JP2966939B2 - ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 - Google Patents
ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ビッグエンドセリン−
１をエンドセリン−１に変換する活性を有するヒト細胞
由来エンドセリン変換酵素と、ヒト細胞から本酵素を抽
出および精製することからなる本酵素の製造法に関す
る。
１をエンドセリン−１に変換する活性を有するヒト細胞
由来エンドセリン変換酵素と、ヒト細胞から本酵素を抽
出および精製することからなる本酵素の製造法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】エンドセリン（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）
は１９８８年、柳沢らによって発見された内皮細胞由来
の血管平滑筋収縮因子であり〔Ｍ．Ｙａｎａｇｉｓａｗ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，４１１（１
９８８）〕、ブタ、ウシ、ヒト等においてその存在が確
認されている。また、エンドセリンには、３種のアイソ
ペプチドが存在し、それぞれエンドセリン−１、エンド
セリン−２、エンドセリン−３と命名されている。これ
らのアイソペプチドのうちヒトにおいても最も活性発現
量を多いのはエンドセリン−１であることが確認されて
いる。
は１９８８年、柳沢らによって発見された内皮細胞由来
の血管平滑筋収縮因子であり〔Ｍ．Ｙａｎａｇｉｓａｗ
ａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，４１１（１
９８８）〕、ブタ、ウシ、ヒト等においてその存在が確
認されている。また、エンドセリンには、３種のアイソ
ペプチドが存在し、それぞれエンドセリン−１、エンド
セリン−２、エンドセリン−３と命名されている。これ
らのアイソペプチドのうちヒトにおいても最も活性発現
量を多いのはエンドセリン−１であることが確認されて
いる。
【０００３】エンドセリンは、強力かつ持続的な血管平
滑筋および気管の収縮作用を有し、高血圧症や気道狭窄
を惹起するとともに、高濃度（血中濃度１〜５０ｐｍｏ
ｌ／ｍｌ程度）では、脳卒中、狭心症、心筋梗塞、心不
全、不整脈等の虚血性脳および心疾患、腎炎等の腎障
害、肺、肝、腸等の循環不全、喘息などの疾病を併発さ
せ、動物個体を死に至らしめることもある。
滑筋および気管の収縮作用を有し、高血圧症や気道狭窄
を惹起するとともに、高濃度（血中濃度１〜５０ｐｍｏ
ｌ／ｍｌ程度）では、脳卒中、狭心症、心筋梗塞、心不
全、不整脈等の虚血性脳および心疾患、腎炎等の腎障
害、肺、肝、腸等の循環不全、喘息などの疾病を併発さ
せ、動物個体を死に至らしめることもある。
【０００４】エンドセリン−１は、その前駆体であるビ
ックエンドセリン−１、すなわち次の式：
ックエンドセリン−１、すなわち次の式：
【０００５】
【化１】 で示されるペプチドを、エンドセリン変換酵素によって
ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基２１個からなるペ
プチドである。この加水分解過程が生体内におけるエン
ドセリンの産生に必須であると考えられる。このエンド
セリン変換活性を有する酵素に関する報告はこれまで培
養ウシ血管内皮細胞〔Ｋ．Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ
ｓ １７１，１１９２（１９９０）〕、ウシ副腎髄質
〔Ｔ．Ｓａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １６８，１２
３０（１９９０）〕等についてなされているが、ヒト由
来のエンドセリン変換活性を有する酵素の存在は未だに
明らかにされていない。
ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基２１個からなるペ
プチドである。この加水分解過程が生体内におけるエン
ドセリンの産生に必須であると考えられる。このエンド
セリン変換活性を有する酵素に関する報告はこれまで培
養ウシ血管内皮細胞〔Ｋ．Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ
ｓ １７１，１１９２（１９９０）〕、ウシ副腎髄質
〔Ｔ．Ｓａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １６８，１２
３０（１９９０）〕等についてなされているが、ヒト由
来のエンドセリン変換活性を有する酵素の存在は未だに
明らかにされていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】エンドセリンは上述の
ように著しい生理活性を有する化合物であるが、その前
駆体のビッグエンドセリンから酵素的変換によって生成
するものであるから、この変換酵素の解明によってエン
ドセリンの生体内での生成を抑制する手段を提供するこ
とになり、またこの変換酵素は生体の血管収縮反応の機
構の解析やエンドセリンが原因となる様々な病態の研究
に有力な試薬としての用途が期待されるのである。
ように著しい生理活性を有する化合物であるが、その前
駆体のビッグエンドセリンから酵素的変換によって生成
するものであるから、この変換酵素の解明によってエン
ドセリンの生体内での生成を抑制する手段を提供するこ
とになり、またこの変換酵素は生体の血管収縮反応の機
構の解析やエンドセリンが原因となる様々な病態の研究
に有力な試薬としての用途が期待されるのである。
【０００７】さらにまたこの変換酵素の解明によりエン
ドセリンの分泌過多により誘発される様々な病態（高エ
ンドセリン症）、例えば高血圧、気道狭窄、虚血性脳お
よび心疾患、腎障害、諸臓器例えば肝、肺、腸等の循環
不全、喘息等の予防および治療の手段としてのこの変換
酵素の阻害剤の探索、開発に有力な手段を提供すること
になる。
ドセリンの分泌過多により誘発される様々な病態（高エ
ンドセリン症）、例えば高血圧、気道狭窄、虚血性脳お
よび心疾患、腎障害、諸臓器例えば肝、肺、腸等の循環
不全、喘息等の予防および治療の手段としてのこの変換
酵素の阻害剤の探索、開発に有力な手段を提供すること
になる。
【０００８】かかる理由からヒト細胞中にこれ迄に見出
されていなかったエンドセリン変換酵素の解明とその入
手のための方法の開発が求められていた。
されていなかったエンドセリン変換酵素の解明とその入
手のための方法の開発が求められていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述した課
題、すなわち、ヒト細胞中からエンドセリン変換酵素を
取り出すべく鋭意研究の結果、ヒト細胞中にエンドセリ
ン変換活性を有する酵素が存在することを見出し本発明
を完成したのである。
題、すなわち、ヒト細胞中からエンドセリン変換酵素を
取り出すべく鋭意研究の結果、ヒト細胞中にエンドセリ
ン変換活性を有する酵素が存在することを見出し本発明
を完成したのである。
【００１０】本発明のエンドセリン変換酵素は、胎盤、
血管内皮、腎臓、大脳などのエンドセリンを産生してい
るヒト臓器および組織のヒト細胞を原料としてこれから
抽出して得られるものである。そして上記した臓器およ
び組織の入手の容易さから胎盤が有利に用いられる。し
かしながら、入手の容易さの観点を別にすれば胎盤以外
の臓器または組織からの、あるいは血液からの抽出も可
能であることは勿論である。
血管内皮、腎臓、大脳などのエンドセリンを産生してい
るヒト臓器および組織のヒト細胞を原料としてこれから
抽出して得られるものである。そして上記した臓器およ
び組織の入手の容易さから胎盤が有利に用いられる。し
かしながら、入手の容易さの観点を別にすれば胎盤以外
の臓器または組織からの、あるいは血液からの抽出も可
能であることは勿論である。
【００１１】本発明のエンドセリン変換酵素は、ヒト細
胞に由来し、ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１
番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン残基との
間を加水分解してビッグエンドセリン−１をエンドセリ
ン−１に変換する能力を有し、その至適ｐＨが６．５〜
７．５で、分子量が約１０万、約２４万または５０万以
上であるものにかかる。
胞に由来し、ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１
番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン残基との
間を加水分解してビッグエンドセリン−１をエンドセリ
ン−１に変換する能力を有し、その至適ｐＨが６．５〜
７．５で、分子量が約１０万、約２４万または５０万以
上であるものにかかる。
【００１２】本発明のエンドセリン変換酵素は、臓器ま
たは組織の細胞膜を界面活性剤で処理して抽出液とし、
この抽出液を分別して得られる分子量が約１０万である
ものと、５０万以上であるものとの二つの画分からな
り、あるいはまた臓器または組織をホモジナイズし、得
られたホモジネートから上清を分取し、このホモジネー
ト上清を超遠心分離に付してその上清を取り出して得ら
れる細胞質画分を分別して得られる分子量が約２４万で
あるものと、５０万以上であるものとの二つの画分から
なるものである。
たは組織の細胞膜を界面活性剤で処理して抽出液とし、
この抽出液を分別して得られる分子量が約１０万である
ものと、５０万以上であるものとの二つの画分からな
り、あるいはまた臓器または組織をホモジナイズし、得
られたホモジネートから上清を分取し、このホモジネー
ト上清を超遠心分離に付してその上清を取り出して得ら
れる細胞質画分を分別して得られる分子量が約２４万で
あるものと、５０万以上であるものとの二つの画分から
なるものである。
【００１３】この四つのエンドセリン変換酵素のうち、
ヒト細胞膜由来の分子量が約１０万であるもの（酵素
Ｉ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリン
−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末端
から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン
残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６．５〜７．５ （ｄ） 分子量：約１０００００（ＴＳＫ−Ｇ３０００
ＳＷを用いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリンにより阻害
を受ける。
ヒト細胞膜由来の分子量が約１０万であるもの（酵素
Ｉ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリン
−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末端
から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン
残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６．５〜７．５ （ｄ） 分子量：約１０００００（ＴＳＫ−Ｇ３０００
