SK59896A3 - Endothelin-converting enzyme - Google Patents

Endothelin-converting enzyme Download PDF

Info

Publication number
SK59896A3
SK59896A3 SK598-96A SK59896A SK59896A3 SK 59896 A3 SK59896 A3 SK 59896A3 SK 59896 A SK59896 A SK 59896A SK 59896 A3 SK59896 A3 SK 59896A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
leu
seq
glu
ala
ser
Prior art date
Application number
SK598-96A
Other languages
English (en)
Inventor
Burkhard Kroger
Harald Seulberger
Thomas Meyer
Martin Schmidt
Elard Jacob
Rainer Otter
Thomas Subkowski
Heinz Hillen
Original Assignee
Basf Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19934339100 external-priority patent/DE4339100A1/de
Priority claimed from DE19944403665 external-priority patent/DE4403665A1/de
Priority claimed from DE19944412372 external-priority patent/DE4412372A1/de
Application filed by Basf Ag filed Critical Basf Ag
Publication of SK59896A3 publication Critical patent/SK59896A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6497—Endothelin-converting enzyme (3.4.24.71)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24071—Endothelin-converting enzyme 1 (3.4.24.71)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)

Description

Predložený vynález sa týka endotelín konvertujúcich enzýmov, spôsobu ich výroby a ich použitia.
Doterajší stav techniky
Zvýšená hladina endotelínu sa vyskytuje v súvislosti s mnohými chorobami ako základná hypertónia, srdcový infarkt, akútne zlyhanie obličiek, šok a srdcové zlyhanie. Na takéto súvislosti je možné usudzovať podľa výsledkov dosiahnutých s endotelín-protilátkami. Vo zvieracích modeloch mohla tak byť znížená veľkosť srdcového infarktu v závislosti od dávky (Watanabe a spol., Náture 344, 114 (1990)), pozitívne ovplyvnená funkcia obličiek (Kon a spol., J. Clin. Invest. 83, 1762, (1989)) a znížená nefrotoxicita cyklosporínu (Kon a spol., Kidney Int. 37, 1487, (1990)).
Endotelín konvertujúci enzým (ECE-1) uvoľňuje endotelín 1 z 38 aminokyselín zloženej prekurzorovej molekuly Big-endotelín-1. Proti nežiadúcim biologickým účinkom spôsobeným endotelínom-1 je možné napr. pôsobiť inhibíciou endotelín konvertujúceho enzýmu a tým biosyntézy endotelínu.
Existujú enzýmové aktivity, ktoré uvoľňujú endotelín príp. endotelínu podobné molekuly zo zodpovedajúcich prekurzorových molekúl, big-endotelínov, ktoré boli izolované z rôznych bunkových línií (Takeda a spol., Biochem. Biophys
176, 860 (1991), Ohnaka a spol., Biochem. Biophys
168, 1128 (1990), Matsumura a spol., FEBS (1992), Ahn a spol., Proc. Natl. Acad. Sci (1992), PCT WO 92/13944, Ohnaka a spol Hypertension A 14; č. 4 (1992), Okada a
Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991), Takada a spol.., Biochem. Biophys. Res. Comm. 182, 1383 (1992), Opgenorth a spol. FASEB
6, 2653 (1992)).
Res. Comm. Res. Comm. Lett. 293, 45 USA 89, 8606, , Clin. Exp. spol., Biochem.
Tieto enzýmové aktivity sú však doposiaľ nedostatočne charakterizované. Sú považované za málo bohaté enzýmové zmesi. Takéto nečisté enzýmové zmesi sú však na použitie v skúšobných postupoch na zisťovanie špecifických ECE-inhibítorov málo vhodné, pretože iné, fyziologicky nerelevantné cudzie proteázy významne rušia enzýmový test.
Napríklad sa tak štiepi big-endotelín taktiež serínproteázou chymotrypsínom ako aj papainom, termolyzínom a NEP 24.11 na endotelín a endotelínu podobné produkty, ktoré v skúšobnom postupe boli falošne priradené enzýmu ECE. Preto je popis endotelín konvertujúceho enzýmu v literatúre rozporný.
Údaje o molekulovej hmotnosti endotelín konvertujúceho enzýmu sa menia od 65 kDalton do 540 kDalton; údaje o hodnotách Km a vmax sa rovnako vzájomne líšia (Opgenorth a spol., FASEB 6, 2653 (1992); Sawamura a spol., Biochem. Biophys. Act 1161,
295 (1993)). Je tak rozpor v tom, či endotelín konvertujúci enzým zaradiť do rodiny aspartátproteáz alebo metaloproteáz Biochem. Biophys. Acta 1161, 295 (1993);
43, 845 (1992)). Ďalej sú v literatúre o charakteristických údajoch, či ide u metaloproteáz o cytoplazmatický alebo membránovo naviazaný enzým a ktoré substráty sú príslušným ECE premenované (Big-Et-1; Big-Et-3: Matsumura a spol. (FEBS Lett. 293, 45 (1992)): Takahashi a spol., (J. Biol. Chem. 268; 21394 (1993)); Okada a spol., (Biochem.. Biophys. Res. Comm. 180, 1019 (1991); Ohnaka a spol. (Clin. Exp. Hypertension A 14; č. 4 (1992); Matsumura a spol. (FEBS Lett. 305; 86 (1992)).
(Sawamura a spol., Biochem, Pharmacol. rozporuplné údaje
Doteraz nebol uvedený jednoznačný popis ECE, ktorý by umožňoval jednoznačne definovať ECE. Takúto definíciu bude možné uskutočniť až určením primárnej štruktúry, animokyselinovej sekvencie, ECE. Preto je nutné ECE najskôr vyrobiť v čistej forme.
Podstata vynálezu
Bol objavený endotelín konvertujúci enzým, ktorý sa vyznačuje molekulovou hmotnosťou 250 000 Dalton a parciálnou aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID NO: 1.
Endotelín konvertujúci enzým podľa predloženého vynálezu vykazuje nasledujúce znaky: vykazuje molekulovú hmotnosť stanovenú pomocou SDS-polyakrylamid-gélovej elektroforézy za neredukčných podmienok približne 250 000 Dalton.
Za redukčných podmienok vykazuje pri SDS-polyakrylamidovej elektroforéze pruh 125 000 Dalton; pozostáva podľa všetkého z homodiméru.
Endotelín konvertujúci enzým je glykozylovaný. Enzymatické odstránenie zvyšku cukru spôsobí zmenu zjavnej molekulovej hmotnosti z 125 000 Dalton na asi 82 000 Dalton.
Sekvenciovanie tryptických peptidov endotelín konvertujúceho enzýmu poskytuje nasledujúce aminokyselinové parciálne sekvencie SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6.
Ďalšia charakterizácia endotelín konvertujúceho enzýmu podľa predloženého vynálezu je uvedená v príkladoch.
Ďalšou podstatou vynálezu sú endotelín konvertujúce enzýmy, vyznačujúce sa molekulovou hmotnosťou asi 250 000 Dalton a aminokyselinovou parciálnou sekvenciou, ktorá vykazuje aspoň 50 % homológie z SEQ ID NO: 1.
Také endotelín konvertujúce enzýmy je možné izolovať z iných organizmov ako je hovädzí dobytok, napríklad z ľudských buniek.
Vynález sa týka ďalej endotelín konvertujúcich enzýmov, ktoré obsahujú v SEQ ID NO: 30 a SEQ ID NO: 36 popísanú polypeptidovú sekvenciu alebo jej funkčný fragment.
Funkčnými fragmentárni sa rozumejú také parciálne sekvencie, ktoré ešte vykazujú enzymatickú aktivitu endotelín konvertujúceho enzýmu, antigénne vlastnosti alebo afinitu k ligandom, napríklad väzbovým proteínom.
Ďalšie funkčné fragmenty sú také polypeptidové sekvencie, ktoré sú pripraviteľné zo SEQ ID NO: 30 alebo NO: 36 inzerciou, deléciou alebo substitúciou aminokyselín alebo peptidov a ktoré ešte v podstate vykazujú enzymatickú aktivitu endotelín konvertujúceho enzýmu a/alebo imunologický krížovo reagujú s endotelínom konvertujúcim enzým vzorca SEQ ID NO: 30 alebo NO: 36.
Ďalšou podstatou vynálezu sú DNA-sekvencie, ktoré kódujú endotelín konvertujúci enzým a ktoré sú zvolené zo skupiny:
a) DNA-sekvenciu so štruktúrou popísanou v SEQ ID NO: 29 alebo SEQ ID NO: 35,
b) DNA-sekvencie, ktoré kódujú proteín so štruktúrou popísanou v SEQ ID NO: 30 alebo SEQ ID NO: 36 a
c) DNA-sekvencie, ktoré za štandardných podmienok hybridizujú s DNA-sekvenciami a) alebo b) ,
d) DNA-sekvencie, ktoré kódujú proteínový produkt, ktorý môže byť rozpoznávaný protilátkami, ktoré sa vytvoria proti proteínu SEQ ID NO: 30 alebo 36 alebo z neho generovaným fragmentom.
Štandardnými podmienkami sú napríklad mienené teploty medzi 42 a 58 °C vo vodnom tlmivom roztoku s koncentráciou medzi 0,1 a 1 x SSC (1 x SSC; 0,15 M NaCI, 15 mM citrát sodný pH 7,2). Experimentálne podmienky pre DNA-hybridizáciu sú uvedené v učebniciach génovej techniky, napríklad v práci Sambrooka a spol., Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
Výroba takýchto DNA sekvencií je popísaná v príklade 8. DNA sekvencia, ktorej proteínové produkty sú rozpoznávané protilátkami, ktoré boli generované proti proteínom SEQ ID NO: 30 alebo 36 alebo ich fragmentom, je možné získať, podľa dobre známych metód.
Výroba protilátok proti takýmto proteínom je napr. popísaná v práci Hudsona L. a Haye F. C., Practical Immunology, Blackwell Sci. Pub., Oxford, 1980.
Použitie protilátok na vyhľadanie cDNA-sekvencií, ktoré kódujú s týmito protilátkami krížovo reagujúce proteíny, je napríklad popísané v: DNA Cloning Vol. I, Glover D. M., Ed., IRL Press Oxford, 1985.
Vynález sa ďalej týka spôsobu výroby endotelín konvertujúceho enzýmu, ktorý sa vyznačujúci sa tým, že sa bunky z cicavca, výhodne endotelínové bunky, stimulujú s inhibítorom endotelín konvertujúceho enzýmu na nadmernú produkciu endotelín konvertujúceho enzýmu a z týchto buniek sa endotelín konvertujúci enzým izoluje bežnými spôsobmi proteínovej chémie.
Na indukciu ECE v bunkách cicavcov môžu byť použité všetky ECE inhibítory. Sú preto vhodné ECE-inhibítory napríklad popísané v JP-146737; JP 05148277-A1; Jpn. J. Biochem. 64; (8) Abst. 2367 (1992); Derwent NCE-93-0956 (1993); Derwent NCE-93-0971 (1993); J. Med. Chem. 36, 173 (1993); EP 518299-A2, Výhodne sa používa fosforamidón. Stimulujú sa bunky v kultúre prídavkom týchto inhibítorov k médiu na kultiváciu buniek počas 6 hodín až 6 dní. Výhodne sa však stimulácie uskutočňuje počas 2-3 dní. Použitá koncentrácia inhibítorov predstavuje 10-2 M až 10”7 M, výhodne 10-2 až 10’4.
Výroba endotelín konvertujúceho enzýmu podľa predloženého vynálezu je však taktiež možná génovotechnickou cestou. Na základe popísaných aminokyselinových parciálnych sekvencií je možné vyrobiť: syntetické oligonukleotidy, ktoré kódujú tieto sekvencie alebo sú komplementárne k týmto kódujúcim sekvenciám.
Tieto oligonukleotidy môžu byť. použité ako hybridizačné sondy na izoláciu zodpovedajúcich génov alebo cDNA-molekúl z génového poolu ako sú génové banky alebo cDNA-pooly. Tento typ génovej izolácie je známy odborníkovi z učebníc molekulárnej biológie ako je Sambrook, Fritsch, Maniatis; Molekular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, USA.
z peptidov popísaných pod aminokyselinovej sekvencie
Pomocou vhodných syntetických oligonukleotidov a polymerázovej reťazovej reakcii (PCR) môžu byť získané takisto časti génov napríklad z cDNA-bánk alebo prvého reťazca cDNA (PCR-protokoly); Academis Press; San Diego; USA; (1990). Oligonukleotidy, ktoré sú na toto vhodné je možné odvodiť SEQ ID NO: 1 až 6 prevedením do dvojreťazcovej DNA sekvencie (sense a antisense). Pritom môžu na základe degenerovaného genetického kódu byť odvodené degenerované oligonukleotidové zmesi z peptidu a nájsť tak použitie ako primér. Oligonukleotidy môžu byť odvodené z peptidov taktiež s ohľadom na takzvané codon usage; preferenčne použitého pri jednom druhu, v tomto prípade hovädzieho dobytka, z určitých nukleotid-tripletov pre aminokyselinu. PCR sa potom uskutočňuje s dvoma odlišnými oligonukleotidami ako primérmi, pričom môžu byť pre PCR potrebné dva priméry zložené z reťazca (sense) a protireťazca (antisense) oligonukleotidu. Rovnako použitie môžu nájsť oligonukleotidy, ktoré sú odvodené z častí cDNA-vektorov, alebo oligo-dT pre 3' časť mRNA.
Tieto génové časti môžu byť potom opäť použité na získanie kompletného génu alebo úplnej cDNA spôsobom génovej izolácie.
Týmto spôsobom je možné nielen izolovať gény pre endotelín konvertujúci enzým, ale taktiež gény príp. varianty endotelín konvertujúceho enzýmu z iných organizmov, napríklad ľudí, ktoré vykazujú najmenej 80 % homológie v oblasti proteínov vzhľadom na SEQ ID NO: 1.
Endotelín konvertujúci enzýmy podľa predloženého vynálezu je možné zvlášť dobre pripraviť tak, že sa izoluje zodpovedajú7 ci gén a tento gén sa exprimuje v hostiteľskom organizme obvyklými génovotechnickými metódami.
ECE podľa predloženého vynálezu alebo z nich odvodené peptidy môžu byt použité na výrobu protilátok alebo fragmentov protilátok ako sú napr. F - fragmenty, ktoré napríklad môžu byť. použité na stanovenie ECE, v skúšobných postupoch na identifikáciu látok, potlačujúcich ECE alebo ako inhibítory ECE.
Takéto protilátky sú všeobecne používané v diagnostike chorôb, na ktorých sa podieľa endotelín konvertujúci enzým, ako cenné pomocné činidlá.
Na tieto účely môžu byť taktiež použité PCR-priméry, ktoré sú odvodené od DNA sekvencií podľa predloženého vynálezu, napríklad na meranie ECE-transkripcie alebo stanovenie genotypu.
Pomocou získaných génov môžu byť odborníkovi známym typom a spôsobom zvieratá zmenené vo svojej génovej podstate tak, že obsahujú jednu alebo viac extrakópií tohto génu alebo že normálny ECE-gén bol vypnutý. Tieto transgénne zvieratá sú okrem iného vhodné na pokusné účely.
Samotné endotelín konvertujúce enzýmy sú vhodné taktiež ako účinná látka na výrobu liečiv, napríklad pri chorobách, ktoré sú sprevádzané zvýšenou hladinou ECE-substrátov ako je napr. bradykinín, substancia P, somatostatín, neuropeptid Y. Takéto choroby sú napríklad zápaly, astma, migréna, reuma, celulárne procesy a bunková proliferácia, ktoré prebiehajú v prítomnosti peptidov ako rastových faktorov. Použitie môže ECE nájsť taktiež ako liečivo pri chorobách, na ktorých sa podieľa vazodilatácia, ktorá môže byť potlačená podaním ECE, napr. septickom šoku, migréne, poruchách potencie.
Pre použitie ECE ako liečiva môže byť za určitých okolností nutné časť ECE mutačne zmeniť. Tieto mutačné zmeny môžu na8 príklad í sú z ECE-derivátu, ktorý nie je glykozylovaný alebo ktorý neobsahuje žiadnu membránovú kotvu (rozpustný ECE). Takýto rozpustný ECE, ktorý už neobsahuje žiadnu membránovú kotvu, môže byť napríklad vyrobený expresiou ECE-fragmentu, ktorý obsahuje extracelulárnu, katalytický účinnú doménu. Môžu byť napríklad získané také ECE-fragmenty, v ktorých je kódujúca sekvencia medzi aminokyselinami 20 a 703 zo SEQ ID NO: 25, výhodne medzi aminokyselinami 27 a 703 zo SEQ ID NO: 25 spojené s DNA sekvenciou in vivo odštiepiteľného signálneho peptidu a zavedená vo vhodnom expresnom vektore do eukaryotických buniek. Ako signálny peptid je vhodná napr. sekvencia ľudského tkanivového plazminogénového aktivátora (Tissue Plasminogen Activator”) medzi polohami aminokyseliny -35 a -4 (Collen D., Náture 301, 214 až 221 (1983)). Zmeny pritom môžu ovplyvňoval napríklad špecifičnosť., čas pôsobenia, príjem. Ďalej môžu funkčné časti ECE byť kopulované s časťami iných proteínov na získanie nových proteínov, ktoré môžu nájsť použitie ako liečivá. Zmenené môžu byť taktiež ECE kovalentnou modifikáciou s nepeptidickými molekulami ako napr. je PEG, dextrán, mastné kyseliny.
