion stimuliert werden und aus diesen Zellen Endothelinkon­ versionsenzym mit üblichen proteinchemischen Maßnahmen isoliert wird.

Für die Induktion des ECE in Säugerzellen können alle ECE- Inhibitoren Verwendung finden. Hierfür geeignete ECE-Inhibitoren sind z. B. beschrieben in JP-146737; JP 05148277-A1; Jpn J. Biochem. 64; (8) Abst. 2367 (1992); Derwent NCE-93-0956 (1993); Derwent NCE-93-0971 (1993); J. Med. Chem. 36,173 (1993); EP 518299-A2. Vorzugsweise findet Phosphoramidon Verwendung. Stimuliert werden die Zellen in Kultur durch Zugabe dieser Inhibitoren zum Zellkulturmedium für 6 Stunden bis zu 6 Tagen. Vorzugsweise wird die Stimulierung jedoch über 2-3 Tage durchge­ führt. Die angewandten Inhibitorkonzentrationen betragen 10^-2 M bis 10^-7 M, vorzugsweise 10^-3 M bis 10^-4 M.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme ist jedoch auch auf gentechnischem Weg möglich. Aufgrund der be­ schriebenen Aminosäurepartialsequenzen lassen sich synthetische Oligonukleotide, die diese Sequenzen codieren oder komplementär zu dafür codierenden Sequenzen sind, herstellen. Diese Oligonu­ kleotide können als Hybridisierungsprobe zur Isolierung der ent­ sprechenden Gene oder der cDNA-Moleküle aus Genpools wie Genban­ ken oder cDNA-Pools verwendet werden. Diese Art der Genisolierung ist dem Fachmann aus Lehrbüchern der Molekularbiologie wie Sam­ brook, Fritsch, Maniatis; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, USA bekannt.

Mit Hilfe geeigneter synthetischer Oligonukleotide und der Poly­ merase-Chain-Reaction (PCR) können ebenfalls Teile des Gens bei­ spielsweise aus cDNA-Banken oder Erststrang cDNA erhalten werden (PCR-Protocols; Academic Press; San Diego; USA; 1990). Oligonu­ kleotide, die hierfür geeignet sind, lassen sich aus den unter Seq ID No. 1 bis No. 5 beschriebenen Peptiden herleiten durch Übersetzen der Aminosäuresequenz in die doppelsträngige DNA-Se­ quenz (mit sense und antisense). Hierbei können aufgrund des de­ generierten genetischen Codes entweder degenerierte Oligonukleo­ tidgemische aus einem Peptid abgeleitet werden und als Primer Verwendung finden. Die Oligonukleotide können aus den Peptiden auch unter Berücksichtigung der sogenannten "codon usage"; des preferentiellen Gebrauchs in einer Spezies- in diesem Fall Rind, von bestimmten Nukleotid-Tripletts für eine Aminosäure, abgelei­ tet werden. Die PCR wird dann mit zwei verschiedenen Oligonukleo­ tiden als Primern durchgeführt, wobei die für die PCR notwendigen zwei Primer sich aus Strang (sense) und Gegenstrang (antisense) der Oligonukleotide zusammensetzen können. Ebenso Verwendung fin­ den können Oligonukleotide, die von Teilen des cDNA-Vektors her­ geleitet sind, oder Oligo-dT für den 3′Teil von RNA. Diese Genteile können dann wiederum eingesetzt werden, um mit dem Verfahren der Genisolierung das komplette Gen oder die vollstän­ dige cDNA zu erhalten.

Auf diese Art lassen sich nicht nur Gene für die Endothelinkon­ versionsenzyme, die exakt die in SEQ ID NO: 1 beschriebene Amino­ säurepartialsequenz besitzen, isolieren, sondern auch Gene für Varianten bzw. Endothelinkonversionsenzyme aus anderen Organis­ men, beispielsweise dem Menschen, die mindestens 80% Homologie auf der Proteinebene zu SEQ ID NO: 1 aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme lassen sich be­ sonders gut herstellen, indem man die entsprechenden Gene iso­ liert und diese Gene in einem Wirtsorganismus mit üblichen gen­ technischen Methoden exprimiert.

