CN106957824B - 耐脂蛋白干扰的抗人Lp‑PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

耐脂蛋白干扰的抗人Lp‑PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106957824B
CN106957824B CN201710300979.8A CN201710300979A CN106957824B CN 106957824 B CN106957824 B CN 106957824B CN 201710300979 A CN201710300979 A CN 201710300979A CN 106957824 B CN106957824 B CN 106957824B
Authority
CN
China
Prior art keywords
pla2
monoclonal antibody
albumen
lipoprotein
human
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710300979.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106957824A (zh
Inventor
曹林
唐波
牛英波
徐晓昱
杨晨辰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing novozan Biotechnology Co., Ltd
Original Assignee
Vazyme Medical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vazyme Medical Co ltd filed Critical Vazyme Medical Co ltd
Publication of CN106957824A publication Critical patent/CN106957824A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106957824B publication Critical patent/CN106957824B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种耐脂蛋白干扰的抗人Lp‑PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用；一株能稳定分泌耐脂蛋白干扰的抗人脂蛋白相关磷脂酶A2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LP1，其保藏号为CCTCC NO：C2016204。经检测该单克隆抗体亲和力达到1×10‑12M，且脂蛋白与Lp‑PLA2蛋白的结合不影响其亲和力。该抗体具有良好的稳定性，能够作为制备Lp‑PLA2诊断试剂的关键原料。采用该单克隆抗体可开发出特异性好、准确度高的诊断检测试剂盒，能够成功检测出健康人与心血管疾病患者血清中Lp‑PLA2的区别。

