JPH04210593A - ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 - Google Patents
ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素Info
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
［０００１］
【産業上の利用分野】本発明は、ビッグエンドセリン１
をエンドセリン−１に変換する活性を有するヒト細胞由
来エンドセリン変換酵素と、ヒト細胞から本酵素を抽出
および精製することからなる本酵素の製造法に関する。 ［０００２］
をエンドセリン−１に変換する活性を有するヒト細胞由
来エンドセリン変換酵素と、ヒト細胞から本酵素を抽出
および精製することからなる本酵素の製造法に関する。 ［０００２］
【従来の技術】エンドセリン（Ｅｎｄｏ ｔ ｈｅ ｌ
ｉ ｎ）は１９８８年、柳沢らによって発見された内
皮細胞由来の血管平滑筋収縮因子であり［Ｍ、Ｙａｎａ
ｇ ｉ ｓａｗａ ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ
３３２，４１１ （１９８８））、ブタ、ウシ、ヒ
ト等においてその存在が確認されている。また、エンド
セリンには、３種のアイソペプチドが存在し、それぞれ
エンドセリン−１，エンドセリン−２、エンドセリン−
３と命名されている。これらのアイソペプチドのうちヒ
トにおいて最も活性発現量の多いのはエンドセリン−１
であることが確認されている。 ［０００３］エンドセリンは１強力かつ持続的な血管平
滑筋および気管の収縮作用を有し、高血圧症や気道狭窄
を惹起するとともに、高濃度（血中濃度１〜５０ｐｍ。 １／ｍ１程度）では、脳卒中、狭心症、心筋梗塞、心不
全、不整脈等の虚血性脳および心疾患、腎炎等の腎障害
、肺、肝、腸等の循環不全、喘息などの疾病を併発させ
、動物個体を死に至らしめることもある。 ［０００４］エンドセリン−１は、その前駆体であるビ
ックエンドセリン−１、すなわち次の式：％式％］
ｉ ｎ）は１９８８年、柳沢らによって発見された内
皮細胞由来の血管平滑筋収縮因子であり［Ｍ、Ｙａｎａ
ｇ ｉ ｓａｗａ ｅｔ ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ
３３２，４１１ （１９８８））、ブタ、ウシ、ヒ
ト等においてその存在が確認されている。また、エンド
セリンには、３種のアイソペプチドが存在し、それぞれ
エンドセリン−１，エンドセリン−２、エンドセリン−
３と命名されている。これらのアイソペプチドのうちヒ
トにおいて最も活性発現量の多いのはエンドセリン−１
であることが確認されている。 ［０００３］エンドセリンは１強力かつ持続的な血管平
滑筋および気管の収縮作用を有し、高血圧症や気道狭窄
を惹起するとともに、高濃度（血中濃度１〜５０ｐｍ。 １／ｍ１程度）では、脳卒中、狭心症、心筋梗塞、心不
全、不整脈等の虚血性脳および心疾患、腎炎等の腎障害
、肺、肝、腸等の循環不全、喘息などの疾病を併発させ
、動物個体を死に至らしめることもある。 ［０００４］エンドセリン−１は、その前駆体であるビ
ックエンドセリン−１、すなわち次の式：％式％］
で示されるペプチドを、エンドセリン変換酵素によって
ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基２１個からなるペ
プチドである。この加水分解過程がエンドセリンの活性
発現に必須であると考えられる。このエンドセリン変換
活性を有する酵素に関する報告はこれまで培養ウシ血管
内皮細胞（Ｋ、０ｋａｄａ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
ｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎｓ １７１．１１９２ （１９９０） 、ウシ副
腎髄質（、Ｔ、Ｓａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ Ｒｅ５ｅｒｃｈＣ。 ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １６８，１２３０ （１
９９０）〕等についてなされているが、ヒト由来のエン
ドセリン変換活性を有する酵素の存在は未だに明らかに
されていない。 ［０００６］
ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基２１個からなるペ
プチドである。この加水分解過程がエンドセリンの活性
発現に必須であると考えられる。このエンドセリン変換
活性を有する酵素に関する報告はこれまで培養ウシ血管
内皮細胞（Ｋ、０ｋａｄａ ｅｔ ａｌ、、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
ｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏ
ｎｓ １７１．１１９２ （１９９０） 、ウシ副
腎髄質（、Ｔ、Ｓａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ、、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ Ｒｅ５ｅｒｃｈＣ。 ｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １６８，１２３０ （１
９９０）〕等についてなされているが、ヒト由来のエン
ドセリン変換活性を有する酵素の存在は未だに明らかに
されていない。 ［０００６］
【発明が解決しようとする課題】エンドセリンは上述の
ように著しい生理活性を有する化合物であるが、その前
駆体のビッグエンドセリンから酵素的変換によって生成
するものであるから、この変換酵素の解明によってエン
ドセリンの生体内での生成を抑制する手段を提供するこ
とになり、またこの変換酵素は生体の血管収縮反応の機
構の解析やエンドセリンが原因となる様々な病態の研究
に有力な試薬としての用途が期待されるのである。 ［０００７］さらにまたこの変換酵素の解明によりエン
ドセリンの分泌過多により誘発される様々な病態（高エ
ンドセリン症）、例えば高血圧、気道狭窄、虚血性脳お
よび心疾患、腎障害、諸臓器例えば肝、肺、腸等の循環
不全、喘息等の予防および治療の手段としてのこの変換
酵素の阻害剤の探索、開発に有力な手段を提供すること
になる。 ［０００８］かかる理由からヒＩ〜細胞中にこれ迄に見
出されていなかったエンドセリン変換酵素の解明とその
入手のための方法の開発が求められていた。 ［０００９］
ように著しい生理活性を有する化合物であるが、その前
駆体のビッグエンドセリンから酵素的変換によって生成
するものであるから、この変換酵素の解明によってエン
ドセリンの生体内での生成を抑制する手段を提供するこ
とになり、またこの変換酵素は生体の血管収縮反応の機
構の解析やエンドセリンが原因となる様々な病態の研究
に有力な試薬としての用途が期待されるのである。 ［０００７］さらにまたこの変換酵素の解明によりエン
ドセリンの分泌過多により誘発される様々な病態（高エ
ンドセリン症）、例えば高血圧、気道狭窄、虚血性脳お
よび心疾患、腎障害、諸臓器例えば肝、肺、腸等の循環
不全、喘息等の予防および治療の手段としてのこの変換
酵素の阻害剤の探索、開発に有力な手段を提供すること
になる。 ［０００８］かかる理由からヒＩ〜細胞中にこれ迄に見
出されていなかったエンドセリン変換酵素の解明とその
入手のための方法の開発が求められていた。 ［０００９］
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述した課
題、すなわち、ヒト細胞中からエンドセリン変換酵素を
取り出すべく鋭意研究の結果、ヒ１〜細胞中にエンドセ
リン変換活性を有する酵素が存在することを見出し本発
明を完成したのである。 ［００１０１本発明のエンドセリン変換酵素は、胎盤、
血管内皮、腎臓、大脳などのエンドセリンを産生してい
るヒト臓器および組織のヒト細胞を原料としてこれから
抽出して得られるものである。そして上記した臓器およ
び組織の入手の容易さから胎盤が有利に用いられる。し
かしながら、入手の容易さの観点を別にすれば胎盤以外
の臓器または組織からの、あるいは血液からの抽出も亘
能であることは勿論である。 ［００１１１本発明のエンドセリン変換酵素は、ヒト細
胞に由来し、ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１
番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン残基との
間を加水分解してビッグエンドセリン−１をエンドセリ
ン−１に変換する能力を有し、その至適ｐＨが６．５へ
７．５で、分子量が約１０万、約２４万または５０万り
上であるものにかかる。 ［００１２１本発明のエンドセリン変換酵素は、臓器ま
たは組織の細胞膜を界面活性剤で処理して抽出液とし、
この抽出液を分別して得られる分子量が約１０万である
ものと、５０万以上であるものとの二つの画分からなり
、あるいはまた臓器または組織をホモジナイズし、彷ら
れたホモジネートから上清を分取し、このホモジネート
上清を超遠心分離に付してその上清を取り出して得られ
る細胞質両分を分別して得られる分子量が約２４万であ
るものと、５０万以上であるものとの二つの両分からな
るものである。 ［００１３］この四つのエンドセリン変換酵素のうち、
ヒト細胞膜由来の分子量が約１０万であるもの（酵素■
）の性質は次のとおりである。 （ａ） 牛用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６． ５〜７． ５（ｄ） 分
子量：約１０００００ （ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷを用
いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテ−１
へ（ＥＤＴＡ）、１．１０−フェナントロリンにより阻
害を受ける。 ［００１４］またヒト細胞膜由来の分子量が５０万以上
であるもの（酵素ＩＩ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６． ５〜７． ５（ｄ） 分
′ｆ量： ５０００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ
を用いたゲルろ過法により測定）（ｅ） 阻害剤：
エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、１．
１０−フェナントロリンにより阻害を受ける。 ［００１５］またヒト細胞膜由来の分子量が２４万であ
るもの（酵素Ｉ Ｉ Ｉ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン＝１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６． ５〜７． ５（ｄ） 分
子量： ２４００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷを
用いたゲルろ過法により測定）［００１６］さらにまた
ヒト細胞膜由来の分子量が５０万以上であるものく酵素
ＩＶ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６． ５〜７． ５（ｄ） 分
子量： ５ｏｏｏｏｏ以上（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷを
用いたゲルろ過法により測定）（ｅ） 阻害剤：エチ
レンジアミンテ１−ラアセテート（ＥＤＴＡ） 、１．
１０−フェナントロリンにより阻害を受ける。 ［００１７］上記した本発明のエンドセリン変換酵素■
〜ＩＶは本発明によれば胎盤、血管内皮、腎臓、大脳等
のエンドセリンを産生しているヒト臓器および組織のヒ
ト細胞を原料として得られる ［００１８］例えばヒト胎盤を原料とする場合、次のよ
うな操作によってこれをうろことができる。すなわち、
ヒト胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した後、
これに適当量の緩衝液、例えば２５ｍＭへベス、０．２
５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、通常
用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホモジナ
イザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られたホモ
シネ−１−を遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る［０
０１９］こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣は、緩
衝液で充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取
し、以後の抽出操作に付す。ここで得られる洗浄沈渣は
、次に述べる胎盤ホモジネート上清を超遠心分離して得
られる沈渣部分と共に細胞膜に由来する成分である。次
いでこの洗浄沈渣は界面活性剤、例えばトリトンＸ−１
００、コール酸ナトリウム、３−１（３−コラミドプロ
ピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネー
ト（ＣＨＡＰＳ） 、シュークロースモノカプレート等
を含む緩衝液に浸し、４℃〜８℃にて一晩放置後、遠心
分離して上清を集め、抽出液を得る。 ［００２０１一方、分取した胎盤ホモジネート上清は、
更に５００００ｇ〜１０００００ｇの超遠心分離をして
沈渣部分であるマイクロシーム分画を得る。このマイク
ロシーム分画を洗浄後、上記と同様にして界面活性剤抽
出を行った後、超遠心分離して上清を集め、抽出液を得