Die erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme können verwendet werden zur Herstellung von Antikörpern, die beispiels­ weise zur Bestimmung von ECE oder in Testverfahren zur Identifi­ zierung von ECE-Hemmern eingesetzt werden können.

Mit Hilfe der erhaltenen Gene können in einer dem Fachmann be­ kannten Art und Weise Tiere in ihrem Gengut so verändert werden, daß sie ein oder mehrere Extrakopien dieses Gens erhalten oder daß das normale ECE-Gen ausgeschaltet wird. Diese transgenen Tiere eignen sich u. a. für Versuchszwecke.

Bevorzugt finden die Endothelinkonversionsenzyme in Testverfahren zur Identifizierung von ECE-Hemmstoffen Verwendung. Diese Test­ verfahren sind in der Regel enzymatische Reaktionen, bei denen die ECE-katalysierte Umsetzung eines Endothelinvorläufers zu einem Endothelin in Gegenwart von potentiellen Hemmstoffen gemes­ sen wird.

Beispiel 1 Stimulation des ECE-1 in primären Rinderendothelzellen FBHE durch Phosphoramidon.

3 Röhrchen mit eingefrorenen FBHE-Rinderendothelzellen (ATCC CRL 1395) wurden in der 14. Passage aufgetaut und in 3 T175-Zellkul­ turflaschen (Fa. Sarstedt) mit je 40 ml Wachstumsmedium DMEM (Gibco Nr. 041-01965)
+ 5 ml/500 ml Glutamin (200 mM; Gibco 043-05030)
+ 1 ml/500 ml Gentamycin (Gibco 043-05750)
+ Non-Essentielle Aminosäuren; Endkonzentration: 1 × (Gibco Nr. 043-01140)
+ 10% FCS (Gibco Nr. 011-06290; inaktiviert für 37 Minuten bei 56°C) + 25 ng/ml Basischer FGF (Intergen 4125-80))
gegeben. Diese Zellen wurden nach Standardverfahren bei 37°C; in einer Atmosphäre aus 7% CO₂; 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am darauffolgenden Tag erfolgte ein Mediumswechsel. Bei Erreichen der Konfluenz - in diesem Fall nach 4 Tagen - wurden die Zellen nach Standardverfahren durch Trypsinbehandlung passagiert und in 9 T-175-Flaschen aufgeteilt und zum Wachstum bei 37°C wie be­ schrieben inkubiert. Nach 3 Tagen und Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen erneut nach Standardverfahren durch Trypsinbe­ handlung aufgeteilt auf 20 T-Flaschen. Nach weiteren 3 Tagen konnten die Zellen auf 40 T-Flaschen aufgeteilt werden. Nach wei­ teren 3 Tagen wurden 39 dieser T-Flaschen auf 78 T-Flaschen auf­ geteilt. Da diese 78 T-Flaschen zur Ernte der Zellen verwendet werden, werden hierfür geeignete Zellkulturflaschen (Fa. Costar; Accell; Nr. 3155) benutzt. Am Tag nach dem Beimpfen dieser T-Flaschen wurden 68 Flaschen mit Phosphoramidon (Fa. Peptide In­ stitute; Nr. 4082; abgekürzt als PHAM) in einer Endkonzentration von 10^-4M versetzt (+ PHAM). Diese Behandlung führt zur Induktion der ECE-Aktivität. Die restlichen 10 T-Flaschen wurden als nicht induzierte Kontrollzellen mitgeführt (-PHAM). Nach weiteren 2 Tagen Inkubation unter den beschriebenen Bedingungen wurden die PHAM-induzierten Zellen und die Kontrollzellen (-PHAM) getrennt geerntet. Hierzu wurden die Flaschen geöffnet und das Medium ab­ gekippt. Die Zellen wurden in der T-Flasche mit je 10 ml BPS (Boehringer Mannheim Nr. 210331) gewaschen (d. h. über Zellrasen vorsichtig geschwenkt). Das PBS wurde abgekippt. Erneut wurden 5 ml PBS pro T-Flasche gegeben. Die Zellen wurden mit einem Cell- Scraper (Fa. Costar Nr. 3010) vom Boden der Kulturflasche ge­ kratzt und als Zellsuspension in ein 150 ml Zentrifugenröhrchen (Falcon Nr. 2076) überführt, wo sie auf Eis aufbewahrt wurden. Jede T-Flasche wurde mit 10 ml PBS nachgespült. Die Zellsuspen­ sion aus dem Nachspülen wurde mit der vorhandenen Zellsuspension in den Zentrifugenröhrchen vereinigt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (1200 RPM; 10 Minuten; Heraeus Christ Minifuge GL Nr. 4400; Rotor 2150) sedimentiert. Der zellfreie Überstand wurde verworfen und das Pellet im 3-fachen Volumen PBS des Zellsedimen­ tes aufgenommen. Nach erneutem Zentrifugieren wurde der zellfreie Überstand erneut verworfen. Das Pellet blieb bis zur Aufarbeitung auf Eis.

