JPH04210593A - ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 - Google Patents

ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素

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JPH04210593A
JPH04210593A JP2413579A JP41357990A JPH04210593A JP H04210593 A JPH04210593 A JP H04210593A JP 2413579 A JP2413579 A JP 2413579A JP 41357990 A JP41357990 A JP 41357990A JP H04210593 A JPH04210593 A JP H04210593A
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endothelin
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博 坂井
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ビッグエンドセリン1
をエンドセリン−1に変換する活性を有するヒト細胞由
来エンドセリン変換酵素と、ヒト細胞から本酵素を抽出
および精製することからなる本酵素の製造法に関する。 [0002]
【従来の技術】エンドセリン(Endo t he l
 i n)は1988年、柳沢らによって発見された内
皮細胞由来の血管平滑筋収縮因子であり[M、Yana
g i sawa  et  al、、Nature 
 332,411  (1988))、ブタ、ウシ、ヒ
ト等においてその存在が確認されている。また、エンド
セリンには、3種のアイソペプチドが存在し、それぞれ
エンドセリン−1,エンドセリン−2、エンドセリン−
3と命名されている。これらのアイソペプチドのうちヒ
トにおいて最も活性発現量の多いのはエンドセリン−1
であることが確認されている。 [0003]エンドセリンは1強力かつ持続的な血管平
滑筋および気管の収縮作用を有し、高血圧症や気道狭窄
を惹起するとともに、高濃度(血中濃度1〜50pm。 1/m1程度)では、脳卒中、狭心症、心筋梗塞、心不
全、不整脈等の虚血性脳および心疾患、腎炎等の腎障害
、肺、肝、腸等の循環不全、喘息などの疾病を併発させ
、動物個体を死に至らしめることもある。 [0004]エンドセリン−1は、その前駆体であるビ
ックエンドセリン−1、すなわち次の式:%式%]
【]】
で示されるペプチドを、エンドセリン変換酵素によって
ビッグエンドセリン−1のN末端から21番目のトリプ
トファン残基と22番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基21個からなるペ
プチドである。この加水分解過程がエンドセリンの活性
発現に必須であると考えられる。このエンドセリン変換
活性を有する酵素に関する報告はこれまで培養ウシ血管
内皮細胞(K、0kada  et  al、、Bio
chemical  and  Biophysica
l  Re5earch  Communicatio
ns  171.1192  (1990) 、ウシ副
腎髄質(、T、Sawamura  et  al、、
Biochemicaland  Biophysic
al  Re5erchC。 mmunications  168,1230 (1
990)〕等についてなされているが、ヒト由来のエン
ドセリン変換活性を有する酵素の存在は未だに明らかに
されていない。 [0006]
【発明が解決しようとする課題】エンドセリンは上述の
ように著しい生理活性を有する化合物であるが、その前
駆体のビッグエンドセリンから酵素的変換によって生成
するものであるから、この変換酵素の解明によってエン
ドセリンの生体内での生成を抑制する手段を提供するこ
とになり、またこの変換酵素は生体の血管収縮反応の機
構の解析やエンドセリンが原因となる様々な病態の研究
に有力な試薬としての用途が期待されるのである。 [0007]さらにまたこの変換酵素の解明によりエン
ドセリンの分泌過多により誘発される様々な病態(高エ
ンドセリン症)、例えば高血圧、気道狭窄、虚血性脳お
よび心疾患、腎障害、諸臓器例えば肝、肺、腸等の循環
不全、喘息等の予防および治療の手段としてのこの変換
酵素の阻害剤の探索、開発に有力な手段を提供すること
になる。 [0008]かかる理由からヒI〜細胞中にこれ迄に見
出されていなかったエンドセリン変換酵素の解明とその
入手のための方法の開発が求められていた。 [0009]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述した課
題、すなわち、ヒト細胞中からエンドセリン変換酵素を
取り出すべく鋭意研究の結果、ヒ1〜細胞中にエンドセ
リン変換活性を有する酵素が存在することを見出し本発
明を完成したのである。 [00101本発明のエンドセリン変換酵素は、胎盤、
血管内皮、腎臓、大脳などのエンドセリンを産生してい
るヒト臓器および組織のヒト細胞を原料としてこれから
抽出して得られるものである。そして上記した臓器およ
び組織の入手の容易さから胎盤が有利に用いられる。し
かしながら、入手の容易さの観点を別にすれば胎盤以外
の臓器または組織からの、あるいは血液からの抽出も亘
能であることは勿論である。 [00111本発明のエンドセリン変換酵素は、ヒト細
胞に由来し、ビッグエンドセリン−1のN末端から21
番目のトリプトファン残基と22番目のバリン残基との
間を加水分解してビッグエンドセリン−1をエンドセリ
ン−1に変換する能力を有し、その至適pHが6.5へ
7.5で、分子量が約10万、約24万または50万り
上であるものにかかる。 [00121本発明のエンドセリン変換酵素は、臓器ま
たは組織の細胞膜を界面活性剤で処理して抽出液とし、
この抽出液を分別して得られる分子量が約10万である
ものと、50万以上であるものとの二つの画分からなり
、あるいはまた臓器または組織をホモジナイズし、彷ら
れたホモジネートから上清を分取し、このホモジネート
上清を超遠心分離に付してその上清を取り出して得られ
る細胞質両分を分別して得られる分子量が約24万であ
るものと、50万以上であるものとの二つの両分からな
るものである。 [0013]この四つのエンドセリン変換酵素のうち、
ヒト細胞膜由来の分子量が約10万であるもの(酵素■
)の性質は次のとおりである。 (a)  牛用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン−1に変換する。 (b)  基質特異性:ビックエンドセリン−1のN末
端から21番目のトリプトファン残基と22番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 (c)  至適pH:6. 5〜7. 5(d)  分
子量:約100000 (TSK−G3000SWを用
いたゲルろ過法により測定) (e)  阻害剤:エチレンジアミンテトラアセテ−1
へ(EDTA)、1.10−フェナントロリンにより阻
害を受ける。 [0014]またヒト細胞膜由来の分子量が50万以上
であるもの(酵素II)の性質は次のとおりである。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン1に変換する。 (b)  基質特異性:ビックエンドセリン−1のN末
端から21番目のトリプトファン残基と22番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 (c)  至適pH:6. 5〜7. 5(d)  分
′f量: 500000以上(TSK−G3000SW
を用いたゲルろ過法により測定)(e)   阻害剤:
エチレンジアミンテトラアセテート(EDTA)、1.