る。 ［００２１］また、上記したように分取した胎盤ホモジ
ネー１〜上清を、更に５００００ｇ〜１０００００ｇの
超遠心分離にかけて得られた上清を回収することにより
、細胞質画分を得る。 ［００２２１本酵素Ｉ〜ＩＶの精製は、上述の細胞膜両
分または細胞質画分を通常の酵素の精製に用いる手段を
利用することにより達成できる。例えば、アサヒバツク
ＨＣ−Ｎ２００ （旭化成工業社製）によるクロマト
グラフィー、Ｑ−セファロースバイパフォーマンス（フ
ァルマシア社製）によるクロマトグラフィー、フェニル
スーパーロース（ファルマシア社製）によるクロマトグ
ラフィー、スーパーデックス２００ （ファルマシア社
製）によるゲルろ過、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ （東ソ
ー社製）によるゲルろ過等の手段を適宜組み合わせ、ビ
ッグエンドセリン−１をエンドセリン−１に変換する活
性を指標として、本発明のエンドセリン変換酵素を精製
することができる。 ［００２３１本発明のエンドセリン変換酵素■〜ＩＶの
活性は力価によって表現されるが、この力価の測定はつ
ぎのようにして行なわれる。 ［００２４］ （１） 酵素活性の測定法１、ｍｌ
の４μｇ／ｍｌビッグエンドセリンー１溶液（１００ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）に０．１ｍｌの酵
素溶液を添加し、３７℃にて３時間反応させる。 反応後１００℃１０分間の処理を行い反応を停止させる
。次いで、生じたエンドセリン−１をサンドインチ−Ｅ
ＩＡ法により定量する。上記反応条件にて１時間に１ｐ
ｍｏｌのビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１に
変換する酵素活性をＩＵ（単位）とする。 ［００２５］ （２） サンドインチ−ＥＩＡ法抗
エンドセリン−１モノクロ一ナル抗体を固相化した９６
六マイクロプレートに、検体および既知濃度のエンドセ
リン−１標準液を加え反応させる。マイクロプレートを
洗浄後、ビオチン標準抗エンドセリンーＪポリクローナ
ル抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジンを加え反応
させる。マイクロプレートを洗浄後、結合したペルオキ
シダーゼ活性を測定する。既知濃度のエンドセリン−１
標準液による検量線から検体中のエンドセリン−１を定
量する。 ［００２６］ （３） 抗エンドセリンー１モノク
ローナル抗体の作成 エンドセリン−１とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をマ
ウスに免疫し、常法に従い、免疫マウス牌細胞とマウス
ミエローマを細胞融合し、ハイブリドーマを作成、エン
ドセリン−１に対する抗体を産生するハイブリドーマを
クローン化する。クローン化されたハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体をプロティンＡカラムで精製
し、抗エンドセリンー１モノクローナル抗体を作成する
。 ［００２７］ （４） 抗エンドセリンー１ポリク
ローナル抗体 エンドセリン−１とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をウ
サギに免疫し抗血清を得る。抗血清からプロティンＡカ
ラムで抗体画分を得る。抗体画分をビッグエンドセリン
１固定化カラムに付し、カラムに結合した両分を集め、
抗エンドセリンー１ポリクローナル抗体を作成する。得
られた抗エンドセリンー１ポリクローナル抗体をビオチ
ン化し、ビオチン標識抗エンドセリンー１ポリクローナ
ル抗体を作成する。 ［００２８］次ぎに、本発明のエンドセリン変換酵素Ｉ
〜ＩＶの酵素化学的特性について述べる。 ［００２９］ （ａ）作用 ビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１に変換する
。 ［００３０１（ｂ） 基質特異性 ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間を加水分解
する。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）にお
いてビッグエンドセリン−１に本酵素を３７℃にて３時
間作用させ、生成物をイナートシルＯＤＳカラム（ジ−
エルサイエンス社製）を用いた逆相クロマ１〜グラフイ
ーに付し、０．０５％トリフルオロ酢酸−１０％アセト
ニトリル溶液から０．０５％トリフルオロ酢酸−５０％
アセ１へニトリル溶液への直線的濃度勾配により分析し
たところ、ビッグエンドセリン−１のピーク以外に２つ
のピークが出現し、それらのピークの溶出位置は、エン
ドセリン−１およびビッグエンドセリン−１のＮ末端よ
り２２番目のバリンから３８番目のセリンまでのビッグ
エンドセリン−１の部分ペプチドと同一であった。この
結果より、本変換酵素によりビッグエンドセリン−１の
Ｎ末端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目の
バリン残基との間が加水分解されていることがわかる。 ［００３１１（ｃ） 至適ｐＨ 木エンドセリン変換酵素の至適ｐＨの測定は、各々のｐ
Ｈの５０ｍＭ緩衝液にて調製したビッグエンドセリン−
１溶液に、本エンドセリン変換酵素を加え、３７℃で反
応することによって行った。使用した緩衝液は、ｐＨ２
，０〜７．５ クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７，５
〜９．０トリス−塩酸緩衝液ｐＨ９，０〜１２．０ 炭
酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液である。 測定の結果、本エンドセリン変換酵素Ｉ−ＩＶは、ｐＨ
６，５〜７．５の範囲において最も強い活性を示した。 ［００３２］ （ｄ） 分子量 ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ （東ソー社製）のカラムによ
るゲルろ適法のカラムクロマトグラフィーにより分子量
既知の標準品と共に分離、分画を行い、本エンドセリン
変換酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＬ ＩＶ、の分子量を推定した
ところ、それぞれ約１０万、５０万以上、約２４万およ
び５０万以上であった。 ［００３３］ （ｅ） 阻害剤 本酵素の、ビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１
に変換する変換活性に対する各種阻害剤の効果を調べた
。各種阻害剤を含む１００μｌの反応液（５０ｍＭトＪ
スー塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）中において本酵素を３７
℃、３０分間インキュベー１へし、残存する酵素活性を
前述の方法にて測定した。各阻害剤存在下における残存
活性を、無処理の活性を１００とした相対活性で表した
結果を表で示す。表１は酵素■、表２は酵素ＩＩ、そし
て表３は酵素ＩＶについての結果である。 ［００３４］
題、すなわち、ヒト細胞中からエンドセリン変換酵素を
取り出すべく鋭意研究の結果、ヒ１〜細胞中にエンドセ
リン変換活性を有する酵素が存在することを見出し本発
明を完成したのである。 ［００１０１本発明のエンドセリン変換酵素は、胎盤、
血管内皮、腎臓、大脳などのエンドセリンを産生してい
るヒト臓器および組織のヒト細胞を原料としてこれから
抽出して得られるものである。そして上記した臓器およ
び組織の入手の容易さから胎盤が有利に用いられる。し
かしながら、入手の容易さの観点を別にすれば胎盤以外
の臓器または組織からの、あるいは血液からの抽出も亘
能であることは勿論である。 ［００１１１本発明のエンドセリン変換酵素は、ヒト細
胞に由来し、ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１
番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン残基との
間を加水分解してビッグエンドセリン−１をエンドセリ
ン−１に変換する能力を有し、その至適ｐＨが６．５へ
７．５で、分子量が約１０万、約２４万または５０万り
上であるものにかかる。 ［００１２１本発明のエンドセリン変換酵素は、臓器ま
たは組織の細胞膜を界面活性剤で処理して抽出液とし、
この抽出液を分別して得られる分子量が約１０万である
ものと、５０万以上であるものとの二つの画分からなり
、あるいはまた臓器または組織をホモジナイズし、彷ら
れたホモジネートから上清を分取し、このホモジネート
上清を超遠心分離に付してその上清を取り出して得られ
る細胞質両分を分別して得られる分子量が約２４万であ
るものと、５０万以上であるものとの二つの両分からな
るものである。 ［００１３］この四つのエンドセリン変換酵素のうち、
ヒト細胞膜由来の分子量が約１０万であるもの（酵素■
）の性質は次のとおりである。 （ａ） 牛用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６． ５〜７． ５（ｄ） 分
子量：約１０００００ （ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷを用
いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エチレンジアミンテトラアセテ−１
へ（ＥＤＴＡ）、１．１０−フェナントロリンにより阻
害を受ける。 ［００１４］またヒト細胞膜由来の分子量が５０万以上
であるもの（酵素ＩＩ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６． ５〜７． ５（ｄ） 分
′ｆ量： ５０００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ
を用いたゲルろ過法により測定）（ｅ） 阻害剤：
エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、１．
１０−フェナントロリンにより阻害を受ける。 ［００１５］またヒト細胞膜由来の分子量が２４万であ
るもの（酵素Ｉ Ｉ Ｉ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン＝１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６． ５〜７． ５（ｄ） 分
子量： ２４００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷを
用いたゲルろ過法により測定）［００１６］さらにまた
ヒト細胞膜由来の分子量が５０万以上であるものく酵素
ＩＶ）の性質は次のとおりである。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビックエンドセリン−１のＮ末
端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目のバリ
ン残基との間を加水分解する。 （ｃ） 至適ｐＨ：６． ５〜７． ５（ｄ） 分
子量： ５ｏｏｏｏｏ以上（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷを
用いたゲルろ過法により測定）（ｅ） 阻害剤：エチ
レンジアミンテ１−ラアセテート（ＥＤＴＡ） 、１．
１０−フェナントロリンにより阻害を受ける。 ［００１７］上記した本発明のエンドセリン変換酵素■
〜ＩＶは本発明によれば胎盤、血管内皮、腎臓、大脳等
のエンドセリンを産生しているヒト臓器および組織のヒ
ト細胞を原料として得られる ［００１８］例えばヒト胎盤を原料とする場合、次のよ
うな操作によってこれをうろことができる。すなわち、
ヒト胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した後、
これに適当量の緩衝液、例えば２５ｍＭへベス、０．２
５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、通常
用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホモジナ
イザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られたホモ
シネ−１−を遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る［０
０１９］こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣は、緩
衝液で充分洗浄し、再度遠心分離して、洗浄沈渣を分取
し、以後の抽出操作に付す。ここで得られる洗浄沈渣は
、次に述べる胎盤ホモジネート上清を超遠心分離して得
られる沈渣部分と共に細胞膜に由来する成分である。次
いでこの洗浄沈渣は界面活性剤、例えばトリトンＸ−１
００、コール酸ナトリウム、３−１（３−コラミドプロ
ピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネー
ト（ＣＨＡＰＳ） 、シュークロースモノカプレート等
を含む緩衝液に浸し、４℃〜８℃にて一晩放置後、遠心
分離して上清を集め、抽出液を得る。 ［００２０１一方、分取した胎盤ホモジネート上清は、
更に５００００ｇ〜１０００００ｇの超遠心分離をして
沈渣部分であるマイクロシーム分画を得る。このマイク
ロシーム分画を洗浄後、上記と同様にして界面活性剤抽
出を行った後、超遠心分離して上清を集め、抽出液を得
る。 ［００２１］また、上記したように分取した胎盤ホモジ
ネー１〜上清を、更に５００００ｇ〜１０００００ｇの
超遠心分離にかけて得られた上清を回収することにより
、細胞質画分を得る。 ［００２２１本酵素Ｉ〜ＩＶの精製は、上述の細胞膜両
分または細胞質画分を通常の酵素の精製に用いる手段を
利用することにより達成できる。例えば、アサヒバツク