Beispiel 2 Vergleichende Anreicherung von nicht stimulierten und mit Phosphoramiden stimulierten Rinderendothelzellen, FBHE; Identifizie­ rung des Proteins

Die nach Beispiel 1 erhaltenen FBHE-Zellen mit und ohne Phospho­ ramidon-Induktion (jeweils 500 µl Feuchtmasse) wurden in 15 ml PBS-Puffer, 0,5 mM Diisopropylfluorophosphat 20 Minuten im Eisbad mit Ultraschall behandelt. Nach Zentrifugation (20 Min. 1000 g) werden die Membranen durch Zugabe von 5% Pluriol F68® zum Über­ stand gefällt und durch erneute Zentrifugation bei 10 000 g ge­ wonnen. Die Membranen werden mit 2 ml 100 mM Tris-Puffer, pH 8,0 digeriert und mit 1% Triton X-100® solubilisiert. Die Solubili­ sate (jeweils 2,5 ml) wurden zentrifugiert, die Rückstände ver­ worfen.

Mono-Q®-Chromatographie

Die Solubilisate der +/--Phosphoramidon-induzierten Zellen wur­ den getrennt auf eine Mono-Q®-HR 5/5-Säule (Fa. Pharmacia) unter exakt gleichen Bedingungen chromatographiert. Die Säule wird mit 50 ml Tris-Puffer, pH 8,0, 0,1% Triton X-100 (A-Puffer) äquili­ briert. Nach Auftrag des Solubilisates wird 15 Min. mit A-Puffer gewaschen und ein 50 Min-Gradient linear mit B-Puffer (A-Puffer + 1 M NaCl gefahren (Fluß 0,2 ml/min). 20 Fraktionen a 0,5 ml wer­ den gesammelt und mit Human Big Et-1 als Substrat getestet. Das gebildete Et-1 wird mittels Reversed-Phase-HPLC in beschriebener Weise (Beispiel 3) nachgewiesen und quantifiziert. Die beiden Fraktionen mit der höchsten Enzymaktivität werden jeweils verein­ igt.

Superose-12®-Gelchromatographie

Die Eluate aus den Mono-Q®-Chromatographien werden mittels Cen­ tricon®-Röhrchen (Fa. Amicon) auf 250 µl konzentriert und je­ weils über eine Superose 12 HR10/36 gelchromatographiert.

Bedingungen
Puffer:
20 mM Natriumphosphat,
	250 mM NaCl, pH 7,4,
	0,05% Triton × 100
Fluß:	0,5 ml/min
Fraktion:	0,5 ml

Nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Test werden die Fraktionen getestet und die jeweils 2 Fraktionen mit der höchsten Enzymakti­ vität vereinigt.

Proteinbestimmungen aller Fraktionen erfolgten nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. 72, 248 (1976)).