Description

耐脂蛋白干扰的抗人Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，尤其涉及一种耐脂蛋白干扰的抗人Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病、脑卒中、外周血管病的主要原因。脂质代谢障碍及其伴发的血管炎症为动脉粥样硬化的病变基础，其特点是受累动脉病变从内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄。病变常累及大中肌性动脉，一旦发展到足以阻塞动脉腔，则该动脉所供应的组织或器官将缺血或坏死。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，因此称为动脉粥样硬化。
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lipoprotein associated phospholipase A2),是磷脂酶A2超家族中的一员，是由441个氨基酸残基组成的一种丝氨酸磷脂酶。最初发现其能够降解血小板活化因子，因此又被称为血小板活化因子乙酰水解酶(Platelet activatingfactor acetylhydrolase，PAF-AH)。Lp-PLA2由血管内膜中的巨噬细胞、T细胞和肥大细胞分泌。动脉粥样硬化斑块中Lp-PLA2表达上调，并且在易损斑块纤维帽的巨噬细胞中有很高的表达[1]。血液中90％以上的Lp-PLA2与氧化型低密度脂蛋白相结合，通过水解氧化低密度脂蛋白中的氧化磷脂，生成脂类促炎物质，进而产生多种致动脉粥样硬化作用，包括内皮细胞死亡和内皮功能异常，刺激粘附因子和细胞因子的产生。这些物质可通过趋化炎症细胞进一步产生自我强化的循环，生成更多促炎物质[2]。
国外大量研究均表明，随着Lp-PLA2水平升高，患冠心病和脑卒中风险增加，尤其对于老年人和无症状的动脉粥样硬化疾病人群[3-6]。卓明峰等人[7]对138例患者的研究表明，具有颈动脉斑块组的Lp-PLA2浓度明显高于颈动脉正常组及颈动脉内膜中膜增厚组(P<0.05)，说明Lp-PLA2能够反映颈动脉粥样硬化病变的严重程度，尤其是斑块的有无及稳定性。杨丽等[8]针对299例拟诊断冠心病患者的研究表明，冠心病组血浆Lp-PLA2水平显著高于对照组(P<0.01)，表面血液Lp-PLA2升高是冠心病的独立危险因素之一，与冠脉病变的严重程度及动脉粥样硬化斑块的稳定性相关。
Lp-PLA2是一种对心脑血管疾病的预测及预后判断十分有力的生化标志物，能够为疾病的预防和早期干预提供新的思路和方向。目前国内无法生产能够应用于临床诊断的抗Lp-PLA2的单克隆抗体。Lp-PLA2在血液中绝大部分与脂蛋白相结合，基于重组抗原生产的Lp-PLA2单克隆抗体针对的抗原表位很可能被脂蛋白遮盖，使得这些单克隆抗体无法准确识别血液中的天然Lp-PLA2蛋白，增加了诊断用单克隆抗体的开发难度。因此开发具有自主知识产权的耐脂蛋白干扰的抗Lp-PLA2单克隆抗体对于研发心脑血管疾病检测试剂具有非常重要的意义。
参考文献：
[1]Je11inger PS,Smith DA,MehtaAE,eta1.American Association ofC1inica1 Endocrino1ogists'Guide1ines for Management of Dys1ipidemia andPrevention of Atherosc1erosis[J].EndocrPract,2012,18Supp1 1:1-78.
[2]Sudhir K.C1inica1review:Lipoprotein-associated phospho1ipase A2，anove1inf1ammatory biomarker and independent risk predictor for cardiovascu1ardisease[J].J C1in Endocrino1Metab,2005,90(5):3100-3105.
[3]Packard CJ，O'Rei11y DS，Cas1ake MJ，et a1.Lipoprotein-associatedphospho1ipase A2as an independ entpre dictor of Coronary heart disease.Westof Scot1and Coronary Prevention Study Group[J].N Eng J Med，2000，343(16):1148-1155.
[4]B1ake GJ,Dada N,Fox JC,et a1.A prospectiveeva1uation of1ipoprotein-associated phospho1ipaseA 2 1eve1s and the risk of Futurecardiovascu1ar events in women[J].J Am Co11Cardio1,2001,38(5):1302-1306.
[5]Oei HH，van der Meer IM，Hofman A，et a1.Lipoprotein-associatedphospho1ipase A2activity is associated with risk of coronary heart diseaseand is chemic stroke:the Rotterdam Study[J].Circu1ation,2005,111(5):570-575.
[6]Cas1akeMJ,Packard CJ,Robertson M,et a1.Lipoprotein-associatedphospho1ipaseA2,inf1ammatorybiomarkers,and risk of cardiovascu1ar disease inthe Prospective Study of Pravastatin in the E1der1y at Risk(PROSPER)[J].Atherosc1erosis,2010，210(1):28-34.
[7]卓明峰，徐尚华，张忠源.颈动脉粥样硬化与脂蛋白相关磷脂酶A2的相关性[J].中国动脉硬化杂志,2009,17(9):774-776.
[8]杨丽，刘寅，刘婷，陈倩.普罗布考联合阿托伐他汀对急性冠脉综合征血脂蛋白相关脂酶A2的影响[J].天津医药,2011,39(8):704-707.
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明提供一种耐脂蛋白干扰的抗人Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体，还提供了分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞，及该单克隆抗体及其特异性抗原的应用。
本发明的目的之一在于提供一株分泌抗人Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株LP1，于2016年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2016204。
