JP2002541775A - フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサー複合体およびｓｃｆユビキチンリガーゼの新規成分 - Google Patents

フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサー複合体およびｓｃｆユビキチンリガーゼの新規成分

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JP2002541775A
JP2002541775A JP2000601023A JP2000601023A JP2002541775A JP 2002541775 A JP2002541775 A JP 2002541775A JP 2000601023 A JP2000601023 A JP 2000601023A JP 2000601023 A JP2000601023 A JP 2000601023A JP 2002541775 A JP2002541775 A JP 2002541775A
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ダブリュー コナウエイ，ジョアン
シー コナウエイ，ロナルド
カムラ，タクミ
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Oklahoma Medical Research Foundation
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサー複合体の、およびＳＣＦユビキチンリガーゼ複合体の成分である、単離および精製された生物学的に活性なｃｕｌｌｉｎと相互作用するＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガータンパク質（「Ｒｉｎｇボックスタンパク質」）を提供する。 【解決手段】 配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する生物学的に活性なＲｉｎｇボックスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を核酸分子の発現に適した条件下で培養し；そして、宿主細胞培養液から組換え生物活性Ｒｉｎｇボックスタンパク質を回収する。 【効果】 （１）ある癌の素因となる可能性を検出、（２）それらの癌を治療的に処置するための分子標的として、（３）細胞増殖を操作する薬物による阻害の標的として、および（４）細胞ユビキチン化、あるアクチベータータンパク質の結合、フィブロネクチン沈着および細胞分裂プロセスの他の態様の様々な複雑な機序をより良く理解するための研究手段としての、細胞マーカーとして作用する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体に影響を及ぼすおよび生体を処置する組成物、並びに、生物学
的診断剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
染色体第３ｐ２５．５上のフォンヒッペルリンドウ（ＶＨＬ）腫瘍サプレッサ
ー遺伝子は、大半の散発性明細胞癌、および、罹患した個体の、明細胞腎癌、小
脳血管芽細胞および血管腫、網膜血管腫、およびクロム親和性細胞腫を含む様々
な腫瘍への素因となる常染色体優性家族性癌症候群であるＶＨＬ疾病において変
異している（Ｌｉｎｅｈａｎ等、１９９５、「フォンヒッペルリンドウ（ＶＨＬ
）遺伝子の同定、その腎癌での役割」、ＪＡＭＡ ２７３：５６４〜５７０；Ｇ
ｎａｒｒａ等、１９９６、「フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサー遺伝子の
分子クローニングおよびその腎癌での役割」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ
Ａｃｔａ １２４２：２０１〜２１０；およびＫａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．および
Ｅ．Ｒ．Ｍａｈｅｒ、１９９８、「ＶＨＬ腫瘍サプレッサー遺伝子概念図式」、
Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １４：４２３〜４２６）。ＶＨＬタンパク質は、大
半の組織および細胞型で発現されており、低酸素症誘導遺伝子の一般的抑圧（Ｉ
ｌｉｐｏｕｌｏｓ等、１９９６、「フォンヒッペルリンドウタンパク質による低
酸素症誘導遺伝子の負の調節」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳ
Ａ ９３：１０５９５〜１０５９９；Ｇｎａｒｒａ等、１９９６、ＶＨＬ腫瘍サ
プレッサー遺伝子の産物による血管内皮増殖因子ｍＲＮＡの転写後調節」、Ｐｒ
ｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３：１０５８９〜１０５９４；
およびＳｉｅｍｅｉｓｔｅｒ等、１９９６、「フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプ
レッサータンパク質によるヒト腎癌細胞での血管内皮増殖因子の調節解除された
発現の復帰」、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：２２９９〜２３０１）；ｐ２７タ
ンパク質安定性の調節（Ｐａｕｓｅ等、１９９８、「フォンヒッペルリンドウ腫
瘍サプレッサー遺伝子は、血清除去時に細胞周期から出るのに必要である」、Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：９９３〜９９８；および
Ｋｉｍ等、１９９９、「フォンヒッペルリンドウ媒介細胞周期停止を発現してい
る組換えアデノウイルスは、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤ｐ２７Ｋｉｐｌの
誘導に関連している」、ＢＢＲＣ ２５３：６７２〜６７７）；および細胞外フ
ィブロネクチンマトリックスの会合の調節（Ｏｈｈ等、１９９８、「フォンヒッ
ペルリンドウ腫瘍サプレッサータンパク質は、細胞外フィブロネクチンマトリッ
クスの適切な会合に必要である」、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １：９５９〜９６８）を
含む、複数の機能を実施するようである。
【０００３】 調べた全細胞型において、ＶＨＬタンパク質は、ユビキチン様Ｅｌｏｎｇｉｎ
Ｂタンパク質、およびＥｌｏｎｇｉｎＣおよびｃｕｌｌｉｎＣＵＬ２（これは、
Ｓｋｐ１−Ｃｄｃ５３ｐ−Ｆ−ボックスタンパク質（ＳＣＦ）ユビキチンリガー
ゼ複合体のそれぞれＳｋｐ１およびＣｄｃ５３成分に配列類似性を共有する）を
含む多タンパク質複合体に認められる（Ｋｉｂｅｌ等、１９９５、「フォンヒッ
ペルリンドウ腫瘍サプレッサータンパク質の、ＥｌｏｎｇｉｎＢおよびＣへの結
合」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：１４４４〜１４４６；Ｄｕａｎ等、１９９５、
「ＶＨＬ腫瘍サプレッサータンパク質による転写伸長阻害」、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６９：１４０２〜１４０６；Ｐａｕｓｅ等、１９９７、「フォンヒッペルリン
ドウ腫瘍サプレッサー遺伝子産物は、Ｃｄｃ５３タンパク質ファミリーの一員で
ある、ヒトＣＵＬ−２と安定な複合体を形成する」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：２１５６〜２１６１；およびＬｏｎｅｒｇａｎ等
、１９９８、「フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサータンパク質による低酸
素症誘導ｍＲＮＡの調節は、ＥｌｏｎｇｉｎＢ／ＣおよびＣｕｌ２を含む複合体
への結合を必要とする」、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １８：７３２〜７４１
）。ＥｌｏｎｇｉｎＢおよびＣは、ＶＨＬタンパク質の短いＢＣボックスモチー
フと相互作用し、その相互作用をＣＵＬ２に橋渡しする安定な亜複合体を形成す
る（Ｐａｕｓｅ等、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
９４：２１５６〜２１６１；Ｌｏｎｅｒｇａｎ等、１９９８、Ｍｏｌ Ｃｅｌ
ｌ Ｂｉｏｌ １８：７３２〜７４１）。散発性明細胞腎癌およびＶＨＬ家系に
見られる高い割合のＶＨＬ変異は、ＢＣボックスの変異または欠失、ＶＨＬ複合
体の破壊、および低酸素症誘導遺伝子発現の調節解除、ｐ２７タンパク質安定性
、およびフィブロネクチンマトリックス会合をもたらす（Ｇｎａｒｒａ等、１９
９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２４２：２０１〜２１０
；Ｐａｕｓｅ等、１９９７、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
９４：２１５６〜２１６１；Ｌｏｎｅｒｇａｎ等、１９９８、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ １８：７３２〜７４１；Ｏｈｈ等、１９９８、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ
１：９５９〜９６８；およびＫａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．およびＥ．Ｒ．Ｍａｈｅｒ
、１９９８、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １４：４２３〜４２６）。
【０００４】 ＶＨＬタンパク質、ＥｌｏｎｇｉｎＢ、ＥｌｏｎｇｉｎＣ、およびＣＵＬ２を
含む多タンパク質複合体に関して現在入手できる情報にも関わらず、この複合体
の全ての成分並びにこれらの成分の互いに対する結合関係が解明されているわけ
ではない。複合体の依然として不明の成分および他の成分とのその相互作用を特
徴づけ、複合体および疾病に対するその関係をさらに解明する必要がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサー複合体の、およびＳＣＦ
ユビキチンリガーゼ複合体の成分である、単離および精製された生物学的に活性
なｃｕｌｌｉｎと相互作用するＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガータンパク質（「Ｒｉｎ
ｇボックスタンパク質」）及びその製法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本明細書に使用した「Ｒｉｎｇボックスタンパク質」および「Ｒｂｘ１」なる
語は、フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサー複合体の成分であるタンパク質
を意味する。この語は、任意の真核生物種、特に哺乳動物種、例えばウシ、ブタ
、ネズミ、ウマ、およびヒトから得られ、そして、天然、合成、半合成、または
組換えの任意の起源から得られるタンパク質を意味する。この語は、完全より少
ないアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質並びに生物学的活性変
異形および遺伝子産物を包含する。
【０００７】 本明細書に使用した「天然」なる語は、動物組織または細胞から単離および精
製された内因性または外因性タンパク質を意味する。
【０００８】 本明細書に使用した「単離および精製」なる語は、他のタンパク質またはポリ
ペプチドと実質的に会合していないタンパク質、例えば、抗体または他の方法の
使用により細胞性および他の混入物から分離された天然タンパク質としての、ま
たは、組換え宿主細胞培養液の精製産物としてのタンパク質を意味する。
【０００９】 本明細書に使用した「生物学的に活性」なる語は、天然分子の構造的、調節的
または生化学的機能を有するタンパク質を意味する。
【００１０】 本明細書に使用した「ヌクレオチド配列」なる語は、別々の断片の形の、また
は、実質的に純粋な形（すなわち混入内因性物質を含まない）で、そして標準的
な生化学法によるその成分のヌクレオチド配列の同定、操作および回収を可能と
