JPH11514228A - リポ蛋白結合ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）ＰＡＦアセチルヒドロラーゼに対して配列相同性を有する化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 配列番号：１のポリペプチドをコードしており、リポ蛋白結合ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）／血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦアセチルヒドロラーゼ）に対して＋／−４０％の相同性を有するポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】 リポ蛋白結合ホスホリパーゼＡ２（Ｌｐ−ＰＬＡ２）ＰＡＦアセチルヒドロラー ゼに対して配列相同性を有する化合物 本発明は、治療におけるポリペプチドの阻害剤の使用に関する。また本発明は 、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、該ポリペ プチドをコードしているＤＮＡで形質転換された組み換え宿主細胞、ならびに治 療において潜在的に有用な化合物の同定における該ポリペプチドの使用に関する 。 リポ蛋白結合ホスホリパーゼＡ２(Lipoprotein Associated Phospholipase A2 )（Ｌｐ−ＰＬＡ２）は、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（ＰＡＦセチ ルヒドロラーゼ）としても当該分野において知られている。ＬＤＬのその酸化型 への変換の間、Ｌ−ＰＬＡ２は、酸化的に修飾されたホスファチジルコリンのｓ ｎ−２エステルの加水分解に関与して、リゾ−ホスファチジルコリンおよび酸化 的に修飾された脂肪酸を生成する。Ｌｐ−ＰＬＡ２のこれらの生成物は両方とも 、循環単球に対する強力な化学誘引物質である。そのようなものとして、この酵 素は、コレステロールエステルを有する細胞の動脈中における蓄積に関与し、ア テローム性動脈硬化の初期段階に関連した特徴的な「脂肪の縞」を生じさせると 考えられている。それゆえ、Ｌｐ−ＰＬＡ２酵素の阻害は、脂肪の縞の形成を停 止し（リゾホスファチジルコリンの生成を抑制することにより）、その結果、ア テローム性動脈硬化の治療に有用であると期待されよう。またＬｐ−ＰＬＡ２阻 害剤は、酵素活性に関連した脂質過酸化を包含する症状、例えばアテローム性動 脈硬化および糖尿病のごとき症状のほかに、リューマチ性関節炎、卒中、心筋梗 塞、再潅流傷害、急性よび慢性的炎症ならびに種々の神経精神医学的疾病（例え ば、精神分裂症、文献としてはPsychopharmacology Bulletin,31:159-165,1995 ）のような他の症状において広範な適用性を有しうる。 酵素リポ蛋白結合Ｌｐ−ＰＬＡ２のアミノ酸およびＤＮＡ配列はＷＯ９５／０ ０６４９に開示されている。 本発明は、新たに同定されたポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドによ りコードされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使 用、ならびにかかるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に関する。より 詳細には、本発明ポリペプチドは新規リパーゼである。また本発明はかかるポリ ペプチドの作用を阻害することに関する。 本発明の１の態様によれば、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する新規ポ リペプチド、またはそのフラグメント、アナログもしくは誘導体が提供される。 本発明ポリペプチドはヒト起源である。 以下、ポリペプチドなる用語を、リパーゼならびにそのフラグメント、アナロ グおよび誘導体をいうのに用いる。 本発明のもう１つの態様によれば、かかるポリペプチドをコードしているポリ ヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が提供される。 本発明の好ましい具体例によれば、配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリ ペプチドをコードしているポリヌクレオチドが提供される。 詳細には、本発明は、配列番号：２に示すＤＮＡ配列を有するポリヌクレオチ ドを提供する。 配列番号：２のｃＤＮＡに対してさらなる同一性部分を示すｃＤＮＡ分子が下 記組織由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて同定された：胎児心臓、松果腺、活 性化Ｔ細胞、毛細血管内皮細胞および二次的乳癌。配列番号：２のポリヌクレオ チドは前立腺（良性肥大）由来のｃＤＮＡライブラリーにおいて発見された。そ れはリパーゼファミリーに構造的に関連している。それは約３９３個のアミノ酸 の蛋白をコードしている読み枠を含んでいる。その蛋白はＬｐ−ＰＬＡ２（ＷＯ ９５／００６４９、ＷＯ９５／０９９１２）に対して最高の相同性を示し、３９ ３個のアミノ酸について４０％の同一性および６０％の類似性を示す。全体とし ての同一性はわずか４０％であるが、Ｌｐ−ＰＬＡ２の触媒トライアッド（tria d）に関して同定された残基（ＷＯ９５／０９９１２）は２つのポリペプチド間 で保存されており、類似の生化学的機能を有する可能性のあることが意味される 。Ｓｅｒ、ＡｓｐおよびＨｉｓの位置を下線で示す。配列番号：１は下側 の配列であり、Ｌｐ−ＰＬＡ２は上側の配列である。たて線は同一の残基を示す 。 この酵素の組織源は、血管系ならびにある種の癌の生物学における役割を示唆 する。そのようなものとして、このポリペプチドの阻害剤は、アテローム性動脈 硬化、高血圧、内皮機能不全、心筋梗塞、再潅流傷害、およびある種の癌のごと き疾病状態において有用性が見いだされうる。さらに、Ｌｐ−ＰＬＡ２に対する 相同性は、この新規酵素が同様の役割を果たし、そのような阻害剤として、アテ ローム性動脈硬化、心筋梗塞、再潅流傷害、急性および慢性の炎症、リューマチ 性関節炎、卒中、糖尿病ならびに神経精神医学的疾病における有用性が見いださ れうることを示唆する。 本発明ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態あるいはＤＮＡの形態であってもよく 、ＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡを包含する。ＤＮＡは２ 本鎖または１本鎖であってもよく、１本鎖である場合、コーディング鎖または非 コーディング配列（アンチセンス）鎖であってもよい。ポリペプチドをコードし ているコーディング配列は配列番号：１に示すコーディング配列と同じであって もよく、あるいは配列番号：１のＤＮＡと同じポリペプチドをコードするが遺伝 コードの縮重の結果として異なるコーディング配列となっているものであっても よい。 本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメント 、アナログおよび誘導体をコードしている種々の上記ポリヌクレオチドを包含す る。種々のポリヌクレオチドは天然に存在するポリヌクレオチドの対立遺伝子変 種またはポリペプチドの天然に存在しない変種であってもよい。 よって、本発明は、配列番号：１に示すポリペプチドと同じものをコードして いるポリヌクレオチドならびにポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナ ログをコードしているかかるポリヌクレオチドの変種を包含する。かかるヌクレ オチド変種は欠失変種、置換変種および付加変種または挿入変種を包含する。 ポリヌクレオチドは、配列番号：２のコーディング配列の自然に発生する対立 遺伝子変種であるコーディング配列を有していてもよい。当該分野で知られてい るように、対立遺伝子変種は、１個またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失 または付加であって、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない ものを有していてもよい、ポリヌクレオチド配列の別形態である。 配列番号：１のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは以下のもの を包含する：ポリペプチドのコーディング配列のみ；ポリペプチドならびにリー ダーもしくは分泌配列またはプロ蛋白配列のごときさらなるコーディング配列； ポリペプチド（および所望によりさらなるコーディング配列）ならびにイントロ ンもしくは成熟ポリペプチドのコーディング配列の非コーデイング５’および／ または３’側の配列のごとき非コーディング配列。 よって、用語「ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド」は、ポリペ プチドのコーディング配列のみ、ならびにさらなるコーディングおよび／または 非コーディング配列を含むポリヌクレオチドを包含する。 それゆえ、本発明は、ポリペプチドのコーディング配列が同じ読み枠中で宿主 細胞由来のポリペプチドの発現および分泌を助けるポリヌクレオチド配列に融合 していてもよいポリヌクレオチドを包含し、例えば、細胞からのポリペプチドの 輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に融合していてもよ い。リーダー配列を有するポリペプチドはプレ蛋白であり、宿主細胞により開裂 されて成熟形態のポリペプチドを生じるリーダー配列を有していてもよい。また ポリヌクレオチドは、成熟蛋白にさらなる５’側のアミノ酸残基が付いたプロ蛋 白をコードしていてもよい。プロ配列を有する成熟蛋白はプロ蛋白であり、その 蛋白の不活性形態である。プロ配列が開裂されると、活性成熟蛋白が残る。 よって、例えば、本発明ポリヌクレオチドは成熟蛋白、またはプロ配列を有す る蛋白、またはプロ配列およびプレ配列（リーダー配列）の両方を有する蛋白を コードしていてもよい。 また、本発明ポリヌクレオチドは、本発明ポリペプチドの精製を可能にするマ ーカー配列にインフレームで（in frame）融合したコーディング配列を有してい てもよい。マーカー配列は、ｐＱＥ９ベクターにより提供されるヘキサーヒスチ ジンタグ（細菌宿主の場合に、該マーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製が 行われる）であってもよく、あるいは、例えば、哺乳動物宿主（例、ＣＯＳ−７ 細胞）の場合には、マーカーはヘマグルチニン（ＨＡ）タグを用いてもよい。Ｈ Ａタグはインフルエンザヘマグルチニン蛋白由来のエピトープである(Wilson,I. ,et al.,Cell,37:767(1984))。 さらに本発明は、配列間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の同一性があ る場合に上記配列にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドにも関する。 詳細には、本発明は、厳密な条件下で上記ポリヌクレオチドにハイブリダイゼー ションするポリヌクレオチドに関する。本明細書の用語「厳密な条件」とは、配 列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性がある場合にの みハイブリダイゼーションが起こることを意味する。好ましい具体例において上 記ポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドは、配列番 号：１のポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能または活性を保持しているポ リペプチドをコードしている。 用語「フラグメント」、「誘導体」および「アナログ」は、配列番号：１のポ リペプチドについていう場合、かかるポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能 または活性を保持しているポリペプチドを意味する。よって、アナログは、プロ 蛋白の一部分の開裂により活性化されて活性成熟ポリペプチドを生じうるプロ蛋 白を包含する。 本発明ポリペプチドは組み換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポ リペプチドであってもよく、好ましくは組み換えポリペプチドである。 配列番号：１のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログは、（ｉ ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が、保存的または保存的でないアミノ酸残 基 （好ましくは保存的アミノ酸残基）で置換されており、かかる置換アミノ酸残基 が遺伝学的コードによりコードされていても、いなくてもよいもの、あるいは（ ｉｉ）１個またはそれ以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの、あるいは（ｉ ｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延長させる化合物（例、ポ リエチレングリコール）のごとき別の化合物に融合しているもの、あるいは（ｉ ｖ）さらなるアミノ酸が、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチドも しくはプロ蛋白配列の精製に用いられる配列のごとき成熟ポリペプチドに融合し ているものであってもよい。かかるフラグメント、誘導体またはアナログは、本 明細書中の教示から、当業者の範囲内であると考えられる。 ポ本発明リペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離形態で「提 供され、好ましくは、均一に精製されている。 用語「単離」は、物質がその元の環境（例えば、それが天然に存在するもので ある場合、天然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、天然に存 在する生きた動物中のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていない が、天然系において共存していた物質のいくぶんかまたはすべてから分離された 同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されている。かかるポリヌクレ オチドはベクターの部分であってもよく、そして／あるいはかかるポリヌクレオ チドまたはポリペプチドは組成物の部分であってもよく、かかるベクターまたは 組成物がその天然環境の部分でないという点で、かかるポリヌクレオチドまたは ポリペプチドはやはり単離されたものである。好ましくは、ポリペプチドは精製 形態である。精製形態とは、他の蛋白混入物に関して少なくとも８０％、より好 ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは９９％の純度で あることを意味する。 また本発明ＤＮＡは、同種組み換えまたは「ノックアウト」法 （Kapecchi,Science,244:1288-1292(1989)）による、この酵素の変種を発現しな い動物または発現する動物の開発を可能にする。 また本発明は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクター、本発明ベクターで遺 伝子操作された宿主細胞、および組み換え法による本発明ポリペプチドの製造に 関する。 それゆえ、本発明のさらなる態様によれば、組み換え法により、該ポリペプチ ドをコードしているポリヌクレオチドを宿主中で発現させ、発現生成物を回収す ることによる、本発明ポリペプチドの製造方法が提供される。別法として、慣用 的なペプチド合成により本発明ポリペプチドを合成的に製造することもできる。 例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであってもよい本発明ベクタ ーを用いて宿主細胞を遺伝子操作（トランシダクションまたは形質転換）する。 例えば、ベクターはプラスミド、ファージ等の形態であってもよい。プロモータ ー活性化、形質転換体選択または遺伝子増幅に適するように修飾された慣用的栄 養培地において遺伝子操作された宿主細胞を培養することができる。温度、ｐＨ 等のごとき培養条件は、発現のために当該宿主細胞についてすでに用いられたも のであり、当業者に明らかであろう。 適当な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列、例えば、Ｓ Ｖ４０誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラ スミド;プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせにより得られるベクター ；ワクシニア、アデノウイルス、フォウルポックスウイルス、および偽狂犬病ウ イルスのごときウイルスＤＮＡを包含する。しかしながら、宿主中で複製可能で 生存可能であるかぎり、他のベクターを用いてもよい。 種々の方法により適当なＤＮＡ配列をベクター中に挿入することができる。一 般的には、当該分野において知られた方法によりＤＮＡ配列を適当な制限エンド ヌクレアーゼ部位中に挿入する。かかる手順および他の手順は当業者の範囲内で あると考えられる。 発現ベクター中のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令する適当な発現制御配列 （プロモーター）に作動するように連結される。かかるプロモーターの典型例と しては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、イー・コリ（E.coli）のｌａｃも しくはｔｒｐ、ファージラムダＰ_Lプロモーターならびに原核細胞または真核細 胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子発現を制御することが知られている他 のプロモーターが挙げられる。また発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソー ム結合部位および転写ターミネーターを含んでいる。またベクターは増幅発現に 適する配列を含んでいてもよい。 さらに、好ましくは、発現ベクターは、形質転換細胞の選択のための表現型の 特徴を提供する、例えば、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼまた はネオマイシン耐性、あるいはイー・コリにおけるテトラサイクリンまたはアン ピシリン耐性のごとき１種またはそれ以上の選択可能マーカー遺伝子を含む。 プロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現のため）および所望により オペレーター（本明細書ではまとめて「制御」エレメントという）の制御下に遺 伝子を置いて、この発現構築物を含むベクターにより所望蛋白をコードしている ＤＮＡ配列が宿主細胞中でＲＮＡに転写されるようにすることができる。コーデ ィング配列はシグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもいなくてもよ い。例えば、イー・コリのｔａｃプロモーターまたはプロテインＡ遺伝子（ｓｐ ａ）プロおよびシグナル配列を用いて本発明蛋白配列を発現することができる。 細菌宿主の翻訳後プロセッシングによりリーダー配列が除去されうる。ＣＡＴ（ クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択可能マーカーを 有する他のベクターを用いて所望遺伝子からプロモーター領域を選択することが できる。２種の適当なベクターはＰＫＫ２３２−８およびＰＭＣ７である。特に 細菌プロモーターｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ_R、Ｐ_Lお よびｔｒｐが挙げられる。真核プロモーターは、ＣＭＶ即時初期、ＨＳＶチミジ ンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、ならびに マウス・メタロチオネイン−Ｉを包含する。適当なベクターおよびプロモーター の選択は十分に当業者のレベルの範囲内である。 制御配列のほかに、宿主細胞の増殖に対応した蛋白配列発現調節を行う可能に する調節配列を付加することが望ましいかもしれない。調節配列は当業者に知ら れており、例としては、調節化合物の存在を包含する化学的または物理的刺激に 応答して遺伝子発現をオンまたはオフにするものが挙げられる。他のタイプの調 節エレメント、例えばエンハンサー配列がベクター中に存在してもよい。 特定のコーディング配列が適当な調節配列とともにベクター中に存在するよう に発現ベクターを構築し、制御配列に対するコーディング配列の配置および向き は、コーディング配列が制御配列の「制御」下で転写されるようにする（すなわ ち、制御配列においてＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼがコーディング 配列を転写するようにする）。コーディング配列の修飾はこの目的を達成するた めに望ましいかも知れない。例えば、いくつかの場合、配列を修飾し、それが適 切な方向で（すなわち、読み枠を維持するように）制御配列に結合できるように することが必要かもしれない。制御配列および他の調節配列をコーディング配列 に連結してから上記クローニングベクターのごときベクター中に挿入してもよい 。別法として、すでに調節配列および適当な制限部位を含んでいる発現ベクター 中にコーディング配列を直接クローン化してもよい。発現を増強するために、コ ーディング配列の修飾を行ってコドン利用を変化させて、選択宿主細胞に適合す るようにしてもよい。 一般的には、組み換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製 開始点および選択可能マーカー、例えばイー・コリのアンピシリン耐性およびエ ス・セレビシエ（S.cerevisiae）のＴＲＰ１遺伝子、下流構造遺伝子の転写を指 令するならびに高発現遺伝子由来のプロモーターを含むであろう。翻訳開始配列 および終止配列、ならびに好ましくは翻訳蛋白のペリプラズム空間または細胞外 培地中への分泌を指令することのできるリーダー配列とともに異種構造配列を適 当な配置に集合させる。異種配列は、所望特性、例えば組み換え生成物を安定化 させあるいは精製を単純化させるＮ−末端同定ペプチドを含む融合蛋白をコード していてもよい。 上記の適当なＤＮＡ配列ならびに適当なプロモーターもしくは制御配列を含んで いるベクターを用いて適当な宿主を形質転換して、宿主が蛋白を発現するように してもよい。 クローニングのための組み換えＤＮＡベクターおよび形質転換可能な宿主細胞 の例としては、バクテリオファージλ（イー・コリ）、ｐＢＲ３２２（イー・コ リ）、ｐＡＣＹＣ１７７（イー・コリ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐ ＧＶＩ１０６（グラム陰性細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、 ｐＭＥ２９０（イー・コリでないグラム陰性細菌）、ｐＨＶ１４（イー・コリお よびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis））、ｐＢＤ９（バチルス）、 ｐＩＪ６１（ストレプトミセス（Streptomyces））、ｐＵＣ６（ストレプトミセ ス）、ＹＩｐ５（サッカロミセス（Saccharomyces））、バキュロウイルス昆虫 細胞系、ＹＣｐ１９（サッカロミセス）が挙げられる。 いくつかの場合において、分泌シグナルの開裂後に宿主からのポリペプチドの 分泌を引き起こす配列を付加することが望ましいかもしれない。 酵母発現ベクターも当該分野において知られている。例えば、米国特許第４４ ４６２３５号、第４４４３５３９号、第４４３０４２８号参照；さらに欧州特許 出願公開第１０５４０９号、第１００５６１号、第９６４９１号参照。哺乳動物 における発現をドライブするためにＳＶ４０後期プロモーターを用いているＳＶ ２ｎｅｏ（J.Mol.Appl.Genet.1:327-341に記載、参照により本明細書に記載され ているものとみなす)、または発現をドライブするためにＣＭＶプロモーターを 用いているｐＣＤＮＡ１（Mol.Cell Biol.7:4125-4129）由来のベクターである ｐＣＤＮＡ１ｎｅｏがある。これらの後者２種はともに哺乳動物細胞における一 時的または安定（Ｇ１８耐性を利用）な発現に使用可能である。昆虫細胞発現系 、例えばドロソフィラ（Drosophila）も有用である。例えば、ＰＣＴ出願公開Ｗ Ｏ９０／０６３５８およびＷＯ９２／０６２１２ならびにＥＰ２９０２６１Ｂ１ 参照。 宿主細胞中、適当なプロモーターの制御下でポリペプチドを発現させることが できる。無細胞翻訳系を用い、本発明ＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてかかる 蛋白を製造することもできる。原核宿主および真核宿主とともに使用するのに適 したクローニングおよび発現ベクターは、Saolbrook,et al.,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)に記載 されており、参照によりその開示を本明細書に記載されているものとみなす。 エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより本発明ポリペプチドをコ ードしているＤＮＡの高等真核細部おによる転写を促進する。エンハンサーはＤ ＮＡのシス−作用性エレメントであり、通常には、約１０ないし３００塩基対 であり、プロモーターに作用してその転写を促進する。例としては、複製開始点 の後期側１００ないし２７０塩基対のところのＳＶ４０エンハンサー、サイトメ ガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオー マエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。 さらなる態様において、本発明は、上記ベクターを含有する宿主細胞に関する 。宿主細胞は哺乳動物細胞のごとき高等真核細胞、または酵母細胞のごとき下等 真核細胞であってよく、あるいは宿主細胞は細菌細胞のごとき原核細胞であって もよい。適当な宿主の典型例としては、原核細胞、例えばイー・コリ、ストレプ トミセス、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）のごとき細 菌細胞ならびに真核細胞、例えば酵母のごとき真菌細胞、ドロソフィラおよびス ポドプテラ・フルギルダ（Spodoptera frugiperda）のごとき昆虫細胞、ＣＨＯ 、ＣＯＳまたはボウズ（Bowes）・メラノーマのごとき哺乳動物細胞、植物細胞 等が挙げられる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示から、当業者の範囲内で あると考えられる。 リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トラン スフェクションまたはエレクトロポレーション （Davis,L.,Dibner,M.,Battey,I.,Basic Methods in Molecular Biology,(1986) ）により構築物の宿主細胞中への導入を行うことができる。 適当な宿主株の形質転換および宿主株の適当な細胞密度への増殖の後、適当な 手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により選択プロモーターを誘導し 、細胞をさらなる時間培養する。 典型的には、細胞を遠心分離により集め、物理的または化学的手段により破壊 し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保存する。 凍結−融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または溶解剤の使用を包 含する慣用的方法により蛋白発現に用いる微生物細胞を破壊することができ、か かる方法は当業者によく知られている。 種々の哺乳動物細胞培養系を用いて組み換え蛋白を発現させることもできる。 哺乳動物発現系の例は、Gluzman,Cell,23:175(1981)により記載されたサル・腎 臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系、および適合ベクターを発現しうる他の細胞系、例 えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系を包含する。哺乳 動物発現ベクターは、複製開始点、適当なプロモーターおよびエンハンサー、な らびに必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよ びアクセプター部位、転写終止配列、および５'隣接非転写配列を含むであろう 。ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配列を用いて必要 な非転写遺伝学的エレメントを得てもよい。 使用する発現系および宿主により、上記発現ベクターにより形質転換された宿 主細胞を目的ポリペプチドが発現される条件下で増殖させることにより本発明ポ リペプチドを製造してもよい。次いで、ポリペプチドを宿主細胞から単離し、精 製する。発現系がポリペプチドを増殖培地中に分泌する場合、ポリペプチドを培 地から直接精製することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解 物から単離または細胞膜フラクションから回収される。ポリペプチドが細胞表面 に局在化する場合、細胞全体または単離膜を所望遺伝子産物のアッセイ可能な源 として用いることができる。イー・コリのごとき細菌宿主において発現されたポ リペプチドは、封入体からの単離および再生を必要とするかもしれない。適当な 増殖条件および回収方法の選択は当業者の範囲内である。 硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交 換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用 クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタ イトクロマトグラフィーならびにレクチンクロマトグラフィーを包含する方法に より、ポリペプチドを組み換え細胞培養物から回収し精製することができる。必 要に応じて、成熟蛋白の配置を完成させる際に蛋白再生工程を用いることができ る。最後に高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製工程に用いる ことができる。 組み換え製造法に用いる宿主により、本発明ポリペプチドは糖鎖付加されてい るかもしれず、されていないかもしれない。本発明ポリペプチドは最初のメチオ ニンアミノ酸残基を含んでいてもよい。 本発明ポリペプチドは、類似の生物学的活性を有する他の分子を同定すること にも有用である。このためのスクリーニングは、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴ ヌクレオチドプローブを合成することにより、あるいは既知ＤＮＡ配列自体をプ ローブとして用いることにより、リパーゼ遺伝子のコーディング領域を単離する ことである。本発明遺伝子に対して相捕的な配列を有する標識オリゴヌクレオチ ドを用いてヒト・ｃＤＮＡＮゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスク リーニングして、ライブラリーのいずれのメンバーがハイブリダイゼーションす るのかを決定する。 かかるポリペプチドのインビボでの発現により、本発明に従ってポリペプチド を用いてもよく、そのことは、しばしば「遺伝子治療」といわれる。 よって、例えば、エクスビボにおいて患者由来の細胞を、ポリペプチドをコー ドしているポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で処理し、次いで、処理細 胞を、当該ポリペプチドで治療すべき患者に与えてもよい。例えば、本発明ポリ ペプチドをコードしているＲＮＡを含んでいるレトロウイルス粒子を用いること により、細胞を当該分野において知られた手順により処理してもよい。 同様に、例えば、当該分野で知られた方法により、ポリペプチドをインビボで 発現させるために細胞をインビボで処理してもよい。当該分野において知られて いるように、本発明ポリペプチドをコードしているＲＮＡを含んでいるレトロウ イルス粒子を産生するためのプロデューサー細胞を患者に投与してインビボで細 胞を処理し、ポリペプチドをインビボで発現させてもよい。かかる方法により本 発明ポリペプチドを投与するためのこれらの方法および他の方法は、本明細書の 教示から当業者に明らかなはずである。例えば、細胞を処理するための発現ビヒ クルはレトロウイルス以外のもの、例えば、適当な送達ビヒクルとの結合後イン ビボで細胞を処理するのに用いることのできるアデノウイルスであってもよい。 「組み換え」ポリペプチドは、ＤＮＡ組み換え法により製造、すなわち所望ポ リペプチドをコードしている外来性ＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から 製造されたポリペプチドをいう。「合成」ポリペプチドは化学合成により製造さ れたものをいう。 「レプリコン」は、インビボにおけるＤＮＡ複製の自律的単位として機能し、 それ自体の制御下で複製しうる遺伝学的エレメント（例えば、プラスミド、染色 体、ウイルス）である。 「ベクター」はプラスミド、ファージまたはコスミドのごときレプリコンであ り、アンカーＤＮＡセグメントがそれに結合して、結合したセグメントが複製さ れる。 「２本鎖ＤＮＡ分子」とは、二重らせん形態となっている（弛緩したものおよ びスーパーコイル状のものの両方）、ポリマー形態のデオキシリボヌクレオチド をいう。この用語は分子の１次構造および２次構造についてのみ用い、それを３ 次形態に限定しない。よって、好ましくは用語は２本鎖ＤＮＡ、とりわけ直鎖状 ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミド、および染色 体を包含する。特定の２本鎖ＤＮＡ分子の構造をいう場合、慣例に従ってＤＮＡ センス鎖の５’から３’方向へと配列を記載してもよい。 ＤＮＡ「特定蛋白のコーディング配列」または「特定蛋白をコードしているヌ クレオチド配列」は、適当な調節配列の制御下においた場合、転写されポリペプ チドに翻訳されるＤＮＡ配列である。 「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合でき、下流のコー ディング配列（３’方向）の転写を可能にするＤＮＡ調節領域である。転写開始 部位（便利にはヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングされる）、ならびにＲＮＡ ポリメラーゼの結合に応答可能な蛋白結合ドメイン（コンセンサス配列）がプロ モーター中に見いだされるであろう。真核プロモーターは「ＴＡＴＡ」ボックス および「ＣＡＴ」ボックスを含むが、それはしばしばではあるが常にではない。 ＤＮＡ「制御配列」は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニ ル化シグナル、転写終止シグナル、転写終止配列、上流調節ドメイン、エンハン サー等の、宿主細胞中でコーディング配列を発現（すなわち、転写および翻訳） させる配列をまとめてをいう。 ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コーディング配列がｍＲＮ Ａに転写され、次いで、それがコーディング配列によりコードされるポリ ペプチドに翻訳される場合、制御配列は細胞中でコーディング配列の「発現を指 令」する。 「宿主細胞」は、外来性ＤＮＡ配列によりた細胞、あるいはトランスフェクショ ンまたは形質転換されうる細胞をいう。 かかる外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合、細胞は「形質転換」された ものである。 外来性ＤＮＡは、細胞のゲノムを形成している染色体ＤＮＡ中に組み込まれて も(共有結合されても)、組み込まれなくてもよい(共有結合されなくてもよい)。 原核細胞および酵母において、例えば、外来性ＤＮＡはプラスミドのごときエピ ソームエレメント上に維持されうる。真核細胞については、安定に形質転換また はトランスフェクションされた細胞は、外来性ＤＮＡが染色体中に組み込まれて 、それが染色体複製により娘細胞に遺伝されるようになっている細胞である。こ の安定性は、外来性ＤＮＡを含む娘細胞集団からなる細胞系またはクローンを確 立する真核細胞の能力により示される。 「クローン」は、有糸分裂により単一細胞または共通の祖先に由来する細胞集 団である。「細胞系」は、多世代にわたりインビトロで安定な増殖をすることの できる１次細胞のクローンである。 少なくとも約８５％（好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なく とも約９５％）のヌクレオチドまたはアミノ酸が分子の一定の長さにおいて対合 する場合、２つのＤＮＡまたはポリペプチド配列は「実質的に相同的」または「実 質的に同じ」であり、対立遺伝子変種も包含される。本明細書の用語「実質的に 相同的」は、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して同一性を示す配列も いう。サザンハイブリダイゼーション条件下で、例えば、特定の系について決定 された厳密な条件下で、実質的に相同的なＤＮＡ配列を同定することができる。 適当なハイブリダイゼーション条件の決定は当業者の範囲内である。例えば、"C urrent Protocols in Mol.Biol."Vol.I & II,Wiley Interscience.Ausbel et al .(ed.)(1992)参照。蛋白分解的消化、ゲル電気泳動および精密配列決定により実 質的に同じ蛋白配列を同定することができる。 用語「機能的に等価」とは、対象蛋白のアミノ酸配列がリパーゼの酵素活性と 同種の活性を示すものであることを意味する。 ＤＮＡ構築物の「異種」領域は、天然界においては他の分子と結合した形態で 見いだされない、別のＤＮＡ分子に含まれるあるいは結合している同定可能なＤ ＮＡセグメントである。 本発明ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを適当な医薬担体と混合して使用 してもよい。かかる組成物は治療上有効量の活性薬剤、および医薬上許容される 担体もしくは賦形剤を含んでなる。かかる担体はセイライン、緩衝化セイライン 、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物を包 含するが、これらに限らない。処方は投与方法に適したものとすべきである。 また本発明は、１種またはそれ以上の本発明医薬組成物の成分を入れた１また はそれ以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。医薬品また は生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により定められた形 式の注意書きをかかる容器に付けることができ、注意書きはヒトへの投与のため の製造、使用または販売についての政府機関による承認を反映したものである。 さらに、本発明ポリペプチドを他の治療化合物と組み合わせて用いてもよい。 医薬組成物を慣用的な方法、例えば、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、 皮下、経皮または皮内経路により投与してもよい。本発明ポリペプチドまたはポ リペプチドを、特定の症状の治療および／または予防に有効な量投与する。患者 に投与すべき活性薬剤の量および投与規則は、投与方法、治療すべき症状の性質 および担当医の判断によるであろう。 本発明配列は染色体の同定にも価値がある。配列は個々のヒト・染色体上の特 定位置に対して特別に標的化され、かかる位置にハイブリダイゼーションしうる 。そのうえ、染色体上の特定部位を同定する必要が現在ある。現在のところ、実 際の配列データ（リピート多型性）に基づく染色体マーキング試薬が染色体位置 のマーキングに使用可能である。本発明による染色体へのＤＮＡのマッピングは 、それらの配列を疾病関連遺伝子と関連づける重要な第１工程である。 簡単に説明すると、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー(好ましくは１５ないし ２５塩基対)を調製することにより配列を染色体にマッピングすることができる 。ｃＤＮＡのコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の１個よりも多いエ キソンにまたがらないプライマーを迅速に選択し、かくして、増幅プロセスを複 雑化させる。次いで、個々のヒト・染色体を含む体細胞ハイブリッドのＰＣＲス クリーニングのためにこれらのプライマーを使用する。プライマーに対応するヒ ト・遺伝子を含むハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じるであろう。 体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定のＤＮＡを特定の染色体に帰 属させるための迅速な方法である。本発明を同じオリゴヌクレオチドプライマー について用いて、特定の染色体または大きなゲノムクローンからのフラグメント の集団についてさらなる位置決めを同様の方法で行うことができる。染色体のマ ッピングのために同様に使用可能な他のマッピング方法は、インシトウ（in sit u）ハイブリダイゼーション、標識されフローソートされた染色体についてのプ レスクリーニングおよび染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハ イブリダイゼーションによるプレセレクションを包含する。 中期染色体スプレッドへのｃＤＮＡクローンの蛍光インシトゥハイブリダイゼ ーション（ＦＩＳＨ）を用いて、正確な染色体位置を１工程で得ることができる 。この方法を５００または６００塩基程度の短いｃＤＮＡについて用いることが できるが、２０００塩基対よりも長いクローンは、簡単に検出できる十分な強度 のシグナルを伴ってユニークな染色体位置に結合する可能性が高い。ＦＩＳＨは 、ＥＳＴが由来するクローンの使用を要し、クローンは長ければ長いほどよい。 例えば、２０００塩基対がよく、４０００がよりよく、時間に比して合理的な結 果を得るには４０００よりも長いものはおそらく不要である。この方法の説明と しては、例えばVerma et al.,Human Chromosomes:a Manual of Basic Technique s,Pergamon Press,New York(1988)参照。 配列を正確な染色体位置にマピングしたら、染色体上の物理的位置を遺伝学的 マップのデータと関連づけることができる。かかるデータは、例えば V.McKusick,Mendelian Inheritance in Man（Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通じてオンラインで利用可能）に見いだされる。次いで、同 じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾病の関連を連関（物理的に隣接した 遺伝子の同時遺伝）の分析により同定する。 次いで、罹病および未罹病個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の相違を決定す る必要がある。変異がいくつかまたはすべての罹病個体において観察されるが、 正常個体においては観察されない場合、その変異はその疾病の病因である可能性 がある。 物理的マッピングおよび遺伝学的マッピングの現在の分離能によれば、疾病関 連染色体領域に正確に位置決めされるｃＤＮＡは５０ないし５００個の潜在的に 病因である遺伝子のうち１個である可能性がある（１メガベースの分離能で、２ ０ｋｂごとに１個の遺伝子があると仮定した場合）。 一般的には、罹病および未罹病個体の比較には、まず、例えば、染色体スプレ ッドから可視化できる、あるいは当該ｃＤＮＡ配列に基づくＰＣＲを用いて検出 できる欠失またはトランスロケーションのごとき染色体における構造変化を探す 必要がある。最終的に、変異の存在を確認し、変異を多型性から識別するために はいくつかの個体由来の遺伝子の完全な配列決定が必要である。 本発明ポリペプチドまたはそれらを発現する細胞を免疫原として用いてそれら に対する抗体を製造することができる。これらの抗体は、例えばポリクローナル またはモノクローナル抗体であってよい。また本発明は、キメラ抗体、１本鎖抗 体、およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブ ラリーの生成物を包含する。当該分野において知られた種々の方法を、かかる抗 体およびフラグメントの製造に使用してもよい。 ポリペプチドを動物に直接注射することにより、あるいは動物に、好ましくは ヒトでない動物に投与することにより、本発明ポリペプチド対して生じる抗体を 得ることができる。そのようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体に結合す るであろう。このようにして、ポリペプチドのフラグメントのみをコードしてい る配列を用いても、本来のポリペプチド全体に結合する抗体を得ることができる 。次いで、かかる抗体を用いて、ポリペプチドを発現する組織からポリペプチド を得ることができる。 モノクローナル抗体を製造するために、連続的細胞系培養により産生される抗 体を提供する技術を用いることができる。例としては、ハイブリドーマ法(Kohle r,G.and Milstein,C.,Nature,256:495-497(1975))；トリオーマ法（Kozbor et a l.Immunology Today,4:72（1983））；およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole et al.Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss,Inc.,77-96（1 985））がある。 一本鎖抗体の産生のために記載された技術(米国特許第４９４６７７８号)は、 本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を製造するのに適用できる。 さらに本発明は、ポリペプチドを阻害する化合物を同定するための化合物をス クリーニングする方法であって、ポリペプチドを試験化合物と接触させ、次いで 、試験化合物不存在下でのターンオーバー速度と比較して酵素基質のターンオー バー速度を測定することを特徴とする方法を提供する。 また本発明は、本発明ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む トランスジェニック非ヒト動物を提供する。また、変異およびＳＡＲ(構造活性 相関)の評価ならびに薬剤スクリーニングのためのモデルとしての該トランスジ ェニック動物の使用方法も提供される。 また本発明は、本発明ポリペプチドの阻害分子、ならびにポリペプチドの機能 の低下または除去におけるそれらの使用にも関する。 阻害剤の例は抗体であり、いくつかの場合にはポリペプチドに結合するオリゴ ヌクレオチドである。 阻害剤の例は、アンチセンス法により調製されるアンチセンス構築物である。 アンチセンス法を用いて、三重らせん形成またはアンチセンスＤＮＡもしくはＲ ＮＡにより（いずれの方法もＤＮＡもしくはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合 に基づく）、遺伝子発現を制御することができる。例えば、本発明ポリペプチド をコードしているポリヌクレオチドの５’コーディング部分を用いて、長さ約１ ０ないし４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。転写 に関わる遺伝子領域に相捕的になるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計して （三重らせん−Lee et al.,Nucl.Acids Res.,6:3073(1979);Cooney et al,Science,241:456(1988);およびDervan et al.,Science,251:1360(1991)）、 そのことにより転写およびポリペプチドの生成を妨害する。アンチセンスＲＮＡ オリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリダイゼーションし、ｍＲＮ Ａのポリペプチドへの翻訳をブロックする（Okano,J.Neurochem.,56:560(1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression,CRC Pre ss,Boca Raton FL(1988)）。上記オリゴヌクレオチドを細胞に送達して、アンチ センスＲＮＡまたはＲＮＡがインビボで発現されてポリペプチドの生成を阻害す るようにすることもできる。 阻害剤のもう１つの例は、ポリペプチドの触媒部位に結合しこれを占領する小 型分子であり、そのことにより基質が触媒部位に近づけなくなり、正常な生物学 的活性が妨げられる。小型分子の例は、小型ペプチドまたはペプチド様分子を包 含するが、これらに限らない。 治療に使用する場合、標準的な製薬慣習に従って本発明阻害剤を処方する。 経口的に投与された場合に活性がある阻害剤を、例えば、シロップ、懸濁液ま たはエマルジョン、錠剤、カプセルおよび甘味入り錠剤として処方することがで きる。 一般的には、液体処方は、適当な液体担体（例えば、エタノール、グリセリン 、非水溶媒、例えばポリエチレングリコール、油脂、または懸濁剤、保存料、香 料もしくは着色料を含有する水）中の化合物または医薬上許容される塩の懸濁液 または溶液からなる。 固体処方の製造に常用される適当な医薬担体を用いることにより錠剤形態の組 成物を製造することができる。かかる担体の例はステアリン酸マグネシウム、デ ンプン、乳糖、蔗糖およびセルロースを包含する。 常用されるカプセル封入法を用いてカプセル形態の組成物を製造することがで きる。例えば、標準的な担体を用いて有効成分をを含有するペレットを製造し、 次いで、硬ゼラチンカプセル中に充填することができる。別法として、適当な医 薬担体、例えば水性ガム、セルロース、シリケートまたは油脂を用いて分散物ま たは懸濁液を製造し、次いで、軟ゼラチンカプセル中に充填することができる。 典型的な非経口組成物は、滅菌水性担体または非経口的に許容される油脂(例 えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、落花生油ま はゴマ油)中の化合物または医薬上許容される塩の溶液または懸濁液からなる。 別法として、溶液を凍結乾燥し、次いで、投与直前に適当な溶媒で復元すること ができる。 典型的な坐薬処方は、坐薬として投与された場合に活性のある式（Ｉ）の化合 物化合物またはその医薬上許容される塩、ならびに結合剤および／またはポリマ ー性グリコール、ゼラチンもまたはコアバターまたは低融点の植物性もしくは合 成ロウもしくは脂質のことき滑沢剤からなる。 好ましくは、組成物は錠剤またはカプセルのごとき１回分の剤形である。 経口投与用の各１回分は、好ましくは、１ないし２５０ｍｇ（好ましくは、非 経口投与用には０.１ないし２５ｍｇ）の本発明阻害剤を含有する。 成人患者についての１日の投与規則は、例えば、式（Ｉ）の化合物またはその 医薬上許容される塩（遊離塩基として計算）１ｍｇないし５００ｍｇ、好ましく は１ｍｇないし２５０ｍｇの経口投与量であるか、あるいは０.１ｍｇないし１ ００ｍｇ、好ましくは０.１ｍｇないし２５ｍｇの静脈内投与、皮下投与または 筋肉内投与量であり、１日１ないし４回投与する。適当には、一定期間連続した 治療において化合物を投与する。 さらに本発明を下記実施例を参照して説明するが、本発明はかかる実施例に限 定されないことを理解すべきである。特記しない限り、すべての部または量は重 量である。 下記実施例の理解を容易にするために、特定の頻用方法および／または用語を 説明する。 「プラスミド」は、大文字および／または番号が先行および／または後に続く 小文字ｐにより示される。本発明の出発プラスミドは市販のもの、公に利用可能 なもの、あるいは公表された手順により利用可能なプラスミドから構築可能なも ののいずれかである。さらに、説明したプラスミドドと同等のプラスミドも当該 分野において知られており、当業者に明らかであろう。 「オリゴヌクレオチド」は１本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは２本の相捕 的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかをいい、それらを化学合成してもよ い。かかる合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸を有しておらず、よって、キナ ーゼ存在下でＡＴＰを用いてリン酸を付加しないと別のオリゴヌクレオチドと連 結しないであろう。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸されていないフラグメ ントと連結するであろう。 「連結」は、２つの２本鎖核酸フラグメント間のホスホジエステル結合形成プ ロセスをいう（Maniatis,T.,et al.,上記文献p.146）。特記しない限り、既知バ ファーおよび条件を用い、連結すべき０.５μｇのほぼ等モルのＤＮＡフラグメ ントに対して１０ユニットのＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結を行ってもよい 。 実施例 遺伝子クローニングおよび発現 ｃＤＮＡライブラリーの構築 標準的方法（Maniatisらの文献参照）を用いてヒト・前立腺（良性前立腺肥大 のもの）ポリＡ＋（ｍＲＮＡ）を単離した。オリゴｄＴプライマーを用いて第１ 鎖ｃＤＮＡをプライムした。Stratagene ZAP-cDNA合成キットを用いてｃＤＮＡ ライブラリーを構築し、Gigpack II gold packaging extractを用いてパッケー ジングし、次いで、XL1-blue MRF細菌細胞中で増幅した。ｃＤＮＡインサートを ベクター中に１方向に組み込んだ。 ＤＮＡ配列決定 ＥＳＴを含むファージクローンをλ Unizap XRバクテリオファージベクターか らBluescriptファージミド中に切り出した（Stratageneのマニュアルに従って） 。プライマーウォーキング（primer walking）niyori１８２３塩基対のインサー トを両方の鎖について手動で配列決定した(Amersham-USB Sequenase2.0DNA配列 決定キットを用いて）（配列番号：２）。ｃＤＮＡは１の読み枠を有しており、 ３９３個のアミノ酸のポリペプチドをコードする能力がある(配列番号：１)。 読み枠全体の推定分子量は４４１４３Ｄａである。 配列のデータ： 配列番号：１ 配列番号：２ ＭはＡまたはＣのいずれかであり、実際の塩基はいずれのＤＮＡ鎖からも不明 である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６１９ Ａ６１Ｋ 31/00 ６１９Ａ ６２６ ６２６Ｇ ６２９ ６２９ ６４３ ６４３Ｄ 39/395 39/395 Ｄ Ｐ 45/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｎ 9/20 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ライス，サイモン・クエンティン・ジョン イギリス、シーエム19・５エイディ、エセ ックス、ハーロウ、ザ・ピナクルズ、コー ルドハーバー・ロード、スミスクライン・ ビーチャム・ファーマシューティカルズ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたは該ポリペプチド のフラグメント、アナログもしくは誘導体をコードしているポリヌクレオチド。 ２．ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ３．ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ４．ゲノムＤＮＡである請求項２のポリヌクレオチド。 ５．配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている上記 請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。 ６．配列番号：２に示されるＤＮＡ配列を有する請求項２のポリヌクレオチド 。 ７．単離形態である上記請求項のいずれか１項のポリヌクレオチド。 ８．請求項２、４、５、６または７のいずれか１項のＤＮＡを含んでいるベク ター。 ９．請求項８のベクターで遺伝子操作された宿主細胞。 １０．上記ＤＮＡによりコードされているポリペプチドを請求項９の宿主細胞 から発現させることを特徴とする、ポリペプチドの製造方法。 １１．請求項８のベクターで細胞を遺伝子操作することを特徴とする、ポリペ プチドを発現しうる細胞の製造方法。 １２．請求項１ないし７のいずれか１項のポリヌクレオチドにハイブリダイゼ ーション可能であり、配列番号：１のポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能 または活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。 １３．配列番号：１のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメ ント、アナログもしくは誘導体。 １４．配列番号：１のアミノ酸配列を有する請求項１３のポリペプチド。 １５．単離形態の請求項１３または１４のポリペプチド。 １６．請求項１３または１４のポリペプチドを阻害する化合物を同定するため の化合物のスクリーニング方法であって、単離ポリペプチドを試験化合物と接触 させ、次いで、試験化合物不存在下でのターンオーバー速度と比較して酵素基質 のターンオーバー速度を測定することを特徴とする方法。 １６．請求項１５の方法により同定される化合物。 １７．請求項１３または1４のポリペプチドの阻害剤。 １８．請求項１３または１４のポリペプチドに対する抗体である請求項１７記 載の阻害剤。 １９．請求項１または１２のポリヌクレオチド、請求項１３のポリペプチド、 請求項１６の化合物または請求項１７の阻害剤および医薬上許容される担体を含 んでなる医薬組成物。 ２０．請求項１３または１４のポリペプチドを阻害する必要のある患者の治療 方法であって、治療上有効量の請求項１６の化合物または請求項１７の阻害剤を 患者に投与することを特徴とする方法。 ２１．治療に使用する医薬の製造のための請求項１６の化合物または請求項１ ７の阻害剤の使用。