ＨＣ−Ｎ２００ （旭化成工業社製）によるクロマト
グラフィー、Ｑ−セファロースバイパフォーマンス（フ
ァルマシア社製）によるクロマトグラフィー、フェニル
スーパーロース（ファルマシア社製）によるクロマトグ
ラフィー、スーパーデックス２００ （ファルマシア社
製）によるゲルろ過、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ （東ソ
ー社製）によるゲルろ過等の手段を適宜組み合わせ、ビ
ッグエンドセリン−１をエンドセリン−１に変換する活
性を指標として、本発明のエンドセリン変換酵素を精製
することができる。 ［００２３１本発明のエンドセリン変換酵素■〜ＩＶの
活性は力価によって表現されるが、この力価の測定はつ
ぎのようにして行なわれる。 ［００２４］ （１） 酵素活性の測定法１、ｍｌ
の４μｇ／ｍｌビッグエンドセリンー１溶液（１００ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）に０．１ｍｌの酵
素溶液を添加し、３７℃にて３時間反応させる。 反応後１００℃１０分間の処理を行い反応を停止させる
。次いで、生じたエンドセリン−１をサンドインチ−Ｅ
ＩＡ法により定量する。上記反応条件にて１時間に１ｐ
ｍｏｌのビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１に
変換する酵素活性をＩＵ（単位）とする。 ［００２５］ （２） サンドインチ−ＥＩＡ法抗
エンドセリン−１モノクロ一ナル抗体を固相化した９６
六マイクロプレートに、検体および既知濃度のエンドセ
リン−１標準液を加え反応させる。マイクロプレートを
洗浄後、ビオチン標準抗エンドセリンーＪポリクローナ
ル抗体およびペルオキシダーゼ標識アビジンを加え反応
させる。マイクロプレートを洗浄後、結合したペルオキ
シダーゼ活性を測定する。既知濃度のエンドセリン−１
標準液による検量線から検体中のエンドセリン−１を定
量する。 ［００２６］ （３） 抗エンドセリンー１モノク
ローナル抗体の作成 エンドセリン−１とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をマ
ウスに免疫し、常法に従い、免疫マウス牌細胞とマウス
ミエローマを細胞融合し、ハイブリドーマを作成、エン
ドセリン−１に対する抗体を産生するハイブリドーマを
クローン化する。クローン化されたハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体をプロティンＡカラムで精製
し、抗エンドセリンー１モノクローナル抗体を作成する
。 ［００２７］ （４） 抗エンドセリンー１ポリク
ローナル抗体 エンドセリン−１とカサ貝ヘモシアニンとの縮合物をウ
サギに免疫し抗血清を得る。抗血清からプロティンＡカ
ラムで抗体画分を得る。抗体画分をビッグエンドセリン
１固定化カラムに付し、カラムに結合した両分を集め、
抗エンドセリンー１ポリクローナル抗体を作成する。得
られた抗エンドセリンー１ポリクローナル抗体をビオチ
ン化し、ビオチン標識抗エンドセリンー１ポリクローナ
ル抗体を作成する。 ［００２８］次ぎに、本発明のエンドセリン変換酵素Ｉ
〜ＩＶの酵素化学的特性について述べる。 ［００２９］ （ａ）作用 ビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１に変換する
。 ［００３０１（ｂ） 基質特異性 ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間を加水分解
する。５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）にお
いてビッグエンドセリン−１に本酵素を３７℃にて３時
間作用させ、生成物をイナートシルＯＤＳカラム（ジ−
エルサイエンス社製）を用いた逆相クロマ１〜グラフイ
ーに付し、０．０５％トリフルオロ酢酸−１０％アセト
ニトリル溶液から０．０５％トリフルオロ酢酸−５０％
アセ１へニトリル溶液への直線的濃度勾配により分析し
たところ、ビッグエンドセリン−１のピーク以外に２つ
のピークが出現し、それらのピークの溶出位置は、エン
ドセリン−１およびビッグエンドセリン−１のＮ末端よ
り２２番目のバリンから３８番目のセリンまでのビッグ
エンドセリン−１の部分ペプチドと同一であった。この
結果より、本変換酵素によりビッグエンドセリン−１の
Ｎ末端から２１番目のトリプトファン残基と２２番目の
バリン残基との間が加水分解されていることがわかる。 ［００３１１（ｃ） 至適ｐＨ 木エンドセリン変換酵素の至適ｐＨの測定は、各々のｐ
Ｈの５０ｍＭ緩衝液にて調製したビッグエンドセリン−
１溶液に、本エンドセリン変換酵素を加え、３７℃で反
応することによって行った。使用した緩衝液は、ｐＨ２
，０〜７．５ クエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ７，５
〜９．０トリス−塩酸緩衝液ｐＨ９，０〜１２．０ 炭
酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液である。 測定の結果、本エンドセリン変換酵素Ｉ−ＩＶは、ｐＨ
６，５〜７．５の範囲において最も強い活性を示した。 ［００３２］ （ｄ） 分子量 ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ （東ソー社製）のカラムによ
るゲルろ適法のカラムクロマトグラフィーにより分子量
既知の標準品と共に分離、分画を行い、本エンドセリン
変換酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＬ ＩＶ、の分子量を推定した
ところ、それぞれ約１０万、５０万以上、約２４万およ
び５０万以上であった。 ［００３３］ （ｅ） 阻害剤 本酵素の、ビッグエンドセリン−１をエンドセリン−１
に変換する変換活性に対する各種阻害剤の効果を調べた
。各種阻害剤を含む１００μｌの反応液（５０ｍＭトＪ
スー塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）中において本酵素を３７
℃、３０分間インキュベー１へし、残存する酵素活性を
前述の方法にて測定した。各阻害剤存在下における残存
活性を、無処理の活性を１００とした相対活性で表した
結果を表で示す。表１は酵素■、表２は酵素ＩＩ、そし
て表３は酵素ＩＶについての結果である。 ［００３４］
【表１】
［００３５］
【表２】
［００３６］
【表３】
［００３７］つぎに、実施例によって本発明を更に詳細
に説明するが、本発明は、これらによって限定されるも
のではない。 ［００３８］
に説明するが、本発明は、これらによって限定されるも
のではない。 ［００３８］
【実施例１】胎盤細胞膜両分の調製
ヒト胎盤（約５ｇ）より、膿等を除去し、生理食塩水で
充分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に、２
５ｍＭヘペス、０．２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ
７，４）２０ｍｌを加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒ
ｏｎ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得ら
れたホモジネートを１０００ｇ、２０分間遠心分離し、
上清を分取した。この上清１００００ｇ、２０分間、再
び遠心分離し、その上清及び沈渣を得た。 ［００３９］こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣に
、上記と同一の緩衝液１０ｍ１を加え、充分洗浄し、再
度１００００ｇ、２０分間の遠心分離を行い、洗浄沈渣
を分取した。得られた洗浄沈渣に、１０ｍ１の０． ５
％トリトンＸ−１，００含有２５ｍＭヘペス、０．２５
Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、４℃に
て一夜放置後、１０００ｇ、２０分間遠心分離して、抽
出液約９ｍｌを得た。 ［００４０１一方、胎盤ホモジネート上清は、１０００
００ｇ、２時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した。 この超遠心分離沈渣に、２ｍｌの０．５％トリトン−Ｘ
１００含有２５ｍＭへベス、０．２５Ｍシュークロース
緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、４℃にて一夜放置後、再
び１０００００ｇ、２時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約１．．５ｍｌを得た。胎盤ホモジネート沈
渣より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心
分離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜画分約
１０．５ｍｌを得た。 ［００４１１
充分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に、２
５ｍＭヘペス、０．２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ
７，４）２０ｍｌを加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒ
ｏｎ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得ら
れたホモジネートを１０００ｇ、２０分間遠心分離し、
上清を分取した。この上清１００００ｇ、２０分間、再
び遠心分離し、その上清及び沈渣を得た。 ［００３９］こうして得られた胎盤ホモジネート沈渣に
、上記と同一の緩衝液１０ｍ１を加え、充分洗浄し、再
度１００００ｇ、２０分間の遠心分離を行い、洗浄沈渣
を分取した。得られた洗浄沈渣に、１０ｍ１の０． ５
％トリトンＸ−１，００含有２５ｍＭヘペス、０．２５
Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、４℃に
て一夜放置後、１０００ｇ、２０分間遠心分離して、抽
出液約９ｍｌを得た。 ［００４０１一方、胎盤ホモジネート上清は、１０００
００ｇ、２時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した。 この超遠心分離沈渣に、２ｍｌの０．５％トリトン−Ｘ
１００含有２５ｍＭへベス、０．２５Ｍシュークロース
緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、４℃にて一夜放置後、再
び１０００００ｇ、２時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約１．．５ｍｌを得た。胎盤ホモジネート沈
渣より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心
分離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜画分約
１０．５ｍｌを得た。 ［００４１１
【実施例２］精製酵素（分子量５０万以上の酵素ＩＩ）
の調製 ［００４２］ （ｉ） 実施例１で得られた細胞膜
画分約１０．５ｍｌを、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化したアサヒバツクＨＣ−Ｎ２００
（旭化成工業社製）のカラムに付し、同緩衝液にて溶
出させ、試料中のトリトンＸ−１００を除去した。トリ
ジＸ１００を除去した細胞膜画分を、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＱ−セファロー
スバイパフォーマンス（ファルマシア社製）のカラム（
φ２．６Ｘ１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液にて充分洗
浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度を直線的に
０〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を溶出し、酵
素活性を有する両分を集めた。得られた活性画分をダイ
アフローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて５．０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、
０．１Ｍｈリスー塩酸、０．３Ｍ ＮａＣ１緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化したスーパーテックス２００ （
ファルマシア社製）のカラム（中２゜６Ｘ６０ｃｍ）に
付し、同一緩衝液で溶出した。 ［００４３１（ｉ ｉ） 上記した（ｉ）の操作によ
って溶出した溶出体積１００ｍ１〜１５０ｍ１の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクシ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＩを
得た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩの総
括性は約３５０Ｕであった。 ［００４４］ （ｉ ｉ ｉ） このようにして得
られた精製エンドセリン変換活性ＩＩの１００ ｇ １
を、０．１ＭトＪスー塩酸、０．８Ｍ ＮａＣ１緩衝
液（ｐＨ７，０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ
（７，５ｍｍφ×６０ｃｍ、東ソー社製）のカラムに
よるゲルろ適法のカラムクロマトグラフィーに付し、同
一緩衝液にて、分子量既知の標準品（グルタメートデヒ
