JPH04210593A - ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 - Google Patents

ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素

Info

Publication number
JPH04210593A
JPH04210593A JP2413579A JP41357990A JPH04210593A JP H04210593 A JPH04210593 A JP H04210593A JP 2413579 A JP2413579 A JP 2413579A JP 41357990 A JP41357990 A JP 41357990A JP H04210593 A JPH04210593 A JP H04210593A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
endothelin
enzyme
big
activity
buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2413579A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2966939B2 (ja
Inventor
Hiroshi Sakai
博 坂井
Tatsuya Owaki
大脇 達也
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nisshin Seifun Group Inc
Original Assignee
Nisshin Seifun Group Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nisshin Seifun Group Inc filed Critical Nisshin Seifun Group Inc
Priority to JP2413579A priority Critical patent/JP2966939B2/ja
Publication of JPH04210593A publication Critical patent/JPH04210593A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2966939B2 publication Critical patent/JP2966939B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ビッグエンドセリン1
をエンドセリン−1に変換する活性を有するヒト細胞由
来エンドセリン変換酵素と、ヒト細胞から本酵素を抽出
および精製することからなる本酵素の製造法に関する。 [0002]
【従来の技術】エンドセリン(Endo t he l
 i n)は1988年、柳沢らによって発見された内
皮細胞由来の血管平滑筋収縮因子であり[M、Yana
g i sawa  et  al、、Nature 
 332,411  (1988))、ブタ、ウシ、ヒ
ト等においてその存在が確認されている。また、エンド
セリンには、3種のアイソペプチドが存在し、それぞれ
エンドセリン−1,エンドセリン−2、エンドセリン−
3と命名されている。これらのアイソペプチドのうちヒ
トにおいて最も活性発現量の多いのはエンドセリン−1
であることが確認されている。 [0003]エンドセリンは1強力かつ持続的な血管平
滑筋および気管の収縮作用を有し、高血圧症や気道狭窄
を惹起するとともに、高濃度(血中濃度1〜50pm。 1/m1程度)では、脳卒中、狭心症、心筋梗塞、心不
全、不整脈等の虚血性脳および心疾患、腎炎等の腎障害
、肺、肝、腸等の循環不全、喘息などの疾病を併発させ
、動物個体を死に至らしめることもある。 [0004]エンドセリン−1は、その前駆体であるビ
ックエンドセリン−1、すなわち次の式:%式%]
【]】
で示されるペプチドを、エンドセリン変換酵素によって
ビッグエンドセリン−1のN末端から21番目のトリプ
トファン残基と22番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基21個からなるペ
プチドである。この加水分解過程がエンドセリンの活性
発現に必須であると考えられる。このエンドセリン変換
活性を有する酵素に関する報告はこれまで培養ウシ血管
内皮細胞(K、0kada  et  al、、Bio
chemical  and  Biophysica
l  Re5earch  Communicatio
ns  171.1192  (1990) 、ウシ副
腎髄質(、T、Sawamura  et  al、、
Biochemicaland  Biophysic
al  Re5erchC。 mmunications  168,1230 (1
990)〕等についてなされているが、ヒト由来のエン
ドセリン変換活性を有する酵素の存在は未だに明らかに
されていない。 [0006]
【発明が解決しようとする課題】エンドセリンは上述の
ように著しい生理活性を有する化合物であるが、その前
駆体のビッグエンドセリンから酵素的変換によって生成
するものであるから、この変換酵素の解明によってエン
ドセリンの生体内での生成を抑制する手段を提供するこ
とになり、またこの変換酵素は生体の血管収縮反応の機
構の解析やエンドセリンが原因となる様々な病態の研究
に有力な試薬としての用途が期待されるのである。 [0007]さらにまたこの変換酵素の解明によりエン
ドセリンの分泌過多により誘発される様々な病態(高エ
ンドセリン症)、例えば高血圧、気道狭窄、虚血性脳お
よび心疾患、腎障害、諸臓器例えば肝、肺、腸等の循環
不全、喘息等の予防および治療の手段としてのこの変換
酵素の阻害剤の探索、開発に有力な手段を提供すること
になる。 [0008]かかる理由からヒI〜細胞中にこれ迄に見
出されていなかったエンドセリン変換酵素の解明とその
入手のための方法の開発が求められていた。 [0009]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述した課
題、すなわち、ヒト細胞中からエンドセリン変換酵素を
取り出すべく鋭意研究の結果、ヒ1〜細胞中にエンドセ
リン変換活性を有する酵素が存在することを見出し本発
明を完成したのである。 [00101本発明のエンドセリン変換酵素は、胎盤、
血管内皮、腎臓、大脳などのエンドセリンを産生してい
るヒト臓器および組織のヒト細胞を原料としてこれから
抽出して得られるものである。そして上記した臓器およ
び組織の入手の容易さから胎盤が有利に用いられる。し
かしながら、入手の容易さの観点を別にすれば胎盤以外
の臓器または組織からの、あるいは血液からの抽出も亘
能であることは勿論である。 [00111本発明のエンドセリン変換酵素は、ヒト細
胞に由来し、ビッグエンドセリン−1のN末端から21
番目のトリプトファン残基と22番目のバリン残基との
間を加水分解してビッグエンドセリン−1をエンドセリ
ン−1に変換する能力を有し、その至適pHが6.5へ
7.5で、分子量が約10万、約24万または50万り
上であるものにかかる。 [00121本発明のエンドセリン変換酵素は、臓器ま
たは組織の細胞膜を界面活性剤で処理して抽出液とし、
この抽出液を分別して得られる分子量が約10万である
ものと、50万以上であるものとの二つの画分からなり
、あるいはまた臓器または組織をホモジナイズし、彷ら
れたホモジネートから上清を分取し、このホモジネート
上清を超遠心分離に付してその上清を取り出して得られ
る細胞質両分を分別して得られる分子量が約24万であ
るものと、50万以上であるものとの二つの両分からな
るものである。 [0013]この四つのエンドセリン変換酵素のうち、
ヒト細胞膜由来の分子量が約10万であるもの(酵素■
)の性質は次のとおりである。 (a)  牛用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン−1に変換する。 (b)  基質特異性:ビックエンドセリン−1のN末
端から21番目のトリプトファン残基と22番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 (c)  至適pH:6. 5〜7. 5(d)  分
子量:約100000 (TSK−G3000SWを用
いたゲルろ過法により測定) (e)  阻害剤:エチレンジアミンテトラアセテ−1
へ(EDTA)、1.10−フェナントロリンにより阻
害を受ける。 [0014]またヒト細胞膜由来の分子量が50万以上
であるもの(酵素II)の性質は次のとおりである。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン1に変換する。 (b)  基質特異性:ビックエンドセリン−1のN末
端から21番目のトリプトファン残基と22番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 (c)  至適pH:6. 5〜7. 5(d)  分
′f量: 500000以上(TSK−G3000SW
を用いたゲルろ過法により測定)(e)   阻害剤:
エチレンジアミンテトラアセテート(EDTA)、1.