ＳＷを用いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリンにより阻害
を受ける。
【００１４】またヒト細胞膜由来の分子量が５０万以上
であるもの（酵素ＩＩ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリン
−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末端
から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン
残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６．５〜７．５ （ｄ） 分子量：５０００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３００
０ＳＷを用いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリンにより阻害
を受ける。
であるもの（酵素ＩＩ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリン
−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末端
から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン
残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６．５〜７．５ （ｄ） 分子量：５０００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３００
０ＳＷを用いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリンにより阻害
を受ける。
【００１５】またヒト細胞質由来の分子量が２４万であ
るもの（酵素ＩＩＩ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリン
−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末端
から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン
残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６．５〜７．５ （ｄ） 分子量：２４００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３００
０ＳＷを用いたゲルろ過法により測定）
るもの（酵素ＩＩＩ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリン
−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末端
から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン
残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６．５〜７．５ （ｄ） 分子量：２４００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３００
０ＳＷを用いたゲルろ過法により測定）
【００１６】さらにまたヒト細胞質由来の分子量が５０
万以上であるもの（酵素ＩＶ）の性質は次のとおりであ
る。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリン
−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末端
から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン
残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６．５〜７．５ （ｄ） 分子量：５０００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３００
０ＳＷを用いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリンにより阻害
を受ける。
万以上であるもの（酵素ＩＶ）の性質は次のとおりであ
る。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリン
−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末端
から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン
残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６．５〜７．５ （ｄ） 分子量：５０００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３００
０ＳＷを用いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテート
（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリンにより阻害
を受ける。
【００１７】上記した本発明のエンドセリン変換酵素Ｉ
〜ＩＶは本発明によれば胎盤、血管内皮、腎臓、大脳等
のエンドセリンを産生しているヒト臓器および組織のヒ
ト細胞を原料として得られる。
〜ＩＶは本発明によれば胎盤、血管内皮、腎臓、大脳等
のエンドセリンを産生しているヒト臓器および組織のヒ
ト細胞を原料として得られる。
【００１８】例えばヒト胎盤を原料とする場合、次のよ
うな操作によってこれをうることができる。すなわち、
ヒト胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した後、
これに適当量の緩衝液、例えば２５ｍＭへベス−０．２
５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、通常
用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホモジナ
イザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られたホモ
ジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。
うな操作によってこれをうることができる。すなわち、
ヒト胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した後、
これに適当量の緩衝液、例えば２５ｍＭへベス−０．２
５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、通常
用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホモジナ
イザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られたホモ
ジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る。
【００１９】こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣
は、緩衝液で充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣
を分取し、以後の抽出操作に付す。ここで得られる洗浄
沈渣は、次に述べる胎盤ホモジネート上清を超遠心分離
して得られる沈渣部分と共に細胞膜に由来する成分であ
る。次いでこの洗浄沈渣は界面活性剤、例えばトリトン
Ｘ−１００、コール酸ナトリウム、３−〔（３−コラミ
ドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスル
ホネート（ＣＨＡＰＳ）、シュークロースモノカプレー
ト等を含む緩衝液に浸し、４℃〜８℃にて一晩放置後、
遠心分離して上清を集め、抽出液を得る。
は、緩衝液で充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣
を分取し、以後の抽出操作に付す。ここで得られる洗浄
沈渣は、次に述べる胎盤ホモジネート上清を超遠心分離
して得られる沈渣部分と共に細胞膜に由来する成分であ
る。次いでこの洗浄沈渣は界面活性剤、例えばトリトン
Ｘ−１００、コール酸ナトリウム、３−〔（３−コラミ
ドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスル
ホネート（ＣＨＡＰＳ）、シュークロースモノカプレー
ト等を含む緩衝液に浸し、４℃〜８℃にて一晩放置後、
遠心分離して上清を集め、抽出液を得る。
【００２０】一方、分取した胎盤ホモジネート上清は、
更に５００００ｇ〜１０００００ｇの超遠心分離をして
沈渣部分であるマイクロゾーム分画を得る。このマイク
ロゾーム分画を洗浄後、上記と同様にして界面活性剤抽
出を行った後、超遠心分離して上清を集め、抽出液を得
る。
更に５００００ｇ〜１０００００ｇの超遠心分離をして
沈渣部分であるマイクロゾーム分画を得る。このマイク
ロゾーム分画を洗浄後、上記と同様にして界面活性剤抽
出を行った後、超遠心分離して上清を集め、抽出液を得
る。
【００２１】また、上記したように分取した胎盤ホモジ
ネート上清を、更に５００００ｇ〜１０００００ｇの超
遠心分離にかけて得られた上清を回収することにより、
細胞質画分を得る。
ネート上清を、更に５００００ｇ〜１０００００ｇの超
遠心分離にかけて得られた上清を回収することにより、
細胞質画分を得る。
【００２２】本酵素Ｉ〜ＩＶの精製は、上述の細胞膜画
分または細胞質画分を通常の酵素の精製に用いる手段を
利用することにより達成できる。例えば、アサヒバック
ＨＣ−Ｎ２００（旭化成工業社製）によるクロマトグラ
フィー、Ｑ−セファロースハイパフォーマンス（ファル
マシア社製）によるクロマトグラフィー、フェニルスー
パーロース（ファルマシア社製）によるクロマトグラフ
ィー、スーパーデックス２００（ファルマシア社製）に
よるゲルろ過、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）
によるゲルろ過等の手段を適宜組み合わせ、ビッグエン
ドセリン−１をエンドセリン−１に変換する活性を指標
として、本発明のエンドエリン変換酵素を精製すること
ができる。
分または細胞質画分を通常の酵素の精製に用いる手段を
利用することにより達成できる。例えば、アサヒバック
ＨＣ−Ｎ２００（旭化成工業社製）によるクロマトグラ
フィー、Ｑ−セファロースハイパフォーマンス（ファル
マシア社製）によるクロマトグラフィー、フェニルスー
パーロース（ファルマシア社製）によるクロマトグラフ
ィー、スーパーデックス２００（ファルマシア社製）に
よるゲルろ過、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）
によるゲルろ過等の手段を適宜組み合わせ、ビッグエン
ドセリン−１をエンドセリン−１に変換する活性を指標
として、本発明のエンドエリン変換酵素を精製すること
ができる。
【００２３】本発明のエンドセリン変換酵素Ｉ〜ＩＶの
活性は力価によって表現されるが、この力価の測定はつ
ぎのようにして行なわれる。
活性は力価によって表現されるが、この力価の測定はつ