本发明目的之二在于提供由所述的杂交瘤细胞株LP1分泌的耐脂蛋白干扰的抗人Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体LP1。
本发明所述的单克隆抗体LP1属于IgG1亚型。
本发明所述的单克隆抗体LP1结合位点位于Lp-PLA2蛋白的脂蛋白结合区域之外。
本发明所述的单克隆抗体LP1亲和力为1×10-6–1×10-12M。
本发明目的之三在于提供一种组合物，包括本发明所述的抗体LP1，和药学上的常用辅料。
本发明目的之四在于提供所述的单克隆抗体LP1在制备心血管疾病诊断或检测试剂中的应用。
本发明还提供所述的单克隆抗体LP1在制备心血管疾病早期诊断或辅助诊断试剂中的应用。
本发明目的之五在于提供包含所述的单克隆抗体LP1的Lp-PLA2早期检测、心血管疾病诊断或检测试剂盒。
所述的试剂盒是胶乳免疫比浊法的诊断试剂盒。
本发明目的之六在于提供所述的单克隆抗体LP1在制备治疗心血管疾病的药物或抗心脑血管疾病研究生物制剂中的应用。
本发明还提供所述的单克隆抗体LP1的特异性抗原作为靶点在制备治疗心血管疾病的药物或抗心血管疾病研究生物制剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供一株能稳定分泌耐脂蛋白干扰的、高效价的抗人Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LP1，该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的亲和力和特异性，能够避免血液中脂蛋白所带来的干扰，可以作为Lp-PLA2检测的关键原料，为建立快速、灵敏检测Lp-PLA2的包括免疫金标、酶联免疫试剂、免疫比浊法等临床诊断试剂提供重要原料。
本发明所提供的一株能稳定分泌耐脂蛋白干扰的、高效价的抗人Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分类命名为杂交瘤细胞株LP1(亚类IgG1)，已经于2016年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：C2016204。
本发明提供的由所述的杂交瘤细胞株产生的抗人Lp-PLA2蛋白单克隆抗体，其亚类属于IgG1。它具有以下特性：(a)特异性地与Lp-PLA2蛋白结合，且结合位点位于Lp-PLA2蛋白的脂蛋白结合区域之外，与脂蛋白结合状态和非脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白亲和力相同，并且(b)所述单克隆抗体亲和力为1×10-6–1×10-12M。它的制备方法包括以下步骤：
(a)用重组Lp-PLA2蛋白免疫小鼠；
(b)将免疫小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞；
(c)从步骤(b)中的杂交瘤细胞中选出能够分泌对重组Lp-PLA2蛋白效价为1:106以上的单克隆抗体的杂交瘤细胞；
(d)从步骤(c)中的杂交瘤细胞中选出能够分泌对脂蛋白结合状态和非脂蛋白结合状态Lp-PLA2蛋白具有相同亲和力的单克隆抗体的杂交瘤细胞；
(e)从步骤(d)的杂交瘤细胞中制得单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明最终获得了能稳定分泌耐脂蛋白干扰的抗人Lp-PLA2蛋白的杂交瘤细胞株LP1，该细胞株分泌的单克隆抗体对血清中的天然Lp-PLA2蛋白的效价高达1:106，对重组Lp-PLA2蛋白的亲和力达到1×10-12M，该单克隆抗体具有良好的特异性，与血液中其它蛋白没有交叉反应，且对脂蛋白结合状态和非脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白具有相同的亲和力。
2.该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有良好的特异性及温度稳定性，37℃保存长达8天效价不下降，可以作为Lp-PLA2检测的关键原料。
3.采用纯化的该Lp-PLA2单克隆抗体作为原料制备的检测Lp-PLA2抗原含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒能够耐受血液中脂蛋白的干扰，进而对病人是否发生动脉粥样硬化进行准确诊断。该单克隆抗体的开发对我国心血管疾病早期筛查试剂的开发具有重要意义。
附图说明
图1：为本发明Lp-PLA2蛋白纯化后鉴定结果图，lane M：蛋白质相对分子质量标准品；lane 1：离心上清；lane 2：阳离子交换柱纯化后的蛋白；lane 3：分子筛层析纯化后的蛋白；
图2：为本发明单克隆抗体LP1十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果图，lane M：蛋白质相对分子质量标准；lane 1：纯化前腹水(还原剂处理的样品)；lane 2：纯化后单克隆抗体(还原剂处理的样品)；lane 3：纯化前腹水(未加还原剂)；lane 4：纯化后单克隆抗体(未加还原剂)；
图3：为本发明单克隆抗体LP1免疫特异性鉴定结果图，lane M：蛋白质相对分子质量标准；lane 1：重组Lp-PLA2蛋白；lane 2：人血清；
图4：为本发明抗Lp-PLA2单克隆抗体LP1的稳定性检测结果图；
图5：为本发明Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的校准曲线图。附图中各部件的标记如下：A图是实施例7中制备的Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的校准曲线图；B图是实施例8中制备的Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的校准曲线图；
图6：为本发明Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的临床样本检测图。附件中各部件的标记如下：A图是实施例7中制备的Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的临床样本检测图；B图是实施例8中制备的Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的临床样本检测图；
图7：为本发明Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒抗干扰实验。附图中各部件的标记如下：A图是实施例7中制备的Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的抗脂蛋白干扰实验；B图是实施例8中制备的Lp-PLA2胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的抗脂蛋白干扰实验。
具体实施方式
