HUT75554A - Endothelin-converting enzyme - Google Patents

Endothelin-converting enzyme Download PDF

Info

Publication number
HUT75554A
HUT75554A HU9601298A HU9601298A HUT75554A HU T75554 A HUT75554 A HU T75554A HU 9601298 A HU9601298 A HU 9601298A HU 9601298 A HU9601298 A HU 9601298A HU T75554 A HUT75554 A HU T75554A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
glu
asn
seq
thr
Prior art date
Application number
HU9601298A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9601298D0 (en
Inventor
Heinz Hillen
Elard Jacob
Burkhard Kroeger
Thomas Meyer
Rainer Otter
Martin Schmidt
Harald Seulberger
Thomas Subkowski
Original Assignee
Basf Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19934339100 external-priority patent/DE4339100A1/de
Priority claimed from DE19944403665 external-priority patent/DE4403665A1/de
Priority claimed from DE19944412372 external-priority patent/DE4412372A1/de
Application filed by Basf Ag filed Critical Basf Ag
Publication of HU9601298D0 publication Critical patent/HU9601298D0/hu
Publication of HUT75554A publication Critical patent/HUT75554A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6497—Endothelin-converting enzyme (3.4.24.71)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24071—Endothelin-converting enzyme 1 (3.4.24.71)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Psychiatry (AREA)

Description

A nemzetközi közzététel száma: WO 95/14095
A találmány endotelin konvertáló enzimekre (ECE), ezek elő állítására szolgáló eljárásokra és felhasználásukra vonatkozik.
Megállapították, hogy az ECE egy inhibitora emlős endoteli ális sejtekben az enzim túltermelését indukálja, és meghatároz ták a tiszta formában előállított ECE jellemző tulajdonságait.
Ismertették az ECE, valamint az ECE elleni antitestek diag nosztikai és kísérleti célra, valamint gyógyszerként való fel használásának lehetőségeit.
uVCCo-t ö Ú ί I * Nemzetközi
Szabadalmi Iroda i l -l (X?2 Budapest, Andrássy út 113. Telelőn: 34-24-950, Fax: 34-24-323
• · · · · ΐ
)
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY • · · · · · • · • · · ·
62.393/BE
Endotelin konvertáló enzim (ECE)
BASF AKTIENGESELLSCHAFT
Feltalálók:
KROGER Burkhard, SEULBERGER Harald, MEYER Thomas, SCHMIDT Martin, JACOB Elard,
OTTER Rainer, SUBKOWSKI Thomas, HILLEN Heinz,
LÜDWIGSHAFEN, DE
LIMBURGERHOF, DE
DOSSENHEIM, DE
SPEYER, DE
BENSHEIM, DE
EISENBERG, DE
SANDHAUSEN, DE
MUTTERSTADT, DE
HALLOCH, DE
A bejelentés napja 199
E1sőbbségéi : 1 993. 1 1 . 1 6
1 994 . 02 . 07
1 994. 04 . 12
A nemzetközi bejelentés . 10 .
• r P 4 3 39 10 0 - 1, DE
• r P 44 03 665 • 5, DE
• r P 44 12 372 •8, DE
száma: PCT/ΕP94 / 0 370 6
A nemzetközi közzététel száma: WO 95/14095 • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · ······ _ ······· · ·«··»·····
A találmány endotelin konvertáló enzimekre, az előállításukra szolgáló eljárásra és használatukra vonatkozik.
A megnövekedett endotelin szintet számos betegséggel hozzák összefüggésbe, például az esszenciális hipertóniával, a szívinfarktussal, az akut veseelégtelenséggel, sokkal vagy szívelégtelenséggel. Erre az összefüggésre endotelin antitestekkel kapott eredményekből szintén lehetett következtetni. Ál1atmode1lekben endotelinnel a szívinfarktus kiterjedését dózisfüggően tudták csökkenteni [ Watanabe et al., Natúré, 3 4 4 , 1 1 4 (1 990 )] , a veseműködést pozitív módon tudták befolyásolni [ Kon et al.,
J.Clin. Invest., 8 3, 17 62 (1 98 9)] , és csökkenteni tudták a ciklosporín nefrotoxicitását [ Kon et al., Kidney Int.,
37, 1487 (1990)] .
Az endotelin konvertáló enzim (ECE-1) az endotelin-1-et a 38 aminosavból álló big-endote 1in-1 prekurzor molekulából szabadítja fel. Az endotelin-1 által okozott nem kívánt biológiai hatások ellen például az endotelin konvertáló enzim gátlásával és ezáltal az endotelin-1 bioszintézisének akadályozásával lehet védekezni.
Különböző sejtvonalakból olyan enzimaktivitásokat izoláltak, amelyek endote1 ineket, illetve endotelin-szerű molekulákat szabadítanak fel a megfelelő prekurzor molekulákból, vagyis a big-endote1 inékbő1 [ Takeda et al.,
Biochem. Biophys. Rés. Comm., 176, 860 (1991); Ohnaka et al . , Biochem. Biophys. Rés. Comm., 1 68 , 1 12 8 (1 9 90 );
• · · · · ·
V
3 • · · • · · · · • · · · • · · ··
Matsumura et al., FEBS Lett. ., 293, 45 (1992); Ahn e t a 1 . ,
Proc. Natl. Acad. Sci. , 89, 8606 (1992); PCT WO 92/13944;
Ohnaka et al., Clin. E xp . Hypertension A, i£, (Nr.4)
(1992); Okada et al . , Biochem. Biophys. Rés. Comm ., 180,
1019 (1991); Takada et al . , Biochem. Biophys. Re s . Comm.,
182, 1383 (1992); Opgenorth et al.,
FASEB,
6,
653 (1992)] .
Ezeket az enzimaktivitásokat azonban eddig még nem vizsgálták kielégítően, mivel mint alacsony koncentrációjú enzimkeverékek állnak rendelkezésre. Specifikus ECE inhibitorok felkutatására szolgáló teszt-e1járásokban való alkalmazásra az ilyen nyers enzimkeverékek azonban kevéssé alkalmasak, mivel más, fiziológiailag nem jelentős idegen proteázok az enzimtesztet erősen zavarják. A big-endotelint például a szerin-proteáz kimotripszin, továbbá a papain, termolizin és a NÉP 24.11 endotelinné és endotelin-szerű termékekké hasítják, és a teszt eljárásokban ezeket az enzimeket tévesen hozzászámítják az ECE enzimekhez. A szakirodalomban ennélfogva az endotelin konvertáló enzim leírása ellentmondásos.
Az endotelin konvertáló enzim molekulatömegére vonatkozó adatok 65 kD-tól 540 kD-ig változnak; a Km és vmax értékek szintén jelentősen eltérnek egymástól [Opgenorth et al., FASEB, 6_, 2 653 (1 992); Sawamura et al., Biochem. Biophys. Acta, 1161, 295 (1993)] . Ellentmondások vannak olyan tekintetben is, hogy vajon az endotelin konvertáló enzim az aszpartát proteázok vagy a meta11oproteáζok csa• · ládjába sorolandó-e [ Sawamura et al . , Biochem. Biophys
Acta, 1 1 61 ,. 295 (1 993); Biochem. Pharmacol., 4 3 , 845 (1992)] . További ellentmondó közlések találhatók a szakirodalomban olyan jellemző adatokra vonatkozóan is, hogy vajon meta 11oproteázként citop1azmatikus vagy membránhoz kötött enzimről van-e szó, és hogy milyen szubsztrátummal reagál a szóbanforgó ECE (big-Et-1; big-Et-3) [Matsumura et al., FEBS Lett., 293, 45 (1992); Takahashi et al., J.
Bioi. Chem., 268, 21394 (1993); Okada et al., Biochem.
Biophys. Rés. Comm., 1 8 0 , 1 0 1 9 ( 1 991 ); Ohnaka et al.,
Clin. Exp . Hypertension A 14 , Nr . 4 (1 992) ; Matsumura et al., FEBS Lett., 305, 86 (1992)] .
Ezidáig nem jelentettek meg az ECE-ről olyan egyértelmű leírást, amely lehetővé tenné az ECE kifogástalan meghatározását. Egy ilyen meghatározás valószínűleg csak az ECE primer szerkezetének, azaz aminosavszekvenciájának a meghatározása esetén jöhet létre. Ehhez elsősorban az
ECE tiszta formában való előállítása szükséges.
Feladatul tűztük ki tehát, hogy az endotelin konvertáló enzimet tiszta formában állítsuk elő.
Találtunk egy olyan endotelin konvertáló enzimet, amelynek a molekulatömege 250 000 dalton. Részleges aminosavs zekvenciá j át az 1. számú szekvencia írja le.
A találmány szerinti endotelin konvertáló enzim jellemzői a következők: SDS-po1iakri1 amid gé 1 e 1 e k t r o f o r é z i s sel - nem redukáló körülmények mellett - meghatározva molekulatömege mintegy 250 000 dalton.
···· ···· • · · ·
Redukáló körülmények mellett, az SDS-ρο1iakri1amid gél egy 125 000 dalton tömegű sávot mutat ki, tehát vélhetően homodimerről van szó.
Az endotelin konvertáló enzim glikozilált. A cukormaradékok enzimes eltávolítása a valószínű 125 000 dalton molekulatömeget mintegy 82 000 daltonra változtatja.
Az endotelin konvertáló enzim tripszines peptidjeinek szekvenálása az 1., 2., 3., 4., 5. és 6. számú szekvenciák szerinti részleges aminosavszekvenciákat szolgáltatta .
Az endotelin konvertáló enzim további vizsgálatával a példákban foglalkozunk.
A találmány további tárgyát képezik azok az endotelin konvertáló enzimek, amelyeknek a molekulatömege körülbelül 250 000 dalton, és olyan aminosavszekvencia-részt tartalmaznak, amely legalább 80%-os homológiát mutat az 1. számú szekvenciával.
Ilyen endotelin konvertáló enzimek nemcsak marhából, hanem más szervezetekből, például emberi sejtekből izolálhatok .
A találmány olyan endotelin konvertáló enzimekre is vonatkozik, amelyek a 30. számú szekvenciában és a 36. számú szekvenciával leírt polipeptid szekvenciát vagy ezek működőképes fragmentumait tartalmazzák.
Működőképes fragmentumok alatt olyan rész-szekvenciák értendők, amelyek még rendelkeznek az endotelin konvertáló enzim enzimaktivitásával, antigén tulajdonsággal • · · · · · · • · • · • · · · · · · • ··« ··· ······ • · · · · • ··« ·· · ·· β
rendelkeznek, és 1igandumokhoζ - például kötőproteinekhez - affinitást mutatnak.
További működőképes fragmentumok az olyan polipeptid szekvenciák, amelyeket a 30. vagy a 36. számú szekvenciából kiindulva aminosavak vagy peptidek inszerciója, deléciója vagy szubsztitúciója révén kaphatunk, és amelyek még lényegében az endotelin konvertáló enzim enzimaktivitásával rendelkeznek, és/vagy a 30. vagy a 36. számú szekvenciák szerinti endotelin konvertáló enzimmel immunológiai ke resztreakeiót adnak.
A találmány tárgyát képezik azok a DNS szekvenciák, amelyek endotelin konvertáló enzimet kódolnak, továbbá azok, amelyeket a következő DNS szekvenciákból álló csoportból választunk ki:
a) DNS s’z e kvenc i á k, amelyek a 29. vagy a 35. számú szekvenciákkal leírt szerkezettel rendelkeznek,
b) DNS szekvenciák, amelyek a 30. vagy a 36. számú szekvenciákkal leírt szerkezetű proteineket kódolják, és
c) DNS szekvenciák, amelyek standard feltételek mellett az a) vagy b) pont alatti DNS szekvenciákkal hibridizálnak, továbbá
d) DNS szekvenciák, amelyek olyan protein termékeket kódolnak, amelyeket a 30. vagy a 36. számú szekvenciákból vagy ezek fragmentumaiból álló proteinek elleni antitestek felismernek.
• · · · · · · • · • ·
Ί
Standard feltételek alatt értjük például, ha egy 0,1 x SSC és 1 x SSC koncentrációjú vizes pufferoldat (1 x
SSC = 0,15 M nátrium-klorid, 15 mM nátrium-citrát, pH
7,2) hőmérséklete 42°C és 58°C között van. A DNS hibridizáláshoz szükséges kísérleti feltételeket géntechnikai szakkönyvek ismertetik, például: Sambrook et al, „Molecular Cloning [ Cold Spring Harbor Laboratory (1989)] .
Ilyen DNS szekvenciák előállítását a 8. példában ismertetjük. Azokat a DNS szekvenciákat, amelyeknek a proteintermékeit a 30. vagy a 36. számú szekvenciákból vagy ezek fragmentumaiból álló proteinek elleni antitestek ismerik fel, jól leírt módszerekkel állíthatjuk elő.
Ilyen proteinek elleni antitestek előállítását ismerteti például L.Hudson és F.C.Hay, „Practical Immunology [ Blackwell Sci. Publ . Oxford ( 1 980 )] című munkája.
Az olyan cDNS szekvenciák kimutatására szolgáló antitestek alkalmazásának leírása, amelyek az ezen antitestekkel keresztreagá1ó proteineket kódolják, például a következő kiadványban található: „ DNA Cloning I. kötet,
D.M.Glover (szerk.) [ IRL Press, Oxford (1 985 )] .
A találmány ezenkívül olyan endotelin konvertáló enzimek előállítására alkalmas eljárásra is vonatkozik, amelyre jellemző, hogy az endotelin konvertáló enzim egy inhibitora emlős sejteket, főként endoteliális sejteket endotelin konvertáló enzim túltermelésre stimulálja, és ···· ···· • · ezekből a sejtekből az endotelin konvertáló enzim a szokásos fehérjekémiai eljárásokkal izolálható.
Emlős sejtekben az ECE indukciójára minden ECE-inhibitor felhasználható. Megfelelő ECE-inhibitorok leírását tartalmazza például a JP-146737 számú japán szabadalmi leírás; a JP 05148277-A1 számú japán szabadalmi bejelentés; továbbá: Jpn . J . Biochem. , 6 4 , (8) kivonat, 2 3 67 (1992); Derwent NCE-93-0956 (1993); Derwent NCE-93-0971 (1993); J. Med. Chem., 3_6, 173 (1 993); EP 5182 99-A2 számú európai szabadalmi bejelentés. Előnyösen alkalmazható a foszforamidon. A tenyésztett sejteket ezen inhibitoroknak a sejt tenyésztő táptalajhoz való hozzáadásával stimulálják 6 órától 6 napos időtartamig. Előnyös, ha a stimulálást 2-3 napon át végzik. Az alkalmazott inhibitor koncentrációk 10'2 M-tól IC'7 M-ig terjednek, előnyös koncentráció a 10 “ - 10 4 M.
A találmány szerinti endotelin konvertáló enzimek azonban géntechnológiai úton is előállíthatók. A leírt részleges aminosavszekvenciák alapján olyan szintetikus oligonukleotidők állíthatók elő, amelyek ezeket a szekvenciákat kódolják, vagy komplementerek az ezeket kódoló szekvenciákkal. Ezeket a oligonukleotidokat hibridizációs szondákként használhatjuk a megfelelő gének izolálására vagy pedig cDNS molekuláknak génpoolból - ilyenek a génbankok - vagy cDNS poolból való izolálására. A gén izolálásnak ezt a módját a szakemberek molekuláris biológiai szakkönyvekből - például: Sambrook, Fritsch, Maniatis, ···· ···· • « ··· ··· ··· · * „Molecular Cloning [Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) USA] - ismerik.
Alkalmas szintetikus oligonukleotidok és polimeráz láncreakció (PCR = polymerase chain reaction) segítségével szintén előállíthatjuk a gén részeit, például cDNS bankokból vagy egyszálú cDNS-ből [ PCR Protocols; Academic
Press; San Diego, USA, (1990)] . Az itt alkalmazható oligonukleotidokat az 1-6. számú szekvenciák szerinti peptidekből úgy vezethetjük le, hogy az aminosavszekvenciát kétszálú DNS szekvenciává (szensz és antiszensz szállal) fordítjuk le. A degenrált genetikai kód következtében egy peptidből degenerált oligonukleotid keverékek vezethetők le, amelyek ezután primerként alkalmazhatók. Az oligonukleotidokat az úgynevezett „codon usage alapján is levezethetjük a peptidekből, azaz annak figyelembevételével, hogy egy fajban - ebben az esetben marhában - egy adott aminosavhoz mely állandó nukleotid tripletnek a használata van előnyben. A PCR-t ezután két különböző oligonukleotid primer használatával végezzük, amikoris a PCR-hez szükséges két prímért az oligonukleotid szensz szálából és antiszensz szálából állítjuk öszsze. Ugyancsak felhasználhatók olyan oligonukleotidok, amelyek a cDNS vektorból származnak, vagy ilyen az oligo-dT a mRNS 3' része számára.
Ezeket a gén részeket ezután arra is használhatjuk, hogy gén izolálási eljárásokkal a teljes gént vagy a teljes cDNS-t megkapjuk.
···· ··r· • « • · · ··· ·* ··· ·· ·
Ilyen módon nemcsak azoknak az endotelin konvertáló enzimeknek a génjét izolálhatjuk, amelyek pontosan az 1. számú szekvencia szerinti részleges aminosavszekvenciát tartalmazzák, hanem variáns géneket is, például más szervezetek - így az ember - endotelin konvertáló enzimeit is, amelyek protein szinten legalább 80%-os homológiát mutatnak az 1. számú szekvenciával.
A találmány szerinti endotelin konvertáló enzimek könnyen előállíthatok, ha a megfelelő géneket izoláljuk, és ezeket a géneket a szokásos géntechnológiai módszerekkel egy gazdaszervezetben kifejezzük.
A találmány szerinti ECE vagy a belőle levezetett peptidek olyan antitestek vagy antitest fragmentumok - ilyenek például az Fv fragmentumok - előállítására használhatók, amelyeket például az ECE meghatározására, teszt-e1járásokban ECE-gátlók azonosítására vagy ECE-inhibitorokként használhatunk.
Ezek az antitestek általában értékes segédanyagok az olyan betegségek diagnosztikájában, amelyekben endotelin konvertáló enzimek vesznek részt.
Ilyen célokra a találmány szerinti DNS szekvenciákból levezetett PCR primerek is felhasználhatók, például az ECE-transzkripció méréséhez vagy a genotípus meghatározásához .