ぎのようにして行なわれる。
【００２４】（１） 酵素活性の測定法 ４μｇ／ｍｌのビッグエンドセリン−１溶液１ｍｌ（１
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）に０．１ｍ
ｌの酵素溶液を添加し、３７℃にて３時間反応させる。
反応後１００℃１０分間の処理を行い反応を停止させ
る。次いで、生じたエンドセリン−１をサンドイッチ−
ＥＩＡ法により定量する。上記反応条件にて１時間に１
ｐｍｏｌのビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１
に変換する酵素活性をＩＵ（単位）とする。
００ｍＭトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）に０．１ｍ
ｌの酵素溶液を添加し、３７℃にて３時間反応させる。
反応後１００℃１０分間の処理を行い反応を停止させ
る。次いで、生じたエンドセリン−１をサンドイッチ−
ＥＩＡ法により定量する。上記反応条件にて１時間に１
ｐｍｏｌのビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１
に変換する酵素活性をＩＵ（単位）とする。
【００２５】（２） サンドイッチ−ＥＩＡ法 抗エンドセリン−１モノクローナル抗体を固相化した９
６穴マイクロプレートに、検体および既知濃度のエンド
セリン−１標準液を加え反応させる。マイクロプレート
を洗浄後、ビオチン標準抗エンドセリン−１ポリクロー
ナル抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジンを加え反
応させる。マイクロプレートを洗浄後、結合したペルオ
キシダーゼ活性を測定する。既知濃度のエンドセリン−
１標準液による検量線から検体中のエンドセリン−１を
定量する。
６穴マイクロプレートに、検体および既知濃度のエンド
セリン−１標準液を加え反応させる。マイクロプレート
を洗浄後、ビオチン標準抗エンドセリン−１ポリクロー
ナル抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジンを加え反
応させる。マイクロプレートを洗浄後、結合したペルオ
キシダーゼ活性を測定する。既知濃度のエンドセリン−
１標準液による検量線から検体中のエンドセリン−１を
定量する。
【００２６】（３） 抗エンドセリン−１モノクローナ
ル抗体の作成 エンドセリン−１とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をマ
ウスに免疫し、常法に従い、免疫マウス脾細胞とマウス
ミエローマと細胞融合し、ハイブリドーマを作成、エン
ドセリン−１に対する抗体を産生するハイブリドーマを
クローン化する。クローン化されたハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体をプロテインＡカラムで精製
し、抗エンドセリン−１モノクローナル抗体を作成す
る。
ル抗体の作成 エンドセリン−１とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をマ
ウスに免疫し、常法に従い、免疫マウス脾細胞とマウス
ミエローマと細胞融合し、ハイブリドーマを作成、エン
ドセリン−１に対する抗体を産生するハイブリドーマを
クローン化する。クローン化されたハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体をプロテインＡカラムで精製
し、抗エンドセリン−１モノクローナル抗体を作成す
る。
【００２７】（４） 抗エンドセリン−１ポリクローナ
ル抗体 エンドセリン−１とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をウ
サギに免疫し抗血清を得る。抗血清からプロテインＡカ
ラムで抗体画分を得る。抗体画分をビッグエンドセリン
−１固定化カラムに付し、カラムに結合した画分を集
め、抗エンドセリン−１ポリクローナル抗体を作成す
る。得られた抗エンドセリン−１ポリクーロナル抗体を
ビオチン化し、ビオチン標識抗エンドセリン−１ポリク
ローナル抗体を作成する。
ル抗体 エンドセリン−１とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をウ
サギに免疫し抗血清を得る。抗血清からプロテインＡカ
ラムで抗体画分を得る。抗体画分をビッグエンドセリン
−１固定化カラムに付し、カラムに結合した画分を集
め、抗エンドセリン−１ポリクローナル抗体を作成す
る。得られた抗エンドセリン−１ポリクーロナル抗体を
ビオチン化し、ビオチン標識抗エンドセリン−１ポリク
ローナル抗体を作成する。
【００２８】次ぎに、本発明のエンドセリン変換酵素Ｉ
〜ＩＶの酵素化学的特性について述べる。
〜ＩＶの酵素化学的特性について述べる。
【００２９】（ａ）作用 ビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１に変換す
る。
る。
【００３０】（ｂ） 基質特異性 ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間を加水分解
する。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にお
いてビッグエンドセリン−１に本酵素を３７℃にて３時
間作用させ、生成物をイナートシルＯＤＳカラム（ジー
エルサイエンス社製）を用いた逆相クロマトグラフィー
に付し、０．０５％トリフルオロ酢酸−１０％アセトニ
トリル溶液から０．０５％トリフルオロ酢酸−５０％ア
セトニトリル溶液への直線的濃度勾配により分析したと
ころ、ビッグエンドセリン−１のピーク以外に２つのピ
ークが出現し、それらのピークの溶出位置は、エンドセ
リン−１およびビッグエンドセリン−１のＮ末端より２
２番目のバリンから３８番目のセリンまでのビッグエン
ドセリン−１の部分ペプチドと同一であった。この結果
より、本変換酵素によりビッグエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間が加水分解されていることがわかる。
トファン残基と２２番目のバリン残基との間を加水分解
する。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）にお
いてビッグエンドセリン−１に本酵素を３７℃にて３時
間作用させ、生成物をイナートシルＯＤＳカラム（ジー
エルサイエンス社製）を用いた逆相クロマトグラフィー
に付し、０．０５％トリフルオロ酢酸−１０％アセトニ
トリル溶液から０．０５％トリフルオロ酢酸−５０％ア
セトニトリル溶液への直線的濃度勾配により分析したと
ころ、ビッグエンドセリン−１のピーク以外に２つのピ
ークが出現し、それらのピークの溶出位置は、エンドセ
リン−１およびビッグエンドセリン−１のＮ末端より２
２番目のバリンから３８番目のセリンまでのビッグエン
ドセリン−１の部分ペプチドと同一であった。この結果
より、本変換酵素によりビッグエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間が加水分解されていることがわかる。
【００３１】（ｃ） 至適ｐＨ 本エンドセリン変換酵素の至適ｐＨの測定は、各々のｐ
Ｈの５０ｍＭ緩衝液にて調製したビッグエンドセリン−
１溶液に、本エンドセリン変換酵素を加え、３７℃で反
応することによって行った。使用した緩衝液は、 ｐＨ２．０〜７．５ クエン酸−リン酸緩衝液 ｐＨ７．５〜９．０ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ９．０〜１２．０ 炭酸水素ナトリウム−水酸化ナ
トリウム緩衝液 である。測定の結果、本エンドセリン変換酵素Ｉ〜ＩＶ
は、ｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を
示した。
Ｈの５０ｍＭ緩衝液にて調製したビッグエンドセリン−
１溶液に、本エンドセリン変換酵素を加え、３７℃で反
応することによって行った。使用した緩衝液は、 ｐＨ２．０〜７．５ クエン酸−リン酸緩衝液 ｐＨ７．５〜９．０ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ９．０〜１２．０ 炭酸水素ナトリウム−水酸化ナ
トリウム緩衝液 である。測定の結果、本エンドセリン変換酵素Ｉ〜ＩＶ
は、ｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を
示した。
【００３２】（ｄ） 分子量 ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（東ソー社製）のカラムによる
ゲルろ過法のカラムクロマトグラフィーにより分子量既
知の標準品と共に分離、分画を行い、本エンドセリン変
換酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、の分子量を推定したと
ころ、それぞれ約１０万、５０万以上、約２４万および
５０万以上であった。
ゲルろ過法のカラムクロマトグラフィーにより分子量既
知の標準品と共に分離、分画を行い、本エンドセリン変
換酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、の分子量を推定したと
ころ、それぞれ約１０万、５０万以上、約２４万および
５０万以上であった。
【００３３】（ｅ） 阻害剤 本酵素の、ビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１
に変換する変換活性に対する各種阻害剤の効果を調べ
た。各種阻害剤を含む１００μｌの反応後（５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）中において本酵素を３
７℃、３０分間インキュベートし、残存する酵素活性を
前述の方法にて測定した。各阻害剤存在下における残存
活性を、無処理の活性を１００とした相対活性で表した
結果を表で示す。表１は酵素Ｉ、表２は酵素ＩＩ、そし
て表３は酵素ＩＶについての結果である。
に変換する変換活性に対する各種阻害剤の効果を調べ
た。各種阻害剤を含む１００μｌの反応後（５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）中において本酵素を３
７℃、３０分間インキュベートし、残存する酵素活性を
前述の方法にて測定した。各阻害剤存在下における残存
活性を、無処理の活性を１００とした相対活性で表した
結果を表で示す。表１は酵素Ｉ、表２は酵素ＩＩ、そし
て表３は酵素ＩＶについての結果である。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【００３７】つぎに、実施例によって本発明を更に詳細
に説明するが、本発明は、これらによって限定されるも
のではない。
に説明するが、本発明は、これらによって限定されるも
のではない。
【００３８】
【実施例１】胎盤細胞膜画分の調製 ヒト細胞（約５ｇ）より、膜等を除去し、生理食塩水で
充分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に、２
５ｍＭへペス−０．２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ
７．４）２０ｍｌを加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒ
ｏｎ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得ら
れたホモジネートを１０００ｇ、２０分間遠心分離、上
清を分取した。この上清を１００００ｇ、２０分間、再
び遠心分離し、その上清及び沈渣を得た。
充分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に、２
５ｍＭへペス−０．２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ
７．４）２０ｍｌを加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒ
ｏｎ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得ら
れたホモジネートを１０００ｇ、２０分間遠心分離、上
清を分取した。この上清を１００００ｇ、２０分間、再
び遠心分離し、その上清及び沈渣を得た。
【００３９】こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣
に、上記と同一の緩衝液１０ｍｌを加え、充分洗浄し、
再度１００００ｇ、２０分間の遠心分離を行い、洗浄沈
渣を分取した。得られた洗浄沈渣に、１０ｍｌの０．５
％トリトンＸ−１００含有２５ｍＭへペス−０．２５Ｍ
シュークロース緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、４℃にて
一夜放置後、１０００ｇ、２０分間遠心分離して、抽出
液約９ｍｌを得た。
に、上記と同一の緩衝液１０ｍｌを加え、充分洗浄し、
再度１００００ｇ、２０分間の遠心分離を行い、洗浄沈
渣を分取した。得られた洗浄沈渣に、１０ｍｌの０．５
％トリトンＸ−１００含有２５ｍＭへペス−０．２５Ｍ
シュークロース緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、４℃にて
一夜放置後、１０００ｇ、２０分間遠心分離して、抽出
液約９ｍｌを得た。
【００４０】一方、胎盤ホモジネート上清は、１０００
００ｇ、２時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した。
この超遠心分離沈渣に、２ｍｌの０．５％トリトン−Ｘ
１００含有２５ｍＭへペス−０．２５Ｍシュークロース
緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、４℃にて一夜放置後、再
び１０００００ｇ、２時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約１．５ｍｌを得た。胎盤ホモジネート沈渣
より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心分
離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜画分約１
０．５ｍｌを得た。
００ｇ、２時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した。
この超遠心分離沈渣に、２ｍｌの０．５％トリトン−Ｘ
１００含有２５ｍＭへペス−０．２５Ｍシュークロース
緩衝液（ｐＨ７．４）を加え、４℃にて一夜放置後、再
び１０００００ｇ、２時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約１．５ｍｌを得た。胎盤ホモジネート沈渣
より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心分
離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜画分約１
０．５ｍｌを得た。
【００４１】
【実施例２】精製酵素（分子量５０万以上の酵素ＩＩ）
の調製
の調製
【００４２】（ｉ） 実施例１で得られた細胞膜画分約
１０．５ｍｌを、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したアサヒパックＨＣ−Ｎ２００（旭
化成工業社製）のカラムに付し、同緩衝液にて溶出さ
せ、試料中のトリトンＸ−１００を除去した。トリンＸ
−１００を除去した細胞膜画分を、１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ−セファロース
ハイパフォーマンス（ファルマシア社製）のカラム（φ
２．６×１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液にて充分洗浄
した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度を直線的に０
〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を溶出し、酵素
活性を有する画文を集めた。得られた活性画分をダイア
フローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて５．０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、
０．１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したスーパーテックス２００（ファ
ルマシア社製）のカラム（φ２．６×６０ｃｍ）に付
し、同一緩衝液で溶出した。
１０．５ｍｌを、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）で平衡化したアサヒパックＨＣ−Ｎ２００（旭
化成工業社製）のカラムに付し、同緩衝液にて溶出さ
せ、試料中のトリトンＸ−１００を除去した。トリンＸ
−１００を除去した細胞膜画分を、１０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ−セファロース
ハイパフォーマンス（ファルマシア社製）のカラム（φ
２．６×１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液にて充分洗浄
した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度を直線的に０
〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を溶出し、酵素
活性を有する画文を集めた。得られた活性画分をダイア
フローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて５．０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、
０．１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したスーパーテックス２００（ファ
ルマシア社製）のカラム（φ２．６×６０ｃｍ）に付
し、同一緩衝液で溶出した。
【００４３】（ｉｉ） 上記した（ｉ）の操作によって
溶出した溶出体積１００ｍｌ〜１５ｍｌの付近をフラク
ショネーションし、これらのフラクションについて前述
の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクションを
合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイアフロ
ーメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を
用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＩを得た。
尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩの総活性は
約３５０Ｕであった。
溶出した溶出体積１００ｍｌ〜１５ｍｌの付近をフラク
ショネーションし、これらのフラクションについて前述
の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクションを
合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイアフロ
ーメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を
用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＩを得た。
尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩの総活性は
約３５０Ｕであった。
【００４４】（ｉｉｉ） このようにして得られた精製
エンドセリン変換酵素ＩＩの１００μｌを、０．１Ｍト
リス−塩酸、０．８Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）
で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×
６０ｃｍ、東ソー社製）のカラムによるゲルろ過法カラ
ムクロマトグラフィーに付し、同一緩衝液にて、分子量
既知の標準品（グルタメートデヒドロゲナーゼ：分子量
２９万、ラクテートデヒドロゲナーゼ：分子量１４万、
エノラーゼ：分子量６．７万、アデニレートキナーゼ：
分子量３．２万、チトクロムＣ：分子量１．２４万）と
共に分離、分画を行い、各画分のエンドセリン変換活性
を前述の方法で測定し、変換活性ピークの溶出位置よ
り、本エンドセリン変換酵素ＩＩの分子量を推定したと
ころ５０万以上であった。結果を図１に示す。
エンドセリン変換酵素ＩＩの１００μｌを、０．１Ｍト
リス−塩酸、０．８Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）
で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×
６０ｃｍ、東ソー社製）のカラムによるゲルろ過法カラ
ムクロマトグラフィーに付し、同一緩衝液にて、分子量
既知の標準品（グルタメートデヒドロゲナーゼ：分子量
２９万、ラクテートデヒドロゲナーゼ：分子量１４万、
エノラーゼ：分子量６．７万、アデニレートキナーゼ：
分子量３．２万、チトクロムＣ：分子量１．２４万）と
共に分離、分画を行い、各画分のエンドセリン変換活性
を前述の方法で測定し、変換活性ピークの溶出位置よ
り、本エンドセリン変換酵素ＩＩの分子量を推定したと
ころ５０万以上であった。結果を図１に示す。
【００４５】
【実施例３】基質特異性 実施例２で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩ １
ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４０
μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物をイ
ナートシルＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス社製）を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％トリ
フルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から０．０５
％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液への直