10−フェナントロリンにより阻害を受ける。 [0015]またヒト細胞膜由来の分子量が24万であ
るもの(酵素I I I)の性質は次のとおりである。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン=1に変換する。 (b)  基質特異性:ビックエンドセリン−1のN末
端から21番目のトリプトファン残基と22番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 (c)  至適pH:6. 5〜7. 5(d)  分
子量: 240000以上(TSK−G3000SWを
用いたゲルろ過法により測定)[0016]さらにまた
ヒト細胞膜由来の分子量が50万以上であるものく酵素
IV)の性質は次のとおりである。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン1に変換する。 (b)  基質特異性:ビックエンドセリン−1のN末
端から21番目のトリプトファン残基と22番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 (c)  至適pH:6. 5〜7. 5(d)  分
子量: 5ooooo以上(TSK−G3000SWを
用いたゲルろ過法により測定)(e)  阻害剤:エチ
レンジアミンテ1−ラアセテート(EDTA) 、1.
10−フェナントロリンにより阻害を受ける。 [0017]上記した本発明のエンドセリン変換酵素■
〜IVは本発明によれば胎盤、血管内皮、腎臓、大脳等
のエンドセリンを産生しているヒト臓器および組織のヒ
ト細胞を原料として得られる [0018]例えばヒト胎盤を原料とする場合、次のよ
うな操作によってこれをうろことができる。すなわち、
ヒト胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した後、
これに適当量の緩衝液、例えば25mMへベス、0.2
5Mシュークロース緩衝液(pH7,4)を加え、通常
用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホモジナ
イザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られたホモ
シネ−1−を遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る[0
019]こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣は、緩
衝液で充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取
し、以後の抽出操作に付す。ここで得られる洗浄沈渣は
、次に述べる胎盤ホモジネート上清を超遠心分離して得
られる沈渣部分と共に細胞膜に由来する成分である。次
いでこの洗浄沈渣は界面活性剤、例えばトリトンX−1
00、コール酸ナトリウム、3−1(3−コラミドプロ
ピル)ジメチルアンモニオ〕−1−プロパンスルホネー
ト(CHAPS) 、シュークロースモノカプレート等
を含む緩衝液に浸し、4℃〜8℃にて一晩放置後、遠心
分離して上清を集め、抽出液を得る。 [00201一方、分取した胎盤ホモジネート上清は、
更に50000g〜100000gの超遠心分離をして
沈渣部分であるマイクロシーム分画を得る。このマイク
ロシーム分画を洗浄後、上記と同様にして界面活性剤抽
出を行った後、超遠心分離して上清を集め、抽出液を得
る。 [0021]また、上記したように分取した胎盤ホモジ
ネー1〜上清を、更に50000g〜100000gの
超遠心分離にかけて得られた上清を回収することにより
、細胞質画分を得る。 [00221本酵素I〜IVの精製は、上述の細胞膜両
分または細胞質画分を通常の酵素の精製に用いる手段を
利用することにより達成できる。例えば、アサヒバツク
HC−N200  (旭化成工業社製)によるクロマト
グラフィー、Q−セファロースバイパフォーマンス(フ
ァルマシア社製)によるクロマトグラフィー、フェニル
スーパーロース(ファルマシア社製)によるクロマトグ
ラフィー、スーパーデックス200 (ファルマシア社
製)によるゲルろ過、TSK−G3000SW (東ソ
ー社製)によるゲルろ過等の手段を適宜組み合わせ、ビ
ッグエンドセリン−1をエンドセリン−1に変換する活
性を指標として、本発明のエンドセリン変換酵素を精製
することができる。 [00231本発明のエンドセリン変換酵素■〜IVの
活性は力価によって表現されるが、この力価の測定はつ
ぎのようにして行なわれる。 [0024]  (1)  酵素活性の測定法1、ml
の4μg/mlビッグエンドセリンー1溶液(100m
Mトリス−塩酸緩衝液、pH7,0)に0.1mlの酵
素溶液を添加し、37℃にて3時間反応させる。 反応後100℃10分間の処理を行い反応を停止させる
。次いで、生じたエンドセリン−1をサンドインチ−E
IA法により定量する。上記反応条件にて1時間に1p
molのビッグエンドセリン−1をエンドセリン−1に
変換する酵素活性をIU(単位)とする。 [0025]  (2)  サンドインチ−EIA法抗
エンドセリン−1モノクロ一ナル抗体を固相化した96
六マイクロプレートに、検体および既知濃度のエンドセ
リン−1標準液を加え反応させる。マイクロプレートを
洗浄後、ビオチン標準抗エンドセリンーJポリクローナ
ル抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジンを加え反応
させる。マイクロプレートを洗浄後、結合したペルオキ
シダーゼ活性を測定する。既知濃度のエンドセリン−1
標準液による検量線から検体中のエンドセリン−1を定
量する。 [0026]  (3)  抗エンドセリンー1モノク
ローナル抗体の作成 エンドセリン−1とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をマ
ウスに免疫し、常法に従い、免疫マウス牌細胞とマウス
ミエローマを細胞融合し、ハイブリドーマを作成、エン
ドセリン−1に対する抗体を産生するハイブリドーマを
クローン化する。クローン化されたハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体をプロティンAカラムで精製
し、抗エンドセリンー1モノクローナル抗体を作成する
。 [0027]  (4)  抗エンドセリンー1ポリク