下面结合附图通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，但并不是对本发明的限制，仅作示例说明。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，如Sambrook等人，分子克隆实验指南(Cold spring Harborlaboratory Press,2001)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件执行。
实施例1 重组Lp-PLA2蛋白的表达纯化和纯度鉴定
将含有Lp-PLA2基因序列的原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，用LB平板培养。从平板上挑取单菌落接种LB培养基中，扩大培养后，在菌液OD600值达到0.6-0.8时加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导表达。16小时后离心收集菌体，超声破碎细菌后离心收集上清。上清用阳离子交换柱和分子筛层析柱纯化，收集样品并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定蛋白纯度。
经阳离子交换柱和分子筛层析柱纯化重组Lp-PLA2蛋白后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，从凝胶上观察到50kDa左右的目的蛋白条带(图1)，即为重组Lp-PLA2蛋白，纯度为90％左右，达到了制备单抗的纯度要求。
实施例2 动物免疫与血清效价检测
将浓度为1mg/ml的纯化的重组Lp-PLA2蛋白与等量的弗氏完全佐剂用双注射器互推法混合乳化，用乳化好的抗原免疫6-8周无特定病原体级雌性BALB/c小鼠，每只小鼠从跗关节处注射40μg抗原。2天后，将浓度为1mg/ml的纯化的重组Lp-PLA2蛋白与等量的弗氏不完全佐剂用双注射器互推法混合乳化，对每只小鼠再次从跗关节处注射40μg乳化的抗原。8天后，尾静脉采血，离心取上清，用间接ELISA法检测血清效价。2次免疫后，百万倍稀释后血清效价已高达2.0以上(表1)。选取血清效价大于106的小鼠，颈椎脱臼处死后取淋巴细胞进行细胞融合。
表1 间接ELISA检测小鼠血清中抗体效价
实施例3 细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆
1.高效价杂交瘤细胞株的制备及筛选
以PEG 1500作为融合剂，融合sp2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠的淋巴细胞，两种细胞比例为1:2-1:3。融合细胞置于含20％FBS血清的HAT-1640培养基培养。一周后观察融合状态并换液，换液3天后取细胞培养上清。用临床确诊发生动脉粥样硬化病人的血清包被ELISA板，该血清中含有高浓度的天然Lp-PLA2蛋白，用间接ELISA方法筛选阳性克隆，选择阳性值与细胞数比值较高的细胞进行多次亚克隆，最终得到多株能够稳定分泌抗Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞库。该杂交瘤细胞库分泌的单克隆抗体与血液中天然Lp-PLA2蛋白有很高的亲和力。
2.耐脂蛋白干扰的杂交瘤细胞株的筛选
将浓度为1mg/ml纯化的重组Lp-PLA2蛋白与浓度为5mg/ml的氧化型低密度脂蛋白(购自sigma)混匀孵育，制备脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白。之后分别用纯化的重组Lp-PLA2蛋白和上述脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白分别包被ELISA板。用含20％FBS血清的HAT-1640培养基培养上述杂交瘤细胞库中的细胞，3天后取细胞培养液，用间接ELISA方法分别测定细胞培养液中的单克隆抗体与纯化的重组Lp-PLA2蛋白和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白的相对亲和力。选取与纯化的重组Lp-PLA2蛋白和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白亲和力相同，且亲和力最高的单克隆细胞，最终得到一株能够分泌耐脂蛋白干扰的抗Lp-PLA2单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为LP1。
实施例4 单克隆抗体的产生与纯化
在成年BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml无菌石蜡油，一周后再向腹腔内注入0.5ml的LP1杂交瘤细胞，细胞密度为1×106-2×106/ml。两周后开始采集腹水。在腹水中缓慢加入等体积饱和硫酸铵，冰上搅拌30分钟后在4℃下12000g离心10分钟，沉淀用少量PBS溶解后用20倍体积的Binding buffer(Protein A Sefinose Kit中提供)透析，用Protein A亲和柱纯化抗体后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定纯化效果。
经电泳分析，纯化后的抗体在还原的胶上呈现分子量为50kDa和25kDa的重链和轻链，而在非还原胶上呈现分子量约为150kDa的单一条带(图2)。这说明经亲和柱层析后单克隆抗体达到了相当高的纯度，可以用于进一步的研究。
实施例5 单克隆抗体亚型、特异性及效价鉴定
1.单克隆抗体亚型鉴定
采用Sino Biological公司的Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents鉴定单克隆抗体亚型，操作按说明书进行。经鉴定，制备的单克隆抗体为IgG1亚型。
2.单克隆抗体特异性鉴定
用临床确诊发生动脉粥样硬化病人的血清和纯化的重组Lp-PLA2蛋白分别进行Western blotting实验鉴定LP1单克隆抗体的特异性。结果显示于病人血清中天然Lp-PLA2蛋白及重组表达Lp-PLA2蛋白处均可见抗Lp-PLA2单克隆抗体LP1的特异结合条带，且在其它位置没有明显杂带(图3)，说明LP1单克隆抗体能够特异性识别血液中的Lp-PLA2蛋白，与血液中的其他抗原没有非特异反应，适合用来检测病人血液中Lp-PLA2蛋白的含量，具有良好的特异性。
3.单克隆抗体效价鉴定
用表面等离子体共振法(SPR)在Biacore 3000仪器上测定LP1单克隆抗体的亲和力。用10μg/ml的纯化的重组Lp-PLA2抗原包被CM5芯片，偶联方式为EDC/NHS化学偶联抗原表面的伯氨基和芯片表面的羧基。加入梯度稀释的抗Lp-PLA2单克隆抗体LP1，测定LP1单克隆抗体与重组Lp-PLA2蛋白的结合常数和解离常数。经过仪器附带的软件计算，LP1单克隆抗体的亲和力达到1pM，即1×10-12M。结果表明，LP1单克隆抗体具有极高的亲和力，能够作为高灵敏度Lp-PLA2检测试剂盒的原料。
实施例6 单抗稳定性的鉴定