10−フェナントロリンにより阻害を受ける。 [0015]またヒト細胞膜由来の分子量が24万であ
るもの(酵素I I I)の性質は次のとおりである。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン=1に変換する。 (b)  基質特異性:ビックエンドセリン−1のN末
端から21番目のトリプトファン残基と22番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 (c)  至適pH:6. 5〜7. 5(d)  分
子量: 240000以上(TSK−G3000SWを
用いたゲルろ過法により測定)[0016]さらにまた
ヒト細胞膜由来の分子量が50万以上であるものく酵素
IV)の性質は次のとおりである。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン1に変換する。 (b)  基質特異性:ビックエンドセリン−1のN末
端から21番目のトリプトファン残基と22番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 (c)  至適pH:6. 5〜7. 5(d)  分
子量: 5ooooo以上(TSK−G3000SWを
用いたゲルろ過法により測定)(e)  阻害剤:エチ
レンジアミンテ1−ラアセテート(EDTA) 、1.
10−フェナントロリンにより阻害を受ける。 [0017]上記した本発明のエンドセリン変換酵素■
〜IVは本発明によれば胎盤、血管内皮、腎臓、大脳等
のエンドセリンを産生しているヒト臓器および組織のヒ
ト細胞を原料として得られる [0018]例えばヒト胎盤を原料とする場合、次のよ
うな操作によってこれをうろことができる。すなわち、
ヒト胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した後、
これに適当量の緩衝液、例えば25mMへベス、0.2
5Mシュークロース緩衝液(pH7,4)を加え、通常
用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホモジナ
イザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られたホモ
シネ−1−を遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る[0
019]こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣は、緩
衝液で充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取
し、以後の抽出操作に付す。ここで得られる洗浄沈渣は
、次に述べる胎盤ホモジネート上清を超遠心分離して得
られる沈渣部分と共に細胞膜に由来する成分である。次
いでこの洗浄沈渣は界面活性剤、例えばトリトンX−1
00、コール酸ナトリウム、3−1(3−コラミドプロ
ピル)ジメチルアンモニオ〕−1−プロパンスルホネー
ト(CHAPS) 、シュークロースモノカプレート等
を含む緩衝液に浸し、4℃〜8℃にて一晩放置後、遠心
分離して上清を集め、抽出液を得る。 [00201一方、分取した胎盤ホモジネート上清は、
更に50000g〜100000gの超遠心分離をして
沈渣部分であるマイクロシーム分画を得る。このマイク
ロシーム分画を洗浄後、上記と同様にして界面活性剤抽
出を行った後、超遠心分離して上清を集め、抽出液を得
る。 [0021]また、上記したように分取した胎盤ホモジ
ネー1〜上清を、更に50000g〜100000gの
超遠心分離にかけて得られた上清を回収することにより
、細胞質画分を得る。 [00221本酵素I〜IVの精製は、上述の細胞膜両
分または細胞質画分を通常の酵素の精製に用いる手段を
利用することにより達成できる。例えば、アサヒバツク
HC−N200  (旭化成工業社製)によるクロマト
グラフィー、Q−セファロースバイパフォーマンス(フ
ァルマシア社製)によるクロマトグラフィー、フェニル
スーパーロース(ファルマシア社製)によるクロマトグ
ラフィー、スーパーデックス200 (ファルマシア社
製)によるゲルろ過、TSK−G3000SW (東ソ
ー社製)によるゲルろ過等の手段を適宜組み合わせ、ビ
ッグエンドセリン−1をエンドセリン−1に変換する活
性を指標として、本発明のエンドセリン変換酵素を精製
することができる。 [00231本発明のエンドセリン変換酵素■〜IVの
活性は力価によって表現されるが、この力価の測定はつ
ぎのようにして行なわれる。 [0024]  (1)  酵素活性の測定法1、ml
の4μg/mlビッグエンドセリンー1溶液(100m
Mトリス−塩酸緩衝液、pH7,0)に0.1mlの酵
素溶液を添加し、37℃にて3時間反応させる。 反応後100℃10分間の処理を行い反応を停止させる
。次いで、生じたエンドセリン−1をサンドインチ−E
IA法により定量する。上記反応条件にて1時間に1p
molのビッグエンドセリン−1をエンドセリン−1に
変換する酵素活性をIU(単位)とする。 [0025]  (2)  サンドインチ−EIA法抗
エンドセリン−1モノクロ一ナル抗体を固相化した96
六マイクロプレートに、検体および既知濃度のエンドセ
リン−1標準液を加え反応させる。マイクロプレートを
洗浄後、ビオチン標準抗エンドセリンーJポリクローナ
ル抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジンを加え反応
させる。マイクロプレートを洗浄後、結合したペルオキ
シダーゼ活性を測定する。既知濃度のエンドセリン−1
標準液による検量線から検体中のエンドセリン−1を定
量する。 [0026]  (3)  抗エンドセリンー1モノク
ローナル抗体の作成 エンドセリン−1とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をマ
ウスに免疫し、常法に従い、免疫マウス牌細胞とマウス
ミエローマを細胞融合し、ハイブリドーマを作成、エン
ドセリン−1に対する抗体を産生するハイブリドーマを
クローン化する。クローン化されたハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体をプロティンAカラムで精製
し、抗エンドセリンー1モノクローナル抗体を作成する
。 [0027]  (4)  抗エンドセリンー1ポリク
ローナル抗体 エンドセリン−1とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をウ
サギに免疫し抗血清を得る。抗血清からプロティンAカ
ラムで抗体画分を得る。抗体画分をビッグエンドセリン
1固定化カラムに付し、カラムに結合した両分を集め、
抗エンドセリンー1ポリクローナル抗体を作成する。得
られた抗エンドセリンー1ポリクローナル抗体をビオチ
ン化し、ビオチン標識抗エンドセリンー1ポリクローナ
ル抗体を作成する。 [0028]次ぎに、本発明のエンドセリン変換酵素I
〜IVの酵素化学的特性について述べる。 [0029]  (a)作用 ビッグエンドセリン−1をエンドセリン−1に変換する
。 [00301(b)  基質特異性 ビッグエンドセリン−1のN末端から21番目のトリプ
トファン残基と22番目のバリン残基との間を加水分解
する。50mMトリス−塩酸緩衝液(pH7,0)にお
いてビッグエンドセリン−1に本酵素を37℃にて3時
間作用させ、生成物をイナートシルODSカラム(ジ−
エルサイエンス社製)を用いた逆相クロマ1〜グラフイ