ドロゲナーゼ：分子量２９万、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼ：分子量１４万、エノラーゼ：分子量６．７万、ア
デニレートキナーゼ：分子量３，２万、チトクロムＣ：
分子量１．２４万）と共に分離、分画を行い、各画分の
エンドセリン変換活性を前述の方法で測定し、変換活性
ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換酵素ＩＩの
分子量を推定したとこる５０万以上であった。結果を図
１に示す。 ［００４５１ 【実施例３］基質特異性 実施例２で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩ
１ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４
０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物を
イナートシルＯＤＳカラム（ジ−エルサイエンス社製）
を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％ト
リフルオロ酢酸−１０％アセトニＩ−リル溶液から０．
０５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液へ
の直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンド
セリン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。そ
れらのピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビ
ッグエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンか
ら３８番目のセリンまでのビックエンドセリン−１の部
分へプチドと同一であった。 ［００４６］ 【実施例４】至適ｐＨの測定 各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２，０〜７． ５ク
エン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０トリス−塩
酸緩衝液、ｐＨ９，０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液）にて精製したビッグエンドセ
リン−１溶液２００μｌに、実施例２で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素ＩＩ ５０μｍを加え、３７℃に
て３時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定
した結果、図２に示すように、本エンドセリン変換酵素
ＩＩはｐＨ６，５〜７．５の範囲において最も強い活性
を示した。 ［００４７］
の調製 ［００４２］ （ｉ） 実施例１で得られた細胞膜
画分約１０．５ｍｌを、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化したアサヒバツクＨＣ−Ｎ２００
（旭化成工業社製）のカラムに付し、同緩衝液にて溶
出させ、試料中のトリトンＸ−１００を除去した。トリ
ジＸ１００を除去した細胞膜画分を、１０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＱ−セファロー
スバイパフォーマンス（ファルマシア社製）のカラム（
φ２．６Ｘ１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液にて充分洗
浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度を直線的に
０〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を溶出し、酵
素活性を有する両分を集めた。得られた活性画分をダイ
アフローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて５．０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、
０．１Ｍｈリスー塩酸、０．３Ｍ ＮａＣ１緩衝液（
ｐＨ７，０）で平衡化したスーパーテックス２００ （
ファルマシア社製）のカラム（中２゜６Ｘ６０ｃｍ）に
付し、同一緩衝液で溶出した。 ［００４３１（ｉ ｉ） 上記した（ｉ）の操作によ
って溶出した溶出体積１００ｍ１〜１５０ｍ１の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクシ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＩを
得た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩの総
括性は約３５０Ｕであった。 ［００４４］ （ｉ ｉ ｉ） このようにして得
られた精製エンドセリン変換活性ＩＩの１００ ｇ １
を、０．１ＭトＪスー塩酸、０．８Ｍ ＮａＣ１緩衝
液（ｐＨ７，０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ
（７，５ｍｍφ×６０ｃｍ、東ソー社製）のカラムに
よるゲルろ適法のカラムクロマトグラフィーに付し、同
一緩衝液にて、分子量既知の標準品（グルタメートデヒ
ドロゲナーゼ：分子量２９万、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼ：分子量１４万、エノラーゼ：分子量６．７万、ア
デニレートキナーゼ：分子量３，２万、チトクロムＣ：
分子量１．２４万）と共に分離、分画を行い、各画分の
エンドセリン変換活性を前述の方法で測定し、変換活性
ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換酵素ＩＩの
分子量を推定したとこる５０万以上であった。結果を図
１に示す。 ［００４５１ 【実施例３］基質特異性 実施例２で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩ
１ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４
０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物を
イナートシルＯＤＳカラム（ジ−エルサイエンス社製）
を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％ト
リフルオロ酢酸−１０％アセトニＩ−リル溶液から０．
０５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液へ
の直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンド
セリン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。そ
れらのピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビ
ッグエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンか
ら３８番目のセリンまでのビックエンドセリン−１の部
分へプチドと同一であった。 ［００４６］ 【実施例４】至適ｐＨの測定 各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２，０〜７． ５ク
エン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０トリス−塩
酸緩衝液、ｐＨ９，０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液）にて精製したビッグエンドセ
リン−１溶液２００μｌに、実施例２で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素ＩＩ ５０μｍを加え、３７℃に
て３時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定
した結果、図２に示すように、本エンドセリン変換酵素
ＩＩはｐＨ６，５〜７．５の範囲において最も強い活性
を示した。 ［００４７］
【実施例５】阻害剤に対する感受性
各種阻害剤を含む１００μｌの反応液（５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）中において、実施例２で得ら
れた精製エンドセリン変換酵素ＩＩを３７℃にて３０分
間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍｌ
ビッグエンドセリンー１溶液４μｍを添加し、３７℃に
て３時間反応させた。反応後、１，００℃、１０分間の
処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−１を
前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した。 各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を１
００とした相対活性で表し、表２に示した。 ［００４８１
塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）中において、実施例２で得ら
れた精製エンドセリン変換酵素ＩＩを３７℃にて３０分
間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍｌ
ビッグエンドセリンー１溶液４μｍを添加し、３７℃に
て３時間反応させた。反応後、１，００℃、１０分間の
処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−１を
前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した。 各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を１
００とした相対活性で表し、表２に示した。 ［００４８１
【実施例６］精製酵素（分子量約１０万の酵素」）の調
製 ［００４９１（ｉ） 実施例１で得られた細胞膜両分
について、実施例２（ｉ）に記載の操作を行なった。 ［００５０１（ｉ ｉ） 上述した（ｉ）の操作によ
って溶出した溶出体積１７０ｍ１〜２１０ｍ１の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクシ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素Ｉを得
た。 尚、得られた精製エンドセリン変換酵素■の総活性は約
３５０Ｕであった。 ［００５１１（ｉ ｉｉ） このようにして得られた
精製エンドセリン変換酵素■の１００μｌを、０．１Ｍ
トリス−塩酸、０．３Ｍ ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，
０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ （７，５ｍ
ｍφ×６０ｃｍ、東ソー社製）のカラムによるゲルろ適
法のカラムクロマトグラフィーに付し、同一緩衝液にて
、分子量既知の標準品（グルタメートデヒドロゲナーゼ
：分子量２９万、ラクテートデヒドロゲナーゼ：分子量
１４万、エノラーゼ：分子量６，７万、アデニレートキ
ナーゼ二分子量３．２万、チトクロムＣ：分子量１，２
４万）と共に分離、分画を行い、各画分のエンドセリン
変換活性を前述の方法で測定し、変換活性ピークの溶出
位置より、本エンドセリン変換酵素Ｉの分子量を推定し
たところ約１０万であった。結果を図３に示す。 ［００５２］ 【実施例７】基礎特異性 実施例６で得られた精製エンドセリン変換酵素Ｉ １
ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４０
μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物をイ
ナートシルＯＤＳカラム（ジ−エルサイエンス社製）を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％トリ
フルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から０．０５
％１−リフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液への
直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセ
リン１のピーク以外に２つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグ
エンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから３
８番目のセリンまでのビッグエンドセリン−１の部分ペ
プチドと同一であった。 ［００５３］
製 ［００４９１（ｉ） 実施例１で得られた細胞膜両分
について、実施例２（ｉ）に記載の操作を行なった。 ［００５０１（ｉ ｉ） 上述した（ｉ）の操作によ
って溶出した溶出体積１７０ｍ１〜２１０ｍ１の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクシ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素Ｉを得
た。 尚、得られた精製エンドセリン変換酵素■の総活性は約
３５０Ｕであった。 ［００５１１（ｉ ｉｉ） このようにして得られた
精製エンドセリン変換酵素■の１００μｌを、０．１Ｍ