A kapott gének segítségével egy, a szakemberek által ismert módszerrel, állatok génkészletét olyan módon változtathatjuk meg, hogy ezek ebből a génből egy vagy több ···· ·«·· ·· ♦* »* « * « · · · · • *«· · · · ····« , ·····»' ·· ··· ·· Μ ·· extra másolatot tartalmazzanak, vagy hogy normál ECE génjük kitörlődjék. Ezek a transzgenikus állatok egyebek közt kísérleti célra alkalmasak.
Maguk az endotelin konvertáló enzimek gyógyszerek előállításához hatóanyagokként használhatók, például olyan betegségeknél, amelyekben az ECE-szubsztrátumok -ilyenek például a bradikinin, a P substance, a szomatosztatin, a neuropeptid Y - emelkedett szintje fordul elő. Ilyen betegségek például a következők: gyulladások, asztma, migrének, reuma és olyan sejt-fο 1yamatok és sejt-prο1iferáciό , amelyek peptid növekedési faktorok részvételével mennek végbe. Az ECE gyógyszerként alkalmazható olyan -betegségeknél is, amelyekben ECE adásával megszüntethető vazodi1atáció áll fenn, ilyenek például a szeptikus sokk, a migrének és a potencia zavarok.
Az ECE gyógyszerként való alkalmazása esetén, bizonyos körülmények között, szükség lehet az ECE mutatív megváltoztatására. Ezek a mutatív változtatások például olyan ECE származékokat eredményezhetnek, amelyek nem g1ikozi1á11ak, vagy amelyek nem tartalmaznak membrán-horgonyt (oldható ECE) . Membrán-horgonyt nem tartalmazó oldható ECE előállítható például olyan ECE-fragmentum expressziója révén, amely extracelluláris, katalitikus hatású domént tartalmaz. Ilyen ECE-fragmentumokhoz például úgy juthatunk, ha a kódoló szekvenciát - a 25. számú szekvenciából a 20. és a 703. aminosav közötti szakaszt, előnyösen a 25. számú szekvenciából a 27. és 703. amino12 «·····» ν ·· ·» *» ♦ » * · » ' » . «·· .»· «·· ··· • · « « » · ·· ·»· *· · ·· sav közötti szakaszt - összekapcsoljuk egy in vivő lehasítható szignálpeptid DNS szekvenciájával, majd egy szakemberek által ismert alkalmas expressziós vektorban eukarióta sejtekbe visszük be. Alkalmas szignálpeptid például a humán szöveti plazminogén aktivátor (tissue plasminogen activator = t-PA) szekvenciának a -35 és -4 aminosav-pozició közötti része [ D.Collen, Natúré, 301,
214-221 (1983)] . A változtatások befolyásolhatják például a specificitást, a hatás időtartamát és a felszívódást.
Az ECE működőképes részeit ezenkívül más proteinekkel is összekapcsolhatjuk, hogy olyan új proteineket állítsunk elő, amelyek gyógyszerként alkalmazhatók. Az ECE más, kovalens kötéssel kötött nem peptid molekulákkal - ilyenek például a PEG, .dextrán, zsírsavak - is módosítható.
A találmány szerinti DNS szekvenciák génterápiában való felhasználásra is alkalmasak, például génterápiás gyógyszerek előállítására. Emelkedett endotelin értékekkel járó betegségek az ECE-DNS-szekvenciábó1 levezetett ο1igonukieotidőkka1 is kezelhetők. Ezek az oligonukleotidok a nem-kódoló szálból (antiszensz) vezethetők le, és mint gyógyszerek alkalmazhatók. Egy ezen alapuló antiszensz terápia előnyösen az ο 1igonukieotidőkbó1 levezetett stabilabb kémiai származékokat használja. Olyan antiszensz oligonukleotidok használhatók például, amelyeket előnyösen a 35. számú szekvencia 31-100 pozíciója közti tartományból szintetizálunk. Az antiszensz oligonukleotidok előnyösen 15-30 csoport hosszúak. Az ···· ···· • · antiszensz terápia vagy betegség megelőzés ugyanazon javallatok esetén kerül alkalmazásra, mint az ECE-inhibitoroké, ilyenek például a következők: cerebrális isémiák; szubarachnoidá1is vérzések; vazospazmusok; koronária isémiák; olyan betegségek, amelyek sejt prο 1iferációs folyamatokkal járnak, mint a prosztata hiperplázia, mint az ateroszklerózis, mint a resztenózis; továbbá magas vérnyomás; pulmonális magas vérnyomás; elégtelen szervműködések, mint a szívelégtelenség és veseelégtelenség; vese isémiák; vese toxicitás: miokardiális infarktus;
koronáriás szívbetegség; szepszis.
Az ECE DNS szekvenciájából olyan szekvenciák is levezethetők, amelyekkel katalitikus hatású RNS molekulák állíthatók elő, ezek az úgynevezett „ribozimek. Ezek a katalitikus RNS molekulák úgy hatnak, hogy alkalmazásuk esetén az ECE-RNS-t vagy ECE-DNS-t elhasítják vagy inaktiválják, és ezáltal az ECE-protein szintézisét meggátolják.
Az ECE DNS szekvenciákat arra is felhasználhatjuk, hogy megfelelő expressziós vektorokkal olyan sejteket hozzunk létre, amelyek ezt az enzimet kifejezik. Ezek a sejtek többek között gyógyszerként alkalmazhatók.
Az endotelin konvertáló enzimek előnyösen ECE-inhibitorok azonosítására szolgáló teszt eljárásokban alkalmazhatók. Ezek a teszt eljárások rendszerint enzimreakciók, amelyekben egy szubsztrátum ECE-kata1izá11 hasítását potenciális inhibitorok jelenlétében mérik.
• · ·· ····
A találmány további tárgyát képezik az endotelin konvertáló enzimek inhibitorai, amelyeket a találmány szerinti endotelin konvertáló enzimek felhasználásával egy enzimtesztben azonosítunk.
A találmány olyan gyógyszerek előállítására szolgáló eljárásra is vonatkozik, amelyek egy endotelin konvertáló enzimet gátolnak. Az eljárás azzal jellemezhető, hogy ismert kémiai vegyületeket a találmány szerinti endotelin konvertáló enzim felhasználásával végzett enzim-tesztben vizsgálunk, és azokat, amelyek gátló hatással rendelkeznek, azonosítjuk, és az ilyen módon azonosított vegyületeket a szokásos vivő- és segédanyagokkal gyógyszerekké f o rmu1á ζ z u k.
Az alábbi példák a találmány szemléltetését szolgálják, és semmiképpen nem korlátozzák a találmány oltalmi körét .
1. példa: '
Az ECE-1 stimulálása foszforamidonna 1 primer FBHE marha endoteliális sejtekben.
Lefagyasztott FBHE marha endoteliális sejteket (ATCC CRL1395) - 14. passzázs - tartalmazó három csövecskét felolvasztottunk, és a sejteket három, egyenként 40 ml DMEM táptalajt (Gibco 041-01965) tartalmazó T175 sejt-tenyésztő palackhoz (Sarstedt cég) adtuk. A táptalajt a következőkkel egészítettük ki:
glutamin (200 mM; Gibco 043-05030) 5 ml/500 ml, • · · · ···· ·· gentamicín (Gibco 043-05750) 1 ml/500 ml, nem esszenciális aminosavak; végkoncentráció IX (Gibco, 0 4 3-0 1 1 4 0 ) ,
10% FCS (Gibco 011-06290) 37 percig 56°C-on inaktiválva;
+ 25 ng/ml bázikus FGF (Intergen 4125-80) (FGF = fibroblaszt növekedési faktor) .
A sejteket standard eljárás szerint, 37°C-on 7% szén-dioxidot tartalmazó légtérben, 100% levegő-nedvességtartalom mellett inkubáljuk. A következő nap táptalaj cserét végzünk. Mihelyt a sejtek összefolytak - ebben az esetben 4 nap múlva - a sejteket standard eljárás szerint tripszinnel kezeljük, és 9 T-175 palackba osztjuk el. A tenyészetet, mint leírtuk, 37°C-on inkubáljuk. Három nap múlva, amikor a tenyészet összefolyt, a sejteket standard eljárás szerint, újból tripszinnel kezeljük, és 20 T-palackba osztjuk el. További 3 nap múlva a sejtek 40 T-palackba oszthatók el. További 3 nap múlva 39 ilyen T-palack sejtjeit 78 T-palackba osztjuk el. Minthogy ezt a 78 T-palackot használjuk az aratáshoz, itt erre alkalmas sejt-tenyésztő palackokat (Costar; Acell 3155) alkalmazunk. Ezen T-palackok beoltása napján, a beoltás után, 68 palackhoz foszf oramidont (Peptide Institute; 4082 ; rövidítve: PHAM) adunk 10 4 M végkoncentrációban (+PHAM). Ez a kezelés az ECE-aktivitás indukcióját idézi elő. A megmaradt 10 T-palackot nem indukált kotroll sejtek gyanánt (-PHAM) futtatjuk. A leírt feltételek mellett további 2 • · napos inkubálás után a PHAM indukált sejteket és a kontroll sejteket (-PHAM) külön-külön learatjuk. A palackokat felnyitjuk, és a táptalajt leöntjük. A T-pa1ackokban lévő sejteket palackonként 10 ml PBS-sel ( Boehringer-Mannheim,
210331) mossuk (azaz a sejtgyep felett óvatosan öblögetjük) . A PBS-t leöntjük. Palackonként újból 5 ml PBS-t mérünk be. A sejteket a tenyésztő palack fenekéről sejt-kaparóval (cél1-scraper; Costar 3010) kaparjuk le, és sejtszuszpenzió formájában egy 150 ml-es centrifugacsőbe (Falcon 2076) visszük át, amelyet jégen tartunk el. Mindegyik T-palackot 10 ml PBS-sel még utána öblítünk. Az öblítéssel kapott sejtszuszpenziót a centrifugacsőbe lévő sejtszuszpenzióva1 egyesítjük. A sejteket centrifugálással (1200 ford/perc; 12 perc; Heraeus Christ Minifuge GL Nr. 4400; rotor 2150) ülepítjük le. A sejtmentes felülúszót eldobjuk, és az üledéket a sejtüledék háromszoros térfogatának megfelelő mennyiségű PBS-ben vesszük fel. Újbóli centrifugálás után a sejtmentes felülúszót megint eldobjuk. Az üledéket a feldolgozásig jégen tartjuk.
. példa:
A nem stimulált és a foszforamidonna1 stimulált FBHE marha endoteliális sejtek összehasonlító feldolgozása; a protein azonosítása.
Az 1. példában foszforamidon indukcióval és enélkül kapott FBHE sejteket (egyenként 500 pl nedves tömeg) 15 ml 0,5 mM diizopropi1-f1uoro-foszfát tartalmú PBS-ben 20 • · · · ···· · · • · · · • · · · · · · percig - jégfürdőben - ultrahanggal kezeljük. Centrifugálás után (20 perc; 1000 g) a felülúszóhoz hozzáadott 5%
Pluriol F68 segítségével a membránokat kicsapjuk, és újból 100 000 g melletti centrifugálással izoláljuk. A membránokat 2 ml 100 mM trisz pufferben (pH 8,0) digeráljuk, majd 1% Triton X-100 hozzáadásával oldhatóvá teszszük. A kapott membrán-oldatokat (egyenként 2,5 ml) lecentrifugáljuk, és az üledéket eldobjuk.
Mono-Q kromatografálás.
A foszforamidonna1 indukált (+) és nem indukált (-) sejtekből származó membránoldatokat Mono Q HR 5/5 oszlopon (Pharmacia), pontosan azonos körülmények mellett kromatografáljuk. Az oszlopokat 50 ml 0,1% Triton X-100 tartalmú trisz pufferrel (A puffer; pH 8,0) hozzuk egyensúlyba. A membrán-oldatok felvitele után az oszlopokat 15 percig A-pufferrel mossuk, majd B-puffer (A-puffer + 1 M nátrium-klorid) lineáris gradiensével 50 percig eluáljuk (átfolyási sebesség 0,2 ml/perc). Húsz 0,5 ml-es frakciót szedtünk, és ezeket humán big-Et-1 szubsztrátumma1 teszteltük. A kapott Et-l-et reverz fázisú HPLC-vel - a 3. példában leírt módon - mutattuk ki, és mennyiségi meghatározást is végeztünk. A legnagyobb enzimaktivitást mutató két frakciót mindkét anyagnál egyesítettük.
Superose 12 gé1kromatografá1ás
A Mono Q kromatografálással kapott eluátumokat
Centricon csövecskékben (Amicon) 250 μΙ-re koncentráljuk, és Superose 12 HR 10/36 oszlopon gé1-kromatografá1juk.
• · · · ···· • · · · ·
Feltételek: puffer 20 mM nátrium-foszfát
250 mM nátrium-klorid, pH 7,4
0,05% Triton X-l0 0 átfolyás 0,5 ml/perc frákció 0,5 ml
A frakciókat a 3. példában leírt vizsgálattal teszteltük, és a legnagyobb enzimaktivitású két frakciót mindkét anyagnál egyesítettük.
A frakciók protein tartalmát Bradford módszerével [Anal. Biochem., 7 2 , 24 8 ( 1 97 6)] határoztuk meg.
Eredmények :
A stimulált és nem stimulált sejtek tisztítása a következő eredményekkel járt a tisztítás különböző lépéseiben :
Tisztítási FBHE sejtek FBHE sejtek
lépés + foszforamidon - foszforamidon
Spec.akt. [ pU/mg] pg/ml
Membránok 129 44
Membrán-oldat 188 22
Mono Q kromatográfia 1470 78
Superose 12 kromatográf i a 4500 130
A S upe r őse 12 kromatográfia két aktív összehasonlításul 8%-os SDS-po1iakri1 amid gélre vittük • · · · · · · fel. A foszforamidonnal kezelt sejtekből származó tisztított ECE-1 gé1-mintázata a nem kezelt sejtekéhez hasonlítva egy további sávot mutat 250 000 daltonnál. Ha a proteineket ditiotreitol (DTT) reduká1ószerre1 visszük fel, az összehasonlításban 125 000 daltonnál mutatkozik a további sáv.
. példa:
ECE-1 aktivitás vizsgálata HPLC-vel.
Big-endote1 in-1 endote 1 in-1-gyé alakítása endotelin konvertáló enzimmel.
A 4. példa szerint kapott 1 μΐ enzim oldathoz hozzáadunk 21 μΐ 50 mM trisz, 50 mM imidazol, 250 mM nátrium-klorid tartalmú puffért (pH 7,4) és 2,5 μΐ humán big-endotelint (2 mg/ml 0, 1%-os vizes ecetsav oldatban) . Két óra múlva a képződött endotelin analízise céljából, a reakciót 72 μΐ 0,5%-os trifluor-ecetsav hozzáadásával állítjuk le. A mintát 1ecentrifugá1juk, és a felülúszót reverz fázisú magas nyomású fο 1yadékkromatográfiáva1 (RP-HPLC) analizáljuk azonosítás céljából, ahogyan J.Takada és munkatársai [Biochem. Biophys. Rés. Comm., 176, 860 (1991)] és K.Ohnaka és munkatársai [ Biochem.
Biophys. Rés. Comm., 168, 1128 (1990)] leírták. A minta mennyiségi vizsgálatát endotelin standarddal való összehasonlítás révén - UV kimutatás (205 nm) - végeztük.
Az enzimaktivitást az alábbiak szerint számítottuk ki, aktivitásban kifejezve:
• · · • · • · · « • · feldolgozott 6 μΜ endotelin ECE [ μϋ] = ------------------perc
Ezen eljárás szerint határoztuk meg a
FBHE sejtek ECE aktivitását a tisztítás különböző fázisaiban. Ugyanakkor Bradford módszerével [Anal. Biochem.,
2 , 24 8 (197 6)] a protein mennyiségét is meghatároztuk.
4. példa:
ECE tisztítása FBHE marha endoteliális sejtekből.
a) membrán izolálás, idegen protein tripszines kezelése .
ml FBHE sejtüledéket (1. példa szerint) 25 ml PBS pufferben digerálunk. A sejteket 5 percen át ultrahang fürdőben, jéghűtés mellett tárjuk fel. A sejt törmelékeket centrifugálással (10 000 g; 20 perc) távolítjuk el.
A felülúszóhoz keverés közben hozzáadunk 3,6 mg tripszint, majd másfél órán át szobahőmérsékleten kevertetjük. A mintát 1 órán át 1 0 0 0 0 0 g mellett centrifugáljuk, és az üledékben lévő membránokat 25 ml 100 mM trisz pufferben (pH 8,0) szuszpendáljuk.
b) ECE-1 oldatba vitele.
A 25 ml membránszuszpenzióhoz diizopropi1-f1uoro-foszfátot adunk 0,5 mM koncentrációig és Triton X-100-at 0,5% koncéntrációig, majd az elegyet egy éjszakán át jégfürdőben tartjuk.
• · ·· ···· • · • · · ·*
c) Mono Q kromatográfia.
Egy Mono Q - FPLC oszlopot (HR 16/10; Pharmacia)
0,025% Triton X-100 tartalmú 50 mM trisz pufferrel (A puffer) hozunk egyensúlyba. Miután a feloldódott elegyet rávittük az oszlopra, azt 30 percen át A pufferrel mossuk, és ezután 100 percen belül B puffer (A puffer + 1 M nátrium-klorid) lineáris grádiensében eluáljuk. Harminc ml-es frakciót szedtünk. A minta protein tartalmát
Bradford módszerével, az ECE-1 aktivitást a 3. példa szerint határoztuk meg. A legnagyobb specifikus aktivitást mutató két frakciót egyesítettük.
d) Gé1s zűrés .
A 4c) pont szerinti Mono Q eluátumot egy 30 kD Centricon membránon (Amicon) 500 μΐ-re koncentráltuk.
Egy Superose 12, HR 10/30 oszlopot (Pharmacia) 250 mM nátrium-klorid és 0,05% Triton X-100 tartalmú 20 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH 7,4) hozunk egyensúlyba, majd rávisszük a bekoncentrált mintát. A kiegyensúlyozó pufferrel kromatográfálunk 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett, és 0,5 ml-es frakciókat szedünk.
A frakciók specifikus aktivitásának a meghatározását a 4c) pontban leírtak szerint végezzük. A legmagasabb specifikus aktivitást mutató frakciót alább ismertetjük;
ez a frakció körülbelül 250 000 dalton-nál eluálódik, azonos kromatográfiás feltételek mellett futtatott standard proteinekhez viszonyítva.
