DE69432795T2 - Porphyromonas gingivalis arginin-spezifische proteinase kodierende sequenzen - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung wurde zumindest teilweise mit Finanzierung von den "National Institutes of Health" gemacht (Grant Nos. DE 09761 , HL 26148 und HL 37090). Entsprechend kann das United States Government gewisse Rechte an dieser Erfindung haben.
  • Gebiet der Erfindung
  • Das Gebiet dieser Erfindung ist bakterielle Proteasen, spezieller diese von Phorphyromonas gingivalis, insbesondere die Arginin-spezifische Protease, die hierin Arg-Gingipain genannt wird, und die Nukleotidsequenz, die dieselbe kodiert.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Phorphyromonas gingivalis (früher Bacteroides gingivalis) ist ein zwangsläufig anaerobes Bakterium, welches mit periodontaler Krankheit in Zusammenhang gebracht wird. P. gingivalis produziert proteolytische Enzyme in relativ großen Mengen; diese Proteinasen sind als wichtige virulente Faktoren bekannt. Eine Anzahl von physiologisch bedeutsamen Proteinen, einschließlich Kollagen, Fibronectin, Immunoglobulinen, Komplement-Faktoren C3, C4, C5 und B, Lysozym, Eisen-bindende Proteine, Plasma-Proteinase-Inhibitoren, Fibrin und Fibrinogen, und Schlüsselfaktoren des Plasmagerinnungskaskadensystems, werden durch Proteinasen von diesem Mikroorganismus hydrolisiert. Eine derartig breite proteolytische Aktivität kann eine Hauptrolle bei der Umgehung von Wirtsverteidigungsmechanismen und der Zerstörung von gingivalem Bindegewebe, verbunden mit fortschreitender Periodontitis, spielen (Saglie et al. (1988) J. Periodontol. 59, 259–265).
  • Es gibt widersprüchliche Daten bezüglich der Anzahl und Arten von durch P. gingivalis hergestellten Proteinasen. In der Vergangenheit wurden proteolytische Aktivitäten von P. gingivalis in zwei Gruppen klassifiziert; diese Enzyme, welche spezifisch Kollagen zersetzten, und die allgemeinen "Trypsin-ähnlichen" Proteinasen, welche für andere proteolytische Aktivität verantwortlich zu sein schienen. Trypsin (und "Trypsin-ähnliche" Proteasen) spaltet nach Arginin oder Lysin in den Substraten (siehe, z. B. Lehninger A. L. (1982), Principles of Biochemistry, Worth Publishing, Inc., New York). Obwohl viele Versuche gemacht worden sind, um eine dieser "Trypsin-ähnlichen" Proteinasen zu isolieren, berichteten Chen et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 18896–18901 die erste strikte Reinigung und biochemische und enzymologische Charakterisierung für eine Argininspezifische P. gingivalis Protease.
  • Diese Anmeldung berichtet von der Reinigung von 50 kDa und Hochmolekulargewicht-"Trypsin-ähnlichen-", Thiol-aktivierten-Proteinasen von P. gingivalis und den Nukleotidsequenzen, die dieselben kodieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Nukleotidsequenz bereitzustellen, die ein Niedermolekulargewicht Arg-Gingipain kodiert, welches hierin Arg-Gingipain-1 (oder Gingipain-1) genannt wird, wobei das Gingipain-1 ein scheinbares Molekulargewicht von 50 kDa hat, wie durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese geschätzt, und ein scheinba res Molekulargewicht von 44 kDa hat, wie durch Gelfiltrationschromatographie geschätzt, wobei das Gingipain-1 amidolytische und proteolytische Aktivität für die Spaltung nach Argininresten hat und keine amidolytische und/oder proteolytische Aktivität für die Spaltung nach Lysinresten hat, wobei die amidolytische und/oder proteolytische Aktivität durch Cysteinprotease-gruppenspezifische Inhibitoren inhibiert wird, einschließlich Jodacetamid, Jodessigsäure, N-Ethylmaleinimid, Leupeptin, Antipain, trans-Epoxysuccinyl-L-Leucylamido-(4-guanidin)butan, TLCK, TPCK, p-Aminobenzamidin, N-Chlorsuccinamid, und chelatisierende Mittel, einschließlich EDTA und EGTA, wobei die amidolytische und/oder proteolytische Aktivität des Gingipain-1 nicht empfindlich gegen Inhibierung durch menschliches Cystatin C, α2-Makroglobulin, α1-Proteinaseinhibitor, Antithrombin III, α2-Antiplasmin, Serinprotease-gruppenspezifische Inhibitoren, einschließlich Diisopropylfluorphosphat, Phenylmethylsulfonylfluorid und 3,4-Diisochlorcoumarin, und wobei die amidolytischen und/oder proteolytischen Aktivitäten von Gingipain-1 durch Ca2+ stabilisiert werden und wobei die amidolytischen und/oder proteolytischen Aktivitäten von Gingipain-1 durch Glycin-enthaltende Peptide und Glycinanaloge stimuliert werden. In einem besonders beispielhaften Gingipain-l-Protein ist das Protein charakterisiert durch eine N-terminale Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 1 Tyr-Thr-Pro-Val-Glu-Glu-Lys-Gln-Asn-Gly-Arg-Met-Ile-Val-Ile-val-Ala-Lys-Lys-Tyr-Glu-Gly-Asp-Ile-Lys-Asp-Phe-Val-Asp-Trp-Lys-Asn-Gln-Arg-Gly-Leu-Thr-Lys-Xaa-Val-Lys-Xaa-Ala und durch eine Cterminale Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 6 (Glu-Leu-Leu-Arg).
  • Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist eine Nukleotidsequenz, die eine Hochmolekulargewichts-Form von Arg-Gingipain kodiert, die hierin Arg-Gingipain-2 genannt wird, welche eine proteolytische Komponente, wie sie im wesentlichen im obigen beschrieben wird, und wenigstens eine Hämagglutinin-Komponente umfaßt.
  • Wie speziell als Beispiel angegeben, wird der kodierte Arg-Gingipain-Hämagglutinin-Komplex als ein Präpolyprotein mit der in SEQ ID NO: 11 angegebenen Aminosäuresequenz von Aminosäure 1–1704 transkribiert. Das kodierte reife Hochmolekulargewicht-Arg-Gingipain-Protein hat eine Proteasekomponente mit einer komplett hergeleiteten Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 11 von Aminosäure 228 bis Aminosäure 719. Eine Aminosäuresequenz einer alternativen Proteasekomponente ist in SEQ ID NO: 4 angegeben, Aminosäuren 1–510. Arg-Gingipain-2 umfaßt weiterhin mindestens eine Hämagglutinin-Komponente. Die Hämagglutinin-Komponenten, welche mit der 50 kDa Arg spezifischen proteolytischen Komponente assoziiert gefunden werden, sind 44 kDa, 27 kDa und 17 kDa und haben Aminosäuresequenzen, wie angegeben in SEQ ID NO: 11, von 720 bis 1091, von 1092 bis 1429 bzw. von 1430 bis 1704.
  • Es ist eine zusätzliche Aufgabe der Erfindung, Nukleinsäuremoleküle für die rekombinante Herstellung eines Arg-Gingipains bereitzustellen. Im wesentlichen reines rekombinantes Arg-Gingipain-l-Protein kann nach Expression der Arg-Gingipainkodierenden Nukleotidsequenzen in einer heterologen Wirtszelle unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren hergestellt werden. Das im wesentlichen reine Arg-Gingipain-1 zeigt amidolytische und/oder proteolytische Aktivität mit Spezifität für Abspaltung nach Arginin, aber zeigt keine amidolytische und/oder proteolytische Aktivität mit Spezifität für Spaltung nach Lysinresten. Das hierin beispielhaft angegebene Reinigungsverfahren umfaßt die Schritte: Fällen von extrazellulärem Protein aus zellfreiem Kulturüberstand von Porphyromo nas gingivalis mit Ammoniumsulfat (90% w/v Sättigung), Fraktionieren des gefällten Proteins durch Gelfiltration, weiteres Fraktionieren durch Anionenaustauschchromatographie von diesen Proteinen in den Fraktionen der Gelfiltration mit der höchsten spezifischen Aktivität für amidolytische Aktivität, wie gemessen mit Benzoyl-L-Arginyl-p-nitroanilid, und Sammeln dieser Proteine, welche nicht an die Anionenaustauschsäule gebunden wurden, und Fraktionieren dieser Proteine durch FPLC über eine Kationenaustauschsäule (MonoS HR5/5, Pharmacia, Piscataway, NJ) und schließlich Trennen des Gingipain-1 von Lysin-spezifischen proteolytischen/amidolytischen Protein (en) durch Affinitätschromatographie über L-Arginyl-Agarose. Vorzugsweise ist das verwendete P. gingivalis vom Stamm H66, und vorzugsweise wird die Kultur bis zur frühen stationären Phase gezüchtet. Arg-Gingipain-1 kann auch von Zellen unter Verwendung von geeigneten Modifikationen der vorhergehenden Verfahren gereinigt werden (die Zellen müssen zerstört werden, z. B., durch Lyse in einer französischen Presszelle). Vorzugsweise wird der Gelfiltrationsschritt unter Verwendung von Sephadex G-150 durchgeführt, der Anionenaustauschchromatographieschritt wird unter Verwendung von Diethylaminoethyl(DEAE)-Zellulose durchgeführt, der FPLC-Schritt wird unter Verwendung von Mono S durchgeführt und die Affinitätschromatographie wird unter Verwendung von L-Arginyl-Sepharose 4B durchgeführt.
  • Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, rekombinante Polynukleotide bereitzustellen (z. B. ein rekombinantes DNA-Molekül), umfassend eine Nukleotidsequenz, die ein Arg-Gingipain-Protein kodiert, vorzugsweise mit einer Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 11 von Aminosäure 228 bis Aminosäure 719 oder mit einer Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 4, Aminosäuren 1 bis 510. Wie speziell hierin als Beispiel angegeben, wird die Nukleotidsequenz, die eine reife Arg-Gingipain-Protease kodiert, in SEQ ID NO: 10 angegeben, Nukleotide 1630 bis 3105, oder SEQ ID NO: 3 von Nukleotiden 1630 bis 3105. Der Fachmann wird verstehen, daß die Aminosäuresequenz des als Beispiel angegebenen Gingipain-Proteins verwendet werden kann, um weitere, nicht als Beispiel angegebene Nukleotidsequenzen zu identifizieren und zu isolieren, welche ein funktionelles Protein mit derselben Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 4 von Aminosäure 1 bis Aminosäure 510 angegeben, oder eine Aminosäuresequenz von mehr als 90% Identität mit äquivalenter biologischer Aktivität kodieren wird. Der Fachmann versteht, daß es wünschenswert sein kann, das Arg-Gingipain als ein sekretiertes Protein zu exprimieren; gegebenenfalls weiß er, wie die als Beispiel angegebene kodierende Sequenz für das "reife" Gingipain-2 durch Hinzufügen einer Nukleotidsequenz zu modifizieren ist, welche ein Signalpeptid kodiert, das für den Wirt, in welchem die Sequenz exprimiert wird, geeignet ist. Wenn es gewünscht ist, daß die ein Arg-Gingipain-Protein kodierende Sequenz exprimiert wird, dann wird der Fachmann Transkriptions- und Translationskontroll-Regulationssequenzen mit den kodierenden Sequenzen operativ verbinden, wobei die Auswahl der Regulationssequenzen durch den Wirt, in welchem die kodierende Sequenz exprimiert werden soll, bestimmt wird. Im Bezug auf ein rekombinantes DNA Molekül, das eine Arg-Gingipain-kodierende Sequenz trägt, wird der Fachmann einen Vektor auswählen (wie z. B. ein Plasmid oder einen viralen Vektor), welcher in die Wirtszelle eingeführt werden kann und sich darin replizieren kann. Die Wirtszelle kann ein Bakterium, vorzugsweise Escherichia coli, oder eine Hefe oder eine Säugerzelle sein.
  • Ebenfalls wird ein spezifisches Beispiel einer ein Arg-Gingipain-kodierenden Nukleotidsequenz bereitgestellt, einschließlich Niedermolekulargewicht-Gingipain-l-Protease-Kom ponente und der Protease-Komponente von Hochmolekulargewicht-Gingipain und seinen assoziierten Hämagglutinin-Komponenten. Diese Komponenten werden aus einem Präpolyprotein prozessiert. Wie speziell als Beispiel angegeben, kodiert die kodierende Sequenz von Nukleotid 949 bis Nukleotid 6063 in SEQ ID NO:10, einschließlich des Stopkodons, ein Präpolyprotein mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 11 angegeben. Das Präpolyprotein wird kodiert durch eine Nukleotidsequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 10 von Nukleotid 949 bis 6063. Das reife Proteasemolekül wird durch Nukleotide 1630 bis 3105 in SEQ ID NO: 10 kodiert. Die reife Arg-spezifische proteolytische Komponente besitzt eine Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 11 von 228–719, und die Hämagglutinin-Komponente besitzt eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 11 von 720–1091, von 1092 bis 1429 oder von 1430 bis 1704.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden rekombinante Polynukleotide bereitgestellt, welche Arg-Gingipain kodieren, einschließlich, z. B. Proteinfusionen oder Deletionen, sowie Expressionssysteme. Expressionssysteme sind definiert als Polynukleotide, welche eine Proteinase exprimieren können, wenn sie in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden. Die rekombinanten Polynukleotide besitzen eine Nukleotidsequenz, welche im wesentlichen ähnlich ist zu einem natürlichen Arg-Gingipain-kodierenden Polynukleotid oder einem Fragment desselben.
  • Die Polynukleotide umfassen RNA, cDNA, genomische DNA, synthetische Formen, und gemischte Polymere, sowohl kodierende als auch nicht-kodierende Stränge, und können chemisch oder biochemisch modifiziert sein oder nicht-natürliche oder derivatisierte Nukleotidbasen enthalten. DNA ist bevorzugt. Rekombinante Polynukleotide, die anderenfalls nicht-natürlich vorkommende Sequenzen umfassen, werden auch durch diese Erfindung bereitgestellt, wie auch Veränderungen einer Wildtyp-Proteinasesequenz bereitgestellt werden, einschließend, aber nicht beschränkt auf Deletion, Insertion, Substitution von einem oder mehreren Nukleotiden oder durch Fusion zu anderen Polynukleotidsequenzen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch Fusionspolypeptide bereit, die ein Arg-Gingipain umfassen. Homologe Polypeptide können Fusionen zwischen zwei oder mehr Proteinasesequenzen oder zwischen den Sequenzen einer Proteinase und einem verwandten Protein sein. Gleichfalls können heterologe Fusionen konstruiert werden, welche eine Kombination von Eigenschaften oder Aktivitäten der Proteine, von denen sie abstammen, zeigen würden. Fusionspartner umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Immunoglobine, Ubiquitin-bakterielle β-Galactosidase, trpE, Protein A, β-Lactamase, alpha-Amylase, Alkoholdehydrogenase und Hefe-alpha-Paarungsfaktor, (Godowski et al. (1988) Science, 241, 812–816). Fusionsproteine werden typischerweise durch rekombinante Verfahren gemacht werden, können aber auch chemisch synthetisiert werden.