ローナル抗体 エンドセリン−1とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をウ
サギに免疫し抗血清を得る。抗血清からプロティンAカ
ラムで抗体画分を得る。抗体画分をビッグエンドセリン
1固定化カラムに付し、カラムに結合した両分を集め、
抗エンドセリンー1ポリクローナル抗体を作成する。得
られた抗エンドセリンー1ポリクローナル抗体をビオチ
ン化し、ビオチン標識抗エンドセリンー1ポリクローナ
ル抗体を作成する。 [0028]次ぎに、本発明のエンドセリン変換酵素I
〜IVの酵素化学的特性について述べる。 [0029]  (a)作用 ビッグエンドセリン−1をエンドセリン−1に変換する
。 [00301(b)  基質特異性 ビッグエンドセリン−1のN末端から21番目のトリプ
トファン残基と22番目のバリン残基との間を加水分解
する。50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7,0)にお
いてビッグエンドセリン−1に本酵素を37℃にて3時
間作用させ、生成物をイナートシルODSカラム(ジ−
エルサイエンス社製)を用いた逆相クロマ1〜グラフイ
ーに付し、0.05%トリフルオロ酢酸−10%アセト
ニトリル溶液から0.05%トリフルオロ酢酸−50%
アセ1へニトリル溶液への直線的濃度勾配により分析し
たところ、ビッグエンドセリン−1のピーク以外に2つ
のピークが出現し、それらのピークの溶出位置は、エン
ドセリン−1およびビッグエンドセリン−1のN末端よ
り22番目のバリンから38番目のセリンまでのビッグ
エンドセリン−1の部分ペプチドと同一であった。この
結果より、本変換酵素によりビッグエンドセリン−1の
N末端から21番目のトリプトファン残基と22番目の
バリン残基との間が加水分解されていることがわかる。 [00311(c)  至適pH 木エンドセリン変換酵素の至適pHの測定は、各々のp
Hの50mM緩衝液にて調製したビッグエンドセリン−
1溶液に、本エンドセリン変換酵素を加え、37℃で反
応することによって行った。使用した緩衝液は、pH2
,0〜7.5   クエン酸−リン酸緩衝液pH7,5
〜9.0トリス−塩酸緩衝液pH9,0〜12.0 炭
酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液である。 測定の結果、本エンドセリン変換酵素I−IVは、pH
6,5〜7.5の範囲において最も強い活性を示した。 [0032]  (d)  分子量 TSK−G3000SW (東ソー社製)のカラムによ
るゲルろ適法のカラムクロマトグラフィーにより分子量
既知の標準品と共に分離、分画を行い、本エンドセリン
変換酵素I、II、IIL IV、の分子量を推定した
ところ、それぞれ約10万、50万以上、約24万およ
び50万以上であった。 [0033]  (e)  阻害剤 本酵素の、ビッグエンドセリン−1をエンドセリン−1
に変換する変換活性に対する各種阻害剤の効果を調べた
。各種阻害剤を含む100μlの反応液(50mMトJ
スー塩酸緩衝液、pH7,0)中において本酵素を37
℃、30分間インキュベー1へし、残存する酵素活性を
前述の方法にて測定した。各阻害剤存在下における残存
活性を、無処理の活性を100とした相対活性で表した
結果を表で示す。表1は酵素■、表2は酵素II、そし
て表3は酵素IVについての結果である。 [0034]
【表1】 [0035]
【表2】 [0036]
【表3】 [0037]つぎに、実施例によって本発明を更に詳細
に説明するが、本発明は、これらによって限定されるも
のではない。 [0038]
【実施例1】胎盤細胞膜両分の調製 ヒト胎盤(約5g)より、膿等を除去し、生理食塩水で
充分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に、2
5mMヘペス、0.25Mシュークロース緩衝液(pH
7,4)20mlを加え、ポリトロン(Polytor
on)ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得ら
れたホモジネートを1000g、20分間遠心分離し、
上清を分取した。この上清10000g、20分間、再
び遠心分離し、その上清及び沈渣を得た。 [0039]こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣に
、上記と同一の緩衝液10m1を加え、充分洗浄し、再
度10000g、20分間の遠心分離を行い、洗浄沈渣
を分取した。得られた洗浄沈渣に、10m1の0. 5
%トリトンX−1,00含有25mMヘペス、0.25
Mシュークロース緩衝液(pH7,4)を加え、4℃に
て一夜放置後、1000g、20分間遠心分離して、抽
出液約9mlを得た。 [00401一方、胎盤ホモジネート上清は、1000
00g、2時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した。 この超遠心分離沈渣に、2mlの0.5%トリトン−X
100含有25mMへベス、0.25Mシュークロース
緩衝液(pH7,4)を加え、4℃にて一夜放置後、再
び100000g、2時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約1..5mlを得た。胎盤ホモジネート沈
渣より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心
分離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜画分約
10.5mlを得た。 [00411
【実施例2]精製酵素(分子量50万以上の酵素II)
の調製 [0042]  (i)  実施例1で得られた細胞膜
画分約10.5mlを、0.1Mトリス−塩酸緩衝液(
pH7,0)で平衡化したアサヒバツクHC−N200
 (旭化成工業社製)のカラムに付し、同緩衝液にて溶
出させ、試料中のトリトンX−100を除去した。トリ
ジX100を除去した細胞膜画分を、10mMトリス−
塩酸緩衝液(pH8,0)で平衡化したQ−セファロー
スバイパフォーマンス(ファルマシア社製)のカラム(
φ2.6X10cm)に吸着させ、同緩衝液にて充分洗
浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度を直線的に