ーに付し、0.05%トリフルオロ酢酸−10%アセト
ニトリル溶液から0.05%トリフルオロ酢酸−50%
アセ1へニトリル溶液への直線的濃度勾配により分析し
たところ、ビッグエンドセリン−1のピーク以外に2つ
のピークが出現し、それらのピークの溶出位置は、エン
ドセリン−1およびビッグエンドセリン−1のN末端よ
り22番目のバリンから38番目のセリンまでのビッグ
エンドセリン−1の部分ペプチドと同一であった。この
結果より、本変換酵素によりビッグエンドセリン−1の
N末端から21番目のトリプトファン残基と22番目の
バリン残基との間が加水分解されていることがわかる。 [00311(c)  至適pH 木エンドセリン変換酵素の至適pHの測定は、各々のp
Hの50mM緩衝液にて調製したビッグエンドセリン−
1溶液に、本エンドセリン変換酵素を加え、37℃で反
応することによって行った。使用した緩衝液は、pH2
,0〜7.5   クエン酸−リン酸緩衝液pH7,5
〜9.0トリス−塩酸緩衝液pH9,0〜12.0 炭
酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液である。 測定の結果、本エンドセリン変換酵素I−IVは、pH
6,5〜7.5の範囲において最も強い活性を示した。 [0032]  (d)  分子量 TSK−G3000SW (東ソー社製)のカラムによ
るゲルろ適法のカラムクロマトグラフィーにより分子量
既知の標準品と共に分離、分画を行い、本エンドセリン
変換酵素I、II、IIL IV、の分子量を推定した
ところ、それぞれ約10万、50万以上、約24万およ
び50万以上であった。 [0033]  (e)  阻害剤 本酵素の、ビッグエンドセリン−1をエンドセリン−1
に変換する変換活性に対する各種阻害剤の効果を調べた
。各種阻害剤を含む100μlの反応液(50mMトJ
スー塩酸緩衝液、pH7,0)中において本酵素を37
℃、30分間インキュベー1へし、残存する酵素活性を
前述の方法にて測定した。各阻害剤存在下における残存
活性を、無処理の活性を100とした相対活性で表した
結果を表で示す。表1は酵素■、表2は酵素II、そし
て表3は酵素IVについての結果である。 [0034]
【表1】 [0035]
【表2】 [0036]
【表3】 [0037]つぎに、実施例によって本発明を更に詳細
に説明するが、本発明は、これらによって限定されるも
のではない。 [0038]
【実施例1】胎盤細胞膜両分の調製 ヒト胎盤(約5g)より、膿等を除去し、生理食塩水で
充分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に、2
5mMヘペス、0.25Mシュークロース緩衝液(pH
7,4)20mlを加え、ポリトロン(Polytor
on)ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得ら
れたホモジネートを1000g、20分間遠心分離し、
上清を分取した。この上清10000g、20分間、再
び遠心分離し、その上清及び沈渣を得た。 [0039]こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣に
、上記と同一の緩衝液10m1を加え、充分洗浄し、再
度10000g、20分間の遠心分離を行い、洗浄沈渣
を分取した。得られた洗浄沈渣に、10m1の0. 5
%トリトンX−1,00含有25mMヘペス、0.25
Mシュークロース緩衝液(pH7,4)を加え、4℃に
て一夜放置後、1000g、20分間遠心分離して、抽
出液約9mlを得た。 [00401一方、胎盤ホモジネート上清は、1000
00g、2時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した。 この超遠心分離沈渣に、2mlの0.5%トリトン−X
100含有25mMへベス、0.25Mシュークロース
緩衝液(pH7,4)を加え、4℃にて一夜放置後、再
び100000g、2時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約1..5mlを得た。胎盤ホモジネート沈
渣より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心
分離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜画分約
10.5mlを得た。 [00411
【実施例2]精製酵素(分子量50万以上の酵素II)
の調製 [0042]  (i)  実施例1で得られた細胞膜
画分約10.5mlを、0.1Mトリス−塩酸緩衝液(
pH7,0)で平衡化したアサヒバツクHC−N200
 (旭化成工業社製)のカラムに付し、同緩衝液にて溶
出させ、試料中のトリトンX−100を除去した。トリ
ジX100を除去した細胞膜画分を、10mMトリス−
塩酸緩衝液(pH8,0)で平衡化したQ−セファロー
スバイパフォーマンス(ファルマシア社製)のカラム(
φ2.6X10cm)に吸着させ、同緩衝液にて充分洗
浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度を直線的に
0〜250mMに上げることにより、酵素を溶出し、酵
素活性を有する両分を集めた。得られた活性画分をダイ
アフローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社
製)を用いて5.0mlまで濃縮した。この濃縮液を、
0.1Mhリスー塩酸、0.3M  NaC1緩衝液(
pH7,0)で平衡化したスーパーテックス200 (
ファルマシア社製)のカラム(中2゜6X60cm)に
付し、同一緩衝液で溶出した。 [00431(i i)  上記した(i)の操作によ
って溶出した溶出体積100m1〜150m1の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクシ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社
製)を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素IIを
得た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素IIの総
括性は約350Uであった。 [0044]  (i i i)  このようにして得
られた精製エンドセリン変換活性IIの100 g 1
を、0.1MトJスー塩酸、0.8M  NaC1緩衝
液(pH7,0)で平衡化したTSK−G3000SW
 (7,5mmφ×60cm、東ソー社製)のカラムに
よるゲルろ適法のカラムクロマトグラフィーに付し、同
一緩衝液にて、分子量既知の標準品(グルタメートデヒ
ドロゲナーゼ:分子量29万、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼ:分子量14万、エノラーゼ:分子量6.7万、ア
デニレートキナーゼ:分子量3,2万、チトクロムC:
分子量1.24万)と共に分離、分画を行い、各画分の
エンドセリン変換活性を前述の方法で測定し、変換活性
ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換酵素IIの
分子量を推定したとこる50万以上であった。結果を図
1に示す。 [00451 【実施例3]基質特異性 実施例2で得られた精製エンドセリン変換酵素II  
1mlに、0.1mg/mlビッグエンドセリン溶液4
0μlを添加し、37℃にて3時間反応させ、生成物を
イナートシルODSカラム(ジ−エルサイエンス社製)