DNA-sekvencie podľa predloženého vynálezu sú vhodné taktiež na použitie v génovej terapii, napríklad na výrobu génovoterapeutických liečiv. Choroby so zvýšenými hodnotami endotelínu môžu byť taktiež liečené oligonukleotidmi odvodenými od ECE-DNA-sekvencie. Tieto oligonukleotidy sú odvodené z nekódujúceho DNA-reťazca (anti-sense) a môžu byť použité ako liečivá. Na nich založená anti-sense-terapia výhodne využíva stabilnejšie chemické deriváty odvodené od oligonukleotidov. Môžu byť. napríklad použité anti-sense-oligonukleotidy, ktoré boli syntetizované vhodne z oblasti, ktorá je definovaná polohami 31 až 100 Seq ID 35. Anti-sense-oligonukleotidy výhodne majú dĺžku 15 až 30 zvyškov. Anti-sense terapia alebo prevencia nachádzajú použitie pri chorobách s rovnakými indikáciami ako ECE-inhibítory, napr. cerebrálna ischémia; subarachnoidálne krvácanie; vazospasmy; koronárnej ischémie; choroby, ktoré sú spojené s bunkovými proliferačnými procesmi ako hyperplazia prostaty, ako ateroskleróza, ako restenóza;
astma; hypertenzia; pulmonálny krvný vysoký tlak; orgánové zlyhanie ako srdcový infarkt a obličkové zlyhanie; obličková ischémia; nefrotoxicita; infarkt myokardu; koronálne srdcové ochorenia; sepsa.
Z DNA-sekvencie ECE môžu byť. taktiež odvodené sekvencie, s ktorými môžu byť vyrobené katalytické RNA-molekuly, takzvané ribozymy. Tieto katalytické RNA-molekuly pôsobia tak, že sa po aplikácii ECE-RNA alebo ECE-DNA štiepia alebo inaktivujú a tak bránia proteínovej syntéze ECE.
ECE-DNA-sekvencie môžu byť využité na ustanovenie vhodných expresných vektorov do buniek, ktoré exprimujú tento enzým. Tieto bunky nachádzajú použitie okrem iného ako liečivo.
Výhodne nachádzajú endotelín konvertujúce enzýmy použitie v analytických postupoch na identifikáciu ECE potlačujúcich látok. Tieto analytické postupy sú zvyčajne enzymatické reakcie, pri ktorých sa meria ECE-katalyzované štiepenie substrátu za prítomnosti potenciálnych potlačujúcich látok.
Ďalšou podstatou vynálezu sú látky, potlačujúce endotelín konvertujúci enzým, ktoré sú identifikované enzýmovým testom za použitia endotelín konvertujúceho enzýmu podľa predloženého vynálezu.
K vynálezu taktiež patrí spôsob výroby liečiv, ktoré inhibujú konverziu endotelín konvertujúceho enzýmu, vyznačujúci sa tým, že sa známe chemické zlúčeniny použijú v enzýmovom teste za použitia endotelín konvertujúceho enzýmu podľa predloženého vynálezu a identifikujú sa tie, ktoré majú inhibujúci účinok a takto identifikované zlúčeniny sa formulujú s bežnými nosičovými alebo pomocnými látkami ako liečivo.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Stimulácia ECE-1 v primárnych bunkách hovädzieho endotelu FBHE fosforamidónom trubičky so zmrazenými FBHE-hovädzími endotelovými bunkami (ATCC CRL 1395) sa v 14. pasáži roztavia a umiestnia do 3 T175-fliaš na bunkovú kultiváciu (fa. Sarstedt) so 40 ml rastového média DMEM (Gibco č. 041-01965) + 5 ml/500 ml glutamínu (200 mM; Gibco 043-05030) + 1 ml/500 ml gentamycínu (Gibco 043-05750) + neesenciálne aminokyseliny; konečná koncentrácia: 1 x (Gibco č. 043-01140) + 10 % FCS (Gibco č. 011-06290; inaktivované 37 minút pri 56 °C) + 25 ng/ml bázického FGF (Intergen 4125-80)).
spôsobom pri 37 °C;
vlhkosti. Nasledujúci dosiahnutí konfluencie
Tieto bunky sa inkubujú štandardným v atmosfére zo 7 % C02; 100 % vzdušnej deň sa uskutoční výmena média. Pri
- v tomto prípade po 4 dňoch - sa bunky pasážujú štandardným spôsobom spracovaním trypsínom a rozdelia sa do 9 Τ-175-fliaš a inkubujú za účelom rastu pri 37 °C ako bolo popísané. Po 3 dňoch a dosiahnutí konfluencie sa bunky znova po štandardnom spracovaní s trypsínom rozdelia do 20 T-fliaš. Po ďalších 3 dňoch môžu byť. bunky rozdelené do 40 T-fliaš. Po ďalších 3 dňoch sa týchto 39 T-fliaš rozdelí do 78 T-fliaš. Pretože sa týchto 78 T-fliaš použije na získanie buniek, sú potrebné fľaše vhodné na bunkovú kultiváciu (fa. Costar; Accell; č. 3155). Deň po naočkovaní týchto T-fliaš sa do 68 fliaš pridá fosforamidón Inštitúte; č. 4082; skráteno PHAM) v konečnej Toto ošetrenie vedie k vyvolaniu T-fliaš predstavuje neindukované Po ďalších 2 dňoch inkubácie za popísaných podmienok sa PHAM-indukované bunky a kontrolné bunky (-PHAM) oddelene získajú. Za týmto účelom sa fľaše otvoria a médium sa vyklopí. Bunky sa v T-fľašiach premyjú vždy s 10 ml (fy Peptide koncentrácii ECE-aktivity.
4 (+PHAM). Zvyšných 10 kontrolné bunky (-PHAM).
PBS (Boehringer Mannheim č. 210331) (t. j. nad bunkovými rasami opatrne natáčajú). PBS sa vyklopí. Znovu sa pridá 5 ml PBS na T-fľašu. Bunky sa odtrhnú odo dna kultivačnej bunky pomocou bunkového škrabáka (Cell-Scraper, fa Costar č. 3010) a ako bunková suspenzia sa prevedú do 150 ml odstredivkových skúmaviek (Falcon č. 2076), a uložia sa na ľad. Každá T-fľaša sa potom vypláchne 10 ml PBS. Bunková suspenzia sa po vypláchnutí spojí s predchádzajúcou bunkovou suspenziou v odstredivkových skúmavkách. Bunky sa sedimentujú odstredením (1200 ot./min., 10 minút, Heraeus Christ Minifuge GL č. 4400, rotor 2150). Supernatant bez buniek sa odloží a peleta sa vyberie do 3-násobných objemov PBS bunkového sedimentu. Po novom odstredení sa supernatant bez buniek znova odloží. Peleta sa až do spracovania uloží na ľad.
Príklad 2
Porovnávacie obohatenie nestimulovaných a fosforamidom stimulovaných buniek hovädzieho endotelu; identifikácia proteínu
Podľa príkladu 1 získané FBHE-bunky s alebo fosforamidónovej indukcie (vždy 500 vlhkej hmoty) spracovávané ultrazvukom v 15 ml diizopropylfluórfosfátu 20 minút v odstránení (20 min., 1000 g) sa membrány prídavkom 5 % Pluriolu F68 vyzrazaju do supernatantu a získajú novým odstredením pri 10000 g. Membrány sa digerujú. s 2 ml 100 mM Tris-pufra, pH 8,0 a solubilizujú s 1 % Tritónu X-100^. Solubilizáty (vždy 2,5 ml) sa odstredia, zvyšky sa odložia.
bez boli
PBS-pufra, 0,5 mm ľadovom kúpeli. Po
Mono-Q+-chromatografia
Solubilizáty +/- - fosforamidónom indukovaných buniek sa oddelia na stĺpci mono Q+ HR 5/5 (fa Pharmacia) za presne rovnakých podmienok chromatografie. Stĺpce sa ekvilibrujú 50 ml Tris-pufra, pH 8,0, 0,1 % Tritón X-100 (A-pufor). Po nanesení solubilizátu sa 15 min. premýva A-pufrom a 50 min. gradientom lineárne B-pufrom (A pufor + 1 M NaCI (prietok 0,2 ml/min.)). 20 frakcií po 0,5 ml sa odoberie a testuje s ľudským Big ET-1 ako substrátom. Vytvorený Et-1 sa dokazuje pomocou HPLC s reverznou fázou popísaným spôsobom (príklad 3) a kvantifikuje sa. Obidve frakcie s najvyššou enzýmovou aktivitou sa vždy spoja.
Superóza 12R-gélová chromatografia
Eluáty z Mono G-chromatografii sa koncentrujú pomocou
D
Centncon -trubičiek (Fa. Amicon) na 250 1 a vždy gélovo chromatografujú cez Superózu 12 HR 10/36.
Podmienky;
pufor: 20 mM fosforečnan sodný
250 mM NaCI, pH 7,4 0,05% Triton X 100 tok: 0,5 ml/min frakcia: 0,5 ml
Podľa testu popísaného v príklade 3 sa testujú frakcie a vždy sa spoja 2 frakcie s najvyššou enzýmovou aktivitou.
Stanovenie proteínu všetkých frakcii sa uskutoční metódou podľa Bradforda (Anál. Biochem. 72, 248 (1976)).
Výsledky
Čistenie stimulovaných a nestimulovaných buniek poskytl nasledujúce výsledky v rôznych stupňoch čistenia:
Stupeň čistenia špec. akt. ( j/mg) FBHE-bunky + fosforamidôn g/mg FBHE-bunky - fosforamidôn
membrány 129 44
solubilizát 188 22
Mono Q-chromat. 1470 78
Superóza 12-chromat. 4500 130
Obidve aktívne frakcie Superóza 12R-chromatografie sa na porovnanie vložia na 8 % SDS-polyakrylamidový gél. Priebeh na géli u prečisteného ECE-1 s fosforamidónom spracovaných buniek ukazuje v porovnaní s neošetrenými bunkami prídavné pásy pri 250 000 Dalton. Pri nanesení proteínov s redukčným činidlom ditiotreitolom (DDT), ukazuje sa v porovnaní prídavný pás pri 125 000 Dalton.
Príklad 3
Test ECE-l-aktivity pomocou HPLC
Premena Big-endotelínu-1 na endotelín-1 pomocou endotelín konvertujúceho enzýmu (ECE-1)
1 roztoku enzýmu získaného podľa príkladu 4 sa zmieša s 21 1 50 mM Tris, 50 mM imidazolu, 250 mM NaCl pH 7,4 pufra a 2,5 1 ľudského Big-endotelínu (2 mg/ml v 0,1 % kyseline octovej vo vode). Po dvoch hodinách sa reakcia za účelom ukončí 72 1 odstredia a . vysokotlakovej
0,5 % kyseliny supernatant sa chromatografie analýzy vytvoreného endotelínu trifluóroctovej. Vzorky sa identifikuje analýzou pomocou s reverznou fázou (RP-HPLC), ako je popísané (J. Takada a spol., Biochem. Biophys. Res. Comm. 176, 860 (1991), K.
Ohnaka a spol., Biochem. Biophys. Res. Comm. 168, 1128 (1990) ) a kvantifikuje sa porovnaním s endotelínovými štandardami pomocou UV-detekcie (205 nm)
Enzýmová aktivita sa potom vypočíta ako aktivita
106 M endotelín ECE [j] = min.
Po tomto spôsobe sa stanoví ECE-aktivita spracovania FBHE-buniek k rôznym stupňom čistenia. Súčasne sa stanoví množstvo proteínu metódou podľa Bradforda (Anál. Biochem. 72, 248 (1976)).
Príklad 4
Čistenie ECE-1 z buniek hovädzieho endotelínu, FBHE
a) Získanie membrán, trypsinizácia cudzieho proteínu ml FBHE-bunkových peliet (podľa príkladu 1) sa digeruje v 25 ml PBS-pufra a 15 min. uzatvorí v ultrazvukovom kúpeli počas chladenia ľadom. Bunkové zlomky sa odstránia odstredením pri 10000 g, 20 min.. Supernatant sa zmieša počas miešania s 3,6 g trypsínu a 1,5 h mieša pri izbovej teplote. Vzorky sa odstred'ujú 1 h pri 100000 g a vo zvyšku sa nachádzajúce membrány sa suspendujú s 25 ml 100 mM Tris-pufra, pH 8,0.
b) Solubilizácia ECE-1 ml membránovej suspenzie sa upraví na 0,5 mM diizopropylfluórfosfátu a potom 0,5 % Tritónu X-100R a uchovávajú sa cez noc v ľadovom kúpeli.
c) Mono-QR-chromatografia
Mono QR-FPLC-stípec, HR 16/10, fa Pharmacia sa ekvilibruje s 50 mM Tris-pufra, pH 8,0; 0,05 % Tritónu X 100R (A pufor).
Po nanesení solubilizátu sa 30 min. premýva A-pufrom a potom lineárnymi gradientami počas 100 min. až do pufra B (pufor A + 1 M NaCI). Odoberie sa 30 frakcií po 100 ml. Obsah proteínu vo vzorkách sa stanoví Bradfordovou metódou, ECE-1 aktivita ako v príklade 1.
Obidve frakcie s najvyššími špecifickými aktivitami sa spoja.
d) Gélová filtrácia
Spojené Mono QR-eluáty podľa 4c) sa koncentrujú cez 30 KDa-Centricon-membránu (fa Amicon) na 500 1.
Stĺpec Superózy 12R, HR 10/30 (fy Pharmacia) sa ekvilibruje s 20 mM Na-fosfátového pufra, pH 7,4, 250 mM NaCl, 0,05 % Tritónu X 100 a koncentrované vzorky sa nanesú. Pri prietoku 0,5 ml sa chromatografuj e ekvilibračným pufrom a odoberajú sa frakcie 0,5 ml.
Stanovenie špecifickej aktivity frakcií sa uskutoční ako v 4c). Frakcia s najvyššou špecifickou aktivitou je uvedená pod
e); eluuje pri asi 250 000 Dalton, kalibrovaného na štandardné proteíny za rovnakých chromatografických podmienok.
e) Výsledky
Stupeň čistenia proteín (mg) špec. aktivita ( j/mg)
membrány 87 410
solubilizát 87 360
Mono Q-eluát 6,6 3760
Superóza 12-eluát 0,35 15100
Príklad 5
SDS-gél-analýza prečisteného ECE-1 z FBHE-buniek
Podľa príkladu 4 prečistený ECE-1 sa analyzuje na 8 %
SDS-gélu podľa Lämmliho (Náture 227, 680 (1979)) za neredukujúcich a redukujúcich podmienok (+DTT). ECE-1 má v neredukovanom stave molekulovú hmotnosť 250 000 Dalton a rozpadá sa po redukcii na široký pás okolo 125 000 Dalton.
Príklad 6
Deglykozylácia ECE-1
1 podľa príkladu 4 prečisteného ECE-l-roztoku sa upraví 10 % SDS-roztokom na obsah 0,25 %-SDS. Vzorky sa inkubujú 20 min. pri izbovej teplote a upravia na 1 % Tritónu X-100. Po 20 min. pri izbovej teplote sa pridá 5 1 250 mM
Na-fosfátového pufra, pH 7,4. Potom sa pridá 0,25 1 PNGasy a pridá sa 0,5 g Endo F. Vzorky sa inkubujú pri 37 °C 8 h. Potom sa opáč pridajú rovnaké množstvá enzýmu a inkubuje sa ďalších 8 hodín pri 37 °C. Potom sa vzorky koncentrujú na 50 a analyzujú v 4-12 % SDS-géli.
Výsledky:
V redukovanom stave sa zmení zjavná molekulová hmotností z 125 000 Dalton odštiepením cukrového zvyšku zo zmesí PNasy F/Endo F na asi 82 000 Dalton.
Príklad 7
Parciálna sekvencia ECE-1 z buniek hovädzieho endotelu.
x 25 g podl'a príkladu 4 získaného ECE-1-roztoku sa preparatívne nanesie na 4-12 % SDS-polyakrylamid-gradientové géli. Po obvyklom vyfarbení pomocou Coomassie blue sa gél odfarbí a zavodní po 4 x 40 minút v čistej vode. Pri 250 kDa digerujú sa 200 1 100 mM trypsínu sa inkubujú cez Zvyšok sa znova inkubuje teplote v 200 1 dosucha v speed-vacvyfarbené pásy sa vyrežú skalpelom a ΝΗ4ΗΟΟβ-roztoku. Po prídavku 0,5 g noc, supernatant sa potom odloží, s 0,6 g trypsínu 5 h pri izbovej
NH4HCO3-pufra. Potom sa vzorky odparia zahustíovači. Zvyšok sa vyberie do 40 1 vody a mieša sa zo 4
40 mM roztoku ditiotreitolu. Potom sa pridajú pri 37 °C 4 1 100 mM roztoku jódacetamidu. Po 2 hodinách sa vzorka odparí dosucha.
Vzniknuté peptidy sa oddelia cez 1 mm x 15 cm HPLC-stípec s reverznou fázou v lineárnych 3-hodinových gradientoch 0,5 % kyseliny frifluóroctovej vo vode po 0,5 % kyselinu trifluóroctovú v 90 % acetonitrile. UV-aktívne frakcie sa spoja a stanoví sa primárna sekvencia na sekvenátore v plynnej fáze.
Výsledky:
Boli stanovené nasledujúce parciálne sekvencie:
SEQ ID NO: 1:
Xaa-Xaa-Pro-Asn-Ala-Leu-Asn-Phe-Gly-Gly-Ile-Gly-ValVa1-Va1 —G1y-His-Glu-Leu-Thr-His-Ala-Phe...
SEQ ID NO: 2:
Xaa-Tyr-Xaa-Lys-Xaa-Gly-Asn-Leu-Arg-Pro
SEQ ID NO: 3:
Xaa-I1e-Ala-Xaa-Glu-Thr-Glu-Leu-Glu-Ile. . .
(íle) (íle)
SEQ ID NO: 4:
Xaa-Pro-Glu-Phe-Leu-Leu-Glu-Gly-Leu-11e-Thr-Asp-Pro . . .
SEQ ID NO: 5:
Xaa-(Gln)-(Ala)-(Glu)-Asn-Val-Ile-Gln-Val-Xaa-Gln. . .