線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセリ
ン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグ
エンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから３
８番目のセリンまでのビックエンドセリン−１の部分ペ
プチドと同一であった。
ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４０
μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物をイ
ナートシルＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス社製）を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％トリ
フルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から０．０５
％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液への直
線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセリ
ン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグ
エンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから３
８番目のセリンまでのビックエンドセリン−１の部分ペ
プチドと同一であった。
【００４６】
【実施例４】至適ｐＨの測定 各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２．０〜７．５クエ
ン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０トリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９．０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセリ
ン−１溶液２００μｌに、実施例２で得られた精製エン
ドセリン変換酵素ＩＩ ５０μｌを加え、３７℃にて３
時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した
結果、図２に示すように、本エンドセリン変換酵素ＩＩ
はｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を示
した。
ン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０トリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９．０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセリ
ン−１溶液２００μｌに、実施例２で得られた精製エン
ドセリン変換酵素ＩＩ ５０μｌを加え、３７℃にて３
時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した
結果、図２に示すように、本エンドセリン変換酵素ＩＩ
はｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を示
した。
【００４７】
【実施例５】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む１００μｌの反応後（５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）中において、実施例２で得
られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩを３７℃にて３０
分間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍ
ｌビッグエンドセリン−１溶液４μｌを添加し、３７℃
にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分間の
処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−１を
前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した。
各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を１
００とした相対活性で表し、表２に示した。
−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）中において、実施例２で得
られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩを３７℃にて３０
分間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍ
ｌビッグエンドセリン−１溶液４μｌを添加し、３７℃
にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分間の
処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−１を
前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した。
各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を１
００とした相対活性で表し、表２に示した。
【００４８】
【実施例６】精製酵素（分子量約１０万の酵素Ｉ）の調
製
製
【００４９】（ｉ） 実施例１で得られた細胞膜画分に
ついて、実施例２（ｉ）に記載の操作を行なった。
ついて、実施例２（ｉ）に記載の操作を行なった。
【００５０】（ｉｉ） 上述した（ｉ）の操作によって
溶出した溶出体積１７０ｍｌ〜２１０ｍｌの付近をフラ
クショネーションし、これらのフラクションについて前
述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクション
を合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイアフ
ローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）
を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素Ｉを得た。
尚、得られた精製エンドセリン変換酵素Ｉの総活性は約
３５０Ｕであった。
溶出した溶出体積１７０ｍｌ〜２１０ｍｌの付近をフラ
クショネーションし、これらのフラクションについて前
述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクション
を合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイアフ
ローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）
を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素Ｉを得た。
尚、得られた精製エンドセリン変換酵素Ｉの総活性は約
３５０Ｕであった。
【００５１】（ｉｉｉ） このようにして得られた精製
エンドセリン変換酵素Ｉの１０μｌを、０．１Ｍトリス
−塩酸、０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×６０
ｃｍ、東ソー社製）のカラムによるゲルろ過法のカラム
クロマトグラフィーに付し、同一緩衝液にて、分子量既
知の標準品（グルタメートデヒドロゲナーゼ：分子量２
９万、ラクテートデヒドロゲナーゼ：分子量１４万、エ
ノラーゼ：分子量６．７万、アデニレートキナーゼ：分
子量３．２万、チトクロムＣ：分子量１．２４万）と共
に分離、分画を行い、各画分のエンドセリン変換活性を
前述の方法で測定し、変換活性ピークの溶出位置より、
本エンドセリン変換酵素Ｉの分子量を推定したところ約
１０万であった。結果を図３に示す。
エンドセリン変換酵素Ｉの１０μｌを、０．１Ｍトリス
−塩酸、０．３Ｍ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×６０
ｃｍ、東ソー社製）のカラムによるゲルろ過法のカラム
クロマトグラフィーに付し、同一緩衝液にて、分子量既
知の標準品（グルタメートデヒドロゲナーゼ：分子量２
９万、ラクテートデヒドロゲナーゼ：分子量１４万、エ
ノラーゼ：分子量６．７万、アデニレートキナーゼ：分
子量３．２万、チトクロムＣ：分子量１．２４万）と共
に分離、分画を行い、各画分のエンドセリン変換活性を
前述の方法で測定し、変換活性ピークの溶出位置より、
本エンドセリン変換酵素Ｉの分子量を推定したところ約
１０万であった。結果を図３に示す。
【００５２】
【実施例７】基礎特異性 実施例６で得られた精製エンドセリン変換酵素Ｉ １ｍ
ｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン−１溶液４
０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物を
イナートシルＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス社製）
を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％ト
リフルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から０．０
５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液への
直線的濃度勾配により分析したところ、ビッグエンドセ
リン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。それ
らのピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッ
グエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから
３８番目のセリンまでのビッグエンドセリン−１の部分
ペプチドと同一であった。
ｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン−１溶液４
０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物を
イナートシルＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス社製）
を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％ト
リフルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から０．０
５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液への
直線的濃度勾配により分析したところ、ビッグエンドセ
リン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。それ
らのピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッ
グエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから
３８番目のセリンまでのビッグエンドセリン−１の部分
ペプチドと同一であった。
【００５３】
【実施例８】至適ｐＨの測定 各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２．０〜７．５クエ
ン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０トリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９．０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセリ
ン−１溶液２００μｌに、実施例６で得られた精製エン
ドセリン変換酵素Ｉ ５０μｌを加え、３７℃にて３時
間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した結
果、図４に示すように、本エンドセリン変換酵素ＩＩは
ｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を示し
た。
ン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０トリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９．０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセリ
ン−１溶液２００μｌに、実施例６で得られた精製エン
ドセリン変換酵素Ｉ ５０μｌを加え、３７℃にて３時
間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した結
果、図４に示すように、本エンドセリン変換酵素ＩＩは
ｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を示し
た。
【００５４】
【実施例９】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む１００μｌの反応液（５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中において、実施例６で得
られた精製エンドセリン変換酵素Ｉを３７℃にて３０分
間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍｌ
のビッグエンドセリン−１溶液４μｌを添加し、３７℃
にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分間の
処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−１を
前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した。
各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を１
００とした相対活性で表し、表１に示した。
−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中において、実施例６で得
られた精製エンドセリン変換酵素Ｉを３７℃にて３０分
間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍｌ
のビッグエンドセリン−１溶液４μｌを添加し、３７℃
にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分間の
処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−１を
前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した。
各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を１
００とした相対活性で表し、表１に示した。
【００５５】
【実施例１０】胎盤細胞質画分の調製 ヒト胎盤（約５ｇ）より、膜等を除去し、生理食塩水で
十分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に２５
ｍＭへペス−０．２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ
７．４）２０ｍｌを加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒ
ｏｎ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得ら
れたホモジネートを１０００ｇ、２０分間遠心分離し、
上清を分取した。この上清を１００００ｇ、２０分間、
再び遠心分離し、その上清を分取した。得られた上清を
１０００００ｇ、２時間超遠心分離し、約２０ｍｌの上
清を回収、細胞質画分とした。
十分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に２５
ｍＭへペス−０．２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ
７．４）２０ｍｌを加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒ
ｏｎ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得ら
れたホモジネートを１０００ｇ、２０分間遠心分離し、
上清を分取した。この上清を１００００ｇ、２０分間、
再び遠心分離し、その上清を分取した。得られた上清を
１０００００ｇ、２時間超遠心分離し、約２０ｍｌの上
清を回収、細胞質画分とした。
【００５６】
【実施例１１】精製酵素（分子量５０万以上の酵素Ｉ
Ｖ）の調製 実施例１０で得られた細胞質画分約２０ｍｌを、１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ−
セファロースハイパフォーマンス（ファルマシア社製）
のカラム（φ２．６×１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度
を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を
溶出し、酵素活性を有する画分を集めた。
Ｖ）の調製 実施例１０で得られた細胞質画分約２０ｍｌを、１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ−
セファロースハイパフォーマンス（ファルマシア社製）
のカラム（φ２．６×１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度
を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を
溶出し、酵素活性を有する画分を集めた。
【００５７】得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて５．
０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、予め０．１Ｍトリ
ス−塩酸、０．３ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したスーパーテックス２００（ファルマシア社製）
のカラム（φ２．６×６０ｃｍ）に付し、同一緩衝液で
溶出し、溶出体積１００ｍｌ〜１５０ｍｌの付近をフラ
クショネーションし、これらのフラクションについて前
述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクション
を合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイアフ
ローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）
を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＶを得
た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶの総活
性は約３５０Ｕであった。
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて５．
０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、予め０．１Ｍトリ
ス−塩酸、０．３ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したスーパーテックス２００（ファルマシア社製）
のカラム（φ２．６×６０ｃｍ）に付し、同一緩衝液で
溶出し、溶出体積１００ｍｌ〜１５０ｍｌの付近をフラ
クショネーションし、これらのフラクションについて前
述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクション
を合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイアフ
ローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）
を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＶを得
た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶの総活
性は約３５０Ｕであった。
【００５８】
【実施例１２】基質特異性 実施例１１で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶ
１ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン−１溶
液４０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成
物をイナートシルＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス社
製）を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５
％トリフルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から
０．０５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶
液への直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエ
ンドセリン−１のピーク以外に２つのピークが出現し
た。それらのピークの溶出位置は、エンドセリン−１お
よびビッグエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバ
リンから３８番目のセリンまでのビックエンドセリン−
１の部分ペプチドと同一であった。
１ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン−１溶