• · ·· ···· • · • · · · • · · · · · ·· ··· ··
e) Eredmények.
Protein (mg) Specifikus aktivitás (pU/mg)
Membráno k 87 410
Membrán-oldat 87 360
Mono Q eluátum 6,6 3760
Superose 12 eluátum 0 , 35 15100
5. példa:
FBHE sejtekből tiszított ECE-1 SDS-gél analízise.
A 4. példa szerint tisztított ECE-l-et 8%-os Laemmli féle [ Natúré, 227, 680 (1979)] SDS-gélre visszük fel, és redukáló (+DTT) és nem redukáló feltételek mellett analizáljuk. Nem redukált állapotban az ECE-1 molekulatömege 250 000 dalton, de redukálás után egy 125 000 dalton körüli széles sávvá esik szét.
6. példa: .
Az ECE-1 deglikozi1á1 ás a.
A 4. példa szerint tisztított ECE-1 oldat 50 pl-ét
10%-os SDS oldattal 0,25% SDS tartalomra állítjuk be. A mintákat 20 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, és 1% Triton X-100 tartalomra állítjuk be. Húsz perc szobahőmérsékleten való tartás után a mintákhoz 5 pl 250 mM mátrium-foszfát puffért (pH 7,4) adunk, majd 0,25 μΐ • · · · · • · • · · · • · ·· · ··· • · · ··· • ·
PNGáz F-et és 0,5 pg Endo-F-et. (PNGáz F = glikopeptidáz F; Endo F = endoglikozidáz F). A mintákat 8 órán át 37’C-on inkubáljuk. Ezután ugyanilyen enzim mennyiségeket adagolunk, és további 8 órán át 37°C-on inkubálunk. A mintákat ezután 50 pl-re koncentráljuk, és 4-12%-os
SDS-gélben analizáljuk.
Eredmények:
Redukált állapotban a cukor-csoportok PNGáz F/Endo F eleggyel való hasítása révén a valószínű molekulatömeg
125 000 daltonról körülbelül 82 000 daltonra változik.
.példa:
Marha endoteliális sejtekből származó ECE-1 rész-szekvenciái.
A 4. példa szerint kapott ECE-1 oldatból 16x25 pg-ot preparatív 4-12%-os SDS-po1iakri1amid-grádiens-gé1ekre viszünk. A szokásos, Coomassie blue-val való festés után a gélt színtelenítjük, és 4x40 percig tiszta vízzel mossuk ki. A 250 kD-nál megfestődött sávokat szikével kivágjuk, és 200 pl 100 mM ammónium-hidrogén-karbonát oldattal digeráljuk. Hozzáadunk 0,5 pg tripszint, egy éjszakán át inkubáljuk, majd a felülúszót levesszük. A maradékhoz megint hozzáadunk 0,5 pg tripszint, és 5 órán át szobahőmérsékleten 200 pl 100 mM ammónium-hidrogén-karbonát pufferben inkubáljuk. A mintát ezután speed-vac-koncéntrátorban szárazra pároljuk. Az üledéket 40 pl vízben vesszük fel, és 4 pl 40 mM ditiotreitol oldat• · · · ···· ·· • · • · • · · · • · ·· ··♦ • · · ·· ·· tál 30 percig kevertetjük. Ezután 37°C-on hozzáadunk 4 pl 100 mM jód-acetamid oldatot. Két óra múlva a mintát szárazra pároljuk.
A kapott peptideket egy 1 mm x 15 cm-es reverz fázisú HPLC oszlopon 0,5%-os vizes trif1uor-ecetsav és 0,5% acetonitril tartalmú 90%-os acetonitril lineáris grádiensében választjuk el 3 órán keresztül. Az UV-aktív frakciókat összegyűjtjük, és a primer szekvenciákat gázfázisú szekvenátorban határozzuk meg.
Eredmények:
A következő rész-szekvenciákat határoztuk meg.
1. számú szekvencia:
Xaa-Xaa-Pro-As'n-Ala-Leu-Asn-Phe-Gly-Gly-Ile-Gly-ValVa1-Va1-G1y-His-Glu-Leu-Thr-His-Ala-Phe...
2. számú szekvencia:
Xaa-Tyr-Xaa-Lys-Xaa-Gly-Asn-Leu-Arg-Pro
3. számú szekvencia:
Xaa-I1e-Ala-Xaa-G1u-Thr-G1u-Leu-Glu-I1e. . .
(Ile) (Ile)
4. számú szekvencia:
Xaa-Pro-Glu-Phe-Leu-Leu-Glu-G1y-Leu-I1e-Thr-Asp-Pro...
5. számú szekvencia:
Xaa- (Gin) - (Ala) - (Glu) -Asn-Val-Ile-Gln-Val-Xaa-Gln. . .
•··· ····
Μ X • · • · ··· • « ·
β. számú szekvencia:
Val-Glu-Ile-Val-Phe-Pro-Ala-Gly-Ile-Leu-Gln-Ala-Pro-(Phe)-Tyr-Thr (Thr)
A zárójelben megadott aminosavak meghatározása bizonytalan .
Az 1. számú szekvencia alátámasztja, hogy az ECE-1 egy meta11oproteináz családhoz tartozó új protein, mivel összehasonlítva a NÉP 24.11 metállendopeptidázok és a termolizin szekvenciáival, jelentős, 72%-os, illetve 40%-os homológiát mutat.
8. péIda:
Endotelin konvertáló enzimet kódoló cDNS szekvencia előállítása.
a) RNS izolálás és cDNS bank létesítés.
Az 1. példa szerint foszforamidonna1 stimulált FBHE sejtekből vagy az 1. példa szerint foszforamidonnal stimulált HeLa sejtekből guanidinium-tiocianátos feltárással össz-RNS-t izoláltunk. Az eljárásban a Stratagene cég (La
Jolla, CA., USA) anyagaival és az „RNA Isolation Kit-tel (katalógus szám: 200345) dolgoztunk a cég útmutatója szerint.
A po1iadeni1 ált messenger RNS-t az származó fenti össz-RNS-ből szelektáltuk nitás-é1vá1asztással. Ezt az eljárást (Madison, WI . , USA) előírásai szerint, a
FBHE sejtekből oligo(dT) affia Promega cég cég anyagaival
• · ·· • « « · • · • ·» ··· • · • ·· és a „PolyATract mRNA Isolation System (katalógus szám: 25200) használatával hajtottuk végre. A po1iadeni1á1t messenger RNS-ből a Stratagene cég (La Jolla, CA . , USA) útmutatója s a Stratagene anyagaival és a „ZAP-cDNA Synthesis Kit (katalógus szám: 200400) használatával cDNS-t szintetizáltunk, amelyet ezután a Stratagene anyagainak a felhasználásával és előírásai szerint „Uni-Zap XR Gigapack II Cloning Kit (katalógus szám: 237611) segítségével lambda fágokba pakoltunk.
b) Oligonukleotid szondák előállítása „RACE-PCR-he z .
A cDNS fragmentumok polimeráz láncreakcióval [ PCR; lásd „Molecular Cloning, 2. kiadás (1989) J.Sambrook et al., CSH Press, 14.1 ff oldal] való klónozásánál a 7.
példában ismertetett 1. számú és 2. számú peptidekből indul tünk ki .
A genetikai kód alapján az 1. számú szekvencia 16-22 pozíciói közötti szakaszból és a 7. számú nukieinsavszekvenciából egy
5'-GGSCAYGARYTNACNCAYGC-3' képletű keveréket szerkesztettünk.
Hasonlóképpen, a 6. számú szekvencia 2-8 pozíciói közötti szakaszból és a 8. számú szekvenciából egy
5' -GARATYGTSTTYCCYGCYGG-3' képletű oligonukleotid keveréket, valamint a 6. számú szekvencia
9-16 pozíciói közötti szakaszból és a 9. számú szekvenciáié 1 egy « · • ·· r 4 • · · · ···· «· » · * · « • »· · · -¼ · • · * · ·· «·* ·« ··» • · «·
5'-ATYCTSCAGGCYCCYTTYTAYAC-3' képletű oligonukleotid keveréket szerkesztettünk.
A 7-9. számú szekvenciák a kódoló DNS szekvenciának felelnek meg. A genetikai kód ismert degenerá1tsága miatt bizonyos pozícióknál több nukleotidot vezettünk be. Ennélfogva a 7-9. számú szekvenciák esetén mintegy 512-szeres komplexitás keletkezik. Az említett szekvenciákat mint oligonukleotidokat szintetizáltuk.
A „PACE-PCR-hez kiegészítésül az alábbi nukleotidokat szintetizáltuk:
A-B-T18 (10. számú szekvencia):
5' -CGAGGGGGATGGTCGACGGAAGCGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'
A (az A-B-T18-ból (11. számú szekvencia):
5' -CGAGGGGGATGGTCGACGG-3' ;
B (az A-B-T18-ból) 12. számú szekvencia):
5'-GATGGTCGACGGAAGCGACC-3' .
A szintetizálásokat az Applied Biosystems 360A típusú DNS szekvenátórával végeztük. Az oligonukleotidokat a védőcsoportok eltávolítása után gé1e1ektroforézisse1 - akri1amid/karbamid gélben - tisztítottuk.
c) DNS-templátok előállítása a PCR-hez.
Az a) pont szerint foszforamidonna1 stimulált FBHE sejtekből származó RNS készítményből 5 pg össz-RNS-t vagy pg po1ί(A)+RNS-t 1 pg A-B-T18 oligonukleotiddal (10. számú szekvencia) és reverz transzkriptáz enzim segítségével egyszálú. cDNS-sé (l’cDNS) alakítottunk. Ennél az eljárásnál a Gibco-BRL (Eggenstein, Németország) anyagai28 ”*ϊ ϊ*·· .“· ·» ·· • · · · · * · . *. ···. -·· ··· ·..
val dolgoztunk, és a cég előírásai szerint a „Superscript
Preamplification System-et (katalógus szám: 8089SA) használtuk. Miután a reakció végbement, a szintézis termékeit a BIO 1.0 1 cég (La Jolla, CA. , USA) „Geneclean II
Kit készítményével tisztítottuk meg a kisebb molekuláktól és a felesleges ο 1igonukieotidoktó1.
d) cDNS rész-szekvencia PCR sokszorozása és klónozása.
A polimeráz láncreakciót ismert technológia szerint végeztük [ lásd: J.Sambrook et al., „Holecular Cloning 2.
kiadás (1989), CSH Press, 14.1 ff oldal] . A Perkin-Elmer cég „DNA Thermal Cycler készülékét használtuk. Ezesetben az M.A.Frohman és munkatársai [ Proc. Natl. Acad. Sci.,
5, 8998-9002 (1988)] szerinti „beskatulyázott primer („ ve rschachte11en Primer) elvet alkalmaztuk, J.D. Fritz és munkatársai [ Nucl . Acids Rés., 1 9, 3747 (1 991 )] módosításával .
A c) pontban kapott l°cDNS-t a 8. számú szekvencia szerinti oligonukleotid és az A ο 1igonukleotid (az A-B-T18-ból) 20-20 pM-jával sokszoroztuk. A feltételek a következők voltak: 35 ciklus, ciklusonként 1' 95°C; 2'
55°C; 3' 72°C.
A PCR termékeket elektroforézissel, 1,2%-os LMP-agaróz/TBE gélben választottuk el.
(LMP = low me'lting point; TBE puffer: 0 , 0 82 M trisz,
0,082 M bórsav, 0,002 M EDTA, pH 8).
A gélből a teljes nyomsávot mintegy 10 gélszeletke alakjában kivágtuk, és növekvő móltömegű külön frakciókként megolvasztottuk.
Ezen frakciók alikvot részeit külön-külön egy második PCR-ben sokszoroztuk a 9. számú oligonukleotid és a B oligonukleotid (az AB-T18-ból) 20-20 pmóljának felhasználásával. Ennél a reakciónál az agarózos rész nem haladta meg egyszer sem a PCR elegy térfogatának 1/10-ét. Re akeiófe11éte1ek: 35 ciklus; ciklusonként 1' 95°C; 2'
0°C; 3' 72°C. .
E frakciók sokszorozott termékeinek gélelektroforetikus elválasztása világosan mutatta, hogy az első PCR termékspektrumának komplexitása csökkent, a második PCR után pedig egy körülbelül 1000 bp hossúságú határozott sávot lehetett felismerni.
Az ilyenképpen szelektált PCR-terméket standard módszerekkel eluáltuk. Az 1000 bp méretű sáv azonosságának ellenőrzésére, azaz hogy ez egy bovin endotelin konvertáló enzim cDNS fragmentuma, egy további, harmadik PCR sokszorozást végeztünk a 7. számú oligonukleotid és a B oligonukleotid (az A-B-T18-ból) használatával. Ez a PCR termék egy körülbelül 950 bp méretű sávot mutatott.
A második PCR reakcióban kapott 1000 bp méretű sávot a pCRII vektorba (TA Cloning Kit; Invitrogen Corp., San Diago; katalógus szám: K2 0 0 0-0 1 ) szubki ónoztuk, a plazmidot E.coli DH5 alfa sejtekben elszaporitottuk. Az egyik klón szekvencia analízise egy 189 aminosavból álló nyílt • · leolvasási keretet mutatott ki (13. számú és 14. számú szekvenciák) . Ugyanebben a leolvasási keretben találhatók az 1. számú, 2. számú és a 4. számú peptid szekvenciák is, és ezek egyértelműen meghatározzák a cDNS fragmentum azonos ságát.
e) Bovin endotelin konvertáló enzim cDNS klónozása.
Az la) példában ismertetett technika szerint cDNS tárat létesítettünk az első szál szintézisének lépésében használt statisztikus primer keverékkel. A primereket az alábbi szekvenciaként szintetizáltuk:
5' -GAGAGAGAGTCGACGGTACCN7; 15. számú szekvencia.
A cDNS szintézis fent ismertetett technikájától eltérően a kétszálú cDNS-t egy 2 ml-es S-1000 Sephacryl oszlopon („Superfine fokozat; Pharmacia, Freibrug; katalógus szám: 17-0476-01) frakeioná1tuk. A legalább 1 kb méretű cDNS fragmentumokat tartalmazó frakciókat alkoholos kicsapással, ismert módon koncentráltuk, és a továbbiakban a cDNS-Synthese Kit használati utasításának megfelelően kezeltük olyan módon, hogy a cDNS készítményt
Xhol helyett Sáli restrikciós endonukleázzal hasítottuk, és lambda vektorba integráltuk.
A cDNS bankból 2x10° kiónt egy olyan DNS szondával hibridizá1 tünk, amelyet a részleges marha cDNS-ből (13.
számú szekvencia) - 136 - 156 pozíciók, illetve 391 - 412 pozíciók közötti szakasz - származó alábbi nukleotidokka 1
5' -CGGCCCTGGTGGAAGAACTCG-3' (16. számú szekvencia) és
5' -TGCGGACGGAACACCAGACCT-3' (17. számú szekvencia) állítottunk elő. A DNS szondát polimeráz láncreakcióban (PCR) digoxigenin-dUTP jelenlétében - mint az lf) példában leírtuk - jeleztük. A hibridizálást szigorúan meghatározott feltételek mellett végeztük (lásd az lf) példát), amikoris a hibridizáció megtörténte után az utolsó mosási lépésben 60°C hőmérsékletet és 0,1 x SSC-t használtunk, majd ezután a megkötött DNS szonda immunológiai kimutatása következett. A kiválasztott kiónok szekvenálása a marha C60 cDNS szekvenciát (18. számú szekvencia) eredményezte, amely egy teljes leolvasási keretet (19.
számú szekvencia) tartalmazott:
Ezután a bank 2 χ 106 kiónját egy olyan DNS szondával hibridizá1tuk, amelyet a C60 cDNS kiónból (18. számú szekvencia) - 500 - 522, illetve 14 - 35 pozíciók közötti szakaszok - származó alábbi ο 1igonukieotidokka1
5' -GCCAGCGCCGTCTCAAAGTCCAG-3' (20. számú szekvencia) és
5' -TGGGGGACCTTCAGCAACCTCT-3' (21. számú szekvencia) állítottunk elő, mint fent leírtuk. A hibridizálást azonos feltételek mellett végeztük. A kiválasztott kiónok szekvenálása egy 708 aminosavból álló teljes leolvasási kerettel (23. számú szekvenica) rendelkező marha cDNS szekvenciát (22. számú szekvencia) eredményezett.
A lambda gtll-ben fenntartott, kereskedelemben kapható marha tüdő cDNS bankból (Clontech Laboratories Inc.,
030 Fábián Way, Palo Alto, CA. , USA; katalógus szám: BllOOőb) 5xl08 plakk képző egységet 10% ρο 1ieti1éng1iko1 • · • · · · • · · · • · • · · · · · • · · • ··
6000 és 1 M nátrium-klorid elegyével való kicsapással koncentráltunk, majd 100 μΐ bideszti11á1t vízben reszuszpendáltuk, és 5 percig 70°C-on tartottuk. Ebből a lizátumból 5 μΙ-t 50 μΐ standard PCR reakcióban (8d) példa) sokszoroztunk a gtll fwd primer és az
5' -GGTGCTTGATGATGGCTTGGTTGT-3' (26. számú szekvencia) primer hasnálatával. A gtll fwd primer a β-galaktozidáz gén (génbank: ECLACZ) 2979-3003 pozíciói közötti szakasznak felel meg, és a lambda gtll klónozó vektorban közvetlenül azon EcoRI integrációs hely előtt helyezkedik el, amelyet a bank létesítésénél használtak [ R.A.Young. R.W. Davis, Genetic Engineering, szerk.: J.Setlow és A.Hollander; Plenum Press, N.Y., 29-41 old.] . A 26. számú szekvencia által leírt primer a 22. számú szekvencia
280-303 pozíciói közötti szakasznak felel meg.
A sokszorozást 40 ciklusban végeztük. A PCR-terméket egy 3%-os „Low Melting Point Nu-Sieve GTG-agaróz gélben (FMC Bio-Products, 191 Thomaston Street, Rockland, Me
04841, USA; katalógus szám: 50082) választottuk el, és
400-600 bázispár méretű tartományban az egyes gélszegmentumok kivágása révén frakeioná1tuk. A gé1szeleteket - mint ahogyan a 8d) példában leírtuk - megolvasztottuk, és ebből 1,5 μΙ-t 50 μΐ további PCR reakcióban sokszoroztunk a gtll fwd és az 5' -AGATGGAGCTGGTCACCGAGATGC-3' (27. számú szekvencia) primerek használatával. A 27. számú szekvencia által leírt primer a 22. számú szekvencia
127-150 közötti szakasznak felel meg.