SEQ ID NO: 6:
Val-Glu-I1e-Val-Phe-Pro-Ala-Gly-Ile-Leu-Gln-Ala-Pro-(Phe)-Tyr-Thr (Thr)
V zátvorkách uvedené aminokyseliny neboli identifikované s absolútnou istotou.
SEQ ID NO: 1 dokladá, že u ECE-1 ide o nový proteín z rodiny metaloproteáz, pretože s porovnaní so sekvenciami metaléndopeptidázami NEP 24.11 a termolyzínu vykazuje významné homológie 72 % a 40 %.
Príklad 8
Výroba cDNA-sekvencie, ktorá kóduje endotelín konvertujúci enzým
a) Izolácia RNA a výroba cDNA-banky
Celková RNA z FBH-buniek, ktoré podľa príkladu 1 boli stimulované s fosforamidónom, alebo z HeLa-buniek, ktoré podľa príkladu 1 boli stimulované s fosforamidónom, boli získané rozkladom v guanídiumtiokyanátu. Pritom sa pracovalo s materiálmi a podľa návodu RNA Isolation Kit firmy Stratagene, La Jolla, Ca, USA (katalógové číslo 200345) .
Polyadenylovaná messenger RNA bola selektovaná z celkovej RNA z FBHE-buniek oligo(dľ)-afinitnou separáciou. Tento spôsob bol uskutočnený s materiálmi a podľa návodu (PollyATract mRNA Isolation System firmy Promega, Madison, WI, USA (katalógové číslo Z5200). Z polyadenylovanej messenger podľa návodu ZAP-cDNA Sythesis
Jolla, CA, USA (katalógové číslo 200400) cDNA, ktorá potom bola s materiálmi a podľa
RNA bola Kit firmy s materiálmi a Stratagene, La syntetizovaná návodu Uni-ZAP XR GigapackII Cloning Kit firmy Stratagene, La Jolla, CA, USA (katalógové číslo 237611) umiestnená do lambda fágov.
b) Výroba oligonukleotidových sond pre RCE-PCR
Pri klonovaní cDNA-fragmentov pomocou polymerizačnej reťazovej reakcie (PCR, viď Molecular Cloning, 2. vyd. (1989), Sambrook J. a spol., CSH-Press, str. 14.1 a ďalej) sa vychádzalo z peptidov uvedených v príklade 7 zo SEQ ID NO: 1 a NO: 6.
Na základe genetického kódu sa nechá zo SEQ ID NO: 1, poloha 16 až 22 odvodiť oligonukleotidová zmes s nukleokyselinovou sekvenciou SEQ ID NO: 7:
5'-GGSCAYGARYTNACNCAYGC-3'.
Rovnako je možné odvodiť zo SEQ ID NO: 6, poloha 2 až 8 oligonukleotidovú zmes s SEQ ID NO: 8:
5’-GARATYGTSTTYCCZGCZGG-3' ako i zo SEQ ID NO: 6, polohy 9 až 16 oligonukleotidová zmes S SEQ ID NO: 9:
5'-ATYCTSCAGGCYCCYTTYTAYAC-3'
SEQ ID NO: 7 až NO: 9 pritom zodpovedajú sekvencii kódujúceho DNA-reúazca. Z dôvodov degenerácie genetického kódu môže na rôznych polohách byť prítomných viacero nukleotidov. Tým sa získava pre SEQ ID NO: 7 až 9 až 512-násobná zmesová komplexností. Uvedené sekvencie sa syntetizujú ako oligonukleotidy.
Nasledujúce oligonukleotidy boli prídavné syntetizované ako 3' primér v RAČE-PCR:
5'-CGAGGGGGATGGTCGACGGAAGCGACCTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3';
ako i
A (z A-B-T18) (SEQ ID NO: 11):
5'-CGAGGGGGATGGTCGACGG-3';
ako i
B (z A-B-T18) (SEQ ID NO: 12):
5'-GATGGTCGACGGAAGCGACC-3' .
Syntézy sa uskutočňujú s DNA-syntetizérom Applied Biosystems Typ 360A. Oligonukleotidy sa prečistia po odstránení chrániacich skupín elektroforeticky cez gél akrylamid/močovina.
c) Výroba DNA-templátov pre PCR g celkovej RNA alebo g Poly(A(+ -RNA) pod a) uvedených RNA-preparátov z fosforamidónstimulovaných FBHE buniek sa prevedú s 1 g oligonukleotidov A-B-T18 (SEQ ID NO: 10) a pomocou enzýmu reverznej transkriptázy, do jednoreťazcovej DNA (1° cDNA). Pracuje sa pritom s materiálmi a podľa návodu SuperScript Preamplification System firmy Gibco BRL, Eggenstein, Nemecko (katalógové číslo 8089SA). Po ukončení reakcie sa produkty syntézy pomocou Geneclean II Kitu firmy BIO 101, La Jolla, CA, USA, vyčistia od menších molekúl a prebytočných oligonukleotidov.
d) PCR a klonovanie časti cDNA-sekvencie
Polymerázová reťazová reakcia sa uskutoční podľa známych protokolov (viď Molecular Cloning, 2. vydanie (1989), Sambrook J. a spol., CHS-Press, str. 14.1 a ďalší). Na to. sa použije princíp preloženého priméru podľa Frohmana M. A. a spol., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002) a modifikovaný podľa Fritza J. D. a spol. (Nucl. Acids Res. (1991) 19, 3747) .
Jednotlivo sa 1° cDNA z c) amplifikuje vždy s 20 pmol oligonukleotidu SEQ ID NO: 8 a A (z A-B-T18). Podmienky pritom boli: ľ 95 °C, 2' 55 °C, 3' 72 °C pre 35 cyklov.
PCR-produkty boli elektroforeticky rozdelené na 1,2 % LMP-agaróza/TBE-gélu.
Z gélu boli vyrezané po celej dĺžke škvrny asi 10 gélových lístkov a tieto boli roztavené ako separátne frakcie s DNA-fragmentárni stúpajúcej molekulovej hmotnosti.
Podiely týchto frakcií potom boli oddelene použité v dvoch PCR vždy s 20 pmol oligonukleotidu SEQ ID NO: 9 a B (z A-B-T18). Podiel agarózy pritom neprekročí 1/10 objemu PCR-vsádzky. Reakčné podmienky: 1' 95 °C, 2' 50 °C, 3' 72 °C pre 35 cyklov.
Elektroforetické delenie amplifikačných produktov tejto frakcie umožňuje rozpoznať významnú redukciu komplexného spektra produktu prvej PCR k definovanému pásu dĺžky asi 1000 bp po druhej PCR.
Takýmto spôsobom selektovaný PCR-produkt sa eluuje štandardnými metódami. Identita lOOObp veľkého pásu ako fragment hovädzí endotelín konvertujúci enzým cDNA sa najskôr preskúša ďalšou, treťou PCR-amplifikáciou s oligonukleotidami SEQ ID NO: 7 a 8 (z A-B-T18). Produkt tejto PCR bol pás veľkosti asi 950 bp.
Po subklonovaní 1000 bp veľkých pásov z druhej PCR-reakcie do vektora pCR II (TA Cloning Kit, Invitrogen Corp., San Giego, kat.č. K2000-01) a pomnoženie plazmidu v E.coli DH5alfa poskytne sekvenčná analýza klonu otvorený čítací rámec 189 aminokyselín SEQ ID NO: 13, NO:14. V rovnakom čítacom rámci sa tiež nachádzajú sekvencie peptidov SEQ ID NO: 1, NO:2 a NO:4, čím je jednoznačne definovaná identita cDNA fragmentov.
e) Klonovanie hovädzej cDNA pre endotelín konvertujúci enzým
Podľa protokolu uvedeného v príklade la) sa generuje cDNA-knižnica so štatistickou zmesou primérov v stupni syntézy prvého reťazca. Priméry boli syntetizované ako sekvencie:
5’-GAGAGAGAGTCGACGGTACCN7; SEQ ID NO: 15.
Odlišne od uvedeného protokolu cDNA-syntézy sa dvojreťazcová cDNA frakcionuje cez 2 ml stĺpec S-1000 Sephakrylu (kvalita Superfine; Pharmacia, Freiburg; kat. číslo 17-0476-01). Frakcie s cDNA-fragmentárni veľkosti aspoň 1 kb sa koncentrujú známym spôsobom alkoholovým zrážaním a ďalej spracovávajú podľa návodu v cDNA-Synthese Kitu, pričom sa cDNA-preparáty následne štiepia s reštrikčnou endonukleázou Sali namiesto Xhol a integrujú sa do lambda vektoru.
x 106 klonov banky hybridizovaných s DNA-sondou, ktorá bola vyrobená s oligonukleotidmi
5’-CGGCCCTGGTGGAAGAACTCG-3' (SEQ ID NO: 16) a 5’-TGCGGACGGAACACCAGACCT-3' (SEQ ID NO: 17) z parciálnych hovädzích cDNA (SEQ ID NO: 13, poloha 136 až 156, príp. 391 až 412, po transfere na nylonových membránach. DNA sondy boli značené v polymerizačnej reťazovej reakcii (PCR) v prítomnosti digoxigenín-dUTP, ako je popísané v príklade lf). Hybridizácia bola uskutočnená v prísnych podmienkach (viď príklad lf), pričom posledný premývací krok bol uskutočnený po uskutočnenej hybridizácii v 0,1 x SSC, 60 °C a potom bol uskutočnený imunologický dôkaz nadviazanej DNA-sondy. Sekvenovanie zvolených klonov poskytlo hovädziu cDNA-sekvenciu C60, SEQ ID NO: 18, s otvoreným čítacím rámcom, SEQ ID NO: 19.
Potom bolo za rovnakých podmienok hybridizovaných 2 x 106 klonov banky s DNA sondou, ktorá bola vyrobená s oligonukleotidmi
5'-GCCAGCGCCGTCTCAAAGTCCAG-3' (SEQ ID NO: 20) a
5'-TGGGGGACCTTCAGCAACCTCT-3' (SEQ ID NO: 21) z cDNA-klonu C60, SEQ ID NO: 18, poloha 500 až 522, príp. 14 až 35, ako je popísané vyššie, za rovnakých podmienok. Sekvenovanie zvolených klonov poskytlo hovädziu cDNA-sekvenciu SEQ ID NO: 22 s otvoreným čítacím rámcom 708 aminokyselín (SEQ ID NO: 23).
x 108 plakotvorných jednotiek obchodne dostupnej cDNA banky hovädzích pľúc v lambda gtll (Clontech Laboratories Inc.; 4030 Fabian Way; Palo Alto CA 94303-4607, USA; katalógové číslo BL1006b) sa po vyzrážaní s 10 % polyetylénglykolom 6000, IM NaCl koncentrujú v 100 1 dvakrát destilovanej vody resuspendujú a 5 min. sa zahrievajú na 70 °C. 5 1 tohto lyzátu sa použije v 50 1 štandardnej PCR reakcii (príklad 8d) s primármi gtll fwd a
5'-GGTGCTTGATGATGGCTTGGTTGT-3' (SEQ ID NO: 26).
Primér gtll fwd zodpovedá polohám 2979-3003 -galaktozidového génu (génová banka: ECLACZ) a leží v klonovacom vektore lambda gtll bezprostredne pred jediným EcoRI-integračným miestom, ktoré bolo použité pri konštrukcii banky (Young R. A. a Davis R. W. (1985) Genetic Engineering, vyd. Setlow J. a Hollander
A., Plénum Press, N. Y. 29-41. Primér SEQ ID NO: 26 zodpovedá polohe 280-303 SEQ ID NO: 22.
Vzniknuté PCR-fragmenty sa sekvenujú po subklonovani v plazmidovom vektore pUC18 (Yanisch-Perron D., Vieira J. a Messing J. (1985) Gene 33, 103-119) (SEQ ID NO: 28).
Tieto sekvencie sa prekrývajú s nukleotidmi 175-324 SEQ ID NO: 22 v polohách 1-150 a predlžujú sa o 14 nukleotidov v smere 5 1 .
f) Klonovanie ľudskej cDNA pre endotelín konvertujúci enzým
Pretože endotelín-1 bol dokázaný v ľudskej placente, bolo prijaté, že sa endotelín konvertujúci enzým exprimuje taktiež v plazme. Bola preto screenovaná s použitím značenej hovädzej-cDNA-sondy gt-11 placentová cDNA banka. Na výrobu digoxigenín-dUTP značenej hovädzej-cDNA-sondy sa v PCR reakcii (viď Molecular Cloning, 2. vydanie (1989), Sambrook J. a spol., CSH-Press, str. 14.1 a ďalší) použije ako templát 1 ng (1 ng/ml) parciálnej hovädzej-cDNA-sekvencie (SEQ ID NO: 13). Sense-oligonukleotid (SEQ ID NO: 16) zahŕňa nukleotidy od polohy 136 do 156 v SEQ ID NO: 13, antisense-oligonukleotid (SEQ ID NO: 17) polohy 392 až 412 v SEQ ID NO: 13. V DNA Therma Cycler (Perkin Elmer) prebehnú 35-krát nasledujúce cykly: 2 min. 94 °C, 2 min. 60 °C a 3 min. 72 °C. Značená cDNA-sonda sa potom prečistí cez agarózový gél a denaturuje sa povarením. Použitím menej prísnych podmienok sa touto sondou screenuje asi 650 000 klonov ľudskej lambda-gtll cDNA-banky (Clontech, HL 1008b). Hybridizácia filtrových odťahov sa sondou uskutočňuje cez noc v 5 x SSC, 2 % blokovacieho činidla (Boehringer Mannheim; č.
1096176), 0,1% Filtre sa potom
o.
SDS pri 60
Na-laurylsarkozín, 0,02 premývajú 20 min. pri 60 °C s 0,5 x SSC, 0,1 % SDS. Ďalšie vyvíjanie filtrov na identifikáciu nadviazaných DIG-sond sa uskutočňuje podľa protokolu Boehringer Mannheim (DIG - detekčný kit pre nukleové kyseliny, č. 1175041) .
Izolujú sa klony s cDNA-sekvenciou uvedenou v SEQ ID NO: 24. Nukleotidy v polohe 1 až polohe 2109 cDNA-sekvencie so SEQ ID NO: 24, kódujú v SEQ ID NO: 25 uvedenej aminokyselinovej sekvencie. Aminokyselinová sekvencia zodpovedá najväčšej časti primárnej sekvencii endotelín . konvertujúceho enzýmu, pretože peptidy SEQ ID NO: 1 až SEQ ID NO: 6 z trypsinpeptidového sekvenovania izolovaného endotelín konvertujúceho enzýmu je možné v sekvencii opäť. nájsť. Taktiež metaloproteináza-konsenzussekvencie HEXXH môže byť taktiež ako HELTH identifikovaná na polohách 540 až 544 v aminokyselinovej sekvencii SEQ ID NO: 25.
Z 3 g placenty poly A(+) RNA sa vyrobí ako je popísané v príklade 8 e) s oligonukleotidom
5' -gagagagagagagagagagaactagtctcgagccaagcaggccaccagtcctg-3' (SEQ ID NO: cDNA-knižnica. 53 SEQ ID NO;
31) ako prvý reťazec cDNA syntézny primér Nukleotidy 32 až 53 zodpovedajú polohám 32 až 24. cDNA-preparát sa integruje ako je popísané
Uni-ZAP XR. Výsledné 4 x 105 a 5 x 108 plakotvorných v príklade 8 e), nasadí do v príklade 8 a) do lambda-vektoru nezávislé klony sa amplifikujú jednotiek sa, ako je popísané
100 1 PCR-reakcie. Primér C leží v lambda-vektore v Bluescript
SK(-)-časti, pol. 881-904, Sequenzfile Genbank: ARBLSKM.
PCR-reakcie o.
sa teplote 65 °C. 1 1
1 PCR-reakčnej hybridizačnej teplote oligonukleotidy D a uskutočňujú 40 cyklov pri hybridizačnej reakčného produktu sa vloží do čerstvých vsádzky a uskutočňuje sa 40 cyklov pri ’C. Ako primér boli., použité
5CCTGCCGCCAGAAGTACCACCAACA-3' (SEQ ID NO: 32)
Primér D leží v Bluescript SK(-)-časti lambda Uni-ZAP XR-vektore (pol. 857-880, Sequenzfile Genbank: ARBLSKM), primérová SEQ ID NO: 32 zodpovedá polohám 11-35 v SEQ ID NO: 24. Reakčný produkt sa subklonuje v plazmidovom vektore pUC18 ako je popísané vyššie. Vybrané klony sa sekvenujú.
Ako sekvencia sa získa nový 5'-podiel ľudskej ECE cDNA (SEQ ID NO: 33, ktorého 3'-terminálna oblasť (pol. 188-222) sa prekrývajú s polohami 1-35 SEQ ID NO: 24. Predlžuje sa o 187 nukleotidov v 5'-smere a poskytuje celkovú ľudskú ECE-sekvenciu SEQ ID NO: 35, ktorá kóduje otvorený čítací rámec 753 aminokyselín (SEQ ID NO: 36).
Príklad 9
Výroba rekombinantného ECE v bunkách cicavcov
1. Konštrukcia expresného vektora pre membránový ľudský ECE
Na expresiu úplného ľudského ECE sa zavedie cDNA-sekvencia (SEQ ID NO: 35) od nukleotidu 29 do 2720 s vhodnými adaptormi do expresného vektora pcDNA3neo fy. Invitrogen (3985 B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA 92121, USA; produkt č. V790-20) medzi miesta Κρη I a Xba I. ECE-sekvencia nesie svoje vlastné translačné štart- a stopsekvencie ako aj konsenzus-Kozak-sekvenciu (Kozák M. (1989), J. Celí Biol. 108, 229-241) . Transkripcia ECE-messenger RNA prebieha v tomto víre pod kontrolou silného cytomegalievírového promótora. Selekcia transfikovaných buniek sa uskutočňuje cez gén neomycínovej rezistencie, ležiacej v plazmide, ktorý umožňuje rast iba G418-rezistentných kolónií.
