DE4412372A1

DE4412372A1 - Endothelinkonversionsenzym (ECE)

Info

Publication number: DE4412372A1
Application number: DE19944412372
Authority: DE
Inventors: Burkhard Dr Kroeger; Harald Dr Seulberger; Thomas Dr Subkowski; Heinz Dr Hillen; Elard Dr Jacob; Thomas Dr Meyer; Rainer Dr Otter; Martin Dr Schmidt
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1994-04-12
Filing date: 1994-04-12
Publication date: 1995-10-19

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Endothelinkonversionsenzyme, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Erhöhte Endothelinspiegel werden mit einer Vielzahl von Erkran kungen wie essentielle Hypertonie, Herzinfarkt, akutes Nieren versagen, Schock oder Herzversagen in Zusammenhang gebracht. Auf einen solchen Zusammenhang lassen auch mit Endothelin-Antikörpern erzielbare Ergebnisse schließen. In Tiermodellen konnte damit die Größe eines Herzinfarkt es dosisabhängig verringert (Watanabe et al., Nature 344, 114 (1990)), die Nierenfunktion positiv be einflußt (Kon et al., J. Clin. Invest. 83, 1762 (1989)), und die Nephrotoxizität von Cyclosporin herabgesetzt werden (Kon et al., Kidney Int. 37, 1487 (1990)).

Endothelinkonversionsenzym (ECE-1) setzt Endothelin 1 aus dem 38 Aminosäuren bestehenden Vorläufermolekül Big-Endothelin-1 frei. Den von Endothelin-1 hervorgerufenen unerwünschten biologischen Effekten läßt sich z. B. durch Inhibierung des Endothelinkon versionsenzyms und damit der Endothelin-1 Biosynthese entgegen wirken.

Es sind Enzymaktivitäten, die Endotheline bzw. endothelinähnliche Moleküle aus den entsprechenden Vorläufermolekülen, den Big-Endo thelinen freisetzen, aus verschiedenen Zellinien isoliert worden (Takeda et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, 860 (1991), Ohnaka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 168, 1128 (1990); Matsumura et al. FEBS Lett. 293, 45 (1992), Ahn et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8606 (1992), PCT WO 92/13944, Ohnaka et al. Clin. Exp. Hypertension A 14; Nr. 4 (1992), Okada et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991), Takada et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 182, 1383 (1992), Opgenorth et al. FASEB 6, 2653 (1992)).

Diese Enzymaktivitäten sind jedoch bisher unzureichend charak terisiert worden. Sie liegen als wenig angereicherte Enzym mischungen vor. Solche unreinen Enzymmischungen sind jedoch für die Verwendung in Testverfahren zum Auffinden von spezifischen ECE-Inhibitoren schlecht geeignet, da andere, physiologisch nicht relevante Fremdproteasen den Enzymtest erheblich stören.

So wird Big-Endothelin beispielsweise auch durch die Serin protease Chymothrypsin sowie durch Papain, Thermolysin und NEP 24.11 zu Endothelin und endothelinähnlichen Produkten gespalten, die in Testverfahren fälschlicherweise dem Enzym ECE zugeordnet werden. Infolgedessen ist die Beschreibung des Endo thelinkonversionsenzyms in der Literatur widersprüchlich.

Die Angaben über das Molekulargewicht des Endothelinkonversions enzyms variieren von 65 KDalton bis 540 KDalton; die Angaben der Km und vmax Werte weichen ebenfalls erheblich voneinander ab (Opgenorth et al. FASEB 6, 2653 (1992); Sawamura et al. Biochem. Biophys. Acta 1161, 295 (1993)). Auch gibt es Widersprüche darüber, ob das Endothelinkonversionsenzym in die Familie der Aspartatproteasen oder der Metalloproteasen einzuordnen ist (Sawamura et al. Biochem. Biophys. Acta 1161, 295 (1993); Biochem. Pharmacol. 43, 845 (1992). Ferner finden sich in der Literatur widersprüchliche Aussagen über charakteristische Angaben, ob es sich bei der Metalloprotease um ein cytoplasmatisches oder membrangebundenes Enzym handelt und welche Substrate von dem jeweiligen ECE umgesetzt werden (Big-Et-1; Big-Et-3): Matsumura et al. (FEBS Lett. 293, 45 (1992)): Takahashi et al. (J. Biol. Chem. 268; 21394 (1993)); Okada et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991)); Ohnaka et al. (Clin. Exp. Hypertension A 14; Nr. 4 (1992)); Matsumura et al. (FEBS Lett. 305; 86 (1992)).

Bisher wurde keine eindeutige Beschreibung des ECE gezeigt, die es ermöglicht, ECE einwandfrei zu definieren. Eine solche Definition kann möglicherweise erst durch das Bestimmen der Primärstruktur, der Aminosäuresequenz, des ECE erfolgen. Hierzu ist es notwendig, ECE zunächst in reiner Form herzustellen.

Es bestand daher die Aufgabe, Endothelinkonversionsenzym in reiner Form bereitzustellen.

Es wurde ein Endothelinkonversionsenzym, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von 250 000 Dalton und die Aminosäurepartial sequenz SEQ ID NO: 1 gefunden.

Das erfindungsgemäße Endothelinkonversionsenzym weist folgende Merkmale auf: Es besitzt ein mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelek trophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen ermitteltes Molekulargewicht von etwa 250 000 Dalton.

Unter reduzierenden Bedingungen zeigt es in der SDS-Polyacryl amidgelelektrophorese eine Bande von 125 000 Dalton; es besteht vermutlich aus einem Homodimer.

Das Endothelinkonversionsenzym ist glykosyliert. Die enzymatische Entfernung der Zuckerreste bewirkt eine Veränderung des apparen ten Molekulargewichts von 125 000 Dalton auf etwa 82 000 Dalton.

Die Sequenzierung von tryptischen Peptiden des Endothelin konversionsenzyms liefert folgende Aminosäurepartialsequenzen SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6
Eine weitere Charakterisierung des erfindungsgemäßen Endothelin konversionsenzyms ist in den Beispielen vorgenommen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Endothelinkonversions enzyme, gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von etwa 250 000 Dalton und eine Aminosäurepartialsequenz, die mindestens 80% Homologie zu SEQ ID NO: 1 aufweisen.

Solche Endothelinkonversionsenzyme lassen sich aus anderen Organismen als Rind, beispielsweise aus menschlichen Zellen isolieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin Endothelinkonversionsenzyme, die die in SEQ ID NO: 30 und SEQ ID NO: 36 beschriebene Polypeptid sequenz oder funktionelle Fragmente davon enthalten.

Unter funktionellen Fragmenten sind solche Teilsequenzen zu verstehen, die noch die enzymatische Aktivität des Endothelin konversionsenzyms, die antigenen Eigenschaften oder die Affinität zu Liganden, beispielsweise Bindeproteinen, besitzen.