液４０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成
物をイナートシルＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス社
製）を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５
％トリフルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から
０．０５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶
液への直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエ
ンドセリン−１のピーク以外に２つのピークが出現し
た。それらのピークの溶出位置は、エンドセリン−１お
よびビッグエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバ
リンから３８番目のセリンまでのビックエンドセリン−
１の部分ペプチドと同一であった。
【００５９】
【実施例１３】至適ｐＨの測定 各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２．０〜７．５クエ
ン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０トリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９．０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセリ
ン−１溶液２００μｌに、実施例１１で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素ＩＶ ５０μｌを加え、３７℃にて
３時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定し
た結果、図５に示すように、本エンドセリン変換酵素Ｉ
ＶはｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を
示した。
ン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０トリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９．０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセリ
ン−１溶液２００μｌに、実施例１１で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素ＩＶ ５０μｌを加え、３７℃にて
３時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定し
た結果、図５に示すように、本エンドセリン変換酵素Ｉ
ＶはｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を
示した。
【００６０】
【実施例１４】分子量の測定 実施例１１で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶの
１００μｌを、０．１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０
００ＳＷ（７．５ｍｍφ×６０ｃｍ、東ソー社製）のカ
ラムによるゲルろ過法のカラムクロマトグラフィーに付
し、同一緩衝液にて、分子量既知の標準品（グルタメー
トデヒドロゲナーゼ：分子量２９万、ラクテートヒドロ
ゲナーゼ：分子量１４万、エノラーゼ：分子量６．７
万、アデニレートキナーゼ：分子量３．２万、チトクロ
ムＣ：分子量１．２４万）と共に分離、分画を行い、各
画分のエンドセリン変換活性を前述の方法で測定し、変
換活性ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換酵素
ＩＶの分子量を推定したところ５０万以上であった。結
果を図６に示す。
１００μｌを、０．１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０
００ＳＷ（７．５ｍｍφ×６０ｃｍ、東ソー社製）のカ
ラムによるゲルろ過法のカラムクロマトグラフィーに付
し、同一緩衝液にて、分子量既知の標準品（グルタメー
トデヒドロゲナーゼ：分子量２９万、ラクテートヒドロ
ゲナーゼ：分子量１４万、エノラーゼ：分子量６．７
万、アデニレートキナーゼ：分子量３．２万、チトクロ
ムＣ：分子量１．２４万）と共に分離、分画を行い、各
画分のエンドセリン変換活性を前述の方法で測定し、変
換活性ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換酵素
ＩＶの分子量を推定したところ５０万以上であった。結
果を図６に示す。
【００６１】
【実施例１５】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む１００μｌの反応液（５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）中において、実施例１１で
得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶを３７℃にて３
０分間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／
ｍｌのビッグエンドセリン−１溶液４μｌを添加し、３
７℃にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分
間の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−
１を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定し
た。各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性
を１００とした相対活性で表し、表３に示した。
−塩酸緩衝液、ｐＨ７．０）中において、実施例１１で
得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶを３７℃にて３
０分間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／
ｍｌのビッグエンドセリン−１溶液４μｌを添加し、３
７℃にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分
間の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−
１を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定し
た。各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性
を１００とした相対活性で表し、表３に示した。
【００６２】
【実施例１６】精製酵素（分子量２４万の酵素ＩＩＩ）
の調製 実施例１０で得られた細胞質画分約２０ｍｌを、１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ−
セファロースハイパフォーマンス（ファルマシア社製）
のカラム（φ２．６×１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度
を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を
溶出し、酵素活性を有する画分を集めた。
の調製 実施例１０で得られた細胞質画分約２０ｍｌを、１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ−
セファロースハイパフォーマンス（ファルマシア社製）
のカラム（φ２．６×１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度
を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を
溶出し、酵素活性を有する画分を集めた。
【００６３】得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて５．
０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、予め０．１Ｍトリ
ス−塩酸、０．３ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したスーパーテックス２００（ファルマシア社製）
のカラム（φ２．６×６０ｃｍ）に付し、同一緩衝液で
溶出し、溶出体積１６０ｍｌ〜１８０ｍｌの付近をフラ
クショネーションし、これらのフラクションについて前
述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクション
を合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイアフ
ローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）
を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩを得
た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩの総
活性は約１５０Ｕであった。
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて５．
０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、予め０．１Ｍトリ
ス−塩酸、０．３ＭＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平
衡化したスーパーテックス２００（ファルマシア社製）
のカラム（φ２．６×６０ｃｍ）に付し、同一緩衝液で
溶出し、溶出体積１６０ｍｌ〜１８０ｍｌの付近をフラ
クショネーションし、これらのフラクションについて前
述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクション
を合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイアフ
ローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）
を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩを得
た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩの総
活性は約１５０Ｕであった。
【００６４】
【実施例１７】基礎特異性 実施例１６で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩ
１ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン−１
溶液４０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、精