2. Konštrukcia expresného systému pre secernovaný ľudský ECE
a) Kionovanie sa uskutočňuje v obchodne prístupnom eukaryotickom expresnom vektore pcDNA3neo fy. Invitrogen (3985 Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA, 92121, USA,-, produkt V790-20. Preto sa vektor najskôr štiepi s reštrikčnými enzýmami Eco RI a Eco RV.
b) Potom sa z cDNA ľudského ECE (SEQ ID NO: 35) získa fragment nukleovej kyseliny poloha 241 - poloha 2396 polymerázovou reťazovou reakciou s vhodnými oligonukleotidprimérami. Podľa voľby sekvencie 5' priméru sa zmení sekvencia nukleovej kyseliny medzi polohami 241 a 245 (SEQ ID NO: 35) v slede zásad 5'-ACGCG-3'. Za zahrnutie polohy 246 sa týmto krokom generuje rozpoznávacia sekvencia pre reštrikčnú endonukleázu Mlu I. Vzniknutý ECE-fragment sa štiepi v ďalšom kroku s Mlu I.
c) Ako ďalší fragment sa vyrobí z dvoch syntetických oligonukleotidov (reťazec/protireťazec) kódujúca sekvencia ľudského tkaninového plazminogénového aktivátora (t-PA) medzi nukleotidom 74 a nukleotidom 176 publikovanej sekvencie (D. Collen, Náture 301, 214-221 (1983)). Prídavné k uvedenej sekvencií boli syntetické oligonukleotidy opatrené adaptormi, ktoré vedú k 5' Eco RI a 3 ' Mlu I presahu.
Ligácia fragmentov generovaných pod b) a c) cez spoločné Mlu I namiesto reštrikčného štiepenia vedie k fúzii čítacieho rastra signálneho peptidu ľudského t-PA génu a extracelulárnej domény ľudského ECE génu. Ligácia tohto fúzneho proteínu do Eco RI a Eco RV štiepeného pcDNA3 vektora z a) vedie k expresnému systému pre secernovaný ľudský ECE.
3. Expresia v bunkách cicavcov
DNA expresné vektory boli transfikované s lipoefektamínom (fa Gibco; Life Technologies GmbH; Dieselstra e 5, 76334 Eggenstein, Nemecko; č. 530-8324SA) do buniek cicavcov. Použité bunky boli CHO-K1 (ATCC CCL 61); BHK-21 (ATCC CCL 10); 293 (ATCC CRL 1573 a C127I (ATCC CRL 1616) .
Vždy 2 x 105 buniek sa nasaje v 3 ml rastového média na jamku 6-jamkovej kultivačnej platne. Ďalší deň sa uskutoční transfekcia. Na tento účel sa bunky raz premyjú PBS. Transfekcia lipofektínamínom sa uskutoční podľa pokynov výrobcu, firmy Gibco (Focus (1993), 15 č. 3, 73-78). Každá jamka obsahuje 1 g DNA a 6 1 lipofektamínu, ktoré boli uvedené do spolu 1000 1 séra neobsahujúceho bunkové kultivačné médium. Po 6-hodinovej inkubácii pri 37 °C sa bunky premyjú raz s PBS a inkubujú v normálnom rastovom médiu. Ďalší deň sa bunky z jednej jamky po oddelení trypsínom rozdelia na 1, 5 alebo 10 Petriho misiek (priemer 10 cm). Za deň sa transfektované bunky selektujú spracovaním s G418 (fa Gibco; kat. č. 066-01811Y; obchodné označenie: Geneticín), t. j. rastové médium sa vymení za médium, ktoré obsahuje 1,2 mg/ml G418. Po 7 až 10 dňoch boli v Petriho miskách pozorované kolónie G418-rezistentných buniek. Tieto boli izolované metódou clonin-cylinder (DNA-cloning Vol. III; vyd. D. M. Glover, IRL press, 1985; str. 220). Izolované kolónie boli umiestnené vždy do jednej jamky 24-jamkovej misky s asi 1,5 ml rastového média (vrátane G418). Pri dosiahnutí konfluencie boli bunky tryptinizáciou prevedené do väčších kultivačných nádob.
a) Membránový ECE
Bunky, ktoré exprimujú membránový ECE, boli skúšané na prítomnosť. ECE po rozbití buniek a frakcionácii ako je popísané v príklade la 2. (Fosforamidónová stimulácia nie je uskutočnená). Špecifická aktivita analyzovaných kolónií predstavuje na membránovej báze až 1550 j/mg proteínu. Membrány kolónie 38 boli ďalej spracovávané. Boli pritom získané nasledujúce výsledky:
Stupeň čistenia špec. aktivita ( j/mg proteínu) membrány solubilizát mono-Q-chromatografia
1550
2010
12000
b) Secernovaný ECE
Bunky, ktoré exprimujú ECE bez membránovej kotvy a secernujú ich do bunkového kultivačného média, boli testované na prítomnosť rekombinantného ECE, pričom bol skúšaný bunkový supernatant konfluentných buniek na ECE-aktivitu. Bunkový supernatant bol po 2 dňoch kultivácie odobraný a odstreďovaním pri 1000 g zbavený bunkových zlomkov. 6 ml supernatantu bolo potom koncentrovaných pomocou zariadenia Centricon 10.000 (fy
Amicon, W. R. Grace + Co., Danver, Ma. 01923, USA; produkt č. 4206) a odstredením pri 3220 g (asi 30 min.). Vytekajúca kvapalina s nízkomolekulovými substanciami bola odobraná (Centricon-Eluat). Centricon bol premytý raz s 1 ml PBS + 10 mM Tris + 150 mM NaCI; pH 7,5. Koncentrát bol vybratý do 300
Centricon-Eluates.
1 koncentrátu bolo použitých v ECE-teste ako je popísané v príklade 3.
Objemová aktivita secernovaného ECE predstavovala skúšané kolónie rekombinantných buniek až 10 jednotiek/ml bunkového kultivačného média.
Sekvenčný protokol (1) Všeobecná informácia (i) Prihlasovateľ (A) Meno: BASF Aktiengesellschaft (B) Ulica: Carl-Bosch-Strasse 38 (C) Mesto: Ludwigshafen (E) Štát: Spolková republika Nemecko (F) Poštové smerovacie číslo: D-67056 (G) Telefón: 0621/6048526 (H) Telefax: 0621/6043123 (I) Telex: 1762175170 (ii) Názov prihlášky: Endotelín konvertujúci enzým (ECE) (iii) Počet sekvencií: 25 (iv) Počítačovo čítacia forma:
(A) Nosič dát: floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Pracovný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version 1.25 (EPA) (2) Informácia o SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 23 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (iii) Hypotetická: nie (v) Typ fragmentu: vnútorný (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (B) Typ tkaniva: endoteliálne (H) Bunková línia: bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 1:
Xaa. Xaa Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly íle Gly Val Val Val Gly 1 5 10- 15
His Glu Leu Thr His Ala Phe 20 (2) Informácia o SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 10 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnútorný (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (B) Typ tkaniva: endoteliálne (H) Bunková línia: bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 2:
Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Gly Asn Leu Arg Pro 1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 10 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnútorný (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (H) Bunková línia: bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: modifikované miesto (B) Poloha: 8 (D) Zvláštne údaj e:/pozn.=Xaa = Leu alebo íle (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: modifikované miesto (B) Poloha.· 7 (D) Zvláštne údaje:/pozn.=Xaa = Leu alebo íle (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 3:
Xaa íle Ala Xaa Glu Thr Xaa Xaa Glu íle .1 5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 13 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnútorný (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (H) Bunková línia.· bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 4:
Xaa Pro Glu Phe Leu Leu Glu Gly Leu íle Thr Ásp Pro 1 -5 10 (2) Informácia o SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 11 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnútorný (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (H) Bunková línia: bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 5:
Xáa Gin Ala Glu Asn Val íle Gin Val Xaa Gin 15 10 (2) Informácia o SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 16 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu: vnútorný (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (H) Bunková línia: bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: modifikované miesto (B) Poloha: 7 (D) Zvláštne údaj e:/pozn.=Xaa = Ala alebo Thr (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 6:
Val Glu íle Val Phe Pro Xaa Gly íle Leu Gin Ala Pro Phe lýr Thr 1 5 10 15 (2) Informácia o SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 7:
GGSCAYGARY TNACNCAYGC (2) Informácia o SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 8:
GARATYGTST TYCCYGCYGG (2) Informácia o SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 23 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 9:
ATYCTSCAGG CYCCYTTYTA YAC (2) Informácia o SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 45 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 10:
CGAGGGGGAT GGTCGACGGA AGCGACCTTT ΤΤΤΤΤΊΤΤΤΤ TTTTT (2) Informácia o SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 19 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 11:
CGAGGGGGAT GGTCGACGG (2) Informácia o SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 20 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 12:
GA.'PGGTCGAC GGAAGCGACC (2) Informácia o SEQ ID NO: 13:
(i)'Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 570 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (B) Bunková línia: bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca (ix) Znaky:
(A) Meno/kíúč: CDS (B) Poloha: 1..567
ATC CTG íle Leu 1 (xi) CAG Gin Popis sekvenci GCG CCA TTC TAC .e: SEQ ID NO: 13: AAC Asn 48
ACC Thr CGC Arg TCT Ser 10 TCA Ser CCC Pro AAT GCC TTA Leu 15
Ala Pro 5 Phe Tyr Asn Ala
TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC GTG GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT 96
Phe Gly Gly íle Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe
20 25 30
GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC GAC AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGC- 144
Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp
35 40 45
TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG GCG TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG 192
Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met
50 55 60
GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC 240
Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly
65 70 75 80
CGG CAC ACC CTC GGC GAA. AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG 288
Arg His Thr Leu Gly Glu Asn íle Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala
85. 90 95
GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC TGG GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG 336
Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin
100 105 110
ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC ACC AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG AGT 384
Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser
115 120 125
TTT GCA CAG GTC TGG TGT TCC GTC CGC ACC CCC GAG AGT TCG CAC GAA 432
Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu
130 135 140
GGT CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCC CGC TTC CGG GTC ATC GGC 480
Gly Leu íle Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val íle Gly
145 150 155 160
TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC TCG GAA CAC TTC CAC TGC CCG CCC 528
Ser íle Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe His Cvs Prn Prn
GGC TCA CCC ATG AAC CCG CAT CAC AAG TGT GAA GTC TGG TGA Glv Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp
180 185
570 (2) Informácia o SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 189 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická)
(xi) i Popis sekvencie: SEQ ID NO: 14 :
íle 1 Leu Gin Ala Pro Phe Tyr 5 Thr Arg Ser 10 Ser Pro Asn Ala Leu Asn 15
Phe Gly Gly íle 20 Gly Val Val Val Gly His 25 Glu Leu Thr His Ala Phe 30
Asp Asp Gin Gly 35 Arg Glu Tyr Asp 40 Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp 45
Trp Lys 50 Asn Ser Ser Val Glu 55 Ala Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met 60
Val 65 Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr 70 Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly 75 . 80
Arg His Thr Leu Gly Glu Asn 85 íle Ala Asp 90 Asn Gly Gly Leu Lys Ala 95
Ala Tyr Arg Ala 100 Tyr Gin Asn Trp Val Lys 105 Lys Asn Gly Ala- Glu Gin 110
Thr Leu Pro Thr 115 Leu Gly Leu Thr 120 Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser 125
Phe Ala 130 Gin Val Trp Cys Ser 135 Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu 14 0
Gly 145 Leu íle Thr Asp Pro His 150 Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val íle Gly 155 160
Ser íle Ser Asn Ser Lys Glu 165 Phe Ser Glu 170 His Phe His Cys Pro Pro 175
Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp 180 185 · (2) Informácia o SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 27 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Hypotetická: áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 15:
GAGAGAGAGT CGACGGTACC NNNNNNN 27 (2) Informácia o SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 21 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 16:
CGGCCCTGGT GGAAGAACTC G 21 (2) Informácia o SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) (B) (C) (D)
DÍžka: 21 párov báz Typ: nukleová kyselina Reťazec: jeden Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Antisense: áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 17:
TGCQGACGGA ACACCAGACC T 21 (2) Informácia o SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 1703 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (B) Bunková línia: bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca (ix) Znaky:
(A) Meno/klúč: CDS (B) Poloha: 2..1703 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 18:
T GGC CAC TCG CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC 4 6
Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe -Ser Asn Leu Trp Glu His Asn
5 10 15
CAA Gin GCC ATC ATC AAG CAC His CTC CTT GAA AAC TCC ACG GCC Ala AGC Ser GTG Val 30 AGC Ser 94
Ala íle íle Lys 20 Leu Leu Glu Asn 25 Ser Thr
GAG GCA GAG AGG AAG GAC CAG GAG TAC TAC CGA GCC TGC ATG AAC GAA 142
Glu Ala Glu Arg Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu
35 40 45
ACC AGG ATT GAG GAG CTC AAG GCC AAA CCC CTG ATG GAG CTC ATT GAG 190
Thr Arg íle Glu Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu íle Glu
50 55 60
AAG CTC GGC GGC TGG AAC ATC ACG GGG CCC TGG GAC AAG GAC AAC TTC 238
Lys Leu Gly Gly Trp Asn íle Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe
70 75
CAG GAC ACC CTG CAG . GTG GTC ACA TCC CAC TAC CAC ACC TCC CCC TTC 286
Gin Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe
80 85 90 95
TTC TCC GTC TAC GTC AGT GCC GAC TCC AAG AAT TCC AAC AGC AAC GTG 334
Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val
100 105 no
ATC CAA GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC TTA CCC TCA AGA GAT TAT TAC 382
íle Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr
115 120 125
CTG AAC AAA ACC GAG AAT GAG AAG GTG CTG ACG GGA TAC CTG AAC TAC 430
Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn yyr
130 135 140
ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGA GGA GGG GCC GAG GAC ACC ATC 478
Met Val Gin Leu Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Thr íle
145 150 155
CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC CTG GAC TTT GAG ACG GCG CTG GCC AAC 526
Arg Pro Gin Met Gin Gin íle Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn
160 165 170 175 .