を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、0.05%ト
リフルオロ酢酸−10%アセトニI−リル溶液から0.
05%トリフルオロ酢酸−50%アセトニトリル溶液へ
の直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンド
セリン−1のピーク以外に2つのピークが出現した。そ
れらのピークの溶出位置は、エンドセリン−1およびビ
ッグエンドセリン−1のN末端より22番目のバリンか
ら38番目のセリンまでのビックエンドセリン−1の部
分へプチドと同一であった。 [0046] 【実施例4】至適pHの測定 各々のpHの50mM緩衝液(pH2,0〜7. 5ク
エン酸−リン酸緩衝液、pH7,5〜9.0トリス−塩
酸緩衝液、pH9,0〜12.0炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液)にて精製したビッグエンドセ
リン−1溶液200μlに、実施例2で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素II  50μmを加え、37℃に
て3時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定
した結果、図2に示すように、本エンドセリン変換酵素
IIはpH6,5〜7.5の範囲において最も強い活性
を示した。 [0047]
【実施例5】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む100μlの反応液(50mMトリス
塩酸緩衝液、pH7,0)中において、実施例2で得ら
れた精製エンドセリン変換酵素IIを37℃にて30分
間インキュベートし、次いで、これに0.1mg/ml
ビッグエンドセリンー1溶液4μmを添加し、37℃に
て3時間反応させた。反応後、1,00℃、10分間の
処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−1を
前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した。 各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を1
00とした相対活性で表し、表2に示した。 [00481
【実施例6]精製酵素(分子量約10万の酵素」)の調
製 [00491(i)  実施例1で得られた細胞膜両分
について、実施例2(i)に記載の操作を行なった。 [00501(i i)  上述した(i)の操作によ
って溶出した溶出体積170m1〜210m1の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクシ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社
製)を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素Iを得
た。 尚、得られた精製エンドセリン変換酵素■の総活性は約
350Uであった。 [00511(i ii)  このようにして得られた
精製エンドセリン変換酵素■の100μlを、0.1M
トリス−塩酸、0.3M  NaC1緩衝液(pH7,
0)で平衡化したTSK−G3000SW (7,5m
mφ×60cm、東ソー社製)のカラムによるゲルろ適
法のカラムクロマトグラフィーに付し、同一緩衝液にて
、分子量既知の標準品(グルタメートデヒドロゲナーゼ
:分子量29万、ラクテートデヒドロゲナーゼ:分子量
14万、エノラーゼ:分子量6,7万、アデニレートキ
ナーゼ二分子量3.2万、チトクロムC:分子量1,2
4万)と共に分離、分画を行い、各画分のエンドセリン
変換活性を前述の方法で測定し、変換活性ピークの溶出
位置より、本エンドセリン変換酵素Iの分子量を推定し
たところ約10万であった。結果を図3に示す。 [0052] 【実施例7】基礎特異性 実施例6で得られた精製エンドセリン変換酵素I  1
mlに、0.1mg/mlビッグエンドセリン溶液40
μlを添加し、37℃にて3時間反応させ、生成物をイ
ナートシルODSカラム(ジ−エルサイエンス社製)を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、0.05%トリ
フルオロ酢酸−10%アセトニトリル溶液から0.05
%1−リフルオロ酢酸−50%アセトニトリル溶液への
直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセ
リン1のピーク以外に2つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−1およびビッグ
エンドセリン−1のN末端より22番目のバリンから3
8番目のセリンまでのビッグエンドセリン−1の部分ペ
プチドと同一であった。 [0053]
【実施例8】至適pHの測定 各々のpHの50mM緩衝液(pH2,0〜7.5クエ
ン酸−リン酸緩衝液、pH7,5〜9.0トリス−塩酸
緩衝液、pH9,0〜12.0炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液)にて調整したビッグエンドセリ
ン−1溶液200μlに、実施例6で得られた精製エン
ドセリン変換酵素I  50μlを加え、37℃にて3
時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した
結果、図4に示すように、本エンドセリン変換酵素II
はpH6,5〜7.5の範囲において最も強い活性を示
した。 [0054]
【実施例9】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む100μIの反応液(50mMトリス
−塩酸緩衝液(pH7,0)中において、実施例6で得
られた精製エンドセリン変換酵素■を37℃にて30分
間インキュベートし、次いで、これに0.1mg/ml
のビッグエンドセリン−1溶液4721を添加し、37
℃にて3時間反応させた。反応後、100℃、10分間
の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−1
を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した
。 各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を1
00とした相対活性で表し、表1に示した。 [0055]
【実施例10】胎盤細胞質画分の調製 ヒト胎盤(約5g)より、膜等を除去し、生理食塩水で
十分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に25
mMへペス、0.25Mシュークロース緩衝液(pH7
,4)20mlを加え、ポリトロン(Polytoro
n)ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得られ
たホモジネートを1000g、20分間遠心分離し、上
清を分取した。この上清を10000g、20分間、再
び遠心分離し、その上清を分取した。得られた上清を1
00000g、2時間超遠心分離し、約20m1の上清
を回収、細胞質画分とした。 [0056]
【実施例11】精製酵素(分子量50万以上の酵素■V
)の調製実施例10で得られた細胞質画分約20m1を
、10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8,0)で平衡化