将纯化后的抗Lp-PLA2单克隆抗体LP1分别置于-20℃、4℃和37℃环境中，浓度为1mg/ml，每24小时取样一次，间接ELISA检测其免疫反应活性的变化。结果显示在-20℃、4℃和37℃孵育24小时后，效价无差别，超过8天后37℃组抗体的效价才开始下降(图4)，说明LP1单克隆抗体具有良好的温度稳定性。
实施例7 Lp-PLA2含量检测试剂盒的制备(胶乳增强免疫比浊法)
本试剂盒包含双试剂，试剂1为胶乳反应缓冲液，试剂2为包被上述抗Lp-PLA2单克隆抗体的胶乳颗粒。
制备试剂1时，称取60.57mg的Tris，58.44mg的NaCl，50mg的PEG6000，3.9mg的NaN3溶于8ml的蒸馏水中，调节pH至8.0，定容至10ml。搅拌混匀，经过0.22μm滤膜抽滤后，即得试剂1。
制备试剂2时，取0.1ml浓度为10％粒径为220nm的聚苯乙烯胶乳于10mL离心管中，再向离心管中加入8.9ml 0.1M MES缓冲溶液(pH 5.0)，混合均匀，得到稀释胶乳溶液。准确称取0.34mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺用1mL 0.1M HEPES缓冲溶液(pH7.5)溶解，并将此溶液加入稀释胶乳溶液中，震荡混合均匀，并置于25℃恒温摇床上，200转/分钟反应30分钟；之后将上述反应溶液分成等量的两份，分别加入0.5ml 1mg/ml抗Lp-PLA2单克隆抗体LP1和另一株抗Lp-PLA2单克隆抗体LP3(来自南京诺唯赞生物科技有限公司)，震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/分钟反应2小时。反应完成后，向两反应体系中分别加入1ml 5％浓度的BSA溶液，混合均匀，并置于37℃恒温摇床上，200转/分钟，反应1小时。将上述体系于16000g，离心30分钟，弃上清，将沉淀分别用5ml含50mM Tris，pH6.5，50mM NaCl，1‰NaN3的缓冲液重悬，将两种胶乳等体积混合后超声分散胶乳，即得试剂2。
实施例8 Lp-PLA2含量检测试剂盒的制备(胶乳增强免疫比浊法)
本试剂盒包含双试剂，试剂1为胶乳反应缓冲液，试剂2为包被上述抗Lp-PLA2单克隆抗体的胶乳颗粒。
制备试剂1时，称取60.57mg的Tris，58.44mg的NaCl，50mg的PEG6000，3.9mg的NaN3溶于8ml的蒸馏水中，调节pH至8.0，定容至10ml。搅拌混匀，经过0.22μm滤膜抽滤后，即得试剂1。
制备试剂2时，取0.1ml浓度为10％粒径为220nm的聚苯乙烯胶乳(购自日本合成橡胶公司)于10mL离心管中，再向离心管中加入9.9ml 50mM HEPES缓冲溶液(pH 7.5)，混合均匀，得到稀释胶乳溶液。之后将上述反应溶液分成等量的两份，分别加入0.5ml1mg/ml抗Lp-PLA2单克隆抗体LP1和另一株抗Lp-PLA2单克隆抗体LP3(来自南京诺唯赞生物科技有限公司)，震荡混合均匀，置于水平摇床上，室温，200转/分钟反应2小时。反应完成后，向两反应体系中分别加入1ml 5％浓度的BSA溶液，混合均匀，并置于37℃恒温摇床上，200转/分钟，反应1小时。将上述体系于16000g，离心30分钟，弃上清，将沉淀分别用5ml含50mM Tris，pH6.5，50mM NaCl，1‰NaN3的缓冲液重悬，将两种胶乳等体积混合后超声分散胶乳，即得试剂2。
实施例9 Lp-PLA2含量检测试剂盒临床实验
1.标准曲线的建立。称取60.57mg的Tris、87.66mg的NaCl、186.12mg的EDTA·Na2和100mg的BSA，溶于溶于8ml的蒸馏水中，调节pH值至7.5，定容至10ml，搅拌使其完全混匀，并经过0.22μm滤膜抽滤，得到标准品稀释液。用上述标准品稀释液溶解纯化的重组Lp-PLA2蛋白，制备不同浓度的标准品(0ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml)。用上述制备的两种Lp-PLA2含量检测试剂盒测定不同浓度标准品中Lp-PLA2的含量。该方法为两点终点法，采用日立7170生化分析仪测定，包括以下步骤：向10μl待检测样本(校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品)中加入200μl的试剂1充分混匀，于37℃孵育5分钟，再向混合体系中加入50μl试剂2，混匀，37℃恒温1分钟后，空白管调零，波长546nm，测定各管吸光度A1，4分钟后测定各管吸光度A2。计算ΔA＝A2-A1。根据多点校准品浓度和对应吸光度变化值ΔA，采用多点非线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
采用实施例7和8中制备的试剂盒及测量方法，采用日立7170生化分析仪测得的上述6种不同含量的Lp-PLA2标准品的曲线(图5)，每个点代表一个含量的参考标准品，其中X轴表示Lp-PLA2含量(ng/ml)；Y轴表示吸光度。
2.Lp-PLA2含量检测试剂盒的临床实验
分别选取50例健康人血清和20例临床确诊已发生动脉粥样硬化病人的血清，按照上述条件，用实施例7和8中制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒分别测定各血清中Lp-PLA2蛋白的含量。结果表明实施例7和8中制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒能够明显区分出正常组和病理组样本(图6),说明基于LP1单克隆抗体制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒能够对动脉粥样硬化进行准确诊断，能够满足临床检测的需求。
实施例10 Lp-PLA2含量检测试剂盒干扰性实验
将浓度为1mg/ml纯化的重组Lp-PLA2蛋白与浓度为5mg/ml的氧化型低密度脂蛋白(购自sigma)混匀孵育，制备脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白。用不含Lp-PLA2的血清作为稀释液，分别配制浓度为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、1000ng/ml的重组Lp-PLA2蛋白和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白。按照实施例9中的实验条件，用实施例7和8中制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒分别测定各稀释样品的浓度。
结果表明实施例7和8中制备的Lp-PLA2含量检测试剂盒测定纯化的重组Lp-PLA2蛋白和脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白浓度的线性相关系数和回归直线斜率均达到了0.99以上(图7)，说明用LP1单克隆抗体制备的Lp-PLA2检测试剂盒测定脂蛋白结合状态和非脂蛋白结合状态的Lp-PLA2蛋白时没有差异，试剂盒能够耐受脂蛋白结合对Lp-PLA2含量测定的干扰。