  • Zusammensetzungen und immunogene Präparationen werden bereitgestellt, umfassend, aber nicht beschränkt auf Vakzine, umfassend rekombinantes, von P. gingivalis abstammendes Arg-Gingipain und einen dafür geeigneten Träger. Derartige Vakzine sind geeignet, z. B., zum Immunisieren eines Tieres, einschließlich Menschen, gegen entzündliche Reaktion und Gewebeschaden, ausgelöst durch P. gingivalis bei einer periodontalen Krankheit. Die Vakzinpräparationen umfassen eine immunogene Menge einer Proteinase oder ein immunogenes Fragment oder eine Untereinheit davon. Derartige Vakzine können eine oder mehrere Arg-Gingipain-Proteinasen umfassen, oder ein Arg-Gingipain in Kom bination mit einem anderen Protein oder einem anderen Immunogen. Mit "immunogene Menge" ist eine Menge gemeint, die geeignet ist, die Produktion von gegen ein oder mehrere Arg-Gingipaine gerichteten Antikörpern in einem Einzelwesen, an welches die Vakzine verabreicht worden sind, hervorzurufen.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt die zusammengesetzte physikalische Genkarte eines Arg-Gingipain-Locus. Das erste Kodon der proteolytischen Komponente des reifen Arg-Gingipains ist angezeigt. Nur Hauptrestriktions-Schnittstellen, die beim Klonen benutzt werden, sind angezeigt: B, BamHI; P, PstI; S, SmaI; A, Asp 718; Pv, PvuII, HindIII. Die vier Arginin-Spaltstellen (R227, R719, R1091 und R1429) sind jeweils mit einem Stern (*) angezeigt. Die drei das aktive Zentrum formenden Reste (C412, H438 bzw. N669) sind ebenfalls gezeigt.
  • 2 ist ein Protein-Matrix-Plot, der die Analyse der Regionen mit Ähnlichkeit zwischen Hämagglutinin-Domänen unter Verwendung einer Pustell Protein Matrix von MacVector, Release 4.0, darstellt. Die vollständige Präpolyproteinsequenz (SEQ ID NO: 11) wurde als X-Achse und Y-Achse verwendet. Die genau diagonale Reihe ist die Identitätslinie, während die Struktur in dem Muster nahe dieser Diagonalen internen Wiederholungen entspricht. Die vier unterschiedlichen Domänen sind wiedergegeben (Arg-Gingipain-Protease, 44 kDa Hämagglutinin, 17 kDa Hämagglutinin und 27 kDa Hämagglutinin). Vier Bereiche mit hoher Homologie sind identifiziert. Die Haupthomologien zwischen Hämagglutinin-Domänen ist detailliert in Tabelle 4 gezeigt.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung Hierin verwendete Abkürzungen für Aminosäuren sind Standard im Stand der Technik: X oder Xaa bedeutet einen Aminosäurerest, der noch nicht identifiziert worden ist, aber irgendein Aminosäurerest sein kann, einschließlich, aber nicht eingeschränkt auf phosphoryliertes Tyrosin, Threonin oder Serin, sowie Cystein oder einen glykosylierten Aminosäurerest. Die Abkürzungen für Aminosäurereste werden hierin wie folgt verwendet: A, Ala, Alanin; V, Val, Valin; L, Leu, Leucin; I, Ile, Isoleucin; P, Pro, Prolin; F, Phe, Phenylalanin; W, Trp, Tryptophan; M, Met, Methionin; G, Gly, Glycin; S, Ser, Serin; T, Thr, Threonin; C, Cys, Cystein; Y, Tyr, Tyrosin; N, Asn, Asparagin; Q, Gln, Glutamin; D, Asp, Asparaginsäure; E, Glu, Glutaminsäure; K, Lys, Lysin; R, Arg, Arginin; und H, His, Histidin. Andere hierin verwendete Abkürzungen umfassen Bz, Benzoyl; CbZ, Carboxybenzoyl; pNA, p-Nitroanilid; MeO, Methoxy; Suc, Succinyl; OR, Ornithyl; Pip, Pipecolyl; SDS, Natriumdodecylsulfat; TLCK, Tosyl-L-Lysin-chlormethylketon; TPCK, Tosyl-L-Phenylalaninchlormethylketon; S-2238, D-Phe-Pip-Arg-pNA, 5-2222, Bz-Ile-Glu-(y-OR)-Gly-pNA; S-2288, D-Ile-Pro-Arg-pNA; S-2251, D-Val-Leu-Lys-pNA; Bis-Tris, 2-[Bis (2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol; FPLC, schnelle Proteinflüssigchromatographie; HPLC, Hochdurchsatz-Flüssigchromatographie; Tricin, N-[2-Hydroxy-l,1-bis(hydroxymethyl)ethyl]glycin; EGTA, [Ethylenbis(oxyethylennitril)tetraessigsäure; EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure; Z-L-Lys-pNa, Z-L-Lysin-p-Nitroanilid; HMW, Hochmolekulargewicht.
  • Arg-Gingipain ist die Bezeichnung, die einem P. gingivalis-Enzym mit Spezifität für proteolytische und/oder amidolytische Aktivität für die Spaltung einer Amidbindung gegeben wird, in welcher L-Arginin die Carboxylgruppe beiträgt. Die hierin beschriebenen Arg-Gingipaine haben als identifizierende Charakteristika eine Cysteinabhängigkeit, eine wie beschriebene Inhibierungsreaktion, Ca2+ -Stabilisierung und Glycinstimulierung. Besondere Formen von Arg-Gingipain werden durch ihre scheinbare molekulare "Masse" der reifen Proteine unterschieden (wie ohne Kochen vor SDS-PAGE gemessen). Arg-Ginipaine der vorliegenden Erfindung haben keine amidolytische oder proteolytische Aktivität für Amidbindungen, in welchen L-Lysin die -COOH-Hälfte beiträgt.
  • Arg-Gingipain-1 ist der Name, der hierin einem Protein gegeben wird, das dadurch charakterisiert wird, daß es eine molekulare Masse von 50 kDa, wie gemessen durch SDS-PAGE, und von 44 kDa wie gemessen durch Gelfiltration über Sephadex G-150, hat und amidolytische und/oder proteolytische Aktivität für Substrate mit L-Arg in der P1-Position hat, d. h. auf der N-terminalen Seite der zu hydrolisierenden Peptidbindung, aber keine Aktivität gegen entsprechende Lysin enthaltende Substrate hat, die von Cystein (oder anderen Thiolgruppen für volle Aktivität) abhängig sind, und Empfindlichkeit gegen Cysteinprotease-gruppenspezifische Inhibitoren hat, einschließlich Jodacetamid, Jodessigsäure, und N-Methylmaleinimid, Leupeptin, Antipain, trans-Epoxysuccinyl-L-Leucylamido-(4-guanidinobutan, TLCK, TPCK, p-Aminobenzamidin, N-Chlorsuccinamid, und chelatisierende Mittel, einschließlich EDTA und EGTA, aber resistent ist gegenüber Inhibierung durch menschliches Cystatin C, α2-Macroglobulin, α1-Proteinaseinhibitor, Antithrombin III, α2-Antiplasmin, Serinprotease-gruppenspezifische Inhibitoren, einschließlich Diisopropylfluorphosphat, Phenylmethylsulfonylfluorid und 3,4-Diisochlorcoumarin, und wobei die amidolytischen und/oder proteolytischen Aktivitäten von Gingipain-1 durch Ca2+ stabilisiert werden und wobei die amidolytischen und/oder proteolytischen Aktivitäten von Gingipain-1 durch Glycin enthaltende Peptide und Glycinanaloge stimuliert werden.
  • Ein als Beispiel angegebenes, hierin beschriebenes und Arg-Gingipain-2 genanntes Arg-Gingipain existiert in der nativen Form in einer Hochmolekularegewichtsform mit einer scheinbaren molekularen Masse von 95 kDa, wie ohne Kochen der Proben durch SDS-PAGE bestimmt. Wenn gekocht, scheint die Hochmolekulargewichts-Form in Komponenten von 50 kDa, 43 kDa, 27 kDa und 17 kDa zu zerfallen. Arg-Gingipain-2 ist der Name, der der 50 kDa enzymatisch aktiven Komponente des Hochmolekulargewichts-Komplexes gegeben wird.
  • Die vollständige Aminosäuresequenz eines als Beispiel angegebenen reifen Arg-Gingipain ist in SEQ ID No: 11 angegeben, von Aminosäure 228 bis Aminosäure 719. Eine zweite mögliche beispielhafte Aminosäuresequenz ist in SEQ ID No: 4 gegeben, Aminosäuren 1 bis 510. In der Natur werden diese Proteine durch das Archebakterium Porphyromonas gingivalis hergestellt; es kann aus Zellen oder aus Kulturüberstand oder als ein rekombinantes Expressionsprodukt unter Verwendung der hierin bereitgestellten Verfahren gereinigt werden. Ohne sich an irgendeine Theorie zu binden, wird vorgeschlagen, daß diese Sequenzen Arg-Gingipain-2 entsprechen.
  • Wie hierin mit Bezug auf Arg-Gingipain-1 verwendet, meint eine im wesentlichen reine Arg-Gingipain-Präparation, das nur eine Proteinbande nach Silberfärbung eines mit der Präparation ausgeführten SDS-Polyacrylamidgels sichtbar ist, und die einzigen amidolytischen und/oder proteolytischen Aktivitäten diese mit Spezifität für L-Arginin in der P1-Position relativ zu der gespaltenen Bindung sind. Eine im wesentlichen reine Hochmolekulargewicht-Arg-Gingipain-Präparation hat nur eine Bande (95 kDa) auf SDS-PAGE (Probe nicht gekocht) oder vier Banden (50 kDa, 43 kDa, 27 kDa, 17 kDa; Probe gekocht). Keine amidolytische oder proteolytische Aktivität für Substrate mit Lysin in der P1-Position ist offensichtlich in einer im wesentlichen reinen Hochmolekulargewichts- oder Arg-Gingipain-2-Präparation. Weiterhin ist eine im wesentlichen reine Präparation von Arg-Gingipain von Komponenten getrennt worden, mit denen es in der Natur auftritt. Im wesentlichen reines Arg-Gingipain ist im wesentlichen frei von natürlich assoziierten Komponenten, wenn es von den natürlichen Verunreinigungen getrennt ist, welche sie in ihrem natürlichen Zustand begleiten. Deshalb wird Arg-Gingipain, das chemisch synthetisiert oder rekombinant in einem zellulären System, das unterschiedlich von der Zelle ist, von der es natürlich abstammt, synthetisiert wird, im wesentlichen frei von seinen natürlichen assoziierten Komponenten sein. Techniken für die Synthese von Polypeptiden sind beschrieben, z. B. in Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149–2156.
  • Ein chemisch synthetisiertes Arg-Gingipain-Protein wird als "isoliertes" Polypeptid angesehen, wie auch ein Arg-Gingipain, das als ein Expressionsprodukt eines isolierten, Proteinasekodierenden Polynukleotids, welches Teil eines Expressionsvektors ist (z. B. eine "rekombinante Proteinase"), selbst falls es in einem homologen Zelltyp exprimiert wird.
  • Rekombinantes Arg-Gingipain-1, Arg-Gingipain-2 und HMW-Arg-Gingipain können durch die Kultur von Wirtszellen, die mit den rekombinanten Polynukleotiden, die wie hierin beschriebene Arg-Gingipain-kodierende Nukleotidsequenzen umfassen, unter für den Erhalt der Expression der Proteinase-kodierenden Sequenz geeigneten Bedingungen erhalten werden.
  • Beispiel 1, unten, und Chen et al. (1992), siehe oben, beschreiben die Reinigung von Arg-Gingipain-1 und HMW-Arg-Gingipain aus P. gingivalis-Kulturüberstand, d. h. aus einer natürlichen Quelle. Verschiedene Methoden für die Isolierung eines Arg-Gingipains aus anderem biologischen Material, wie z. B. aus nicht als Beispiel angegebenen Stämmen von P. gingi- valis oder aus Zellen, die mit derartige Proteine kodierenden rekombinanten Polynukleotiden transformiert sind, können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren erreicht werden. Verschiedene Verfahren der Proteinreinigung sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich dieser, die beschrieben werden, z. B., im Guide to Protein Purification, ed. Deutscher, Vol. 182, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.: San Diego, 1990) und Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag: New York, 1982).
  • Chromatographie über Sephadex G-150 ergab vier Peaks mit Bz-L-Arg-pNA-hydrolysierender Aktivität. In jeder dieser Fraktionen war die hydrolytische Aktivität abhängig von Cystein und wurde vielfach durch die Zugabe von Glycyl-Glycin oder Glycinamid verstärkt. Ein für Arg-Gingipain-1-spezifischer Antikörper immunopräzipitiert Proteinase von allen vier Sephadex G-150 Peaks. Ohne sich an irgendeine besondere Theorie zu binden, wird postuliert, daß das vier-Peak-Bz-L-Arg-pNA-amidolytische Profil eine aus der Bindung von Gingipain-1 an Membran- oder Nukleinsäurefragmente resultierende Anomalie ist. Alternativ können diese höheres Molekulargewichtprotein enthaltenden Peaks teilweise prozessierte Gingipain-1-Vorstufen enthalten. Obwohl die als Beispiel angegebene Reinigung von Gingipain-1 aus extrazellulärem Protein erfolgt, kann es auch aus den bakteriellen Zellen gereinigt werden.
  • Weitere Analyse (siehe Beispiel 1) der Hochmolekulargewichts-Fraktionen, die Arg-spezifische amidolytische und proteolytische Aktivität enthalten, offenbarte, daß Arg-Gingipain-2 (50 kDa) nicht-kovalent an Proteine von 44 kDa, 27 kDa und 17 kDa gebunden auftrat, welche Hämagglutinin-Aktivität haben. Die empirisch bestimmte N-terminale Aminosäuresequenz des komplexierten 44 kDa Proteins entspricht den Aminosäuren 720–736 von SEQ ID Nr: 11.
  • Arg-Gingipain-1 wurde weiter gereinigt, ausgehend von der Sephadex G-150 Peak 4-Proteinmischung durch weitere Schritte einer Anionenaustauschchromatographie über DEAE-Zellulose und zwei Läufen über MonoS FPLC. Arg-Gingipain-l-Rückgewinnung wurde bemerkenswert reduziert, falls ein Affinitätschromatographieschritt (L-Arginyl-Sepharose 4B) verwendet wurde, um Spurenmengen einer verunreinigenden Proteinase mit Spezifität für Spaltung nach Lysinresten zu entfernen.