したQ−セファロースバイパフォーマンス(ファルマシ
ア社製)のカラム(中2゜6X10cm)に吸着させ、
同緩衝液にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリ
ウム濃度を直線的に0〜250mMに上げることにより
、酵素を溶出し、酵素活性を有する両分を集めた。 [0057]得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターPM−10(アミコン社製)を用いて5゜
0mlまで濃縮した。この濃縮液を、予め0.1Mトリ
ス−塩酸、0.3MNaC1緩衝液(pH7; 0)で
平衡化したスーパーテックス200(ファルマシア社製
)のカラム(中2゜6X60cm)に付し、同一緩衝液
で溶出し、溶出体積100m1〜150m1の付近をフ
ラグショネーションし、これらのフラクションについて
前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクショ
ンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイア
フローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社製
)を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素IVを得
た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素IVの総活
性は約350Uであった。 [0058]
【実施例12】基質特異性 実施例11で得られた精製エンドセリン変換活性IV1
mlに、0.1mg/mlビッグエンドセリン溶液40
μmを添加し、37℃にて3時間反応させ、生成物をイ
ナートシルODSカラム(ジ−エルサイエンス社製)を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、0.05%トリ
フルオロ酢酸−10%アセトニトリル溶液から0.05
%トリフルオロ酢酸−50%アセトニトリル溶液への直
線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセノ
ン−1のピーク以外に2つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−1およびビッグ
エンドセリン−1のN末端より22番目のバリンから3
8番目のセリンまでのビックエンドセリン−1の部分ペ
プチドと同一であった。 [0059]
【実施例13】至適pHの測定 各々のpHの50mM緩衝液(pH2,0〜7. 5ク
エン酸−リン酸緩衝液、pH7,5〜9.0トリス−塩
酸緩衛液、pH9,0〜12.0炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液)にて調製したビッグエンドセ
リン−1溶液200μmに、 実施例11で得られた精
製エンドセリン変換酵素IV  50μIを加え、37
℃にて3時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を
測定した結果、図5に示すように、本エンドセリン変換
酵素IVはpH6,5〜7,5の範囲において最も強い
活性を示した。 [00603
【実施例14]分子量の測定 実施例11で得られた精製エンドセリン変換酵素IVの
100μmを、O,1Mトリス−塩酸、0.3M  N
aC1緩衝液(pH7,0)で平衡化したTSF’−G
3000SW (7,5mmφX60cm、東ソー社製
)のカラムによるゲルろ適法のカラムクロマトグラフィ
ーに付し、同一緩衝液にて、分子量既知の標準品(グル
タメートデヒドロゲナーゼ二分子量29万、ラクテート
ヒドロゲナーゼ:分子量14万、エノラーゼ:分子量6
,7万、アデニレートキナーゼ:分子量3.2万、チト
クロムC:分子量1.24万)と共に分離、分画を行い
、各両分のエンドセリン変換活性を前述の方法で測定し
、変換活性ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換
酵素IVの分子量を推定したところ50万以上であった
。結果を図6に示す。 [0061,] 【実施例15】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む100μlの反応液(50mMトリス
塩酸緩衝液、pH7,0)中において、実施例11で得
られた精製エンドセリン変換酵素IVを37℃にて30
分間インキュベートし、次いで、これに0.1mg/m
lのビッグエンドセリン−1溶液47Llを添加し、3
7℃にて3時間反応させた。反応後、100℃、10分
間の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン1
を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した
。各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を
100とした相対活性で表し、表3に示した。 [0062]
【実施例16】精製酵素(分子量24万の酵素I I 
I)の調製 実施例10で得られた細胞質両分約20m1を、10m
Mトリス−塩酸緩衝液(pH8,0)で平衡化したQ−
セファロースバイパフォーマンス(ファルマシア社製)
のカラム(中2゜6X10cm)に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度
を直線的に0〜250mMに上げることにより、酵素を
溶出し、酵素活性を有する画分を集めた。 [0063]得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターPM−10(アミコン社製)を用いて5゜
0mlまで濃縮した。この濃縮液を、予め0.1Mトリ
ス−塩酸、0.3MNaC1緩衝液(pH7,0)で平
衡化したスーパーテックス200 (ファルマシア社製
)のカラム(中2゜6X60cm)に付し、同一緩衝液
で溶出し、溶出体積1.60m1〜180m1の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラグジ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターPM−10(アミコン社
製)を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素III
を得た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素III
の総括性は約150Uであった。 [0064]
【実施例17】基礎特異性 実施例16で得られた精製エンドセリン変換酵素III
1mlに、0゜1mg/mlビッグエンドセリン溶液4
0μlを添加し、37℃にて3時間反応させ、精製物を
イナートシルODSカラム (ジ−エルサイエンス社製
)を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、0.05%
トリフルオロ酢酸−10%アセI−二トリル溶液から0
.05%トリフルオロ酢酸−50%アセトニトリル溶液
への直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエン
ドセリン−1のピーク以外に2つのピークが出現した。 それらのピークの溶出位置は、エンドセリン−1および
ビッグエンドセリン−1のN末端より22番目のバリン