トリス−塩酸、０．３Ｍ ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，
０）で平衡化したＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ （７，５ｍ
ｍφ×６０ｃｍ、東ソー社製）のカラムによるゲルろ適
法のカラムクロマトグラフィーに付し、同一緩衝液にて
、分子量既知の標準品（グルタメートデヒドロゲナーゼ
：分子量２９万、ラクテートデヒドロゲナーゼ：分子量
１４万、エノラーゼ：分子量６，７万、アデニレートキ
ナーゼ二分子量３．２万、チトクロムＣ：分子量１，２
４万）と共に分離、分画を行い、各画分のエンドセリン
変換活性を前述の方法で測定し、変換活性ピークの溶出
位置より、本エンドセリン変換酵素Ｉの分子量を推定し
たところ約１０万であった。結果を図３に示す。 ［００５２］ 【実施例７】基礎特異性 実施例６で得られた精製エンドセリン変換酵素Ｉ １
ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４０
μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物をイ
ナートシルＯＤＳカラム（ジ−エルサイエンス社製）を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％トリ
フルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から０．０５
％１−リフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液への
直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセ
リン１のピーク以外に２つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグ
エンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから３
８番目のセリンまでのビッグエンドセリン−１の部分ペ
プチドと同一であった。 ［００５３］
【実施例８】至適ｐＨの測定
各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２，０〜７．５クエ
ン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０トリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９，０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液）にて調整したビッグエンドセリ
ン−１溶液２００μｌに、実施例６で得られた精製エン
ドセリン変換酵素Ｉ ５０μｌを加え、３７℃にて３
時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した
結果、図４に示すように、本エンドセリン変換酵素ＩＩ
はｐＨ６，５〜７．５の範囲において最も強い活性を示
した。 ［００５４］
ン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０トリス−塩酸
緩衝液、ｐＨ９，０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−水
酸化ナトリウム緩衝液）にて調整したビッグエンドセリ
ン−１溶液２００μｌに、実施例６で得られた精製エン
ドセリン変換酵素Ｉ ５０μｌを加え、３７℃にて３
時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を測定した
結果、図４に示すように、本エンドセリン変換酵素ＩＩ
はｐＨ６，５〜７．５の範囲において最も強い活性を示
した。 ［００５４］
【実施例９】阻害剤に対する感受性
各種阻害剤を含む１００μＩの反応液（５０ｍＭトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中において、実施例６で得
られた精製エンドセリン変換酵素■を３７℃にて３０分
間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍｌ
のビッグエンドセリン−１溶液４７２１を添加し、３７
℃にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分間
の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−１
を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した
。 各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を１
００とした相対活性で表し、表１に示した。 ［００５５］
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）中において、実施例６で得
られた精製エンドセリン変換酵素■を３７℃にて３０分
間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍｌ
のビッグエンドセリン−１溶液４７２１を添加し、３７
℃にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分間
の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン−１
を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した
。 各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を１
００とした相対活性で表し、表１に示した。 ［００５５］
【実施例１０】胎盤細胞質画分の調製
ヒト胎盤（約５ｇ）より、膜等を除去し、生理食塩水で
十分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に２５
ｍＭへペス、０．２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７
，４）２０ｍｌを加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒｏ
ｎ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得られ
たホモジネートを１０００ｇ、２０分間遠心分離し、上
清を分取した。この上清を１００００ｇ、２０分間、再
び遠心分離し、その上清を分取した。得られた上清を１
０００００ｇ、２時間超遠心分離し、約２０ｍ１の上清
を回収、細胞質画分とした。 ［００５６］
十分洗浄後、微小断片化した。この胎盤微小断片に２５
ｍＭへペス、０．２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７
，４）２０ｍｌを加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒｏ
ｎ）ホモジナイザーを用いてホモジナイズした。得られ
たホモジネートを１０００ｇ、２０分間遠心分離し、上
清を分取した。この上清を１００００ｇ、２０分間、再
び遠心分離し、その上清を分取した。得られた上清を１
０００００ｇ、２時間超遠心分離し、約２０ｍ１の上清
を回収、細胞質画分とした。 ［００５６］
【実施例１１】精製酵素（分子量５０万以上の酵素■Ｖ
）の調製実施例１０で得られた細胞質画分約２０ｍ１を
、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化
したＱ−セファロースバイパフォーマンス（ファルマシ
ア社製）のカラム（中２゜６Ｘ１０ｃｍ）に吸着させ、
同緩衝液にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリ
ウム濃度を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることにより
、酵素を溶出し、酵素活性を有する両分を集めた。 ［００５７］得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて５゜
０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、予め０．１Ｍトリ
ス−塩酸、０．３ＭＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７； ０）で
平衡化したスーパーテックス２００（ファルマシア社製
）のカラム（中２゜６Ｘ６０ｃｍ）に付し、同一緩衝液
で溶出し、溶出体積１００ｍ１〜１５０ｍ１の付近をフ
ラグショネーションし、これらのフラクションについて
前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクショ
ンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイア
フローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製
）を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＶを得
た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶの総活
性は約３５０Ｕであった。 ［００５８］
）の調製実施例１０で得られた細胞質画分約２０ｍ１を
、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化
したＱ−セファロースバイパフォーマンス（ファルマシ
ア社製）のカラム（中２゜６Ｘ１０ｃｍ）に吸着させ、
同緩衝液にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリ
ウム濃度を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることにより
、酵素を溶出し、酵素活性を有する両分を集めた。 ［００５７］得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて５゜
０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、予め０．１Ｍトリ
ス−塩酸、０．３ＭＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７； ０）で
平衡化したスーパーテックス２００（ファルマシア社製
）のカラム（中２゜６Ｘ６０ｃｍ）に付し、同一緩衝液
で溶出し、溶出体積１００ｍ１〜１５０ｍ１の付近をフ
ラグショネーションし、これらのフラクションについて
前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラクショ
ンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイア
フローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製
）を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＶを得
た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶの総活
性は約３５０Ｕであった。 ［００５８］
【実施例１２】基質特異性
実施例１１で得られた精製エンドセリン変換活性ＩＶ１
ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４０
μｍを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物をイ
ナートシルＯＤＳカラム（ジ−エルサイエンス社製）を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％トリ
フルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から０．０５
％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液への直
線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセノ
ン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグ
エンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから３
８番目のセリンまでのビックエンドセリン−１の部分ペ
プチドと同一であった。 ［００５９］
ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４０
μｍを添加し、３７℃にて３時間反応させ、生成物をイ
ナートシルＯＤＳカラム（ジ−エルサイエンス社製）を
用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％トリ
フルオロ酢酸−１０％アセトニトリル溶液から０．０５
％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液への直
線的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセノ
ン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。それら
のピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグ
エンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから３
８番目のセリンまでのビックエンドセリン−１の部分ペ
プチドと同一であった。 ［００５９］