Claims (9)

1.一株分泌抗人Lp-PLA2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株LP1，于2016年12月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2016204。
2.由权利要求1所述的保藏编号为CCTCC NO：C2016204的杂交瘤细胞株LP1分泌的抗人Lp-PLA2蛋白单克隆抗体LP1。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体LP1，其特征在于，所述单克隆抗体LP1结合位点位于Lp-PLA2蛋白的脂蛋白结合区域之外。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体LP1，其特征在于，所述单克隆抗体LP1亲和力为1× 10-6 – 1 × 10-12M。
5.一种包含权利要求2所述的单克隆抗体LP1的Lp-PLA2早期检测或心脑血管疾病诊断试剂盒。
6.权利要求2所述的单克隆抗体LP1或权利要求5所述试剂盒在制备心脑血管疾病诊断或检测试剂中的应用。
7.权利要求2所述的单克隆抗体LP1或权利要求5所述试剂盒在制备心脑血管疾病早期诊断或辅助诊断试剂中的应用。
8.一种组合物，其特征在于，包含权利要求2所述的单克隆抗体LP1和药学上的常用辅料。
9.权利要求2所述的单克隆抗体LP1或权利要求8所述组合物在制备治疗心脑血管疾病的药物或抗心脑血管疾病研究生物制剂中的应用。
CN201710300979.8A 2016-12-27 2017-05-02 耐脂蛋白干扰的抗人Lp‑PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用 Active CN106957824B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2016112706772 2016-12-27
CN201611270677 2016-12-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106957824A CN106957824A (zh) 2017-07-18
CN106957824B true CN106957824B (zh) 2018-02-23