Weitere funktionelle Fragmente sind solche Polypeptidsequenzen, 5 die ausgehend von SEQ ID NO: 30 oder NO: 36 durch Insertion, Deletion oder Substitution von Aminosäuren oder Peptiden erhält lich sind, und die noch im wesentlichen die enzymatische Aktivität der Endothelinkonversionsenzyme besitzen und/oder mit den Endothelinkonversionsenzymen der Formel SEQ ID NO: 30 oder NO: 36 immunologisch kreuzreagieren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die für ein Endothelinkonversionsenzym codieren und die aus der Gruppe, die von

a) DNA-Sequenzen mit der in SEQ ID NO: 29 oder SEQ ID NO: 35 beschriebenen Struktur,
b) DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der in SEQ ID NO: 30 oder SEQ ID NO: 36 beschriebenen Struktur codieren, und
c) DNA-Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit DNA- Sequenzen a) oder b) hybridisieren,
d) DNA-Sequenzen, die Proteinprodukte kodieren, welche von Antikörpern erkannt werden, die gegen die Proteine der SEQ ID NO: 30 oder 36 oder Fragmenten davon generiert wurden, gebildet wird,

ausgewählt sind.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 und 1 × SSC (1 × SSC: 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat pH 7,2) zu verstehen. Die experimentellen Bedingungen für DNA-Hybridisierung sind in Lehrbüchern der Gen technik, beispielsweise in Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben.

Die Herstellung solcher DNA Sequenzen ist in Beispiel 8 beschrie ben. DNA Sequenzen, deren Proteinprodukte von Antikörpern erkannt werden, die gegen die Proteine der SEQ ID NO: 30 oder 36 oder Fragmenten davon generiert wurden, lassen sich nach gut beschrie benen Methoden gewinnen.

Die Erzeugung von Antikörpern gegen solche Proteine ist z. B. be schrieben in Hudson, L. u. Hay, F.C., "Practical Immunology", Blackwell Sci. Pub., Oxford, 1980.

Die Verwendung von Antikörpern zur Auffindung von cDNA-Sequenzen, die mit diesen Antikörpern kreuzreagierende Proteine kodieren, ist beispielsweise beschrieben in: "DNA Cloning Vol. I", Glover, D.M., Ed., IRL Press Oxford, 1985.

Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung der Endothelinkonversionsenzyme, die dadurch gekennzeichnet sind, daß Säugerzellen, bevorzugt Endothelzellen, mit einem Inhibitor des Endothelinkonversionsenzyms zur Endothelinkonversionsenzym-Über produktion stimuliert werden und aus diesen Zellen Endothelin konversionsenzym mit üblichen proteinchemischen Maßnahmen iso liert wird.

Für die Induktion des ECE in Säugerzellen können alle ECE- 3 Inhibitoren Verwendung finden. Hierfür geeignete ECE-Inhibitoren sind z. B. beschrieben in JP-146737; JP05148277-A1; Jpn J. Biochem. 64; (8) Abst. 2367 (1992); Derwent NCE-93-0956 (1993); Derwent NCE-93-0971 (1993); J. Med. Chem. 36, 173 (1993); EP 518299-A2. Vorzugsweise findet Phosphoramidon Verwendung. Stimuliert werden die Zellen in Kultur durch Zugabe dieser Inhibitoren zum Zellkulturmedium für 6 Stunden bis zu 6 Tagen. Vorzugsweise wird die Stimulierung jedoch über 2-3 Tage durchge führt. Die angewandten Inhibitorkonzentrationen betragen 10^-2 M bis 10^-7 M, vorzugsweise 10^-3 M bis 10^-4 M.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme ist jedoch auch auf gentechnischem Weg möglich. Aufgrund der beschriebenen Aminosäurepartialsequenzen lassen sich synthetische Oligonukleotide, die diese Sequenzen codieren oder komplementär zu dafür codierenden Sequenzen sind, herstellen. Diese Oligo nukleotide können als Hybridisierungsprobe zur Isolierung der entsprechenden Gene oder der cDNA-Moleküle aus Genpools wie Gen banken oder cDNA-Pools verwendet werden. Diese Art der Gen isolierung ist dem Fachmann aus Lehrbüchern der Molekularbiologie wie Sambrook, Fritsch, Maniatis; Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, USA bekannt.

Mit Hilfe geeigneter synthetischer Oligonukleotide und der Poly merase-Chain-Reaction (PCR) können ebenfalls Teile des Gens bei spielsweise aus cDNA-Banken oder Erststrang cDNA erhalten werden (PCR-Protocols; Academic Press; San Diego; USA; 1990). Oligo nukleotide, die hierfür geeignet sind, lassen sich aus den unter Seq ID No. 1 bis No. 6 beschriebenen Peptiden herleiten durch Übersetzen der Aminosäuresequenz in die doppelsträngige DNA- Sequenz (mit sense und antisense). Hierbei können aufgrund des degenerierten genetischen Codes degenerierte Oligonukleotid gemische aus einem Peptid abgeleitet werden und als Primer Ver wendung finden. Die Oligonukleotide können aus den Peptiden auch unter Berücksichtigung der sogenannten "codon usage"; des preferentiellen Gebrauchs in einer Spezies, in diesem Fall Rind, von bestimmten Nukleotid-Tripletts für eine Aminosäure, abge leitet werden. Die PCR wird dann mit zwei verschiedenen Oligo nukleotiden als Primern durchgeführt, wobei die für die PCR notwendigen zwei Primer sich aus Strang (sense) und Gegenstrang (antisense) der Oligonukleotide zusammensetzen können. Ebenso Verwendung finden können Oligonukleotide, die von Teilen des cDNA-Vektors hergeleitet sind, oder Oligo-dT für den 3′Teil von mRNA.

Diese Genteile können dann wiederum eingesetzt werden, um mit dem Verfahren der Genisolierung das komplette Gen oder die voll standige CDNA zu erhalten.

Auf diese Art lassen sich nicht nur Gene für die Endothelin konversionsenzyme, die exakt die in SEQ ID NO: 1 beschriebene Aminosäurepartialsequenz besitzen, isolieren, sondern auch Gene für Varianten bzw. Endothelinkonversionsenzyme aus anderen Organismen, beispielsweise dem Menschen, die mindestens 80% Homologie auf der Proteinebene zu SEQ ID NO: 1 aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme lassen sich besonders gut herstellen, indem man die entsprechenden Gene isoliert und diese Gene in einem Wirtsorganismus mit üblichen gentechnischen Methoden exprimiert.

Die erfindungsgemäßen ECE oder davon abgeleitete Peptide können verwendet werden zur Herstellung von Antikörpern oder Antikörper fragmenten wie z. B. F_v-Fragmenten, die beispielsweise zur Bestimmung von ECE, in Testverfahren zur Identifizierung von ECE-Hemmern oder als ECE-Inhibitoren eingesetzt werden können.

Solche Antikörper sind generell in der Diagnostik von Erkran kungen, an denen Endothelinkonversionsenzyme beteiligt sind, wertvolle Hilfsmittel.

Für diese Zwecke können auch PCR-Primer, die sich von den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen ableiten, verwendet werden, um beispielsweise die ECE-Transkription zu messen oder den Genotyp zu bestimmen.

Mit Hilfe der erhaltenen Gene können in einer dem Fachmann be kannten Art und Weise Tiere in ihrem Gengut so verändert werden, daß sie ein oder mehrere Extrakopien dieses Gens erhalten oder daß das normale ECE-Gen ausgeschaltet wird. Diese transgenen Tiere eignen sich u. a. für Versuchszwecke.

Die Endothelinkonversionsenzyme selbst eignen sich auch als Wirkstoff zur Herstellung von Arzneimitteln, beispielsweise bei Erkrankungen, bei denen erhöhte Spiegel von ECE-Substraten wie z. B. Bradykinin, Substanz P, Somatostatin, Neuropeptid Y vor liegen. Solche Erkrankungen sind beispielsweise Entzündungen, Asthma, Migräne, Rheuma, zelluläre Prozesse und Zellprolifera tion, die unter Beteiligung von Peptiden als Wachstumsfaktoren ablaufen. Anwendung finden kann ECE als Arzneimittel auch bei Krankheiten, in denen eine Vasodilatation vorliegt, die durch Verabreichen von ECE beseitigt werden kann, z. B. Septischer Schock, Migräne, Potenzstörungen.

Für eine Anwendung von ECE als Arzneimittel kann es unter Umstanden notwendig sein, Teile des ECE mutativ zu verändern. Diese mutativen Veränderungen können beispielsweise zu einem ECE- Derivat führen, das nicht glykosyliert ist oder welches keinen Membrananker enthält (lösliches ECE). Ein solches lösliches ECE, welches keinen Membrananker mehr enthält, kann beispielsweise durch die Expression eines ECE-Fragmentes, welcher eine extra zelluläre, katalytisch wirksame Domäne enthält, hergestellt werden. Solche ECE-Fragmente kann man z. B. gewinnen, indem man die kodierende Sequenz zwischen Aminosäure 20 und 703 aus SEQ ID NO: 25, vorzugsweise zwischen Aminosäure 27 und 703 aus SEP ID NO: 25 mit der DNA Sequenz eines in vivo abspaltbaren Signalpeptid verknüpft und in einem, dem Fachmann bekannten, geeigneten Expressionsvektor in Eukaryontenzellen bringt. Als Signalpeptid eignet sich z. B. die Sequenz des humanen "Tissue Plasminogen Activator" zwischen Aminosäure Position -35 und -4 (Collen, D., Nature 301, 214 bis 221 (1983)). Veränderungen können dabei beispielsweise die Spezifität, die Wirkdauer, die Aufnahme beeinflussen. Ferner können funktionelle Teile von ECE mit Teilen anderer Proteine gekoppelt werden, um neue Proteine zu erzeugen, die als Arzneimittel Anwendung finden. Verändert werden kann ECE auch durch kovalente Modifizierung mit nicht-pepti dischen Molekülen wie z. B. PEG, Dextran, Fettsäuren.

Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen eignen sich auch zur Ver wendung in der Gentherapie, beispielsweise zur Herstellung von gentherapeutischen Medikamenten. Krankheiten mit erhöhten Endo thelin-Werten können auch mit von der ECE-DNA-Sequenz abgeleite ten Oligonukleotiden behandelt werden. Diese Oligonukleotide sind aus dem nicht-kodierenden DNA-Strang (anti-sense) abgeleitet und können als Arzneimittel angewandt werden. Eine hierauf basierende anti-sense-Therapie benutzt vorzugsweise von den Oligonukleotiden abgeleitete stabilere chemische Derivate.

Aus der DNA-Sequenz des ECE können auch Sequenzen abgeleitet wer den, mit denen katalytische RNA-Moleküle erzeugt werden können, sogenannte "ribozymes". Diese katalytischen RNA-Moleküle wirken, indem sie nach Applikation die ECE-RNA oder ECE-DNA spalten oder inaktivieren und dadurch die Proteinsynthese des ECE verhindern.

Die ECE-DNA-Sequenzen können benutzt werden, um mit geeigneten Expressionsvektoren Zellen zu etablieren, die dieses Enzym exprimieren. Diese Zellen finden Verwendung u. a. als Arznei mittel.

Bevorzugt finden die Endothelinkonversionsenzyme in Testverfahren zur Identifizierung von ECE-Hemmstoffen Verwendung. Diese Test verfahren sind in der Regel enzymatische Reaktionen, bei denen die ECE-katalysierte Spaltung eines Substrates in Gegenwart von potentiellen Hemmstoffen gemessen wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Hemmstoffe für Endo thelinkonversionsenzyme, die mit einem Enzymtest unter Verwendung der erfindungsgemäßen Endothelinkonversionsenzyme, identifiziert werden.

Zur Erfindung gehört auch ein Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln, die ein Endothelinkonversionsenzym inhibieren, dadurch gekennzeichnet, daß man bekannte chemische Verbindungen in einen Enzymtest unter Verwendung der erfindungsgemäßen Endo thelinkonversionsenzyme einsetzt und solche mit inhibierender Wirkung identifiziert und die solchermaßen identifizierten Verbindungen mit üblichen Träger- und Hilfsstoffen als Arznei mittel formuliert.

Beispiel 1 Stimulation des ECE-1 in primären Rinderendothelzellen FBHE durch Phosphoramidon

3 Röhrchen mit eingefrorenen FBHE-Rinderendothelzellen (ATCC CRL 1395) wurden in der 14. Passage aufgetaut und in 3 T175-Zell kulturflaschen (Fa. Sarstedt) mit je 40 ml Wachstumsmedium DMEM (Gibco Nr. 041-01965)
+ 5 ml/500 ml Glutamin (200 mM; Gibco 043-05030)
+ 1 ml/500 ml Gentamycin (Gibco 043-05750)
+ Non-Essentielle Aminosäuren; Endkonzentration: 1 × (Gibco Nr. 043-01140)
+ 10% FCS (Gibco Nr. 011-06290; inaktiviert für 37 Minuten bei 56°C) + 25 ng/ml Basischer FGF (Intergen 4125-80))
gegeben. Diese Zellen wurden nach Standardverfahren bei 37°C; in einer Atmosphäre aus 7% CO₂; 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Am darauffolgenden Tag erfolgte ein Mediumswechsel. Bei Erreichen der Konfluenz - in diesem Fall nach 4 Tagen - wurden die Zellen nach Standardverfahren durch Trypsinbehandlung passagiert und in 9 T-175-Flaschen aufgeteilt und zum Wachstum bei 37°C wie beschrieben inkubiert. Nach 3 Tagen und Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen erneut nach Standardverfahren durch Trypsin behandlung aufgeteilt auf 20 T-Flaschen. Nach weiteren 3 Tagen konnten die Zellen auf 40 T-Flaschen aufgeteilt werden. Nach wei teren 3 Tagen wurden 39 dieser T-Flaschen auf 78 T-Flaschen auf geteilt. Da diese 78 T-Flaschen zur Ernte der Zellen verwendet werden, werden hierfür geeignete Zellkulturflaschen (Fa. Costar; Accell; Nr. 3155) benutzt. Am Tag nach dem Beimpfen dieser T-Flaschen wurden 68 Flaschen mit Phosphoramidon (Fa. Peptide Institute; Nr. 4082; abgekürzt als PHAM) in einer Endkonzen tration von 10^-4M versetzt (+ PHAM). Diese Behandlung führt zur Induktion der ECE-Aktivität. Die restlichen 10 T-Flaschen wurden als nicht induzierte Kontrollzellen mitgeführt (-PHAM). Nach weiteren 2 Tagen Inkubation unter den beschriebenen Bedingungen wurden die PHAM-induzierten Zellen und die Kontrollzellen (-PHAM) getrennt geerntet. Hierzu wurden die Flaschen geöffnet und das Medium abgekippt. Die Zellen wurden in der T-Flasche mit je 10 ml PBS (Boehringer Mannheim Nr. 210331) gewaschen (d. h. über Zell rasen vorsichtig geschwenkt). Das PBS wurde abgekippt. Erneut wurden 5 ml PBS pro T-Flasche gegeben. Die Zellen wurden mit einem Cell-Scraper (Fa. Costar Nr. 3010) vom Boden der Kultur flasche gekratzt und als Zellsuspension in ein 150 ml Zentri fugenröhrchen (Falcon Nr. 2076) überführt, wo sie auf Eis auf bewahrt wurden. Jede T-Flasche wurde mit 10 ml PBS nachgespült. Die Zellsuspension aus dem Nachspülen wurde mit der vorhandenen Zellsuspension in den Zentrifugenröhrchen vereinigt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (1200 RPM; 10 Minuten; Heraeus Christ Minifuge GL Nr. 4400; Rotor 2150) sedimentiert. Der zellfreie Überstand wurde verworfen und das Pellet im 3-fachen Volumen PBS des Zellsedimentes aufgenommen. Nach erneutem Zentrifugieren wurde der zellfreie Überstand erneut verworfen. Das Pellet blieb bis zur Aufarbeitung auf Eis.

Beispiel 2

Vergleichende Anreicherung von nicht stimulierten und mit Phos phoramiden stimulierten Rinderendothelzellen, FBHE; Identifizie rung des Proteins.

Die nach Beispiel 1 erhaltenen FBHE-Zellen mit und ohne Phosphor amidon-Induktion (jeweils 500 µl Feuchtmasse) wurden in 15 ml PBS-Puffer, 0,5 mM Diisopropylfluorophosphat 20 Minuten im Eisbad mit Ultraschall behandelt. Nach Zentrifugation (20 Min. 1000 g) werden die Membranen durch Zugabe von 5% Pluriol F68® zum Über stand gefällt und durch erneute Zentrifugation bei 10 000 g ge wonnen. Die Membranen werden mit 2 ml 100 mM Tris-Puffer, pH 8,0 digeriert und mit 1% Triton X-100® solubilisiert. Die Solu bilisate (jeweils 2,5 ml) wurden zentrifugiert, die Rückstände verworfen.

Mono-Q®-Chromatographie

Die Solubilisate der ±-Phosphoramidon-induzierten Zellen wur den getrennt auf eine Mono Q® HR 5/5-Säule (Fa. Pharmacia) unter exakt gleichen Bedingungen chromatographiert. Die Säule wird mit 50 ml Tris-Puffer, pH 8,0, 0,1% Triton X-100 (A-Puffer) äquili briert. Nach Auftrag des Solubilisates wird 15 Min. mit A-Puffer gewaschen und ein 50 Min-Gradient linear mit B-Puffer (A-Puffer + 1 M NaCl gefahren (Fluß 0,2 ml/min). 20 Fraktionen a 0,5 ml wer den gesammelt und mit Human Big Et-1 als Substrat getestet. Das gebildete Et-1 wird mittels Reversed-Phase-HPLC in beschriebener Weise (Beispiel 3) nachgewiesen und quantifiziert. Die beiden Fraktionen mit der höchsten Enzymaktivität werden jeweils ver einigt.

Superose 12®-Gelchromatographie

Die Eluate aus den Mono Q-Chromatographien werden mittels Centri con®-Röhrchen (Fa. Amicon) auf 250 µl konzentriert und jeweils über eine Superose 12 HR10/36 gelchromatographiert.

Bedingungen
Puffer:
20 mM Natriumphosphat,
	250 mM NaCl, pH 7,4,
	0,05% Triton X 100
Fluß:	0,5 ml/min
Fraktion:	0,5 ml

Nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Test werden die Fraktionen getestet und die jeweils 2 Fraktionen mit der höchsten Enzym aktivität vereinigt.

Proteinbestimmungen aller Fraktionen erfolgten nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. 72, 248 (1976)).

Ergebnisse

Die Reinigung von stimulierten und unstimulierten Zellen ergab folgende Ergebnisse auf den verschiedenen Stufen der Reinigung:

Die beiden aktiven Fraktionen der Superose 12®-Chromatographie wurden vergleichend auf ein 8%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen. Das Gelmuster von gereinigtem ECE-1 aus Phosphoramidon behandel ten Zellen zeigt im Vergleich zu den nicht behandelten Zellen eine zusätzliche Bande bei 250 000 Dalton. Trägt man die Proteine mit dem Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) auf, so zeigt sich im Vergleich eine zusätzliche Bande bei 125 000 Dalton.

Beispiel 3 ECE-1-Aktivitätstest mittels HPLC Umsatz von Big-Endothelin-1 zu Endothelin-1 mittels des Endo thelin-Konversionsenzyms (ECE-1)

1 µl Enzymlösung, erhalten nach Beispiel 4, wurde mit 21 µl 50 mM Tris, 50 mM Imidazol, 250 mM NaCl, pH 7,4 Puffer und 2,5 µl humanem Big-Endothelin (2 mg/ml in 0,1% Essigsäure in Wasser) versetzt. Nach 2 Stunden wurde die Reaktion zwecks Analyse des gebildeten Endothelins mit 72 µl 0,5% Trifluoressigsäure abge stoppt. Die Probe wurde zentrifugiert und der Überstand durch Analyse mittels Reversed Phase-Hochdruckflüssigkeitschromato graphie (RP-HPLC), wie in (J. Takada et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, 860 (1991), K. Ohnaka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 168, 1128 (1990)) beschrieben, identifiziert und durch Vergleich mit einem Endothelin-Standard mittels UV-Detektion (205 nm) quantifiziert.

Die Enzymaktivität läßt sich dann berechnen in Aktivität

Nach diesem Verfahren wurde die ECE-Aktivität der Aufarbeitung von FBHE-Zellen zu verschiedenen Stufen der Reinigung bestimmt. Gleichzeitig wurden die Proteinmengen nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. 72, 248 (1976)) bestimmt.

Beispiel 4 Reinigung von ECE-1 aus Rinderendothelzellen, FBHE a) Membrangewinnung, Trypsinisierung von Fremdprotein

6 ml FBHE-Zellpellet (nach Beispiel 1) werden in 25 ml PBS- Puffer digeriert und 15 Minuten im Ultraschallbad unter Eis kühlung aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Abzen trifugation bei 10 000 g, 20 Min., entfernt. Der Überstand wurde unter Rühren mit 3,6 mg Trypsin versetzt und 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Probe wurde 1 h bei 100 000 g zentrifugiert und die im Rückstand befindlichen Membranen mit 25 ml 100 mM Tris-Puffer, pH 8,0 suspendiert.

b) Solubilisierung von ECE-1

Die 25 ml Membransuspension wurden auf 0,5 mM Diisopropyl fluorphosphat und anschließend 0,5% Triton X-100® einge stellt und über Nacht im Eisbad aufbewahrt.

c) Mono-Q®-Chromatographie

Eine Mono Q®-FPLC-Säule, HR16/10, Fa. Pharmacia wurde mit 50 mM Tris-Puffer, pH 8,0; 0,05% Triton X 100® (A-Puffer) äquilibriert.

Nach Auftrag des Solubilisates wurde 30 Min. mit A-Puffer gewaschen und danach mit einem linearen Gradienten innerhalb 100 Minuten nach Puffer B (Puffer A + 1 m NaCl) eluiert. Es werden 30 Fraktionen je 10 ml gesammelt. Der Proteingehalt der Proben wird nach der Bradford-Methode, die ECE-1 Aktivität nach Beispiel 3 bestimmt.

Die beiden Fraktionen mit der höchsten spezifischen Aktivität wurden vereinigt.

d) Gelfiltration

Die vereinigten Mono Q®-Eluate nach 4c) wurden über eine 30KDa-Centricon-Membran(Fa. Amicon) auf 500 µl konzentriert.

Eine Superose 12®, HR 10/30-Säule (Fa. Pharmacia) wird mit 20 mM Na-Phosphat-Puffer, pH 7,4, 250 mM NaCl, 0,05% Triton X 100 äquilibriert und die konzentrierte Probe aufgetragen.

Bei einem Fluß von 0,5 ml wird mit dem Äquilibrierungspuffer chromatographiert und 0,5 ml-Fraktionen gesammelt.

Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der Fraktionen er folgt wie in 4c). Die Fraktion mit der höchsten spezifischen Aktivität ist unter e) angegeben; sie eluiert bei ca. 250 000 Dalton, geeicht an Standardproteinen unter gleichen Chromato graphiebedingungen.

e) Ergebnisse

Beispiel 5 SDS-Gel-Analyse von gereinigtem ECE-1 aus FBHE-Zellen

Das nach Beispiel 4 gereinigte ECE-1 wird auf einem 8%igen SDS- Gel nach Lämmli (Nature 227, 680 (1979)) unter nicht reduzieren den und reduzierenden Bedingungen (+DTT) analysiert. ECE-1 hat danach im nicht reduzierten Zustand ein Molekulargewicht von 250 000 Dalton und zerfällt nach Reduktion in eine breite Bande um 125 000 Dalton.

Beispiel 6 Deglykosylierung von ECE-1

50 µl der nach Beispiel 4 gereinigten ECE-1-Lösung wurden mit 10%iger SDS-Lösung auf 0,25%-SDS-Gehalt eingestellt. Die Proben wurden 20 Min. bei Raumtemperatur inkubiert und auf 1% Triton X-100 eingestellt. Nach 20 Min. bei RT wurden 5 µl 250 mM Na-Phosphatpuffer, pH 4,7 zugegeben. Danach wurden 0,25 µl PNGase und 0,5 µg Endo F zugegeben. Die Proben wurden 8 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die gleichen Enzymmengen erneut zugegeben und 8 weitere Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Proben auf 50 µl einkonzentriert und im 4-12%igen SDS Gel analysiert.

Ergebnisse

Im reduzierten Zustand verändert sich das apparente Molekülar gewicht von 125 000 Dalton durch Abspaltung der Zuckerreste mit der Mischung von PNGase F/Endo F auf ca. 82 000 Dalton.

Beispiel 7 Partialsequenzen des ECE-1 aus Rinderendothelzellen

16 × 25 µg der nach Beispiel 4 erhaltenen ECE-1-Lösung wurden in 4-12%igen SDS-Polyacrylamid-Gradientengelen präparativ aufge tragen. Nach üblicher Färbung mit Coomassie blue wird das Gel entfärbt und 4 × 40 Minuten in reinem Wasser gewässert. Die bei 250 KDa gefärbten Banden wurden mit einem Skalpell ausgeschnitten und mit 200 µl 100 mM NH₄HCO₃-Lösung digeriert. Nach Zugabe von 0,5 µg Trypsin wird über Nacht inkubiert, der Überstand danach abgenommen. Der Rückstand wird erneut mit 0,5 µg Trypsin 5 h bei Raumtemperatur in 200 µl 100 mM NH₄HCO₃-Puffer inkubiert. Danach wird die Probe im speed-vac-Konzentrator zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird mit 40 µl Wasser aufgenommen und mit 4 µl 40 mM Dithiothreitol-Lösung 30 Min. gerührt. Danach wurden bei 37°C 4 µl 100 mM Jodacetamid-Lösung zugegeben. Nach 2 Stunden wird die Probe zur Trockne eingeengt.

Die entstandenen Peptide wurden über eine 1 mm × 15 cm Reversed- Phase-HPLC-Säule in einem linearen 3-Stunden-Gradienten von 0,5% Trifluoressigsäure in Wasser nach 0,5% Trifluoressigsäure in 90% Acetonitril aufgetrennt. UV-aktive Fraktionen wurden ge sammelt und die Primärsequenzen auf einem Gasphasen-Sequenzer bestimmt.

Ergebnisse

Folgende Partialsequenzen wurden bestimmt:

Die in Klammern angegebenen Aminosäuren wurden nicht absolut sicher identifiziert.

SEQ ID NO: 1 belegt, daß es sich beim ECE-1 um ein neues Protein aus der Familie der Metalloproteasen handelt, da es im Vergleich mit Sequenzen der Metallendopeptidasen NEP 24.11 und Thermolysin signifikante Homologien von 72% bzw. 40% aufweist.

Beispiel 8 Herstellung einer cDNA-Sequenz, die für ein Endothelin konversionsenzym kodiert a) Isolierung von RNA und Herstellung einer cDNA-Bank

Gesamt-BNA aus FBHE-Zellen, die nach Beispiel 1 mit Phosphor amidon stimuliert wurden, oder aus HeLa-Zellen, die nach Beispiel 1 mit Phosphoramidon stimuliert wurden, wurde durch Aufschluß in Guanidiniumthiocyanat gewonnen. Dabei wurde mit Materialien und nach Anleitung des "RNA Isolation Kit" der Firma Stratagene, La Jolla, CA, USA (Catalog Nr. 200345) gearbeitet.

Die polyadenylierte messenger RNA wurde aus der o.a. Gesamt- RNA aus FBHE-Zellen durch oligo(dT)-Affinitätsseparation selektiert. Dieses Verfahren wurde mit Materialien und nach Anleitung des "PolyATtract mRNA Isolation System" der Firma Promega, Madison, WI, USA (Catalog Nr. Z5200) durchgeführt. Aus polyadenylierter messenger RNA wurde mit Materialien und nach Anleitung des "ZAP-cDNA Synthesis Kit" der Firma Stratagene, La Jolla, CA, USA (Catalog Nr. 200400) cDNA synthetisiert, die dann mit Materialien und nach Anleitung des "Uni-ZAP XR GigapackII Cloning Kit" der Firma Stratagene, La Jolla, CA, USA (Catalog Nr. 237611) in Lambda Phagen ver packt wurde.

b) Herstellung von Oligonukleotidproben für die "RACED"-PCR

Zur Klonierung von cDNA-Fragmenten mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR, s. "Molecular Cloning", 2nd edition (1989), Sambrook, J. et al., CSH-Press, Seite 14.1 ff.) wurde von den in Beispiel 7 angeführten Peptiden mit den SEQ ID NO: 1 und NO: 6 ausgegangen.

Unter Zugrundelegung des genetischen Codes läßt sich aus der SEQ ID NO: 1, Position 16 bis 22 ein Oligonukleotid-Gemisch mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO: 7 herleiten:
5′-GGSCAYGARYTNACNCAYGC-3′.

Desgleichen lassen sich aus der SEQ ID NO: 6, Position 2 bis 8 ein Oligonukleotidgemisch mit der SEQ ID NO: 8:
5′-GARATYGTSTTYCCYGCYGG-3′,
sowie aus der SEQ ID NO: 6, Position 9 bis 16 ein Oligo nukleotidgemisch mit der SEQ ID NO: 9:
5′-ATYCTSCAGGCYCCYTTYTAYAC-3′
herleiten.

Dabei entsprechen SEQ ID NO: 7 bis NO: 9 der Sequenz des kodierenden DNA-Stranges. Wegen der bekannten Degeneriertheit des genetischen Codes sind an manchen Positionen mehrere Nukleotide eingesetzt worden. Damit ergibt sich für SEQ ID NO: 7 bis 9 eine bis zu 512fache Gemischkomplexität. Die genannten Sequenzen wurden als Oligonukleotide syntheti siert.

Folgende Oligonukleotide wurden zusätzlich als 3′Primer in der "RACE"-PCR synthetisiert:
A-B-T18 (SEQ ID NO: 10):
5′-CGAGGGGGATGGTCGACGGAAGCGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′;
sowie
A (aus A-B-T18) (SEQ ID NO: 11):
5′-CGAGGGGGATGGTCGACGG-3′;
sowie
B (aus A-B-T18) (SEQ ID NO: 12):
5′-GATGGTCGACGGAAGCGACC-3′.

Die Synthesen wurden mit einem Applied Biosystems Typ 360A DNA-Synthesizer durchgeführt. Die Oligonukleotide wurden nach Entfernung der Schutzgruppen gelelektrophoretisch über ein Acrylamid/Harnstoff-Gel gereinigt.

c) Herstellung von DNA-templates für die PCR

5 µg Gesamt-RNA oder 1 µg Poly(A)+-RNA der unter a) auf geführten RNA-Präparation aus Phosphoramidonstimulierten FBHE Zellen wurden mit 1 µg des Oligonukleotides A-B-T18 (SEQ ID NO: 10) und mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkrip tase in einzelsträngige cDNA (1°cDNA) übersetzt. Dabei wurde mit Materialien und nach Anleitung des "SuperScript Pream plification System" der Firma Gibco BRL, Eggenstein, Deutsch land (Catalog Nr. 8089SA) gearbeitet. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Syntheseprodukte mittels "Geneclean II Kit" der Firma BIO 101, La Jolla, CA, USA, von kleineren Molekülen und überschüssigen Oligonukleotiden gereinigt.

d) PCRs und Klonierung einer Teil-cDNA-Sequenz

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde nach bekannten Protokol len durchgeführt (s. "Molecular Cloning", 2nd edition (1989), Sambrook, J. et al., CSH-Press, Seite 14.1 ff.). Dazu wurde ein "DNA Thermal Cycler" der Firma Perkin Elmer benutzt. Dabei wurde das Prinzip der "verschachtelten Primer" nach Frohmann, M.A. et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1988) 85, 8998-9002) verwendet und nach Fritz, J.D. et al. (Nucl. Acids Res. (1991) 19, 3747) modifiziert angewendet.

Im Einzelnen wurde die 1°cDNA aus c) mit jeweils 20 pmol der Oligonukleotide SEQ ID NO: 8 und A (aus A-B-T18) amplifi ziert. Die Bedingungen waren dabei: 1′ 95°C; 2′ 55°C; 3′ 72°C für 35 Zyklen.

Die PCR-Produkte wurden elektrophoretisch auf einem 1,2%igen LMP-Agarose/TBE-Gel aufgetrennt.

Aus dem Gel wurden über die gesamte Länge des "Schmiers" etwa 10 Gelscheibchen geschnitten und diese als separate Fraktionen mit DNA-Fragmenten steigender Molmasse geschmolzen.

Aliquots dieser Fraktionen wurden dann separat in eine zweite PCR mit jeweils 20 pmol der Oligonukleotide SEQ ID NO: 9 und B (aus A-B-T18) eingesetzt. Dabei überschritt der Agarosean teil nie 1/10 Volumen des PCR-Ansatzes. Reaktionsbedingungen: 1′ 95°C; 2′ 50°C; 3′ 72°C für 35 Zyklen.

Die gelelektrophoretische Auftrennung der Amplifikations produkte dieser Fraktionen ließ deutlich eine Reduzierung des komplexen Produktspektrums der ersten PCR hin zu einer definierten Bande von ca. 1000 bp Länge nach der zweiten PCR erkennen.

Dieses solchermaßen selektierte PCR-Produkt wurde nach Standardmethoden eluiert. Die Identität der 1000 bp großen Bande als ein Fragment der bovinen Endothelinkonversionsenzym cDNA wurde zunächst durch eine weitere, dritte PCR-Ampli fikation mit den Oligonukleotiden SEQ ID NO: 7 und B (aus A-B-T18) überprüft. Das Produkt dieser PCR war eine ca. 950 bp große Bande.