【実施例１３】至適ｐＨの測定
各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２，０〜７． ５ク
エン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０トリス−塩
酸緩衛液、ｐＨ９，０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセ
リン−１溶液２００μｍに、 実施例１１で得られた精
製エンドセリン変換酵素ＩＶ ５０μＩを加え、３７
℃にて３時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を
測定した結果、図５に示すように、本エンドセリン変換
酵素ＩＶはｐＨ６，５〜７，５の範囲において最も強い
活性を示した。 ［００６０３
エン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０トリス−塩
酸緩衛液、ｐＨ９，０〜１２．０炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセ
リン−１溶液２００μｍに、 実施例１１で得られた精
製エンドセリン変換酵素ＩＶ ５０μＩを加え、３７
℃にて３時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を
測定した結果、図５に示すように、本エンドセリン変換
酵素ＩＶはｐＨ６，５〜７，５の範囲において最も強い
活性を示した。 ［００６０３
【実施例１４］分子量の測定
実施例１１で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶの
１００μｍを、Ｏ，１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ Ｎ
ａＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＴＳＦ’−Ｇ
３０００ＳＷ （７，５ｍｍφＸ６０ｃｍ、東ソー社製
）のカラムによるゲルろ適法のカラムクロマトグラフィ
ーに付し、同一緩衝液にて、分子量既知の標準品（グル
タメートデヒドロゲナーゼ二分子量２９万、ラクテート
ヒドロゲナーゼ：分子量１４万、エノラーゼ：分子量６
，７万、アデニレートキナーゼ：分子量３．２万、チト
クロムＣ：分子量１．２４万）と共に分離、分画を行い
、各両分のエンドセリン変換活性を前述の方法で測定し
、変換活性ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換
酵素ＩＶの分子量を推定したところ５０万以上であった
。結果を図６に示す。 ［００６１，］ 【実施例１５】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む１００μｌの反応液（５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）中において、実施例１１で得
られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶを３７℃にて３０
分間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍ
ｌのビッグエンドセリン−１溶液４７Ｌｌを添加し、３
７℃にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分
間の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン１
を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した
。各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を
１００とした相対活性で表し、表３に示した。 ［００６２］
１００μｍを、Ｏ，１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ Ｎ
ａＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＴＳＦ’−Ｇ
３０００ＳＷ （７，５ｍｍφＸ６０ｃｍ、東ソー社製
）のカラムによるゲルろ適法のカラムクロマトグラフィ
ーに付し、同一緩衝液にて、分子量既知の標準品（グル
タメートデヒドロゲナーゼ二分子量２９万、ラクテート
ヒドロゲナーゼ：分子量１４万、エノラーゼ：分子量６
，７万、アデニレートキナーゼ：分子量３．２万、チト
クロムＣ：分子量１．２４万）と共に分離、分画を行い
、各両分のエンドセリン変換活性を前述の方法で測定し
、変換活性ピークの溶出位置より、本エンドセリン変換
酵素ＩＶの分子量を推定したところ５０万以上であった
。結果を図６に示す。 ［００６１，］ 【実施例１５】阻害剤に対する感受性 各種阻害剤を含む１００μｌの反応液（５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）中において、実施例１１で得
られた精製エンドセリン変換酵素ＩＶを３７℃にて３０
分間インキュベートし、次いで、これに０．１ｍｇ／ｍ
ｌのビッグエンドセリン−１溶液４７Ｌｌを添加し、３
７℃にて３時間反応させた。反応後、１００℃、１０分
間の処理を行い反応を停止させ、生じたエンドセリン１
を前述の方法にて定量し、残存する酵素活性を測定した
。各阻害剤存在下における残存活性を、無処理の活性を
１００とした相対活性で表し、表３に示した。 ［００６２］
【実施例１６】精製酵素（分子量２４万の酵素Ｉ Ｉ
Ｉ）の調製 実施例１０で得られた細胞質両分約２０ｍ１を、１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＱ−
セファロースバイパフォーマンス（ファルマシア社製）
のカラム（中２゜６Ｘ１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度
を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を
溶出し、酵素活性を有する画分を集めた。 ［００６３］得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて５゜
０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、予め０．１Ｍトリ
ス−塩酸、０．３ＭＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化したスーパーテックス２００ （ファルマシア社製
）のカラム（中２゜６Ｘ６０ｃｍ）に付し、同一緩衝液
で溶出し、溶出体積１．６０ｍ１〜１８０ｍ１の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラグジ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩ
を得た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩ
の総括性は約１５０Ｕであった。 ［００６４］
Ｉ）の調製 実施例１０で得られた細胞質両分約２０ｍ１を、１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）で平衡化したＱ−
セファロースバイパフォーマンス（ファルマシア社製）
のカラム（中２゜６Ｘ１０ｃｍ）に吸着させ、同緩衝液
にて充分洗浄した後、同緩衝液中で塩化ナトリウム濃度
を直線的に０〜２５０ｍＭに上げることにより、酵素を
溶出し、酵素活性を有する画分を集めた。 ［００６３］得られた活性画分をダイアフローメンブレ
ンフィルターＰＭ−１０（アミコン社製）を用いて５゜
０ｍｌまで濃縮した。この濃縮液を、予め０．１Ｍトリ
ス−塩酸、０．３ＭＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化したスーパーテックス２００ （ファルマシア社製
）のカラム（中２゜６Ｘ６０ｃｍ）に付し、同一緩衝液
で溶出し、溶出体積１．６０ｍ１〜１８０ｍ１の付近を
フラグショネーションし、これらのフラクションについ
て前述の方法でエンドセリン変換活性を有するフラグジ
ョンを合わせ、活性画分とした。この活性画分を、ダイ
アフローメンブレンフィルターＰＭ−１０（アミコン社
製）を用いて濃縮し、精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩ
を得た。尚、得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩ
の総括性は約１５０Ｕであった。 ［００６４］
【実施例１７】基礎特異性
実施例１６で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩ
１ｍｌに、０゜１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４
０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、精製物を
イナートシルＯＤＳカラム （ジ−エルサイエンス社製
）を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％
トリフルオロ酢酸−１０％アセＩ−二トリル溶液から０
．０５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液
への直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエン
ドセリン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。 それらのピークの溶出位置は、エンドセリン−１および
ビッグエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリン
から３８番目のセリンまでのビッグエンドセリン−１の
部分ペプチドと同一であった。 ［００６５］
１ｍｌに、０゜１ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリン溶液４
０μｌを添加し、３７℃にて３時間反応させ、精製物を
イナートシルＯＤＳカラム （ジ−エルサイエンス社製
）を用いた逆相クロマトグラフィーに付し、０．０５％
トリフルオロ酢酸−１０％アセＩ−二トリル溶液から０
．０５％トリフルオロ酢酸−５０％アセトニトリル溶液
への直線的濃度勾配により分析したところ、ビックエン
ドセリン−１のピーク以外に２つのピークが出現した。 それらのピークの溶出位置は、エンドセリン−１および
ビッグエンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリン
から３８番目のセリンまでのビッグエンドセリン−１の
部分ペプチドと同一であった。 ［００６５］
【実施例１８】至適ｐＨの測定
各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝液（ｐＨ２，０〜７． ５ク
エン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０トリス−塩
酸緩衝液、ｐＨ９，０〜］２．０炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセ
リン−１溶液２００μｌに、実施例１６で得られた精製
エンドセリン変換酵素ＩＩＩ ５０μｌを加え、３７
℃にて３時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を
測定した結果、図７に示すように、木エンドセリン変換
酵素ＩＩＩはｐＨ６，５〜７．５の範囲において最も強
い活性を示した。 ［００６６］
エン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ７，５〜９．０トリス−塩
酸緩衝液、ｐＨ９，０〜］２．０炭酸水素ナトリウム−
水酸化ナトリウム緩衝液）にて調製したビッグエンドセ
リン−１溶液２００μｌに、実施例１６で得られた精製
エンドセリン変換酵素ＩＩＩ ５０μｌを加え、３７
℃にて３時間反応を行った後、前述の方法で酵素活性を
測定した結果、図７に示すように、木エンドセリン変換
酵素ＩＩＩはｐＨ６，５〜７．５の範囲において最も強
い活性を示した。 ［００６６］
【実施例１−９】分子量の測定
実施例１６で得られた精製エンドセリン変換酵素ＩＩＩ
の１００ ｌＬｌを、０．１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ
ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＴ Ｓ
Ｋ −Ｇ ３０００ＳＷ （７，５ｍｍφＸ６０ｃｍ
、東ソー社製）のカラムによるゲルろ適法のカラムクロ
マトグラフィーに付し、同一緩衝液にて、分子量既知の
標準品（グルタメートデヒドロゲナーゼ：分子量２９万
、ラクテートヒドロゲナーゼ：分子量１４万、エノラー
ゼ：分子量６．７万、アデニレートキナーゼ：分子量３
．２万、チ１−クロムＣ：分子量１，２４万）と共に分
離、分画を行い、各画分のエンドセリン変換活性を前述
の方法で測定し、変換活性ピークの溶出位置より、木エ
ンドセリン変換酵素ＩＩＩの分子量を推定したところ約
２４万であった。結果を図８に示す。
の１００ ｌＬｌを、０．１Ｍトリス−塩酸、０．３Ｍ
ＮａＣ１緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＴ Ｓ
Ｋ −Ｇ ３０００ＳＷ （７，５ｍｍφＸ６０ｃｍ
、東ソー社製）のカラムによるゲルろ適法のカラムクロ
マトグラフィーに付し、同一緩衝液にて、分子量既知の
標準品（グルタメートデヒドロゲナーゼ：分子量２９万
、ラクテートヒドロゲナーゼ：分子量１４万、エノラー
ゼ：分子量６．７万、アデニレートキナーゼ：分子量３