  • Gereinigtes Arg-Gingipain-1 zeigt eine scheinbare molekulare Masse von etwa 50 kDa, wie bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese. Die durch Gelfiltration auf Superose 12 (Pharmacia, Piscataway, NJ) erhaltene Größenabschätzung ist 44 kDa. Aminoterminale Sequenzanalyse über 43 Reste ergab eine eindeutige Struktur, welche keine Homologie mit irgendeinem anderen Protein zeigte, basierend auf einem Vergleich mit der Protein NBRS-Datenbank, release 39.0. Die erhaltene Sequenz ist wie folgt: Tyr-Thr-Pro-val-Glu-Glu-Lys-Gln-Asn-Gly-Arg-Met-Ile-Val-Ile-Val-Ala-Lys-Lys-Tyr-Glu-Gly-Asp-Ile-Lys-Asp-Phe-Val-Asp-Trp-Lys-Asn-Gln-Arg-Gly-Leu-Thr-Lys-Xaa-Val-Lys-Xaa-Ala (SEQ ID Nr: 1). Die C-terminale Aminosäuresequenz des Gingipain-1 (Hauptform, erkannt in Zymographie-SDS-PAGE, 0.1% Gelatine im Gel), wurde gefunden, Glu-Leu-Leu-Arg zu sein. (SEQ ID Nr: 5).
  • Dies entspricht den Aminosäuren 716–719 in SEQ ID Nr: 4 und den Nukleotiden 3094–3105 in SEQ ID NO: 3. Dies ist konsistent mit dem Modell für eine autoproteolytische Prozessierung des Vorstufenpolyproteins, um das reife 50 kDa Gingipain-l-Protein herzustellen.
  • Ein Vergleich von SEQ ID NO: 1 mit SEQ ID NO: 4 und 11 zeigt Unterschiede bei Aminosäuren 37–38 des reifen Arg-Gingipains. Ohne sich an irgendeine Theorie zu binden, wird vorgeschlagen, daß SEQ ID NO: 3 (oder SEQ ID NO: 10) die kodierende Sequenz für Arg-Gingipain-2, die enzymatisch aktive Komponente der Hochmolekulargewichts-Form von Arg-Gingipain, umfaßt. Dies ist konsistent mit der Beobachtung, daß es mindestens zwei Gene mit wesentlicher Nukleinsäurehomologie zu der Arg-Gingipainspezifischen Sonde gibt.
  • Die enzymatische Aktivität von Arg-Gingipain-1 wird durch Glycin und Glycin-enthaltende Verbindungen stimuliert. In der Abwesenheit einer Glycin-enthaltenen Verbindung hat das Enzym im wesentlichen dieselbe amidolytische Aktivität im pH-Bereich von 7,5–9,0. Jedoch in der Gegenwart von z. B. Glycyl-Glycin wird eine wesentliche Verschärfung des pH-Bereiches für die Aktivität beobachtet, wobei das Optimum zwischen pH 7,4 und 8,0 ist. Vorläufige kinetische Daten zeigen an, daß der Effekt von Glycin und Glycinanalogen darin liegt, kcat und Km gleich anzugeben, so daß sich das kcat/Km-Verhältnis nicht ändert. Es ist deshalb wahrscheinlich, daß diese Verbindungen an das Enzym und/oder Substrat binden, nachdem ein Enzym-Substrat-Komplex bereits gebildet worden ist. Die Hochmolekulargewichts-Form wird nur etwa halb so sehr durch Glycinverbindungen stimuliert.
  • Arg-Gingipain 1 benötigt Cystein für volle amidolytische Aktivität, und, obwohl es durch andere Thiol-enthaltende Verbindungen stimuliert wird, war der Effekt weniger ausgeprägt. Cystein und Cysteamin sind besonders wirksam, vermutlich weil sie die doppelten Rollen als Reduktionsmittel und Glycin-Analoga erfüllen.
  • Die amidolytische Aktivität von Arg-Gingipain-1 wird durch eine Anzahl von -SH Blockierungsgruppenreagentien, Oxidantien, Ca2+-chelatisierenden Mitteln, und Zn2+ inhibiert. Der Effekt der chelatisierenden Mittel EDTA und EGTA wurde vollständig durch die Zugabe von überschüssigem Ca2+ umgekehrt, wobei es im Fall von Zn2+ notwendig war, o-Phenantrolin vor Ca2+ zuzugeben.
  • Typische Serinproteinase-gruppenspezifische Inhibitoren haben keinen Effekt auf die Enzymaktivität, und es ist wahrscheinlich, daß die Inhibierung durch sowohl TLCK als auch TPCK durch Reaktion mit einem essentiellen Cysteinrest in dem Enzym verursacht wurde, eine bekannte Eigenschaft von Chlormethylketonderivaten. Bezeichnenderweise wurde Arg-Gingipain-1 durch derartige Cysteinproteinaseinhibitoren wie trans-Epoxysuccinyl-L-Leucylamido-(4-guanidino)butan, Leupeptin und Antipain inhibiert. Obwohl die Reaktionen nicht stöchiometrisch waren, war die Inhibierung konzentrationsabhängig. Jedoch inhibiert menschliches Cystatin C, ein Inhibitor von Säuger- und Pflanzencysteinproteinasen, Arg-Gingipain-1 nicht, noch tat es einer der Trypsin-spezifischen Inhibitoren aus menschlichem Plasma, einschließlich α2-Macroglobulin, α1-Proteinaseinhibitor, Antithrombin III und α2-Antiplasmin. Tatsächlich legen vorläufige Untersuchungen nahe, daß der Inhibitor in jedem Fall durch Arg-Gingipain-1 inaktiviert wurde.
  • Calciumionen stabilisieren Arg-Gingipain-1, ohne daß sie direkt die Aktivität beeinflussen. In der Gegenwart von Ca2+ ist das Enzym in dem pH-Bereich zwischen 4,5 und 7,5 für mehrere Tage bei 4°C stabil. Jedoch wird die Enzymaktivität unter pH 4,0 oder in der Abwesenheit von Ca2+ schnell verloren. Bei 37°C erhöht Ca2+ beträchtlich die Stabilität, obwohl die Aktivität schneller verloren geht, als bei der niedrigen Temperatur. Bei –20°C ist Arg-Gingipain-1 für mehrere Monate stabil. Während einer Lyophilisierung verliert es jedoch irreversibel mehr als 90% seiner katalytischen Aktivität.
  • Die amidolytische Aktivität des gereinigten Arg-Gingipain-1 auf synthetische Peptidsubstrate war beschränkt auf Substrate mit einem P1-Arg-Rest. Selbst dann hatte Arg-Gingipain-1 signifikant unterschiedliche Turnover-Geschwindigkeiten auf individuelle Substrate, wobei es am effektivsten gegen S-2238(D-Phe-Pip-Arg-pNA) und 5-2222 (Bz-Ile-Glu-(y-OR)-Gly Arg-pNA) ist. Geringere, vergleichbare Aktivität wurde unter Verwendung von S2288 (D-Ile-Pro-Arg-pNA) und Bz-Arg-pNA beobachtet. D-Val-Leu-Lys-pNA (S-2251), Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, Gly-Pro-pNA und Cbz-Phe-Leu-Glu-pNA hatten im wesentlichen keine Substrataktivität. Diese enge Spezifität wurde durch Untersuchung der Spaltprodukte nach Inkubation mit der Insulin-B-Kette oder Mellitin bestätigt; es wurde gefunden, daß Spaltung spezifisch nur nach Arg-Resten erfolgte, aber nicht nach Lys oder irgendeiner anderen Aminosäure, solange nicht der letzte Affinitätschromatographieschritt über L-Arginin-Sepharose 4B ausgelassen wurde.
  • Weil fortschreitende Periodontitis durch Gewebeabbau, Kollagenzerstörung und eine starke entzündliche Reaktion charakterisiert ist, und weil P. gingivalis dafür bekannt war, daß es komplement-hydrolisierende Aktivität zeigt, wurde gereinigtes Arg-Gingipain-1 auf Proteinase-Aktivität unter Verwendung gereinigter menschlicher Komplemente C3 und C5 als Substrate getestet (siehe Wingrove et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 18902–18907). Niedermolekulargewicht-Arg-Gingipain spaltete selektiv die α'-Kette, und erzeugte dadurch, was anfänglich die α'-Kette von C3b zu sein schien. Weitere Zerlegungsfragmente der C3 α'-Kette wurden beobachtet und eine abnehmende Intensität der α'-Bande legte nahe, daß der Abbau weiterging. Visuelle Anzeichen legten nahe, daß die C3-β-Kette resistent gegenüber dieser Proteinase ist. Versuche C3a biologische Aktivität in der C3-Verdauungsmischung nachzuweisen, waren nicht erfolgreich, und das von der α-Kette freigegebene C3a-ähnliche Fragment wurde umfassend durch Arg-Gingipain-1 abgebaut.
  • Menschliches C5 wurde auch durch Arg-Gingipain-1 abgebaut, mit anfänglicher für die CS-α-Kette spezifischer Spaltung, wie im Falle von C3. Die α-1 (86 kDa) und die α-2 (30 kDa) Fragmente waren die ersten Polypeptide, die durch Spaltung von C5 Gingipain-1 gebildet wurden, und sie gleichen dem Molekulargewicht der intakten α-Kette, ein Fragment in dem Größenbereich von C5a wurde beobachtet. C5a ist resistenter gegen Arg-Gingipain-1 als C3a, und funktionelles C5a kann sich ohne weiteren nennenswerten Abbau anreichern. Die biologische Aktivität von C5a wurde nach Verdau von menschlichem C5 mit Arg-Gingipain-1 detektiert. Charakteristische morphologische Veränderungen in menschlichen Neutrophilen, bekannt als Polarisation, wurden durch Zählen der deformierten Zellen relativ zu den normal gerundeten Zellen gezählt.
  • Um für biologische in vivo Aktivität zu testen, wurde das gereinigte Niedermolekulargewicht-Arg-Gingipain-Enzym in Meerschweinchenhaut injiziert. Es induzierte eine Erhöhung der vascularen Permeabilität bei Konzentrationen größer als 10–8 M in dosisabhängigen und von der proteolytischen Aktivität abhängigen Weisen. Die Aktivität zur Erhöhung von vascularer Durchlässigkeit wurde nicht durch Diphenhydramin (ein Antihistamin) inhibiert, und die Aktivität wurde durch SQ 20,881 (Inhibitor für Angiotensin-umwandelndes Enzym) verstärkt. Die Erhöhung der vaskularen Durchlässigkeit durch Arg-Gingipain-1 wurde durch Sojabohnentrypsininhibitor (SBTI) bei einer Konzentration von 10–5 M inhibiert, eine Konzentration, bei der SBTI die enzymatische Aktivität nicht inhibierte, wie mit Bz-L-Arg-pNA und Azocasein als Substrate gemessen wurde.
  • Mit Arg-Gingipain-1 (10–8 bis 10–6 M)behandeltes menschliches Plasma oder Meerschweinchenplasma induzierte eine Erhöhung der vascularen Permeabilität in dem Meerschweinchenhautassay. Verstärkung der vaskularen Permeabilität durch Arg-Gingipain-1 behandeltes Plasma wurde durch Zugabe von 1,10-Phenanthrolin (Kinaseinhibitor, chelatisierendes Mittel für Zn-Ionen) auf eine Endkonzentration von 1 mM erhöht. Erhöhung der vascularen Permeabilität durch Arg-Gingipain-1 behandelte Plasmen wurde bemerkenswert reduziert, wenn Plasmen, die defizient bezüglich Hagemann-Faktor, Prekallikrein oder Hochmolekulargewicht-Kininogen, verwendet wurden. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die Verstärkung der vascularen Permeabilisierung durch Arg-Gingipain-1 über eine Aktivierung des Hagemann-Faktors und die nachfolgende Freisetzung von Bradykinin von Hochmolekulargewicht-Kininogen durch Kallikrein wirkt.
  • Intradermale Injektion von Arg-Gingipain-1 in das Meerschweinchen resultierte auch in Neutrophilanhäufung an der Stelle der Injektion, eine Aktivität, welche abhängig von der protoelytischen Aktivität war.
  • Die vorhergehenden Ergebnisse zeigen die Fähigkeit von Arg-Gingipain, entzündliche Reaktion in einem Meerschweinchen-Tiermodell hervorzurufen.
  • Rekombinantes Arg-Gingipain ist geeignet in Verfahren zur Identifizierung von Mitteln, die Arg-Gingipain-Proteinaseaktivität modulieren, sei es durch Wirkung auf die Proteinase selbst oder durch Verhinderung der Interaktion einer Proteinase mit einem Protein in der Gingivalgegend, wie z. B. C3 oder C5. Ein derartiges Verfahren umfaßt die Schritte: Inkubierung einer Proteinase mit einem vermeintlichen Therapeutikum, d. h. einem Arg-Gingipain-inhibierenden Mittel; Bestimmung der Aktivität der mit dem Mittel inkubierten Proteinase; und Vergleich der im Schritt zuvor erhaltenen Aktivität mit der Aktivität einer Kontrollprobe der Proteinase, die nicht mit dem Mittel inkubiert worden ist.
  • SDS-PAGE-Analyse (ohne Kochen) der gereinigten Hochmolekulargewichts-Form von Arg-Gingipain zeigte eine einzelne Bande mit einer scheinbaren Molekularmasse von 95 kDa. Diese Schätzung wurde durch analytische Chromatographie über eine TSK 3000 SW Gelfiltrationssäule bestätigt. Wenn die Enzympräparation vor der SDS-PAGE gekocht wurde, wurden jedoch Banden mit scheinbaren Molekularmassen von ungefähr 50 kDa, 44 kDa, 27 kDa und 17 kDa beobachtet. Diese Banden wurden nicht generiert durch Behandlungen unterhalb der Siedetemperatur, durch Reduktionsmittel oder Detergenzien. Es wurde geschlossen, daß die 95 kDa-Bande das Ergebnis von starken nicht-kovalenten Bindungen zwischen den Proteinen mit niederem Molekulargewicht war.
  • Die 50 kDa proteolytische Komponente des Hochmolekulargewicht-Arg-Gingipains wurde bezüglich der N-terminalen Aminosäuresequenz über 22 Aminosäuren charakterisiert. Die Sequenz war identisch zu den ersten 22 Aminosäuren des 50 kDa Niedermolekulargewicht-Arg-Gingipain-1. Eine Charakterisierung der Hochmolekulargewicht-Arg-Gingipain-Aktivität zeigte dieselbe Abhängigkeit von Cystein (oder anderen Thiolen) und dasselbe Reaktionsspektrum gegen potentielle Inhibitoren. Obwohl das Hochmolekulargewicht-Arg-Gingipain durch Glycinverbindungen stimuliert wurde, war die Reaktion nur etwa halb so groß wie sie für die Niedermolekulargewichtsform beobachtet wurde.