から38番目のセリンまでのビッグエンドセリン−1の
部分ペプチドと同一であった。 [0065]
【実施例18】至適pHの測定 各々のpHの50mM緩衝液(pH2,0〜7. 5ク
エン酸−リン酸緩衝液、pH7,5〜9.0トリス−塩
酸緩衝液、pH9,0〜]2.0炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液)にて調製したビッグエンドセ
リン−1溶液200μlに、実施例16で得られた精製
エンドセリン変換酵素III  50μlを加え、37
℃にて3時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を
測定した結果、図7に示すように、木エンドセリン変換
酵素IIIはpH6,5〜7.5の範囲において最も強
い活性を示した。 [0066]
【実施例1−9】分子量の測定 実施例16で得られた精製エンドセリン変換酵素III
の100 lLlを、0.1Mトリス−塩酸、0.3M
  NaC1緩衝液(pH7,0)で平衡化したT S
 K −G 3000SW (7,5mmφX60cm
、東ソー社製)のカラムによるゲルろ適法のカラムクロ
マトグラフィーに付し、同一緩衝液にて、分子量既知の
標準品(グルタメートデヒドロゲナーゼ:分子量29万
、ラクテートヒドロゲナーゼ:分子量14万、エノラー
ゼ:分子量6.7万、アデニレートキナーゼ:分子量3
.2万、チ1−クロムC:分子量1,24万)と共に分
離、分画を行い、各画分のエンドセリン変換活性を前述
の方法で測定し、変換活性ピークの溶出位置より、木エ
ンドセリン変換酵素IIIの分子量を推定したところ約
24万であった。結果を図8に示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例2で得られるエンドセリン変換酵素II
の分子量決定のための試験結果を図示したものである。
【図2】実施例2で得られるエンドセリン変換酵素II
の至適pHの試験結果を図示したものである。
【図3】実施例6で得られるエンドセリン変換酵素Iの
分子量決定のための試験結果を図示したものである。
【図4】実施例6で得られたエンドセリン変換酵素Iの
至適pHの試験結果を図示したものである。
【図5】実施例11で得られるエンドセリン変換酵素■
Vの至適pHの試験結果を図示したものである。
【図6】実施例11で得られるエンドセリン変換酵素■
Vの分子量決定のための試験結果を図示したものである
【図7】実施例16で得られたエンドセリン変換酵素■
IIの至適pHの試験結果を図示したものである。
【図8】実施例16で得られるエンドセリン変換酵素■
IIの分子量決定のための試験結果を図示したものであ
る。
【図3】
【手続補正書】
【提出日】平成3年10月23日
【手続補正1】
【補正対象項目名】明細書
【補正対象項目名] 0005 【補正方法】変更
【補正内容】
[0005]
【化1】 で示されるペプチドを、エンドセリン変換酵素によって
ビッグエンドセリン−1のN末端から21番目のトリプ
トファン残基と22番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基21個からなるペ
プチドである。この加水分解過程が生体内におけるエン
ドセリンの産生に必須であると考えられる。このエンド
セリン変換活性を有する酵素に関する報告はこれまで培
養ウシ血管内皮細胞[K、0kada  et  al
、。 Biochemtcal  andBiophysic
ai   Re5earch  COmmtiniCa
tiOnS171.1192  (1990))、ウシ
副腎髄質[T。 Sawamura  etal、、Biochemic
al  and  Biophysical  Res
erchCommunications  168,1
230  (1990)3等についてなされているが、
ヒト由来のエンドセリン変換活性を有する酵素の存在は
未だに明らかにされていない。
【手続補正2】
【補正対來書類名】明細書
【補正対象項目名1001.5 【補正方法】変更
【補正内容】
[o 0151またヒト細胞質由来の分子量が24万で
あるもの(酵素I I I)の性質は次のとおりである
。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエンドセリ
ン1に変換する。 (t))  基質特異性:ビックエ
ンドセリン−lのN末端から21番目のトリプトファン
残基と22番目のバリン残基との間を加水分解する。 
(C)至適pH:6.5へ−7,5(d)  分子量:
 240000以上(TSK、−G3000 SWを用
いたゲルろ過法により測定)
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名10016 【補正方法】変更
【補正内容】
[0016]さらにまたヒト細胞質由来の分子量が50
万以上であるもの(酵素IV)の性質は次のとおりであ
る。 (a)  作用:ビックエンドセリン−1をエン
ドセづン−1に変換する。 (b)  基質特異性:ビ
ックエンドセリン−1のN末端から21番目のトリプト
ファン残基と22番目のバリン残基との間を加水分解す
る。 (c)  至適pH: 6. 5〜7. 5 (d) 
 分子量:500000以上(TSK−G3000SW
を用いたゲルろ過法により測定) (e) 阻害剤:エ
チレンジアミンテ1へラアセテ−1−(EDTA)、1
.10−ツェナシトロリンにより阻害を受ける。
【手続補正4】
【補正対像書類名】明細書
【補正対象項目名10018 【補正方法】変更
【補正内容】
[0018]例えばヒ1−胎盤を原料とする場合、次の
ような操作によってこれをうろことができる。すなわち
、ヒ1−胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した
後、これに適当量の緩衝液、例えば25mMへベスー0
. 25Mシュークロース緩衝液(pH7,4)を加え
、通常用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホ
モジナイザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られ
たホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名10024 【補正方法】変更
【補正内容】
[0024]  (1)  酵素活性の測定法ng/m
↓9旦ッグエンドッグエンドセリン−1溶液(100m
Mhリス塩酸緩衝液、pH7,0)に0.1mlの酵素
溶液を添加し、37℃にて3時間反応させる。反応後1
00℃10分間の処理を行い反応を停止させる。次いで
、生じたエンドセリン−1をサンドイッチ−EIA法に
より定板する。上記反応条件にて12時間にlpmol
のビッグエンドセリン−1をエンドセリン〜1に変換す
る酵素活性をIU(単位)とする。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名)0038 【補正方法】変更
【補正内容】
[0038]
【実施例1】胎盤細胞膜画分の調製しh胎盤(約5g)
より、膜等を除去し、生理食塩水で充分洗浄後、微小断
片化した。この胎盤微小断片に、25mMへペス−0゜
25Mシュークロース緩衝液(pH7,4)20mlを
加え、ポリトロン(Polytoron)ホモジナイザ
ーを用いてホモジナイズした。得られたホモシネ−1−
を1000g、20分間遠心分離し、上清を分取した。 この丘清を1. OO00g、20分間、再び遠心分離