．２万、チ１−クロムＣ：分子量１，２４万）と共に分
離、分画を行い、各画分のエンドセリン変換活性を前述
の方法で測定し、変換活性ピークの溶出位置より、木エ
ンドセリン変換酵素ＩＩＩの分子量を推定したところ約
２４万であった。結果を図８に示す。
【図１】実施例２で得られるエンドセリン変換酵素ＩＩ
の分子量決定のための試験結果を図示したものである。
の分子量決定のための試験結果を図示したものである。
【図２】実施例２で得られるエンドセリン変換酵素ＩＩ
の至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
の至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
【図３】実施例６で得られるエンドセリン変換酵素Ｉの
分子量決定のための試験結果を図示したものである。
分子量決定のための試験結果を図示したものである。
【図４】実施例６で得られたエンドセリン変換酵素Ｉの
至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
【図５】実施例１１で得られるエンドセリン変換酵素■
Ｖの至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
Ｖの至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
【図６】実施例１１で得られるエンドセリン変換酵素■
Ｖの分子量決定のための試験結果を図示したものである
。
Ｖの分子量決定のための試験結果を図示したものである
。
【図７】実施例１６で得られたエンドセリン変換酵素■
ＩＩの至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
ＩＩの至適ｐＨの試験結果を図示したものである。
【図８】実施例１６で得られるエンドセリン変換酵素■
ＩＩの分子量決定のための試験結果を図示したものであ
る。
ＩＩの分子量決定のための試験結果を図示したものであ
る。
【図３】
【提出日】平成３年１０月２３日
【手続補正１】
【補正対象項目名】明細書
【補正対象項目名］ ０００５
【補正方法】変更
［０００５］
【化１】
で示されるペプチドを、エンドセリン変換酵素によって
ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基２１個からなるペ
プチドである。この加水分解過程が生体内におけるエン
ドセリンの産生に必須であると考えられる。このエンド
セリン変換活性を有する酵素に関する報告はこれまで培
養ウシ血管内皮細胞［Ｋ、０ｋａｄａ ｅｔ ａｌ
、。 Ｂｉｏｃｈｅｍｔｃａｌ ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｉ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ＣＯｍｍｔｉｎｉＣａ
ｔｉＯｎＳ１７１．１１９２ （１９９０））、ウシ
副腎髄質［Ｔ。 Ｓａｗａｍｕｒａ ｅｔａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １６８，１
２３０ （１９９０）３等についてなされているが、
ヒト由来のエンドセリン変換活性を有する酵素の存在は
未だに明らかにされていない。
ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプ
トファン残基と２２番目のバリン残基との間で加水分解
により切断して生成するアミノ酸残基２１個からなるペ
プチドである。この加水分解過程が生体内におけるエン
ドセリンの産生に必須であると考えられる。このエンド
セリン変換活性を有する酵素に関する報告はこれまで培
養ウシ血管内皮細胞［Ｋ、０ｋａｄａ ｅｔ ａｌ
、。 Ｂｉｏｃｈｅｍｔｃａｌ ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｉ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ ＣＯｍｍｔｉｎｉＣａ
ｔｉＯｎＳ１７１．１１９２ （１９９０））、ウシ
副腎髄質［Ｔ。 Ｓａｗａｍｕｒａ ｅｔａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １６８，１
２３０ （１９９０）３等についてなされているが、
ヒト由来のエンドセリン変換活性を有する酵素の存在は
未だに明らかにされていない。
【手続補正２】
【補正対來書類名】明細書
【補正対象項目名１００１．５
【補正方法】変更
［ｏ ０１５１またヒト細胞質由来の分子量が２４万で
あるもの（酵素Ｉ Ｉ Ｉ）の性質は次のとおりである
。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン１に変換する。 （ｔ）） 基質特異性：ビックエ
ンドセリン−ｌのＮ末端から２１番目のトリプトファン
残基と２２番目のバリン残基との間を加水分解する。
（Ｃ）至適ｐＨ：６．５へ−７，５（ｄ） 分子量：
２４００００以上（ＴＳＫ、−Ｇ３０００ ＳＷを用
いたゲルろ過法により測定）
あるもの（酵素Ｉ Ｉ Ｉ）の性質は次のとおりである
。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエンドセリ
ン１に変換する。 （ｔ）） 基質特異性：ビックエ
ンドセリン−ｌのＮ末端から２１番目のトリプトファン
残基と２２番目のバリン残基との間を加水分解する。
（Ｃ）至適ｐＨ：６．５へ−７，５（ｄ） 分子量：
２４００００以上（ＴＳＫ、−Ｇ３０００ ＳＷを用
いたゲルろ過法により測定）
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名１００１６
【補正方法】変更
［００１６］さらにまたヒト細胞質由来の分子量が５０
万以上であるもの（酵素ＩＶ）の性質は次のとおりであ
る。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエン
ドセづン−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビ
ックエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプト
ファン残基と２２番目のバリン残基との間を加水分解す
る。 （ｃ） 至適ｐＨ： ６． ５〜７． ５ （ｄ）
分子量：５０００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ
を用いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エ
チレンジアミンテ１へラアセテ−１−（ＥＤＴＡ）、１
．１０−ツェナシトロリンにより阻害を受ける。
万以上であるもの（酵素ＩＶ）の性質は次のとおりであ
る。 （ａ） 作用：ビックエンドセリン−１をエン
ドセづン−１に変換する。 （ｂ） 基質特異性：ビ
ックエンドセリン−１のＮ末端から２１番目のトリプト
ファン残基と２２番目のバリン残基との間を加水分解す
る。 （ｃ） 至適ｐＨ： ６． ５〜７． ５ （ｄ）
分子量：５０００００以上（ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ
を用いたゲルろ過法により測定） （ｅ） 阻害剤：エ
チレンジアミンテ１へラアセテ−１−（ＥＤＴＡ）、１
．１０−ツェナシトロリンにより阻害を受ける。
【手続補正４】
【補正対像書類名】明細書
【補正対象項目名１００１８
【補正方法】変更
［００１８］例えばヒ１−胎盤を原料とする場合、次の
ような操作によってこれをうろことができる。すなわち
、ヒ１−胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した
後、これに適当量の緩衝液、例えば２５ｍＭへベスー０
． ２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）を加え
、通常用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホ
モジナイザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られ
たホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る
。
ような操作によってこれをうろことができる。すなわち
、ヒ１−胎盤を微小断片化し、生理食塩水等で脱血した
後、これに適当量の緩衝液、例えば２５ｍＭへベスー０
． ２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）を加え
、通常用いられるホモジナイザー、例えばポリトロンホ
モジナイザーにより低温下ホモジナイズを行う。得られ
たホモジネートを遠心分離に付し、上清及び沈渣を得る
。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名１００２４
【補正方法】変更
［００２４］ （１） 酵素活性の測定法ｎｇ／ｍ
↓９旦ッグエンドッグエンドセリン−１溶液（１００ｍ
Ｍｈリス塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）に０．１ｍｌの酵素
溶液を添加し、３７℃にて３時間反応させる。反応後１
００℃１０分間の処理を行い反応を停止させる。次いで
、生じたエンドセリン−１をサンドイッチ−ＥＩＡ法に
より定板する。上記反応条件にて１２時間にｌｐｍｏｌ
のビッグエンドセリン−１をエンドセリン〜１に変換す
る酵素活性をＩＵ（単位）とする。
↓９旦ッグエンドッグエンドセリン−１溶液（１００ｍ
Ｍｈリス塩酸緩衝液、ｐＨ７，０）に０．１ｍｌの酵素
溶液を添加し、３７℃にて３時間反応させる。反応後１
００℃１０分間の処理を行い反応を停止させる。次いで
、生じたエンドセリン−１をサンドイッチ−ＥＩＡ法に
より定板する。上記反応条件にて１２時間にｌｐｍｏｌ
のビッグエンドセリン−１をエンドセリン〜１に変換す
る酵素活性をＩＵ（単位）とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名）００３８
【補正方法】変更
［００３８］
【実施例１】胎盤細胞膜画分の調製しｈ胎盤（約５ｇ）
より、膜等を除去し、生理食塩水で充分洗浄後、微小断
片化した。この胎盤微小断片に、２５ｍＭへペス−０゜
２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）２０ｍｌを
加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ）ホモジナイザ
ーを用いてホモジナイズした。得られたホモシネ−１−
を１０００ｇ、２０分間遠心分離し、上清を分取した。 この丘清を１． ＯＯ００ｇ、２０分間、再び遠心分離
し、その上清及び沈渣を得た。
より、膜等を除去し、生理食塩水で充分洗浄後、微小断
片化した。この胎盤微小断片に、２５ｍＭへペス−０゜
２５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）２０ｍｌを
加え、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ）ホモジナイザ
ーを用いてホモジナイズした。得られたホモシネ−１−
を１０００ｇ、２０分間遠心分離し、上清を分取した。 この丘清を１． ＯＯ００ｇ、２０分間、再び遠心分離
し、その上清及び沈渣を得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名］ ００３９
【補正方法】変更
［００３９１こうして得られた胎盤ホモシネ−１・・沈
渣に、上記と同一の緩衝液１０ｍ１を加え充分洗浄し、
再度１００００ｇ、２０分間の遠心分離を行い、洗浄沈
渣を分取した 。得られた洗浄沈渣に、１０ｍ１の０．
５％トリトンＸ−１００含有２５ｍＭヘペスー０．２５
Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、４℃に
て一夜放置後、］、００００ｇ２０分間遠心分離して、
抽出液約９ｍｌを得た。
渣に、上記と同一の緩衝液１０ｍ１を加え充分洗浄し、
再度１００００ｇ、２０分間の遠心分離を行い、洗浄沈
渣を分取した 。得られた洗浄沈渣に、１０ｍ１の０．
５％トリトンＸ−１００含有２５ｍＭヘペスー０．２５
Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、４℃に
て一夜放置後、］、００００ｇ２０分間遠心分離して、
抽出液約９ｍｌを得た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名１００４０
【補正方法】変更
［００４０１−一方、胎盤ホモジネート上清は、１００
０００ｇ、２時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した
。 この超遠心分離沈渣に、２ｍｌの０．５％トリトン−Ｘ
１００含有２５ｍＭヘペスー０．２５Ｍシュークロース
緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、４℃にて一夜放置後、再
び１０００００ｇ、２時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約１．５ｍｌを得た。胎盤ホモジネート沈渣
より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心分
離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜両分約１
０．５ｍｌを得た。
０００ｇ、２時間の超遠心分離を行い、沈渣を分取した
。 この超遠心分離沈渣に、２ｍｌの０．５％トリトン−Ｘ
１００含有２５ｍＭヘペスー０．２５Ｍシュークロース
緩衝液（ｐＨ７，４）を加え、４℃にて一夜放置後、再
び１０００００ｇ、２時間超遠心分離を行い、上清を集