  • Die Primärstruktur des NH2-Endes von Niedermolekulargewicht-Arg-Gingipain, die durch direkte Aminosäurensequenzierung bestimmt worden war (SEQ ID NO: 1), wurde verwendet, um eine Mischung von synthetischen Primeroligonukleotiden GIN-1-32 (SEQ ID NO: 6), die für die Aminosäuren 2 bis 8 des reifen Proteins kodieren, und Primer GIN-2-30 (SEQ ID NO: 7), die für Aminosäuren 25 bis 32 des reifen Proteins kodieren, herzustellen. Diese Primer wurden in einer PCR mit P. gingivalis DNA verwendet. Ein einzelnes 105-Basenpaarprodukt (P105) resultierte. Dieses wurde in ein PCR-ScriptTMSK(–) (Stratagene) kloniert und sequenziert. Die Sequenzanalyse von P105 erzeugte 49 Nukleotide einer Arg-Gingipain-kodierenden Sequenz. Auf der Grundlage der Sequenz von P105 wurde ein anderer Primer (GIN-8S-48) SEQ ID NO: 8, der dem kodierenden Strang des partiellen Arg-Gingipain-Gens (48-mers) entspricht, synthetisiert, um die λDASH DNA-Genbank unter Verwendung einer 32P-markierten GIN-8S-48-Sonde zu überprüfen. Eine Teilsequenz des Arg-Gingipain-Gens (Nukleotide 1-3159), SEQ ID NO: 3) wurde durch Überprüfen der P. gingivalis DNA-Genbank unter Verwendung einer 32Pmarkierten Hybridisierungssonde GIN-8S-48 (SEQ ID NO: 8) bestimmt. Aus einer Gesamtheit von 2 × 105 überprüften, unabhän gigen Plaques wurden sieben positive Klone isoliert und gereinigt. Nach Aufarbeitung und Reinigung wurde die DNA durch Restriktionsenzyme analysiert: Ein Klon (A1) hat ein 3,5 kb BamHI-Fragment und ein 3 kb PstI Fragment; ein anderer Klon (B1) hat ein 9,4 kb BamHI-Fragment und ein 9,4 kb PstI-Fragment; und 5 Klone haben ein 9,4 kb BamHI-Fragment und ein 10 kb Pstl-Fragment. Diese Ergebnisse sind ähnlich zu diesen, die durch Southern-Analyse von P. gingivalis DNA erhalten wurden, und sind konsistent mit der Existenz von mindestens zwei Arg-Gingipain-Genen. Der A1-Klon wurde für die Sequenzierung ausgewählt, weil die für die Kodierung eines 50-kDa-Proteins erwartete DNA-Größe ungefähr 1,35 kb ist. Das 3,159 kb Pstl/BamHI-Fragment von Klon A1 wurde der Reihe nach subkloniert in pBluescript SK(–) als ein SmaI/BamHI-Fragment und als ein PstI-Fragment und ein PstI/BamHI-Fragment, und in M13mp18 und 19 als ein PstI-Fragment und als ein PstI/BamHI-Fragment, und sequenziert. Um das Stopkodon von Gingipain-1 zu klonieren, welches in dem PstI/BamHI-Fragment fehlte, wurden P. gingivalis DNA-Klone aus dem Doppelverdau mit PstI/HindIII wurden mit 32P-markierten GIN-14-20 (SEQ ID NO: 9) (Nukleotide 2911–2930 von SEQ ID NO: 3), die am 3'-Ende dieses Klones lokalisiert sind, hybridisiert. Ein PstI/HindIII-Fragment von ungefähr 4,3 kb wurde identifiziert und in pBluescript SK(-) kloniert. Ein kleineres Fragment (PstI/Asp713 und BamHI/HindIII) wurde auch in M13mp18 und 19 subkloniert.
  • SEQ ID NO: 3 ist die DNA-Sequenz des 3159 Basenpaaren PSTI/EAMHI-Fragment (siehe Tabelle 1).
  • TABELLE 1 Nukleotidsequenz und hergeleitete Aminosäuresequenz eines Arg-Gingipains
    Figure 00240001
  • TABELLE 1 (Forts.)
    Figure 00250001
  • TABELLE 1 (Forts.)
    Figure 00260001
  • TABELLE 1 (Forts.)
    Figure 00270001
  • TABELLE 1 (Forts.)
    Figure 00280001
  • TABELLE 1 (Forts.)
    Figure 00290001
  • Als Beispiel angegebene Nukleotidsequenzen, die ein reifes Arg-Gingipain kodieren, das hierin Arg-Gingipain-2 genannt wird, erstrecken sich von 1630–3105 in SEQ ID NO: 3 und in SEQ ID NO: 10. Das erste ATG erscheint bei Nukleotid 949 und wird von einem langen offenen Leseraster (ORF) von 5111 bp in Tabelle 2 (SEQ ID NO: 10) gefolgt. Dieser ORF war der Größte, der beobachtet wurde. Jedoch ist das erste ATG von 8 weiteren im Leseraster gefolgt (bei Nukleotiden 1006, 1099, 1192, 1246, 1315, 1321, 1603 und 1609). Der wahrscheinlichste Kandidat für den Start der Translation ist zur Zeit unbekannt. Welches dieser Startkodons bei der Translation des Arg-Gingipain-2-Vorläufers verwendet wird, kann durch Expression des Polyproteins in Bakterien und nachfolgende aminoterminale Sequenzanalyse der Proprotein-Zwischenprodukte bestimmt werden. Die Sequenz, die von den 5'-nicht-kodierenden Sequenzen abgeleitet wird, besteht aus 948 bp. Die Primärstruktur des reifen Arg-Gingipain-Moleküls kann aus den empirischen amino-terminalen und carboxy-terminalen Sequenzen und dem Molekulargewicht abgeleitet werden. So hat das reife Arg-Gingipain-2 ein Aminoende, das bei Nukleotidrest 1630 in SEQ ID NO: 3 und bei Aminosäure 1 in SEQ ID NO: 4 beginnt. Wie für eine Arginin-spezifische Protease erwartet, wird das reife Protein nach einem Argininrest gespalten. Die 50 kDa- und die 44 kDa-Banden von den Bz-L-Arg-pNa-Aktivitätpeaks haben eine identische Sequenz zu dieser abgeleiteten Aminosäuresequenz von Gingipain, die jeweils bei den Nukleotiden 1630–1695 und bei den Nukleotiden 3106–3156 kodiert wird. Entsprechend diesen Daten stammt das Carboxyl-Ende höchstwahrscheinlich aus autoproteolytischer Prozessierung nach dem Argininrest, der bei 3103–3105 kodiert wird, wo die das Aminoende kodierende Sequenz einer Hämagglutinin-Komponente beginnt (Nukleotid 3106). Die abgeleiteten 492 Aminosäuren von Gingipain-2 ergeben ein Proteasemolekül mit einem berechneten Molekulargewicht von 54 kDa, welches gut mit der durch SDS-PAGE-Analyse bestimmten molekularen Masse von 50 kDa korreliert. Die Tabellen 1 und 2 (siehe auch SEQ ID NO: 10 und 11) zeigen die kodierende Sequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz von Gingipain-2. Das erste in der Sequenz gezeigte Nukleotid gehört zu der PstI-Klonierungsstelle und wird als Nukleotid 1 bezeichnet. Fett gedruckte Buchstaben zeigen die potentiellen Startstellen ATG und das erste Kodon des reifen Gingipain-2 an. Die aminoterminale Sequenz von Gingipain-2 und die aminoterminale Sequenz der 44 kDa-Banden von den Bz-L-Arg-pNa-Aktitivätspeaks sind unterstrichen.
  • Tabelle 2 (entsprechend den SEQ ID NO: 10–11) zeigt die Nukleotidsequenz, die die gesamte Präpoly-Proteinsequenz kodiert, einschließlich sowohl der Proteasekomponente und der Hämagglutinin-Komponente(n) von HMW-Arg-Gingipain. Die kodierende Sequenz erstreckt sich von einem ATG bei Nukleotid 949 bis zu einem TAG-Stop-Kodon bei Nukleotid 6063 in SEQ ID NO: 10. Die abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 11 angegeben.
  • TABELLE 2 Sequenzbereich: 1-7266
    Figure 00320001
  • TABELLE 2 (Forts.)
    Figure 00330001
  • TABELLE 2 (Forts.)
    Figure 00340001
  • TABELLE 2 (Forts.)
    Figure 00350001
  • TABELLE 2 (Forts.)
    Figure 00360001
  • TABELLE 2 (Forts.)
    Figure 00370001
  • TABELLE 2 (Forts.)
    Figure 00380001
  • TABELLE 2 (Forts.)
    Figure 00390001
  • sDie Spaltung des Vorläuferproteins nach dem Arg-Rest bei Aminosäure 227 entfernt den N-terminalen Vorläuferteil und setzt nach dem Arg-Rest bei Aminosäure 719, 1091 und 1429 ein Niedermolekulargewicht-Arg-Gingipain und drei Hämagglutinin-Komponenten frei. Die 44 kDa Hämagglutinin-Komponente hat eine Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID Nr: l1 von 720–1091 angegeben, mit einem berechneten Molekulargewicht von 39,4 kDa, konsistent mit dem durch Gel-Elektrophorese geschätzten. Die 17 kDa Hämagglutinin-Komponente hat eine Aminosäuresequenz, wie angegeben in SEQ ID NO: 11 bei den Aminosäuren 1092–1429, und ein berechnetes Molekulargewicht von 37,1 kDa. Die 27 kDa Hämagglutinin-Komponente hat eine Aminosäuresequenz, die sich von Aminosäuren 1430–1704 in SQ ID NO: 11 erstreckt, und ein berechnetes Molekulargewicht von 29,6 kDa.
  • Figure 00410001
  • Tabelle 3 ist das Ergebnis eines Sequenzvergleichs der 44 kDa, 27 kDa und 17 kDa Hämagglutinin-Domänen des Arg-Gingipain-Komplexes, das Alignment von Regionen von Aminosäureidentität, welche, ohne sich an irgendeine besondere Theorie zu binden, postuliert werden, die für die Hämagglutinin-Aktivität verantwortliche Domäne zu sein. Aminosäuren, die bei allen Hämagglutinin-Domänen identisch sind, sind in Großbuchstaben, und Aminosäuren, die nicht konserviert sind, sind in Kleinbuchstaben gezeigt. Im Falle der proteolytischen Komponente ist nur eine begrenzte Region mit signifikanter Übereinstimmung gezeigt.
  • Eine genomische DNA-Genbank wurde auch von virulenter P. gingivalis W50 hergestellt. Zwei Klone wurden als Sequenz identifiziert, welche die für Arg-Gingipain-kodierende Sequenz enthält. 0,5 und 3,5 kb BamHI-Fragmente wurden sequenziert; es zeigte 99% Nukleotidsequenz-Identität mit etwa 3160 plus 557 bp von P. gingivalis H66 DNA, die Arg-Gingipain-kodierende Sequenz enthält. Ein Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der kodierten Arg-Gingipain-Sequenzen zeigte 99% Identität.
  • Tabellen 1 und 2 geben beide Sequenzen von P. gingivalis wieder. Es wird jedoch vorausgesetzt, daß es einige Variationen in den Aminosäuresequenzen und kodierenden Nukleinsäuresequenzen für Arg-Gingipain von verschiedenen P. gingivalis-Stämmen geben wird. Der Fachmann kann leicht Arg-Gingipain-kodierende Sequenzen von anderen Stämmen identifizieren und isolieren, in denen es eine mindestens 70%ige Homologie zu den hierin speziell als Beispiel angegebenen Sequenzen gibt, unter Verwendung der hierin bereitgestellten Sequenzen, zusammen mit dem, was im Stand der Technik wohlbekannt ist. Auch innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung befinden sich Arg-Gin gipaine, in denen die Protease oder proteolytische Komponente eine mindestens etwa 85%ige Aminosäuresequenzidentität mit einer hierin als Beispiel angegebenen Aminosäuresequenz hat.
  • Es wird auch vom Fachmann verstanden, daß es eine beschränkte Anzahl von Aminosäuresubstitutionen in einem Protein geben kann, ohne daß die Funktion signifikant beeinflußt wird, und daß nicht als Beispiel angegebene Gingipain-1-Proteine einige Aminosäuresequenzabweichungen von der als Beispiel angegebenen Aminosäuresequenz haben können. Derartige natürlich auftretende Varianten können identifiziert werden, z. B. durch Hybridisierung an die als Beispiel angegebene, für (reifes) Arg-Gingipain-2-kodierende Sequenz (oder einem Teil davon, der zur spezifischen Hybridisierung mit Arg-Gingipain-Sequenzen fähig ist) unter Bedingungen, die geeignet sind, um mindestens etwa 70% Nukleotidsequenzhomologie, vorzugsweise etwa 80%, stärker bevorzugt etwa 90% und am meisten bevorzugt 95–100% Sequenzhomologie zu detektieren. Vorzugsweise hat die kodierte Arg-Gingipain-Protease oder proteolytische Komponente mindestens etwa 85% Aminosäureidentität zu einer als Beispiel angegebenen Arg-Gingipain-Aminosäuresequenz.
  • Es ist wohlbekannt im biologischen Stand der Technik, daß bestimmte Aminosäuresubstitutionen in Proteinsequenzen gemacht werden können, ohne die Funktion des Proteins zu beeinflussen. Im allgemeinen werden konservative Aminosäuren toleriert, ohne die Proteinfunktion zu beeinflussen. Ähnliche Aminosäuren können solche sein, die ähnlich in Größe und/oder Ladungseigenschaften sind, z. B. Aspartat und Glutamat und Isoleucin und Valin sind beides Paare von ähnlichen Aminosäuren. Ähnlichkeit zwischen Aminosäurepaaren ist im Stand der Technik in einer Anzahl von Arten beurteilt worden. Zum Beispiel, Dayhoff et al. (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure, Volume 5, Supplement 3, Chapter 22, pages 345–352, welches hierin durch Verweis aufgenommen wird, stellt Frequenztabellen für Aminosäuresubstitutionen bereit, welche als ein Maß der Aminosäureähnlichkeit verwendet werden können. Die Frequenztabellen von Dayhoff et al. basieren auf Vergleichen von Aminosäuresequenzen für Proteine mit derselben Funktion von einer Vielzahl von entwicklungsgeschichtlich verschiedenen Quellen.