ATC ACC ATC CCC CAG GAG AAG CGC CGG GAC GAG GAA CTC ATC TAC CAC 574
íle Thr íle Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu íle Tyr His
180 185 190
AAA GTG ACG GCG GCT GAG TTG CAG ACC TTG GCG CCC GCC ATC AAC TGG 622
Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala íle Asn Trp
195 200 205
CTG CCC TTC CTC AAC ACC ATC TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCA 670
Leu Pro F. ίθ Leu Asn Thr íle Phe Tyr Pro Val Glu íle Asn Glu Ser
210 215 220
GAG CCT ATT GTC ATC TAC GAC AAA GAA TAC CTG AGC AAG GTC TCC ACC 718
Glu Pro íle Val íle iyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr
225 230 235
CTC ATC AAC AGC ACA GAC AAA TGC CTG CTG AAC AAC TAC ATG ATC TGG 766
Leu íle Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met íle Trp
240 245 250 255
AAC CTG GTA CGG AAG ACG AGC TCC TTC CTC GAT CAG CGC TTC CAG GAC 814
Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp
260 265 270
GCC GAC GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAT GGG ACC AAG AAG ACG TGT 862
Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys
275 280 2 85
CTT CCC CGC TGG AAG TTT TGT GTG AGT GAT ACA GAG AAC ACC TTG GGC 910
Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly
290 295 300
TTC GCC Phe Ala 305 CTG Leu GGC Gly CCC ATG TŤČ Phe 310 GTC Val AAA GCG ACC TTC GCT GAG Phe Ala Glu 315 GAC Asp AGC Ser 958
Pro Met Lys Ala Thr
AAG AAC ATA GCC AGC GAG ATC ATC CTG GAG ATC AAG AAG GCG TTT GAA 1006
Lys Asn íle Ala Ser Glu íle íle Leu Glu íle Lys Lys Ala Phe Glu
320 325 330 335
GAG AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAA GAT ACT CGG AAA TCG 1054
Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser
340 345 350
GCC AAG GAA AAG GCG GAC GCG ATC TAC AAC ATG ATA GGC TAC CCC AAC 1102
Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala íle Tyr Asn Met íle Gly Tyr Pro Asn
355 360 365
TTT ATC ATG GAC CCC AAG GAG CTG GAC AAA GTG TTC AAT GAC TAC ACC llbt
Phe íle Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr
370 375 380
GCT GTG CCA GAC CTC TAC TTC GAG AAC GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC 119E
Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe
385 390 395
TCC TGG AGG GTC ACT GCC GAC CAG CTC CGG AAA GCG CCC AAC AGA GAT 124 e
Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp
400 405 410 415
CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC 129<
Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr
420 425 430
AAG AAC GAG ATC GTG TTT CCG GCC GGA ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC 1342
Lys Asn Glu íle Val Phe Pro Ala Gly íle Leu Gin Ala Pro Phe Tyr
435 440 445
ACC CGC TCT TCA CCC AA.T GCC TTA AAC TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC . 13 9(
Thr Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly íle Gly Val Val
450 455 460
GTG GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC 14 3 f
Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr
455 470 475
GAC AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGG TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG 14 8:
Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu
480 485 490 495
GCG TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT 153·
Ala Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr
500 505 510
AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC 158
Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn
515 520 525
ATC GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC 163
íle Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn
530 535 540
TGG GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC 167
Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu
545 550 555
ACC AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG A 170
Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu
560 565
(2) Informácia o SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 567 párov báz (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 19:
Gly 1 His Ser Arg Trp 5 Gly Thr Phe Ser Asn 10 Leu Trp Glu His Asn 15 Gin
Ala íle íle Lys 20 His Leu Leu Glu Asn 25 Ser Thr Ala Ser Val 30 Ser Glu
Ala Glu Arg 35 Lys Asp Gin Glu Tyr 40 Tyr Arg Ala Cys Met 45 Asn Glu Thr
Arg íle 50 Glu Glu Leu Lys Ala 55 Lys Pro Leu Met Glu 60 Leu íle Glu Lys
Leu 65 Gly Gly Trp Asn íle 70 Thr Gly Pro Trp Asp 75 Lys Asp Asn Phe Gin 80
Asp Thr Leu Gin Val 85 Val Thr Ser His iyr 90 His Thr Ser Pro Phe 95 Phe
Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val íle
100 *105 110
Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu 115 120 125
Asn Lys 130 Thr Glu Asn Glu Lys 135 Val Leu Thr Gly Tyr 140 Leu Asn iyr Met
Val 145 Gin Leu Gly Lys Leu 150 Leu Gly Gly Gly Ala 155 Glu Asp Thr íle Arg 160
Pro Gin Meo Gin Gin 165 íle Leu Asp Phe Glu 17 0 Thr Ala Leu Ala Asn 175 íle
Thr íle Pro Gin 180 Glu Lys Arg Arg Asp 185 Glu Glu Leu íle Tyr 190 His Lys
Val Thr Ala 195 Ala Glu Leu Gin Thr 200 Leu Ala Pro Ala íle 205 Asn Trp Leu
Pro Phe 210 Leu Asn Thr íle Phe 215 Tyr Pro Val Glu íle 220 Asn Glu Ser Glu
Pro 225 íle Val íle Tyr Asp 230 Lys Glu Tyr Leu Ser 235 Lys Val Ser Thr Leu 240
íle Asn Ser Thr Asp 245 Lys Cys Leu Leu Asn 250 Asn Tyr Met íle Trp 255 Asn
Leu Val Arg Lys 260 Thr Ser Ser Phe Leu 265 Asp Gin Arg Phe Gin 270 Asp Ala
Asp Glu Lys 275 Phe Met Glu Val Met 280 Tyr Gly Thr Lys Lys 285 Thr Cys Leu
Pro Arg 290 Trp Lys Phe Cys Val 295 Ser Asp Thr Glu Asn 300 Thr Leu Gly Phe
Ala 305 Leu Gly Pro Met Phe 310 Val Lys Ala Thr Phe 315 Ala Glu Asp Ser Lys 320
Asn íle Ala Ser Glu 325 íle íle Leu Glu íle 330 Lys Lys Ala Phe Glu 335 Glu
Ser Leu Ser Thr 340 Leu Lys Trp Met Asp 345 Glu Asp Thr Arg Lys 350 Ser Ala
Lys Glu Lys 355 Ala Asp Ala íle Tyr 360 Asn Met íle Gly Tyr 365 Pro Asn Phe
íle Met 370 Asp Pro Lys- Glu Leu 375 Asp Lys Val Phe 'Asn 380 Asp Tyr Thr Ala
Val 385 Pro Asp Leu Tyr Phe 390 Glu Asn Ala Mét Arg 395 Phe Phe Asn Phe Ser 400
Trp Arg Val Thr Ala 405 Asp Gin Leu Arg Lys 410 Ala Pro Asn Arg Asp 415 Gin
Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys
420 425 430
Asn Glu íle 435 Val Phe Pro Ala Gly íle Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr
440 445
Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly íle Gly Val Val Val
450 455 460
Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp
455 470 475 480
Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala
485 490 4 9 5'
Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Ty r Gly Asn Tyr Ser
500 505 510
Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg' His Thr Leu Gly Glu Asn íle
515 520 525
Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp
530 535 540
Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr
545 550 555 560
Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu
555 (2) Informácia o SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 23 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Antisense: áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 20:
GCCAGCGCCG TCTCAAAGTC CAG (2) Informácia o SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 22 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Antisense: nie (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 21:
TGGGGGACCT TCAGCAACCT CT (2) Informácia o SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 2129 párov báz (B) Typ: aminokyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (B) Bunková línia: bunková línia endotelu fetálneho hovädzieho srdca
- 46 (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Poloha: 3..2126 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 22:
GG ACC CCG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG CTG GTG GCG CTC CTG GCG 47
Thr Pro Val Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
GCG GCA TTG GTG GCC TGT TTG GCA GTA CTG GGC ATC CAA TAC CAG ACA 95
Ala Ala Leu Val Ala Cys Leu Ala Val Leu Gly íle Gin Tyr Gin Thr
20 25 30
AGA ACG CCC TCG GTG TGC CTA AGT GAG GCC TGC ATC TCG GTG ACC AGC 14?
Arg Thr Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys íle Ser Val Thr Ser
35 40 45
TCC ATC TTG AGT TCC ATG GAC CCC ACG GTG GAC CCC TGC CAG GAC TTC 191
Ser íle Leu Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys Gin Asp Phe
50 55 60
TTC. ACC TAT GCC TGT GGC GGC TGG ATC AAA GCC AAC CCC GTG CCG GAT 239
Phe Thr Tyr Ala Cys Gly Gly Trp íle Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp
65 70 75
GGC CAC TCG .CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC CAA 287
Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin
80 85 90 95' •
GCC ATC ATC AAG CAC CTC CTT GAA AAC TCC ACG GCC AGC GTG AGC GAG 335
Ala íle íle Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu
100 105 110
GCA GAG AGG AAG GAC CAG GAG TAC TAC CGA GCC TGC ATG AAC GAA ACC 383
Ala Glu Arg Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr
115 120 125
AGG ATT GAG GAG CTC AAG GCC AAA CCC CTG ATG GAG CTC ATT GAG AAG 431
Arg íle Glu Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu íle Glu- Lys
130 135 140
CTC GGC GGC TGG AAC ATC ACG GGG CCC TGG GAC AAG GAC AAC TTC CAG 479
Leu Gly Gly Trp Asn íle Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin
145 150 155
GAC ACC CTG CAG GTG GTC ACA TCC CAC TAC CAC ACC TCC CCC TTC TTC 527
Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe
160 165 170 17:5
7
TCC GTC Ser Val TAC Tyr GTC AGT GCC GAC TCC AAG AAT TCC AAC AGC AAC GTG Ser Asn Val 190 ATC zle 575
Vaľ Ser Ala Asp 180 Ser Lys Asn 185 Ser Asn
CAA GTG GAC CAG TGT GGC CTG GGC TTA CCC TCA AGA GAT TAT TAC CTG 623
Gin' Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu
195 200 205
AAC AAA ACC GAG AAT GAG AAG GTG CTG ACG GGA TAC CTG AAC TAC ATG 671
Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met
210 215 220
GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGA GGA GGG GCC GAG GAC ACC ATC CGG 719
Val Gin Leu Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Thr íle A.rg
225 230 235
CCC CAG ATG CAG CAG ATC CTG GAC TTT GAG ACG GCG CTG GCC AAC ATC 767
Pro Gin Met Gin Gin íle Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn íle
240 245 250 255
ACC ATC CCC CAG GAG AAG CGC CGG GAC GAG GAA CTC ATC TAC CAC AAA 815
Thr íle Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu íle Tyr His Lys
260 265 270
GTG ACG GCG GCT GAG TTG CAG ACC TTG GCG CCC GCC ATC AAC TGG CTG 863
Val Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala íle Asn Trp Leu
275 280 285
CCC TTC CTC AAC ACC ATC TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCA GAG 911
Pro Phe Leu Asn Thr íle Phe Tyr Pro Val Glu íle Asn Glu Ser Glu
290 295 3 00
CCT ATT GTC ATC TAC· GAC AAA GAA TAC CTG AGC AAG GTC TCC ACC CTC 959
Pro íle Val íle Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu
305 310 315
ATC AAC AGC ACA GAC AAA TGC CTG CTG AAC AAC TAC ATG ATC TGG AAC 1007
íle Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met íle Trp Asn
320 325 330 335
CTG GTA CGG AAG ACG AGC TCC TTC CTC GAT CAG CGC TTC CAG GAC GCC 1055
Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala
340 345 350
GAC. GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAT GGG ACC AAG AAG ACG TGT CTT 1103
Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu
355 360 365
CCC CGC TGG AAG TTT TGT GTG AGT GAT ACA GAG AAC ACC TTG GGC TTC 1151
Pro Arg Trp Lys ‘Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe
370 375 380
GCC Ala CTG Leu 385 GGC CCC ATG Met TTC GTG AAA GCG ACC TTC GCT GAG GAC Asp AGC Ser AAG Lys 1
Gly Pro Phe Val 390 Lys Ala Thr Phe Ala 395 Glu
AAC ATA GCC AGC GAG ATC ATC CTG GAG ATC AAG AAG GCG TTT GAA GAG i:
Asn íle Ala Ser Glu íle íle Leu Glu íle Lys Lys Ala Phe Glu Glu
400 405 410 415
AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAA GAT ACT CGG AAA TCG GCC i;
Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser Ala
420 425 430
AAG GAA AAG GCG GAC GCG ATC TAC AAC ATG ATA GGC TAC CCC AAC TTT 11
Lys Glu Lys Ala Asp Ala íle Tyr. Asn Met íle Gly Tyr Pro Asn Phe
435 440 445
ATC ATG GAC CCC AAG GAG CTG GAC AAA GTG TTC AAT GAC TAC ACC GCT 13
íle Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala
450 455 460
GTG CCA GAC CTC TAC TTC GAG AAC GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC TCC 14
Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser
465 470 475 • ,
TGG AGG GTC ACT GCC GAC CAG CTC CGG AAA GCG CCC AAC AGA GAT CAG 14
Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gin
480 485 490 495
TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC AAG 15
Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys
500 505 510
AAČ GAG ATC GTG TTT CCG GCC GGA ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC ACC 15
Asn Glu íle Val Phe Pro Ala Gly íle Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr
515 520 525
CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC GTG 16
Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly íle Gly Val Val Val
530 535 540
GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC GAC 16
Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr· Asp
545 550 555
AAG GAT GGG .AAC CTC CGG CCC TGG TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG GCG 17
Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu • Ala
560 565 570 '575
TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT AGC 17
Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser
580 585 590
GTG Val AAC Asn GGG GAG CCG Pro GTG Val AAC Asn GGC Gly CGG Arg 600 CAC His ACC Thr CTC Leu GGC Gly GAA Glu 605 AAC Asn ATC íle 1823
Gly Glu 595
GGC GAC AAC Ls'jsj GGC CTC AAG GCG GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC TGG 1871
Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp
610 615 620
GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC ACC 1919
Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr
625 630 635
AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG AGT ΊΤΤ GCA CAG GTC TGG TGT TCC GTC 1967
Asn Asn C-ln Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val
640 645 650 655
CGC ACC CCC GAG AGT TCG CAC GAA GGT CTC ATC ACC GAT CCC CAC AGC 2015
Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu Gly Leu íle Thr Asp Pro His Ser
660 665 670
ccc TCC CGC TTC CGG GTC ATC GGC TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC 2063
Pro Ser Arg Phe Arg Val íle Gly Ser íle Ser Asn Ser Lys Glu Phe
675 680 685
TCG GAA CAC TTC CAC TGC. CCG CCC GGC TCA CCC ATG AAC CCG CAT CAC 2111
Ser Glu’ His Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn. Pro His His
'690 695 700
AAG TGT GAA GTC TGG TGA 2129
Lys Cys Glu Val Trp
(2) Informácia o SEQ ID NO: 23:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 708 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna
(ii) Typ molekuly: proteín
(xi) Popis sekvencie : SEQ ID NO : 23
Thr 1 Pro Val Glu Lys 5 Arg Leu Val Val Leu 10 Val Ala Leu Leu Ala 15 Ala
Ala Leu Val Ala Cys 20 Leu Ala Val Leu 25 Gly íle Gin Tyr Gin 30 Thr Arg
Thr Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys íle Ser Val Thr Ser Ser
40 45
íle Leu .50 Ser Ser Met Asp Pro 55 Thr Val Asp Pro Cys 60 Gin Asp Phe Phe
Thr Tyr Ala Cys Gly Gly Trp íle Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly
65 70 75 80
His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Ala
85 90 95
íle íle Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala
100 105 110
Glu Arg Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg
115 120 125
íle Glu Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu íle Glu Lys Leu
130 135 140
Gly Gly Trp Asn íle Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin Asp
145 150 155 160
Thr Leu Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe Ser
165 170 175
Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val íle Gin
180 185 190
Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr .Tyr Leu Asn
195 200 205
Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val
210 215 220
Gin Leu Gly Lys Leu- Leu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Thr íle Arg Pro
225 230 235 240
Gin Met Gin Gin íle Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn íle Thr
245 250 255
íle Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu íle Tyr His Lys Val
260 265 270
Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala íle Asn Trp Leu Pro
275 280 285
Phe Leu Asn Thr íle Phe Tyr Pro val Glu íle Asn Glu Ser Glu Pro
290 295 300
íle Val íle Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu íle
305 310 315 320
Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met íle Trp Asn Leu
325 330 335
Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu 340
Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr 355 360
Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp 370 375
Leu Gly Pro Met Phe Val Lys Ala 385 390 íle Ala Ser Glu íle íle Leu Glu 405
Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp 420
Glu Lys Ala Asp Ala íle Tyr Asn 435 440
Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys 450 455
Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala 465 470
Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg 485
S r Met Thr Pro Pro Met Val Äsn 500
Glu íle Val Phe Pro Ala Gly íle 515 520
Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn Phe 530 535
His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp 545 550
Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp 565
Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met Val 580
Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly Arg 595 600
Asp 345 Gin Arg Phe Gin Asp 350 Ala Asp
Gly Thr Lys Lys Thr 365 Cys Leu Pro
Thr Glu Asn Thr 380 Leu Gly Phe Ala
Thr Phe Ala 395 Glu Asp Ser Lys Asn 400
íle Lys 410 Lys Ala Phe Glu Glu 415 Ser
Glu 425 Asp Thr Arg Lys Ser 430 Ala Lys
Met íle Gly Tyr Pro 445 Asn Phe íle
Val Phe Asn Asp 460 Tyr Thr Ala Val
Met Arg Phe 475 Phe Asn Phe Ser Trp 480
Lys Ala 490 Pro Asn Arg Asp Gin 495 Trp
Ala 505 Tyr Tyr Ser Pro Thr 510 Lys Asn
Leu Gin Ala Pro Phe 525 Tyr Thr Arg
Gly Gly íle Gly 540 Val Val Val Gly
Asp Gin Gly 555 Arg Glu Tyr Asp Lys 560
Lys Asn 570 Ser Ser Val Glu Ala 575 Phe
Glu 585 Gin Tyr Gly Asn Tyr 590 Ser Val
His Thr Leu Gly Glu Asn íle Ala
605
Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val 610 615 620
Lys 625 Lys Asn Gly Ala Glu 630 Gin Thr Leu Pro Thr 635 Leu Gly Leu Thr Asn 640
Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg
645 650 65 5
Thr Pro Glu Ser Ser His Glu Gly Leu íle Thr Asp Pro His Ser Pro
660 665 670
Ser Arg Phe Arg Val íle Gly Ser íle Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser
675 680 685
Glu His Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys
690 695 700
Cys Glu Val Trp
705 (2) Informácia o SEQ ID NO: 24:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 2533 aminokyselín (B) Typ: nukleová kyselina (C) Refazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva:placenta (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Poloha: 1..2109 (xi)
Popis sekvencie
SEQ ID NO: 24 :
CGG CTG GTG Nrg Leu Val 1 GTG TTG GTG Val GTA CTT CTG GCG GCA GGA CTG GTG GCC TGC 48
Val Leu 5 Val Leu Leu Ala 10 Ala Gly Leu Val Ala 15 Cys
TTG GCA GCA CTG GGC ATC CAG TAC CAG ACA AGA TCC CCC TCT GTG TGC 96
Leu Ala Ala Leu Gly íle Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys
20 25 30
CTG AGC GAA GCT TGT GTC TCA GTG ACC AGC TCC ATC TTG AGC TCC ATG 144
Leu Ser Glu Ala Cys Val Ser Val Thr Ser Ser íle Leu Ser Ser Met
35 40 4 5
GAC CCC ACA GTG GAC CCC TGC CAT GAC TTC TTC AGC TAC GCC TGT GGG 192
Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Ti/r Ala Cys Gly
50 55 60
GGC TGG ATC AAG GCC AAC CCA GTC CCT GAT GGC CAC TCA CGC TGG GGG 240