0〜250mMに上げることにより、酵素を溶出し、酵
素活性を有する両分を集めた。得られた活性画分をダイ
アフローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社
製)を用いて5.0mlまで濃縮した。この濃縮液を、
0.1Mhリスー塩酸、0.3M  NaC1緩衝液(
pH7,0)で平衡化したスーパーテックス200 (
ファルマシア社製)のカラム(中2゜6X60cm)に
付し、同一緩衝液で溶出した。 [00431(i i)  上記した(i)の操作によ
って溶出した溶出体積100m1〜150m1の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクシ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社
製)を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素IIを
得た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素IIの総
括性は約350Uであった。 [0044]  (i i i)  このようにして得
られた精製エンドセリン変換活性IIの100 g 1
を、0.1MトJスー塩酸、0.8M  NaC1緩衝
液(pH7,0)で平衡化したTSK−G3000SW
 (7,5mmφ×60cm、東ソー社製)のカラムに
よるゲルろ適法のカラムクロマトグラフィーに付し、同
一緩衝液にて、分子量既知の標準品(グルタメートデヒ
ドロゲナーゼ:分子量29万、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼ:分子量14万、エノラーゼ:分子量6.7万、ア
デニレートキナーゼ:分子量3,2万、チトクロムC:
分子量1.24万)と共に分離、分画を行い、各画分の
エンドセリン変換活性を前述の方法で測定し、変換活性
ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換酵素IIの
分子量を推定したとこる50万以上であった。結果を図
1に示す。 [00451 【実施例3]基質特異性 実施例2で得られた精製エンドセリン変換酵素II  
1mlに、0.1mg/mlビッグエンドセリン溶液4
0μlを添加し、37℃にて3時間反応させ、生成物を
イナートシルODSカラム(ジ−エルサイエンス社製)
を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、0.05%ト
リフルオロ酢酸−10%アセトニI−リル溶液から0.
05%トリフルオロ酢酸−50%アセトニトリル溶液へ
の直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンド
セリン−1のピーク以外に2つのピークが出現した。そ
れらのピークの溶出位置は、エンドセリン−1およびビ
ッグエンドセリン−1のN末端より22番目のバリンか
ら38番目のセリンまでのビックエンドセリン−1の部
分へプチドと同一であった。 [0046] 【実施例4】至適pHの測定 各々のpHの50mM緩衝液(pH2,0〜7. 5ク
エン酸−リン酸緩衝液、pH7,5〜9.0トリス−塩
酸緩衝液、pH9,0〜12.0炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液)にて精製したビッグエンドセ
リン−1溶液200μlに、実施例2で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素II  50μmを加え、37℃に
て3時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定
した結果、図2に示すように、本エンドセリン変換酵素
IIはpH6,5〜7.5の範囲において最も強い活性
を示した。 [0047]
【実施例5】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む100μlの反応液(50mMトリス
塩酸緩衝液、pH7,0)中において、実施例2で得ら
れた精製エンドセリン変換酵素IIを37℃にて30分
間インキュベートし、次いで、これに0.1mg/ml
ビッグエンドセリンー1溶液4μmを添加し、37℃に
て3時間反応させた。反応後、1,00℃、10分間の
処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−1を
前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した。 各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を1
00とした相対活性で表し、表2に示した。 [00481
【実施例6]精製酵素(分子量約10万の酵素」)の調
製 [00491(i)  実施例1で得られた細胞膜両分
について、実施例2(i)に記載の操作を行なった。 [00501(i i)  上述した(i)の操作によ
って溶出した溶出体積170m1〜210m1の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクシ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社
製)を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素Iを得
た。 尚、得られた精製エンドセリン変換酵素■の総活性は約
350Uであった。 [00511(i ii)  このようにして得られた
精製エンドセリン変換酵素■の100μlを、0.1M
トリス−塩酸、0.3M  NaC1緩衝液(pH7,
0)で平衡化したTSK−G3000SW (7,5m
mφ×60cm、東ソー社製)のカラムによるゲルろ適
法のカラムクロマトグラフィーに付し、同一緩衝液にて
、分子量既知の標準品(グルタメートデヒドロゲナーゼ
:分子量29万、ラクテートデヒドロゲナーゼ:分子量
14万、エノラーゼ:分子量6,7万、アデニレートキ
ナーゼ二分子量3.2万、チトクロムC:分子量1,2
4万)と共に分離、分画を行い、各画分のエンドセリン
変換活性を前述の方法で測定し、変換活性ピークの溶出
位置より、本エンドセリン変換酵素Iの分子量を推定し
たところ約10万であった。結果を図3に示す。 [0052] 【実施例7】基礎特異性 実施例6で得られた精製エンドセリン変換酵素I  1