し、その上清及び沈渣を得た。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0039 【補正方法】変更
【補正内容】
[00391こうして得られた胎盤ホモシネ−1・・沈
渣に、上記と同一の緩衝液10m1を加え充分洗浄し、
再度10000g、20分間の遠心分離を行い、洗浄沈
渣を分取した 。得られた洗浄沈渣に、10m1の0.
5%トリトンX−100含有25mMヘペスー0.25
Mシュークロース緩衝液(pH7,4)を加え、4℃に
て一夜放置後、]、0000g20分間遠心分離して、
抽出液約9mlを得た。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名10040 【補正方法】変更
【補正内容】
[00401−一方、胎盤ホモジネート上清は、100
000g、2時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した
。 この超遠心分離沈渣に、2mlの0.5%トリトン−X
100含有25mMヘペスー0.25Mシュークロース
緩衝液(pH7,4)を加え、4℃にて一夜放置後、再
び100000g、2時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約1.5mlを得た。胎盤ホモジネート沈渣
より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心分
離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜両分約1
0.5mlを得た。
【手続補正9】
【補正対宋書類名】明細書
【補正対象項目名] 0046 【補正方法】変更
【補正内容】
[0046]
【実施例4】至適p)(の測定各々のpHの50mM緩
衝液(pH2,0〜7.5クエン酸−リン酸緩衝液、p
H7,5〜9.Ol−リス−塩酸緩衝液、pH9,0〜
12.0炭酸水素ナトリウム−水酸化す1−リン酸緩衝
液)に工週製したビッグエンドセリン−1溶液200 
/11に、実施例2で得られた精製エンドセリン変換酵
素ll50μlを加え、37℃にて3時間反応を行った
後、前述の方法で酵素活性を測定した結果、図2に示す
よう(二本エンドセリン変換酵素IIはpH6,5〜7
.5の範囲において最も強い活性を示した。
【手続補正1] 【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0052 【補正方法】変更
【補正内容】
[0052]
【実施例7】基礎特異性実施例6で得られた精製エンド
セリン変換酵素I  1mlに、0.1mg/mlビッ
グエンドセリンー [溶液40 lLIを添加し、37
℃にて3時間反応させ、生成物をイナー1ヘシルODS
カラム(ジ−エルサイエンス社製)を用いた逆相クロマ
トグラフィーに付し、0.05%1へリフルオロ酢酸−
10%アセ1−二l−リル溶液から0,05%1ヘリフ
ルオロ酢酸−50%アセ[・ニトリル溶液への直線的濃
度勾配により分析したところ、ビックエンドセリン−1
のピーク以外に2つのピークが出現した。それらのピー
クの溶出位置は、エンドセリン−1およびビッグエンド
セリン−1のN末端より22番[]のバリンから38番
目のセリンまでのビッグエンドセリン−1の部分ペプチ
ドと同一であった。
【手続補正11】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0053 【補正方法】変更
【補正内容】
[0053]
【実施例8】至適pHの測定各々のpHの50mM緩衝
液(pH2,0〜7.5クエン酸−リン酸緩衝液、pH
7,5〜9.0トリス−塩酸緩衝液、pH9,0〜12
.0炭酸水素す1へリウムー水酸化ナトリウム緩衝液)
にて調製したビッグエンドセリン−1,溶液200μm
(二実施例6で得られた精製エンドセリン変換酵素I5
0μIを加え、37℃にて3時間反応を行った後、前述
の方法で酵素活性を測定した結果、図4に示すように、
本エンドセリン変換酵素IIはpH6,5〜7.5の範
囲において最も強い活性を示した。
【手続補正]2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0055 【補正方法】変更
【補正内容】
[0055]
【実施例10】胎盤細胞質両分の調製ヒ1−胎盤(約5
g)より、膜等を除去し、生理食塩水で十分洗浄後、微
小断片化した。この胎盤微小断片に25mMへペスし2
5Mシュークロース緩衝液(pH7,4)20mlを加
え、ポリ1−ロン(Polytoron)ホモジナイザ
ーを用いてホモジナイズした。得らねだホモシネ−1−
を1000g、20分間遠心分離し5、上清を分取した
。この上清を1−0000 g、20分間、再び遠心分
離し、その上清を分取した。得られた一上清を1000
00g、2時間超遠心分離し、約20m1の上清を回収
、細胞質画分としまた。
【手続補正]、3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0058 【補正方法】変更
【補正内容】
[0058]
【実施例1,2】基質特異性実施例]、1で得られた精
製エンドセリン変換酵素K V 1 m lに、0.1
mg/mlビッグエンドセリンー1溶液40μmを添加
し、37℃にて3時間反応させ、生成物をイナーhシル
ODSカラム(ジ−エルサイエンス社製)を用いた逆相
クロマトグラフィーに付し、0.05%1ヘリフルオロ
酢酸−10%アセ1ヘニトリル溶液から0.05%トリ
フルオロ酢酸−50%アセI−二I〜リル溶液への直線
的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセリン
−1のピーク以外に2つのピークが出現した。それらの
ピークの溶出位置は、エンドセリン−1およびビッグエ
ンドセリン−1のN末端より22番目のバリンから38
番目のセリンまでのビックエンドセリン−1,の部分ペ
プチドと同一であった。
【手続補正14】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名] 0064 【補正方法】変更
【補正内容】
[0064]
【実施例17】基礎特異性実施例16で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素II11mlに、o、]、、]mg
/m1ビッグエンドセリンー1溶液40μを添加し、3
7℃にて3時間反応させ、精製物をイナートシルODS
カラム(ジ−エルサイエンス社製)を用いた逆相クロマ
トグラフィーに付し、0.05%トリフルオロ酢酸−1
0%アセl−二トリル溶液から0.05%トリフルオロ
酢酸50%アセ1へ二1ヘリル溶液への直線的濃度勾配
により分析したところ、ビックエンドセリン−1のピー
ク以外に2つのピークが出現した。それらのピークの溶
出位置は、エンドセリン−1およびビッグエンドセリン
−1のN末端より22番目のバリンから38番目のセリ
ンまでのビッグエンドセリン−]−の部分ペプチドと同
一であった。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ビッグエンドセリン−1のN末端から21
    番目のトリプトファン残基と22番目のバリン残基との
    間を加水分解してビッグエンドセリン−1をエンドセリ
    ン−1に変換する、至適pHが6.5〜7.5で、分子
    量が約10万、約24万または50万以上である、ヒト
    細胞由来エンドセリン変換酵素。