する量または濃度の、少なくとも１回単離されたＤＮＡまたはＲＮＡから得られ
るより大きな核酸作成物の一成分としての、ポリヌクレオチド分子を意味する。
かかる配列は、好ましくは、内部非翻訳配列、すなわち真核生物遺伝子に典型的
に存在するイントロンにより中断されていないオープンリーディングフレームの
形で提供される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームの５’
に存在しても３’に存在してもよく、これは、コード領域の操作または発現を妨
害しない。
【００１１】 本明細書に使用した「核酸分子」なる語は、一本鎖または二本鎖で、線形また
は共有結合的に閉じた分子の、ＲＮＡまたはＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）を意味す
る。核酸分子はまた、全遺伝子またはそのかなりの部分に、またはその断片およ
び誘導体に対応するゲノムＤＮＡであり得る。ヌクレオチド配列は、天然ヌクレ
オチド配列に対応し得るか、または、その断片を含む、１つまたは複数のヌクレ
オチド置換、欠失および／または付加を含み得る。核酸分子中の全てのこのよう
な変異は、適切な宿主で発現されると生物学的に活性なタンパク質、またはその
生物学的に活性な断片をコードする能力を保持している。本発明の核酸分子は、
タンパク質をコードするヌクレオチド配列のみを含んでも、または、遺伝子をタ
ンパク質に進展するための遺伝子を含むより大きな核酸分子の一部であってもよ
い。より大きな核酸分子中のタンパク質をコードしていない配列は、ベクター、
プロモーター、終結因子、エンハンサー、複製、シグナル配列、または遺伝子の
非コード領域を含み得る。
【００１２】 本明細書に使用した「変異形」なる語は、天然タンパク質に実質的に相同であ
るが、１つまたはそれ以上の欠失、挿入、誘導体化、または置換により、天然タ
ンパク質（ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ、または他の真核生物種）
とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。変異アミノ酸配列は
、好ましくは、天然アミノ酸配列に少なくとも４０％同一であるが、最も好まし
くは少なくとも７０％同一である。変異形は、保存的に置換された配列を含み得
、ここでは、あるアミノ酸残基が、類似の物理化学的特徴を有する残基により置
換されている。保存的置換は当分野で公知であり、互いにＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅ
ｕ、またはＡｌａなどの、ある脂肪族残基の別のものへの置換、または、Ｌｙｓ
とＡｒｇ間；ＧｌｕとＡｓｐ間；またはＧｌｎとＡｓｎ間などの、ある極性残基
の別のものへの置換を含む。かかる変異形を作成および使用するために慣用的な
手順および方法を使用できる。類似した疎水性特徴を有する全領域の置換などの
他のかかる保存的置換も公知である。天然変異形も本発明に包含される。かかる
変異形の例は、タンパク質の生物学的活性を残し、その生物学的機能を実施でき
る、選択的ＲＮＡスプライシング事象から、およびタンパク質のタンパク質分解
的切断から生じたタンパク質である。ｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、
切断短縮されているが、生物学的に活性なタンパク質が生じ得る。タンパク質分
解に起因する変異は、１つまたはそれ以上の末端アミノ酸がタンパク質からタン
パク質分解的に除去されたことによる、様々な種類の宿主細胞における発現時の
、ＮまたはＣ末端の差異を含む。
【００１３】 本明細書に使用した「実質的に同じ」なる語は、タンパク質の性質に、すなわ
ちタンパク質の構造および／または生物活性に物質的な影響を及ぼさない配列変
異を有する、核酸またはアミノ酸を意味する。特に核酸配列に言及すると、「実
質的に同じ」なる語は、発現を支配するコード領域および保存配列を言及すると
捉えられ、そして、主に、同じアミノ酸をコードする縮重コドン、または、コー
ドポリペプチド中の保存的に置換されたアミノ酸をコードする別のコドンに言及
する。アミノ酸配列に言及すると、「実質的に同じ」なる語は、一般に、構造ま
たは機能の決定に関与していないポリペプチド領域の保存的置換および／または
変異を意味する。
【００１４】 本明細書に使用した「同一％」なる語は、ウィスコンシン大学から入手できる
ＵＷＧＣＧ配列解析プログラムに定義されるようなアミノ酸配列間の比較を意味
する（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜
３９７（１９８４））。
【００１５】 本発明は、記載した特定の方法、プロトコル、細胞系、ベクター、および試薬
に限定されない。なぜならこれらは変更し得るからである。さらに、本明細書に
使用した専門用語は、単に特定の実施形態を説明するためであり、本発明の範囲
を限定するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲に使用したよう
に、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容から明らかに別である
と示されない限り、複数の言及を含み、例えば、「宿主細胞」は、複数の前記宿
主細胞を含む。
【００１６】 遺伝子コードの縮重のために、本明細書で言及したＲｂｘ１または他のＲｉｎ
ｇボックスタンパク質をコードする複数のヌクレオチド配列が産生され得る。こ
れらの配列には高度に相同的なものもあり、任意の既知で天然の遺伝子のヌクレ
オチド配列に最小限に相同的であるものもある。本発明は、可能なコドン選択肢
に基づいて組合せを選択することにより作成できる、各々そしてあらゆる可能な
ヌクレオチド配列の変異を考える。これらの組合せは、天然Ｒｂｘ１のヌクレオ
チド配列に適用したような、標準的なトリプレット遺伝子コードに従って作成さ
れ、全てのかかる変異を、明確に開示したものと考える。
【００１７】 特記しない限り、本明細書に使用した全ての専門的および科学的用語および任
意の頭字語が、本発明の分野で当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有
する。本明細書に記載したものと類似したまたは等価な任意の方法および物質を
、本発明の実施に使用でき、好ましい方法、装置および物質を本明細書では記載
する。
【００１８】 本明細書に記載した全ての特許および刊行物を、本明細書に、本発明で使用し
得る本明細書で報告したタンパク質、酵素、ベクター、宿主細胞、および方法を
、記載および開示する目的で法律により許容される程度で参考として取込む。し
かし、本明細書のいずれの記載も、以前の発明によりかかる開示の日時を早める
権利がないという承認とは捉えない。
【００１９】
【発明の実施の態様】
本発明は、フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプレッサー複合体の、およびＳＣＦ
ユビキチンリガーゼ複合体の成分である、単離および精製された生物学的に活性
なｃｕｌｌｉｎと相互作用するＲＩＮＧ−Ｈ２フィンガータンパク質（「Ｒｉｎ
ｇボックスタンパク質」）、Ｒｉｎｇボックスタンパク質をコードする核酸分子
、Ｒｉｎｇボックスタンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクター、Ｒｉ
ｎｇボックスタンパク質をコードするＤＮＡを有する発現ベクターでトランスフ
ェクトまたは形質転換した宿主細胞、Ｒｉｎｇボックスタンパク質をコードする
ＤＮＡを有する発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞を
培養することによる組換えＲｉｎｇボックスタンパク質、単離および精製組換え
Ｒｉｎｇボックスタンパク質、複合体の産生法、および、治療剤のスクリーニン
グにおけるＲｉｎｇボックスタンパク質の使用法、ある癌への患者の素因を診断
する方法、ヒトおよび他の動物において数個の列挙したいずれかの癌を処置また
は代謝的に欠乏した系を増大する方法、および、Ｒｉｎｇボックス関連癌の治療
処置の効力を評価する方法を提供する。特に、本発明は、Ｒｂｘ１と称される新
規Ｒｉｎｇボックスタンパク質を提供する。
【００２０】 Ｒｂｘ１の単離および精製 ラット肝からの内因性ＶＨＬ複合体を、最初に、以下に記載し図１Ａに概略を
示した手順により精製した。ＶＨＬ複合体を、３６０匹の雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄ
ａｗｌｅｙラットの肝臓から調製した後核上清から精製し、以前に記載されたよ
うに（ＮＨ４）２ＳＯ４沈降により分画した（Ｃｏｎａｗａｙ等、１９９６、「
ラット肝臓からのＲＮＡポリメラーゼＩＩ一般転写因子の精製」、Ｍｅｔｈ Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ ２７３：１９４〜２０７）。ＶＨＬ複合体を含む画分を、ＶＨＬ
タンパク質に対するモノクローナルのＩＧ３２を使用して、ウェスタンブロット
により同定した（Ｋｉｂｅｌ等、１９９５、「フォンヒッペルリンドウ腫瘍サプ
レッサー遺伝子のＥｌｏｎｇｉｎＢおよびＣへの結合」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６
９：１４４４〜１４４６）。０〜３８％の（ＮＨ４）２ＳＯ４画分を、０．５Ｍ
Ｍ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌのアンチパイン、および１０μｇ／ｍｌのロイペ
プチンを含む緩衝液Ａ［２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．９）、０．
５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］に再懸濁
し、０．５ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液Ａに対する３時間の透析および同緩衝液
での希釈により、１００ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液Ａと等しい伝導率とした。透
析液を、３０分間、２８，０００×ｇで遠心分離し、上清を、〜４５分間、１０
０ｍＭ ＫＣｌおよび０．５ｍＭ ＰＭＳＦを含む緩衝液Ａ中で予め平衡化した
８００ｍｌのホスホセルロース（Ｐ１１、ホワットマン）と穏やかに混合した。
次いで、スラリーを、１０．５ｃｍ直径のカラム中で５００ｍｌ／時間でろ過し
た。画分を通るホスホセルロース流を、〜４５分間、８０ｍＭ ＫＣｌを含む緩
衝液Ｃ［４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍ
Ｍ ＤＴＴ、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］中に平衡化した２５０ｍｌ
のＴｏｙｏｐｅａｒｌＤＥＡＥ−６５０Ｍ（ＴｏｓｏＨａａｓ）と穏やかに混合
した。スラリーを、５．０ｃｍ直径のカラム中で１５０ｍｌ／時間でろ過し、次
いで、同じ流速で８０ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液Ｃで洗浄した。カラムを、２２
０ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液Ａで２５０ｍｌ／時間で段階的に溶出し、５０ｍｌ
画分を集めた。ＶＨＬタンパク質を含む画分を、０．３ｍｇ／ｍｌの（ＮＨ４） ２ ＳＯ４沈降により濃縮し、１０μｇ／ｍｌのアンチパインおよび１０μｇ／ｍ
ｌのロイペプチンを含む緩衝液Ａ１０ｍｌに再懸濁し、３００ｍＭ ＫＣｌを含
む緩衝液Ａに対して、５００ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む緩衝液Ａと等価な伝
導率となるまで透析した。１５分間１２，０００×ｇで遠心分離した後、得られ
た上清を、２０ｍｌ／時間で、４００ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液Ａ中で前以て平
衡化した、５００ｍｌの２．６ｃｍ直径のＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡｃＡ３４ゲルろ
過カラム（ＩＢＦ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ）に適用した。カラムを２０ｍｌ／
時間で溶出し、１０ｍｌ画分を集めた。３３０ｋＤａ〜２００ｋＤａの見かけの
天然分子量で溶出された、ＶＨＬタンパク質を含む画分を、２．０Ｍ （ＮＨ４ ）２ＳＯ４を含む、等容量の緩衝液Ｅ［４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ
７．９）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、および１０％（ｖ／ｖ）グ
リセロール］で希釈した。２０分間６０，０００×ｇで遠心分離後、得られた上
清を、１．０Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む緩衝液Ｅ中で前以て平衡化した、Ｓ
ｐｈｅｒｏｇｅｌＴＳＫフェニル５−ＰＷカラム（２１．５−×１５０−ｍｍ、
ベックマンインストルメンツ）に適用した。カラムを、５ｍｌ／分で、緩衝液Ｅ
中１．０Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４から緩衝液Ｅの線形勾配で溶出し、５ｍｌ画分を
集めた。１７０ｍＭ〜８０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４で溶出された、ＶＨＬタンパ
ク質を含む画分をプールし、緩衝液Ｃに対して、６０ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液
Ｃと等価な伝導率になるまで透析した。２０分間６０，０００×ｇで遠心分離後
、得られた上清を、６０ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液Ｃ中で予め平衡化した、Ｂｉ
ｏ−ＧｅｌＳＥＣ ＤＥＡＥ５−ＰＷカラム（７．５−×７５−ｍｍ、バイオラ
ッド）に適用した。カラムを、０．８ｍｌ／分で、緩衝液Ｃ中６０ｍＭから２５
０ｍＭ ＫＣｌの線形勾配４０ｍｌで溶出し、０．７ｍｌ画分を集めた。１２０
ｍＭ〜１４０ｍＭ ＫＣｌで溶出された、ＶＨＬタンパク質を含む画分をプール
し、５ｍＭリン酸カリウムとした。２０分間６０，０００×ｇで遠心分離後、得
られた上清を、緩衝液Ｐ［５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．６）、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール］中で予め平
衡化した、結晶性ヒドロキシルアパタイトバイオ−スケールＣＨＴ−Ｉカラム（
７−×５２−ｍｍ、バイオラッド）に適用した。カラムを、０．６ｍｌ／分で、
緩衝液Ｐ中５０ｍＭから４００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．６）の線形勾配
２４ｍｌで溶出し、０．３ｍｌ画分を集めた。５０ｍＭから８０ｍＭリン酸カリ
ウムで溶出された、ＶＨＬタンパク質を含む画分をプールし、５０ｍＭ ＫＣｌ
を含む緩衝液Ｃで、８０ｍＭ ＫＣｌ中の緩衝液Ｃと等価な伝導率となるまで希
釈した。２０分間６０，０００×ｇで遠心分離後、得られた上清を、８０ｍＭ
ＫＣｌを含む緩衝液Ｃ中で予め平衡化したＭｏｎｏＱカラム（５−×５０−ｍｍ
、ファルマシア）に適用した。カラムを、０．４ｍｌ／分で、緩衝液Ｃ中８０ｍ
Ｍから３００ｍＭ ＫＣｌの線形勾配１２ｍｌで溶出し、０．２ｍｌ画分を集め
た。ＶＨＬタンパク質を含む画分は、１８０ｍＭから２００ｍＭ ＫＣｌで溶出
された。
【００２１】 図１Ｂおよび１Ｃに示したように、肝ホモジネート中の９０％以上の検出可能
なＶＨＬタンパク質が、ＣＵＬ２、ＥｌｏｎｇｉｎＢ、ＥｌｏｎｇｉｎＣ、およ
び見かけの分子量〜１６ｋＤａを有する小ポリペプチドと共精製された。ＶＨＬ
、ＣＵＬ２、ＥｌｏｎｇｉｎＢ、およびＥｌｏｎｇｉｎＣポリペプチドの実体は
、ウェスタンブロットおよび／またはペプチドシークエンスにより確認された。
図１Ｃに示したＳＤＳポリアクリルアミドゲルから切出した〜１６ｋＤａタンパ
ク質の、以下に記載した方法を使用した（Ｅｎｇ等、１９９４、Ｊ．Ａｍ Ｓｏ
ｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ５：９７６およびＣｈｉｔｔｕｍ等、１９９
８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１０８６６）、オンラインイオントラッ
プＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳペプチドシークエンスにより、それは、「Ｒｂｘ１」ま
たは「Ｒｉｎｇ−ボックスタンパク質」と称される、新規ＲＩＮＧ−Ｈ２フィン
ガータンパク質であることが判明した。
【００２２】 Ｒｂｘ１のシークエンス ＶＨＬ腫瘍サプレッサー複合体を、１３％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気
泳動により分画した。タンパク質を、クーマシーブルーでゲルを染色して可視化
し、切り出し、ゲル内還元、Ｓ−カルボキシアミドメチル化、およびトリプシン
消化にかけた。１０％の消化混合物を使用して、ペプチド配列を、１回の操作で
、四重極イオントラップ質量分析計のエレクトロスプレーイオン化源（Ｆｉｎｎ
ｉｇａｎ ＬＣＱ）に結合したミクロキャピラリー逆相クロマトグラフィーによ
り決定した。イオントラップのオンラインデータ依存的走査により、荷電状態お
よび正確な質量を決定するための高分解スペクトルおよび配列情報用のタンデム
質量分析スペクトルの自動獲得が可能となる。相対的衝突エネルギーは３５％で
あり、単離幅は２．５ダルトンであった。ＴＬＡＳＴＩＮアルゴリズムを使用し
て実施したＥＳＴデータベースの探索により、ペプチド配列ＮＨＩＭＤＬＣＩＥ
ＣＱＡＮ、ＱＶＣＰＬＤＮＲＥＷＥＦＱＫ、ＷＮＡＶＡＬおよびＷＬＫをコード
するヒトおよびマウスＥＳＴが同定され、これは、ＶＨＬ複合体と同時精製され
た、１６ｋＤａポリペプチドのイオントラップ質量分析により決定された。同定
は、アルゴリズムＳＥＱＵＥＳＴ（Ｅｎｇ等、１９９４、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍ
ａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ５：９７６）およびハーバード微量化学施設で開発
されたプログラム（Ｃｈｉｔｔｕｍ等、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
３７：１０８６６）により容易になった。ヒト（Ｈ７１９９３）およびマウス（
Ｗ６６９８９およびＡＡ２６０８８９）Ｒｂｘ１の完全な１０８アミノ酸長のＯ
ＲＦをコードしている、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアムｃＤＮＡクローン
（Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．コンソーシアム：ゲノムおよびその発現の統合的分子解
析」、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３３：１５１〜１５２）を、アラバマ、ハンツビル、
リサーチジェネティクスから得、両鎖のヌクレオチド配列を決定した。ヒトおよ
びマウスｃＤＮＡは、１０８アミノ酸の同一のポリペプチドをコードしていた。
ヒトおよびマウスＲｂｘ１のアミノ酸配列を図２および配列番号１に示す。ヒト
Ｒｂｘ１ＤＮＡのヌクレオチド配列を、配列番号３のヌクレオチド７〜３３３に
示し、ネズミＲｂｘ１ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号５のヌクレオチド１
８〜３４４に示し、終止コドンを含む。ヌクレオチド１〜６および１〜１７は、
それぞれ５’非翻訳領域であり、３３４〜５０８および３４５〜５０４は、それ
ぞれ３’非翻訳領域である。
【００２３】 図２に示したように、Ｒｂｘ１は、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＯＲＦ１１
５Ｃ２．１１、Ｃ．エレガンスＯＲＦ ＺＫ２８７．５、およびＳ．セレビジア
エＯＲＦ ＹＯＬ１３３ｗに高度に相同的である。サッカロミセスセレビジアエ
Ｒｂｘ１のアミノ酸配列を配列番号２に示し、サッカロミセスセレビジアエＲｂ
ｘ１ＤＮＡのヌクレオチド配列を配列番号４のヌクレオチド４〜３６９に示し、
終止コドンを含む。推定アミノ酸配列の比較により、タンパク質は約８０％の同
一性をもって高度に相同的であり、タンパク質は実質的に同じであることが実証
される。さらに、Ｒｂｘ１は、サッカロミセスセレビジアエ分裂後期促進複合体
サブユニットＡＰＣ１１に有意な配列類似性を示す（Ｚａｃｈａｒｉａｅ等、１
９９８、「酵母からの分裂後期促進複合体の質量分析：ｃｕｌｌｉｎｓに関連し
たサブユニットの同定」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：１２１６〜１２１９）。
【００２４】 遺伝子コードの縮重のために、ＤＮＡ配列は、配列番号３に示したものとは異
なり得るが、配列番号１に示したアミノ酸配列を有するＲｂｘ１タンパク質を依
然としてコードする。かかる変異ＤＮＡ配列は、サイレント変異から、例えばＰ
ＣＲ増幅中に生じ得るか、または、天然配列の慎重な変異誘発の産物であり得る
。それ故、本発明は、（ａ）天然Ｒｂｘ１遺伝子のコード領域；（ｂ）配列番号
３に提示したヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；（ｃ）中程度にストリンジェン
トな条件下で天然Ｒｂｘ１遺伝子にハイブリダイズでき、生物学的に活性なＲｂ
ｘ１をコードする、ＤＮＡ；および（ｄ）遺伝子コードの縮重の結果、（ａ）、
（ｂ）、または（ｃ）に定義したＤＮＡに変性し、そして、生物学的に活性なＲ
ｂｘ１をコードするＤＮＡ、から選択された生物学的に活性なＲｂｘ１をコード
する等価な単離ＤＮＡ配列を提供する。かかるＤＮＡ等価配列によりコードされ
るＲｂｘ１は本発明に包含される。
【００２５】 Ｒｂｘ１の組換え発現 単離および精製組換えＲｂｘ１は、本発明に従って、対応するＤＮＡを、発現
ベクターに取込み、ＤＮＡを適切な宿主細胞で発現してタンパク質を産生するこ
とにより提供される。
【００２６】 発現ベクター タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターは、公知の技法を
使用して調製できる。発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫
遺伝子から得られた配列などの、適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に
作動可能に連結したＤＮＡ配列を含む。調節配列の例は、転写プロモーター、オ
ペレーター、エンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、および、転写および
翻訳開始および終結を制御する適切な配列を含む。ヌクレオチド配列は、調節配
列が、適切なタンパク質のＤＮＡ配列に機能的に関連する場合に「作動可能に連
結」している。従って、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレ
オチド配列が、適切なＤＮＡ配列の転写を制御する場合に、Ｒｂｘ１ＤＮＡ配列
に作動可能に連結している。
【００２７】 通常複製起点により付与される所望の宿主細胞での複製能、および、形質転換
体を同定する選択遺伝子を、さらに、発現ベクターに取込み得る。 さらに、天然にＲｂｘ１に会合していない適切なシグナルペプチドをコードす
る配列を、発現ベクターに取込むことができる。例えば、シグナルペプチド（分
泌リーダー）のＤＮＡ配列を、タンパク質配列にインフレーム融合し、よって、
タンパク質は最初、シグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳される。
目的の宿主細胞で機能的なシグナルペプチドは、適切なポリペプチドの細胞外分
泌を増強する。シグナルペプチドは、細胞からのタンパク質の分泌時にポリペプ
チドから切断され得る。
【００２８】 宿主細胞 Ｒｂｘ１の発現に適した宿主細胞は、原核細胞、酵母、古細菌、および他の真
核細胞を含む。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物細胞宿主で使用するに適切な
クローニングおよび発現ベクターは、当分野で公知である。例えば、Ｐｏｕｗｅ
ｌｓ等、クローニングベクター：実験マニュアル、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨ
ーク（１９８５）。ベクターは、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、または一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクター
であり得る。かかるベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとして、
ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するための公知の技術により、細胞に導入し得
る。ベクターが、ファージおよびウイルスベクターの場合も、感染および形質導
入の公知の技術により、パッケージングまたはカプセル化されたウイルスとして
細胞に導入し得、好ましくは導入する。ウイルスベクターは、複製コンピテント
または複製欠陥であり得る。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、宿主細胞を
捕捉した場合にのみ起こる。細胞非含有翻訳系も、本発明のＤＮＡ作成物から得
られたＲＮＡを使用してタンパク質を産生するのに使用できる。
【００２９】 本発明で宿主細胞として有用な原核生物は、Ｅ．コリまたは桿菌などのグラム
陰性またはグラム陽性生物を含む。原核宿主細胞では、ポリペプチドは、原核宿
主細胞での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基
を含み得る。Ｎ末端Ｍｅｔは、発現されたＲｂｘ１ポリペプチドから切断し得る
。組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般的に使用されるプロモーター配列は、
β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系を含む。
【００３０】 原核宿主細胞に使用する発現ベクターは、一般に、１つまたはそれ以上の表現
型選択マーカー遺伝子を含む。表現型選択マーカーは、例えば、抗生物質耐性を
付与または独立栄養要求を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核
宿主細胞に有用な発現ベクターの例は、クローニングベクターｐＢＲ３２２（Ａ
ＴＣＣ３７０１７）などの市販で入手できるプラスミドから得られるものを含む
。ｐＢＲ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、従
って、形質転換細胞を同定する簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２を使用して
発現ベクターを作成するために、適切なプロモーターおよびＤＮＡ配列をｐＢＲ
３２２ベクターに挿入する。他の市販で入手可能なベクターは、例えば、ｐＫＫ
２２３−３（ファルマシアファインケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）、ｐ
ＧＥＭ１（プロメガバイオテック、マディソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ）およ
びｐＥＴ（ノバゲン、マディソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ）およびｐＲＳＥＴ
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カールズバッド、カルフォルニア、ＵＳＡ）、一連
のベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３７
（１９９１）；Ｓｃｈｏｅｐｆｅｒ，Ｒ．Ｇｅｎｅ １２４：８３（１９９３）
）を含む。
【００３１】 組換え原核宿主細胞発現ベクターに一般に使用されるプロモーター配列は、Ｔ
７（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｈ．、Ｌａｄｅ，Ｂ．Ｎ．、Ｃｈｕｉ，Ｄ−Ｓ．
、Ｌｉｎ，Ｓ−Ｗ．、Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．およびＳｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．（１
９８７）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）５６、１２５〜１３５）、β−ラクタマーゼ（
ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ
２７５：６１５、（１９７８）；およびＧｏｅｄｄｅｌ等、Ｎａｔｕｒｅ ２８
１：５４４（１９７９））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅ
ｄｄｅｌ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０））、お
よびｔａｃプロモーター（Ｍａｎｉａｔｉｓ、分子クローニング：実験マニュア
ル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、４１２項（１９８２））を含む
。
【００３２】 本発明で宿主細胞として有用な酵母は、サッカロミセス属、ピシア，Ｋ．、放
線菌、および、クリュイベロミセスからのものを含む。酵母ベクターは、しばし
ば、２μプラスミドの複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領
域、ポリアデニル化配列、転写終結配列、および選択マーカー遺伝子を含む。酵
母ベクターの適切なプロモーター配列は、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホ
スホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
５５：２０７３（１９８０））または他の糖分解酵素（Ｈｏｌｌａｎｄ等、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、１７：４９００（１９７８））、例えばエノラーゼ、グリセルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲ
ナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコール−６−リン酸イソメラーゼ、３−
ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラ
ーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼを含む。酵母発現
で使用する他の適切なベクターおよびプロモーターは、Ｆｌｅｅｒ等、Ｇｅｎｅ
、１０７：２８５〜１９５（１９９１）にさらに記載されている。酵母および酵
母形質転換プロトコルの他の適切なプロモーターおよびベクターは、当分野で公
知である。
【００３３】 酵母形質転換プロトコルは、当業者には公知である。１つのかかるプロトコル
は、Ｈｉｎｎｅｎ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、７５：
１９２９（１９７８）に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎプロトコルは、選択培地
でＴｒｐ．ｓｕｐ．＋形質転換体を選択し、ここで、選択培地は、０．６７％の
酵母窒素ベース、０．５％のカサミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌのア
デニン、および２０μｇ／ｍｌのウラシルからなる。
【００３４】 当分野で公知の哺乳動物または昆虫宿主細胞系も、組換えＲｂｘ１を発現する
ために使用でき、例えば、昆虫細胞での異種タンパク質の産生のためにバキュロ
ウイルス系を（ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ６：４７（１９８８））または哺乳動物発現にはチャイニーズハムスター
卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用し得る。哺乳動物宿主細胞発現ベクター用の転写およ
び翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り出し得る。一般に使用されるプロモ
ーター配列およびエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２
、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、およびヒトサイトメガロウイルスから得
られる。ＳＶ４０ウイルスゲノムから得られるＤＮＡ配列を、哺乳動物宿主細胞
での構造遺伝子配列の発現用の他の遺伝子エレメント、例えば、ＳＶ４０起点、
初期および後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル
化部位を提供するために使用し得る。ウイルス初期および後期プロモーターが特
に有用である。なぜなら、両方共、容易にウイルスゲノムから、ウイルス複製起
点を含み得る断片として得られるからである。哺乳動物宿主細胞で使用する例示
的発現ベクターは、当分野で公知である。
【００３５】 Ｒｂｘ１および他のＲｉｎｇボックスタンパク質は、有益である場合、融合セ
グメントに付着したＲｉｎｇボックスタンパク質を有する融合タンパク質として
発現され得る。融合セグメントは、しばしば、例えば、融合タンパク質の単離お
よびアフィニティクロマトグラフィーによる精製を可能とすることにより、タン
パク質精製を補助する。融合タンパク質は、タンパク質のカルボキシルおよび／
またはアミノ末端に付着した融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合
核酸配列で形質転換した組換え細胞を培養することにより産生できる。好ましい
融合セグメントは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダ
ーゼ、二価金属イオンに結合できるポリ−ヒスチジンセグメント、およびマルト
ース結合タンパク質を含むがこれに限定されない。
【００３６】 発現および回収 本発明に従って、単離および精製Ｒｂｘ１は、上記の組換え発現系により産生
し得る。この方法は、タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで
形質転換した宿主細胞を、タンパク質の発現を促進するに十分な条件下で培養す
ることを含む。次いで、タンパク質を、使用した発現系に応じて、培養培地また
は細胞抽出物から回収する。当業者には公知のように、組換えタンパク質を精製
する手順は、使用する宿主細胞の種類および組換えタンパク質が培養培地に分泌
されるかどうかなどの因子によって変化する。組換えタンパク質を分泌する発現
系を使用する場合、培養培地を最初に濃縮し得る。濃縮段階後、濃縮液を、ゲル
ろ過媒体などの精製マトリックスに適用できる。別に、陰イオン交換レジン、例
えば遊離したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは
基質を使用できる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラ
ン、セルロース、またはタンパク質精製に一般的に使用される他のタイプであり
得る。また、陽イオン交換段階も使用できる。適切な陽イオン交換体は、スルホ
プロピルまたはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスを含む。さ
らに、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、遊離メチルまたは他の脂肪族基を有
するシリカゲル）、イオン交換−ＨＰＬＣ（例えば、遊離ＤＥＡＥまたはスルホ
プロピル（ＳＰ）基を有するシリカゲル）、または疎水性相互作用−ＨＰＬＣ（
例えば、遊離フェニル、ブチル、または他の疎水性基を有するシリカゲル）を使
用した１つまたはそれ以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ
）を、タンパク質をさらに精製するために使用できる。様々な組合せの、前記精
製段階のいくつかまたは全ては、当分野で公知であり、単離および精製組換えタ
ンパク質の提供に使用できる。
【００３７】 細菌培養液中で産生された組換えタンパク質は、通常、最初に宿主細胞を破壊
し、遠心分離にかけ、不溶性ポリペプチドの場合には細胞ペレットから、または
可溶性ポリペプチドの場合には上清液体から抽出し、次いで、１回またはそれ以
上濃縮し、脱塩し、イオン交換、アフィニティー精製、またはサイズ排除クロマ
トグラフィー段階にかけることにより単離する。最後に、ＲＰ−ＨＰＬＣを最終
精製段階に使用できる。微生物細胞は、凍結−解凍サイクリング、超音波処理、
機械的破壊、または細胞溶菌剤の使用を含む、任意の慣用的な方法により破壊で
きる。
【００３８】 別の態様において、本発明は、ＳＣＦ複合体による修飾に標的化した任意の基
質への、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質の添加のＲｂｘ１−依存性刺
激を妨害または増大するであろう、可能性ある治療剤についてスクリーニングす
るのに有用なタンパク質複合体を提供する。複合体は、補因子タンパク質、並び
に、ｃｕｌｌｉｎタンパク質、基質認識タンパク質、およびリンカータンパク質
からなる群から選択される１つまたはそれ以上のタンパク質を含む。ＡＴＰなど
の追加の成分を、複合体を含む溶液または組成物に加えて、複合体形成および使
用を容易にし得る。
【００３９】 好ましい実施形態において、複合体は、ｃｕｌｌｉｎタンパク質；基質認識タ
ンパク質；リンカータンパク質；および補因子タンパク質を含むユビキチンリガ
ーゼタンパク質複合体である。複合体は、好ましくは、各群からの１つのタンパ
ク質を有するが、必要または好ましい場合、各群から１つ以上のタンパク質を有
することができる。好ましくは、複合体は、タンパク質から形成されるが、複合
体を含む溶液または組成物は、複合体形成および利用を容易にするために必要で
ある場合、追加の成分を含み得る。例えば、複合体を含む溶液または組成物は、
（１）Ｓｋｐ１、ＥｌｏｎｇｉｎＣ、または他のリンカータンパク質；（２）β
−ＴＲＣＰ、Ｃｄｃ４、Ｇｒｒ１、または他のＦ−ボックス基質認識タンパク質
またはＶＨＬまたは他のＥｌｏｎｇｉｎＣ結合基質認識タンパク質；（３）ＣＵ
Ｌ１、Ｃｄｃ５３、ＣＵＬ２、または他のｃｕｌｌｉｎタンパク質；（４）Ｃｄ
ｃ３４、ＵＢＣ５Ｃ、または別のＥ２ユビキチンコンジュゲート酵素；（５）リ
ン酸化または他の適切に修飾された基質；（６）Ｅ１ユビキチン活性化酵素；（
７）ＡＴＰ；および（８）ユビキチン、ＧＳＴ−ユビキチン、ＧＳＴ−ユビキチ
ンＲＡ、ユビキチン誘導体、またはユビキチン様タンパク質、例えばＳＵＭＯ、
ＮＥＤＤ８、またはＲｕｂ１の様々な組合せを含むことができる。
【００４０】 好ましくは、複合体は、ｃｕｌｌｉｎタンパク質、基質認識タンパク質、リン
カータンパク質、および補因子タンパク質を含む、ユビキチンリガーゼタンパク
質複合体である。最も好ましくは、複合体は、かかるタンパク質を含む、単離お
よび精製ユビキチンリガーゼタンパク質複合体である。
【００４１】 一般に、本発明のｃｕｌｌｉｎタンパク質は、Ｃｄｃ５３、Ｃｕｌｌｉｎ１（
ＣＵＬ１）、Ｃｕｌｌｉｎ２（ＣＵＬ２）、Ｃｕｌｌｉｎ３（ＣＵＬ３）、Ｃｕ
ｌｌｉｎ４Ａ（ＣＵＬ４Ａ）、Ｃｕｌｌｉｎ４Ｂ（ＣＵＬ４Ｂ）、およびＣｕｌ
ｌｉｎ５（ＣＵＬ５）からなる群から選択されたタンパク質、好ましくはＣＵＬ
１またはＣＵＬ２である。基質認識タンパク質は、Ｆ−ボックスタンパク質、例
えばβ−ＴＲＣＰ（ＨＯＳ）、Ｃｄｃ４、Ｇｒｒ１、およびこのタンパク質ファ
ミリーの他のメンバーおよびＶＨＬおよび他のＥｌｏｎｇｉｎＣ結合タンパク質
からなる群から選択され、好ましくはＦ−ボックスまたはＶＨＬである。リンカ
ータンパク質は、Ｓｋｐ１またはＥｌｏｎｇｉｎＣからなる群から選択される。
多くのこのようなＣｕｌｌｉｎ、基質認識、およびリンカータンパク質が当分野
で公知であり、本発明に使用できる。補因子タンパク質は、本発明のＲｉｎｇボ
ックスタンパク質であり、好ましくはＲｂｘ１である。
【００４２】 図５は、本発明のユビキチンリガーゼを示す、ＳＣＦおよびＶＨＬユビキチン
リガーゼ複合体の図を示す。ｃｕｌｌｉｎタンパク質は、ＳＣＦ複合体ではＣｄ
ｃ５３／Ｃｕｌｌ、およびＶＨＬ複合体ではＣＵＬ２であり、基質認識タンパク
質は、ＳＣＦ複合体ではＦ−ボックスタンパク質、およびＶＨＬ複合体ではＶＨ
Ｌタンパク質であり、リンカータンパク質は、ＳＣＦ複合体ではＳｋｐ１、ＶＨ
Ｌ複合体ではＥｌｏｎｇｉｎＣである。ＶＨＬ複合体はまた、ＥｌｏｎｇｉｎＢ
も含む。補因子タンパク質Ｒｂｘ１は、他のタンパク質に結合し、ユビキチンリ
ガーゼを活性化する。ＳＣＦユビキチンリガーゼは、Ｓｉｃ１、サイクリン、β
−カテニン、ＮＦ−κＢ阻害剤、例えばＩκＢα等の基質タンパク質を標的化し
、ＶＨＬユビキチンリガーゼ複合体は、低酸素症誘導因子１（ＨＩＦ１）および
低酸素症誘導因子２（ＨＩＦ２）などの基質タンパク質を標的化する。
【００４３】 本発明はまた、ＶＨＬ含有複合体のＳＣＦによる修飾に標的化されたものを含
む、任意の基質への、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質の添加のＲｂｘ
１依存性刺激を妨害または増大するであろう、可能性ある治療剤についてスクリ
ーニングする方法を提供する。この方法は、補因子タンパク質、並びに、ｃｕｌ
ｌｉｎタンパク質、基質認識タンパク質、リンカータンパク質からなる群から選
択される１つまたはそれ以上のタンパク質を含む複合体をインビトロで形成し；
試験化合物を加えて複合体と相互作用させ；そして、複合体が無傷のままである
か、または化合物により破壊されているかを決定することを必要とする。複合体
が破壊されている場合、化合物は、癌または炎症疾患などの対応する疾病の処置
に有用な治療剤のようである。例えば、複合体は、Ｃｄｃ５３とＲｂｘ１の間で
インビトロで形成され得る。試験化合物を加えて、複合体と相互作用させること
ができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットまたは他の既知の技法などのア
ッセイを実施して、複合体が無傷のままであるか、または破壊されているかを決
定できる。ＳＣＦユビキチンリガーゼは、サイクリンおよびサイクリン依存性キ
ナーゼ阻害剤（これは細胞周期を調節する）およびＩκＢ（これは炎症プロセス
を調節する）を含むがこれに限定されない、タンパク質の安定性を制御する。複
合体が破壊されている場合、化合物は、抗癌剤または抗炎症薬の候補のようであ
る。
【００４４】 好ましくは、方法に使用する複合体は、本明細書に記載のユビキチンリガーゼ
タンパク質複合体であり、最も好ましくは、単離および精製ユビキチンリガーゼ
タンパク質複合体である。
【００４５】 類似のアッセイにおいて、Ｒｂｘ１は、様々なセットの標的タンパク質に、ユ
ビキチンまたはユビキチン様タンパク質をコンジュゲートするのを制御する、他
のＣｕｌｌｉｎ含有ユビキチンリガーゼの、およびＶＨＬ複合体の活性を増大ま
たは阻害する、薬剤についてスクリーニングするのに使用できる。低酸素症誘導
転写因子ＨＩＦ１αは、ＶＨＬ複合体によるユビキチン化の標的のようである（
Ｍａｘｗｅｌｌ等、「腫瘍サプレッサータンパク質ＶＨＬは、酸素依存性タンパ
ク質分解の低酸素症誘導因子を標的化する」、Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２７１、
１９９９）。低酸素症誘導転写因子は、正常な血管新生並びに腫瘍の血管新生を
制御する、血管内皮増殖因子を含む、低酸素症誘導遺伝子の発現を調節する。従
って、ＶＨＬ複合体の機能を破壊または妨害する化合物は、抗癌薬または血管新
生を促進する薬物の候補のようである。
【００４６】 別の態様において、本発明は、ある癌への患者の素因を診断する方法を提供す
る。本発明は、ある患者組織または体液における、ＶＨＬ関連タンパク質、すな
わちＲｉｎｇボックスタンパク質、例えばＲｂｘ１の非存在は、患者が、ある癌
の素因があることを示すという発見に基づく。この方法は、患者から組織または
体液サンプルを集め、組織または体液を、組織中のＲｉｎｇボックスタンパク質
の量について解析し、そして、組織または体液中のＲｉｎｇボックスタンパク質
の量に基づいてある癌への患者の素因を予測することを含む。特に、ある組織中
のＲｂｘ１タンパク質レベルの決定により、患者における、特異的で早期、好ま
しくは転移が起こる前の、癌の検出が可能となる。本発明の方法を使用して診断
できる癌は、明細胞腎癌を含むがこれに限定されない。
【００４７】 別の態様において、本発明は、ヒトおよび他の動物における、数個の列挙した
いずれかのＲｉｎｇボックスタンパク質関連癌を処置する、または代謝的に欠乏
した系（例えばフィブロネクチン沈着）を増大する方法を提供する。１つの方法
は、標的Ｒｂｘ１遺伝子の発現をインビボで増強または増大し、Ｒｉｎｇボック
スタンパク質の発現をインビボで増強する化合物の治療有効量を、Ｒｉｎｇボッ
クスタンパク質関連癌または細胞性欠乏症を有すると診断された、および、Ｒｉ
ｎｇボックスタンパク質、好ましくはＲｂｘ１欠乏症と診断された患者に投与す
ることを含む。好ましい実施形態において、化合物は、Ｒｉｎｇボックスタンパ
ク質をコードする核酸配列の配列を含む核塩基である。投与後、核酸配列は活性
化され、Ｒｉｎｇボックスタンパク質が産生され、細胞中のＲｉｎｇボックスタ
ンパク質の量は増加する。Ｒｉｎｇボックスタンパク質の量が増加すると、ＶＨ
Ｌ腫瘍サプレッサー活性、ユビキチン化、フィブロネクチン沈着、および類似の
活性は増加する。別の方法は、治療有効量のＲｉｎｇボックスタンパク質を、Ｒ
ｉｎｇボックスタンパク質関連癌または細胞性欠乏症を有すると診断された、お
よび、Ｒｉｎｇボックスタンパク質、好ましくはＲｂｘ１欠乏症と診断された患
者に投与することを含む。本発明の方法を使用して処置できる癌は、明細胞腎癌
を含むがこれに限定されない。
【００４８】 別の態様において、本発明は、Ｒｉｎｇボックス関連癌の治療処置の効力を評
価する方法を提供する。この方法は、Ｒｉｎｇボックス関連癌に罹患している、
および、かかる癌の治療処置を受けている患者から組織または体液サンプルを集
め、組織または体液サンプル中のＲｉｎｇボックスタンパク質の量を決定し、そ
して、Ｒｉｎｇボックスタンパク質の決定した量を、正常なＲｉｎｇボックスタ
ンパク質レベルを示す標準と比較することを含む。標準は、正常患者のＲｉｎｇ
ボックスレベルの平均であり得るが、好ましくは、処置開始前の処置する患者の
Ｒｉｎｇボックスタンパク質レベルである。標準に比べて上昇したＲｉｎｇボッ
クスタンパク質レベルは、処置が効果的であることを示す。
【００４９】
【実施例】
実施例１ インビトロのＳｉｃ１ユビキチン化アッセイにおけるＳＣＦＣｄｃ４とＲｂｘ１
の使用 Ｒｂｘ１は、細胞ユビキチン化の様々な複雑な機序をより良く理解するための
研究手段として使用できる。ＳＣＦＣｄｃ４機能のＲｂｘ１の役割を直接試験す
るために、Ｓｉｃ１リン酸化およびＥ２Ｃｄｃ４に依存した、標準的なインビト
ロＳｉｃ１ユビキチン化アッセイを使用した（Ｓｋｏｗｙｒａ等、１９９７、Ｃ
ｅｌｌ ９１：２０９）。ＳＣＦＣｄｃ４成分は、哺乳動物または酵母Ｒｂｘ１
の存在下または非存在下で、昆虫細胞において共発現され、複合体を、ＭＹＣ−
タグＣｄｃ５３（ＭＹＣ−Ｃｄｃ５３）またはＦＬＡＧ−タグＳｋｐ１（ＦＬＡ
Ｇ−Ｓｋｐ１）サブユニットを通して免疫精製した。免疫精製したＳＣＦＣｄｃ ４ 複合体を、免疫ブロットによるＳｉｃ１コンジュゲートの解析前に、リン酸化
Ｓｉｃ１、Ｃｄｃ４、Ｅ１ユビキチン活性化酵素、ＡＴＰ、およびＧＳＴ−Ｕｂ ＲＡ で補充した。ＧＳＴ−ＵｂＲＡは、ポリユビキチン化産物を僅かにしか形成
せず、よって、Ｓｉｃ１コンジュゲートは、ＧＳＴ−ＵｂＲＡのサイズとは、〜
３５ｋｄ異なるバンドのはしごに取り込まれる。使用した反応条件下では、低い
が、検出可能な量のＳｉｃ−ＧＳＴ−ＵｂＲＡコンジュゲートが、６０分間の反
応後に、ＳＣＦＣｄｃ４複合体により産生された。酵母または哺乳動物Ｒｂｘ１
の存在下では、Ｓｉｃ１−ＧＳＴ−ＵｂＲＡコンジュゲートの蓄積は、２０分後
に劇的に増加し、かなりの量のより高分子量のコンジュゲートが６０分後に蓄積
した。反応が、抗Ｃｄｃ５３または抗ＦＬＡＧ−Ｓｋｐ１免疫複合体を含む場合
、高い割合のリン酸化Ｓｉｃ１が、Ｓｉｃ１−ＧＳＴ−ＵｂＲＡコンジュゲート
に；例えば、＞９５％が変換されるか、または、Ｓｉｃ１は、抗Ｓｋｐ１免疫複
合体を含む反応でコンジュゲートに変換された。これに対し、５％以下の基質が
、大量のＣｄｃ４またはＣｄｃ５３の存在下にも関わらず、Ｃｄｃ５３またはＳ
ｋｐ１免疫複合体により、Ｒｂｘ１の非存在下で、コンジュゲートしていた。活
性化の程度およびＲｂｘ１活性化の濃度依存性を調べるために、ＳＣＦＣｄｃ４ 複合体を、様々なレベルのＭＹＣ−Ｒｘｂ１を共発現している昆虫細胞から精製
し、次いで、Ｓｉｃ１ユビキチンコンジュゲート活性についてアッセイした。Ｒ
ｂｘ１の非存在下で、低レベルのコンジュゲートが観察された。Ｒｂｘ１の量の
増加により、ユビキチン化レベルは増加し、活性化の最大程度は、２０倍近くで
あった。この見積もりは、Ｒｂｘ１がＳｉｃ１−ＧＳＴ−ＵｂＲＡコンジュゲー
トの蓄積速度を増加できる下限を示す。なぜなら、高い割合のリン酸化Ｓｉｃ１
基質が、反応の終了時に枯渇したからである。これらの複合体の免疫ブロット解
析により、Ｃｄｃ５３、Ｃｄｃ４、およびＳｋｐ１のレベルは、Ｒｂｘ１滴定を
通じて一貫していることが示された。
【００５０】 実施例２ ＩκＢαユビキチン化を刺激するための、ＳＣＦβ−ＴＲＣＰとＲｂｘ１の使用 研究手段としてＲｂｘ１を使用する別の例として、Ｒｂｘ１は、Ｅ１ユビキチ
ン活性化酵素、Ｅ２ユビキチンコンジュゲート酵素ＵＢＣ５Ｃ、ＡＴＰ、ＧＳＴ
−ＵｂＲＡ、およびＳＣＦβ−ＴＲＣＰ（これはＦ−ボックスタンパク質β−Ｔ
ＲＣＰを含む）の存在下で、リン酸化ＩκＢのユビキチン化を刺激するために使
用できる（Ｙａｒｏｎ等、１９９８、「ＩκＢα−ユビキチンリガーゼの受容体
成分の同定」、Ｎａｔｕｒｅ ３９６：５９０〜５９４；Ｗｉｎｓｔｏｎ等、１
９９９、「ＳＣＦβ−ＴＲＣＰ−ユビキチンリガーゼ複合体は、ＩκＢαおよび
β−カテニンのリン酸化破壊モチーフと特異的に会合し、ＩκＢαユビキチン化
をインビトロで刺激する」、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １３：２７０〜２８３）。好
ましい実施形態において、Ｒｂｘ１とＳＣＦβ−ＴＲＣＰの複合体は、ＳＣＦサ
ブユニットおよびＲｂｘ１をコードするバキュロウイルスで感染させたＨｉ５ま
たはＳｆ２１昆虫細胞の溶菌液から精製できる。複合体は、Ｗｉｎｓｔｏｎの記
載したように調製したリン酸化ＩκＢ（Ｗｉｎｓｔｏｎ等、１９９９、Ｇｅｎｅ
ｓ Ｄｅｖ １３：２７０〜２８３）、ＵＢＣ５Ｃ、Ｅ１ユビキチン活性化酵素
、ＡＴＰ、およびＧＳＴ−ＵｂＲＡで補充できる。インキュベート期間後、反応
産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＩκＢαに対する抗体を使用してウェスタン
ブロットにより解析できる。ＩκＢαへのＧＳＴ−ＵｂＲＡのコンジュゲートに
より、ＧＳＴ−ＵｂＲＡのサイズと、〜３５ｋＤ異なるＩκＢαコンジュゲート
のはしごが形成される。Ｒｂｘ１を研究手段として使用できる確認は、刊行され
ている。例えばＴａｎ等、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３：５２７（１９９９）。
【００５１】 実施例３ ＨＩＦ１αユビキチン化を再構成するためのＶＨＬ複合体とＲｂｘ１の使用 研究手段としてＲｂｘ１を使用する別の例として、Ｒｂｘ１を、ＨＩＦ１α（
Ｍａｘｗｅｌｌ等、「腫瘍サプレッサータンパク質ＶＨＬは、酸素依存性タンパ
ク質分解の低酸素症誘導因子を標的化する」、Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２７１、
１９９９）のユビキチン化アッセイに、Ｅ１ユビキチン活性化酵素、Ｅ２ユビキ
チンコンジュゲーション酵素ＵＢＣ５ａ、ＡＴＰ、ＧＳＴ−ＵｂＲＡ、および、
ＶＨＬタンパク質、ＥｌｏｎｇｉｎＢ、ＥｌｏｎｇｉｎＣ、ＣＵＬ２、およびＲ
ｂｘ１からなる複合体の存在下で使用した。好ましい実施形態において、ＶＨＬ
含有複合体は、ＶＨＬ複合体のサブユニットをコードしているバキュロウイルス
で感染させたＳｆ２１昆虫細胞から精製する。ＶＨＬ複合体に、ＨＩＦ１または
ＨＩＦ２をコードしているバキュロウイルスで感染させた昆虫細胞からの溶菌液
、および、ＵＢＣ５ａ、Ｅ１ユビキチン活性化酵素、ＡＴＰ、およびＧＳＴ−Ｕ
ｂＲＡを補充した。インキュベート期間後、反応産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにか
け、ＨＩＦ１αに対する抗体を使用してウェスタンブロットにより解析した。Ｈ
ＩＦ１αへのＧＳＴ−ＵｂＲＡのコンジュゲートにより、ＧＳＴ−ＵｂＲＡのサ
イズと、〜３５ｋＤサイズが異なるＨＩＦ１αコンジュゲートのはしごが形成さ
れる。
【００５２】 実施例４ Ｃｕｌｌｉｎタンパク質のＲｕｂ１（ＮＥＤＤ８）修飾を刺激するためのＲｂｘ
１の使用 Ｒｂｘ１を使用して、Ｒｕｂ１活性化酵素Ｕｂａ３／Ｕｌａ１、Ｒｕｂ１−コ
ンジュゲート酵素Ｕｂｃ１２、ＡＴＰ、ＧＳＴ−Ｒｕｂ１、および、Ｒｂｘ１お
よびＣｄｃ５３またはＣｌｕ２からなる複合体の存在下で、ユビキチン様タンパ
ク質Ｒｕｂ１（ＮＥＤＤ８としても知られる）による、ｃｕｌｌｉｎタンパク質
Ｃｄｃ５３およびＣＵＬ２の修飾を刺激した（Ｋａｍｕｒａ等、「ＳＣＦおよび
ＶＨＬ Ｅ３ユビキチンリガーゼのＲｂｘ１サブユニットは、ｃｕｌｌｉｎｓ
Ｃｄｃ５３およびＣｕｌ２のＲｕｂ１修飾を活性化する」、Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．
１３：２９２８、１９９９）。１つの実施形態において、Ｃｄｃ５３−Ｒｂｘ１
複合体は、Ｃｄｃ５３およびＲｂｘ１をコードするバキュロウイルスで感染させ
たＳｆ２１細胞から精製する。複合体に、Ｕｂａ３／Ｕｌａ１、Ｕｂｃ１２、Ａ
ＴＰ、およびＧＳＴ−Ｒｕｂ１を補充する。インキュベート期間後、反応産物を
ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、Ｃｄｃ５３を認識する抗体を使用してウェスタンブロ
ットにより解析する。Ｃｄｃ５３へのＧＳＴ−Ｒｕｂ１のコンジュゲートにより
、非修飾Ｃｄｃ５３は消失し、Ｃｄｃ５３−ＧＳＴ−Ｒｕｂ１コンジュゲートに
対応する、新規でよりゆっくりと移動しているバンドが出現した。別の実施形態
において、ＣＵＬ２−Ｒｂｘ１複合体は、ＣＵＬ２およびＲｂｘ１をコードする
バキュロウイルスで感染させたＳｆ２１細胞から精製する。複合体に、Ｕｂａ３
／Ｕｌａ１、Ｕｂｃ１２、ＡＴＰ、およびＧＳＴ−Ｒｕｂ１を補充する。インキ
ュベート期間後、反応産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＣＵＬ２を認識する抗体
を使用してウェスタンブロットにより解析する。ＣＵＬ２へのＧＳＴ−Ｒｕｂ１
へのコンジュゲートにより、非修飾ＣＵＬ２は消失し、Ｃｄｃ５３−ＧＳＴ−Ｒ
ｕｂ１コンジュゲートに対応する新規でよりゆっくりと移動しているバンドが出
現する。
【００５３】 実施例５ ＶＨＬ複合体の再構成 ＶＨＬ複合体およびその部分会合物の昆虫細胞での細菌発現タンパク質による
インビトロでの再構成により、Ｒｂｘ１は、ＶＨＬ、ＣＵＬ２、およびＥｌｏｎ
ｇｉｎＢＣ複合体と相互作用できることが示される。 Ｒｂｘ１およびＶＨＬを、それぞれ、Ｎ末端ＨｉｓタグおよびＮ末端ｍｙｃお
よびＣ末端ＦＬＡＧタグを用いて、ｐＢａｃＰＡＫ８にサブクローニングした。
ＣＵＬ１を、Ｃ末端ＨＡタグを用いて同ベクターに導入し、ＣＵＬ２を、Ｎ末端
ＨｉｓおよびＨＡタグを用いてｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ１に導入し、組換えバキ
ュロウイルスを、ＢａｃＰＡＫバキュロウイルス発現系（クロンテック）を使用
して作成した。Ｓ．セレビジアエＣＤＣ５３（Ｗｉｌｌｅｍｓ等、１９９６、「
Ｃｄｃ５３は、ユビキチンタンパク質分解経路により、分解のためにリン酸化Ｇ
１サイクリンを標的化する」、Ｃｅｌｌ ８６：４５３〜４６３）およびＥｌｏ
ｎｇｉｎｓＢおよびＣをコードする、バキュロウイルスベクターが記載されてい
る（Ｋａｍｕｒａ等、１９９８、「ＥｌｏｎｇｉｎＢＣ複合体は、ＳＯＣＳ、ｒ
ａｓ、ＷＤ−４０リピート、およびアンキリンリピートＦＡＭＩＬＩＥＳのメン
バーに存在する保存ＳＯＣＳ−ボックスモチーフと相互作用する」、Ｇｅｎｅｓ
Ｄｅｖ １２：３８７２〜３８８１）。Ｓｆ２１細胞を、２７℃で、５％ウシ
胎児血清を含むＳｆ−９００ＩＩＳＦＭ中で培養し、ｍｙｃ−Ｒｂｘ１、ＦＬＡ
Ｇ−ＶＨＬ、ＨＡ−ＣＵＬ２、ＨＰＣ４−ＥｌｏｎｇｉｎＢ、およびＨＳＶ−Ｅ
ｌｏｎｇｉｎＣをコードする様々な組合せのバキュロウイルスで同時感染した。
感染の６０時間後、Ｓｆ２１細胞を集め、４０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、ｐ
Ｈ７．９、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．５％（ｖ／ｖ）グリセ
ロール、５μｇ／ｍｌのロイペプチン、５μｇ／ｍｌのアンチパイン、５μｇ／
ｍｌのペプスタチンＡ、および５μｇ／ｍｌのアプロチニンを含む氷冷緩衝液中
で穏やかにボルテックスをかけることにより溶菌した。溶菌液を、１０，０００
×ｇで２０分間４℃で遠心分離した。上清を免疫沈降に使用した。
【００５４】 Ｅ．コリ中での組換えタンパク質の発現および精製のために、全長マウスＲｂ
ｘ１を、Ｎ末端６−ヒスチジンおよびｍｙｃエピトープタグを有するｐＲＳＥＴ
Ｂ（インビトロジェン）で発現させた。ヒトＶＨＬを、Ｎ末端６−ヒスチジン
およびＣ末端ＦＬＡＧエピトープタグを有するｐＲＳＥＴ Ｂで発現させた。Ｅ
ｌｏｎｇｉｎＢおよびＣの封入体および発現作成物からの組換えタンパク質の精
製は以前に記載されている（Ｋａｍｕｒａ等、１９９８、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ
１２：３８７２〜３８８１）。
【００５５】 免疫沈降およびウェスタンブロットの手順は以下の通りである。抗Ｔ７および
抗ＨＳＶ抗体はノバゲンから得た。抗ＨＡ（１２ＣＡ５）および抗ｃ−ｍｙｃ（
９Ｅ１０）抗体はベーリンガー−マンハイムから得た。抗ＦＬＡＧ（Ｍ２）はイ
ーストマンコダックから得た。抗ＥｌｏｎｇｉｎＣモノクローナル抗体はトラン
スダクションラボラトリーズから得た。抗ＶＨＬモノクローナル抗体（Ｉｇ３２
）は、ファーミンゲンから得た。抗Ｓｉｃ１（ｙＮ−１９およびｙＣ−１９）お
よび抗Ｃｄｃ５３（ｙＣ−１７）抗体は、サンタクルツバイオテクノロジー社か
ら得た。抗ＥｌｏｎｇｉｎＢウサギポリクローナル抗体は、以前に記載されてい
た（Ｇａｒｒｅｔｔ等、１９９５、「尾ユビキチン相同体による一般転写ＳＩＩ
Ｉの正の調節」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７１
７２〜７１７６）。抗ＨＰＣ４モノクローナル抗体（Ｓｔｅａｒｎｓ等、１９８
８、「プロテインＣ活性化ペプチド領域と、Ｃａ２＋依存性モノクローナル抗体
の相互作用。抗原および抗体の両方への不可避的なＣａ２＋結合の証拠」、Ｊ
Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：８２６〜８３２）は、同僚から得た。昆虫細菌溶
菌液および再度折り畳まれた細菌発現タンパク質のウェスタンブロットおよび免
疫沈降は記載の通りに実施した（Ｋａｍｕｒａ等、１９９８、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅ
ｖ １２：３８７２〜３８８１）。
【００５６】 図３Ａに示したように、ＶＨＬ複合体の全５つの成分が、抗ＦＬＡＧ（レーン
５）または抗ｍｙｃ（レーン９）抗体と共に、Ｓｆ２１細胞溶菌液から共に同時
免疫沈降し得る。さらに、Ｒｂｘ１、ＶＨＬ、およびＥｌｏｎｇｉｎＣＢ複合体
は、抗ＦＬＡＧ（レーン６）または抗ｍｙｃ（レーン１０）抗体と共に、ＣＵＬ
２の非存在下で、Ｓｆ２１細胞溶菌液から同時免疫沈降し；そして、Ｒｂｘ１、
ＣＵＬ２、およびＥｌｏｎｇｉｎＢＣ複合体は、ＶＨＬ（レーン１１）の非存在
下で、抗ｍｙｃ抗体と共に、Ｓｆ２１細胞溶菌液から同時免疫沈降し得る。図３
Ｂおよび３Ｄに示したように、Ｒｂｘ１は、ｍｙｃ−Ｒｂｘ１およびＦＬＡＧ−
ＶＨＬ、ｍｙｃ−Ｒｂｘ１およびＨＡ−ＣＵＬ２、またはｍｙｃ−Ｒｂｘ１、Ｈ
ＰＣ４−ＥｌｏｎｇｉｎＢ、およびＨＳＶ−ＥｌｏｎｇｉｎＣで共感染したＳｆ
２１細胞の溶菌液からの、ＶＨＬ、ＣＵＬ２、またはＥｌｏｎｇｉｎＢＣ複合体
と共に、抗ｍｙｃ抗体で同時免疫沈降し得る。これらの結果と一致して、図３Ｃ
に示したように、Ｒｂｘ１は、細菌で発現されるＦＬＡＧ−ＶＨＬ、ＨＰＣ４−
ｅｌｏｎｇｉｎＢ、およびＨＳＶ−ＥｌｏｎｇｉｎＣでインビトロで再構成され
た、ＶＨＬ−ＥｌｏｎｇｉｎＢＣおよびＥｌｏｎｇｉｎＢＣ部分会合物と共に同
時免疫沈降し得る。
【００５７】 ＣＵＬ２は、多タンパク質Ｃｕｌｌｉｎファミリーの一員であり（Ｋｉｐｒｅ
ｏｓ等、１９９６、「Ｃｕｌ−１は、Ｃ．エレガンスの細胞周期出口に必要であ
り、新規遺伝子ファミリーを同定する」、Ｃｅｌｌ ８５：８２９〜８３９）、
これはまた、ＳＣＦ成分ＣＵＬ１およびそのＳ．セレビジアエ相同体Ｃｄｃ５３
を含む。Ｒｂｘ１は、図３Ａに示したようにＣＵＬ２と相互作用するので、ＣＵ
Ｌ１およびＣｄｃ５３と相互作用し得る可能性を調べた。図３Ｄに示したように
、Ｒｂｘ１は、ヒトＣＵＬ１およびＳ．セレビジアエＣｄｃ５３の両方に結合す
る。Ｍｙｃ−Ｒｂｘ１およびヒトＨＡ−ＣＵＬ１は、ｍｙｃ−Ｒｂｘ１およびＨ
Ａ−ＣＵＬ１をコードするバキュロウイルスで同時感染したＳｆ２１細胞の溶菌
液からの抗ｍｙｃ抗体で同時免疫沈降し得る。さらに、ｍｙｃ−Ｒｂｘ１および
Ｃｄｃ５３は、ｍｙｃ−Ｒｂｘ１およびＣｄｃ５３をコードするバキュロウイル
スで同時感染したＳｆ２１細胞の溶菌液からの抗ｍｙｃ抗体と同時免疫沈降し得
る。
【００５８】 実施例６ ＳＣＦＣｄｃ４ユビキチンリガーゼの機能に対するＲｂｘ１の効果 Ｃｄｃ５３／ＣＵＬ１は、近年記載されたＳＣＦユビキチンリガーゼ複合体の
一成分であり、これは、細胞周期、転写および発達に重要な役割を有する多様な
集合のタンパク質のユビキチン化を触媒する（Ｐａｔｔｏｎ等、１９９８、「Ｃ
ｄｃ５３は、酵母で細胞分裂およびメチオニン生合成を調節する、複数のＣｄｃ
３４／Ｓｋｐ１／Ｆ−ボックスタンパク質複合体の足場タンパク質である」、Ｇ
ｅｎｅｓ Ｄｅｖ １２：６９２〜７０５；Ｂａｉ等、１９９６、「ＳＫＰ１は
、細胞周期調節因子を、新規モチーフのＦ−ボックスを介して、ユビキチンタン
パク質分解機械に接続する」、Ｃｅｌｌ ８６：２６３〜２７４；Ｐａｔｔｏｎ
等、１９９８、「ユビキチン依存性タンパク質分解の組合せ制御：ｄｏｎｔ’ｓ
Ｓｋｐ ｔｈｅ Ｆ−ｂｏｘ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ １４：２３６〜２４３；Ｓｋｏｗｙｒａ等、１９９７、「
Ｆ−ボックスタンパク質は、リン酸化基質を、ＳＣＦユビキチン−リガーゼ複合
体に補充する受容体である」、Ｃｅｌｌ ９１：２０９〜２１９；およびＦｅｌ
ｄｍａｎ等、１９９７、「Ｃｄｃ４ｐ、Ｓｋｐｌｐ、およびＣｄｃ５３ｐ／Ｃｕ
ｌｌｉｎの複合体は、リン酸化ＣＤＫ阻害剤のＳｉｃｌｐのユビキチン化を触媒
する」、Ｃｅｌｌ ９１：２２１〜２３０）。ＳＣＦ複合体は、Ｃｄｃ５３／Ｃ
ＵＬ１、Ｓｋｐ１、および、基質をユビキチン化のためにＳＣＦに補充する、様
々なＦ−ボックスタンパク質の１つを含む（Ｐａｔｔｏｎ等、１９９８、Ｇｅｎ
ｅｓ Ｄｅｖ １２：６９２〜７０５；およびＢａｉ等、１９９６、Ｃｅｌｌ
８６：２６３〜２７４）。結果により、Ｒｂｘ１は、ＣＵＬ１および追加のＳＣ
Ｆ成分のＳｋｐ１を含む複合体をに会合できる。なぜなら、Ｍｙｃ−Ｒｂｘ１は
、ｍｙｃ−Ｒｂｘ１、Ｔ７タグＳｋｐ１（Ｔ７−Ｓｋｐ１）およびＨＡ−ＣＵＬ
１をコードするウイルスで同時感染したＳｆ２１細胞の溶菌液からの抗Ｔ７抗体
で同時免疫沈降し得るからである。
【００５９】 ＳＣＦＣｄｃ４複合体によるユビキチン化のためにｃｄｋ阻害剤のＳｉｃ１を
補充する、ＷＤ４０リピートタンパク質Ｃｄｃ４、および、ＳＣＦＧｒｒｌ複合
体によるユビキチン化のためにＧ１サイクリンＣｌｎ２を補充するロイシンリッ
チリピートタンパク質Ｇｒｒｌは、酵母で見られる数個のＦ−ボックスタンパク
質に含まれる。Ｒｂｘ１は、細胞において、ＣＵＬ２およびＶＨＬ複合体と相互
作用するだけでなく、ＳＣＦ成分のＣｄｃ５３／ＣＵＬ１（図３Ａ）およびＳｋ
ｐ１と相互作用することが示されたので、染色体ＲＢＸ１遺伝子を欠失した変異
酵母株を、Ｒｂｘ１がＳＣＦＣｄｃ４およびＳＣＦＧＲＲｌの機能に影響を及ぼ
し得る可能性を試験するために作成した。
【００６０】 Ｒｂｘ１遺伝子を欠失したＳ．セレビジアエ株は以下の通りに作成した。Ｒｂ
ｘ１遺伝子は、ＭＣＹ４５３（Ｍａｔａ／ＭＡＴｈｉｓ３）−２００／ｈｉｓ３
）−２００ ｃａｎ１Ｒ／ｃａｎ１Ｒ ｃｙｈ２Ｒｃｙｈ２Ｒ ｕｒａ３／ｕｒ
ａ３ ｌｅｕ２／ｌｅｕ２ ｔｒｐ１／ｔｒｐ１ ｌｙｓ２／ｌｙｓ２）におい
て、完全なＲｂｘ１ＯＲＦ（ＹＯＬ１３３ｗ）を、ＨＩＳ３遺伝子と交換するこ
とにより破壊した（Ｂａｕｄｉｎ等、１９９３、「サッカロミセス・セレビジア
エの直接的遺伝子欠失のための簡単で効率的な方法」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ ２１：３３２９〜３３３０）。ｒｂｘ１欠失株（ＭＣＹ５５７）
を哺乳動物ＲＢＸ１で救出するために、野生型および変異哺乳動物ＲＢＸ１遺伝
子を、プラスミドＹｅｐ３５２−ＧＡＬのＧＡＬ１，１０プロモーターに融合さ
せた。これらのプラスミドを、ＭＣＹ５５７に形質転換し、ＵＲＡ３＋形質転換
体を選択した。無作為な胞子が、ガラクトース培地（ヒスチジン（−））上で発
芽し、４日間３０℃で発芽させた。生じたコロニーを交配について試験した。救
出が、ＳＣＦ発現プラスミドの存在に起因するかを確認するために、細胞を、ウ
ラシルを含む培地中での長期増殖後にＦＯＡ中での増殖能について試験した。胞
子形成および四分子解体により、生存率について２：０の分離が示され、全ての
生存可能な胞子はＨＩＳ−であり、ＲＢＸ１は必須な遺伝子であることが示され
る。生存不能の胞子は、１０〜２０個の細胞を含むミクロコロニーを産生し、そ
の多くが異常に伸長しているか、または複数の異常な形の芽を含んでいた。ＳＣ
Ｆ成分のＣｄｃ５３、Ｓｋｐ１、Ｃｄｃ４、およびＣｄｃ３４をコードする遺伝
子の変異を含むＳ．セレビジアエ株は、類似の形態を示す。この表現型は、ＲＢ
Ｘ１欠失に起因した。なぜなら、ｒｂｘ１欠失株は、ｙＲｂｘ１の発現により救
出できるからである。
【００６１】 Ｒｂｘ１欠失株はまた、ｍｙｃタグ哺乳動物Ｒｂｘ１（ｍＲｂｘ１）または変
異ｍＲｂｘ１（Ｍ４）の発現により救出され、ここで、推定環フィンガーシステ
イン５３およびシステイン５６は、セリンで置換されていた。しかし、ｒｂｘ１
欠失株は、変異ｍＲｂｘ１（Ｍ３）の発現により救出されず、ここで、推定環フ
ィンガーシステイン４２およびシステイン４５はセリンにより置換されていた。
ｒｂｘ１欠失株または野生型背景で発現される場合、ｍｙｃタグｍＲｂｘ１は、
内因性酵母Ｃｄｃ５３タンパク質と同時免疫沈降し、これは、それは細胞中でＣ
ｄｃ５３と会合していることを示唆する（図４Ａ）。さらに、野生型および変異
型ｍＲｂｘ１タンパク質と、Ｃｄｃ５３の同時免疫沈降は、欠失表現型を救出す
る能力に関連していた。なぜなら、有意により多くのＣｄｃ５３が、非捕捉Ｍ３
変異体とよりも、捕捉ｍＲｂｘ１Ｍ４変異体と同時沈降したからである（図４Ａ
）。
【００６２】 これらの結果により、酵母Ｒｂｘ１（ｙＲｂｘ１）は、ＳＣＦＣｄｃ４ユビキ
チンリガーゼのサブユニットおよびアクチベーターであり、哺乳動物Ｒｂｘ１（
ｍＲｂｘ１）は、活性ＳＣＦＣｄｃ４複合体の再構成の酵母対応物と置換できる
ことが示される。
【００６３】 ＳＣＦｃｄｃ４複合体は、Ｓｉｃｌ（その分解はＧ１／Ｓ移行に必須である）
を含む様々な細胞周期調節タンパク質のユビキチン化および標的化分解に必要で
ある。ＳＣＦＧｒｒｌ複合体は、Ｇ１サイクリンＣｌｎ２のユビキチン化および
標的化分解に必要である。これらのプロセスでのＲｂｘ１の役割を伝える１つの
手段として、ｍｙｃタグ野生型またはＭ４変異ｍＲｂｘ１は、ＧＡＬ１，１０プ
ロモーターの制御下で、高コピー数のプラスミドでのｒｂｘ１欠失株で発現され
た。プラスミドを有する細胞をガラクトース培地からグルコース培地へ移すと、
Ｒｂｘ１タンパク質は枯渇し、伸長した発芽形態を示す細胞の割合は劇的に増加
した（図４Ｃ）。Ｍ４変異体を発現している細胞は、グルコースを移動した数時
間以内に増殖が停止し、一方、野生型Ｒｂｘ１を発現している細胞は、ゆっくり
と増殖し続け、これはおそらく、少量の残留Ｒｂｘ１の存在に起因する。期待さ
れるように、Ｍ４細胞が、少なくとも一部、ユビキチン化できないために、Ｓｉ
ｃｌおよびＣｌｎ２を停止する場合、Ｍ４細胞は、グルコースに移した場合、Ｓ
ｉｃｌおよびＣｌｎ２タンパク質を蓄積した（図４Ｂ）。
【００６４】 Ｒｂｘ１がＳＣＦユビキチン−リガーゼの一般的なサブユニットであることを
示すことにより、（１）Ｒｂｘ１は、ＳＣＦユビキチン−リガーゼ複合体を含む
、Ｃｄｃ５３／ＣＵＬ１のサブユニットと相互作用する、（２）Ｒｂｘ１変異体
が、ＳＣＦユビキチンリガーゼのＣｄｃ５３サブユニットに結合する能力は、染
色体Ｒｂｘ１を欠失した酵母株での細胞周期停止を防ぐ能力に関連する、および
（３）酵母からのＲｂｘ１の枯渇は、ＳＣＦｃＣｄｃ４およびＳＣＦＧｒｒ１の
機能を妨害することが実証される。Ｒｂｘ１はまた、ＣＵＬ２含有ＶＨＬ複合体
の一成分であるので、Ｒｂｘ１は、ここで、依然として同定されていないセット
の標的タンパク質の可能性あるユビキチンリガーゼおよびユビキチン様リガーゼ
としての、ＶＨＬ複合体およびおそらく他のＣｕｌｌｉｎ複合体の機能の描写に
適用できる。多タンパク質ＶＨＬ複合体は、ｃｄｋ阻害剤ｐ２７のレベルの制御
を通して、低酸素症誘導遺伝子の減退において、および細胞外フィブロネクチン
マトリックスの会合において、細胞周期調節に役割を果たしていることが示され
たので、Ｒｂｘ１をＶＨＬ複合体の再構成に適用して、ＶＨＬ複合体の解離を引
き起こす治療剤を決定できる。さらに、Ｒｂｘ１は、ＳＣＦＣｄｃ４複合体の一
成分であり、一般的なＳＣＦサブユニットとして機能し、Ｓｗｅ１および転写調
節因子のＩκＢおよびβ−カテニンなどの標的タンパク質のユビキチン化を指令
する、ＭＥＴ３０およびβ−ＴＲＣＰを含む追加のＦ−ボックスタンパク質を含
むＳＣＦ複合体によるユビキチン化の調節に関与する。従って、Ｒｂｘ１は、他
のＳＣＦ複合体を介してユビキチン化を調節できる治療薬の決定に適用できる。
【００６５】 本発明は、大半の散発性明細胞癌、並びに、罹患した個体の、明細胞腎癌、小
脳血管芽細胞および血管腫、網膜血管腫、およびクロム親和性細胞腫を含む様々
な腫瘍への素因となる常染色体優性家族性癌症候群に見られるＶＨＬ腫瘍サプレ
ッサー活性；低酸素症誘導遺伝子の一般的抑制；および、ｐ２７タンパク質安定
性の調節およびフィブロネクチンマトリックス会合の成分に関する。記載のＲｉ
ｎｇボックスタンパク質は、（１）ある癌の素因となる可能性を検出、（２）そ
れらの癌を治療的に処置するための分子標的として、（３）細胞増殖を操作する
薬物による阻害の標的として、および（４）細胞ユビキチン化、あるアクチベー
タータンパク質の結合、フィブロネクチン沈着および細胞分裂プロセスの他の態
様の様々な複雑な機序をより良く理解するための研究手段としての、細胞マーカ
ーとして作用する。
【００６６】 本発明を説明するために好ましい実施形態を示すが、当業者により物質および
方法に数多くの変更を実施できる。かかる全ての変更は、添付の特許請求の範囲
により定義された本発明の精神に包含される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜Ｃは、ラット肝サイトゾルからのＲｂｘ１とＶＨＬ複合体の同時精製
を記載する。 Ａは、ＶＨＬ複合体の精製に使用した様々な段階を示す図解であり、ここで、
Ｐ−ｃｅｌｌ＝ホスホセルロースＰ１１である。 Ｂは、ＶＨＬ複合体とＲｂｘ１のクロマトグラフィーであり、ここで、ＶＨＬ
＝フォンヒッペルリンドウタンパク質；ＣＵＬ２＝ＣＵＬ２タンパク質またはｃ
ｕｌｌｉｎ；ＥｌｏＢ−ＥｌｏｎｇｉｎＢ；ＥｌｏＣ＝ＥｌｏｎｇｉｎＣである
。ＭｏｎｏＱカラムからのカラム画分のアリコートを、１２％ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、タンパク質を銀染色により検出した。 Ｃは、ペプチドシークエンスに使用したサンプルの５〜２０％ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲルを示す。
【図２】 図２は、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ、カエノラブディティス・エ
レガンス、およびサッカロミセス・セレビジアエの予測Ｒｂｘ１タンパク質配列
と、Ｓ．セレビジアエ由来のＡＰＣ１１のアラインメントを示すチャートであり
、ここで、ＤＲＯＳ−キイロショウジョウバエ；ＥＬＥＧＡＮＳ＝カエノラブデ
ィティス・エレガンス；およびＹＥＡＳＴ＝サッカロミセス・セレビジアエであ
る。アラインメントは、ＭＡＣＡＷプログラムを使用して作成した（Ｓｃｈｕｌ
ｅｒ等、１９９１、「マルチプルアラインメント作成および解析のワークベンチ
」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｅｔ ９：１８０〜
１９０）。暗い影は、異なる種由来のＲｂｘ１タンパク質間の実体の位置、およ
び、Ｒｂｘ１とＡＰＣ１１タンパク質の間の実体の位置を示す。灰色の影は、類
似した位置を示す。
【図３】 図３Ａ〜Ｄは、Ｒｂｘ１含有複合体の再構成を示す。 Ａは、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣの存在下で、ＶＨＬとＣＵＬ２と複合体を形成して
いるＲｂｘ１を示す。示したウイルスを発現しているＳｆ２１細胞の溶菌液を、
抗ＦＬＡＧまたは抗ＭＹＣ抗体で免疫沈降させ、免疫沈降したタンパク質を、免
疫ブロットにより検出した。 Ｂは、Ｒｂｘ１と、ＥｌｏｎｇｉｎＢＣおよびＶＨＬの独立的な会合を示す。
示したウイルスを発現しているＳｆ２１細胞の溶菌液を、抗ＨＰＣ４、抗ＦＬＡ
Ｇまたは抗ＭＹＣ抗体で免疫沈降させ、免疫沈降したタンパク質を、免疫ブロッ
トにより検出した。 Ｃは、組換えＲｂｘ１、ＶＨＬ、およびＥｌｏｎｇｉｎＢＣのインビトロでの
結合を示す。Ｅ．コリで発現されＥ．コリから精製されたタンパク質を、示した
組合せで共に混合し、希釈および透析により再生し、抗ＨＰＣ４で免疫沈降した
。免疫沈降したタンパク質を、示した抗体での免疫ブロットにより検出した。 Ｄは、Ｒｂｘ１と、Ｃｕｌ１、Ｃｕｌ２、およびＣｄｃ５３の独立的な会合を
示す。示したウイルスを発現しているＳｆ２１細胞の溶菌液を、抗ＭＹＣ抗体で
免疫沈降させ、免疫沈降したタンパク質を、免疫ブロットにより検出した。
【図４】 図４Ａ〜Ｃは、Ｒｂｘ１の存在または非存在に関連した様々な活性を示す。 Ａは、Ｒｂｘ１タンパク質の、内因性酵母Ｃｄｃ５３への結合が、機能に関連
することを示す。上のパネルは、野生型または変異型哺乳動物Ｒｂｘ１（ｍＲｂ
ｘ１）タンパク質を発現しているｒｂｘ１Δ細胞の表現型を示す。下のパネルに
示したように、ｒｂｘ１欠失株（欠失）または親株ＭＣＹ４５３（野生型）にお
いて、野生型および変異型哺乳動物ＭＹＣ−Ｒｂｘ１タンパク質を発現している
細胞からの溶菌液を、抗ＭＹＣ抗体での免疫沈降にかけた。免疫沈降したタンパ
ク質を、抗ＭＹＣまたは抗Ｃｄｃ５３抗体での免疫ブロットにより検出した。 Ｂは、Ｓｉｃ１タンパク質が、Ｒｂｘ１枯渇細胞に蓄積することを示す。Ｒｂ
ｘ１Δ／ｐＧＡＬ−ｍｒｂｘ１（Ｍ４）細胞を、ガラクトース含有培地中ＯＤ６
００が１となるまで増殖し、次いでグルコース培地に移した。細胞をグルコース
中８時間増殖した後に収集し、細胞溶菌液を、抗ＭＹＣおよび２つの異なる抗Ｓ
ｉｃ１抗体での免疫ブロットにより解析した。 Ｃは、Ｒｂｘ１枯渇に関連した形態変化を示す。Ｒｂｘ１Δ／ｐＧＡＬ−ｍｒ
ｂｘ１（Ｍ４）細胞を、ガラクトース（ｇａｌ）中、またはグルコースを移した
後８時間（ｇｌｕ）増殖し、その後固定および染色した。核形態を、ＤＡＰＩ（
４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色により可視化した（パネル
ＡおよびＣ、ＤＩＣ；パネルＢおよびＤ、ＤＡＰＩ）。
【図５】 図５は、ＳＣＦユビキチンリガーゼ複合体およびＶＨＬユビキチンリガーゼ複
合体の図を示し、本発明のユビキチンリガーゼを図解する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８４ Ｃ１２Ｎ 1/15 9/00 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 Ｚ 9/00 33/68 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/68 37/60 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 コナウエイ，ジョアン ダブリュー アメリカ合衆国オクラホマ 73151 オク ラホマ シティ イースト アップル バ レイ ロード 10801 (72)発明者 コナウエイ，ロナルド シー アメリカ合衆国オクラホマ 73151 オク ラホマ シティ イースト アップル バ レイ ロード 10801 (72)発明者 カムラ，タクミ アメリカ合衆国オクラホマ 73132 オク ラホマ シティ チェストマウント ドラ イブ 7016 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 CB01 CB21 DA13 DA36 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 AA12 BA21 CA04 DA02 DA05 DA06 DA12 EA02 EA04 HA03 HA15 4B050 CC03 CC07 DD07 DD11 LL01 LL03 4B064 AF27 AG01 CA10 CA19 CA21 CC24 DA03 4B065 AA26X AA80X AA90X AA90Y AA91X AB01 BA01 BA02 BA25 CA23 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA17 BA01 BA08 BA22 CA17 CA18 CA20 CA21 CA23 CA53 DA27 DC28 NA14 ZB26 ZC41 4H045 AA10 AA30 BA09 BA54 CA40 DA22 DA89 EA20 EA28 EA51 FA72 FA74

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号１に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを
    含む、単離および精製された生物学的に活性なＲｉｎｇボックスタンパク質。
  2. 【請求項２】 配列番号１に対応するアミノ酸配列を有する生物学的に活性
    なＲｉｎｇボックスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離および
    精製核酸分子。
  3. 【請求項３】 配列番号３を含む請求項２に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 請求項２または３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発
    現ベクター。
  5. 【請求項５】 請求項４の発現ベクターを含む宿主細胞。
  6. 【請求項６】 請求項５の宿主細胞を、核酸分子の発現に適した条件下で培
    養し；そして、宿主細胞培養液から組換え生物活性Ｒｉｎｇボックスタンパク質
    を回収する段階を含む、組換え生物活性Ｒｉｎｇボックスタンパク質を産生する
    方法。
  7. 【請求項７】 請求項６の方法に従って調製した組換えＲｉｎｇボックスタ
    ンパク質。
  8. 【請求項８】 補因子タンパク質、並びに、ｃｕｌｌｉｎタンパク質、基質
    認識タンパク質、およびリンカータンパク質からなる群から選択される１つまた
    はそれ以上のタンパク質を含むＳＣＦ複合体による修飾に標的化された任意の基
    質への、ユビキチンまたはユビキチン様タンパク質の添加のＲｂｘ−１依存性刺
    激を妨害または増大するであろう可能性ある治療剤についてスクリーニングする
    のに有用なタンパク質複合体。
  9. 【請求項９】 複合体は、ユビキチンリガーゼタンパク質複合体である、請
    求項８に記載のタンパク質複合体。
  10. 【請求項１０】 ユビキチンリガーゼタンパク質複合体は、ＳＣＦおよびＶ
    ＨＬからなる群から選択される、請求項９に記載のタンパク質複合体。
  11. 【請求項１１】 補因子タンパク質はＲｂｘ１である、請求項８に記載のタ
    ンパク質複合体。
  12. 【請求項１２】 ｃｕｌｌｉｎタンパク質；基質認識タンパク質；リンカー
    タンパク質；および補因子タンパク質を含む、単離および精製ユビキチンリガー
    ゼタンパク質複合体。
  13. 【請求項１３】 ｃｕｌｌｉｎタンパク質は、Ｃｄｃ５３、Ｃｕｌｌｉｎ１
    、Ｃｕｌｌｉｎ２、Ｃｕｌｌｉｎ３、Ｃｕｌｌｉｎ４Ａ、Ｃｕｌｌｉｎ４Ｂ、お
    よびＣｕｌｌｉｎ５からなる群から選択される、請求項１２に記載のユビキチン
    リガーゼタンパク質複合体。
  14. 【請求項１４】 基質認識タンパク質は、β−ＴＲＣＰ、Ｃｄｃ４、Ｇｒｒ
    １、ＶＨＬおよびＥｌｏｎｇｉｎＣ結合タンパク質からなる群から選択される、
    請求項１２に記載のユビキチンリガーゼタンパク質複合体。
  15. 【請求項１５】 リンカータンパク質は、Ｓｋｐ１およびＥｌｏｎｇｉｎＣ
    からなる群から選択される、請求項１２に記載のユビキチンリガーゼタンパク質
    複合体。
  16. 【請求項１６】 補因子タンパク質はＲｂｘ１である、請求項１２に記載の
    ユビキチンリガーゼタンパク質複合体。
  17. 【請求項１７】 任意の基質へのユビキチンまたはユビキチン様タンパク質
    の添加のＲｂｘ−１依存性刺激を妨害または増大するであろう可能性のある治療
    剤をスクリーニングする方法であって、補因子タンパク質、並びに、ｃｕｌｌｉ
    ｎタンパク質、基質認識タンパク質、およびリンカータンパク質からなる群から
    選択される１つまたはそれ以上のタンパク質を含む複合体をインビトロで形成し
    ；試験化合物を加えて複合体と相互作用させ；そして、複合体が無傷のままであ
    るか、または化合物により破壊されているかを決定することを含む、前記方法。
  18. 【請求項１８】 補因子タンパク質はＲｂｘ１である、請求項１７に記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 ある癌への患者の素因を診断する方法であって、患者から
    組織または体液サンプルを集め；組織中のＲｉｎｇボックスタンパク質の量につ
    いて組織または体液を解析し；そして、組織または体液中のＲｉｎｇボックスタ
    ンパク質の量に基づいてある癌への患者の素因を予測することを含む、前記方法
    。
  20. 【請求項２０】 動物において、Ｒｉｎｇボックスタンパク質関連癌を処置
    、または、代謝的に欠乏した系を増大する方法であって、Ｒｉｎｇボックスタン
    パク質関連癌または細胞性欠乏症を有すると診断された、および、Ｒｉｎｇボッ
    クスタンパク質欠乏症と診断された患者に、Ｒｂｘ１遺伝子のインビボでの発現
    を増強または増大およびＲｉｎｇボックスタンパク質のインビボでの発現を増強
    する化合物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
  21. 【請求項２１】 動物において、Ｒｉｎｇボックスタンパク質関連癌を処置
    、または代謝的に欠乏した系を増大する方法であって、治療有効量のＲｉｎｇボ
    ックスタンパク質を、Ｒｉｎｇボックスタンパク質関連癌または細胞性欠乏症を
    有すると診断された、およびＲｉｎｇボックスタンパク質欠乏症と診断された患
    者に投与することを含む、前記方法。
  22. 【請求項２２】 Ｒｉｎｇボックス関連癌の治療処置の効力を評価する方法
    であって、Ｒｉｎｇボックス関連癌に罹患している、およびかかる癌の治療処置
    を受けている患者からの組織または体液サンプルを集め；組織または体液サンプ
    ル中のＲｉｎｇボックスタンパク質の量を決定し；そして、決定したＲｉｎｇボ
    ックスタンパク質の量を、正常Ｒｉｎｇボックスタンパク質レベルを示す標準と
    比較することを含む、前記方法。
  23. 【請求項２３】 Ｒｉｎｇボックスタンパク質はＲｂｘ１である、請求項１
    ９、２０、２１、および２２に記載の方法。
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