···· ···· • · • · · ·
A kapott PCR fragmentumokat a pUC18 ρ1azmidvektorba [ D . Yani s eh-Pe r ron , J.Vieira, J.Messing, Gene, 3 3 , 103-119 (1985)] szubkiónoztuk, majd szekventá1tuk (28. számú s ze kvencia) .
Ez a szekvencia a 175-324 nukieotidőkka1 átfedi a
22. számú szekvencia 1-150 pozíciói közötti szakaszt, és ezt 5' irányban 174 nukleotiddal meghosszabbítja. A kapott teljes szekvencia (29. számú szekvencia) 754 aminosavnak (30. számú szekvencia) megfelelő nyílt leolvasási keretet határoz meg.
f) Humán endotelin konvertáló enzimet meghatározó cDNS klónozása.
Minthogy az endotelin-1 jelenlétét kimutatták humán placentában, feltételeztük, hogy az endotelin konvertáló enzim a placentában is kifejeződik. Ezért jelzett marha cDNS szonda használatával szűrtünk egy humán kgt-ll placenta cDNS bankot. A digoxigenin-dUTP jelzett marha cDNS szonda előállításához a részleges marha cDNS szekvencia (13. számú szekvencia) 1 ng-ját (1 ng/ml) „templát gyanánt használtuk egy PCR reakcióban [lásd: J.Sambrook et al . , „Molecular Cloning 2. kiadás (1 98 9) 14.1 ff old.,
CSH-Press] . A „szensz oligonukleotid (16. számú szekvencia) a 13. számú szekvenciában a 136-156 pozíciók közötti szakaszt ölelte fel, az „antíszensz oligonukleotid (17.
számú szekvencia) a 13. számú szekvenciában a 392-412 pozíciók közötti szakaszt ölelte fel. Perkin-Elmer féle „DNA Thermal Cycler készülékben 35 ciklust futtattunk.
• · ·· ·· ·· • · · · · • ··· «·· ···
Ciklusonként! paraméterek: 2 perc 9 4 ° C ; 2 perc 6 0 ° C ; 3 perc 72°C. A jelzett 276 bp méretű marha cDNS szondát ezután agaróz gélben tisztítottuk, és főzéssel denaturáltuk. A humán placenta Xgt-ll cDNS bankból (Clontech, HL
1008b) körülbelül 650 000 kiónt szűrtünk meg ezzel a szondával, kevéssé szigorú feltételek mellett. A szűrőlevonatok hibridizá1ását ezzel a szondával egy éjszakán át végeztük, 60°C hőmérsékleten, a következő elegyben: 5 x SSC, 2% blokkoló reagens (Boehringer-Mannheim, No. 1096176), 0,1% N-lauril-szarkozin, 0,02% SDS. A szűrőket ezután 2x5 percig 60°C-on 0,1% SDS tartalmú 2 x SSC-ben, majd 20 percig 60°C-on 0,1% SDS tartalmú 0,5 x SSC-ben mostuk. A megkötött DIG-szondák azonosítása végett a szűrő további kifejlesztését a Boehringer-Mannheim által leírt technológiának megfelelően végeztük (DIG = Nukleinsáuredetektionskit, No. 1175041.
A 24. számú szekvencia szerinti cDNS szekvenciával kiónokat izoláltunk. A 24. számú szekvencia szerinti cDNS szekvencia 1-2109 pozíciói közötti szakasz kódolja a 25.
s z amu s zekvencia aminosavszekvenciát
Az aminosavszekvencia megfelel a primer endotelin konvertáló enzim szekvencia nagy részének, mivel az izolált endotelin konvertáló enzim tripszines peptid szekvenálásából származó 1. - 6. szekvenciák szerinti peptidek e szekvenciában újból összetalálkoznak. Az általánosan elfogadott HEXXH .metalloproteináz szekvencia is, mint HELTH szekvencia azonosítható a 25. számú aminosavszekvencia
540-544 pozícióiban.
Placenta poliA(+) RNS-ből és az
5' -GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGCCAAGCAGGCCACCAGTCCTG-3' oligonukleotidból (31. számú szekvencia, mint első szál cDNS szintézis-primerbő1 cDNS tárat állítottunk elő a 8e) példában leírt módon. A 32-53 mukleotidok a 24. számú szekvencia 32-53 pozíciói közötti szakasznak felelnek meg. A cDNS készítményt - mint a 8a) példában leírtuk az Uni-ZAP XR lambda vektorba intergáltuk. A kapott 4xl05 független kiónt sokszoroztuk, és 5x10 plakk képző egységgel - mint a 8e) példában leírtuk - 100 μΐ reakcióelegyben PCR reakciót végeztünk, amelyben primerekként a
31. számú szekvenciát és a C szekvenciát használtuk. A C primer a lambda vektor Bluescript SK(-) részében (881-904 pozíciók; Sequenzfile ARBLSKM) helyezkedik el.
A PCR reakciót 40 ciklusban, 65°C hibridizációs hőmérséklet mellett végeztük. A reakciótermék 1 μΐ-ét 50 μΐ friss PCR reakcióelegyhez adtuk és 40 ciklusban, 60°C hibridizációs hőmérséklet mellett végeztük a sokszorozást. Primerekként a D oligonukleotidot és az
5'-CCTGCCGCCAGAAGTACCACCAACA-3' (32. számú szekvencia) oligonukleotidot használtuk.
A D primer a lambda Uni-ZAP XR vektor Bluescript
SK(-) részében (857-880 pozíciók; Sequencfile Genbank:
ARBLSKM) helyezkedik el, a 32. számú szekvencia szerinti primer a 24. számú szekvenciában a 11-35 pozíciók közötti • · ·
• ί szakasznak felel meg. A reákeióterméket, mint fent leírtuk, a pUC18 vektorba szubkiónoztuk, és a kiválasztott kiónokat szekvenáltuk.
A kapott szekvencia a humán ECE cDNS egy újabb 5'-részletének (33. számú szekvencia) felelt meg, amelynek 3'-terminális szakasza (188-222 pozíciók közötti rész) a 24. számú szekvencia 1-35 pozíciói közti szakaszával azonos. A szekvenciát ez a szakasz 187 nukleotiddal 5' irányban hosszabbítja meg, és így a teljes humán ECE szekvenciát (35. számú szekvencia) adja meg, amely 753 aminosavból álló (36. számú szekvencia) nyílt leolvasási keretet határoz meg.
. példa:
Rekombináns ECE előállítása emlős sejtekben.
1. Expressziós vektor készítése membránhoz kötött humán ECE részére.
A teljes humán ECE expressziója céljából a 35. számú szekvencia szerinti cDNS 29-2720 nukleotidjait, megfelelő adapterek segítségével, bevezettük a pcDNAneo expressziós vektor (Invitrogen, 3985 B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA., 92121, USA; termékszám: V790-20) KpnI és Xbal restrikciós helye közé. Az ECE szekvencia magával vitte saját transzlációs start és stop szekvenciáit, valamint egy általánosan elfogadott Kozák szekvenciát [M.Kozák, J.
Cell Bioi., 108, 229-241 (1989)] . Az ECE mRNS transzkripciója ebben a vektorban az erős citomagelövirus promoter • · · · ···· ··*· szabályozása alatt áll. A transzfektált sejtek szelekcióját a plazmádban lévő neomicin rezisztencia gén segítségével végeztük. Ez a gén csak a G418-rezisztens telepek növekedését engedi meg.
2. Expressziós rendszer előállítása szekretált humán
ECE részére.
a) A klónozást a kereskedelemben kapható pcDNAneo eukarióta expressziós vektorban (Invitrogen; termékszám: V79Q-20) végeztük. Ennek érdekében a vektort először
EcoRI és EcoRV restrikciós enzimekkel hasítottuk.
b) Ezután a humán ECE cDNS-ből (35. számú szekvencia) a 241-2396 pozíciókat felölelő nukleinsav fragmentumot polimeráz láncreakcióval - a megfelelő oligonukleotid primerek használatával - nyertük. A választott 5' primer szekvencia a nuk1einsavszekvenciában (35. számú szekvencia) a 241 és 245 pozíciók közötti 5'ACGCG-3' bázis-sor megváltozását vonja maga után. Ennek a lépésnek a révén, a 246. pozíció bevonásával, felismerő szekvencia képződött a Miül restrikciós endonukleáz számára. A kapott ECE fragmentumot egy következő lépésben Mlul-gyel hasitj uk.
c) További fragmentumként két szintetikus oligonukleotidból (szá1/e11enszá1) előállítottuk a humán szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) kódoló szekvenciáját a publikált szekvencia [ C.Collen, Natúré, 3 0 1 , 2 1 4-22 1 (1983)] szerinti 74. és 176. nukleotid között. A megadott szekvencián felül a szintetikus oligonukleotidokat olyan • · · · · • · · · · · ··· ·«« « Λ .,* adapterekkel láttuk el, amelyek egy 5' EcoRI és egy 3' Miül túlnyúló véget hoztak létre.
A b) és c) pontok szerint előállított fragmentumok ligálása a bennük lévő azonos Miül restrikciós helyeknél a humán t-PA gén szignálpeptid leolvasási keret és a humán ECE gén extracelluláris dómén fúzióját eredményezte. Ennek a fúziós terméknek az a) pont szerinti EcoRI-gyel és EcoRV-vel hasított pcDNAneo vektorba való ligálása szekretált humán ECE-hez alkalmas expressziós rendszert eredménye z.
3. Expresszió emlős sejtekben.
Az expressziós vektorok DNS-ét lipofektamin (GIBCO; Life Technologies GmbH; Diese1strasse 5, 76334
Eggenstein, NSZK; termékszám: 530-8324SA) segítségével emlős sejtekbe transzfektá1tuk. A következő sejteket használtuk: CH0-K1 (ATCC CCL 61), BHK-21 (ATCC CCL 10),
293 (ATCC CRL 1573) és C1271 (ATCC CRL 1616).
Egy 6 tartályos tenyésztő lemezre tartályonként 3 ml táptalajban egyenként 2xl05 sejtet oltottunk le. A következő napon végeztük a transzfektálást. Ekkor a sejteket egyszer mostuk PBS-ben. A 1ipofektaminna1 való transzfekeiót a gyártó cég (GIBCO) előírásai szerint hajtottuk végre [ Focus, 3_, (15. szám) 73-78 (1 993)] . Minden tartályhoz 1 pg DNS-t és 6 μΐ 1 ipofektamint adtunk, amelyeket összesen 1000 μΐ szérum-mentes sejt-tenyésztő táptalajban vettünk fel. Hat órás 37°C-on való inkubálás után a sejteket egyszer mostuk PBS-ben, majd egy éjszakán • · *· *♦ **! ··♦ ··♦ . · · · « ·»· ···♦ át normál táptalajban inkubáltuk. A következő napon egy tartály sejtjeit tripszinnel való kezelés után 1, 5 vagy
Petri csészére (átmérő: 10 cm) osztottuk el. Egy nap múlva a transzfektált sejteket G418-cal (GIBCO; katalógus szám: 066-01811Y; az áru neve: geneticin) való kezeléssel szelektáltuk, azaz a táptalajt egy olyan táptalajra cseréltük, amely 1,2 mg/ml G418-at tartalmazott. A Petri csészében 7-10 nap múlva G418 rezisztens telepek növekedését észleltük. Ezeket „cloning cylinder módszerrel izoláltuk [ DNA’-cloning, II. kötet, 220. old. szerk. :
D.M.Glover, IRL Press (1985)] . Az izolált telepeket körülbelül 1,5 ml G418 tartalmú táptalajban egy 24-tartályos lemez egy-egy tartályához adtuk. Az összefolyás elérése után a sejteket - tripszines kezelés után - nagyobb tenyésztő edényekbe vittük át.
a) Membránzhoz kötött ECE.
Azokat az ECE sejteket, amelyek a membránhoz kötött
ECE-t fejezik ki, sejt-fe1tárás és frakcionálás után ECE jelenlétére vizsgáltuk az 1. és 2. példában leírt módon.
(Foszforamidőn stimulációt nem végeztünk.) A vizsgált telepek specifikus aktivitása membrán alapra vonatkoztatva elérte a 1550 μϋ/mg protein értéket. A 38-as telep membránjait tovább dolgoztuk fel, és a következő eredményt kaptuk:
• « · · * .·· • \ ·’\ ··; ··; jr· ·· ·«» .··..♦
Tisztítási lépés Specifikus aktivitás (μϋ/mg protein)
Membránok 1550
Membrán-oldat 2010
Mono Q kromatográfia 12 00 0
b) Szekretált ECE.
Azokat a sejteket, amelyek az ECE-t membrán-horgony nélkül fejezik ki, és a sejt-tényésztő táptalajba választják ki, rekombináns ECE jelenlétére teszteltük úgy, hogy az összefolyt sejtek tenyészetének felülúszóját vizsgáltuk. A tenyészet-fe1ü1úsζót 2 napi tenyésztés után vettük le, és 1000 g mellett való centrifugálással távolítottuk el a sejttörmelékeket. A felülúszó 6 ml-ét ezután Centricon 10 000 készülékben (Amicon, W.R.Grace +
CO . , Danver, MA, 01923 USA; termékszám: 420 6) és 3220 g mellett való centrifugálással (körülbelül 30 perc) koncentráltuk. Az alacsony mo1eku1atömegű anyagokkal átfutó folyadékot („Centricon-e1uat) félretettük. A Centricon-t egyszer mostuk 1 ml 10 mM trisz és 150 mM nátrium-klorid tartalmú PBS-sel (pH 7,5). A koncentrátumot 300 μΐ „Centricon-Eluat-bán vettük fel.
A koncentrátum 18 μΙ-ét a 3. példában leirt ECEtesztben analizáltuk.
A szekretált ECE térfogat-aktivitása egyes vizsgált rekombináns sejt-telep esetén elérte a 10 pU/ml táptalaj értéket.
SZEKVENCIÁK JEGYZÉKE
AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 23 aminosav (B) Típus: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (iii) FELTÉTELEZETT-E: nem (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA: belső (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (F) SZÖVETTÍPUS: endoteliális (H) SEJTVONAL: fetális marhaszív endoteliális sejtvonal (xi) Az 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Xaa Xaa Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly 15 10 15
His Glu Leu Thr His Ala Phe 20
A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: agyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA: belső • · · · · · • · · · ···· ·· • · · · • · · · · · · » · · · · • · · · · · · (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (H) SEJTVONAL: fetális marhaszív endoteliális sejtvonal (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Gly Asn Leu Arg Pro 15 10
A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 10 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(C) SZÁLTÍPUS: agyszálú
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
MOLEKULA TÍPUSA: peptid
(v) A FRAGMENTUM TÍPUSA: belső (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (H) SEJTVONAL: fetális marhaszív endoteliális sejtvonal (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: módosított hely (B) HELYZET: 8 (D) Egyéb adatok: /megjegyzés3 Xaa = Leu vagy Ile (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: módosított hely (B) HELYZET: 7 (D) Egyéb adatok: /megjegyzés3 Xaa = Glu vagy Ile (xi) A 3.
SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Xaa Ile Alá Xaa Glu Thr Xaa Xaa Glu 1 5
Ile 1 0 • · · · ····
A 4. SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 13 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA: belső (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (H) SEJTVONAL: fetális marhaszív (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Xaa Pro Glu Phe Leu Leu Glu Gly 1 5 endoteliális sejtvonal
Leu Ile Thr Asp Pro 10
Az 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 11 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA: belső (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (H) SEJTVONAL: fetális marhaszív endoteliális sejtvonal (xi) Az 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Xaa Gin Ala Glu Asn Val Ile Gin Val Xaa Gin 15 10
A 6. SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI:
······ ·· « • · · · · • · · · · · (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 16 aminosavn (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (v) A FRAGMENTUM TÍPUSA: belső (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus
(H) SEJTVONAL: fetális marhaszív endoteliális sej tvonal
ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: módosított hely
(B) HELYZET: 7
(D) Egyéb adatok: /megjegyzés= Xaa = Alá vagy Thr
(xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Val Glu Ile Val Phe Pro Xaa Gly Ile Leu Gin Alá Pro Phe Tyr Thr
1 5 10 15
A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 Bázispár (B) TÍPUS: Nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: Egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGSCAYGARY TNACNCAYGC • ·
A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 Bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GARATYGTST TYCCYGCYGG 20
A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 23 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATYCTSCAGG CYCCYTTYTA YAC 23
A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 45 Bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA 10:
CGAGGGGGAT GGTCGACGGA AGCGACCTTT TTTTTTTTTT TTTTT • · · · · · · • ··· ··» «····· • · · * · · ·· *·» ·· · ,.
A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 19 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGAGGGGGAT GGTCGACGG 1 9
A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATGGTCGAC GGAAGCGACC 20
A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 570 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (H) SEJTVONAL: fetális marhasziv endoteliális sejtvonal • · (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 1..567 (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC ACC CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC 48
lle 1 Leu Gin Alá Pro Phe 5 Tyr Thr Arg Ser 10 Ser Pro Asn Alá Leu 15 Asn
TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC GTG GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT 96
Phe Gly Gly He Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Alá Phe
20 25 30
GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC GAC AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGG 144
Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp
35 40 45
TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG GCG TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG 192
Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Alá Phe Lys Gin Gin Thr Alá Cys Met
50 55 60
GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC 240
Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly
65 70 75 80
CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG 288
Arg His Thr Leu Gly Glu Asn He Alá Asp Asn Gly Gly Leu Lys Alá
85 90 95
GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC TGG GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG 336
Alá Tyr Arg Alá Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Alá Glu Gin
100 ,105 110
ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC ACC AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG AGT 384
Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser
115 120 125
TTT GCA CAG GTC TGG TGT TCC GTC CGC ACC CCC GAG AGT TCG CAC GAA 432
Phe Alá Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu
130 135 140
GGT CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCC CGC TTC CGG GTC ATC GGC 480
Gly Leu He Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val lle Gly
145 150 155 160
TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC TCG GAA CAC TTC CAC TGC CCG CCC 528
Ser lle Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe His Cys Pro Pro
165 170 175
GGC TCA CCC ATG AAC CCG CAT CAC AAG TGT GAA GTC TGG TGA 570
Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp
180 185
A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 189 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Ile 1 Leu Gin Alá Pro 5 Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Asn Alá Leu Asn
10 15
Phe Gly Gly Ile Gly 20 Val Val Val Gly His 25 Glu Leu Thr His Alá Phe 30
Asp Asp Gin 35 Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp 40 Gly Asn Leu Arg Pro Trp 45
Trp Lys Asn 50 Ser Ser Val Glu Alá Phe Lys 55 Gin Gin Thr Alá Cys Met 60
Val 65 Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn 70 Gly Glu Pro Val Asn Gly 75 80
Arg His Thr Leu Gly 85 Glu Asn Ile Alá Asp 90 Asn Gly Gly Leu Lys Alá 95
Alá Tyr Arg Alá Tyr 100 Gin Asn Trp Val Lys 105 Lys Asn Gly Alá Glu Gin 110
Thr Leu Pro 115 Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn 120 Gin Leu Phe Phe Leu Ser 125
Phe Alá Gin 130 Val Trp Cys Ser Val Arg Thr 135 Pro Glu Ser Ser His Glu 140
Gly 145 Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser 150 Arg Phe Arg Val Ile Gly 155 160
Ser Ile Ser Asn Ser 165 Lys Glu Phe Ser Glu 170 His Phe His Cys Pro Pro 175
Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp 180 185 • · · · • · · · · · • · · « · · ··
A 15. SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) FELTÉTELEZETT-E: igen (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAGAGAGAGT CGACGGTACC NNNNNNN 27
A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGGCCCTGGT GGAAGAACTC G 21
A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) ANTISZENSZ-E: igen (xi) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGCGGACGGA ACACCAGACC T 21
A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 1703 bázispár
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁLTÍPUS: egyszálú
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (H) SEJTVONAL: fetális marhaszív endoteliális sejtvonal (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 2..1703 (xi) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
T GGC CAC TCG CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC 46
Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn
10 15
CAA GCC ATC ATC AAG Gin Alá Ile Ile Lys CAC CTC CTT GAA AAC TCC ACG GCC AGC GTG AGC Asn Ser Thr Alá Ser Val Ser 94
His Leu Leu Glu
20 25 30
GAG GCA GAG AGG AAG GAC CAG GAG TAC TAC CGA GCC TGC ATG AAC GAA 142
Glu Alá Glu Arg Lys 35 Asp Gin Glu Tyr 40 Tyr Arg Alá Cys Met Asn Glu 45
ACC AGG ATT GAG GAG CTC AAG GCC AAA CCC CTG ATG GAG CTC ATT GAG 190
Thr Arg Ile Glu Glu 50 Leu Lys Alá 55 Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu 60
AAG CTC GGC GGC TGG AAC ATC ACG GGG CCC TGG GAC AAG GAC AAC TTC 238
Lys Leu 65 Gly Gly Trp Asn Ile 70 Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe 75
• · ·· ····
CAG GAC Gin Asp 80 ACC CTG CAG Gin GTG Val 85 GTC ACA TCC CAC TAC CAC ACC TCC CCC TTC 286
Thr Leu Val Thr Ser His Tyr 90 His Thr Ser Pro Phe 95
TTC TCC GTC TAC GTC AGT GCC GAC TCC AAG AAT TCC AAC AGC AAC GTG 334
Phe Ser Val Tyr Val 100 Ser Alá Asp Ser Lys 105 Asn Ser Asn Ser Asn 110 Val
ATC CAA GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC TTA CCC TCA AGA GAT TAT TAC 382
Ile Gin Val Asp 115 Gin Ser Gly Leu Gly 120 Leu Pro Ser Arg Asp 125 Tyr Tyr
CTG AAC AAA ACC GAG AAT GAG AAG GTG CTG ACG GGA TAC CTG AAC TAC 430
Leu Asn Lys 130 Thr Glu Asn Glu Lys 135 Val Leu Thr Gly Tyr Leu 140 Asn Tyr
ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGA GGA GGG GCC GAG GAC ACC ATC 478
Met Val 145 Gin Leu Gly Lys Leu 150 Leu Gly Gly Gly Alá Glu Asp 155 Thr Ile
CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC CTG GAC TTT GAG ACG GCG CTG GCC AAC 526
Arg Pro 160 Gin Met Gin Gin 165 Ile Leu Asp Phe Glu 170 Thr Alá Leu Alá Asn 175
ATC ACC ATC CCC CAG GAG AAG CGC CGG GAC GAG GAA CTC ATC TAC CAC 574
Ile Thr Ile Pro Gin 180 Glu Lys Arg Arg Asp 185 Glu Glu Leu Ile Tyr 190 His
AAA GTG ACG GCG GCT GAG TTG CAG ACC TTG GCG CCC GCC ATC AAC TGG 622
Lys Val Thr Alá 195 Alá Glu Leu Gin Thr 200 Leu Alá Pro Alá Ile 205 Asn Trp
CTG CCC TTC CTC AAC ACC ATC TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCA 670
Leu Pro Phe 210 Leu Asn Thr Ile Phe 215 Tyr Pro Val Glu Ile Asn 220 Glu Ser
GAG CCT ATT GTC ATC TAC GAC AAA GAA TAC CTG AGC AAG GTC TCC ACC 718
Glu Pro 225 Ile Val Ile Tyr Asp 230 Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val 235 Ser Thr
CTC ATC AAC AGC ACA GAC AAA TGC CTG CTG AAC AAC TAC ATG ATC TGG 766
Leu Ile 240 Asn Ser Thr Asp 245 Lys Cys Leu Leu Asn 250 Asn Tyr Met Ile Trp 255
AAC CTG GTA CGG AAG ACG AGC TCC TTC CTC GAT CAG CGC TTC CAG GAC 814
Asn Leu Val Arg Lys 260 Thr Ser Ser Phe Leu 265 Asp Gin Arg Phe Gin 270 Asp
GCC GAC GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAT GGG ACC AAG AAG ACG TGT 862
Alá Asp Glu Lys 275 Phe Met Glu Val Met 280 Tyr Gly Thr Lys Lys 285 Thr Cys
CTT CCC CGC TGG AAG TTT TGT GTG AGT GAT ACA GAG AAC ACC TTG GGC 910
Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly
290 295 300 β · ·
TTC GCC CTG GGC CCC ATG TTC GTC AAA GCG ACC TTC GCT GAG GAC AGC Asp Ser 958
Phe Ala Leu 305 Gly Pro Met Phe Val 310 Lys Ala Thr Phe Ala 315 Glu
AAG AAC ATA GCC AGC GAG ATC ATC CTG GAG ATC AAG AAG GCG TTT GAA 1006
Lys Asn Ile Ala Ser Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Glu
320 325 330 335
GAG AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAA GAT ACT CGG AAA TCG 1054
Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser
340 345 350
GCC AAG GAA AAG GCG GAC GCG ATC TAC AAC ATG ATA GGC TAC CCC AAC 1102
Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn
355 360 365
TTT ATC ATG GAC CCC AAG GAG CTG GAC AAA GTG TTC AAT GAC TAC ACC 1150
Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr
370 375 380
GCT GTG CCA GAC CTC TAC TTC GAG AAC GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC 1198
Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe
385 390 395
TCC TGG AGG GTC ACT GCC GAC CAG CTC CGG AAA GCG CCC AAC AGA GAT 1246
Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp
400 405 410 415
CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC 1294
Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr
420 425 430
AAG AAC GAG ATC GTG TTT CCG GCC GGA ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC 1342
Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr
435 440 445
ACC CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC 1390
Thr Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val
450 455 460
GTG GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC 1438
Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr
465 470 475
GAC AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGG TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG 1486
Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu
480 485 490 495
GCG TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT 1534
Ala Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr
500 505 510
AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC 1582
Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn
515 520 525
• · ·
ATC Ile GCC GAC AAC Ala Asp Asn 530 GGG GGC CTC Gly Gly Leu AAG Lys 535 GCG GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC 1630
Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr 540 Gin Asn
TGG GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC 1678
Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu
545 550 555
ACC AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG A 1703
Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu
560 565
A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ : 567 aminosav
(B) TÍPUS: aminosav
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly 1 His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin
5 10 15
Ala Ile Ile Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu
20 25 30
Ala Glu Arg Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr
35 40 45
Arg Ile Glu Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Lys
50 55 60
Leu Gly Gly Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin
65 70 75 80
Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe
85 90 95
Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile
100 105 110
Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu
115 120 125
Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met 130 135 140
Val Gin Leu 145 Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Alá Glu Asp Thr Ile Arg 160
150 155
Pro Gin Met Gin Gin 165 Ile Leu Asp Phe Glu Thr Alá Leu Alá 170 Asn 175 Ile
Thr Ile Pro Gin 180 Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr 185 190 His Lys
Val Thr Alá 195 Alá Glu Leu Gin Thr Leu Alá Pro Alá Ile Asn 200 205 Trp Leu
Pro Phe Leu 210 Asn Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu 215 220 Ser Glu
Pro Ile Val 225 Ile Tyr Asp 230 Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser 235 Thr Leu 240
Ile Asn Ser Thr Asp 245 Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile 250 Trp 255 Asn
Leu Val Arg Lys 260 Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin 265 270 Asp Alá
Asp Glu Lys 275 Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr 280 285 Cys Leu
Pro Arg Trp 290 Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu 295 300 Gly Phe
Alá Leu Gly 305 Pro Met Phe 310 Val Lys Alá Thr Phe Alá Glu Asp 315 Ser Lys 320
Asn Ile Alá Ser Glu 325 Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Alá Phe 330 Glu 335 Glu
Ser Leu Ser Thr 340 Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys 345 350 Ser Alá
Lys Glu Lys 355 Ma Asp Alá Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro 360 365 Asn Phe
Ile Met Asp 370 Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr 375 380 Thr Alá
Val Pro Asp 385 Leu Tyr Phe 390 Glu Asn Alá Met Arg Phe Phe Asn 395 Phe Ser 400
Trp Arg Val Thr Alá 405 Asp Gin Leu Arg Lys Alá Pro Asn Arg Asp 410 415 Gin
Trp Ser Met Thr 420 Pro Pro Met Val Asn Alá Tyr Tyr Ser Pro 425 430 Thr Lys
• · · ···· »··· • ·
Asn Glu Iie Val Phe Pro Alá Gly Ile Leu Gin Alá Pro Phe Tyr Thr
435 440 445
Arg Ser Ser Pro Asn Alá Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val
450 455 460
Gly His Glu Leu Thr His Alá Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp
465 470 475 480
Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Alá
485 490 495
Phe Lys Gin Gin Thr Alá Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser
500 505 510
Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile
515 520 525
Alá Asp Asn Gly Gly Leu Lys Alá Alá Tyr Arg Alá Tyr Gin Asn Trp
530 535 540
Val Lys Lys Asn Gly Alá Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr
545 550 555 560
Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu
565
A 20. SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 23 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) ANTISZENSZ-E: igen (xi) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCCAGCGCCG TCTCAAAGTC CAG
A 21. SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 22 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav • · • · · ♦ • · · · · · · • · · • *« (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) ANTISZENSZ-E: nem (xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TGGGGGACCT TCAGCAACCT CT 22
A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 2129 bázispár
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁLTÍPUS: egyszálú
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (H) SEJTVONAL: fetális marhaszív endoteliális sejtvonal (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 3..2126 (xi) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GG ACC CCG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG CTG GTG GCG CTC CTG GCG 47
Thr Pro Val Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Alá Leu Leu Alá
1 5 10 15
GCG GCA TTG GTG GCC TGT TTG GCA GTA CTG GGC ATC CAA TAC CAG ACA
Alá Alá Leu Val Alá Cys Leu Alá Val Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr
20 25 30
AGA ACG ccc TCG GTG TGC CTA AGT GAG GCC TGC ATC TCG GTG ACC AGC
Arg Thr Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Alá Cys Ile Ser Val Thr Ser
35 40 45
TCC ATC TTG AGT TCC ATG GAC CCC ACG GTG GAC CCC TGC CAG GAC TTC
Ser Ile Leu Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys Gin Asp Phe
50 55 60
TTC ACC TAT GCC TGT GGC GGC TGG ATC AAA GCC AAC CCC GTG CCG GAT 239
Phe Thr Tyr 65 Alá Cys Gly Gly Trp 70 Ile Lys Alá Asn Pro 75 Val Pro Asp
GGC CAC TCG CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC CAA 287
Gly His Ser 80 Arg Trp Gly 85 Thr Phe Ser Asn Leu 90 Trp Glu His Asn Gin 95
GCC ATC ATC AAG CAC CTC CTT GAA AAC TCC ACG GCC AGC GTG AGC GAG 335
Alá Ile Ile Lys His 100 Leu Leu Glu Asn Ser 105 Thr Alá Ser Val Ser Glu 110
GCA GAG AGG AAG GAC CAG GAG TAC TAC CGA GCC TGC ATG AAC GAA ACC 383
Alá Glu Arg Lys Asp 115 Gin Glu Tyr Tyr 120 Arg Alá Cys Met Asn Glu Thr 125
AGG ATT GAG GAG CTC AAG GCC AAA CCC CTG ATG GAG CTC ATT GAG AAG 431
Arg Ile Glu 130 Glu Leu Lys Alá Lys 135 Pro Leu Met Glu Leu 140 Ile Glu Lys
CTC GGC GGC TGG AAC ATC ACG GGG CCC TGG GAC AAG GAC AAC TTC CAG 479
Leu Gly Gly 145 Trp Asn Ile Thr Gly 150 Pro Trp Asp Lys Asp 155 Asn Phe Gin
GAC ACC CTG CAG GTG GTC ACA TCC CAC TAC CAC ACC TCC CCC TTC TTC 527
Asp Thr Leu 160 Gin Val Val 165 Thr Ser His Tyr His 170 Thr Ser Pro Phe Phe 175
TCC GTC TAC GTC AGT GCC GAC TCC AAG AAT TCC AAC AGC AAC GTG ATC 575
Ser Val Tyr Val Ser 180 Alá Asp Ser Lys Asn 185 Ser Asn Ser Asn Val Ile 190
CAA GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC TTA CCC TCA AGA GAT TAT TAC CTG 623
Gin Val Asp Gin 195 Ser Gly Leu Gly Leu 200 Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu 205
AAC AAA ACC GAG AAT GAG AAG GTG CTG ACG GGA TAC CTG AAC TAC ATG 671
Asn Lys Thr 210 Glu Asn Glu Lys Val 215 Leu Thr Gly Tyr Leu 220 Asn Tyr Met
GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGA GGA GGG GCC GAG GAC ACC ATC CGG 719
Val Gin Leu 225 Gly Lys Leu Leu Gly 230 Gly Gly Alá Glu Asp 235 Thr Ile Arg
CCC CAG ATG CAG CAG ATC CTG GAC TTT GAG ACG GCG CTG GCC AAC ATC 767
Pro Gin Met 240 Gin Gin Ile 245 Leu Asp Phe Glu Thr 250 Alá Leu Alá Asn Ile 255
ACC ATC CCC CAG GAG AAG CGC CGG GAC GAG GAA CTC ATC TAC CAC AAA 815
Thr Ile Pro Gin Glu 260 Lys Arg Arg Asp Glu 265 Glu Leu Ile Tyr His Lys 270
GTG ACG GCG GCT GAG TTG CAG ACC TTG GCG CCC GCC ATC AAC TGG CTG 863
Val Thr Alá Alá 275 Glu Leu Gin Thr Leu 280 Alá Pro Alá Ile Asn Trp Leu 285
·*· ·-» ·*·· ···· ·«
CCC TTC CTC AAC ACC ATC TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCA GAG 911
Pro Phe Leu 290 Asn Thr Ile Phe Tyr Pro 295 Val Glu Ile Asn 300 Glu Ser Glu
CCT ATT GTC ATC TAC GAC AAA GAA TAC CTG AGC AAG GTC TCC ACC CTC 959
Pro Ile Val Ile Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu
305 310 315
ATC AAC AGC ACA GAC AAA TGC CTG CTG AAC AAC TAC ATG ATC TGG AAC 1007
Ile Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn
320 325 330 335
CTG GTA CGG AAG ACG AGC TCC TTC CTC GAT CAG CGC TTC CAG GAC GCC 1055
Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Alá
340 345 350
GAC GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAT GGG ACC AAG AAG ACG TGT CTT 1103
Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu
355 360 365
CCC CGC TGG AAG TTT TGT GTG AGT GAT ACA GAG AAC ACC TTG GGC TTC 1151
Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe
370 375 380
GCC CTG GGC CCC ATG TTC GTC AAA GCG ACC TTC GCT GAG GAC AGC AAG 1199
Alá Leu Gly Pro Met Phe Val Lys Alá Thr Phe Alá Glu Asp Ser Lys
385 390 395
AAC ATA GCC AGC GAG ATC ATC CTG GAG ATC AAG AAG GCG TTT GAA GAG 1247
Asn Ile Alá Ser Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Alá Phe Glu Glu
400 405 410 415
AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAA GAT ACT CGG AAA TCG GCC 1295
Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser Alá
420 425 430
AAG GAA AAG GCG GAC GCG ATC TAC AAC ATG ATA GGC TAC CCC AAC TTT 1343
Lys Glu Lys Alá Asp Alá Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe
435 440 445
ATC ATG GAC CCC AAG GAG CTG GAC AAA GTG TTC AAT GAC TAC ACC GCT 1391
Ile Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Alá
450 455 460
GTG CCA GAC CTC TAC TTC GAG AAC GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC TCC 1439
Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Alá Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser
465 470 475
TGG AGG GTC ACT GCC GAC CAG CTC CGG AAA GCG CCC AAC AGA GAT CAG 1487
Trp Arg Val Thr Alá Asp Gin Leu Arg Lys Alá Pro Asn Arg Asp Gin
480 485 490 495
TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC AAG 1535
Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Alá Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys
500 505 510 _ ' ” ’ -WW V « * ·· ··· ··* **
AAC Asn GAG ATC GTG TTT CCG GCC GGA ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC ACC 1583
Glu Ile Val 515 Phe Pro Ala Gly Ile Leu 520 Gin Ala Pro Phe 525 Tyr Thr
CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC GTG 1631
Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val
530 535 540
GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC GAC 1679
Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp
545 550 555
AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGG TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG GCG 1727
Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala
560 565 570 575
TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT AGC 1775
Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser
580 585 590
GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC ATC 1823
Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile
595 600 605
GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC TGG 1871
Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp
610 615 620
GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC ACC 1919
Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr
625 630 635
AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG AGT TTT GCA CAG GTC TGG TGT TCC GTC 1967
Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val
640 645 650 655
CGC ACC CCC GAG AGT TCG CAC GAA GGT CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC 2015
Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser
660 665 670
CCC TCC CGC TTC CGG GTC ATC GGC TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC 2063
Pro Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe
675 680 685
TCG GAA CAC TTC CAC TGC CCG CCC GGC TCA CCC ATG AAC CCG CAT CAC 2111
Ser Glu His Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His
690 695 700
AAG TGT GAA GTC TGG TGA Lys Cys Glu Val Trp
705
2129 • · · · • · · · · · · • ··· ··· ······ • · · · ·
A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
···· ···· (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 708 aminosavn
(B) TÍPUS: aminosav
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
(xi; 1 A 23 . SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Thr 1 Pro Val Glu Lys Arg Leu Val 5 Val Leu Val Alá Leu Leu Alá Alá 10 15
Alá Leu Val Alá 20 Cys Leu Alá Val Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg 25 30
Thr Pro Ser 35 Val Cys Leu Ser Glu 40 Alá Cys Ile Ser Val Thr Ser Ser 45
Ile Leu 50 Ser Ser Met Asp Pro Thr 55 Val Asp Pro Cys Gin Asp Phe Phe 60
Thr 65 Tyr Alá Cys Gly Gly Trp Ile 70 Lys Alá Asn Pro Val Pro Asp Gly 75 80
His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser 85 Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Alá 90 95
Ile Ile Lys His 100 Leu Leu Glu Asn Ser Thr Alá Ser Val Ser Glu Alá 105 110
Glu Arg Lys 115 Asp Gin Glu Tyr Tyr 120 Arg Alá Cys Met Asn Glu Thr Arg 125
Ile Glu 130 Glu Leu Lys Alá Lys Pro 135 Leu Met Glu Leu Ile Glu Lys Leu 140
Gly 145 Gly Trp Asn Ile Thr Gly Pro 150 Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin Asp 155 160
Thr Leu Gin Val Val Thr Ser His 165 Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe Ser 170 175
Val Tyr Val Ser 180 Alá Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin 185 190
Val Asp Gin 195 Ser Gly Leu Gly Leu 200 Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn 205
Lys Thr 210 Glu Asn Glu Lys Val Leu 215 Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val 220
···· ···«
Gin 225 Leu Gly Lys Leu Leu 230 Gly Gly Gly Alá Glu 235 Asp Thr Ile Arg Pro 240
Gin Met Gin Gin Ile Leu Asp Phe Glu Thr Alá Leu Alá Asn Ile Thr
245 250 255
Ile Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val
260 265 270
Thr Alá Alá Glu Leu Gin Thr Leu Alá Pro Alá Ile Asn Trp Leu Pro
275 280 285
Phe Leu Asn Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro
290 295 300
Ile Val Ile Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu Ile
305 310 315 320
Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu
325 330 335
Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Alá Asp
340 345 350
Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro
355 360 365
Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe Alá
370 375 380
Leu Gly Pro Met Phe Val Lys Alá Thr Phe Alá Glu Asp Ser Lys Asn
385 390 395 400
Ile Alá Ser Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Alá Phe Glu Glu Ser
405 410 415
Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser Alá Lys
420 425 430
Glu Lys Alá Asp Alá Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile
435 440 445
Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Alá Val
450 455 460
Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Alá Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp
465 470 475 480
Arg Val Thr Alá Asp Gin Leu Arg Lys Alá Pro Asn Arg Asp Gin Trp
485 490 495
Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Alá Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn 500 505 510 • ·
Glu Ile Val 515 Phe Pro Alá Gly Ile 520 Leu Gin Alá Pro Phe 525 Tyr Thr Arg
Ser Ser Pro Asn Alá Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly
530 535 540
His Glu Leu Thr His Alá Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys
545 550 555 560
Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Alá Phe
565 570 575
Lys Gin Gin Thr Alá Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val
580 585 590
Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Alá
595 600 605
Asp Asn Gly Gly Leu Lys Alá Alá Tyr Arg Alá Tyr Gin Asn Trp Val
610 615 620
Lys Lys Asn Gly Alá Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn
625 630 635 640
Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser Phe Alá Gin Val Trp Cys Ser Val Arg
645 650 655
Thr Pro Glu Ser Ser His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro
660 665 670
Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser
675 680 685
Glu His Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys
690 695 700
Cys Glu Val Trp
705
A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 2533 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
···· ··· · · · ·· • · · · · · · • ··· ··· ···· • · * · · · (A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: placenta (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 1..2109 (xi) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGG Arg 1 CTG GTG GTG TTG GTG GTA CTT CTG GCG GCA GGA CTG GTG GCC TGC 48
Leu Val Val Leu Val Val 5 Leu Leu Alá 10 Alá Gly Leu Val Alá 15 Cys
TTG GCA GCA CTG GGC ATC CAG TAC CAG ACA AGA TCC CCC TCT GTG TGC 96
Leu Alá Alá Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys
20 25 30
CTG AGC GAA GCT TGT GTC TCA GTG ACC AGC TCC ATC TTG AGC TCC ATG 144
Leu Ser Glu Alá Cys Val Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Met
35 40 45
GAC CCC ACA GTG GAC CCC TGC CAT GAC TTC TTC AGC TAC GCC TGT GGG 192
Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Alá Cys Gly
50 55 60
GGC TGG ATC AAG GCC AAC CCA GTC CCT GAT GGC CAC TCA CGC TGG GGG 240
Gly Trp Ile Lys Alá Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly
65 70 75 80
ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC CAA GCA ATC ATC AAG CAC CTC 288
Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Alá Ile Ile Lys His Leu
85 90 95
CTC GAA AAC TCC ACG GCC AGC GTG AGC GAG GCA GAG AGA AAG GCG CAA 336
Leu Glu Asn Ser Thr Alá Ser Val Ser Glu Alá Glu Arg Lys Alá Gin
100 105 110
GTA TAC TAC CGT GCG TGC ATG AAC GAG ACC AGG ATC GAG GAG CTC AGG 384
Val Tyr Tyr Arg Alá Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu Leu Arg
115 120 125
GCC AAA CCT CTA ATG GAG TTG ATT GAG AGG CTC GGG GGC TGG AAC ATC 432
Alá Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn Ile
130 135 140
ACA GGT CCC TGG GCC AAG GAC AAC TTC CAG GAC ACC CTG CAG GTG GTC 480
Thr Gly Pro Trp Alá Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val
145 150 155 160
ACC GCC CAC TAC CGC ACC TCA CCC TTC TTC TCT GTC TAT GTC AGT GCC 528
Thr Alá His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Alá
165 170 175
···· ···· • ·
GAT TCC Asp Ser AAG AAC TCC Ser AAC AGC AAC GTG ATC CAG GTG GAC CAG TCT GGC 576
Lys Asn 180 Asn Ser Asn Val Ile 185 Gin Val Asp Gin 190 Ser Gly
CTG GGC TTG CCC TCG AGA GAC TAT TAC CTG AAC AAA ACT GAA AAC GAG 624
Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu
195 200 205
AAG GTG CTG ACC GGA TAT CTG AAC TAC ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG 672
Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu
210 215 220
CTG GGC GGC GGG GAC GAG GAG GCC ATC CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC 720
Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Alá Ile Arg Pro Gin Met Gin Gin Ile
225 230 235 240
TTG GAC TTT GAG ACG GCA CTG GCC AAC ATC ACC ATC CCA CAG GAG AAG 768
Leu Asp Phe Glu Thr Alá Leu Alá Asn Ile Thr Ile Pro Gin Glu Lys
245 250 255
CGC CGT GAT GAG GAG CTC ATC TAC CAC AAA GTG ACG GCA GCC GAG CTG 816
Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Alá Alá Glu Leu
260 265 270
CAG ACC TTG GCA CCC GCC ATC AAC TGG TTG CCT TTT CTC AAC ACC ATC 864
Gin Thr Leu Alá Pro Alá Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr Ile
275 280 285
TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCC GAG CCT ATT GTG GTC TAT GAC 912
Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val Tyr Asp
290 295 300
AAG GAA TAC CTT GAG CAG ATC TCC ACT CTC ATC AAC ACC ACC GAC AGA 960
Lys Glu Tyr Leu Glu Gin Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr Thr Asp Arg
305 310 315 320
TGC CTG CTC AAC AAC TAC ATG ATC TGG AAC CTG GTG CGG AAA ACA AGC 1008
Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser
325 330 335
TCC TTC CTT GAC CAG CGC TTT CAG GAC GCC GAT GAG AAG TTC ATG GAA 1056
Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Alá Asp Glu Lys Phe Met Glu
340 345 350
GTC ATG TAC GGG ACC AAG AAG ACC TGT CTT CCT CGC TGG AAG TTT TGC 1104
Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys
355 360 365
GTG AGT GAC ACA GAA AAC AAC CTG GGC TTT GCG TTG GGC CCC ATG TTT 1152
Val Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Alá Leu Gly Pro Met Phe
370 375 380
GTC AAA GCA ACC TTC GCC GAG GAC AGC AAG AGC ATA GCC ACC GAG ATC 1200
Val Lys Alá Thr Phe Alá Glu Asp Ser Lys Ser Ile Alá Thr Glu Ile
385 390 395 400
• ·
ATC CTG Ile Leu GAG ATT Glu Ile AAG AAG GCA TTT GAG GAA AGC CTG AGC ACC CTG AAG 1248
Lys Lys 405 Alá Phe Glu Glu 410 Ser Leu Ser Thr Leu 415 Lys
TGG ATG GAT GAG GAA ACC CGA AAA TCA GCC AAG GAA AAG GCC GAT GCC 1296
Trp Met Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ser Alá Lys Glu Lys Alá Asp Alá
420 425 430
ATC TAC AAC ATG ATA GGA TAC CCC AAC TTC ATC ATG GAT CCC AAG GAG 1344
Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu
435 440 445
CTG GAC AAA GTG TTT AAT GAC TAC ACT GCA GTT CCA GAC CTC TAC TTT 1392
Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Alá Val Pro Asp Leu Tyr Phe
450 455 460
GAA AAT GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC TCA TGG AGG GTC ACT GCC GAT 1440
Glu Asn Alá Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Alá Asp
465 470 475 480
CAG CTC AGG AAA GCC CCC AAC AGA GAT CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC 1488
Gin Leu Arg Lys Alá Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro
485 490 495
ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC AAG AAT GAG ATT GTG TTT CCG 1536
Met Val Asn Alá Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro
500 505 510
GCC GGG ATC CTG CAG GCA CCA TTC TAC ACA CGC TCC TCA CCC AAG GCC 1584
Alá Gly Ile Leu Gin Alá Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Alá
515 520 525
TTA AAC TTT GGT GGC ATA GGT GTC GTC GTG GGC CAT GAG CTG ACT CAT 1632
Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His
530 535 540
GCT TTT GAT GAT CAA GGA CGG GAG TAT GAC AAG GAC GGG AAC CTC CGG 1680
Alá Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg
545 550 555 560
CCA TGG TGG AAG AAC TCA TCC GTG GAG GCC TTC AAG CGT CAG ACC GAG 1728
Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Alá Phe Lys Arg Gin Thr Glu
565 570 575
TGC ATG GTA GAG CAG TAC AGC AAC TAC AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG 1776
Cys Met Val Glu Gin Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val
580 585 590
AAC GGG CGG CAC ACC CTG GGG GAG AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGT CTC 1824
Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Alá Asp Asn Gly Gly Leu
595 600 605
AAG GCG GCC TAT CGG GCT TAC CAG AAC TGG GTG AAG AAG AAC GGG GCT 1872
Lys Alá Alá Tyr Arg Alá Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Alá
610 615 620
GAG CAC TCG CTC CCC ACC Leu Pro Thr 630 CTG GGC CTC Leu Gly Leu ACC AAT AAC CAG CTC TTC TTC 1920
Glu His 625 Ser Thr Asn 635 Asn Gin Leu Phe Phe 640
CTG GGC TTT GCA CAG GTC TGG TGC TCC GTC CGC ACA CCT GAG AGC TCC 1968
Leu Gly Phe Alá Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser
645 650 655
CAC GAA GGC CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCT CGC TTC CGG GTC 2016
His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser _Pro Ser Arg Phe Arg Val
660 665 670
ATC GGC TCC CTC TCC AAT TCC AAG GAG TTC TCA GAA CAC TTC CGC TGC 2064
Ile Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys
675 680 685
CCA CCT GGC TCA CCC ATG AAC CCG CCT CAC AAG TGC GAA GTC TGG 2109
Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp
690 695 700
TAAGGACGAA GCGGAGAGAG CCAAGACGGA GGAGGGGAAG GGGCTGAGGA CGAGACCCCC 2169
ATCCAGCCTC CAGGGCATTG CTCAGCCCGC TTGGCCACCC GGGGCCCTGC TTCCTCACAC 2229
TGGCGGGTTT TCAGCCGGAA CCGAGCCCAT GGTGTTGGCT CTCAACGTGA CCCGCAGTCT 2289
GATCCCCTGT GAAGAGCCGG ACATCCCAGG CACACGTGTG CGCCACCTTC AGCAGGCATT 2349
CGGGTGCTGG GCTGGTGGCT CATCAGGCCT GGGCCCCACA CTGACAAGCG CCAGATACGC 2409
CACAAATACC ACTGTGTCAA atgctttcaa GATATATTTT TGGGGAAACT ATTTTTTAAA 2469
CACTGTGGAA TACACTGGAA ATCTTCAGGG AAAAACACAT TTAAACACTT TTTTTTTTAA 2529
GCCC 2533
A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 703 aminosavn
(B) TÍPUS: aminosav
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Leu Val Val Leu Val Val Leu Leu Alá Alá Gly Leu Val Alá Cys 15 10 15 • · • ·
Leu Alá Alá Leu 20 Gly Ile Gin Tyr Gin 25 Thr Arg Ser Pro Ser 30 Val Cys
Leu Ser Glu Alá Cys Val Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Met
35 40 45
Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Alá Cys Gly
50 55 60
Gly Trp Ile Lys Alá Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly
65 70 75 80
Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Alá Ile Ile Lys His Leu
85 90 95
Leu Glu Asn Ser Thr Alá Ser Val Ser Glu Alá Glu Arg Lys Alá Gin
100 105 110
Val Tyr Tyr Arg Alá Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu Leu Arg
115 120 125
Alá Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn Ile
130 135 140
Thr Gly Pro Trp Alá Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val
145 150 155 160
Thr Alá His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Alá
165 170 175
Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin Val Asp Gin Ser Gly
180 185 190
Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu
195 200 205
Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu
210 215 220
Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Alá Ile Arg Pro Gin Met Gin Gin Ile
225 230 235 240
Leu Asp Phe Glu Thr Alá Leu Alá Asn Ile Thr Ile Pro Gin Glu Lys
245 250 255
Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Alá Alá Glu Leu
260 265 270
Gin Thr Leu Alá Pro Alá Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr Ile
275 280 285
Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val Tyr Asp 290 295 300 ······ · · ·· · · • · · · · · · • ··· ··· ······
Lys 305 Glu Tyr Leu Glu Gin 310 Ile Ser Thr Leu Ile 315 Asn Thr Thr Asp Arg 320
Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser
325 330 335
Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu
340 345 350
Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys
355 360 365
Val Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe
370 375 380
Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser Ile Ala Thr Glu Ile
385 390 395 400
Ile Leu Glu Ile Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys
405 410 415
Trp Met Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala
420 425 430
Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu
435 440 445
Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe
450 455 460
Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp
465 470 475 480
Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro
485 490 495
Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro
500 505 510
Ala Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala
515 520 525
Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His
530 535 540
Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg
545 550 555 560
Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gin Thr Glu
565 570 575
Cys Met Val Glu Gin Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val 580 585 590 »······· ·· ·· · · • · · · · · · • ··· · · · ······ • · * · · · ·· ··· ·· · ··
Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu
595 600 605
Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala
610 615 620
Glu His Ser Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe
625 630 635 640
Leu Gly Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser
645 650 655
His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val
660 665 670
Ile Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys
675 680 685
Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp
690 695 700
A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) FELTÉTELEZETT-E: nem (iii) ANTISZENSZ-E: igen (xi) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGTGCTTGAT GATGGCTTGG TTGT
A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 24 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) FELTÉTELEZETT-E: nem (iii) ANTISZENSZ-E: igen (xi) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AGATGGAGCT GGTCACCGAG ATGC 24
A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 324 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (iii) FELTÉTELEZETT-E: nem (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (F) SZÖVETTÍPUS: tüdő (xi) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGGAGCGCGG CGCGGGGCCG GAGCGGAGCG CGCGAGCGAT GATGTCTACC TACAAGCGGC 60
CCACGCTGGA CGAGGAGGAC CTGGTGGACT CGCTGTCCGA GAGCGACGTG TACCCCAACC 120
ACCTGCAGGT GAACTTCCGA GGCCCCCGGA ACGGCCAGAG ATGCTGGGCC GCCAGGACCC 180
CGGTGGAGAA GCGGCTGGTG GTGCTGGTGG CGCTCCTGGC GGCGGCATTG GTGGCCTGTT 240
TGGCAGTACT GGGCATCCAA TACCAGACAA GAACGCCCTC GGTGTGCCTA AGTGAGGCCT 300
GCATCTCGGT GACCAGCTCC ATCT 324
A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 2314 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Bős taurus (F) SZÖVETTÍPUS: tüdő (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 39..2301 (xi) A 29. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GGGAGCGCGG CGCGGGGCCG GAGCGGAGCG CGCGAGCG ATG ATG TCT ACC TAC 53
Met Met Ser Thr Tyr
5
AAG Lys CGG CCC ACG CTG Thr Leu 10 GAC Asp GAG GAG GAC CTG GTG GAC TCG CTG TCC GAG 101
Arg Pro Glu Glu Asp Leu Val 15 Asp Ser Leu Ser 20 Glu
AGC GAC GTG TAC CCC AAC CAC CTG CAG GTG AAC TTC CGA GGC CCC CGG 149
Ser Asp Val Tyr Pro Asn His Leu Gin Val Asn Phe Arg Gly Pro Arg
25 30 35
AAC GGC CAG AGA TGC TGG GCC GCC AGG ACC CCG GTG GAG AAG CGG CTG 197
Asn Gly Gin Arg Cys Trp Alá Alá Arg Thr Pro Val Glu Lys Arg Leu
40 45 50
GTG GTG CTG GTG GCG CTC CTG GCG GCG GCA TTG GTG GCC TGT TTG GCA 245
Val Val Leu Val Alá Leu Leu Alá Alá Alá Leu Val Alá Cys Leu Alá
55 60 65
GTA CTG GGC ATC CAA TAC CAG ACA AGA ACG CCC TCG GTG TGC CTA AGT 293
Val Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg Thr Pro Ser Val Cys Leu Ser
70 75 80 85
GAG GCC TGC ATC TCG GTG ACC AGC TCC ATC TTG AGT TCC ATG GAC CCC 341
Glu Alá Cys Ile Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser Ser Met Asp Pro
90 95 100
ACG GTG GAC CCC TGC CAG GAC TTC TTC ACC TAT GCC TGT GGC GGC TGG 389
Thr Val Asp Pro Cys Gin Asp Phe Phe Thr Tyr Alá Cys Gly Gly Trp
105 110 115
ATC AAA GCC AAC CCC GTG CCG GAT GGC CAC TCG CGC TGG GGG ACC TTC 437
Ile Lys Alá Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe
120 125 130
• · · · · · · • ··· ··· ······ • · · · · · • ··* ·· · » * ··*· ··»·
AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC CAA GCC ATC ATC AAG CAC CTC CTT Leu GAA Glu 485
Ser Asn Leu 135 Trp Glu His Asn Gin 140 Alá He He Lys His 145 Leu
AAC TCC ACG GCC AGC GTG AGC GAG GCA GAG AGG AAG GAC CAG GAG TAC 533
Asn Ser Thr 150 Alá Ser Val 155 Ser Glu Alá Glu Arg 160 Lys Asp Gin Glu Tyr 165
TAC CGA GCC TGC ATG AAC GAA ACC AGG ATT GAG GAG CTC AAG GCC AAA 581
Tyr Arg Alá Cys Met 170 Asn Glu Thr Arg He 175 Glu Glu Leu Lys Alá 180 Lys
CCC CTG ATG GAG CTC ATT GAG AAG CTC GGC GGC TGG AAC ATC ACG GGG 629
Pro Leu Met Glu 185 Leu lle Glu Lys Leu 190 Gly Gly Trp Asn He 195 Thr Gly
CCC TGG GAC AAG GAC AAC TTC CAG GAC ACC CTG CAG GTG GTC ACA TCC 677
Pro Trp Asp 200 Lys Asp Asn Phe Gin 205 Asp Thr Leu Gin Val 210 Val Thr Ser
CAC TAC CAC ACC TCC CCC TTC TTC TCC GTC TAC GTC AGT GCC GAC TCC 725
His Tyr His 215 Thr Ser Pro Phe Phe 220 Ser Val Tyr Val Ser 225 Alá Asp Ser
AAG AAT TCC AAC AGC AAC GTG ATC CAA GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC 773
Lys Asn Ser 230 Asn Ser Asn 235 Val He Gin Val Asp 240 Gin Ser Gly Leu Gly 245
TTA CCC TCA AGA GAT TAT TAC CTG AAC AAA ACC GAG AAT GAG AAG GTG 821
Leu Pro Ser Arg Asp 250 Tyr Tyr Leu Asn Lys 255 Thr Glu Asn Glu Lys 260 Val
CTG ACG GGA TAC CTG AAC TAC ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGA 869
Leu Thr Gly Tyr 265 Leu Asn Tyr Met Val 270 Gin Leu Gly Lys Leu 275 Leu Gly
GGA GGG GCC GAG GAC ACC ATC CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC CTG GAC 917
Gly Gly Alá 280 Glu Asp Thr lle Arg 285 Pro Gin Met Gin Gin 290 lle Leu Asp
TTT GAG ACG GCG CTG GCC AAC ATC ACC ATC CCC CAG GAG AAG CGC CGG 965
Phe Glu Thr 295 Alá Leu Alá Asn lle 300 Thr He Pro Gin Glu 305 Lys Arg Arg
GAC GAG GAA CTC ATC TAC CAC AAA GTG ACG GCG GCT GAG TTG CAG ACC 1013
Asp Glu Glu 310 Leu lle Tyr 315 His Lys Val Thr Alá 320 Alá Glu Leu Gin Thr 325
TTG GCG CCC GCC ATC AAC TGG CTG CCC TTC CTC AAC ACC ATC TTC TAC 1061
Leu Alá Pro Alá lle 330 Asn Trp Leu Pro Phe 335 Leu Asn Thr He Phe 340 Tyr
CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCA GAG CCT ATT GTC ATC TAC GAC AAA GAA 1109
Pro Val Glu He 345 Asn Glu Ser Glu Pro 350 He Val lle Tyr Asp 355 Lys Glu
«· »· *· • « · · · · · « ··· ·«· ··· ··· • · « · · · ·· ··« ·· · ·· ···» ····
TAC CTG AGC AAG GTC TCC ACC CTC ATC AAC AGC ACA GAC AAA TGC CTG 1157
Tyr Leu Ser 360 Lys Val Ser Thr Leu Ile 365 Asn Ser Thr Asp Lys 370 Cys Leu
CTG AAC AAC TAC ATG ATC TGG AAC CTG GTA CGG AAG ACG AGC TCC TTC 1205
Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe
375 380 385
CTC GAT CAG CGC TTC CAG GAC GCC GAC GAG TAG TTC ATG GAA GTC ATG 1253
Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Alá Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met
390 395 400 405
TAT GGG ACC AAG AAG ACG TGT CTT CCC CGC TGG AAG TTT TGT GTG AGT 1301
Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser
410 415 420
GAT ACA GAG AAC ACC TTG GGC TTC GCC CTG GGC CCC ATG TTC GTC AAA 1349
Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe Alá Leu Gly Pro Met Phe Val Lys
425 430 435
GCG ACC TTC GCT GAG GAC AGC AAG AAC ATA GCC AGC GAG ATC ATC CTG 1397
Alá Thr Phe Alá Glu Asp Ser Lys Asn Ile Alá Ser Glu Ile Ile Leu
440 445 450
GAG ATC AAG AAG GCG TTT GAA GAG AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG 1445
Glu Ile Lys Lys Alá Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met
455 460 465
GAT GAA GAT ACT CGG AAA TCG GCC AAG GAA AAG GCG GAC GCG ATC TAC 1493
Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser Alá Lys Glu Lys Alá Asp Alá Ile Tyr
470 475 480 485
AAC ATG ATA GGC TAC CCC AAC TTT ATC ATG GAC CCC AAG GAG CTG GAC 1541
Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp
490 495 500
AAA GTG TTC AAT GAC TAC ACC GCT GTG CCA GAC CTC TAC TTC GAG AAC 1589
Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Alá Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn
505 510 515
GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC TCC TGG AGG GTC ACT GCC GAC CAG CTC 1637
Alá Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Alá Asp Gin Leu
520 525 530
CGG AAA GCG CCC AAC AGA GAT CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG 1685
Arg Lys Alá Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val
535 540 545
AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC AAG AAC GAG ATC GTG TTT CCG GCC GGA 1733
Asn Alá Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile Val Phe Pro Alá Gly
550 555 560 565
ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC ACC CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC 1781
Ile Leu Gin Alá Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Asn Alá Leu Asn
570 575 580 *·· 999·
Ί4
TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC GTG GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT 1829
Phe Gly Gly Ile 585 Gly Val Val Val Gly His 590 Glu Leu Thr His 595 Alá Phe
GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC GAC AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGG 1877
Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp
600 605 610
TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG GCG TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG 1925
Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Alá Phe Lys Gin Gin Thr Alá Cys Met
615 620 625
GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC 1973
Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly
630 635 640 645
CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG 2021
Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Alá Asp Asn Gly Gly Leu Lys Alá
650 655 660
GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC TGG GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG 2069
Alá Tyr Arg Alá Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Alá Glu Gin
665 670 675
ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC ACC AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG AGT 2117
Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser
680 685 690
TTT GCA CAG GTC TGG TGT TCC GTC CGC ACC CCC GAG AGT TCG CAC GAA 2165
Phe Alá Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu
695 700 705
GGT CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCC CGC TTC CGG GTC ATC GGC 2213
Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val Ile Gly
710 715 720 725
TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC TCG GAA CAC TTC CAC TGC CCG CCC 2261
Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe His Cys Pro Pro
730 735 740
GGC TCA CCC ATG AAC CCG CAT CAC AAG TGT GAA GTC TGG T GAAGGGCCAG 2311
Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp
745 750
GCA 2314
A 30. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 754 aminosavn (B) TÍPUS: aminosav »··· ···· *· • · · < · · ·· ··· ·· · ·»
75
(D) TOPOLÓGIA : lineáris
(ii: 1 A ] HOLEKULA TÍPUSA: protein
(xi) A 30 . SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met Met Ser Thr Tyr Lys Arg Pro Thr Leu Asp Glu Glu Asp Leu Val
1 5 10 15
Asp Ser Leu Ser Glu Ser Asp Val Tyr Pro Asn His Leu Gin Val Asn
20 25 30
Phe Arg Gly Pro Arg Asn Gly Gin Arg Cys Trp Alá Alá Arg Thr Pro
35 40 45
Val Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Alá Leu Leu Alá Alá Alá Leu
50 55 60
Val Alá Cys Leu Alá Val Leu Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg Thr Pro
65 70 75 80
Ser Val Cys Leu Ser Glu Alá Cys Ile Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu
85 90 95
Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys Gin Asp Phe Phe Thr Tyr
100 105 110
Alá Cys Gly Gly Trp Ile Lys Alá Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser
115 120 125
Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Alá Ile Ile
130 135 140
Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Alá Ser Val Ser Glu Alá Glu Arg
145 150 155 160
Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Alá Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu
165 170 175
Glu Leu Lys Alá Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Lys Leu Gly Gly
180 185 190
Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu
195 200 205
Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr
210 215 220
Val Ser Alá Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin Val Asp
225 230 235 240
Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr
245 250 255
• ·
Glu Asn Glu Lys 260 Val Leu Thr Gly Tyr 265 Leu Asn Tyr Met Val 270 Gin Leu
Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Alá Glu Asp Thr Ile Arg Pro Gin Met
275 280 285
Gin Gin Ile Leu Asp Phe Glu Thr Alá Leu Alá Asn Ile Thr Ile Pro
290 295 300
Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Al a
305 310 315 320
Alá Glu Leu Gin Thr Leu Alá Pro Alá Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu
325 330 335
Asn Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val
340 345 350
Ile Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu Ile Asn Ser
355 360 365
Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg
370 375 380
Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Alá Asp Glu Lys
385 390 395 400
Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp
405 410 415
Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe Alá Leu Gly
420 425 430
Pro Met Phe Val Lys Alá Thr Phe Alá Glu Asp Ser Lys Asn Ile Alá
435 440 445
Ser Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Alá Phe Glu Glu Ser Leu Ser
450 455 460
Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser Alá Lys Glu Lys
465 470 475 480
Alá Asp Alá Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp
485 490 495
Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Alá Val Pro Asp
500 505 510
Leu Tyr Phe Glu Asn Alá Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val
515 520 525
Thr Alá Asp Gin Leu Arg Lys Alá Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met 530 535 540
77 • · * · · · • · • · · • · • · · · 1 • · · · • · • · · · • 9 • ·· • · · • · · · · • · • · • • • •
Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu Ile
545 550 555 560
Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser
565 570 575
Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu
580 585 590
Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly
595 600 605
Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Gin
610 615 620
Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly
625 630 635 640
Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn
645 650 655
Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys
660 665 670
Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin
675 680 685
Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro
690 695 700
Glu Ser Ser His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg
705 710 715 720
Phe Arg Val Ile Gly Ser Ile Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His
725 730 735
Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu
740 745 750
Val Trp
A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 53 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) « · • · « ···· ···· ·, • · · · · ··· ...
* * · · ·· ··· .· (iii) FELTÉTELEZETT-E: nem (iii) ANTISZENSZ-E: igen (xi) A 31. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA ACTAGTCTCG AGCCAAGCAG GCCACCAGTC CTG 53
A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 25 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTÍPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iii) FELTÉTELEZETT-E: nem (iii) ANTISZENSZ-E: igen (xi) A 32. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CCTGCCGCCA GAAGTACCAC CAACA 25
A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 222 bázispár
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁLTÍPUS: egyszálú
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (iii) FELTÉTELEZETT-E: nem (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: placenta ···· ····
(ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 38..222 (xi) A 33. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCCCCCCCG GTGTCCGCCC TGCTGTCGGC GCTGGGG ATG TCG ACG TAC AAG CGG 55
Met Ser Thr Tyr Lys Arg
5
GCC Alá ACG Thr CTG GAC GAG GAG GAC CTG GTG GAC TCG CTC TCC GAG GGC GAC Gly Asp 103
Leu Asp Glu Glu 10 Asp Leu Val 15 Asp Ser Leu Ser Glu 20
GCA TAC CCC AAC GGC CTG CAG GTG AAC TTC CAC AGC CCC CGG AGT GGC 151
Alá Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe His Ser Pro Arg Ser Gly
25 30 35
CAG AGG TGC TGG GCT GCA CGG ACC CAG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG 199
Gin Arg Cys Trp Alá Alá Arg Thr Gin Val Glu Lys Arg Leu Val Val
40 45 50
TTG GTG GTA CTT CTG GCG GCA GG 222
Leu Val Val Leu Leu Alá Alá
55 60
A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 61 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein (xi) A 34. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Ser Thr Tyr Lys 5 Arg Alá Thr Leu Asp 10 Glu Glu Asp Leu Val 15 Asp
Ser Leu Ser Glu Gly Asp Alá Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe
20 25 30
His Ser Pro Arg Ser Gly Gin Arg Cys Trp Alá Alá Arg Thr Gin Val 35 40 45
Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Val Leu Leu Alá Alá
55 60
A 35. SZÁMÓ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 2720 bázispár
(B) TÍPUS: nukleinsav
(C) SZÁLTÍPUS: egyszálú
(D) TOPOLÓGIA: lineáris
(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: cDNS mRNS-hez (iii) FELTÉTELEZETT-E: nem (vi) EREDETI SZÁRMAZÁS:
(A) SZERVEZET: Homo sapiens (F) SZÖVETTÍPUS: placenta (ix) JELLEGZETESSÉGEK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) HELYZET: 38..2297 (xi) A 35. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGCCCCCCCG GTGTCCGCCC TGCTGTCGGC GCTGGGG ATG TCG ACG TAC AAG CGG 55
Met Ser Thr Tyr Lys Arg
5
GCC Alá ACG CTG GAC GAG Glu GAG GAC CTG Glu Asp Leu GTG GAC TCG CTC TCC GAG GGC GAC 103
Thr Leu Asp 10 Val 15 Asp Ser Leu Ser Glu 20 Gly Asp
GCA TAC CCC AAC GGC CTG CAG GTG AAC TTC CAC AGC CCC CGG AGT GGC 151
Alá Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe His Ser Pro Arg Ser Gly
25 30 35
CAG AGG TGC TGG GCT GCA CGG ACC CAG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG 199
Gin Arg Cys Trp Alá Alá Arg Thr Gin Val Glu Lys Arg Leu Val Val
40 45 50
TTG GTG GTA CTT CTG GCG GCA GGA CTG GTG GCC TGC TTG GCA GCA CTG 247
Leu Val Val Leu Leu Alá Alá Gly Leu Val Alá Cys Leu Alá Alá Leu
55 60 65 70
GGC ATC CAG TAC CAG ACA AGA TCC CCC TCT GTG TGC CTG AGC GAA GCT 295
Gly Ile Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Alá
75 80 85
···· ····
TGT GTC Cys Val TCA GTG ACC Thr AGC TCC ATC TTG AGC TCC ATG GAC CCC ACA GTG 343
Ser Val 90 Ser Ser Ile Leu Ser 95 Ser Met Asp Pro 100 Thr Val
GAC CCC TGC CAT GAC TTC TTC AGC TAC GCC TGT GGG GGC TGG ATC AAG 391
Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Ile Lys
105 110 115
GCC AAC CCA GTC CCT GAT GGC CAC TCA CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC 439
Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn
120 125 130
CTC TGG GAA CAC AAC CAA GCA ATC ATC AAG CAC CTC CTC GAA AAC TCC 487
Leu Trp Glu His Asn Gin Ala Ile Ile Lys His Leu Leu Glu Asn Ser
135 140 145 150
ACG GCC AGC GTG AGC GAG GCA GAG AGA AAG GCG CAA GTA TAC TAC CGT 535
Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Gin Val Tyr Tyr Arg
155 160 165
GCG TGC ATG AAC GAG ACC AGG ATC GAG GAG CTC AGG GCC AAA CCT CTA 583
Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu Leu Arg Ala Lys Pro Leu
170 175 180
ATG GAG TTG ATT GAG AGG CTC GGG GGC TGG AAC ATC ACA GGT CCC TGG 631
Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn Ile Thr Gly Pro Trp
185 190 195
GCC AAG GAC AAC TTC CAG GAC ACC CTG CAG GTG GTC ACC GCC CAC TAC 679
Ala Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ala His Tyr
200 205 210
CGC ACC TCA CCC TTC TTC TCT GTC TAT GTC AGT GCC GAT TCC AAG AAC 727
Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn
215 220 225 230
TCC AAC AGC AAC GTG ATC CAG GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC TTG CCC 775
Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro
235 240 245
TCG AGA GAC TAT TAC CTG AAC AAA ACT GAA AAC GAG AAG GTG CTG ACC 823
Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr
250 255 260
GGA TAT CTG AAC TAC ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGC GGC GGG 871
Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly
265 270 275
GAC GAG GAG GCC ATC CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC TTG GAC TTT GAG 919
Asp Glu Glu Ala Ile Arg Pro Gin Met Gin Gin Ile Leu Asp Phe Glu
280 285 290
ACG GCA CTG GCC AAC ATC ACC ATC CCA CAG GAG AAG CGC CGT GAT GAG 967
Thr Ala Leu Ala Asn Ile Thr Ile Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu
295 300 305 310
GAG CTC Glu Leu ATC TAC Ile Tyr CAC AAA GTG ACG GCA GCC GAG CTG CAG ACC TTG GCA 1015
His Lys 315 Val Thr Ala Ala 320 Glu Leu Gin Thr Leu Ala 325
CCC GCC ATC AAC TGG TTG CCT TTT CTC AAC ACC ATC TTC TAC CCC GTG 1063
Pro Ala Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr Ile Phe Tyr Pro Val
330 335 340
GAG ATC AAT GAA TCC GAG CCT ATT GTG GTC TAT GAC AAG GAA TAC CTT 1111
Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu
345 350 355
GAG CAG ATC TCC ACT CTC ATC AAC ACC ACC GAC AGA TGC CTG CTC AAC 1159
Glu Gin Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr Thr Asp Arg Cys Leu Leu Asn
360 365 370
AAC TAC ATG ATC TGG AAC CTG GTG CGG AAA ACA AGC TCC TTC CTT GAC 1207
Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp
375 380 385 390
CAG CGC TTT CAG GAC GCC GAT GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAC GGG 1255
Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly
395 400 405
ACC AAG AAG ACC TGT CTT CCT CGC TGG AAG TTT TGC GTG AGT GAC ACA 1303
Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr
410 415 420
GAA AAC AAC CTG GGC TTT GCG TTG GGC CCC ATG TTT GTC AAA GCA ACC 1351
Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe Val Lys Ala Thr
425 430 435
TTC GCC GAG GAC AGC AAG AGC ATA GCC ACC GAG ATC ATC CTG GAG ATT 1399
Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser Ile Ala Thr Glu Ile Ile Leu Glu Ile
440 445 450
AAG AAG GCA TTT GAG GAA AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAG 1447
Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu
455 460 465 470
GAA ACC CGA AAA TCA GCC AAG GAA AAG GCC GAT GCC ATC TAC AAC ATG 1495
Glu Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala Ile Tyr Asn Met
475 480 485
ATA GGA TAC CCC AAC TTC ATC ATG GAT CCC AAG GAG CTG GAC AAA GTG 1543
Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val
490 495 500
TTT AAT GAC TAC ACT GCA GTT CCA GAC CTC TAC TTT GAA AAT GCC ATG 1591
Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met
505 510 515
CGG TTT TTC AAC TTC TCA TGG AGG GTC ACT GCC GAT CAG CTC AGG AAA 1639
Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys
520 525 530
GCC CCC Alá Pro 535 AAC Asn AGA GAT CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC 1687
Arg Asp Gin 540 Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Alá
545 550
TAC TAC TCG CCC ACC AAG AAT GAG ATT GTG TTT CCG GCC GGG ATC CTG 1735
Tyr Tyr Ser Pro Thr 555 Lys Asn Glu Ile Val Phe 560 Pro Alá Gly Ile Leu 565
CAG GCA CCA TTC TAC ACA CGC TCC TCA CCC AAG GCC TTA AAC TTT GGT 1783
Gin Alá Pro Phe 570 Tyr Thr Arg Ser Ser 575 Pro Lys Alá Leu Asn Phe Gly 580
GGC ATA GGT GTC GTC GTG GGC CAT GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT 1831
Gly Ile Gly 585 Val Val Val Gly His 590 Glu Leu Thr His Alá Phe Asp Asp 595
CAA GGA CGG GAG TAT GAC AAG GAC GGG AAC CTC CGG CCA TGG TGG AAG 1879
Gin Gly Arg 600 Glu Tyr Asp Lys Asp 605 Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys 610
AAC TCA TCC GTG GAG GCC TTC AAG CGT CAG ACC GAG TGC ATG GTA GAG 1927
Asn Ser 615 Ser Val Glu Alá 620 Phe Lys Arg Gin Thr 625 Glu Cys Met Val Glu 630
CAG TAC AGC AAC TAC AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGG CGG CAC 1975
Gin Tyr Ser Asn Tyr 635 Ser Val Asn Gly Glu Pro 640 Val Asn Gly Arg His 645
ACC CTG GGG GAG AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGT CTC AAG GCG GCC TAT 2023
Thr Leu Gly Glu 650 Asn Ile Alá Asp Asn 655 Gly Gly Leu Lys Alá Alá Tyr 660
CGG GCT TAC CAG AAC TGG GTG AAG AAG AAC GGG GCT GAG CAC TCG CTC 2071
Arg Alá Tyr 665 Gin Asn Trp Val Lys 670 Lys Asn Gly Alá Glu His Ser Leu 675
CCC ACC CTG GGC CTC ACC AAT AAC CAG CTC TTC TTC CTG GGC TTT GCA 2119
Pro Thr 680 Leu Gly Leu Thr Asn Asn 685 Gin Leu Phe Phe Leu Gly Phe Alá 690
CAG GTC TGG TGC TCC GTC CGC ACA CCT GAG AGC TCC CAC GAA GGC CTC 2167
Gin Val 695 Trp Cys Ser Val 700 Arg Thr Pro Glu Ser 705 Ser His Glu Gly Leu 710
ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCT CGC TTC CGG GTC ATC GGC TCC CTC 2215
Ile Thr Asp Pro His 715 Ser Pro Ser Arg Phe Arg 720 Val Ile Gly Ser Leu 725
TCC AAT TCC AAG GAG TTC TCA GAA CAC TTC CGC TGC CCA CCT GGC TCA 2263
Ser Asn Ser Lys 730 Glu Phe Ser Glu His 735 Phe Arg Cys Pro Pro Gly Ser 740
CCC ATG Pro Met AAC Asn 745 CCG Pro CCT Pro CAC His AAG TGC Lys Cys 750 GAA Glu GTC TGG Val Trp T AAGGACGAAG 2307
• · • · Λ ·· ·· • ··· * · · • · , ··· ······
.......· . · ·
CGGAGAGAGC CAAGACGGAG GAGGGGAAGG GGCTGAGGAC GAGACCCCCA TCCAGCCTCC 2367
AGGGCATTGC TCAGCCCGCT TGGCCACCCG GGGCCCTGCT TCCTCACACT GGCGGGTTTT 2427
CAGCCGGAAC CGAGCCCATG GTGTTGGCTC TCAACGTGAC CCGCAGTCTG ATCCCCTGTG 2487
AAGAGCCGGA CATCCCAGGC ACACGTGTGC GCCACCTTCA GCAGGCATTC GGGTGCTGGG 2547
CTGGTGGCTC ATCAGGCCTG GGCCCCACAC TGACAAGCGC CAGATACGCC ACAAATACCA 2607
CTGTGTCAAA TGCTTTCAAG ATATATTTTT GGGGAAACTA TTTTTTAAAC ACTGTGGAAT 2667
ACACTGGAAA TCTTCAGGGA AAAACACATT TAAACACTTT TTTTTTTAAG CCC 2720
Α 36. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) HOSSZ: 753 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: protein
(xi) A 36 . SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Met 1 Ser Thr Tyr Lys Arg Alá Thr 5 Leu Asp Glu Glu Asp Leu Val Asp 10 15
Ser Leu Ser Glu 20 Gly Asp Alá Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe 25 30
His Ser Pro 35 Arg Ser Gly Gin Arg 40 Cys Trp Alá Alá Arg Thr Gin Val 45
Glu Lys 50 Arg Leu Val Val Leu Val 55 Val Leu Leu Alá Alá Gly Leu Val 60
Alá 65 Cys Leu Alá Alá Leu Gly Ile 70 Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser 75 80
Val Cys Leu Ser Glu Alá Cys Val 85 Ser Val Thr Ser Ser Ile Leu Ser 90 95
Ser Met Asp Pro 100 Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Alá 105 110
Cys Gly Gly 115 Trp Ile Lys Alá Asn 120 Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg 125
Trp Gly 130 Thr Phe Ser Asn Leu Trp 135 Glu His Asn Gin Alá Ile Ile Lys 140
His 145 Leu Leu Glu Asn Ser 150 Thr Alá Ser Val Ser 155 Glu Alá Glu Arg Lys 160
Alá Gin Val Tyr Tyr Arg Alá Cys Met Asn Glu Thr Arg Ile Glu Glu
165 170 175
Leu Arg Alá Lys Pro Leu Met Glu Leu Ile Glu Arg Leu Gly Gly Trp
180 185 190
Asn Ile Thr Gly Pro Trp Alá Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin
195 200 205
Val Val Thr Alá His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val
210 215 220
Ser Alá Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val Ile Gin Val Asp Gin
225 230 235 240
Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu
245 250 255
Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly
260 265 270
Lys Leu Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Alá Ile Arg Pro Gin Met Gin
275 280 285
Gin Ile Leu Asp Phe Glu Thr Alá Leu Alá Asn Ile Thr Ile Pro Gin
290 295 300
Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu Ile Tyr His Lys Val Thr Alá Alá
305 310 315 320
Glu Leu Gin Thr Leu Alá Pro Alá Ile Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn
325 330 335
Thr Ile Phe Tyr Pro Val Glu Ile Asn Glu Ser Glu Pro Ile Val Val
340 345 350
Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Glu Gin Ile Ser Thr Leu Ile Asn Thr Thr
355 360 365
Asp Arg Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met Ile Trp Asn Leu Val Arg Lys
370 375 380
Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Alá Asp Glu Lys Phe
385 390 395 400
Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys
405 410 415
Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Alá Leu Gly Pro 420 425 430
86 ·· ··, • · ’ ·· • · · • · *
Met Phe Val Lys Alá Thr Phe Alá Glu Asp Ser Lys Ser Ile Alá Thr
435 440 445
Glu Ile Ile Leu Glu Ile Lys Lys Alá Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr
450 455 460
Leu Lys Trp Met Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ser Alá Lys Glu Lys Alá
465 470 475 480
Asp Alá Ile Tyr Asn Met Ile Gly Tyr Pro Asn Phe Ile Met Asp Pro
485 490 495
Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Alá Val Pro Asp Leu
500 505 510
Tyr Phe Glu Asn Alá Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr
515 520 525
Alá Asp Gin Leu Arg Lys Alá Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr
530 535 540
Pro Pro Met Val Asn Alá Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu I le Val
545 550 555 560
Phe Pro Alá Gly Ile Leu Gin Alá Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro
565 570 575
Lys Alá Leu Asn Phe Gly Gly Ile Gly Val Val Val Gly His Glu Leu
580 585 590
Thr His Alá Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn
595 600 605
Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Alá Phe Lys Arg Gin
610 615 620
Thr Glu Cys Met Val Glu Gin Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu
625 630 635 640
Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn Ile Alá Asp Asn Gly
645 650 655
Gly Leu Lys Alá Alá Tyr Arg Alá Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn
660 665 670
Gly Alá Glu His Ser Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu
675 680 685
Phe Phe Leu Gly Phe Alá Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu
690 695 700
Ser Ser His Glu Gly Leu Ile Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe
705 710 715 720
8J
Arg Val Ile Gly Ser 725 Leu Ser Asn Ser Lys 730 Glu Phe Ser Glu His 735 Phe
Arg Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val
740 745 750
Trp
.........
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (10)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Endotelin konvertáló enzimek, azzal jellemezve, hogy a
    36. számú szekvencia szerinti polipeptid-szekvenciát vagy ennek olyan rész-szekvenciáit tartalmazzák, amelyek még rendelkeznek az endotelin konvertáló enzim enzimaktivitásával, az antigén tulajdonságokkal vagy a ligandumokhoz való affinitással.
  2. 2. DNS szekvenciák, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti endotelin konvertáló enzimet kódolnak, és az említett szekvenciák az alábbi csoportokba sorolhatók:
    a) DNS szekvenciák, amelyek a 35. számú szekvenciával leírt szerkezetűek,
    b) DNS szekvenciák, amelyek a 36. számú szekvenciával leírt szerkezetű proteineket kódolnak.
  3. 3. Eljárás endotelin konvertáló enzimek géntechnológiai előállítására a 2. igénypont szerinti DNS szekvenciák felhasználásával .
  4. 4. Eljárás az 1. igénypont szerinti endotelin konvertáló enzimek előállítására, azzal jellemezve, hogy emlős sejteket egy endotelin konvertáló enzim inhibitorral endotelin konvertáló enzim túltermelésre stimulálunk, és ezekből a sejtekből az endotelin konvertáló enzimet a szokásos proteinkémiai módszerekkel izolálj uk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy inhibitorként foszforamidont használunk.
  6. 6. Eljárás az 1. igénypont szerinti endotelin konvertáló enzim előálítására, azzal jellemezve, hogy a 36. számú szekvencia
    62.393/riEip] • · · · egy rész-szekvenciáját kódoló oligonukleotidot vagy ezen szekvenciákkal komplementer oligonukleotidot hibridizációs szondaként használva egy génkönyvtárból egy endotelin konvertáló enzim gént izolálunk, és ezt a gént szokásos géntechnológiai módszerekkel egy gazdaszervezetben kifejezzük.
  7. 7 . Az 1. igénypont szerinti endotelin konvertáló enzim felhasználása az endotelin konvertáló enzimet gátló anyagok (inhibitorok) azonosítására.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti endotelin konvertáló enzimek felhasználása antitestek előállítására.
  9. 9. Egy 2. igénypont szerinti DNS szekvencia felhasználása olyan transzgenikus állatok előállítására, amelyek ezen DNS szekvencia egy vagy több extra másolatát tartalmazzák, vagy amelyekben a normál EXE-gén (endotelin konvertáló enzim gén) ki van oltva.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti endotelin konvertáló enzimek felhasználása gyógyszerek előállfására.
HU9601298A 1993-11-16 1994-11-10 Endothelin-converting enzyme HUT75554A (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19934339100 DE4339100A1 (de) 1993-11-16 1993-11-16 Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1)
DE19944403665 DE4403665A1 (de) 1994-02-07 1994-02-07 Endothelinkonversionsenzym (ECE)
DE19944412372 DE4412372A1 (de) 1994-04-12 1994-04-12 Endothelinkonversionsenzym (ECE)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9601298D0 HU9601298D0 (en) 1996-07-29
HUT75554A true HUT75554A (en) 1997-05-28

Family

ID=27205762

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9601298A HUT75554A (en) 1993-11-16 1994-11-10 Endothelin-converting enzyme

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6066502A (hu)
EP (1) EP0728209B1 (hu)
JP (1) JPH09505733A (hu)
KR (1) KR960705934A (hu)
CN (1) CN1141651A (hu)
AT (1) ATE315656T1 (hu)
AU (1) AU8107094A (hu)
BR (1) BR9408077A (hu)
CA (1) CA2176507A1 (hu)
CZ (1) CZ139496A3 (hu)
DE (1) DE59410427D1 (hu)
FI (1) FI962047A (hu)
HU (1) HUT75554A (hu)
NO (1) NO962023L (hu)
NZ (1) NZ275817A (hu)
PL (1) PL314480A1 (hu)
SK (1) SK59896A3 (hu)
WO (1) WO1995014095A1 (hu)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6255468B1 (en) * 1998-05-07 2001-07-03 Smithkline Beecham Plc MPROT12 polynucleotides and methods thereof
JP2003531572A (ja) 1999-09-24 2003-10-28 レキシコン・ジェネティクス・インコーポレーテッド エンドセリン変換酵素様の新規ヒトタンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド
EP1564558B1 (de) * 2004-02-13 2005-12-07 B.R.A.H.M.S Aktiengesellschaft Verfahren zur Bestimmung der Bildung von Endothelinen zu Zwecken der medizinischen Diagnostik, sowie Antikörper und Kits für die Durchführung eines solchen Verfahrens
US9062347B2 (en) 2007-07-27 2015-06-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Endothelin single nucleotide polymorphisms and methods of predicting β-adrenergic receptor targeting agent efficacy

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2966939B2 (ja) * 1990-12-07 1999-10-25 日清製粉株式会社 ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素
EP0575405A1 (en) * 1991-02-04 1993-12-29 Berlex Laboratories, Inc. Endothelin converting enzyme

Also Published As

Publication number Publication date
US6066502A (en) 2000-05-23
AU8107094A (en) 1995-06-06
CZ139496A3 (en) 1997-10-15
ATE315656T1 (de) 2006-02-15
CA2176507A1 (en) 1995-05-26
HU9601298D0 (en) 1996-07-29
EP0728209A1 (de) 1996-08-28
KR960705934A (ko) 1996-11-08
SK59896A3 (en) 1997-07-09
FI962047A (fi) 1996-07-12
FI962047A0 (fi) 1996-05-14
PL314480A1 (en) 1996-09-16
CN1141651A (zh) 1997-01-29
DE59410427D1 (en) 2006-04-06
JPH09505733A (ja) 1997-06-10
WO1995014095A1 (de) 1995-05-26
NO962023L (no) 1996-07-16
BR9408077A (pt) 1997-08-12
NO962023D0 (no) 1996-05-15
NZ275817A (en) 1997-02-24
EP0728209B1 (de) 2006-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8263326B2 (en) Compounds and methods for modulating activation of NF-κB
CN101184772A (zh) 人类原癌基因及其编码的蛋白质
JP2011172588A (ja) Ｄｐ７５をコードするｄｎａおよびその使用のためのプロセス
JPH10510986A (ja) メタロプロテイナーゼ−４のヒト組織インヒビター
US5359045A (en) Nucleic acid coding for the human angiotensin converting enzyme (ACE), and its uses, especially for the in vitro diagnosis of arterial hypertension
JPH10501962A (ja) マトリックス金属プロテアーゼのｄｎａ配列、その調製および使用
JP2533869B2 (ja) Ｈｕｓｉ―ｉ型インヒビタ―の生物学的活性を有するタンパク質をコ―ドするｄｎａ配列、前記ｄｎａ配列を含む組換え体クロ―ニングベクタ―及び前記ベクタ―により形質転換された細菌
EP1036165A1 (en) Human rnase h and compositions and uses thereof
JPH0673456B2 (ja) ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉ▼
HUT75554A (en) Endothelin-converting enzyme
EP0748376A1 (en) Rna editing enzyme and methods of use thereof
US6569665B1 (en) Calpaines, production and use thereof
DK172400B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af renset minactivin, minactivinkodende DNA-molekyle, rekombinant DNA-molekyle, sammensmeltet gen, vært, reagent til lokalisering og definering af grænserne for tumorer i histologiske prøver, samt anvendelse af det rekombinante DNA-molekyle, minactivinet og peptider deraf
KR20020062375A (ko) 인간 헤파라나제-관련 폴리펩티드 및 핵산
US5612190A (en) DNA molecule encoding bovine group I phospholipase A2 receptor
JP3197355B2 (ja) アスパラギニルエンドペプチダーゼ遺伝子
JP2623807B2 (ja) セリンプロテアーゼおよびセリンプロテアーゼ遺伝子
EP0843006A2 (en) Recombinant PSA expression vectors and assays using the same
JPH11225765A (ja) 新規セリンプロテアーゼ
JP2001275687A (ja) 膜結合型メタロプロテアーゼ及びその可溶性分泌型
WO2000011146A1 (fr) Epimorphine destinee a des artiodactyles
US20030144496A1 (en) Human RNase H and compositions and uses thereof
JP2001046065A (ja) 新規セリンプロテアーゼ
JP2001046072A (ja) Ａｃｅ類似遺伝子
DE4403665A1 (de) Endothelinkonversionsenzym (ECE)

Legal Events

Date Code Title Description
DFA9 Temporary protection cancelled due to abandonment