mlに、0.1mg/mlビッグエンドセリン溶液40
μlを添加し、37℃にて3時間反応させ、生成物をイ
ナートシルODSカラム(ジ−エルサイエンス社製)を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、0.05%トリ
フルオロ酢酸−10%アセトニトリル溶液から0.05
%1−リフルオロ酢酸−50%アセトニトリル溶液への
直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセ
リン1のピーク以外に2つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−1およびビッグ
エンドセリン−1のN末端より22番目のバリンから3
8番目のセリンまでのビッグエンドセリン−1の部分ペ
プチドと同一であった。 [0053]
【実施例8】至適pHの測定 各々のpHの50mM緩衝液(pH2,0〜7.5クエ
ン酸−リン酸緩衝液、pH7,5〜9.0トリス−塩酸
緩衝液、pH9,0〜12.0炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液)にて調整したビッグエンドセリ
ン−1溶液200μlに、実施例6で得られた精製エン
ドセリン変換酵素I  50μlを加え、37℃にて3
時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した
結果、図4に示すように、本エンドセリン変換酵素II
はpH6,5〜7.5の範囲において最も強い活性を示
した。 [0054]
【実施例9】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む100μIの反応液(50mMトリス
−塩酸緩衝液(pH7,0)中において、実施例6で得
られた精製エンドセリン変換酵素■を37℃にて30分
間インキュベートし、次いで、これに0.1mg/ml
のビッグエンドセリン−1溶液4721を添加し、37
℃にて3時間反応させた。反応後、100℃、10分間
の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−1
を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した
。 各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を1
00とした相対活性で表し、表1に示した。 [0055]
【実施例10】胎盤細胞質画分の調製 ヒト胎盤(約5g)より、膜等を除去し、生理食塩水で
十分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に25
mMへペス、0.25Mシュークロース緩衝液(pH7
,4)20mlを加え、ポリトロン(Polytoro
n)ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得られ
たホモジネートを1000g、20分間遠心分離し、上
清を分取した。この上清を10000g、20分間、再
び遠心分離し、その上清を分取した。得られた上清を1
00000g、2時間超遠心分離し、約20m1の上清
を回収、細胞質画分とした。 [0056]
【実施例11】精製酵素(分子量50万以上の酵素■V
)の調製実施例10で得られた細胞質画分約20m1を
、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8,0)で平衡化
したQ−セファロースバイパフォーマンス(ファルマシ
ア社製)のカラム(中2゜6X10cm)に吸着させ、
同緩衝液にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリ
ウム濃度を直線的に0〜250mMに上げることにより
、酵素を溶出し、酵素活性を有する両分を集めた。 [0057]得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターPM−10(アミコン社製)を用いて5゜
0mlまで濃縮した。この濃縮液を、予め0.1Mトリ
ス−塩酸、0.3MNaC1緩衝液(pH7; 0)で
平衡化したスーパーテックス200(ファルマシア社製
)のカラム(中2゜6X60cm)に付し、同一緩衝液
で溶出し、溶出体積100m1〜150m1の付近をフ
ラグショネーションし、これらのフラクションについて
前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクショ
ンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイア
フローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社製
)を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素IVを得
た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素IVの総活
性は約350Uであった。 [0058]
【実施例12】基質特異性 実施例11で得られた精製エンドセリン変換活性IV1
mlに、0.1mg/mlビッグエンドセリン溶液40
μmを添加し、37℃にて3時間反応させ、生成物をイ
ナートシルODSカラム(ジ−エルサイエンス社製)を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、0.05%トリ
フルオロ酢酸−10%アセトニトリル溶液から0.05
%トリフルオロ酢酸−50%アセトニトリル溶液への直
線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセノ
ン−1のピーク以外に2つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−1およびビッグ
エンドセリン−1のN末端より22番目のバリンから3
8番目のセリンまでのビックエンドセリン−1の部分ペ
プチドと同一であった。 [0059]
【実施例13】至適pHの測定 各々のpHの50mM緩衝液(pH2,0〜7. 5ク
エン酸−リン酸緩衝液、pH7,5〜9.0トリス−塩