  • Der Fachmann erkennt, daß andere P. gingivalis-Stämme kodierende Sequenzen für ein Protein mit den unterscheidenden Charakteristika eines Arg-Gingipains haben können; Diese kodierenden Sequenzen können identisch oder synonym mit der als Beispiel angegebenen kodierenden Sequenz sein, oder es können einige Variation en) in der kodierten Aminosäuresequenz vorliegen. Eine Arg-Gingipain-kodierende Sequenz von einem P. gingivalis-Stamm, der von H66 verschieden ist, kann identifiziert werden, z. B. durch Hybridisierung mit einem Polynukleotid oder einem Oligonukleotid mit der gesamten oder einem Teil der als Beispiel angegebenen kodierenden Sequenz für reifes Gingipain, unter stringenten Bedingungen, die geeignet sind, um eine Sequenz mit mindestens 70% Homologie zu detektieren.
  • Ein Polynukleotid oder ein Fragment davon ist "im wesentlichen homolog" (oder "im wesentlichen ähnlich") zu einem anderen Polynukleotid, wenn es optimal mit einem anderen Polynukleotid ausgerichtet ist (mit geeigneten Nukleotidinsertionen oder -deletionen), falls es eine Nukleotidsequenz-Identität für ungefähr 60% der Nukleotidbasen gibt, gewöhnlich ungefähr 70%, mehr gewöhnlich etwa 80%, bevorzugt etwa 90%, und besonders bevorzugt etwa 95% bis 100% der Nukleotidbasen.
  • Alternativ existiert eine wesentliche Homologie (oder Ähnlichkeit), wenn ein Polynukleotid oder ein Fragment davon an ein anderes Polynukleotid unter selektiven Hybridisierungsbedingungen hybridisieren wird. Eine Hybridierungsselektivität existiert unter Hybridisierungsbedingungen, welche es einem erlauben, das Zielpolynukleotid von Interesse von anderen Polynukleotiden zu unterscheiden. Typischerweise wird eine selektive Hybridisierung auftreten, wenn es ungefähr 55% Ähnlichkeit über eine Strecke von etwa 14 Nukleotiden, vorzugsweise ungefähr 65%, mehr bevorzugt ungefähr 75%, und am meisten bevorzugt ungefähr 90% gibt. Siehe Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res., 12: 203–213. Die Länge des Homologievergleiches, wie beschrieben, kann sich über längere Abschnitte erstrecken und wird sich in bestimmten Ausführungsformen oft über einen Abschnitt von etwa 17 bis 20 Nukleotiden erstrecken, und bevorzugt etwa 36 oder mehr Nukleotiden betragen.
  • Die Hybridisierung von Polynukleotiden wird beeinflußt durch derartige Bedingungen wie Salzkonzentration, Temperatur oder organische Lösungsmittel, zusätzlich zu der Basenzusammensetzung, Länge der komplementären Stränge, und der Anzahl von Nukleotidbasenunstimmigkeiten zwischen den hybridisierenden Polynukleotiden, wie leicht von Fachleuten eingeschätzt werden wird. Stringente Temperaturbedingungen werden im allgemeinen Temperaturen über 30°C umfassen, typischerweise über 37°C, und bevorzugt über 45°C. Stringente Salzbedingungen werden normalerweise weniger als 1 M sein, typischerweise weniger als 500 mM und bevorzugt weniger als 200 mM. Jedoch ist die Parameterkombination viel wichtiger als das Maß eines einzelnen Parameters (Wetmur and Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31, 349–370).
  • Ein "isoliertes" oder "im wesentlichen reines" Polynukleotid ist ein Polynukleotid, welches im wesentlichen von anderen Polynukleotidsequenzen getrennt ist, welche natürlicherweise eine native Gingipain-1-Sequenz begleiten. Der Begriff umfaßt eine Polynukleotidsequenz, welche aus ihrer natürlich auftretenden Umgebung entfernt worden ist, und umfaßt rekombinante oder klonierte DNA-Isolate, chemisch synthetisierte Analoga und Analoga, die biologisch durch heterologe Systeme synthetisiert werden.
  • Von einem Polyonukleotid wird gesagt, daß es ein Polypeptid "kodiert", falls es in seinem nativen Zustand, oder wenn es durch Fachleuten bekannte Methoden manipuliert worden ist, transkribiert und/oder translatiert werden kann, um das Polypeptid eines Fragments davon herzustellen. Von dem nichtkodierenden Strang eines derartigen Polynukleotids wird auch gesagt, daß es die Sequenz kodiert.
  • Eine Nukleotidsequenz ist operativ verknüpft, wenn sie in eine funktionelle Beziehung zu einer anderen Nukleotidsequenz gesetzt wird. Zum Beispiel ist ein Promoter operativ verknüpft mit einer kodierenden Sequenz, falls der Promoter ihre Transkription oder Expression beeinflußt. Allgemein bedeutet operativ verknüpft, daß die verknüpften Sequenzen aneinander angrenzend sind und, wo es notwendig ist, zwei proteinkodierende Regionen zu verknüpfen, aneinander angrenzend und im Leseraster sind. Jedoch ist es wohlbekannt, daß bestimmte genetische Elemente, wie z. B. Verstärker, auch über eine Entfernung operativ verknüpft sein können, d. h. auch dann, wenn sie nicht aneinander angrenzen.
  • Der Begriff "rekombinantes" Polynukleotid bezieht sich auf ein Polynukleotid, welches durch die Kombination von zwei anderen falls voneinander getrennten Sequenzsegmenten gebildet wird, was durch die künstliche Manipulation von isolierten Polynukleotidsegmenten durch genetische Manipulationstechniken oder durch chemische Synthese erreicht wird. Dadurch kann man Polyonukleotidsegmente von gewünschter Funktion miteinander verknüpfen, um eine gewünschte Kombination von Funktionen zu erzeugen.
  • Polynukleotidsonden umfassen ein isoliertes Polynukleotid, das mit einem Markierung oder Reportermolekül verknüpft ist und verwendet werden kann, um andere Arg-Gingipain-kodierende Sequenzen zu identifizieren und zu isolieren. Sonden, die synthetische Oligonukleotide oder andere Polynukleotide umfassen, können von natürlich vorkommenden oder rekombinanten einfach- oder doppelsträngigen Nukleinsäuren abgeleitet werden oder chemisch synthetisiert werden. Polynukleotidsonden können durch irgendeine im Stand der Technik bekannte Methode markiert werden, z. B., "Random-Hexamer-Labeling", "Nick-Translation", oder die Klenow-Auffüllreaktion.
  • Große Mengen der Polynukleotide können durch Replikation in einer geeigneten Wirtszelle hergestellt werden. Natürliche oder synthetische DNA-Fragmente, die für eine Proteinase oder ein Fragment davon kodieren, werden in rekombinante Polynukleotidkonstrukte eingebaut werden, typischerweise in DNA-Konstrukte, die zur Einführung und zur Replikation in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle fähig sind. Gewöhnlich wird das Konstrukt geeignet sein für die Replikation in einem einzelligen Wirt, wie z. B. Hefe oder Bakterien, aber ein mehrzelliger eukaryotischer Wirt kann auch zweckmäßig sein, mit oder ohne Integration im Genom der Wirtszellen. Gewöhnlich verwendete prokaryotische Wirte umfassen Stämme von Escherichia coli, obwohl andere Prokaryoten, wie z. B. Bacillus subtilis oder Pseudomonas auch verwendet werden können. Säuger- oder andere eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefe-, filamentöse Pilz-, Pflanzen-, Insekten-, amphibische und Vogelarten. Derartige Faktoren wie Leichtigkeit der Manipulation, die Fähigkeit, exprimierte Proteine geeignet zu glycosylieren, Grad und Kontrolle der Proteinexpression, Leichtigkeit der Reinigung der exprimierten Proteine von zellulären Verunreinigungen, oder andere Faktoren können die Wahl der Wirtszelle bestimmen.
  • Die Polynukleotide können auch durch chemische Synthese hergestellt werden, z. B., durch die Phosphoramiditmethode, beschrieben durch Beaucage and Caruthers (1981) Tetra. Letts., 22: 1859–1862 oder die Triestermethode nach Matteuci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc., 103: 3185, und können mit kommerziellen automatisierten Oligonukleotid-Synthesemaschinen durchgeführt werden. Ein doppelstrangiges Fragment kann aus dem einzelstrangigen Produkt der chemischen Synthese entweder durch Synthese des Komplementärstranges und Annealing der Stränge zusammen unter geeigneten Bedingungen, oder durch Zugeben des Komplementärstranges unter Verwendung von DNA-Polymerase mit einer zweckmäfligen Primersequenz erhalten werden.
  • Für die Einführung in einen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt hergestellte DNA-Konstrukte werden typischerweise ein Replikationssystem umfassen (d. h. Vektor), das von dem Wirt erkannt wird, einschliefllich des gewünschten DNA-Fragments, das das gewünschte Polypeptid kodiert, und werden vorzugsweise auch die den Start der Transkription und Translations regulierende Sequenzen enthalten, die operativ mit dem Polypeptid-kodierenden Segment verknüpft sind. Expressionssysteme (Expressionsvektoren) können umfassen, z. B., einen Ur- sprung der Replikation oder eine autonome Replikationssequenz (ARS) und Expressions-Kontrollsequenzen, einen Promoter, einen Verstärker und notwendige Prozessierungs-Informationsstellen, wie z. B. Ribosom-Bindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen, transkriptionsbeendende Sequenzen, und mRNA-stabilisierende Sequenzen. Signalpeptide können auch umfaßt werden, wo es zweckmäßig ist, von sekretierten Polypeptiden derselben oder von verwandten Arten, welche es erlauben, daß das Protein Zellmembranen überwindet und/oder darin eingebettet wird oder von der Zelle sekretiert wird.
  • Ein geeigneter Promoter und andere notwendigen Vektorsequenzen werden so gewählt werden, daß sie funktionell im Wirt sein werden. Beispiele von durchführbaren Kombinationen von Zelllinien und Expressionsvektoren werden beschrieben in Sambrook et al. (1989) siehe unten; Ausubel et al. (Hrsg.) (1987) Current Protocols in Molecular Biolog , Greene Publishing and Wiley Interscience, New York; und Metzger et al. (1988) Nature, 334: 31–36. Viele nützliche Vektoren zur Expression in Bakterien, Hefe, Säuger-, Insekten-, Pflanzen- oder anderen Zellen sind im Stand der Technik wohlbekannt und können von Verkäufern, wie z. B. Stratagen, New England Biolabs, Promega Biotech, und anderen erhalten werden. Zusätzlich kann das Konstrukt mit einem amplifizierbaren Gen (z. B. DHFR) verknüpft werden, so daß vielfache Kopien des Gens gemacht werden können. Für zweckmäßige Verstärker und andere expressionskontrollierende Sequenzen, siehe auch Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, N. Y. (1983). Während sich derartige Expressionsvektoren selbständig replizieren können, können sie sich weniger bevorzugt replizieren, indem sie in das Genom der Wirtszelle eingeführt werden.
  • Expressions- und Klonierungs-Vektoren werden wahrscheinlich einen auswählbaren Marker enthalten, das heißt, ein Gen, das ein für das Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle notwendiges Protein kodiert. Obwohl ein derartiges Marker-Gen auf einer anderen Polynukleotidsequenz, die zusammen in die Wirtszelle eingeführt wird, getragen werden kann, ist es besonders häufig auf dem Klonierungs-Vektor enthalten. Nur diese Wirtszellen, in welche das Marker-Gen eingeführt worden ist, werden unter selektierenden Bedingungen überleben und/oder wachsen. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, welche (a) Resistenz gegen Antibiotika oder andere toxische Substanzen verleihen, z. B., Ampicillin, Neomycin, Methotrextat, etc.; (b) auxotrophe Mängel komplementieren; oder (c) kritische Nährstoffe zur Verfügung stellen, die nicht aus dem Komplexmedium verfügbar sind. Die Wahl des geeigneten auswählbaren Markers wird von der Wirtszelle abhängen; zweckmäßige Marker für unterschiedliche Wirte sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die rekombinanten Vektoren, die die Arg-Gingipain-kodierenden Sequenzen von Interesse enthalten, können in die Wirtszelle eingeführt (transformiert, transfiziert) werden durch eine Anzahl von zweckmäßigen Mitteln, einschließlich Elektroporation; Transformation oder Transfektion unter Verwendung von Calciumchlorid, Rubidiumchlorid, Calciumphosphat, DEAE-dextran, oder anderen Substanzen; Microprojektil-Bombardierung; Lipofektion und Transfektion oder Infektion (falls der Vektor ein infektiöses Agens ist, wie z. B. ein Viren- oder Retrovirengenom). Die Wahl derartiger Mittel wird oft von der Wirtszelle abhängen. Große Mengen der Polynukleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch Transformation geeigneter prokaryotischer oder eukaryotischer Wirtszellen mit Gingipain-1-kodierenden Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung in kompatiblen Vektoren oder anderen Expressionsvehikeln und Kul-tivieren derartig transformierter Wirtszellen unter für die Expression des Arg-Gingipain-kodierenden Gens geeigneten Bedingungen präpariert werden. Das Arg-Gingipain kann dann von den Wirtszellen zurückgewonnen und gereinigt werden.
  • Die kodierende Sequenz für die "reife" Form von Arg-Gingipain-2 wird nach PCR zielgerichteter Mutagenese und Klonieren in einen Expressionsvektor exprimiert, der für die Verwendung in, z. B. E. coli geeignet ist. Beispielhafte Expressionsvektoren für E. coli und andere Wirtszellen werden angegeben, z. B. in Sambrook et al. (1989), siehe unten, und in Pouwels et al. (Hrsg.) (1986) Cloning Vectors, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, Niederlande.
  • Um Leader-Sequenzen und Vorläufer-Sequenzen auf der 5'-Seite der kodierenden Sequenz zu eliminieren, wird eine Kombination von Schneiden mit Restriktions-Endonukleasen und zielgerichteter Mutagenese über PCR unter Verwendung eines Oligonukleotids verwendet, das eine gewünschte Restriktionsschnittstelle zum Klonieren enthält (eine, der nicht in der kodierenden Sequenz vorhanden ist), sowie eine Ribosombindestelle, ein Startkodon für die Translation (ATG) und die Kodons für die ersten Aminosäuren des reifen Arg-Gingipains-2. Das Oligonukleotid für die zielgerichtete Mutagenese am 3'-Ende der kodierenden Sequenz für reifes Gingipain-1 umfaßt Nukleotide, welche für die carboxyterminalen Aminosäuren des reifen Gingipain-1 kodieren, ein Translations-Stopkodon (TAA, TGA or TAG), und eine zweite geeignete Erkennungsstelle für Restriktionsendonuklease, die nicht im Rest der in den Expressionsvektor einzuführenden DNA-Sequenz vorhanden ist. Die zielgerichtete Mutagenesestrategie ist ähnlich zu der von Boone et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2800–2804, wie modifiziert für die Verwendung mit PCR.