めて抽出液約１．５ｍｌを得た。胎盤ホモジネート沈渣
より得られた抽出液と胎盤ホモジネート上清の超遠心分
離沈渣より得られた抽出液とを合わせて細胞膜両分約１
０．５ｍｌを得た。
【手続補正９】
【補正対宋書類名】明細書
【補正対象項目名］ ００４６
【補正方法】変更
［００４６］
【実施例４】至適ｐ）（の測定各々のｐＨの５０ｍＭ緩
衝液（ｐＨ２，０〜７．５クエン酸−リン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７，５〜９．Ｏｌ−リス−塩酸緩衝液、ｐＨ９，０〜
１２．０炭酸水素ナトリウム−水酸化す１−リン酸緩衝
液）に工週製したビッグエンドセリン−１溶液２００
／１１に、実施例２で得られた精製エンドセリン変換酵
素ｌｌ５０μｌを加え、３７℃にて３時間反応を行った
後、前述の方法で酵素活性を測定した結果、図２に示す
よう（二本エンドセリン変換酵素ＩＩはｐＨ６，５〜７
．５の範囲において最も強い活性を示した。
衝液（ｐＨ２，０〜７．５クエン酸−リン酸緩衝液、ｐ
Ｈ７，５〜９．Ｏｌ−リス−塩酸緩衝液、ｐＨ９，０〜
１２．０炭酸水素ナトリウム−水酸化す１−リン酸緩衝
液）に工週製したビッグエンドセリン−１溶液２００
／１１に、実施例２で得られた精製エンドセリン変換酵
素ｌｌ５０μｌを加え、３７℃にて３時間反応を行った
後、前述の方法で酵素活性を測定した結果、図２に示す
よう（二本エンドセリン変換酵素ＩＩはｐＨ６，５〜７
．５の範囲において最も強い活性を示した。
【手続補正１］
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名］ ００５２
【補正方法】変更
［００５２］
【実施例７】基礎特異性実施例６で得られた精製エンド
セリン変換酵素Ｉ １ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッ
グエンドセリンー ［溶液４０ ｌＬＩを添加し、３７
℃にて３時間反応させ、生成物をイナー１ヘシルＯＤＳ
カラム（ジ−エルサイエンス社製）を用いた逆相クロマ
トグラフィーに付し、０．０５％１へリフルオロ酢酸−
１０％アセ１−二ｌ−リル溶液から０，０５％１ヘリフ
ルオロ酢酸−５０％アセ［・ニトリル溶液への直線的濃
度勾配により分析したところ、ビックエンドセリン−１
のピーク以外に２つのピークが出現した。それらのピー
クの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグエンド
セリン−１のＮ末端より２２番［］のバリンから３８番
目のセリンまでのビッグエンドセリン−１の部分ペプチ
ドと同一であった。
セリン変換酵素Ｉ １ｍｌに、０．１ｍｇ／ｍｌビッ
グエンドセリンー ［溶液４０ ｌＬＩを添加し、３７
℃にて３時間反応させ、生成物をイナー１ヘシルＯＤＳ
カラム（ジ−エルサイエンス社製）を用いた逆相クロマ
トグラフィーに付し、０．０５％１へリフルオロ酢酸−
１０％アセ１−二ｌ−リル溶液から０，０５％１ヘリフ
ルオロ酢酸−５０％アセ［・ニトリル溶液への直線的濃
度勾配により分析したところ、ビックエンドセリン−１
のピーク以外に２つのピークが出現した。それらのピー
クの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグエンド
セリン−１のＮ末端より２２番［］のバリンから３８番
目のセリンまでのビッグエンドセリン−１の部分ペプチ
ドと同一であった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名］ ００５３
【補正方法】変更
［００５３］
【実施例８】至適ｐＨの測定各々のｐＨの５０ｍＭ緩衝
液（ｐＨ２，０〜７．５クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ
７，５〜９．０トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９，０〜１２
．０炭酸水素す１へリウムー水酸化ナトリウム緩衝液）
にて調製したビッグエンドセリン−１，溶液２００μｍ
（二実施例６で得られた精製エンドセリン変換酵素Ｉ５
０μＩを加え、３７℃にて３時間反応を行った後、前述
の方法で酵素活性を測定した結果、図４に示すように、
本エンドセリン変換酵素ＩＩはｐＨ６，５〜７．５の範
囲において最も強い活性を示した。
液（ｐＨ２，０〜７．５クエン酸−リン酸緩衝液、ｐＨ
７，５〜９．０トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９，０〜１２
．０炭酸水素す１へリウムー水酸化ナトリウム緩衝液）
にて調製したビッグエンドセリン−１，溶液２００μｍ
（二実施例６で得られた精製エンドセリン変換酵素Ｉ５
０μＩを加え、３７℃にて３時間反応を行った後、前述
の方法で酵素活性を測定した結果、図４に示すように、
本エンドセリン変換酵素ＩＩはｐＨ６，５〜７．５の範
囲において最も強い活性を示した。
【手続補正］２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名］ ００５５
【補正方法】変更
［００５５］
【実施例１０】胎盤細胞質両分の調製ヒ１−胎盤（約５
ｇ）より、膜等を除去し、生理食塩水で十分洗浄後、微
小断片化した。この胎盤微小断片に２５ｍＭへペスし２
５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）２０ｍｌを加
え、ポリ１−ロン（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ）ホモジナイザ
ーを用いてホモジナイズした。得らねだホモシネ−１−
を１０００ｇ、２０分間遠心分離し５、上清を分取した
。この上清を１−００００ ｇ、２０分間、再び遠心分
離し、その上清を分取した。得られた一上清を１０００
００ｇ、２時間超遠心分離し、約２０ｍ１の上清を回収
、細胞質画分としまた。
ｇ）より、膜等を除去し、生理食塩水で十分洗浄後、微
小断片化した。この胎盤微小断片に２５ｍＭへペスし２
５Ｍシュークロース緩衝液（ｐＨ７，４）２０ｍｌを加
え、ポリ１−ロン（Ｐｏｌｙｔｏｒｏｎ）ホモジナイザ
ーを用いてホモジナイズした。得らねだホモシネ−１−
を１０００ｇ、２０分間遠心分離し５、上清を分取した
。この上清を１−００００ ｇ、２０分間、再び遠心分
離し、その上清を分取した。得られた一上清を１０００
００ｇ、２時間超遠心分離し、約２０ｍ１の上清を回収
、細胞質画分としまた。
【手続補正］、３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名］ ００５８
【補正方法】変更
［００５８］
【実施例１，２】基質特異性実施例］、１で得られた精
製エンドセリン変換酵素Ｋ Ｖ １ ｍ ｌに、０．１
ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリンー１溶液４０μｍを添加
し、３７℃にて３時間反応させ、生成物をイナーｈシル
ＯＤＳカラム（ジ−エルサイエンス社製）を用いた逆相
クロマトグラフィーに付し、０．０５％１ヘリフルオロ
酢酸−１０％アセ１ヘニトリル溶液から０．０５％トリ
フルオロ酢酸−５０％アセＩ−二Ｉ〜リル溶液への直線
的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセリン
−１のピーク以外に２つのピークが出現した。それらの
ピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグエ
ンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから３８
番目のセリンまでのビックエンドセリン−１，の部分ペ
プチドと同一であった。
製エンドセリン変換酵素Ｋ Ｖ １ ｍ ｌに、０．１
ｍｇ／ｍｌビッグエンドセリンー１溶液４０μｍを添加
し、３７℃にて３時間反応させ、生成物をイナーｈシル
ＯＤＳカラム（ジ−エルサイエンス社製）を用いた逆相
クロマトグラフィーに付し、０．０５％１ヘリフルオロ
酢酸−１０％アセ１ヘニトリル溶液から０．０５％トリ
フルオロ酢酸−５０％アセＩ−二Ｉ〜リル溶液への直線
的濃度勾配により分析したところ、ビックエンドセリン
−１のピーク以外に２つのピークが出現した。それらの
ピークの溶出位置は、エンドセリン−１およびビッグエ
ンドセリン−１のＮ末端より２２番目のバリンから３８
番目のセリンまでのビックエンドセリン−１，の部分ペ
プチドと同一であった。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名］ ００６４
【補正方法】変更
［００６４］
【実施例１７】基礎特異性実施例１６で得られた精製エ
ンドセリン変換酵素ＩＩ１１ｍｌに、ｏ、］、、］ｍｇ
／ｍ１ビッグエンドセリンー１溶液４０μを添加し、３
７℃にて３時間反応させ、精製物をイナートシルＯＤＳ
カラム（ジ−エルサイエンス社製）を用いた逆相クロマ
トグラフィーに付し、０．０５％トリフルオロ酢酸−１
０％アセｌ−二トリル溶液から０．０５％トリフルオロ
酢酸５０％アセ１へ二１ヘリル溶液への直線的濃度勾配
により分析したところ、ビックエンドセリン−１のピー
ク以外に２つのピークが出現した。それらのピークの溶
出位置は、エンドセリン−１およびビッグエンドセリン
−１のＮ末端より２２番目のバリンから３８番目のセリ
ンまでのビッグエンドセリン−］−の部分ペプチドと同
一であった。
ンドセリン変換酵素ＩＩ１１ｍｌに、ｏ、］、、］ｍｇ
／ｍ１ビッグエンドセリンー１溶液４０μを添加し、３
７℃にて３時間反応させ、精製物をイナートシルＯＤＳ
カラム（ジ−エルサイエンス社製）を用いた逆相クロマ
トグラフィーに付し、０．０５％トリフルオロ酢酸−１
０％アセｌ−二トリル溶液から０．０５％トリフルオロ
酢酸５０％アセ１へ二１ヘリル溶液への直線的濃度勾配
により分析したところ、ビックエンドセリン−１のピー
ク以外に２つのピークが出現した。それらのピークの溶
出位置は、エンドセリン−１およびビッグエンドセリン
−１のＮ末端より２２番目のバリンから３８番目のセリ
ンまでのビッグエンドセリン−］−の部分ペプチドと同
一であった。
Claims (1)
- 【請求項１】ビッグエンドセリン−１のＮ末端から２１
番目のトリプトファン残基と２２番目のバリン残基との
間を加水分解してビッグエンドセリン−１をエンドセリ
ン−１に変換する、至適ｐＨが６．５〜７．５で、分子
量が約１０万、約２４万または５０万以上である、ヒト
細胞由来エンドセリン変換酵素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2413579A JP2966939B2 (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2413579A JP2966939B2 (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04210593A true JPH04210593A (ja) | 1992-07-31 |
| JP2966939B2 JP2966939B2 (ja) | 1999-10-25 |
Family
ID=18522190
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2413579A Expired - Fee Related JP2966939B2 (ja) | 1990-12-07 | 1990-12-07 | ヒト細胞由来のエンドセリン変換酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2966939B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0545344A2 (en) * | 1991-11-29 | 1993-06-09 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Endothelin,converting enzymes |
| WO1995014095A1 (de) * | 1993-11-16 | 1995-05-26 | Basf Aktiengesellschaft | Endothelinkonversionsenzym (ece) |
| WO1995016043A1 (en) * | 1993-12-09 | 1995-06-15 | Zeneca Limited | Cloning of endothelin converting enzyme |
-
1990
- 1990-12-07 JP JP2413579A patent/JP2966939B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0545344A2 (en) * | 1991-11-29 | 1993-06-09 | Nisshin Flour Milling Co., Ltd. | Endothelin,converting enzymes |
| EP0545344A3 (ja) * | 1991-11-29 | 1994-02-16 | Nisshin Flour Milling Co | |
| WO1995014095A1 (de) * | 1993-11-16 | 1995-05-26 | Basf Aktiengesellschaft | Endothelinkonversionsenzym (ece) |
| WO1995016043A1 (en) * | 1993-12-09 | 1995-06-15 | Zeneca Limited | Cloning of endothelin converting enzyme |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2966939B2 (ja) | 1999-10-25 |
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