Gly Trp íle Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly
65 70 75 80
ACC TTC AGC AAC CTC TGG GAA CAC AAC CAA GCA ATC ATC AAG CAC CTC 288
Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Ala íle íle Lys His Leu
85 90 95
CTC GAA AAC TCC. ACG GCC AGC GTG AGC GAG GCA GAG AGA AAG GCG CAA 336
Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Gin
100 105 110
GTA TAC TAC CGT GCG TGC ATG AAC GAG ACC AGG ATC GAG GAG CTC AGG 384
Val Tyr Tyr Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg íle G1.U Glu Leu Arg
115 120 125
GCC AAA CCT CTA ATG GAG TTG ATT GAG AGG CTC GGG GGC TGG AAC ATC 432
Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu íle Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn íle
130 135 140
ACA GGT CCC TGG GCC AAG GAC AAC TTC CAG GAC ACC CTG CAG GTG GTC 480
Thr Gly Pro Trp Ala Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val
145 150 155 160
ACC GCC CAC TAC CGC ACC TCA CCC TTC TTC TCT GTC TAT GTC AGT GCC 528
Thr Ala His Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala
165 170 175
GAT TCC AAG AAC TCC AAC AGC AAC GTG ATC CAG GTG GAC CAG TCT GGC 576
Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val íle Gin Val Asp Gin Ser Gly
180 185 190
CTG GGC TTG CCC TCG AGA GAC TAT TAC CTG AAC AAA ACT GAA AAC GAG 624
Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu
195 200 205
AAG GTG Lys Val 210 CTG ACC GGA TAT CTG AAC TAC ATG GTC CAG Gin 220 CTG Leu GGG Gly AAG Lys CTG Leu 672
Leu Thr Gly Tyr Leu 215 Asn Tyr Met Val
CTG GGC GGC GGG GAC GAG GAG GCC ATC CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC 720
Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala íle Arg Pro Gin Met Gin Gin íle
225 230 235 240
TTG GAC TTT GAG ACG GCA CTG GCC AAC ATC ACC ATC CCA CAG GAG AAG 768
Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn íle Thr íle Pro Gin Glu Lys
245 250 255
CGC CGT GAT GAG GAG CTC ATC TAC CAC AAA GTG ACG GCA GCC GAG CTG 816
Arg Arg Asp Glu Glu Leu íle Tyr HÍS Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu
260 265 270
CAG ACC TTG GCA CCC GCC ATC AAC TGG TTG CCT TTT CTC AAC ACC ATC 8
Gin Thr Leu Ala Pro Ala íle Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr íle
275 280 285
TTC TAC CCC GTG GAG ATC AAT GAA TCC GAG CCT ATT GTG GTC TAT GAC 9
Phe Tyr Pro Val Glu íle Asn Glu Ser Glu Pro íle Val Val Tyr Asp
290 295 300
AAG G.AA TAC CTT GAG CAG ATC TCC ACT CTC ATC AAC ACC ACC GAC AGA 9
Lys Glu Tyr Leu Glu Gin íle Ser Thr Leu íle Asn Thr Thr Asp Arg
305 310 315 320
TGC CTG CTC AAC AAC TAC ATG ATC TGG AAC CTG GTG CGG AAA ACA AGC 10
Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met íle Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser
325 330 335
TCC TTC CTT GAC CAG CGC TTT CAG GAC GCC GAT GAG AAG TTC ATG GAA 10
Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu
340 345 350
GTC ATG TAC GGG ACC AAG AAG ACC TGT CTT CCT CGC TGG AAG TTT TGC 11
Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys
355 360 365
GTG AGT GAC ACA GAA AAC AAC CTG GGC TTT GCG TTG GGC CCC ATG TTT 11
Val Ser Asp Thr Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe
370 375 380
GTC AAA GCA ACC TTC GCC GAG GAC AGC AAG AGC ATA GCC ACC GAG ATC 12
Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser íle Ala Thr Glu íle
385 390 395 400
ATC CTG GAG ATT AAG AAG GCA TTT GAG GAA AGC CTG AGC ACC CTG AAG 12
íle Leu Glu íle Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys
405 410 415
'TGG ATG GAT GAG GAA ACC CGA AAA TCA GCC AAG GAA AAG GCC GAT GCC 12
Trp Met Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala
420 425 430
ATC TAC AAC ATG ATA GGA TAC CCC AAC TTC ATC ATG GAT CCC AAG GAG 13
íle Tyr Asn Met íle Gly Tyr Pro Asn Phe íle Met Asp Pro Lys Glu
435 440 445
CTG GAC AAA GTG TTT AAT GAC TAC ACT GCA GTT CCA GAC CTC TAC TTT 13
Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe
450 455 460
GAA AAT GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTC TCA TGG AGio GTC ACT GCC GAT 14
Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp
465 470 475 480
CAG CTC AGG AAA GCC CCC AAC AGA GAT CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC 1488
Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro
485 490 495
ATG GTG AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC AAG AAT GAG ATT GTG TTT CCG 1536
Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu íle Val Phe Pro
500 505 510
GCC GGG ATC CTG CAG GCA CCA TTC TAC ACA CGC TCC TCA CCC AAG GCC 1584
Ala Gly íle Leu Gin Ala Pro Phe iyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala
515 520 525
TTA AAC TTT GGT GGC ATA GGT GTC GTC GTG GGC CAT GAG CTG ACT CAT 1632
Leu Asn Phe Gly Gly íle Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His
530 535 540
GCT TTT GAT GAT CAA GGA CGG GAG TAT GAC AAG GAC GGG AAC CTC CGG 1680
Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg
545 550 555 560
CCA TGG TGG AAG AAC TCA TCC GTG GAG GCC TTC AAG CGT CAG ACC GAG .1728
Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gin Thr Glu
565 570 575
TGC ATG GTA GAG CAG TAC AGC AAC TAC AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG 1776
Cys Met Val Glu Gin Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val
580 585 590
AAC GGG CGG CAC ACC CTG GGG GAG AAC ATC GCC GAC .AAC GGG GGT CTC 1824
Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn íle Ala Asp Asn Gly Gly Leu
595 600 605
AAG GCG GCC TAT CGG GCT TAC CAG AAC TGG GTG AAG AAG AAC GGG GCT 1872
Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala
610 615 620
GAG CAC TCG CTC ccc ACC CTG GGC CTC ACC AAT AAC CAG CTC TTC TTC 1920
Glu His Ser Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe
62 5 630 635 640
CTG GGC TTT GCA CAG GTC TGG TGC TCC GTC CGC ACA CCT GAG AGC TCC 1968
Leu Gly Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser
645 650 655
CAC His GAA GGC Glu Gly CTC ATC ACC GAT ČČČ ČÁČ His 665 ÁČČ CCC TCT CGC Arg TTC CGG GTC Phe Arg Val 670 2016
Leu 660 íle Thr Asp Pro Ser Pro Ser
ATC GGC TCC CTC TCC AAT TCC AAG GAG TTC TCA GAA CAC TTC CGC TGC 2064
íle Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys
675 680 685
CCA CCT GGC TCA CCC ATG AAC CCG CCT CAC AAG TGC GAA GTC TGG 2109
Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp
690 695 700
TAAGGACGAA GCGGAGAGAG CCAAGACGGA GGAGGGGAAG GGGCTGAGGA CGAGACCCCC 2169
ATCCAGCCTC CAGGGCATTG CTCAGCCCGC TTGGCCACCC GGGGCCCTGC TTCCTCACAC 2229
TGGCGGGTTT TCAGCCGGAA CCGAGCCCAT GGTGTTGGCT CTCAACGTGA CCCGCAGTCT 2289
GATCCCCTGT GAAGAGCCGG ACATCCCAC-G CACACGTGTG CGCCACCTTC AGCAGGCATT 2349
CGGGTGCTGG GCTGGTGGCT CATCAGGCCT GGGCCCCACA CTGACAAGCG CCAGATACGC 2409
CACAAATACC ACTGTGTCAA ATGCTTTCAA GATATATTTT TGGGGAAACT ATTTTTTAAA 2469
CACTGTGGAA TACACTGGAA ATCTTCAGGG AAAAACACAT TTAAACACTT TTTTTTTTAA 2529
GCCC 2 533 (2) Informácia o SEQ ID NO: 25:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 703 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein
(x :i) Popi, s se kvencie : SE Q ID NO : 25
Arg Leu Val Val Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Gly Leu Val Ala Cys
1 5 10 15
Leu Ala Ala Leu Gly íle Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys
20 25 30
Leu Ser Glu Ala Cys Val Ser Val Thr Ser Ser íle Leu Ser Ser Met
35 40 45
Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala Cys Gly
50 55 60
Gly Trp íle Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly
65 70 75 80
Thr Phe Ser Asn Leu 85 Trp Glu His Asn Gin 90 Ala íle íle Lys His 95 Leu
Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Gin
100 105 110
Val Tyr Tyr ' Arg Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg íle Glu Glu Leu Arg
115 120 125
Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu íle Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn Π e
130 135 140
Thr Gly Pro Trp Ala Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val
145 150 155 160
Thr Ala Kis Tyr Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala
165 170 175
Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val íle Gin Val Asp Gin Ser Gly
180 185 190
Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu
195 200 205
Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu
210 215 220
Leu Gly Gly Gly Asp Glu Glu Ala íle Arg Pro Gin Met Gin Gin íle
225 230 235 240
Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn íle Thr íle Pro Gin Glu Lys
245 2 50 255
Arg Arg Asp Glu Glu Leu íle Tyr His Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu
260 265 270
Gin Thr Leu Ala Pro Ala íle Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr íle
275 280 285
Phe Tyr Pro Val Glu íle Asn Glu Ser Glu Pro íle Val Val Tyr Asp
290 295 300
Lys Glu Tyr Leu Glu. Gin íle Ser Thr Leu íle Asn Thr Thr Asp Arg
305 310 315 320
Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met íle Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser
325 330 335
Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu
340 345 350
Val Met Tyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys 355 360 365 ·-
Val Ser Asp Thr 370. Glu Asn Asn 375 Leu Gly Phe Ala Leu 380 Gly Pro Met Phe
Val Lys Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser íle Ala Thr Glu íle
385 390 395 400
íle Leu Glu íle Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys
405 410 415
Trp Met Asp Glu Glu Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala
420 425 430
íle Tyr Asn Meč íle Gly Tyr Pro Asn Phe íle Met Asp Pro Lys Glu
435 440 445
Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe
450 455 460
Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp
465 470 475 480
Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro
485 490 495
Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu íle Val Phe Pro
500 505 510
Ala Gly íle Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala
515 520 525
Leu Asn Phe Gly Gly íle Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His
530 535 540
Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg
545 550 555 560
Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gin Thr Glu
565 570 575
Cys Met Val Glu Gin Tyr Ser Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val
580 585 590
Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn íle Ala Asp Asn Gly Gly Leu
595 600 60 5
Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala
.610 615 620
Glu His Ser Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe
5
630
635
640
Leu Gly Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser 645 650 655
His Glu Gly Leu íle Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val
660 665 670
íle Gly Ser Leu Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys
675 680 685
Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp
690 695 700
Infor máci .a o SEQ ID NO: 26 :
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomický) (iii) Hypotetická: nie (iii) Antisense: áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 26:
GGTGCTTGAT GATGGCTTGG TTGT (2) Informácia o SEQ ID NO: 27:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 24 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Hypotetická: nie (iii) Antisense: áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 27:
AGATGGAGCT GGTCACCGAG ATGC 24 (2) Informácia o SEQ ID NO: 28:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 324 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (B) Typ tkaniva: pľúca (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 28:
GGGAGCGCGG CGCGGGGCCG GAGCGGAGCG CGCGAGCGAT gatgtctacc TACAAGCGGC 60
CCACGCTGGA CGAGGAGGAC CTGGTGGACT CGCTGTCCGA GAGCGACGTG TACCCCAACC 120
ACCTGCAGGT GAACTTCCGA GGCCCCCGGA ACGGCCAGAG ATGCTGGGCC GCCAGGACCC 180
CGGTGGAGAA GCGGCTGGTG GTGCTGGTGG CGCTCCTGGC GGCGGCATTG GTGGCCTGTT 240
TGGCAGTACT GGGCATCCAA TACCAGACAA GAACGCCCTC GGTGTGCCTA AGTGAGGCCT 300
GCATCTCGGT GACCAGCTCC ATCT
324 (2) Informácia o SEQ ID NO: 29:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 2314 párov báz (3) Typ: nukleová kyselina (C) Reúazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) typ molekuly: cDNS k mRNS (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Bos taurus (B) Typ tkaniva: pľúca (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Poloha: 39..2301 (xi): Popis sekvencie: SEQ ID NO: 29:
GGGAGCGCGG CGCGGGGCCG GAGCGGAGCG CGCGAGCG ATG ATG TCT ACC TAC 53
Met Met Ser Thr Tyr
5
AAG Lys CGG CCC ACG CTG Leu 10 GAC GAG GAG GAC CTG GTG GAC TCG CTG TCC GAG Glu 101
Arg Pro Thr Asp Glu Glu Asp Leu Val Asp Ser Leu Ser
15 20
AGC GAC GTG TAC CCC AAC CAC CTG CAG GTG AAC TTC CGA GGC CCC CGG 149
Ser Asp Val Tyr Pro Asn His Leu Gin Val Asn Phe Arg Gly Pro Arg
25 30 35
AAC GGC CAG AGA TGC TGG GCC GCC AGG ACC CCG GTG GAG AAG CGG CTG 197
Asn Gly Gin Arg Cys Trp Ala Ala Arg Thr Pro Val Glu Lys Arg Leu
40 45 50
GTG GTG CTG GTG GCG CTC CTG GCG GCG GCA TTG GTG GCC TGT TTG GCA 245
Val Val Leu Val Ala Leu Leu Ala Ala Ala Leu Val Ala Cys Leu Ala
55 60 65
GTA CTG GGC ATC CAA TAC CAG ACA AGA ACG CCC TCG GTG TGC CTA AGT 293
Val Leu Gly íle Gin Tyr Gin Thr Arg Thr Pro Ser Val Cys Leu Ser
75 80 85
GAG GCC TGC ATC íle TCG Ser 90 GTG Val ACC AGC TCC ATC íle 95 TTG AGT TCC Ser ATG Met GAC Asp 100 CCC Pro 341
Glu Ale cys Thr Ser Ser Leu Ser
ACG GTG GAC CCC TGC CAG GAC TTC TTC ACC TAT GCC TGT GGC GGC TGG 3 89
Thr Vsi Asp Pro Cys Gin Asp Phe Phe Thr Tyr Ala Cys C-ly Gly Trp
105 110 115
ATC AAA GCC AAC CCC GTG CCG GAT GGC CAC TCG CGC TGG GGG ACC TTC 437
íle Lys Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe
120 125 13 0 (
AGC AA.C CTC TGG GAA CAC AAC CAA GCC ATC ATC AAG CAC CTC CTT 1 GAA 485
Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Ala íle íle Lys His Leu Leú Glu
135 140 145
AAC TCC ACG GCC AGC GTG AGC GAG GCA GAG AGG AAG CAC CAG GAC y i. TAC 533
Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Asp Gin Glu Tyr
150 155 160 165
TAC CGA GCC TGC ATG AAC GAA ACC AGG ATT GAG GAG CTC AAG GCC AAA 581
iyr Arg A.la Cys Met Asn Glu Thr Arg íle Glu Glu Leu Lys Ala Lys
170 175 180
CCC CTG ATG GAG CTC ATT GAG AAG CTC GGC GGC TGG AAC ATC ACG GGG 629
Pro Leu Met Glu Leu íle Glu Lys Leu Gly Gly Trp Asn íle Thr Gly
185 190 195
CCC TGG GAC AAG GAC AAC TTC CAG GAC ACC CTG CAG GTG GTC ACA TCC 677
Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ser
200 205 210
CAC TAC CAC ACC TCC CCC TTC TTC TCC GTC TAC GTC AGT GCC GAC TCC 725
His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val iyr Val Ser Ala Asp Ser
215 220 225
AAG AAT TCC AAC AGC AAC GTG ATC CAA GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC 773
Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val íle Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly
230 235 240 245
TTA CCC TCA AGA GAT TAT TAC CTG AAC AAA ACC GAG AAT GAG AAG GTG 821
Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val
250 255 260
CTG ACG GGA TAC CTG AAC TAC ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGA 869
Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu Leu Gly
265 270 275
GGA GGG GCC GAG GAC ACC ATC CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC CTG GAC 917
Gly Gly Ala Glu Asp Thr íle Arg Pro Gin Met Gin Gin íle Leu Asp
280 285 290
TTT GAG Phe Glu 295 ACG GCG CTG Leu GCC AAC ATC ACC ATC íle CCC CAG GAG Pro Gin Glu 305 AAG Lys CGC Arg CGG Arg 9 6:
Thr Ala Ala Asn 300 íle Thr
GAC GAG GAA CTC ATC TAC CAC AAA GTG ACG GCG GCT GAG TTG CAG ACC io i:
Asp Glu Glu Leu íle Tyr His Lvs Val Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr
310 315 320 325
TTG GCG CCC GCC ATC AAC TGG CTG CCC TTC CTC AAC ACC ATC TTC TAC 10 63
Leu Ala Pro Ala íle Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr íle Phe Tyr
330 335 340
ccc GTG GAG ATC AAT GAA TCA GAG CCT ATT GTC ATC TAC GAC AAA GAA 1109
Pro Val Glu íle * Asi} Glu Ser Glu Pro íle Val íle Tyr Asp Lys Glu
345 350 355
TAC CTG AGC AAG Gli TCC ACC CTC ATC AAC AGC ACľA GAC AAA TGC CTG 1157
Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu íle Asn Ser Thr Asp Lys Cys Leu
360 365 370
CTG AAC AAC TAC ATG ATC TGG AAC CTG GTA CGG AAG ACG AGC TCC TTC 1205
Leu Asn Asn Tyr Met íle Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe
375 380 385
CTC GAT CAG CGC TTC CAG GAC GCC GAC GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG 1253
Leu Asp Gin Arg Phe Gln Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met
390 395 400' 405
TAT C-GG ACC AAG AAG ACG TGT CTT CCC CGC TGG AAG TTT TGT GTG AGT 1301
iyr Gly Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser
410 415 420
GAT ACA GAG AAC ACC TTG GGC TTC GCC CTG GGC CCC ATG TTC GTC AAA 1349
Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe Val Lys
425 430 435
GCG ACC TTC GCT GAG GAC AGC AAG AAC ATA GCC AGC GAG ATC ATC CTG 1397
Ala Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Asn íle Ala Ser Glu íle íle Leu
440 445 450
GAG ATC AAG AAG GCG TTT GAA GAG AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG 1445
Glu íle Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met
455 460 465
GAT GAA GAT ACT CGG AAA TCG GCC AAG GAA AAG GCG GAC GCG ATC TAC 1493
Asp Glu Asp Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala Asp Ala íle Tyr
470 475 480 485
AAC ATG ATA GGC TAC CCC AAC TTT ATC ATG GAC CCC AAG GAG CTG GAC 1541
Asn Met íle Gly Tyr Pro Asn Phe íle Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp
490 495 500
AAA GTG TTC Phe AAT Asn 505 GAC Asp TAC ACC Tyr Thr GCT GTG CCA GAC Asp CTC Leu TAC Tyr TTC Phe 515 GAG Glu AAC Asn ibsy
Lys Val Ala Val 510 Pro
GCC ATG CGG TTT TTC AAC TTČ TCC TGG AGG GTC ACT GCC GAC CAG CTC 1637
Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu
520 525 530
CGG AAA GCG CCC AAC AGA GAT CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG 1685
Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val
535 540 545
AAC GCC TAC TAC TCG CCC ACC AAG AAC GAG ATC GTG TTT CCG GCC GGA 1733
Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu íle Val Phe Pro Ala Gly
550 555 560 565
ATC CTG CAG GCG CCA TTC TAC ACC CGC TCT TCA CCC AAT GCC TTA AAC 781
íle Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Asn Ala Leu Asn
570 575 580
TTC GGC GGC ATC GGC GTC GTC GTG GGC CAC GAG CTG ACT CAT GCT TTT 1829
Phe Gly Gly íle Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe
585 590 595
GAT GAT CAA GGC CGA GAG TAC GAC AAG GAT GGG AAC CTC CGG CCC TGG 1877
Asp Asp Gin Gly Arg Glu Týr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp
600 605 610
TGG AAG AAC TCG TCC GTG GAG GCG TTC AAG CAG CAG ACC GCG TGC ATG 1925
Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Gin Gin Thr Ala Cys Met
615 620 625
GTG GAG CAG TAC GGC AAC TAT AGC GTG AAC GGG GAG CCG GTG AAC GGC 1973
Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly Glu Pro Val Asn Gly
630 635 640 645
CGG CAC ACC CTC GGC GAA AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGC CTC AAG GCG 2021
Arg His Thr Leu Gly Glu Asn íle Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala
650 655 660
GCC TAT CGG GCC TAC CAG AAC .TGG GTC AAG AAG AAT GGG GCT GAG CAG 2069
Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu Gin
665 670 675
ACA CTG CCC ACC CTG GGT CTC ACC AAC AAC CAG CTC TTC TTC CTG AGT 2117
Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Ser
680 685 690
TTT GCA CAG GTC TGG TGT TCC GTC CGC ACC CCC GAG AGT TCG CAC GAA 2165
Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu
695 700 705
GGT Gly 710 CTC Leu ATC ACC GAT CCC CAC His AGC Ser CCC Pro TCC Ser CGC Arg 720 TTC Phe CGG GTC ATC GGC Gly 725 2213
íle Thr Asp Pro 715 .Arg Val íle
TCC ATC TCC AAC TCC AAG GAG TTC TCG GAA CAC TTC CAC TGC CCG CCC 2261
Ser íle Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe His Cys Pro Pro .