Ergebnisse

Die Reinigung von stimulierten und unstimulierten Zellen ergab folgende Ergebnisse auf den verschiedenen Stufen der Reinigung:

Die beiden aktiven Fraktionen der Superose-12®-Chromatographie wurden vergleichend auf ein 8%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen. Das Gelmuster von gereinigtem ECE-1 aus Phosphoramidon behandel­ ten Zellen zeigt im Vergleich zu den nicht behandelten Zellen eine zusätzliche Bande bei 250 000 Dalton. Trägt man die Proteine mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) auf, so zeigt sich im Vergleich eine zusätzliche Bande bei 125 000 Dalton.

Beispiel 3 ECE-1-Aktivitätstest mittels HPLC Umsatz von Big-Endothelin-1 zu Endothelin-1 mittels des Endothe­ lin-Konversionsenzyms (ECE-1)

1 µl Enzymlösung, erhalten nach Beispiel 4, wurde mit 21 µl 50 mM Tris, 50 mM Imidazol, 250 mM NaCl, pH 7,4 Puffer und 2,5 µl huma­ nem Big-Endothelin (2 mg/ml in 0,1% Essigsäure in Wasser) ver­ setzt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktion zwecks Analyse des ge­ bildeten Endothelins mit 72 µl 0,5% Trifluoressigsäure abge­ stoppt. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand durch Analyse mittels Reversed Phase-Hochdruckflüssigkeitschromatogra­ phie (RP-HPLC), wie in (J. Takada et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, 860 (1991), K. Ohnaka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 168, 1128 (1990)) beschrieben, identifiziert und durch Ver­ gleich mit einem Endothelin-Standard mittels UV-Detektion (205 nm) quantifiziert.

Die Enzymaktivität läßt sich dann berechnen in Aktivität

Nach diesem Verfahren wurde die ECE-Aktivität der Aufarbeitung von FBHE-Zellen zu verschiedenen Stufen der Reinigung bestimmt. Gleichzeitig wurden die Proteinmengen nach der Methode von Brad­ ford (Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) bestimmt.

Beispiel 4 Reinigung von ECE-1 aus Rinderendothelzellen, FBHE a) Membrangewinnung, Trypsinisierung von Fremdprotein

6 ml FBHE-Zellpellet (nach Beispiel 1) werden in 25 ml PBS- Puffer digeriert und 15 Minuten im Ultraschallbad unter Eis­ kühlung aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Abzen­ trifugation bei 10 000 g, 20 Min., entfernt. Der Überstand wurde unter Rühren mit 3,6 mg Trypsin versetzt und 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Probe wurde 1 h bei 100 000 g zentrifugiert und die im Rückstand befindlichen Membranen mit 25 ml 100 mM Tris-Puffer, pH 8,0 suspendiert.

b) Solubilisierung von ECE-1

Die 25 ml Membransuspension wurden auf 0,5 mM Diisopropylflu­ orphosphat und anschließend 0,5% Triton X-100® eingestellt und über Nacht im Eisbad aufbewahrt.

c) Mono-Q®-Chromatographie

Eine Mono-Q®-FPLC-Säule, HR16/10, Fa. Pharmacia wurde mit 50 mM Tris-Puffer, pH 8,0; 0,05% Triton X-100® (A-Puf­ fer) äquilibriert.

Nach Auftrag des Solubilisates wurde 30 Min. mit A-Puffer ge­ waschen und danach mit einem linearen Gradienten innerhalb 100 Minuten nach Puffer B (Puffer A + 1 m NaCl) eluiert. Es werden 30 Fraktionen je 10 ml gesammelt. Der Proteingehalt der Proben wird nach der Bradford-Methode, die ECE-1 Aktivität nach Beispiel 3 bestimmt.

Die beiden Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität wurden vereinigt.

d) Gelfiltration

Die vereinigten Mono-Q®-Eluate nach 4c) wurden über eine 30 KDa-Centricon-Membran (Fa. Amicon) auf 500 µl konzentriert.

Eine Superose-12®, HR 10/30-Säule (Fa. Pharmacia) wird mit 20 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4, 250 mM NaCl, 0,05% Triton X 100 äquilibriert und die konzentrierte Probe aufgetragen. Bei einem Fluß von 0,5 ml wird mit dem Äquilibrierungspuffer chromatographiert und 0,5 ml-Fraktionen gesammelt.