  • In einer anderen Ausführungsform werden polyklonale und/oder monoklonale Antikörper bereitgestellt, die fähig sind, spezifisch an eine Proteinase oder Fragmente davon zu binden. Der Begriff Antikörper wird verwendet, um sowohl eine homogene molekulare Einheit zu bezeichnen, als auch eine Mischung, wie z. B. ein aus einer Vielzahl von verschiedenen molekularen Einheiten bestehendes Serumprodukt. Monoklonale oder polyklonale Antikörper, die spezifisch mit den Arg-Gingipainen reagieren, können durch im Stand der Technik bekannte Methoden hergestellt werden. Siehe, z. B., Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratiories; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2nd ed., Academic Press New York; und Ausubel et al. (1987), siehe oben. Rekombinante Immunoglobuline können auch durch im Stand der Technik bekannte Methoden hergestellt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Methoden, die im U.S. Patent Nr. 4,816,567 beschrieben werden. Bevorzugt werden monoklonale Antikörper mit Affinitäten von 108 M–1, vorzugsweise 109 bis 1010 oder mehr.
  • Spezifische Antikörper für Arg-Gingipain(e) können nützlich sein, z. B., als Sonden zum Screenen von DNA-Expressions-Genbanken oder für den Nachweis des Vorhandenseins von Arg-Gingipainen in einer Testprobe. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper durch Verknüpfung, entweder kovalent oder nicht kovalent, mit einer Substanz markiert, welche ein detektierbares Signal bereitstellt. Geeignete Markierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Radionukleotide, Enzyme, Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, fluoreszierende Mittel, chemilumineszierende Mittel, magnetische Partikel und ähnliches. United States Patente, die die Verwendung derartiger Label beschreiben, umfassen, aber sind nicht beschränkt auf Nr. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241.
  • Spezifische Antikörper für Arg-Gingipain(e), die fähig sind, seine (ihre) Proteinaseaktivität zu inhibieren, können geeignet sein für die Behandlung von Tieren, einschließlich Menschen, die an periodontalen Krankheiten leiden. Derartige Antikörper können erhalten werden durch die oben beschriebenen Methoden und nachfolgendes Screenen der Arg-Gingipain-spezifischen Antikörper auf ihre Fähigkeit, Proteinaseaktivität zu inhibieren.
  • Bereitgestellt werden Zusammensetzungen und immunogene Präparationen, einschließlich Vakzin-Zusammensetzungen, umfassend im wesentlichen gereinigte rekombinante Arg-Gingipain (e) und einen dafür geeigneten Träger. Alternativ können hydrophile Regionen der proteolytischen Komponente oder der Hämagglutinin-Komponente(n) von Arg-Gingipain durch den Fachmann identifiziert werden, und Peptidantigene können synthetisiert und an ein geeignetes Trägerprotein (z. B. Rinderserum-Albumin oder Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin) gebunden werden, für die Verwendung in Vakzinen oder zur Erzeugung eines für Arg-Gingipaine spezifischen Antikörpers. Immunogene Zusammensetzungen sind diese, welche in spezifischer Antikörperproduktion resultieren, wenn sie in einen Menschen oder ein Tier injiziert werden. Derartige Vakzine sind nützlich, z. B., für die Immunisierung eines Tieres, einschließlich von Menschen, gegen entzündliche Reaktion und Gewebeschaden, ausgelöst durch P. gingivalis bei einer periodontalen Krankheit. Die Vakzin-Präparationen umfassen eine immunogene Menge eines oder mehrerer Arg-Gingipaine oder immunogene(s)-Fragment (e) oder Un tereinheit(en) davon. Derartige Vakzine können eine oder mehrere Arg-Gingipain-Proteinasen umfassen, oder eine Kombination mit einem anderen Protein oder einem anderem Immunogen. "Immunogene Menge" meint eine Menge, die geeignet ist, die Produktion von gegen Arg-Gingipain(e) gerichtete Antikörper in einem Individuum hervorzurufen, an welches das Vakzin verabreicht worden ist.
  • Immunogene Träger können verwendet werden, um die Immunogenität der Proteinasen zu verstärken. Derartige Träger umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Proteine und Polysaccharide, Liposomen, und Bakterienzellen und -membranen. Proteinträger können an die Proteinasen gebunden werden, um Fusionsproteine durch rekombinante oder synthetische Mittel oder durch chemische Kupplung zu bilden. Nützliche Träger und Mittel zur Kupplung derartiger Träger an Polypeptidantigene sind im Stand der Technik bekannt.
  • Die Vakzine können durch jedes im Stand der Technik bekannte Mittel formuliert werden. Derartige Vakzine werden üblicherweise für die Injektion präpariert, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen. Ebenfalls hergestellt werden können feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in Flüssigkeit, vor der Injektion, geeignet sind. Die Präparation kann auch, z. B., emulgiert werden, oder das Protein kann in Liposomen eingeschlossen werden.
  • Die aktiven immunogenen Bestandteile werden oft mit Verdünnungsmitteln oder Trägern gemischt, welche pharmazeutisch verträglich und kompatibel mit dem Wirkstoff sind. Geeignete Verdünnungsmittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol oder ähnliches und Kombinationen davon. Die Konzentration des immunogenen Polypeptids in injizierbaren Formulierungen liegt gewöhnlich im Bereich von 0,2 bis 5 mg/ml.
  • Zusätzlich können die Vakzine, falls gewünscht, geringe Mengen von Hilfssubstanzen enthalten, wie z. B. Benetzungs- oder Emulsionsmittel, pH-Puffermittel, und/oder Zusatzstoffe, welche die Effektivität des Vakzins verstärken. Beispiele von Zusatzstoffen, welche effektiv sein können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Aluminiumhydroxid; N-Acetylmuramyl-L-Threonyl-D-Isoglutamin (thr-MDP); N-Acetyl-nor-muramyl-L-Alanyl-D-Isoglutamin (CGP 11637, bezeichnet als nor-MDP); N-Acetylmuramyl-L-Alanyl-D-Isoglutaminyl-L-Alanin-2-(1'-2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (CGP 19835A, bezeichnet als MTP-PE); und RIBI, welches drei aus Bakterien extrahierte Komponenten enthält, Monophosphoryl-Lipid A, Trehalose-dimycolat und Zellwandskelett (MPL + TDM + CWS) in einer 2%igen Squalen/Tween 80 Emulsion. Die Effektivität eines Zusatzstoffs kann durch Messung der Menge der gegen das Immunogen gerichteten Antikörper bestimmt werden, welche aus der Verabreichung des Immunogens in Vakzinen resultiert, welche auch aus den unterschiedlichen Zusatzstoffen bestehen. Derartige zusätzliche Formulierungen und Verfahren der Verabreichung, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, können auch verwendet werden.
  • 50 kDa Arg-Gingipain oder Hochmolekulargewicht-Arg-Gingipain und Fragmente davon können in Vakzinen als neutrale oder als Salzformen formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die Säureadditionssalze (gebildet mit freien Aminogruppen des Peptids), welche mit anorganischen Säuren gebildet werden, z. B. Chlorwasserstoffsäure oder Phosphorsäuren; und organischen Säuren, z. B. Essig-, Oxal-, Wein-, oder Maleinsäure. Mit den freien Carboxylgruppen gebildete Salze können auch hergeleitet werden von anorganischen Basen, z. B. Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, oder Eisenhydroxiden, und organischen Basen, z. B. Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylamino-ethanol, Histidin und Procain.
  • Die Vakzine werden in einer für die Dosierungsformulierung geeigneten Weise verabreicht und in einer derartigen Menge, die prophylaktisch und/oder therapeutisch effektiv sein wird. Die zu verabreichende Menge, welche im allgemeinen im Bereich von etwa 100 bis 1000 μg Protein pro Dosis ist, allgemeiner im Bereich von etwa 5 bis 500 μg Protein pro Dosis, hängt von dem zu behandelnden Fall ab, der Kapazität des Immunsystems des Individuums zur Synthese von Antikörpern und dem Grad des gewünschten Schutzes. Genaue Mengen des Wirkstoffes, die verabreicht werden sollen, können von dem Urteil des Arztes oder Zahnarztes abhängen und können einzigartig für jedes Individuum sein, aber eine derartige Bestimmung liegt im Können eines solchen Praktikers.
  • Die Vakzine oder eine andere immunogene Zusammensetzung (können) kann in einer einzigen Dosis oder einem Mehrfachdosenschema gegeben werden. Ein Mehrfachdosenschema ist eines, in welchem eine erste Impfphase ein bis zehn oder mehr separate Dosen umfassen kann, gefolgt von anderen Dosen, die nach Notwendigkeit zu nachfolgenden Zeitintervallen verabreicht werden, um die Immunantwort aufrecht zu erhalten und/oder zu stärken, z. B. nach 1 bis 4 Monaten für eine zweite Dosis, und, falls benötigt, eine nachfolgende Dosis (Dosen) nach einigen Monaten.
  • Rekombinante Arg-Gingipaine sind nützlich für Verfahren zur Identifikation von Mitteln, die Proteinaseaktivität modu lieren, z. B. durch Einwirkung auf die Proteinase selbst. Eines der derartigen Verfahren umfaßt folgende Schritte: Inkubieren von Arg-Gingipain-1 (oder Hochmolekulargewicht-Arg-Proteinase) mit einem vermeintlichen therapeutischen Mittel; Bestimmung der Aktivität der mit dem Mittel inkubierten Proteinase; und Vergleich der in diesem Schritt erhaltenen Aktivität mit der Aktivität einer Kontrollprobe von Proteinase, die nicht mit dem Mittel inkubiert worden ist.
  • Alle hierin zitierten Referenzen werden hiermit durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
  • Wenn nicht hiernach anders angegeben, sind Standardverfahren zum Klonieren, zur DNA-Isolierung, Verstärkung und Reinigung, für enzymatische Reaktionen mit Beteiligung von DNA-Ligase, DNA-Polymerase, Restriktions-Endonukleasen und ähnlichen, und verschiedene Trennungstechniken, solche, die bekannt sind und von einem Fachmann gewöhnlich verwendet werden. Eine Anzahl von Standardverfahren wird beschrieben in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Hrsg.) (1993) Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Hrsg.) (1979) Meth. Enzymol. 68; Wu et al. (Hrsg.) (1983) Meth. Enzymol. 100 und 101; Grossman und Moldave (Hrsg.) Meth. Enzymol. 65; Miller (Hrsg.) (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, Old Primrose (1981) Principles of Gene Manipulation, University of California Press, Berkeley; Schleif und Wensink (1982) Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Hrsg.) (1985) DNA Cloning Vol. I und II, IRL Press, Oxford, UK; Hames und Higgins (Hrsg.) (1985) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK; Setlow und Hollaender (1979) Genetic Engi neering: Principles and Methods: Vols. 1–4, Plenum Press, New York. Die verwendeten Abkürzungen und die verwendete Nomenklatur wird als Standard im Stand der Technik angesehen und gewöhnlich in professionellen Zeitschriften, wie z. B. den hierin zitierten, verwendet.
  • Die vorhergehende Diskussion und die nachfolgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, sollen sie aber nicht einschränken. Der Fachmann wird verstehen, dafl alternative Verfahren verwendet werden können, um die Erfindung auszuführen.
  • Beispiele
  • Beispiel 1 Reinigung von Gingipain-Enzymen
  • Beispiel 1.1 Bakterielle Anzucht
  • P. gingivalis-Stämme H66 (ATCC 33277) und W50 (ATCC 53978) (virulent) wurden in diesen Untersuchungen verwendet. Zellen wurden in 500 ml Brühe, enthaltend 15,0 g Trypticase-Sojabrühe (Difco, Detroit, Michigan), 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 mg Hämin, 0,25 g Cystein, 0,05 g Dithiothreitol, 0,5 mg Menadion (alle von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) anaerob bei 37°C für 48 Stunden in einer Atmosphäre aus 85% N2, 10% CO2, 5% H2 gezüchtet. Die gesamte 500 ml Kultur wurde verwendet, um 20 Liter desselben Mediums zu impfen, und letzteres wurde in einem Fermentierungsbehälter bei 37°C für 48 Stunden (zu einer endgültigen optischen Dichte von 1,8 bei 650 nm) inkubiert.
  • Beispiel 1.2 Reinigung von Niedermolekulargewicht Arg-Gingipain 1200 ml zellfreier Überstand wurde von der 48-Stundenkultur durch Zentrifugation bei 18.000 × g für 30 Min. bei 4°C erhal ten. Proteine in dem Überstand wurden durch 90%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Nach 2 Stunden bei 4°C wurde die Suspension bei 18.000 × g für 30 Min. zentrifugiert. Das resultierende Pellet wurde in 0,05 M Natriumacetatpuffer aufgelöst, pH 4,5, 0,15 NaCl, 5 mM CaCl2; die Lösung wurde über Nacht gegen denselben Puffer bei 4°C dialysiert, mit drei Wechseln mit einer Puffer : Proteinlösung größer als 150 : 1. Das Dialysat wurde dann mit 25.000 × g für 30 Min. zentrifugiert und der dunkelbraune Überstand (26 ml) wurde dann über eine Agarosegelfiltrationssäule (5,0 × 150 cm; Sephadex G-150, Pharmacia, Piscataway, NJ) chromatographiert, welche mit demselben Puffer voreingestellt worden war. Die Säule wurde mit dem Puffer bei einer Flußgeschwindigkeit von 36 ml/h entwickelt. 6 ml Fraktionen wurden gesammelt und sowohl für amidolytische und proteolytische Aktivitäten getestet, unter Verwendung von Bz-L-Arg-pNA und Azocasein als Substrate. Vier amidolytische Aktivität enthaltene Peaks wurden identifiziert (1). Die Peak 4 entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, durch Ultrafiltration (Amicon PM-10 Membran; Amicon, Beverly, MA) konzentriert und dann über Nacht gegen 0,05 Bis-Tris, 5 mM CaCl2, pH 6,0 dialysiert. Das Volumen des Dialysats war 14 ml.