730 735 740
GGC TCA GCC' ATG AAC CCG CAT CAC AAG TGT GAA GTC TGG T GAAGGGCCAG 2311
Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys Cys Glu Val Trp
745 750
GCA ' 2314 (2) Informácia o SEQ ID NO: 30:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 754 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 30:
Met 1 Met Ser Thr Tyr 5 Lys Arg Pro Thr Leu 10 Asp Glu Glu Asp Leu 15 Val
Asp Ser Leu Ser 20 Glu Ser Asp Val Tyr 25 Pro Asn His Leu Gin 30 Val Asn
Phe Arg Gly 35 Pro Arg Asn Gly Gin 40 Arg Cys Trp Ala Ala 45 Arg Thr Pro
Val Glu 50 Lys Arg Leu Val Val 55 Leu Val Ala Leu Leu 60 Ala Ala Ala Leu
Val 65 Ala Cys Leu Ala Val 70 Leu Gly íle Gin Tyr 75 Gin Thr Arg Thr Pro 80
Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys íle Ser Val Thr Ser Ser íle Leu
90 95
Ser Ser Met Asp Pro Thr Val Asp Pro Cys Gin Asp Phe Phe Thr Tyr 100 105 110
Ala Cys Gly Gly 115 Trp íle Lys Ala Asn 120 Pro Val Pro Asp 125 Gly His Ser
Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn Leu Trp Glu His Asn Gin Ala íle íle
130 135 140
Lys His Leu Leu Glu Asn Ser Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg
145 150 155 160
Lys Asp Gin Glu Tyr Tyr Arg Ala Cys 'Met Asn Glu Thr Arg íle Glu
165 170 175
Glu Leu Lys Ala Lys Pro Leu Met Glu Leu íle Glu Lys Leu Gly Gly
180 185 190
Trp Asn íle Thr Gly Pro Trp Asp Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu
19 5 200 205
Gin Val Val Thr Ser His Tyr His Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr
210 215 220
Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn Ser Asn Ser Asn Val íle Gin Val Asp
225 230 235 240
Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr
245 250 255
Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu
260. 265 270
Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly Ala Glu Asp Thr íle Arg Pro Gin Met
275 280 285
Gin Gin íle Leu Asp Phe Glu Thr Ala Leu Ala Asn íle Thr íle Pro
290 295 300
Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu Glu Leu íle Tyr His Lys Val Thr Ala
305 310 315 320
Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala Pro Ala íle Asn Trp Leu Pro Phe Leu
325 330 335
Asn Thr íle Phe Tyr Pro Val Glu íle Asn Glu Ser Glu Pro íle Val
340 345 350
íle Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu Ser Lys Val Ser Thr Leu íle Asn Ser
355 360 365
Thr Asp Lys Cys Leu Leu Asn Asn Tyr Met íle Trp Asn Leu Val Arg
370 375 380
Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys 385 390 395 400
Phe Met Glu Val Met 405 Tyr Gly Thr Lys Lys 410 Thr Cys Leu Pro Arg 415 Trp
Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr Glu Asn Thr Leu Gly Phe Ala Leu Gly
420 425 430
Pro .Met Phe Val Lys Al a Thr Phe Ala Glu Asp Ser Lys Asn íle Ala
435 440 445
S? r Glu íle íle Leu Glu íle Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser
450 455 4 60
Thr Leu Lys Trp Met ASP Glu Asp Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys
465 470 475 480
Ala Asp Ala íle iyr Asn Met íle Gly Tyr Pro Asn Phe íle Met Asp
485 490 495
Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp
500 505 510
Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val
515 520 525
Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys Ala Pro Asn Arg Asp Gin Trp Ser Met
530 535 540
Thr Pro Pro Met Val Asn Ala Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu íle
545 550 555 560
Val Phe Pro Ala Gly íle Leu Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Sér Ser
565 570 575
Pro Asn Ala Leu Asn Phe Gly Gly íle Gly Val Val Val Gly His Glu
580 585 590
Leu Thr His Ala Phe Asp Asp Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly
595 600 605
Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Gin
'610 615 620
Gin Thr Ala Cys Met Val Glu Gin Tyr Gly Asn Tyr Ser Val Asn Gly
625 630 635 640
Glu Pro Val Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Glu Asn íle Ala Asp Asn
645 650 655
Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys
660 665 670
Asn Gly Ala Glu Gin Thr Leu Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin
675 680 585
Leu Phe Phe Leu Ser Phe Ala Gin Val Trp Cys Ser Val Arg Thr Pro 690 695 700
Glu Ser Ser His Glu Gly Ĺéu iíé ŤRŕ Ásp Pro His Ser Pro Ser Arg
705 710 715 .720
Phe Arg Val íle Gly Ser íle Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His
725 730 735
Phe His Cys Pro Pro Gly Ser Pro Met Asn Pro His His Lys cys Glu
740 745 750
Val Trp (2) Informácia o SEQ ID NO: 31:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 53 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly; DNS (genomická) (iii) Hypotetická: nie (iii) Antisense: áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 31:
GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA ACTAGTCTCG AGCCAAGCAG GCCACCAGTC CTG (2) Informácia o SEQ ID NO: 32:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 25 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: DNS (genomická) (iii) Hypotetická: nie (iii) Antisense.- áno (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 32:
CCTGCCGCCA GAAGTACCAC CAACA (2) Informácia o SEQ ID NO: 33:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 222 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reťazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: nie (iii) Antisense: áno (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva: placenta (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúČ: CDS (B) Poloha: 38..222 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 33:
CGCCCCCCCG GTGTCCGCCC TGCTGTCGGC GCTGGGG ATG TCG ACG TAC AAG CGG 55
Met Ser Thr Tyr Lys Arg
5
GCC Ala ACG Thr CTG GAC Leu Asp 10 GAG GAG GAC CTG GTG GAC TCG CTC Leu TCC Ser GAG Glu 20 GGC Gly GAC Asp 103
Glu Glu Asp Leu Val 15 Asp Ser
GCA TAC CCC AAC GGC CTG CAG GTG AAC TTC CAC AGC CCC CGG AGT GGC 151
Ala Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe His Ser Pro Arg Ser Gly
25 30 35
CAG AGG TGC TGG GCT GCA CGG ACC CAG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG 199
Gin Arg Cys Trp Ala Ala Arg Thr Gin Val Glu Lys Arg Leu Val Val
40 . 45 50
222
TTG GTG GTA CTT CTG GCG GCA GG Leu Val Val Leu Leu Ala Ala
60 (2) Informácia o SEQ ID NO: 34:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 61 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 34:
Met 1 Ser Thr Tyr Lys 5 Arg Ala Thr Leu Asp Glu Glu Asp Leu Val Asp
10 15
Ser Leu Ser Glu Gly Asp Ala Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe
20 25 30
His Ser Pro Arg Ser Gly Gin Arg Cys Trp Ala Ala Arg Thr Gin Val
35 40 45
Glu Lys Arg Leu Val Val Leu Val Val Leu Leu Ala Ala
50 55 60
(2) Informácia o SEQ ID NO: 35:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) DÍžka: 2720 párov báz (B) Typ: nukleová kyselina (C) Reúazec: jeden (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: cDNS k mRNS (iii) Hypotetická: nie (vi) Pôvod:
(A) Organizmus: Homo sapiens (B) Typ tkaniva: placenta (ix) Znaky:
(A) Meno/kľúč: CDS (B) Poloha: 38..2297 (xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 35:
CGCCCCCCCG GTGTCCGCCC TGCTGTCGGC GCTGGGG ATG TCG ACG TAC AAG CGG 55
Met Ser Thr Tyr Lys Arg
5
GCC ACG CTG GAC GAG Asp Glu 10 GAG GAC CTG GTG GAC TCG CTC TCC GAG GGC GAC Asp 103
Ala Thr Leu Glu Asp Leu Val 15 Asp Ser Leu Ser Glu 20 Gly
GCA TAC CCC AAC GGC CTG CAG GTG AAC TTC CAC AGC CCC CGG AGT GGC 151
Ala Tyr Pro Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe His Ser Pro Arg Ser Gly
25 30 35
CAG AGG TGC TGG GCT GCA CGG ACC CAG GTG GAG AAG CGG CTG GTG GTG 199
Gin Arg Cys Trp Ala Ala Arg Thr Gin Val Glu Lys Arg Leu Val Val
40 45 50
TTG GTG GTA CTT CTG GCG GCA GGA CTG GTG GCC TGC TTG GCA GCA CTG 247
Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Gly Leu Val Ala Cys Leu Ala Ala Leu
55 60 65 70
GGC ATC CAG TAC CAG ACA AGA TCC CCC TCT GTG TGC CTG AGC GAA GCT 295
Gly íle Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser Val Cys Leu Ser Glu Ala
75 80 85
TGT GTC TCA GTG ACC AGC TCC ATC TTG AGC TCC ATG GAC CCC ACA GTG 343
Cys Val Ser Val Thr Ser Ser íle Leu Ser Ser Met Asp Pro Thr Val
90 95 100
GAC CCC TGC CAT GAC TTC TTC AGC TAC GCC TGT GGG GGC TGG ATC AAG 391
Asp Pro Cys His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala Cys Gly Gly Trp íle Lys
105 110 115
GCC AAC CCA GTC CCT GAT GGC CAC TCA ' CGC TGG GGG ACC TTC AGC AAC 4 :·
Ala Asn Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg Trp Gly Thr Phe Ser Asn
120 125 130
CTC TGG GAA CAC AAC CAA GCA ATC ATC AAG CAC CTC CTC GAA AAC TCC 48
Leu Trp Glu His Asn Gin Ala íle íle Lys His Leu Leu Glu Asn Ser
135 140 145 150
ACG GCC AGC GTG AGC GAG GCA GAG AGA AAG GCG CAA GTA TAC TAC CGT 53
Thr Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys Ala Gin Val Tyr Tyr Arg
155 160 165
GCG TGC ATG AAC GAG ACC AGG ATC GAG GAG CTC AGG GCC AAA CCT CTA 58
Ala Cys Met Asn Glu Thr Arg íle Glu Glu Leu Arg Ala Lys Pro Leu
170 175 180
ATG GAG TTG ATT GAG AGG CTC GGG GGČ TGG AÁČ ATC ACA GGT CCC TGG 63ľ
Met Glu Leu íle Glu Arg Leu Gly Gly Trp Asn íle Thr Gly Pro Trp
185 190 195
GCC AAG GAC AAC TTC CAG GAC ACC CTG CAG GTG GTC ACC GCC CAC TAC 67í
Ala Lys Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin Val Val Thr Ala His Tyr
200 205 210
CGC ACC TCA CCC TTC TTC TCT GTC TAT GTC AGT GCC GAT TCC AAG AAC 727
Arg Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val Ser Ala Asp Ser Lys Asn
215 220 225 230
TCC AAC AGC AAC GTG ATC CAG GTG GAC CAG TCT GGC CTG GGC TTG CCC 775
Ser Asn Ser Asn Val íle Gin Val Asp Gin Ser Gly Leu Gly Leu Pro
235 240 245
TCG AGA GAC TAT TAC CTG AAC AAA ACT GAA AAC GAG AAG GTG CTG ACC 823
Ser Arg Asp Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu Asn Glu Lys Val Leu Thr
250 255 2 60
GGA TAT CTG AAC TAC ATG GTC CAG CTG GGG AAG CTG CTG GGC GGC GGG 871
Gly Tyr Leu Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly Lys Leu Leu Gly Gly Gly
265 270 275
GAC GAG GAG GCC ATC CGG CCC CAG ATG CAG CAG ATC TTG GAC TTT GAG 919
Asp Glu Glu Ala íle Arg Pro Gin Met Gin Gin íle Leu Asp Phe Glu
280 285 290
ACG GCA CTG GCC AAC ATC ACC ATC CCA CAG GAG AAG CGC CGT GAT GAG 967
Thr Ala Leu Aid Asn íle Thr íle Pro Gin Glu Lys Arg Arg Asp Glu
295 300 305 310
GAG CTC ATC TAC CAC AAA GTG ACG GCA GCC GAG CTG CAG ACC TTG GCA 1015
Glu Leu íle Tyr His Lys Val Thr Ala Ala Glu Leu Gin Thr Leu Ala
315 320 325
CCC GCC ATC AA.C TGG TTG CCT TTT CTC AAC ACC ATC TTC TAC CCC IjíVj
Pro Ala íle Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn Thr íle Phe Tyr Pro Val
330 335 340
GAG ATC AAT GAA TCC GAG CCT ATT GTG GTC TAT GAC AAG GAA TAC CTT 1111
Glu íle Asn Glu Ser Gl.U Pro íle Val Val Tyr Asp Lys Glu Tyr Leu
345 350 355
GAG CAG ATC TCC ACT CTC ATC AAC ACC ACC GAC AGA TGC CTG CTC AAC 1159
Glu Gin íle Ser Thr Leu íle Asn Thr Thr Asp Arg Cys Leu Leu Asn
360 365 370
AAC TAC ATG ATC TGG AAC CTG GTG CGG AAA ACA AGC TCC TTC CTT GAC 1207
Asn Tyr Met íle Trp Asn Leu Val Arg Lys Thr Ser Ser Phe Leu Asp
375 380 385 390
CAG CGC TTT CAG GAC GCC GAT GAG AAG TTC ATG GAA GTC ATG TAC GGG 1255
Gin Arg Phe Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe Met Glu Val Met Tyr Gly
395 400 405
ACC AAG AAG ACC TGT CTT CČT CGC TGG AAG TTT TGC GTG AGT GAC ACA 1303
Thr Lys Lys Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys Phe Cys Val Ser Asp Thr
410 415 420
GAA AAC AAC CTG GGC TTT GCG TTG GGC CCC ATG TTT GTC AAA GCA ACC 1351
Glu Asn Asn Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro Met Phe Val Lys Ala Thr
425 430 435
TTC GCC GAG GAC AGC AAG AGC ATA GCC ACC GAG ATC ATC CTG GAG ATT 1399
Phe Ala Glu Asp Ser Lys Ser íle Ala Thr Glu íle íle Leu Glu íle
440 44 5 450
AAG AAG GCA TTT GAG GAA AGC CTG AGC ACC CTG AAG TGG ATG GAT GAG 1447
Lys Lys Ala Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr Leu Lys Trp Met Asp Glu
455 460 465 470
GAA ACC CGA AAA TCA GCC AAG GAA AAG GCC GAT GCC ATC TAC AAC ATG 14 95
Glu Thr Arg Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala ASP Ala íle Tyr Asn Met
475 480 485
ATA GGA TAC CCC AAC TTC ATC ATG GAT CCC AAG GAG CTG GAC AAA ’ GTG 1543
íle Gly Tyr Pro Asn Phe íle Met Asp Pro Lys Glu Leu Asp Lys Val
.490 495 500
TTT AAT GAC TAC ACT GCA GTT CCA GAC CTC TAC TTT GAA AAT GCC ATG 1591
Phe Asn Asp Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu Tyr Phe Glu Asn Ala Met
505 510 515
CGG TTT TTC AAC TTC TCA TGG AGG GTC ACT GCC GAT CAG CTC AGG AAA 1639