製物をイナートシルＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス
社製）を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０
５％トリフルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から
０．０５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶
液への直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエ
ンドセリン−１のピーク以外に２つのピークが出現し
た。それらのピークの溶出位置は、エンドセリン−１お
よびビッグエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバ
リンから３８番目のセリンまでのビッグエンドセリン−
１の部分ペプチドと同一であった。
１ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン−１
溶液４０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、精
製物をイナートシルＯＤＳカラム（ジーエルサイエンス
社製）を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０
５％トリフルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から
０．０５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶
液への直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエ
ンドセリン−１のピーク以外に２つのピークが出現し
た。それらのピークの溶出位置は、エンドセリン−１お
よびビッグエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバ
リンから３８番目のセリンまでのビッグエンドセリン−
１の部分ペプチドと同一であった。
【００６５】
【実施例１８】至適ｐＨの測定 各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２．０〜７．５クエ
ン−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０トリス−塩酸緩
衝液、ｐＨ９．０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水酸
化ナトリム緩衝液）にて調製したビッグエンドセリン−
１溶液２００μｌに、実施例１６で得られた精製エンド
セリン変換酵素ＩＩＩ ５０μｌを加え、３７℃にて３
時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した
結果、図７に示すように、本エンドセリン変換酵素ＩＩ
ＩはｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を
示した。
ン−リン酸緩衝液、ｐＨ７．５〜９．０トリス−塩酸緩
衝液、ｐＨ９．０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水酸
化ナトリム緩衝液）にて調製したビッグエンドセリン−
１溶液２００μｌに、実施例１６で得られた精製エンド
セリン変換酵素ＩＩＩ ５０μｌを加え、３７℃にて３
時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した
結果、図７に示すように、本エンドセリン変換酵素ＩＩ
ＩはｐＨ６．５〜７．５の範囲において最も強い活性を
示した。
【００６６】
【実施例１９】分子量の測定 実施例１６で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩ
の１００μｌを、０．１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３
０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×６０ｃｍ、東ソー社製）の
カラムによるゲルろ過法のカラムクロマトグラフィーに
付し、同一緩衝液にて、分子量既知の標準品（グルタメ
ートデヒドロゲナーゼ：分子量２９万、ラクテートヒド
ロゲナーゼ：分子量１４万、エノラーゼ：分子量６．７
万、アデニレートキナーゼ：分子量３．２万、チトクロ
ムＣ：分子量１．２４万）と共に分離、分画を行い、各
画分のエンドセリン変換活性を前述の方法で測定し、変
換活性ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換酵素
ＩＩＩの分子量を推定したところ約２４万であった。結
果を図８に示す。
の１００μｌを、０．１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ Ｎ
ａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３
０００ＳＷ（７．５ｍｍφ×６０ｃｍ、東ソー社製）の
カラムによるゲルろ過法のカラムクロマトグラフィーに
付し、同一緩衝液にて、分子量既知の標準品（グルタメ
ートデヒドロゲナーゼ：分子量２９万、ラクテートヒド
ロゲナーゼ：分子量１４万、エノラーゼ：分子量６．７
万、アデニレートキナーゼ：分子量３．２万、チトクロ
ムＣ：分子量１．２４万）と共に分離、分画を行い、各
画分のエンドセリン変換活性を前述の方法で測定し、変
換活性ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換酵素
ＩＩＩの分子量を推定したところ約２４万であった。結
果を図８に示す。
【図１】実施例２で得られるエンドセリン変換酵素ＩＩ
の分子量決定のための試験結果を図示したものである。
の分子量決定のための試験結果を図示したものである。
【図２】実施例２で得られるエンドセリン変換酵素ＩＩ
の至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
の至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
【図３】実施例６で得られるエンドセリン変換酵素Ｉの
分子量決定のための試験結果を図示したものである。
分子量決定のための試験結果を図示したものである。
【図４】実施例６で得られたエンドセリン変換酵素Ｉの
至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
【図５】実施例１１で得られるエンドセリン変換酵素Ｉ
Ｖの至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
Ｖの至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
【図６】実施例１１で得られるエンドセリン変換酵素Ｉ
Ｖの分子量決定のための試験結果を図示したものであ
る。
Ｖの分子量決定のための試験結果を図示したものであ
る。
【図７】実施例１６で得られたエンドセリン変換酵素Ｉ
ＩＩの至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
ＩＩの至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
【図８】実施例１６で得られるエンドセリン変換酵素Ｉ
ＩＩの分子量決定のための試験結果を図示したものであ
る。
ＩＩの分子量決定のための試験結果を図示したものであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，176 （２）（1991），ｐ．860−865 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂ ｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ ｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，174 （２）（1991），ｐ．446−451 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２
１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン残基と
の間を加水分解してビッグエンドセリン−１をエンドセ
リン−１に変換する、至適ｐＨが６．５〜７．５で、分
子量が約１０万、約２４万または５０万以上である、ヒ
ト細胞由来エンドセリン変換酵素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2413579A JP2966939B2 (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2413579A JP2966939B2 (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04210593A JPH04210593A (ja) | 1992-07-31 |
| JP2966939B2 true JP2966939B2 (ja) | 1999-10-25 |
Family
ID=18522190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2413579A Expired - Fee Related JP2966939B2 (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2966939B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0545344B1 (en) * | 1991-11-29 | 1997-05-02 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Endothelin,converting enzymes |
| US6066502A (en) * | 1993-11-16 | 2000-05-23 | Basf Aktiengesellschaft | Endothelin converting enzyme (ECE) |
| GB9325221D0 (en) * | 1993-12-09 | 1994-02-09 | Zeneca Ltd | Nucleid acid |
-
1990
- 1990-12-07 JP JP2413579A patent/JP2966939B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，１７４（２）（１９９１），ｐ．４４６−４５１ |
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，１７６（２）（１９９１），ｐ．８６０−８６５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04210593A (ja) | 1992-07-31 |
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|---|---|---|---|
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