  • Das 14 ml Dialysat aus dem vorherigen Schritt wurde dann auf eine Säule (1 × 10 cm) mit DEAE-Zellulose (Whatman, Maidstone, England) gegeben, die mit 0,05 mM Bis-Tris, 5 mM CaCl2, pH 6,0 eingestellt worden war. Die Säule wurde dann mit zusätzlichen 100 ml desselben Puffers gewaschen. Etwa 75% der amidolytischen Aktivität, aber nur etwa 50% des Proteins, passierten durch die Säule. Die Säulenwaschflüssigkeit wurde gegen 0,05 Natriumacetatpuffer, enthaltend 5 mM CaCl2 (pH 4,5) dialysiert. Dieses 19 ml Dialysat wurde auf eine Mono S FPLC-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) gegeben, die mit demselben Puffer eingestellt worden war. Die Säule wurde mit dem Startpuffer mit einer Flußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min für 20 Minuten gewaschen. Gebundene Proteine wurden zuerst mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 bis 0,1 M) eluiert, gefolgt von einem zweiten linearen NaCl Gradienten (0,1 bis 0,25 M), wobei jeder Gradient über eine Zeitspanne von 25 Minuten angewendet wurde. Die Fraktionen wurden für amidolytische Aktivität unter Verwendung von Bz-L-Arg-pNA getestet. Fraktionen mit Aktivität wurden zusammengeführt und unter Verwendung derselben Bedingungen wieder chromatographiert. Obwohl nicht detektierbar durch Gelelektrophorese, wurde manchmal eine Spurenverunreinigung durch eine zur Spaltung nach Lysylresten fähige Proteinase beobachtet. Diese verunreinigende Aktivität wurde leicht entfernt, indem die Probe auf eine Arginyl-Agarose-Säule (L-Arginyl-SEPHAROSE 4B) gegeben wurde, die mit 0,025 M Tris-HCl, 5 mM CaCl2, 0,15 M NaCl, pH 7,5 eingestellt worden war. Nach Waschen mit demselben Puffer wurde gereinigtes Enzym mit 0,05 M Natriumacetatpuffer, 5 mM CaCl2, pH 4,5 eluiert. Ausbeuten an Gingipain-1 wurden durch diesen Schritt deutlich reduziert (etwa 60%).
  • Beispiel 1.3 Reinigung von Hochmolekulargewicht-Arg-Gingipain
  • Der Kulturüberstand (2,900 ml) wurde durch,Zentrifugation der gesamten Kultur erhalten (6000 × g, 30 Min., 4°C). Gekühltes Aceton (4,350 ml) wurde zu dieser Fraktion über eine Dauer von 15 Minuten gegeben, wobei die Temperatur der Lösung unter Verwendung eines Eis-/Salzbades immer unter 0°C gehalten wurde, und diese Mischung wurde zentrifugiert (6000 × g, 30 Min., – 15°C). Der Niederschlag wurde in 290 ml von 20 mM Bis-Tris-HC1, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0,02% (w/v) NaN3, pH 6,8 (Puffer A) aufgelöst, und gegen Puffer A, enthaltend 1,5 mM 4,4'-Dithiodipyridindisulfid für 4 Stunden dialysiert, gefolgt von zwei Wechseln von Puffer A über Nacht. Die dialysierte Fraktion wurde zentrifugiert (27.000 × g, 30 Min, 4°C), wonach sie durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon PM-10-Membran auf 40 ml konzentriert wurde. Diese konzentrierte Fraktion wurde auf eine Sephadex G-150 Säule gegeben (5 × 115 cm = 2260 ml; Pharmacia, Piscataway, NJ), welche zuvor mit Puffer A eingestellt worden war, und die Fraktionierung wurde mit 30 ml/h (1,5 cm/h) durchgeführt. Fraktionen (9 ml) wurden auf ihre Aktivität gegen Bz-L-Arg-pNa und Z-L-Lys-pNa (Novabiochem; 0,5 mM) untersucht. Amidolytische Aktivitäten für Bz-L-Arg-pNa (0,5 mM) oder Z-L-Lys-pNa wurden in 0,2 M Tris. HCl, 1 mM CaCl2, 0,02% (w/v) NaN3, 10 mM L-Cystein, pH 7,6 gemessen. Die allgemeine proteolytische Aktivität wurde mit Azocasein (2% w/v) gemessen, wie von Barrett and Kirschke (1981) Meth. Enzymol. 80, 535–561 für Cathepsin L. beschrieben. Drei Peaks mit Aktivität gegen die beiden Substrate wurden gefunden. Der erste Aktivitätspeak (höchstes Molekulargewicht) wurde zusammengeführt, auf 60 ml unter Verwendung von Ultrafiltration konzentriert und über Nacht gegen zwei Wechsel von 50 mM Tris-HCl, 1 mM CaCl2, 0,02% NaN3, pH 7,4 (Puffer 8) dialysiert.
  • Diese Hochmolekulargewichts-Fraktion wurde auf eine L-Arginin-Sepharose-Säule (1,5 × 30 cm = 50 ml) gegeben, welche vorher mit Puffer B bei einer Flußgeschwindigkeit von 20 ml/h (11,3 cm/h) eingestellt worden war, wonach die Säule mit zwei Säulenvolumen Puffer B gewaschen wurde. Danach wurde ein Stufengradient von 500 mM NaCl in Puffer B angewendet und die Säule wurde mit dieser Konzentration von NaCl gewaschen, bis die A280-Basislinie auf Null fiel. Nach Wiedereinstellung der Säule mit Puffer B wurde ein Gradient von 0 bis 750 mM L-Lysin in einem Gesamtvolumen von 300 ml angewandt, gefolgt von 100 ml von 750 mM L-Lysin. Die Säule wurde noch einmal mit Puffer B erneut eingestellt und ein weiterer Gradient bis 100 mM L- Arginin in 300 ml wurde in derselben Weise angewandt. Fraktionen (6 ml) der Arg-Wäsche wurden auf Aktivität gegen die zwei Substrate wie zuvor beschrieben getestet. Der Arginingradient eluierte einen Hauptpeak für ein Enzym, das Bz-L-Arg-pNa abbaut. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengeführt und unter zweimaligem Wechseln von 20 mM Bis-Tris-HCl, 1 mM CaCl2, 0,02% (v/w) NaN3, pH 6,4 (Puffer C) dialysiert und auf 10 ml unter Verwendung einer Amicon PM-10-Membran konzentriert.
  • Das Konzentrat mit Aktivität für die Spaltung von Bz-L-Arg-pNa wurde auf eine mit Puffer C eingestellte Mono-Q FPLC-Säule (Pharmacia LKB Biotechnology Inc, Piscataway, NJ) gegeben, die Säule wurde mit 5 Säulenvolumen Puffer C bei 1,0 ml/Min. gewaschen, wonach gebundenes Protein mit einem 3-Stufen-Gradienten [0–200 mM NaCl (10 min), gefolgt von 200–250 mM NaCl (15 Min) und 250–500 mM NaCl (5 Min.)] eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen aus Mono-Q wurden zusammengeführt und für weitere Analysen verwendet.
  • Beispiel 2 Molekulargewichtsbestimmung
  • Das Molekulargewicht des gereinigten Arg-Gingipain-1 wurde durch Gelfiltration auf einer Superose 12 Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) und durch Tricin-SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese geschätzt. In letzterem Fall wurde 1 mM TLCK verwendet, um die Protease vor dem Kochen zu inaktivieren, und so autoproteolytische Verdauung zu verhindern.
  • Beispiel 3 Enzym Assays
  • Amidolytische Aktivitäten von P. gingivalis Proteinasen wurden mit den Substraten MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA mit einer Konzentration von 0,5 mM, Suc-Ala-Ala-Ala-pNA (0,5 mM), Suc-Ala- A1a-Pro-Phe-pNA (0,5 mM); Bz-Arg-pNA (1,0 mM), Cbz-Phe-Leu-G1u-pNA) (0,2 mM) gemessen; S-2238, 5-2222, S-2288 und S-2251 jeweils mit einer Konzentration von 0,05 mM; in 1.0 ml von 0.2 M Tris-HCl, 5 mM CaCl2, pH 7,5. In einigen Fällen wurden entweder 5 mM Cystein und/oder 50 mM Glycylglycin (Gly-Gly) zu der Reaktionsmischung zugegeben.
  • Für Routineassays, pH-Optimumsbestimmung und Messung des Effektes von stimulierenden Mitteln und Inhibitoren auf Trypsinähnliche Enzyme wurde nur Bz-L-Arg-pNA als Substrat verwendet. Potentielle Inhibierungs- oder Stimulierungsverbindungen wurden mit dem Enzym für bis zu 20 Minuten bei Raumtemperatur bei pH 7,5, in Gegenwart von 5 mM CaCl2 (außer, wenn die Effekte von Chelatisierungsmitteln getestet wurden) vor dem Essay auf Enzymaktivität präinkubiert.
  • Allgemeine proteolytische Aktivität wurde unter Verwendung desselben Puffersystems getestet, wie für die Bestimmung von amidolytische Aktivität beschrieben, aber unter Verwendung von Azocoll oder Azocasein (1% w/v) als Substrat.
  • Eine enzymatische Einheit der Arg-Gingipain-l-Enzymaktivität basiert auf dem spektroskopischen Assay unter Verwendung von Benzoyl-Arg-p-Nitroanilid als Substrat und Aufnahme der Δ-Absorptionseinheiten bei 405 nm/min/Absorptionseinheit bei 280 nm gemäß dem Verfahren nach Chen et al. (1992), siehe oben.
  • Beispiel 4 Enzymspezifität
  • Gereinigtes Arg-Gingipain-1 (0,8 μg) in 50 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer, pH 7,7, 5 mM CaCl2 wurde mit 2 mM Cystein für 10 Minuten präinkubiert, gefolgt von der Zugabe von entweder oxidierter Insulin-B-Kette (225 μg) oder Melittin (225 μg) bei 25°C. Proben wurden nach verschiedenen Zeitintervallen entnom men und die Reaktionsmischungen wurden einer HPLC ("reverse phase"-Säule, MicroPak SP C-18-Säule) unter Verwendung von linearen Gradienten (0,08% Trifluoressigsäure bis 0,08% Trifluoressigsäure plus 80% Acetonitril, über eine Zeitspanne von 45 Minuten (F1ießgeschwindigkeit 1,0 ml/Min.) unterworfen. Peptide wurden durch Überwachung von A220 detektiert. Produkt-Peaks wurden gesammelt und einer Aminosäureanalyse und/oder einer Sequenzanalyse am aminoterminalen Ende unterworfen.
  • Beispiel 5 Aminosäuresequenzanalyse
  • Sequenzanalyse der aminoterminalen Aminosäuren von entweder Arg-Gingipain-1 oder Abbauprodukten von proteolytischen Reaktionen wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems 4760A Gasphasensequenators durchgeführt, unter Verwendung des vom Hersteller entworfenen Programmes.
  • Die Aminosäuresequenz des COOH-Endes von SDS-denaturiertem Arg-Gingipain-1 und von Arg-Gingipain-2 wurden bestimmt. 10 nmol-Aliquote von Gingipain-1 wurden in 0,2 M N-Ethylmorpholinacetat Puffer, pH 8,0, mit Carboxypeptidase A und B bei Raumtemperatur unter Verwendung von 1 : 100 bzw. 1 : 50 molaren Verhältnissen verdaut. Proben wurden nach Intervallen von 0 bis 12 Stunden entfernt, gekocht, um die Carboxypeptidase zu inaktivieren, und das Protein wurde mit 20% Trichloressigsäure gefällt. Die Aminosäureanalyse wurde mit den Überständen durchgeführt.
  • Beispiel 6 Materialien
  • MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, Gly-PropNA, Suc-Ala-Ala-Ala-pNA, Bz-Arg-pNA, Diisopropylfluorphosphat, Phenylmethylsulfonylfluorid, Tosyl-L-Lysinchlormethylketon (TLCK), Tosyl-L-Phenylalaninchlormethylketon (TPCK), trans-Epoxysuccinyl-L-Leucylamid-(4-guanidino)butan), ein Inhibitor für Cysteinproteinasen, Leupeptin, Antipain und Azocasein wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO erhalten. 3,4-Dichlorisocoumarin wurde von Boehringer, Indianapolis, IN erhalten und CBz-Phe-Leu-Glu-pNA und Azocoll wurden von Calbiochem, La Jolla, CA erhalten. S-2238 (D-Phe-Pip-Arg-pNA), 5-2222 (Bz-Ile-Glu-(γ-OR)-Gly-Arg-pNA), S-2288 (D-Ile-Pro-ArgpNA) und S-2251 (D-Val-Leu-Lys-pNA) wurden von Kabi-Vitrum (Beaumont, Texas) erhalten.
  • Beispiel 7 Elektrophorese
  • SDS-PAGE von Arg-Gingipain-1 wurde wie bei Laemmli (1970) Nature 227: 680–685 durchgeführt. Vor der Elektrophorese wurden die Proben in einem Puffer gekocht, der 20% Glycerol, 4% SDS und 0,1% Bromphenol Blau enthält. Die Proben wurden unter reduzierenden Bedingungen laufen gelassen, indem 2% β-Mercaptoethanol zugegeben wurde, sofern nicht anderweitig angemerkt. Die Proben wurden vor dem Aufbringen auf die Gele für 5 Minuten bei 100°C erhitzt. Ein 5–15%iges Gradientengel wurde für die anfänglichen Verdaue von C3 und C5 verwendet, und die Gele wurden anschließend mit Coomassie Brilliant Blue R gefärbt. Der C5 Verdau, welcher verwendet wird, um Zerlegungsprodukte vor und nach der Reduktion der Disulfidbindungen sichtbar zu machen, wurde einer Elektrophorese in einem 8%igen Gel unterworfen. Versuche, C5a bei dem C5a-Verdau sichtbar zu machen, wurden unter Verwendung von 13%igen Gelen durchgeführt, die mit Silberfärbung gemäß dem Verfahren von Merril et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci USA 76, 4335-4340 entwickelt wurden.
  • In einigen Experimenten (Hochmolekulargewichts-Formen) wurde SDS-PAGE unter Verwendung von Tris-HCl/Tricin-Puffer nach Shagger und Van Jagow (1987) Analyt. Biochem. 166, 368–379, ausgeführt.
  • Elektrophorese auf Zelluloseazetatstreifen wurde in 0,075 Barbital-Puffer bei pH 8,5 und 4°C für 30 Min. bei 200 V durchgeführt. Ein Beckman Microzone Apparat (Modell R101) wurde für die Elektrophorese des Proteins verwendet, und die Streifen wurden unter Verwendung von Amido Black gefärbt.