酸緩衛液、pH9,0〜12.0炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液)にて調製したビッグエンドセ
リン−1溶液200μmに、 実施例11で得られた精
製エンドセリン変換酵素IV  50μIを加え、37
℃にて3時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を
測定した結果、図5に示すように、本エンドセリン変換
酵素IVはpH6,5〜7,5の範囲において最も強い
活性を示した。 [00603
【実施例14]分子量の測定 実施例11で得られた精製エンドセリン変換酵素IVの
100μmを、O,1Mトリス−塩酸、0.3M  N
aC1緩衝液(pH7,0)で平衡化したTSF’−G
3000SW (7,5mmφX60cm、東ソー社製
)のカラムによるゲルろ適法のカラムクロマトグラフィ
ーに付し、同一緩衝液にて、分子量既知の標準品(グル
タメートデヒドロゲナーゼ二分子量29万、ラクテート
ヒドロゲナーゼ:分子量14万、エノラーゼ:分子量6
,7万、アデニレートキナーゼ:分子量3.2万、チト
クロムC:分子量1.24万)と共に分離、分画を行い
、各両分のエンドセリン変換活性を前述の方法で測定し
、変換活性ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換
酵素IVの分子量を推定したところ50万以上であった
。結果を図6に示す。 [0061,] 【実施例15】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む100μlの反応液(50mMトリス
塩酸緩衝液、pH7,0)中において、実施例11で得
られた精製エンドセリン変換酵素IVを37℃にて30
分間インキュベートし、次いで、これに0.1mg/m
lのビッグエンドセリン−1溶液47Llを添加し、3
7℃にて3時間反応させた。反応後、100℃、10分
間の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン1
を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した
。各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を
100とした相対活性で表し、表3に示した。 [0062]
【実施例16】精製酵素(分子量24万の酵素I I 
I)の調製 実施例10で得られた細胞質両分約20m1を、10m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH8,0)で平衡化したQ−
セファロースバイパフォーマンス(ファルマシア社製)
のカラム(中2゜6X10cm)に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度
を直線的に0〜250mMに上げることにより、酵素を
溶出し、酵素活性を有する画分を集めた。 [0063]得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターPM−10(アミコン社製)を用いて5゜
0mlまで濃縮した。この濃縮液を、予め0.1Mトリ
ス−塩酸、0.3MNaC1緩衝液(pH7,0)で平
衡化したスーパーテックス200 (ファルマシア社製
)のカラム(中2゜6X60cm)に付し、同一緩衝液
で溶出し、溶出体積1.60m1〜180m1の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラグジ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社
製)を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素III
を得た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素III
の総括性は約150Uであった。 [0064]
【実施例17】基礎特異性 実施例16で得られた精製エンドセリン変換酵素III
1mlに、0゜1mg/mlビッグエンドセリン溶液4
0μlを添加し、37℃にて3時間反応させ、精製物を
イナートシルODSカラム (ジ−エルサイエンス社製
)を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、0.05%
トリフルオロ酢酸−10%アセI−二トリル溶液から0
.05%トリフルオロ酢酸−50%アセトニトリル溶液
への直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエン
ドセリン−1のピーク以外に2つのピークが出現した。 それらのピークの溶出位置は、エンドセリン−1および
ビッグエンドセリン−1のN末端より22番目のバリン
から38番目のセリンまでのビッグエンドセリン−1の
部分ペプチドと同一であった。 [0065]
【実施例18】至適pHの測定 各々のpHの50mM緩衝液(pH2,0〜7. 5ク
エン酸−リン酸緩衝液、pH7,5〜9.0トリス−塩
酸緩衝液、pH9,0〜]2.0炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液)にて調製したビッグエンドセ
リン−1溶液200μlに、実施例16で得られた精製
エンドセリン変換酵素III  50μlを加え、37
℃にて3時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を
測定した結果、図7に示すように、木エンドセリン変換
酵素IIIはpH6,5〜7.5の範囲において最も強
い活性を示した。 [0066]
【実施例1−9】分子量の測定 実施例16で得られた精製エンドセリン変換酵素III
の100 lLlを、0.1Mトリス−塩酸、0.3M
  NaC1緩衝液(pH7,0)で平衡化したT S
 K −G 3000SW (7,5mmφX60cm
、東ソー社製)のカラムによるゲルろ適法のカラムクロ
マトグラフィーに付し、同一緩衝液にて、分子量既知の
標準品(グルタメートデヒドロゲナーゼ:分子量29万
、ラクテートヒドロゲナーゼ:分子量14万、エノラー
ゼ:分子量6.7万、アデニレートキナーゼ:分子量3
.2万、チ1−クロムC:分子量1,24万)と共に分
離、分画を行い、各画分のエンドセリン変換活性を前述
の方法で測定し、変換活性ピークの溶出位置より、木エ
ンドセリン変換酵素IIIの分子量を推定したところ約
24万であった。結果を図8に示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例2で得られるエンドセリン変換酵素II
の分子量決定のための試験結果を図示したものである。
【図2】実施例2で得られるエンドセリン変換酵素II
の至適pHの試験結果を図示したものである。
【図3】実施例6で得られるエンドセリン変換酵素Iの
分子量決定のための試験結果を図示したものである。
【図4】実施例6で得られたエンドセリン変換酵素Iの
至適pHの試験結果を図示したものである。
【図5】実施例11で得られるエンドセリン変換酵素■
Vの至適pHの試験結果を図示したものである。
【図6】実施例11で得られるエンドセリン変換酵素■
Vの分子量決定のための試験結果を図示したものである
【図7】実施例16で得られたエンドセリン変換酵素■
IIの至適pHの試験結果を図示したものである。
【図8】実施例16で得られるエンドセリン変換酵素■
IIの分子量決定のための試験結果を図示したものであ
る。
【図3】
【手続補正書】
【提出日】平成3年10月23日
【手続補正1】
【補正対象項目名】明細書
【補正対象項目名] 0005 【補正方法】変更
【補正内容】
[0005]
【化1】 で示されるペプチドを、エンドセリン変換酵素によって
ビッグエンドセリン−1のN末端から21番目のトリプ
トファン残基と22番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基21個からなるペ
プチドである。この加水分解過程が生体内におけるエン
ドセリンの産生に必須であると考えられる。このエンド
セリン変換活性を有する酵素に関する報告はこれまで培
養ウシ血管内皮細胞[K、0kada  et  al
、。 Biochemtcal  andBiophysic
ai   Re5earch  COmmtiniCa
tiOnS171.1192  (1990))、ウシ
副腎髄質[T。 Sawamura  etal、、Biochemic
al  and  Biophysical  Res
erchCommunications  168,1
230  (1990)3等についてなされているが、
ヒト由来のエンドセリン変換活性を有する酵素の存在は
未だに明らかにされていない。
【手続補正2】
【補正対來書類名】明細書
【補正対象項目名1001.5 【補正方法】変更
【補正内容】
[o 0151またヒト細胞質由来の分子量が24万で
あるもの(酵素I I I)の性質は次のとおりである
。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン1に変換する。 (t))  基質特異性:ビックエ
ンドセリン−lのN末端から21番目のトリプトファン
残基と22番目のバリン残基との間を加水分解する。 
(C)至適pH:6.5へ−7,5(d)  分子量:
 240000以上(TSK、−G3000 SWを用
いたゲルろ過法により測定)
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名10016 【補正方法】変更
【補正内容】
[0016]さらにまたヒト細胞質由来の分子量が50
万以上であるもの(酵素IV)の性質は次のとおりであ
る。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエン
ドセづン−1に変換する。 (b)  基質特異性:ビ
ックエンドセリン−1のN末端から21番目のトリプト
ファン残基と22番目のバリン残基との間を加水分解す
る。 (c)  至適pH: 6. 5〜7. 5 (d) 
 分子量:500000以上(TSK−G3000SW
を用いたゲルろ過法により測定) (e) 阻害剤:エ
チレンジアミンテ1へラアセテ−1−(EDTA)、1
.10−ツェナシトロリンにより阻害を受ける。
【手続補正4】
【補正対像書類名】明細書
【補正対象項目名10018 【補正方法】変更
【補正内容】
[0018]例えばヒ1−胎盤を原料とする場合、次の
ような操作によってこれをうろことができる。すなわち
、ヒ1−胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した
後、これに適当量の緩衝液、例えば25mMへベスー0
. 25Mシュークロース緩衝液(pH7,4)を加え
、通常用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホ
モジナイザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られ
たホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名10024 【補正方法】変更
【補正内容】
[0024]  (1)  酵素活性の測定法ng/m
↓9旦ッグエンドッグエンドセリン−1溶液(100m
Mhリス塩酸緩衝液、pH7,0)に0.1mlの酵素
溶液を添加し、37℃にて3時間反応させる。反応後1
00℃10分間の処理を行い反応を停止させる。次いで
、生じたエンドセリン−1をサンドイッチ−EIA法に
より定板する。上記反応条件にて12時間にlpmol
のビッグエンドセリン−1をエンドセリン〜1に変換す
る酵素活性をIU(単位)とする。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名)0038 【補正方法】変更
【補正内容】
[0038]
【実施例1】胎盤細胞膜画分の調製しh胎盤(約5g)
より、膜等を除去し、生理食塩水で充分洗浄後、微小断
片化した。この胎盤微小断片に、25mMへペス−0゜
25Mシュークロース緩衝液(pH7,4)20mlを
加え、ポリトロン(Polytoron)ホモジナイザ
ーを用いてホモジナイズした。得られたホモシネ−1−
を1000g、20分間遠心分離し、上清を分取した。 この丘清を1. OO00g、20分間、再び遠心分離
し、その上清及び沈渣を得た。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0039 【補正方法】変更
【補正内容】
[00391こうして得られた胎盤ホモシネ−1・・沈
渣に、上記と同一の緩衝液10m1を加え充分洗浄し、
再度10000g、20分間の遠心分離を行い、洗浄沈
渣を分取した 。得られた洗浄沈渣に、10m1の0.