Arg Phe Phe Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr Ala Asp Gin Leu Arg Lys
520 525 530
GCC CCC AAC AGA GAT CAG TGG AGC ATG ACC CCG CCC ATG GTG AAC GCC 168
Ala Pro Asn. Arg Asp Gin Trp Ser Met Thr Pro Pro Met Val Asn Ala
535 540 545 550
TAC TAC TCG CCC ACC AAG AAT GAG ATT GTG TTT CCG GCC GGG ATC CTG 173
.Tyr Tyr Ser Pro Thr Lys Asn Glu íle Val Phe Pro Ala Gly íle Leu
555 560 565
CAG GCA CCA TTC TAC ACA CGC TCC TCA CCC AAG GCC TTA AAC TTT GGT 178
Gin Ala Pro Phe Tyr Thr Arg Ser Ser Pro Lys Ala Leu Asn Phe Gly
570 575 580
GGC ATA GGT GTC GTC GTG GGC CAT GAG CTG ACT CAT GCT TTT GAT GAT 1831
Gly íle Gly Val Val Val Gly His Glu Leu Thr His Ala Phe Asp Asp
585 590 595
CAA GGA CGG GAG TAT GAC AAG GAC GGG AAC CTC CGG CCA TGG TGG AAG 187$
Gin Gly Arg Glu Tyr Asp Lys Asp Gly Asn Leu Arg Pro Trp Trp Lys
600 605 610
AAC TCA TCC GTG GAG GCC TTC AAG CGT CAG ACC GAG TGC ATG GTA GAG 1927
Asn Ser Ser Val Glu Ala Phe Lys Arg Gin Thr Glu Cys Met Val Glu
615 ' 620 625 630
CAG TAC AGC AAC TAC AGC GTG AAC Asn GGG GAG CCG GTG AAC GGG CGG CAC 1975
Gin Tyr Ser Asn Tyr 635 Ser Val Gly Glu 640 Pro Val Asn Gly Arg 645 His
ACC CTG GGG GAG AAC ATC GCC GAC AAC GGG GGT CTC AAG GCG GCC TAT 2023
Thr Leu Gly Glu Asn íle Ala Asp Asn Gly Gly Leu Lys Ala Ala Tyr
650 655 660
CGG GCT TAC CAG AAC TGG GTG AAG AAG AAC GGG GCT GAG CAC TCG CTC 2071
Arg Ala Tyr Gin Asn Trp Val Lys Lys Asn Gly Ala Glu His Ser Leu
665 670 675
CCC ACC CTG «kre». CTC ACC AAT AAC CAG CTC TTC TTC CTG GGC TTT GCA 2119
Pro Thr Leu Gly Leu Thr Asn Asn Gin Leu Phe Phe Leu Gly Phe Ala
680 685 690
CAG GTC TGG TGC TCC GTC CGC ACA CCT GAG AGC TCC CAC GAA GGC CTC 2167
Gin Val Trp Cys Ser val Arg Thr Pro Glu Ser Ser His Glu Gly Leu
695 700 705 710
ATC ACC GAT CCC CAC AGC CCC TCT CGC TTC CGG GTC ATC GGC TCC CTC 2215
íle Thr Asp Pro His Ser Pro Ser Arg Phe Arg Val íle Gly Ser Leu
715 720 72 5
TCC AAT TCC AAG -GAG TTC TCA GAA CAC TTC CGC TGC CCA CCT GGC TCA 2263
Ser Asn Ser Lys Glu Phe Ser Glu His Phe Arg Cys Pro Pro Gly Ser
730 735 740
CCC ATG AAC CCG CCT CAC AAG TGC GAA GTC TGG T AAGGACGAAG 2307
Pro Met Asn Pro Pro His Lys Cys Glu Val Trp
745 750
CGGAGAGAGC CAAGACGGAG GAGGGGAAGG GGCTGAGGAC GAGACCCCCA TCCAGCCTCC ' 2367
AGGGCATTGC TCAGCCCGCT TGGCCACCCG GGGCCCTGCT TCCTCACACT GGCGGGTTTT 2427
CAGCCGGAAC CGAGCCCATG GTGTTGGCTC TCAACGTGAC CCGCAGTCTG ATCCCCTGTG 2487
AAGAGCCGGA CATCCCAGGC ACACGTGTGC GCCACCTTCA GCAGGCATTC GGGTGCTGGG 2547
CTGGTGGCTC ATCAGGCCTG GGCCCCACAC TGACAAGCGC CAGATACGCC ACAAATACCA 2607
CTGTGTCAAA TGCTTTCAAG ATATATTTTT GGGGAAACTA TTTTTTAAAC ACTGTGGAAT 2667
ACACTGGAAA TCTTCAGGGA AAAACACATT TAAACACTTT TTTTTTTAAG CCC
2720 (2) Informácia o SEQ ID NO: 36:
(i) Charakteristika sekvencie:
(A) Dĺžka: 753 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín
(xi) Popis sekvencie: SEQ ID NO: 36 :
Met 1 Ser Thr Tyr Lys Arg Ala 5 Thr Leu Asp 10 Glu Glu Asp Leu Val Asp 15
Ser Leu Ser Glu 20 Gly Asp Ala Tyr Pro 25 Asn Gly Leu Gin Val Asn Phe 30
His Ser Pro Arg 35 Ser Gly Gin Arg 40 Cys Trp Ala Ala Arg Thr Gin Val 45
Glu Lys Arg Leu 50 Val Val Leu 55 Val Val Leu Leu Ala Ala Gly Leu Val 60
Ala 65 Cys Leu Ala Ala Leu Gly 70 íle Gin Tyr Gin Thr Arg Ser Pro Ser 75 80
Val Cys Leu Ser Glu Ala Cys 85 Val Ser Val 90 Thr Ser Ser íle Leu Ser 95
Ser Met Asp Pro 100 Thr Val Asp Pro Cys 105 His Asp Phe Phe Ser Tyr Ala 110
Cys Gly Gly Trp 115 íle Lys Ala Asn 120 Pro Val Pro Asp Gly His Ser Arg 125
Trp Gly Thr Phe 130 Ser Asn Leu 135 Trp Glu His Asn Gin Ala íle íle Lys 140
His 145 Leu Leu Glu Asn Ser Thr 150 Ala Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Lys 155 160
Ala Gin Val Tyr Tyr Arg Ala 165 Cys Met Asn 170 Glu Thr Arg íle Glu Glu 175
Leu Arg Ala Lys .180 Pro Leu Met Glu Leu 185 íle Glu Arg Leu Gly Gly Trp 190
Asn íle Thr Gly 195 Pro Trp Ala Lys 200 Asp Asn Phe Gin Asp Thr Leu Gin 205
Val Val Thr Ala 210 His Tyr Arg 215 Thr Ser Pro Phe Phe Ser Val Tyr Val 220
Ser Ala Asp Ser Lys Asn 225 230
Ser Gly Leu Gly Leu Pro 245
Asn Glu Lys Val Leu Thr 260
Lys Leu Leu Gly Gly Gly 275
Gin. Zle Leu Asp Phe Glu 290
Glu Lys Arg Arg Asp Glu 305 310
Glu Leu Gin Thr Leu Ala 325
Thr íle Phe Tyr Pro Val 340
Tyr Asp Lys Glu iyr Leu 355
Asp Arg Cys Leu Leu Asn 370 '
Thr Ser Ser Phe Leu Asp 385 390
Met Glu Val Met Tyr Gly 405
Phe Cys Val Ser Asp Thr 420
Met Phe Val Lys Ala Thr 435
Glu íle íle Leu Glu íle 450
Leu Lys Trp Met Asp Glu 465 470
Asp Ala íle Tyr Asn Met 485
Lys Glu Leu Asp Lys Val 500
Tyr Phe Glu Asn Ala Met 515
Sér
Ser
Gly
Asp
Thr
295
Glu
Pro
Glu
Glu
Asn
375
Gin
Thr
Glu
Phe
Lys
455
Glu íle
Phe
Arg
Asn Ser
Arg Asp
Tyr Leu 265
Glu Glu 280
Ala Leu
Leu íle
Ala íle íle Asn 345
Gin íle 360
Tyr Met
Arg Phe
Lys Lys
Asn 'Asn 425
Ala Glu 440
Lys Ala
Thr Arg
Gly Tyr
Asn Asp 505
Phe Phe 520
Asn Val íle Gin Val Asp Gin 235 240
Tyr Tyr Leu Asn Lys Thr Glu 250 255
Asn Tyr Met Val Gin Leu Gly 270
Ala íle Arg Pro Gin Met Gin 285
Ala Asn íle Thr íle Pro Gin 300
Tyr His Lys Val Thr Ala Ala 315 320
Asn Trp Leu Pro Phe Leu Asn 330 335
Glu Ser Glu Pro íle Val Val 350
Ser Thr Leu íle Asn Thr Thr 365 íle Trp Asn Leu Val Arg Lys 380
Gin Asp Ala Asp Glu Lys Phe 395 400
Thr Cys Leu Pro Arg Trp Lys 410 415
Leu Gly Phe Ala Leu Gly Pro 430
Asp Ser Lys Ser íle Ala Thr 445
Phe Glu Glu Ser Leu Ser Thr 460
Lys Ser Ala Lys Glu Lys Ala 475 480
Pro Asn Phe íle Met Asp Pro 490 495
Tyr Thr Ala Val Pro Asp Leu 510
Asn Phe Ser Trp Arg Val Thr 525
Ala Asp Gin Leu Arg 530
Pro Pro Met Val Asn 545
Phe Pro Ala Gly íle 565
Lys Ala Leu Asn Phe 580
Thr His Ala Phe Asp 595
Leu Arg Pro Trp Trp 610
Thr Glu Cys Met Val 625
Pro. Val Asn Gly Arg 645
Gly Leu Lys Ala Ala 660
Gly Ala Glu His Ser 675
Phe' Phe Leu Gly Phe 690
Ser Ser His Glu Gly 705
Arg Val íle Gly Ser 725
Arg Cys Pro Pro Gly 740
Lys Ála Pro Asn Arg 535
Ala Tyr Tyr Ser Pro 550
Leu Gin Ala Pro Phe 570
Gly Gly íle Gly Val 585
Asp Gin Gly Arg Glu 600
Lys Asn Ser Ser Val 615
Glu Gin Tyr Ser Asn 630
His Thr Leu Gly Glu 650
Tyr Arg Ala Tyr Gin 665
Leu Pro Thr Leu Gly 680
Ala Gin Val Trp Cys 695
Leu íle Thr Asp Pro 710
Leu Ser Asn Ser Lys 730
Ser Pro Met Asn Pro 745
Asp Gin 540
Thr Lys 555
Tyr Thr
Val Val
Tyr Asp
Glu Ala 620
Tyr Ser 635
Asn íle
Asn Trp
Leu Thr
Ser Val 700
His Ser 715
Glu Phe
Pro His
Trp Ser
Asn Glu
Arg Ser
Gly His 590
Lys Asp 605
Phe Lys
Val Asn
Ala Asp
Val Lys 670
Asn Asn 685
Arg Thr
Pro Ser
Ser Glu
Lys Cys 750
Mec Thr íle Val 560
Ser Pro 575
Glu Leu
Gly Asn
Arg Gin
Gly Glu 640
Asn Gly 655
Lys Asn
Gin Leu
Pro Glu
Arg Phe 720
His Phe 73 5
Glu Val
Trp
7// s~<?f - ?£

Claims (10)

1. Endotelín konvertujúci enzým, vyznačujúci sa tým, že obsahuje v SEQ ID NO: 36 popísanú polypeptidovú sekvenciu alebo parciálnu sekvenciu, ktorá ešte vykazuje enzýmatickú aktivitu endotelín konvertujúceho enzýmu, antigénne vlastnosti alebo afinitu k ligandom.
2. DNA sekvencie, ktoré kódujú endotelín konvertujúci enzým podľa nároku 1 a sú vybrané zo skupiny, zahŕňajúcej
a) DNA-sekvenciu so štruktúrou popísanou v SEQ ID NO: 35,
b) DNA-sekvencie, ktoré kódujú proteín so štruktúrou popísanou v SEQ ID NO: 36.
3. Spôsob génovotechnickej výroby endotelín konvertujúcich enzýmov za použitia DNA sekvencií podľa nároku 2.
4. Spôsob výroby endotelín konvertujúceho enzýmu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa bunky z cicavca stimulujú inhibítorom endotelín konvertujúceho enzýmu na nadmernú produkciu endotelín konvertujúceho enzýmu a z týchto buniek sa izoluje endotelín konvertujúci enzým bežnými spôsobmi.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že sa ako inhibítor použije fosforamidón.
6. Spôsob výroby endotelín konvertujúceho enzýmu podľa nároku
1, vyznačujúci sa tým, že SEQ ID NO: 36 kódujúca hybridizačná sonda, na sa použije parciálna sekvencia alebo sekvenčne komplementárna izoláciu génu pre endotelín konvertujúci enzým z génového poolu a tento gén sa bežnými génovotechnickými metódami exprimuje v hostiteľskom organizme.
7. Použitie endotelín konvertujúceho enzýmu podľa nároku 1 na identifikáciu inhibítorov endotelín konvertujúceho enzým.
8. Použitie endotelín konvertujúceho enzýmu podľa nároku 1 na výrobu protilátok.
9. Použitie DNA-sekvencie podľa nároku 2 na výrobu transgénnych zvierat, ktoré túto DNA-sekvenciu obsahujú v jednej alebo viac extrakópiach alebo u ktorých je normálny EXE-gén vypnutý.
10. Použitie endotelín konvertujúceho enzýmu podľa nároku 1 na výrobu liečiv.
SK598-96A 1993-11-16 1994-11-10 Endothelin-converting enzyme SK59896A3 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19934339100 DE4339100A1 (de) 1993-11-16 1993-11-16 Endothelinkonversionsenzym-1 (ECE-1)
DE19944403665 DE4403665A1 (de) 1994-02-07 1994-02-07 Endothelinkonversionsenzym (ECE)
DE19944412372 DE4412372A1 (de) 1994-04-12 1994-04-12 Endothelinkonversionsenzym (ECE)
PCT/EP1994/003706 WO1995014095A1 (de) 1993-11-16 1994-11-10 Endothelinkonversionsenzym (ece)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK59896A3 true SK59896A3 (en) 1997-07-09

Family

ID=27205762

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK598-96A SK59896A3 (en) 1993-11-16 1994-11-10 Endothelin-converting enzyme

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6066502A (sk)
EP (1) EP0728209B1 (sk)
JP (1) JPH09505733A (sk)
KR (1) KR960705934A (sk)
CN (1) CN1141651A (sk)
AT (1) ATE315656T1 (sk)
AU (1) AU8107094A (sk)
BR (1) BR9408077A (sk)
CA (1) CA2176507A1 (sk)
CZ (1) CZ139496A3 (sk)
DE (1) DE59410427D1 (sk)
FI (1) FI962047A (sk)
HU (1) HUT75554A (sk)
NO (1) NO962023L (sk)
NZ (1) NZ275817A (sk)
PL (1) PL314480A1 (sk)
SK (1) SK59896A3 (sk)
WO (1) WO1995014095A1 (sk)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6255468B1 (en) * 1998-05-07 2001-07-03 Smithkline Beecham Plc MPROT12 polynucleotides and methods thereof
CA2385813A1 (en) 1999-09-24 2001-03-29 Lexicon Genetics Incorporated Human endothelin converting enzyme-like proteins and polynucleotides encoding the same
ATE312351T1 (de) * 2004-02-13 2005-12-15 Brahms Ag Verfahren zur bestimmung der bildung von endothelinen zu zwecken der medizinischen diagnostik, sowie antikörper und kits für die durchführung eines solchen verfahrens
WO2009018209A1 (en) 2007-07-27 2009-02-05 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate ENDOTHELIN SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISMS AND METHODS OF PREDICTING β-ADRENERGIC RECEPTOR TARGETING AGENT EFFICACY

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2966939B2 (ja) * 1990-12-07 1999-10-25 日清製粉株式会社 ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素
EP0575405A1 (en) * 1991-02-04 1993-12-29 Berlex Laboratories, Inc. Endothelin converting enzyme

Also Published As

Publication number Publication date
EP0728209B1 (de) 2006-01-11
PL314480A1 (en) 1996-09-16
DE59410427D1 (en) 2006-04-06
JPH09505733A (ja) 1997-06-10
CN1141651A (zh) 1997-01-29
US6066502A (en) 2000-05-23
CZ139496A3 (en) 1997-10-15
HU9601298D0 (en) 1996-07-29
ATE315656T1 (de) 2006-02-15
NO962023D0 (no) 1996-05-15
HUT75554A (en) 1997-05-28
KR960705934A (ko) 1996-11-08
FI962047A0 (fi) 1996-05-14
FI962047A (fi) 1996-07-12
CA2176507A1 (en) 1995-05-26
BR9408077A (pt) 1997-08-12
NZ275817A (en) 1997-02-24
WO1995014095A1 (de) 1995-05-26
AU8107094A (en) 1995-06-06
NO962023L (no) 1996-07-16
EP0728209A1 (de) 1996-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6423507B1 (en) Human osteoclast-derived cathepsin
Galjart et al. Human lysosomal protective protein has cathepsin A-like activity distinct from its protective function
US20050287546A1 (en) Novel proteases
WO2001083782A2 (en) Novel proteases
US20030108998A1 (en) Aggrecan degrading metallo proteases
EP1171449A1 (en) Apoptosis related genes
US6833248B2 (en) Human caspase-12 materials and methods
SK59896A3 (en) Endothelin-converting enzyme
JPH09149790A (ja) 新規セリンプロテアーゼ
AU737504B2 (en) Novel calpaines, their preparation and use
US6548284B1 (en) Membrane-bound metalloprotease and soluble secreted form thereof
JPH11225765A (ja) 新規セリンプロテアーゼ
EP1895002B1 (en) Novel trypsin family serine proteases
JPH10194991A (ja) インターロイキン−１ベータ変換酵素様アポトーシス性プロテアーゼ
JP2004256436A (ja) アグリカナーゼ−１阻害剤
AU679990C (en) Human osteoclast-derived cathepsin
JP2001046065A (ja) 新規セリンプロテアーゼ
US20040224341A1 (en) Alternatively spliced isoforms of cysteine protease cathepsin K (CTSK)
JP2001046072A (ja) Ａｃｅ類似遺伝子