  • Beispiel 8 Oligonukleotidsynthese
  • Oligonukleotid-Primer für PCR-Sonden und das Sequenzieren wurden nach der Phosphoramiditmethode mit einem automatisierten Applied Biosystems Modell 394 DNA-Syntheseapparat (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert und durch PAGE gereinigt und auf Sep-Pak (Millipore Corp., Beverly, MA) unter Verwendung von Standardvorschriften entsalzt. Der Primer GIN-1-32 wurde entworfen, um an den nicht-kodierenden Strang der Arg-Gingipain-DNA zu binden, welche dem NH2-terminalen Teil des reifen Proteins entspricht, d. h. an die Sequenz, die die Aminosäuren 2–8 innerhalb von SEQ ID No: 1 kodiert. Die Sequenz des 32-Basenprimers besteht aus 20 Basen, die spezifisch für Arg-Gingipain sind, und sechs zusätzlichen Basen am 5'-Ende (unterstrichen), wie folgt: 5'-GGCTTTACNCCNGTNGARGARYTNGA-3' (SEQ ID No: 6), wobei N ein A oder G oder C oder T ist. Der Primer GIN-2-30 wurde entworfen, um an den kodierenden Strang der Arg-Gingipain-DNA zu binden, die den Aminosäuren 25–32 des reifen Proteins entsprechen, d. h. den Resten 25–32 der SEQ ID NR. 1. Die Sequenz des 30-Basen-Primers besteht aus 24 Basen, die spezifisch für Gingipain-1 (und Gingipain-2) -DNA sind, und sechs zusätzlichen Basen am 5'-Ende (unterstrichen) wie folgt: 5'-GGCTTTRTTYTTCCARTCNACRAARTCYTT-3', wobei R, A oder G ist, Y, C oder T ist und N, A oder G oder C oder T ist (SEQ ID No: 7). Primer GIN-8S-48: 5'-CCTGGAGAATTCTCGTATGATCGTCATCGTAGCCAAAAAGTATGAGGG-3'd (SEQ ID No: 8) wurde entworfen, um an den nicht-kodierenden Strang der Arg-Gingipain-DNA zu binden, der den Aminosäuren 11–22 des reifen Proteins entspricht, d. h. den Aminosäuren 11–22 der SEQ ID No: 1, und wurde auf der Basis von partieller DNA-Sequenzinformation für die Arg-Gingipain-kodierende Sequenz (Nukleotide 1659–1694 der SEQ ID No: 3) entworfen und beinhaltete eine 6-Basen EcoRI-Restriktions-Schnittstelle plus sechs zusätzliche Basen am 5'-Ende (unterstrichen). Dieser Primer wurde als eine Sonde verwendet, um eine genomische λDASH P. gingivalis DNA-Genbank zu screenen (siehe unten). Ein zusätzliches Oligonukleotid GIN-14-20 (20-mer), das ursprünglich zur Sequenzierung von Arg-Gingipain-DNA entworfen worden war, wurde als Sonde verwendet, um das 3'-Ende der Gingipain-l-kodierenden Sequenz zu identifizieren und dann als eine PstI-HindIII-Sequenz zu klonieren. Der Primer GIN-14-20 wurde entworfen, um an den nicht-kodierenden Strang der Gingipain-1-DNA zu binden, der den 20 Basen entspricht, die für das 3'-Ende von Arg-Gingipain spezifisch sind (Nukleotide 2911-2930 innerhalb der SEQ ID No: 3): 5'-ATCAACACTAATGGTGAGCC-3' (SEQ ID No: 9). Insgesamt wurden 71 20-mere als interne Primer unter Verwendung einer empirisch bestimmten Sequenz entworfen, um den Arg-Gingipain-Locus zu sequenzieren.
  • Beispiel 9 Polymerase Ketten Reaktion
  • Die gesamte zelluläre DNA des P. gingivalis-Stammes H66 wurde bei der PCR als DNA-Templat eingesetzt. Die PCR wurde betrieben unter Verwendung von Primer GIN-1-32 (SEQ ID No: 6) zusammen mit Primer GIN-2-30 (SEQ ID No: 7); die PCR ergab konsistent ein einziges 105-Basenpaarprodukt (P105), das auf einem 7%igen Acrylamidgel detektiert wurde, und das eine teilweise Gingipain-DNA darstellte. Nach Behandlung mit dem Klenow-Enzym wurde P105 in pCR-ScriptTMSK(+) (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert. Nach der Sequenzanalyse von P105 wurde der spezifische Primer GIN-8S-48 (SEQ ID No: 8) entworfen, um als eine Sonde zu dienen. Die 32P-markierte GIN-8S-48-Sonde wurde durch Kinasereaktion für die Verwendung in nachfolgendem Hybridisierungs-Screening der λDASH-Genbank generiert. Eingebaute Nukleotide wurden von nicht eingebauten Nukleotiden auf einer Sephadex G-25-Säule getrennt (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN).
  • Beispiel 10 Konstruktion und Screening der genomischen DNA-Genbank
  • λDASH und λZAP DNA-Genbanken wurden gemäß den Vorschriften von Stratagen konstruiert, unter Verwendung des lambda DASHTM II/BamHI "Cloning-Kit" und DNA-Präparationen von den P. gingi- valis-Stämmen H66 und W50. Bibliotheken von 3 × 105 unabhängigen recombinanten Klonen wurden unter Verwendung von P. gingivalis H66 DNA erhalten und 1,5 × 105 unabhängige rekombinante Klone wurden von P. gingivalis W50 DNA erhalten.
  • Ungefähr 3 × 105 Phagen wurden auf 5 × 150 mm Agarplatten gezüchtet, als Duplikat auf unterstützte Nitrozellulose-Transfermembranen (BAS-NC, Schleicher & Schuell, Keene, NH) gehoben, hybridisiert mit der oben beschriebenen 32P-markierten GIN-8S-48 Sonde. Hybridisierungen wurden über Nacht bei 42°C durchgeführt in 2X Denhardt-Lösung (Denhardt, D. T. (1966), Biochem. Biophys. Res. Comm. 23, 641–646), 6X SSC (SSC ist 15 mM Natriumcitrat, 150 mM NaCl), 0,4% SDS (w/v), 500 μg/ml Fischsperma DNA. Die Filter wurden bei 48°C in 2X SSC (w/v), der 0,05% SDS (s/v) enthielt, gewaschen. Sieben positiv hybridisierende Plaques wurden gereinigt. Nach Extraktion und Reinigung wurde die DNA durch Restriktionsenzym-Verdau und Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Das 3kb-PstI-Fragment von K1on A1 (P. gingivalis H66) wurde nachfolgend in pBluescript SK(–) (Stratagene, La Jolla, CA) und M13mp18 und 19 kloniert und sequenziert. Nach Restriktionsanalyse des Al-Klons wurde ein SmaI/BamHI-Fragment dann in pBluescript SK(–) kloniert. Ein kleineres PstI/BamHI-Fragment wurde für Sequenzierungszwecke in M13mp18 und 19 subkloniert. 3,5 und 0,5 kb-BamHI-Fragmente aus der λZAP P. gingivalis W50 DNA-Genbank wurden in pBluescript SK(–) und M13mp18 und 19 kloniert und sequenziert. Standardvorschriften für cDNA-Genbank-Screening, lambda Phagen Reinigung, Agarosegelelektrophorese und Plasmid-Klonierungen wurden verwendet (Maniatis et al. (1982), siehe oben).
  • Beispiel 11 Southern Blot Analyse
  • Die Membranen wurden, wie oben beschrieben, gewaschen. Mit BamHI, HindIII- oder PstI-verdaute P. gingivalis H66 DNA-Proben wurden mit 32P-markierten GIN-8S-48 hybridisiert. Zwei BamHI-Fragmente von ungefähr 9,4 und 3,5 kb, und zwei PstI-Fragmente von ungefähr 9,4 und 3 kb wurden gefunden. Es wurde kein HindIII-Fragment gesehen. Die mit BamHI- und PstI-verdaute λDASH DNA enthüllte nach Screening und Reinigung von positiven rekombinanten Klonen aus der Genbank einen Klon (A1) mit einem 3,5 kb BamHI-Fragment und einem 3 kb PstI-Fragment; einen Klon (B1) mit einem 9,4 kb BamHI-Fragment und einem 9,4 kb PstI-Fragment; und 5 Klone mit einem 9,4 kb BamHI-Fragment und einem 10 kb PstI-Fragment. Der A1-Klon wurde sequenziert, weil vorausgesagt wurde, daß die ein 50-kDa-Protein kodierende DNA ungefähr 1,35 kb groß ist. Um das Stopkodon von Arg-Gingipain-2 zu klonieren, wurde P. gingivalis DNA aus einem Doppelverdau mit PstI/HindIII mit 32P-markiertem GIN-14-20 hybridisiert. Ein PstI/HindIII-Fragment von ungefähr 4,3 kb wurde gefunden. Dieses Fragment wurde durch Gel gereinigt und zum Sequenzieren in pBluescipt SK(–) kloniert. Kleinere Fragmente (PstI/SmaI und BamHI/HindIII) wurden auch in M13mp18 und 19 subkloniert und sequenziert, und es wurde gefunden, daß sie das Stopkodon enthalten. Die vorstehende Tabelle 2 zeigt hierin (siehe auch SEQ ID No: 10) etwa 7 kb einer Sequenz, die sich von einer PstI-Schnittstelle aufwärts des Startkodons bis zu einer HindIII-Schnittstelle abwärts von dem Ende des Stopkodons des Präpolyproteins erstreckt.
  • Beispiel 12 DNA-Sequenzierung
  • In pBluescript SK(–) klonierte doppelsträngige DNA und in M13mp18 und 19 klonierte einzelsträngige DNA wurden durch das Dideoxyterminationsverfahren(Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467) unter Verwendung von United States Biochemicals (Cleveland, OH; Sequenase version 2.0) gekauften "Sequenzierungs-Kits" sequenziert. Die DNA wurde unter Verwendung von M13 Universal-Primer, revers sequenzierendem Primer und internen Primern segenziert, wie im Stand der Technik wohlbekannt.
  • Konkordanzliste zu den Sequenzlisten
  • In den Sequenzlisten (Sequence Listing) bedeutet:
    General Information Allgemeine Information
    Applicant Anmelder
    Title of Invention Titel der Erfindung
    Number of Sequences Anzahl der Sequenzen
    Correspondence Address Korrespondenzadresse
    Addressee Adressat
    Street Straße
    City Stadt
    State Staat
    Country Land
    ZIP PLZ
    Computer Readable Form computerlesbare Form
    Medium Type Speichermedium
    Operating System Betriebssystem
    Current Application Data Daten der vorliegenden Anmeldung
    Application Number Anmeldungsnummer
    Filing Date Anmeldetag
    Classification Klassifizierung
    Prior Application Data Daten der Prioritätsanmeldung
    Attorney/Agent Information Anwaltsinformation
    Name Name
    Registration Number Registrationsnummer
    Reference/Docket Number Referenznummer
    Information for SEQ ID NO Information über SEQ ID NO
    Sequence Characteristics Sequenzcharakteristika
    Length Länge
    (amino acids) (Aminosäuren)
    (base pairs) (Basenpaare)
    Type Typ
    amino acid Aminosäure
    nucleic acid Nukleinsäure
    Strandedness Strängigkeit
    single einfach
    double doppelt
    Topology Topologie
    Molecule Type Molekültyp
    peptide Peptid
    protein Protein
    DNA (genomic) DNA (genomisch)
    DNA (other nucleic acid) DNA (andere Nukleinsäure)
    Hypothetical Hypothetisch
    No Nein
    Anti-Sense Nicht-kodierend
    Fragment-Type Fragmenttyp
    N-terminal N-terminal
    internal intern
    C-terminal C-terminal
    Original Source Originalquelle
    Organism Organismus
    Strain Stamm
    Sequence Description Sequenzbeschreibung
    Feature Merkmal
    Name/Key Name/Schlüssel
    Location Ort

Claims (13)

  1. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend eine Nucleotid-Sequenz, die ein Arg-gingipain-Protein mit einer enzymatisch aktiven Protease-Komponente und mindestens eine Hämagglutinin-Komponente kodiert, wobei die mindestens eine Hämagglutinin-Komponente eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure 720 bis Aminosäure 1091, Aminosäure 1092 bis Aminosäure 1429 und Aminosäure 1430 bis Aminosäure 1704, wie in SEQ ID NO. 11 angegeben.
  2. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Nucleotid-Sequenz, die die mindestens eine Hämagglutinin-Komponente kodiert, ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Nucleotid 3106 bis Nucleotid 4221, Nucleotid 4222 bis Nucleotid 5235 und Nucleotid 5236 bis Nucleotid 6160, wie in SEQ ID NO. 10 angegeben.
  3. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz der enzymatisch aktiven Protease-Komponente eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure 1 bis Aminosäure 510, wie in SEQ ID NO. 4 angegeben, Aminosäure 228 bis Aminosäure 719, wie in SEQ ID NO. 11 angegeben, und einer Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Aminosäuresequenzidentität mit Aminosäure 228 bis Aminosäure 719, wie in SEQ ID NO. 11 angegeben.
  4. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 3, wobei die Nucleotidsequenz, die die enzymatisch aktive Protease-Komponente kodiert, eine Sequenz ist, wie in einer der SEQ ID NO. 3 von Nucleotid 1630 bis Nucleotid 3105 und SEQ ID NO. 10 von Nucleotid 1630 bis Nucleotid 3105 angegeben, oder eine Nucleotidsequenz mit mindestens 70% Homologie zu einer der genannten Sequenzen ist.
  5. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 1, wobei das Arggingipain innerhalb einer Sequenz von Nucleotid 949 bis Nucleotid 6063, wie in SEQ ID NO. 10 angegeben, oäer einer Nucleotidsequenz mit mindestens 70% Sequenzhomologie dazu kodiert wird.
  6. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 5, wobei das Arggingipain als ein Prepolyprotein mit einer Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO. 11 angegeben, exprimiert wird.
  7. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 6, wobei die Nucleotidsequenz, die das Polyprotein kodiert, Nucleotid 949 bis Nucleotid 6063, wie in SEQ ID NO. 10 angegeben, ist.
  8. Eine reine P. gingivalis Arginin-spezifische Präparation mit hohem Molekulargewicht, umfassend ein Arg-gingipain-Protein, wobei das Arg-gingipain-Protein eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminosäure 720 bis Aminosäure 1091, Aminosäure 1092 bis Aminosäure 1429 und Aminosäure 1430–1704, wie in SEQ ID NO. 11 angegeben, umfaßt.
  9. Präparation nach Anspruch 8, wobei die Protease-Komponente eine Rminosäuresequenz hat, wie in einer der SEQ ID No. 4 von Aminosäure 1 bis Aminosäure 510 und SEQ ID NO. 11 von Aminosäure 228 bis Aminosäure 719 angegeben.
  10. Präparation nach Anspruch 8, wobei die mindestens eine Hämagglutinin-Komponente eine scheinbares Molekulargewicht hat, das ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus 44 kDa, 27 kDa und 17 kDa.
  11. Immunisierende Zusammensetzung, umfassend eine Arggingipain-Präparation nach Anspruch 8 und einen geeigneten Träger dafür.
  12. Zusammensetzung, umfassend eine Arg-gingipain-Präparation nach Anspruch 8 und einen geeigneten Träger dafür, wobei das Arg-gingipain rekombinant ist und von P. gingivalis erhalten wird.
  13. Verwendung eines gereinigten rekombinanten Arg-gingipain, erhalten von P. gingivalis, zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung zum Schützen eines Tieres gegen entzündliche Reaktion und Gewebeschaden, ausgelöst durch P. gingivalis bei einer peridontalen Krankheit.
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