Nach Subklonierung der 1000 bp großen Bande aus der zweiten PCR-Reaktion in den Vektor pCR II (TA Cloning Kit, Invitrogen Corp., San Diego Cat.No. K2000-01) und Vermehrung des Plasmides in E.coli DH5alpha ergab die Sequenzanalyse eines Klones ein offenes Leseraster von 189 Aminosäuren SEQ ID NO: 13, NO: 14). Im gleichen Leseraster fanden sich auch die Sequenzen der Peptide SEQ ID NO: 1, ,NO: 2 und NO: 4, wodurch die Identität des cDNA Fragmentes eindeutig definiert wird.

e) Klonierung einer bovinen cDNA für das Endothelinkonversions enzym

Nach dem in Beispiel 1a) aufgeführten Protokoll wurde eine cDNA-Bibliothek mit einem statistischen Primergemisch im Schritt der Erststrang-Synthese generiert. Die Primer wurden als Sequenz:
5′-GAGAGAGAGTCGACGGTACCN7; SEQ ID NO: 15
synthetisiert.

Abweichend von o.a. cDNA-Syntheseprotokoll wurde die doppel strängige cDNA über eine 2 ml Säule S-1000 Sephacryl (Grad: "Superfine"; Pharmacia, Freiburg; Catalog Nr. 17-0476-01) fraktioniert. Die Fraktionen mit cDNA-Fragmenten von minde stens 1 kb Größe wurden durch Alkoholfällung auf bekannte Weise konzentriert und entsprechend der Anweisung im cDNA- Synthese Kit weiterbehandelt, wobei die cDNA-Präparation mit der Restriktionsendonuklease SalI statt mit XhoI nach gespalten und in den Lambdavektor integriert wurde.

2 × 106 Klone der Bank wurden mit einer DNA-Sonde, die mit den Oligonukleotiden
5′-CGGCCCTGGTGGAAGAACTCG-3′ (SEQ ID NO: 16) und
5′-TGCGGACGGAACACCAGACCT-3′ (SEQ ID NO: 17)
aus der partiellen Rinder cDNA (SEQ ID NO: 13), Position 136 bis 156, bzw. 391 bis 412 erzeugt wurde, nach Transfer auf Nylonmembranen hybridisiert. Die DNA-Sonde wurde in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Gegenwart von Digoxigenin dUTP markiert, wie in Beispiel 1f) beschrieben. Die Hybridi sierung wurde unter stringenten Bedingungen durchgeführt (s. Beispiel 1f)), wobei der letzte Waschschritt nach er folgter Hybridisation in 0.1 × SSC, 60°C durchgeführt wurde und anschließend der immunologische Nachweis der gebundenen DNA-Sonde erfolgte. Die Sequenzierung ausgewählter Klone ergab die Rinder CDNA-Sequenz C60, SEQ ID NO: 18, mit einem durchgehenden Leserahmen, SEQ ID NO: 19.

Danach wurden 2 × 106 Klone der Bank mit einer DNA-Sonde, die mit den Oligonukleotiden
5′-GCCAGCGCCGTCTCAAAGTCCAG-3′ (SEQ ID NO: 20) und
5′-TGGGGGACCTTCAGCAACCTCT-3′ (SEQ ID NO: 21)
aus dem cDNA-Klon C60, SEQ ID NO: 18, Position 500 bis 522, bzw. 14 bis 35, wie oben beschrieben, erzeugt wurde, unter gleichen Bedingungen hybridisiert. Die Sequenzierung ausge wählter Klone ergab die Rinder-cDNA-Sequenz SEQ ID NO: 22 mit einem durchgehenden Leserahmen von 708 Aminosäuren (SEQ ID NO: 23).

5 × 108 plaquebildende Einheiten einer käuflichen Rinder lungen cDNA Bank in Lambda gt11 (Clontech Laboratories, Inc.; 4030 Fabian Way; Palo Alto CA 94303-4607, USA; Katalog Nr. BL1006b) wurden durch Fällung mit 10% Polyethylenglykol 6000, 1 M NaCl konzentriert in 100 µl Bidest resuspendiert und 5 min auf 70°C erhitzt. 5 µl dieses Lysats wurden in einer 50 µl Standard PCR-Reaktion (Beispiel 8d) mit den Primern gt11 fwd und 5′-GGTGCTTGATGATGGCTTGGTTGT-3′ (SEQ ID NO: 26) eingesetzt. Der Primer gt11 fwd entspricht der Position 2979-3003 des β-Galaktosidasegens (Gen bank: ECLACZ) und liegt im Klonierungsvektor Lambda gt11 unmittelbar vor der singulären EcoRI-Integrationsstelle, die bei der Bankkonstruktion benutzt wurde (Young, R.A. u. Davis, R.W. (1985) Genetic Engineering, Ed. by Setlow, J. u. Hollander, A. Plenum Press, N.Y. 29-41). Der Primer SEQ ID NO: 26 entspricht der Position 280-303 der SEQ ID NO: 22.

Die Amplifikationen wurden über 40 Zyklen durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde auf einem 3% "Low Melting Point" Nu-Sieve GTG-Agarosegel (Firma FMC BioProducts, 191 Thomaston Street, Rockland, ME 04841, USA; Katalog Nr. 50082) aufgetrennt und der Größenbereich 400-E00 Basenpaare durch Ausschneiden einzelner Gelsegmente fraktioniert. Die Gelscheiben wurden, wie im Beispiel 8d) beschriebene aufgeschmolzen, und 1.5 µl wurden in 50 µl einer frischen PCR-Reaktion mit den Primern gt11 fwd und 5′-AGATGGAGCTGGTCACCGAGATGC-3′ (SEQ ID NO: 27) eingesetzt. Der Primer SEQ ID NO: 27 entspricht der Position 127-150 der SEQ ID NO: 22.

Die entstandenen PCR-Fragmente wurden nach Subklonierung in dem Plasmidvektor pUC18 (Yanisch-Perron, D., Vieira, J. u. Messing, J. (1985) Gene 33, 103-119) sequenziert (SEQ ID NO: 28).

Diese Sequenz überlappt mit den Nukleotiden 175-324 die SEQ ID NO: 22 in den Positionen 1-150 und verlängert sie um 174 Nukleotide in 5′-Richtung. Die resultierende Gesamt sequenz (SEQ ID NO: 29) kodiert einen offenen Leserahmen von 754 Aminosäuren (SEQ ID NO: 30).