Family

ID=59484678

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710300979.8A Active CN106957824B (zh) 2016-12-27 2017-05-02 耐脂蛋白干扰的抗人Lp‑PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106957824B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110317270A (zh) * 2019-05-09 2019-10-11 中国科学院昆明动物研究所 抗毒蛇pla2蛋白抗体及其应用
CN111662387A (zh) * 2020-07-14 2020-09-15 重庆中元汇吉生物技术有限公司 抗人脂蛋白相关磷脂酶a2单克隆抗体及其应用
CN112433051B (zh) * 2020-11-23 2022-07-08 四川大学华西医院 血小板活化因子乙酰水解酶检测试剂在制备肺癌筛查试剂盒中的用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995000649A1 (en) * 1993-06-25 1995-01-05 Smithkline Beecham Plc Lipoprotein associated phospholipase a2, inhibitors thereof and use of the same in diagnosis and therapy
WO1997012984A1 (en) * 1995-09-29 1997-04-10 Smithkline Beecham Plc COMPOUND HAVING SEQUENCE HOMOLOGY WITH LIPOPROTEIN ASSOCIATED PHOSPHOLIPASE A2 (Lp-PLA2)/PAF ACETYL HYDROLASE

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995000649A1 (en) * 1993-06-25 1995-01-05 Smithkline Beecham Plc Lipoprotein associated phospholipase a2, inhibitors thereof and use of the same in diagnosis and therapy
WO1997012984A1 (en) * 1995-09-29 1997-04-10 Smithkline Beecham Plc COMPOUND HAVING SEQUENCE HOMOLOGY WITH LIPOPROTEIN ASSOCIATED PHOSPHOLIPASE A2 (Lp-PLA2)/PAF ACETYL HYDROLASE