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der Fraktionen er­ folgt wie in 4c). Die Fraktion mit der höchsten spezifischen Aktivität ist unter e) angegeben; sie eluiert bei ca. 250 000
Dalton, geeicht an Standardproteinen unter gleichen Chromato­ graphiebedingungen.

e) Ergebnisse

Beispiel 5 SDS-Gel-Analyse von gereinigtem ECE-1 aus FBHE-Zellen

Das nach Beispiel 4 gereinigte ECE-1 wird auf einem 8%igen SDS- Gel nach Lämmli (Nature 227, 680 (1979)) unter nicht reduzieren­ den und reduzierenden Bedingungen (+DTT) analysiert. ECE-1 hat danach im nicht reduzierten Zustand ein Molekulargewicht von 250 000 Dalton und zerfällt nach Reduktion in eine breite Bande um 125 000 Dalton.

Beispiel 6 Deglykosylierung von ECE-1

50 µl der nach Beispiel 4 gereinigten ECE-1-Lösung wurden mit 10%iger SDS-Lösung auf 0,25%-SDS-Gehalt eingestellt. Die Proben wurden 20 Min. bei Raumtemperatur inkubiert und auf 1% Triton X-100 eingestellt. Nach 20 Min. bei RT wurden 5 µl 250 mM Na- Phosphatpuffer, pH 4,7 zugegeben. Danach wurden 0,25 µl PNGase und 0,5 µg Endo F zugegeben. Die Proben wurden 8 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die gleichen Enzymmengen erneut zugegeben und 8 weitere Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Proben auf 50 µl einkonzentriert und im 4-12%igen SDS Gel analysiert.

Ergebnisse

Im reduzierten Zustand verändert sich das apparente Molekularge­ wicht von 125 000 Dalton durch Abspaltung der Zuckerreste mit der Mischung von PNGase F/Endo F auf ca. 82 000 Dalton.

Beispiel 7 Partialsequenzen des ECE-1 aus Rinderendothelzellen

16 × 25 µg der nach Beispiel 4 erhaltenen ECE-1-Lösung wurden in 4-12%igen SDS-Polyacrylamid-Gradientengelen präparativ aufgetra­ gen. Nach üblicher Färbung mit Coomassie blue wird das Gel ent­ färbt und 4 × 40 Minuten in reinem Wasser gewässert. Die bei 250 KDa gefärbten Banden wurden mit einem Skalpell ausgeschnitten und mit 200 µl 100 mM NH₄HCO₃-Lösung digeriert. Nach Zugabe von 0,5 µg Trypsin wird über Nacht inkubiert, der Überstand danach abgenom­ men. Der Rückstand wird erneut mit 0,5 µg Trypsin 5 h bei Raumtem­ peratur in 200 µl 100 mM NH₄HCO₃-Puffer inkubiert. Danach wird die Probe im speed-vac-Konzentrator zur Trockene eingeengt. Der Rück­ stand wird mit 40 µl Wasser aufgenommen und mit 4 µl 40 mM Di­ thiothreitol-Lösung 30 Min. gerührt. Danach wurden bei 37°C 4 µl 100 mM Jodacetamid-Lösung zugegeben. Nach 2 Stunden wird die Probe zur Trockne eingeengt.

Die entstandenen Peptide wurden über eine 1 mm x 15 cm Reversed- Phase-HPLC-Säule in einem linearen 3-Stunden-Gradienten von 0,5% Trifluoressigsäure in Wasser nach 0,5% Trifluoressigsäure in 90% Acetonitril aufgetrennt. UV-aktive Fraktionen wurden gesammelt und die Primärsequenzen auf einem Gasphasen-Sequenzer bestimmt.

Ergebnisse:

Folgende Partialsequenzen wurden bestimmt:

SEQ ID NO: 1:
Xaa-Xaa-Pro-Asn-Ala-Leu-Asn-Phe-Gly-Gly-Ile-Gly-Val- Val-Val-Gly-His-Glu-Leu-Thr-His-Ala-Phe . . .

SEQ ID NO: 2:
Xaa-Tyr-Xaa-Lys-Xaa-Gly-Asn-Leu-Arg-Pro

SEQ ID NO: 3:
Xaa-Ile-Ala-Xaa-Glu-Thr-Gl-Leu-Glu-Ile . . . (Ile) (Ile)

SEQ ID NO: 4:
Xaa-Pro-Glu-Phe-Leu-Leu-Glu-Gly-Leu-Ile-Thr-Asp-Pro . . .

SEQ ID NO: 5:
Xaa-(Gln)-(Ala)-(Glu)-Asn-Val-Ile-Gln-Val-Xaa-Gln . . .

SEQ ID NO: 6:
Val-Glu-Ile-Val-Phe-Pro-Ala-Gly-Ile-Leu-Gln-Ala-Pro-(Phe)-Tyr-Thr (Thr).

Die in Klammern angegebenen Aminosäuren wurden nicht absolut sicher identifiziert.

SEQ ID NO: 1 belegt, daß es sich beim ECE-1 um ein neues Protein aus der Familie der Metalloproteasen handelt da es im Vergleich mit Sequenzen der Metallendopeptidasen NEP 24.11 und Thermolysin signifikante Homologien von 72% bzw. 40% aufweist.

SEQUENZ PROTOKOLL (1) ALLGEMEINE INFORMATION

• (i) ANMELDER:
  • (A) NAME: BASF Aktiengesellschaft
  • (B) STRASSE: Carl-Bosch-Straße 38
  • (C) ORT: Ludwigshafen
  • (E) LAND: Bundesrepublik Deutschland
  • (F) POSTLEITZAHL: D-67056
  • (G) TELEPHON: 0621/6048526
  • (H) TELEFAX: 0621/6043123
  • (I) TELEX: 1762175170
• (ii) ANMELDETITEL: Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1)
• (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6
• (iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
  • (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC compatible
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1

• (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2

• (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 3

• (i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
• (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
  • (B) LAGE: 7
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Xaa=Glu oder Ile"
• (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
  • (B) LAGE: 8
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Xaa=Leu oder Ile"
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 4

• (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 5

• (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 6

• (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: Einzel
  • (D) TOPOLOGIE: linear
• (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
• (iii) HYPOTHETISCH: NEIN
• (iii) ANTISENSE: NEIN
• (v) ART DES FRAGMENTS: inneres
• (ix) MERKMALE:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: Modified-site
  • (B) LAGE: 7
  • (D) SONSTIGE ANGABEN: /note= "Xaa=Ala oder Thr"
• (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

Claims (6)

1. Endothelinkonversionsenzym, gekennzeichnet durch ein Moleku­ largewicht von 250 000 Dalton und eine Aminosäurepartialse­ quenz, die mindestens 80% Homologie zu SEQ ID NO:1 aufweist.

2. Verfahren zur Herstellung von Endothelinkonversionsenzym ge­ mäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Säugerzellen mit einem Inhibitor des Endothelinkonversionsenzyms zur Endothe­ linkonversionsenzym-Überproduktion stimuliert werden und aus diesen Zellen Endothelinkonversionsenzym mit üblichen pro­ teinchemischen Maßnahmen isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Inhibitor Phosphoramidon verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Endothelzelle die Rinderzellinie FBHE verwendet wird.

5. Verfahren zur Herstellung von Endothelinkonversionsenzym ge­ mäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein für die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Aminosäuresequenz codierendes Oligo­ nukleotid als Hybridisierungsprobe verwendet wird, um ein Gen für ein Endothelinkonversionsenzym aus einem Genpool zu iso­ lieren und dieses Gen mit üblichen gentechnischen Methoden in einem Wirtsorganismus exprimiert wird.

6. Verwendung von Endothelinkonversionsenzym gemäß Anspruch 1 in Testverfahren zur Identifizierung von Hemmstoffen des Endo­ thelinkonversionsenzym.