f) Klonierung einer humanen cDNA für das Endothelinkonversions enzym

Da Endothelin-1 in humaner Plazenta nachgewiesen worden war, wurde angenommen, daß das Endothelinkonversionsenzym auch in Plazenta exprimiert wird. Es wurde daher unter Verwendung einer markierten Rinder-cDNA-Sonde eine humane λgt-11 Plazenta cDNA Bank gescreent. Zur Herstellung der Digoxi genin-dUTP markierten Rinder-cDNA-Sonde wurde in einer PCR- Reaktion (siehe "Molecular Cloning", 2nd edition (1989), Sambrook, J. et al., CSH-Press, Seite 14.1 ff.) als ′template′ 1 ng (1ng/ml) der partiellen Rinder-cDNA-Sequenz (SEQ ID NO: 13) verwendet. Das ′sense′-Oligonukleotid (SEQ ID NO: 16) umfaßte die Nukleotide von Position 136 bis 156 in SEQ ID NO: 13, das ′antisense′-Oligonukleotid SEQ ID NO: 17) die Positionen 392 bis 412 in der SEQ ID NO: 13. Im ′DNA Thermal Cycler′ (Perkin Elmer) wurden die nachfolgenden Zyklen 35 mal durchlaufen: 2 min. 94°C, 2 min 60°C und 3 min 72°C. Die markierte 276 bp Rinder cDNA-Sonde wurde anschließend über ein Agarosegel gereinigt und durch Aufkochen denaturiert. Unter niederstringenten Bedingungen wurden ca. 650 000 Klone einer humanen Plazenta λgt-11 cDNA- Bank (Clontech, HL 1008b) mit dieser Sonde gescreent. Die Hybridisierung der Filterabzüge mit der Sonde erfolgte über Nacht in 5 × SSC, 2% Blockierreagenz (Boehringer Mannheim; No. 1096176), 0,1% N-Laurylsarkosin, 0,02% SDS bei 60°C. Die Filter wurden dann 2 × 5 min bei 60°C mit 2 × SSC, 0,1% SDS und anschließend 20 min bei 60°C mit 0,5 × SSC, 0,1% SDS gewaschen. Die weitere Entwicklung der Filter zur Identifi zierung der gebundenen DIG-Sonden erfolgte entsprechend dem Protokoll von Boehringer Mannheim (DIG-Nukleinsäurendedek tionskit, No. 1175041).

Es wurden Klone mit der in SEQ ID NO: 24 angegebenen cDNA- Sequenz isoliert. Die Nukleotide in der Position 1 bis Position 2109 der cDNA-Sequenz mit der SEQ ID NO: 24 kodieren für die in SEQ ID NO: 25 angegebene Aminosäuresequenz. Die Aminosäuresequenz entspricht dem größten Teil der Primär sequenz des Endothelinkonversionsenzyms, da sich die Peptide SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 aus der Trypsinpeptidsequen zierung des isolierten Endothelinkonversionsenzyms in der Sequenz wiederfinden lassen. Auch die Metalloproteinase konsensussequenz HEXXH kann als HELTH an den Positionen 540 bis 544 in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 25 identifiziert werden.

Von 3 µg Plazenta poly A(+) BNA wurden wie im Beispiel 8 e) beschrieben mit dem Oligonukleotid 5′-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTC′TCGAGCCAAGCAGGCCACCAGTCCTG-3′ (SEQ ID NO: 31) als Erst-Strang cDNA Syntheseprimer eine cDNA-Bibliothek erzeugt. Die Nukleotide 32 bis 53 entsprechen den Positionen 32 bis 53 der SEQ ID NO: 24. Die cDNA-Präpara tion wurde wie in Beispiel 8a) beschrieben in den Labbda vektor Uni-ZAP XR integriert. Die resultierenden 4 × 105 un abhängigen Klone wurden amplifiziert und 5x108 plaquebildende Einheiten wurden, wie in Beispiel 8 e) beschrieben, in eine 100 µl PCR-Reaktion eingesetzt. Dazu wurden die Primer SEQ ID NO: 31 und C eingesetzt. Der Primer C liegt im Lambda vektor in dem Bluescript SK(-)-Teil, Pos. 881-904, Sequenz file Genbank: ARBLSKM.

Die PCR-Reaktion wurde 40 Zyklen bei einer Hybridisations temperatur von 65°C durchgeführt. 1 µl des Reaktionsprodukts wurde in einen frischen 50 µl PCR-Reaktionsansatz gegeben, der 40 Zyklen bei einer Hybridisationstemperatur von 60°C durchgeführt wurde. Als Primer wurden die Oligonukleotide D und
5′-CCTGCCGCCAGAAGTACCACCAACA-3′ (SEQ ID NO: 32)
verwendet.

Primer D liegt im Bluescript SK(-)-Teil des Lambda Uni-ZAP XR-Vektors (Pos. 857-880, Sequenzfile Genbank:ARBLSKM), der Primer SEQ ID NO: 32 entspricht der Position 11-35 in der SEQ ID NO: 24. Das Reaktionsprodukt wurde in dem Plasmid vektor pUC18 wie oben beschrieben subkloniert. Ausgewählte Klone wurden sequenziert.

Als Sequenz wurde ein neuer 5′-Anteil der humanen ECE cDNA erhalten (SEQ ID NO: 33, dessen 3′-terminaler Bereich (Pos. 188-222) mit der Position 1-35 der SEQ ID NO: 24 ver lappt. Er verlängert sie um 187 Nukleotide in 5′-Richtung und ergibt die gesamte humane ECE-Sequenz SEQ ID NO: 35, die einen offenen Leserahmen von 753 Aminosäuren (SEQ ID NO: 36) kodiert.

SequenzProtokoll

Claims

1. Endothelinkonversionsenzyme, dadurch gekennzeichnet, daß sie die in SEQ ID NO: 30 oder SEQ ID NO: 36 beschriebene Poly peptidsequenz oder funktionelle Fragmente davon enthalten.

2. DNA-Sequenzen, die für ein Endothelinkonversionsenzym nach Anspruch 1 codieren und die aus der Gruppe, die von

ausgewählt sind.

3. Verfahren zur gentechnischen Herstellung von Endothelin konversionsenzymen unter Verwendung von DNA-Sequenzen gemäß Anspruch 2.

4. Verfahren zur Herstellung von Endothelinkonversionsenzym gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Säugerzellen mit einem Inhibitor des Endothelinkonversionsenzyms zur Endo thelinkonversionsenzym-Überproduktion stimuliert werden und aus diesen Zellen Endothelinkonversionsenzym mit üblichen proteinchemischen Maßnahmen isoliert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Inhibitor Phosphoramidon verwendet wird.

6. Verfahren zur Herstellung von Endothelinkonversionsenzym gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein für eine Teilsequenz von SEQ ID NO: 36 codierendes oder sequenzkomple mentäres Oligonukleotid als Hybridisierungsprobe verwendet wird, um ein Gen für ein Endothelinkonversionsenzym aus einem Genpool zu isolieren und dieses Gen mit üblichen gentechni schen Methoden in einem Wirtsorganismus exprimiert wird.

7. Verwendung von Endothelinkonversionsenzym gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung von Hemmstoffen des Endothelinkonver sionsenzyms.

8. Hemmstoffe für Endothelinkonversionsenzyme, die mit einem Enzymtest unter Verwendung der Endothelinkonversionsenzyme gemäß Anspruch 1 identifiziert werden.

9. Verwendung von Hemmstoffen nach Anspruch 8 als Arzneimittel.

10. Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln, die ein Endo thelinkonversionsenzym inhibieren, dadurch gekennzeichnet, daß man bekannte chemische Verbindungen in einen Enzymtest unter Verwendung der Endothelinkonversionsenzyme gemäß Anspruch 1 einsetzt und solche mit inhibierender Wirkung identifiziert und die solchermaßen identifizierten Verbindungen mit üblichen Träger- und Hilfsstoffen als Arzneimittel formuliert.