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LP-PLA2的原核表达、抗体制备及表位分析;黄美容;《重庆医科大学硕士学位论文》;20121231;摘要 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106957824A (zh) 2017-07-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ikeda et al. A sandwich-enzyme immunoassay for the quantification of lipoprotein lipase and hepatic triglyceride lipase in human postheparin plasma using monoclonal antibodies to the corresponding enzymes
KR102549704B1 (ko) Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법
CN106957824B (zh) 耐脂蛋白干扰的抗人Lp‑PLA2蛋白的单克隆抗体及其应用
US8399207B2 (en) Monoclonal antibodies against osteopontin
CN107119023B (zh) 耐脂肪酸干扰的抗人心型脂肪酸结合蛋白的单克隆抗体及其应用
CA2201152A1 (en) A monoclonal antibody to human ventricular myosin light chains
JPH04503600A (ja) 抗インターロイキン―１α及び―１βのモノクローナル抗体、その製法、ならびに前記抗体類の、インターロイキン―１α及び―１βの検出と治療への応用
JP2021515553A (ja) 抗ｐｌａ２−ｇｉｂ抗体およびその使用
KR100730529B1 (ko) Ｈｃｖ 코어 항원의 검출 또는 정량 방법 및 이에사용하기 위한 검출 또는 정량용 시약
JP2005510696A (ja) 患者サンプル中の生化学的標識の迅速同時検出のための免疫分析法および免疫分析キット
CN109336973B (zh) 抗转铁蛋白抗体及其用途
CN104066749B (zh) 用于特异性识别人肝羧酸酯酶1的单克隆抗体、生成单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其用途
AU2006213411B2 (en) Antibody for assay of ADAMTS13 activity and method of activity assay
CN106939034A (zh) 用于鉴定受试者所感染的hev基因型的方法和试剂盒
CN106366199A (zh) 一种肌钙蛋白i单克隆抗体磁微粒及其制备方法和检测试剂盒
JP2000512123A (ja) ネフロパシー―関連免疫グロブリンｇ及びそのための抗体
CN104024275A (zh) 对于人β1-肾上腺素受体（β1-AR）的结合化合物以及它们在测量自身抗β1-AR抗体中的应用
WO2022032497A1 (zh) 用于检测冠状病毒中和抗体的试剂盒、方法
Jackson et al. Aberrant synthesis of antibodies directed at the Fab fragment of IgA in patients with IgA nephropathies
JPH10226700A (ja) Ｍｉａの検出のためのイムノアッセイ
EP1765867B1 (en) Monoclonal antibodies to hiv-1 vpr and methods of using same
CN117187189B (zh) 一种用于检测乌司奴单抗的杂交瘤细胞株组合和抗体组合及其应用
RU2763178C2 (ru) Антитела для лабораторной диагностики концентрации интерлейкина-11
CN117285637B (zh) 一种抗独特型抗体及其应用
JP3451783B2 (ja) コリンエステラーゼの測定法及び肝硬変と肝炎の識別法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20181228

Address after: 210038 C1-2, Hongfeng Science Park, Ke Chuang Road, Qixia District, Nanjing, Jiangsu.

Patentee after: VAZYME BIOTECH (NANJING) CO., LTD.

Address before: 210046 C2, 1-3 level, Hongfeng Science Park, Ke Chuang Road, Nanjing economic and Technological Development Zone, Jiangsu.

Patentee before: Nanjing promise Medical Technology Co., Ltd.

CP01 Change in the name or title of a patent holder
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Qixia District of Nanjing City, Jiangsu province 210038 Branch Road, Hongfeng Technology Park building C1-2

Patentee after: Nanjing novozan Biotechnology Co., Ltd

Address before: Qixia District of Nanjing City, Jiangsu province 210038 Branch Road, Hongfeng Technology Park building C1-2

Patentee before: VAZYME BIOTECH (NANJING) Co.,Ltd.