5%トリトンX−100含有25mMヘペスー0.25
Mシュークロース緩衝液(pH7,4)を加え、4℃に
て一夜放置後、]、0000g20分間遠心分離して、
抽出液約9mlを得た。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名10040 【補正方法】変更
【補正内容】
[00401−一方、胎盤ホモジネート上清は、100
000g、2時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した
。 この超遠心分離沈渣に、2mlの0.5%トリトン−X
100含有25mMヘペスー0.25Mシュークロース
緩衝液(pH7,4)を加え、4℃にて一夜放置後、再
び100000g、2時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約1.5mlを得た。胎盤ホモジネート沈渣
より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心分
離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜両分約1
0.5mlを得た。
【手続補正9】
【補正対宋書類名】明細書
【補正対象項目名] 0046 【補正方法】変更
【補正内容】
[0046]
【実施例4】至適p)(の測定各々のpHの50mM緩
衝液(pH2,0〜7.5クエン酸−リン酸緩衝液、p
H7,5〜9.Ol−リス−塩酸緩衝液、pH9,0〜
12.0炭酸水素ナトリウム−水酸化す1−リン酸緩衝
液)に工週製したビッグエンドセリン−1溶液200 
/11に、実施例2で得られた精製エンドセリン変換酵
素ll50μlを加え、37℃にて3時間反応を行った
後、前述の方法で酵素活性を測定した結果、図2に示す
よう(二本エンドセリン変換酵素IIはpH6,5〜7
.5の範囲において最も強い活性を示した。
【手続補正1] 【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0052 【補正方法】変更
【補正内容】
[0052]
【実施例7】基礎特異性実施例6で得られた精製エンド
セリン変換酵素I  1mlに、0.1mg/mlビッ
グエンドセリンー [溶液40 lLIを添加し、37
℃にて3時間反応させ、生成物をイナー1ヘシルODS
カラム(ジ−エルサイエンス社製)を用いた逆相クロマ
トグラフィーに付し、0.05%1へリフルオロ酢酸−
10%アセ1−二l−リル溶液から0,05%1ヘリフ
ルオロ酢酸−50%アセ[・ニトリル溶液への直線的濃
度勾配により分析したところ、ビックエンドセリン−1
のピーク以外に2つのピークが出現した。それらのピー
クの溶出位置は、エンドセリン−1およびビッグエンド
セリン−1のN末端より22番[]のバリンから38番
目のセリンまでのビッグエンドセリン−1の部分ペプチ
ドと同一であった。
【手続補正11】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0053 【補正方法】変更
【補正内容】
[0053]
【実施例8】至適pHの測定各々のpHの50mM緩衝
液(pH2,0〜7.5クエン酸−リン酸緩衝液、pH
7,5〜9.0トリス−塩酸緩衝液、pH9,0〜12
.0炭酸水素す1へリウムー水酸化ナトリウム緩衝液)
にて調製したビッグエンドセリン−1,溶液200μm
(二実施例6で得られた精製エンドセリン変換酵素I5
0μIを加え、37℃にて3時間反応を行った後、前述
の方法で酵素活性を測定した結果、図4に示すように、
本エンドセリン変換酵素IIはpH6,5〜7.5の範
囲において最も強い活性を示した。
【手続補正]2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0055 【補正方法】変更
【補正内容】
[0055]
【実施例10】胎盤細胞質両分の調製ヒ1−胎盤(約5
g)より、膜等を除去し、生理食塩水で十分洗浄後、微
小断片化した。この胎盤微小断片に25mMへペスし2
5Mシュークロース緩衝液(pH7,4)20mlを加
え、ポリ1−ロン(Polytoron)ホモジナイザ
ーを用いてホモジナイズした。得らねだホモシネ−1−
を1000g、20分間遠心分離し5、上清を分取した
。この上清を1−0000 g、20分間、再び遠心分
離し、その上清を分取した。得られた一上清を1000
00g、2時間超遠心分離し、約20m1の上清を回収
、細胞質画分としまた。
【手続補正]、3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0058 【補正方法】変更
【補正内容】
[0058]
【実施例1,2】基質特異性実施例]、1で得られた精
製エンドセリン変換酵素K V 1 m lに、0.1
mg/mlビッグエンドセリンー1溶液40μmを添加
し、37℃にて3時間反応させ、生成物をイナーhシル
ODSカラム(ジ−エルサイエンス社製)を用いた逆相
クロマトグラフィーに付し、0.05%1ヘリフルオロ
酢酸−10%アセ1ヘニトリル溶液から0.05%トリ
フルオロ酢酸−50%アセI−二I〜リル溶液への直線
的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセリン
−1のピーク以外に2つのピークが出現した。それらの
ピークの溶出位置は、エンドセリン−1およびビッグエ
ンドセリン−1のN末端より22番目のバリンから38
番目のセリンまでのビックエンドセリン−1,の部分ペ
プチドと同一であった。
【手続補正14】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0064 【補正方法】変更
【補正内容】
[0064]
【実施例17】基礎特異性実施例16で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素II11mlに、o、]、、]mg
/m1ビッグエンドセリンー1溶液40μを添加し、3
7℃にて3時間反応させ、精製物をイナートシルODS
カラム(ジ−エルサイエンス社製)を用いた逆相クロマ
トグラフィーに付し、0.05%トリフルオロ酢酸−1
0%アセl−二トリル溶液から0.05%トリフルオロ
酢酸50%アセ1へ二1ヘリル溶液への直線的濃度勾配
により分析したところ、ビックエンドセリン−1のピー
ク以外に2つのピークが出現した。それらのピークの溶
出位置は、エンドセリン−1およびビッグエンドセリン
−1のN末端より22番目のバリンから38番目のセリ
ンまでのビッグエンドセリン−]−の部分ペプチドと同
一であった。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ビッグエンドセリン−1のN末端から21
    番目のトリプトファン残基と22番目のバリン残基との
    間を加水分解してビッグエンドセリン−1をエンドセリ
    ン−1に変換する、至適pHが6.5〜7.5で、分子
    量が約10万、約24万または50万以上である、ヒト
    細胞由来エンドセリン変換酵素。
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