JP2413579A 1990-12-07 1990-12-07 ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 Expired - Fee Related JP2966939B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2413579A JP2966939B2 (ja) 1990-12-07 1990-12-07 ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2413579A JP2966939B2 (ja) 1990-12-07 1990-12-07 ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH04210593A true JPH04210593A (ja) 1992-07-31
JP2966939B2 JP2966939B2 (ja) 1999-10-25

Family

ID=18522190

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2413579A Expired - Fee Related JP2966939B2 (ja) 1990-12-07 1990-12-07 ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2966939B2 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0545344A2 (en) * 1991-11-29 1993-06-09 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Endothelin,converting enzymes
WO1995014095A1 (de) * 1993-11-16 1995-05-26 Basf Aktiengesellschaft Endothelinkonversionsenzym (ece)
WO1995016043A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-15 Zeneca Limited Cloning of endothelin converting enzyme

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0545344A2 (en) * 1991-11-29 1993-06-09 Nisshin Flour Milling Co., Ltd. Endothelin,converting enzymes
EP0545344A3 (ja) * 1991-11-29 1994-02-16 Nisshin Flour Milling Co
WO1995014095A1 (de) * 1993-11-16 1995-05-26 Basf Aktiengesellschaft Endothelinkonversionsenzym (ece)
WO1995016043A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-15 Zeneca Limited Cloning of endothelin converting enzyme

Also Published As

Publication number Publication date
JP2966939B2 (ja) 1999-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH06505561A (ja) レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のcDNAクローニング方法及びhGRBタンパク質
VAN et al. CaBP2 is a rat homolog of ERp72 with proteindisulfide isomerase activity
JPS6163295A (ja) 免疫インタ−フエロンの製法
JP2559537B2 (ja) プロテインcに対するモノクローナル抗体
CN101074264A (zh) 一种重组抗ctla4单克隆抗体及其制备方法和用途
Marques et al. N-domain angiotensin I-converting enzyme with 80 kDa as a possible genetic marker of hypertension
JPH04210593A (ja) ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素
IL94201A (en) Antibodies that increase the rate of fission of the peptide bond
Zampar et al. Acetylated tubulin associates with the fifth cytoplasmic domain of Na+/K+-ATPase: possible anchorage site of microtubules to the plasma membrane
AU657678B2 (en) Inhibitors of catalytic antibodies
EP0644261B1 (en) Endothelin converting enzyme consisting of apolipoprotein B
US6159723A (en) Renin-active substance
JPH04210594A (ja) ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素
KR20070039704A (ko) 803번 아스파라진 잔기가 수화된 HIF-1α를 특이적으로인식하는 단일클론항체 및 항원 펩티드
JPH04252954A (ja) タンパクの測定方法、試薬及びキット
JP2002504686A (ja) プロテインキナーゼc
Kim et al. Human brain pyridoxal-5'-phosphate phosphatase: Production and characterization of monoclonal antibodies
CN101074263A (zh) 一种重组抗proteinA单克隆抗体及其制备方法和用途
JPH0753757B2 (ja) モノクローナル抗体及びその使用方法
JPH05268956A (ja) ヒト細胞由来エンドセリン変換酵素
JP3232415B2 (ja) モノクローナル抗体,その製造法および用途
JP3179902B2 (ja) エンドセリン変換酵素およびその製造方法
EP0535038A1 (en) Mammalian adipogenic factors
Shaposhnikov et al. IMMOBILIZATION OF PROTEOLYTIC ENZYMES ON AGAROSE SURFACE AND DETERMINATION OF PROTEOLYTIC ACTIVITY OF IMMOBILIZED ENZYMES
WO2003016347A1 (fr) Procede de preparation d'un fragment peptidique presentant une activite inhibitrice de mort cellulaire

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees