JPH06500070A - 新規タンパク質及びその製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規タンパク質及びその製造 本発明は、タンパク質及びその製造に関する。

血液凝固を溶解することができる一連のタンパク質、例えばｔＰＡ、ウロキナー ゼ及びストレプトキナーゼは、既に公知である。その作用は、血液凝固の際に存 在するフィブリンをペプチド鎖の切断により解重合し、かつ従って、溶解性にす ることよりなる。血液凝固の溶解は、ε−（γ−グルタミル）−リジン−結合を 溶かすことによっても行なわれうる。このような物質は、水蛭（Ｈｉｒｕｄｏ　 ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）から単離される。デスタビラーゼ（Ｄｅｓｔａｂｉ　 １ａｓｅ）　（旧ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ＵＳＳＲ５０，３５７（１９８５） ）がこれに属し、これは、分子量１２３００Ｄａを有する（Ｘ［ｌ　Ｃｏｎｇｒ ｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ　。

ｎ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、Ａｂｓｔｒａｃ ｔ１７２７（１９８９））。

本発明の目的は、配列表中に示す配列１−１２を有し、かつε−（γ−グルタミ ル）−リジン−結合を切断する新規タンパク質並びにその突然変異タンパク質（ Ｍｕｔｅｉｎ）及び匹敵する作用を有する天然の変種である。

突然変異タンパク質とは、タンパク質鎖中でのアミノ酸又はペプチドの交換、欠 失及び／又は付加により、新規タンパク質から由来するタンパク質である。

天然の変種とは、吸血動物種牛に存在し、かつ近似のアミノ酸配列で同様の作用 を示すタンパク質である。

この新規タンパク質は、水蛭（Ｂｌｕｔｅｇｅｌ）　（旧ｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃ ｉｎａｌｉｓ）の線分泌物から、Ｓ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）■、 コンカナバリン（Ｃｏｎｃａｎａｖａｌ　ｉｎ）　Ａ−及び銅キレートクロマト グラフィーカラムでのクロマトグラフィーにより単離することができる。水蛭５ ００ｇの線分泌物から、このタンパク質の活性単位３０〜２００を単離すること ができる。

新規タンパク質は、線分泌物中に濃度１〜１００μｇ／ｋｇで存在する。医薬目 的用のタンパク質を多量に入手するためには、公知の遺伝子技術法（サンブロー ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、　Ｔ、等、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）＋、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、１９８９参照 ）を使用することができる。この目的のために、先ず、この新規タンパク質に関 する遺伝情報を同定し、かつ相当する核酸を単離させるべきである。このために 、純粋なタンパク質をジチオトレイトールを用いて還元し、次いでヨードアセト アミドを加えて遊離ＳＨ−基を誘導体化させ、かつ引き続き、このようにして処 理されたタンパク質をブロムシアン及びトリプシンを用いて切断して小さいペプ チドにする。ペプチドの分離は、逆相−クロマトグラフィーにより行なう。この 精製したペプチドを引き続き配列決定する。

存在するペプチド配列は、相当するオリゴヌクレオチドの合成により、配列特異 性フィルターハイブリッド形成（ｓｅｑｕｅｎｚｓｐｅｚｉｆｉｓｃｈｅ　Ｆｉ ｌｔｅｒｈｙｂｒｉｄｉｓｉｅｒｕｎｇ）によるゲノム又は相当するｃ−ＤＮＡ −パンク（Ｂａｎｋ）からの遺伝子の明白な同定を可能にする。ここで有用なタ ンパク質配列データからの縮重オリゴヌクレオチドプローブ（ｃｌｅｇｅｎｅｒ ｉｅｒｔｅｎ　Ｏｌｉｇｏｎｕｋｌｅｏｔｉｄｓｏｎｄｅｎ）の製法、ｍＲＮＡ の単離及びｃＤＮＡへのその書換え並びにｃＤＮＡ−パンクの製造及びｃＤＮＡ −パンクとオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成は、技術水準であ り、かつ文献「モレキュラー・クローニング」（サンブローク等（１９８９）Ｋ ａｐｉｔｅｌ　１１．７及び８）中に記載されている。

次いで、こうして得られたタンパク質の遺伝情報を種々異なる寄主細胞、例えば 真核細胞（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｓｃｈｅＺｅｌｌｅ）、酵母（Ｈｅｆｅ）、枯草 菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で、自 体公知の方法により発現させ、かつこうして多量のタンパク質を得ることができ る。

異種遺伝子の発現のために必要な方法も技術水準であり、かつサンブローク等（ １９８９）のＫａｐｉｔｅｌ　ｌ　６及び１７中に詳述されている。

この突然変異タンパク質も、遺伝子技術法により、有利に製造される。

この新規タンパク質を水蛭から単離する場合には、これはグリコジル化された形 で得られる０発現のために、真核細胞を使用する場合には、遺伝子技術的製造に 関して同様のことが当てはまる。原核細胞中でそれを発現させる場合、それはグ リコジル化されていない形で得られる。どちらの形も、同様の作用を示す。

この新規タンパク質は、インペプチダーゼであり、かつ＃素活性により活性化さ れた因子Ｘｌｌ＋により架橋された線維素凝塊（血栓）を溶かすことができる。

この架橋は、グルタメート−及びリシン−側鎖間のインペプチド結合により形成 される。切断は、ｙ−グルタミル基の、他のアミノ酸、ジペプチドへの転移又は 加水分解により行なわれる。このインペプチド結合の加水分解により、因子Ｘ１ ｌｌａの作用が消される。こうして、因子Ｘ１ｌｌａにより架橋された（エージ ングした）凝塊を減縮させ、かつ直接溶解するか又は組織プラスミノーゲンアク チベーター（例えばｔＰＡ）と組み合わせて溶解させる。こうして、この酵素を 血栓状態（例えば心筋梗塞、重い静脈血栓症及びアテローム硬化症）の治療に、 緊急処置に、予防に使用することができる。

遊離した腫瘍細胞は、ε〜（γ−グルタミル）−リジン−結合を介して目的組織 中で固着し、かつ次いで線維素被覆により免疫系から遠ざかる。従って、この新 規酵素は、転移形成を阻止するためにも好適である。

新規タンパク質の取得 例１ 特表千６−５０００７０　（３） ａ）ヒル分泌物の取得 水蛭５００ｇを４℃で、僅かな水を有する冷蔵室中で、約５０ｇに分けて保持し た。この動物を１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０　ｍ　Ｍ　アルギニン及び２０ｍＭ リン酸塩緩衝液ｐＨ７，４中で２時間、室温で刺激した。これを２日後に、１５ ０　ｍＭ　Ｎａ１ｌ、２０ｍＭリン酸塩緩衝液ｐＨ７，４及び１％ピロカルビン 中に１時間浸漬した。その際に、水蛭は、多量の粘液並びに発色基質（Ｆａｒｂ ｓｕｂｓｔｒａｔ）　ｙ−グルタミル−パラ−ニトロアニリドを変換する酵素活 性を分泌した。ヒル５００ｇは、この酵素活性３０〜２００単位を分泌した。

ｂ）ヒル分泌物からのタンパク質の単離ｌＯＯ単位（ａ参照）を平衡緩衝液（２ ０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５，１０ｍＭ　ＮａＣ１，０。

０１％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）　＠　８０　）　５１で希釈した。ｐＨを４． ５に調整した。最終容量は、約６１であった。

この容量を流速５ｍ１／分で、Ｓ〜セファａ−ス９３５０ｍ１上にのせ、平衡ａ ！衡液液４カラム量用いて洗浄し、かつ２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４ ゜５、　１０ｍＭ　ＮａＣ１，０，０１％トウイーン■８０１１から２０ｍＭリ ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４，５，５００ｍ　Ｍ　Ｎａ１ｌ、０．Ｏ１％トウィ ーン０８０１１の塩−勾配を用いて展開させた。酵素活性は、５０〜２００　ｍ 　Ｍ　ＮａＣ１で溶離した。

活性フラクションを集めた。希釈により、この緩衝液を２０ｍＭ酢酸ナトリウム ｐＨ７，０，１５０ｍＭＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｎＣ１，、ｌ　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ 、及び１　ｍ　Ｍ　ＣａＣｌ２に調節した。このａ液をコンカナバリンＡ−カラ ム（２５ｍｌ）上に加え、かつ同様の緩衝液４カラム量を用いて洗浄した。付加 的に１０ｍＭマンノース又は５ｍＭ　α−メチルマンノシドを有する同様の緩衝 液を用いて、溶離を行なった。

活性フラクションを集め、かつＭ受液中で２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，０ ，５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％トゥイーン０８０の最終濃度が得られ るように希釈した。同様のａ新液中で平衡させた銅キレートカラム（２ｍ１容量 ）を負荷し、かつ２０　ｍ　Ｍコハク酸ｐＨ７，０，５００ｍＭ　ＮａＣ１，０ ，０１％トウイーン０８０１５カラム量から得られた均衡緩衝液１５カラム量を 用いて洗浄した。その後に、カラムを２０ｍＭコハク酸ｐＨ４，５，５００ｍＭ 　ＮａＣ１，０，０１％トウイーン８０への勾配を用いて溶離させた。

活性は、ｐＨ６〜５．４で溶離した。

Ｃ）モノ　Ｓ−クロマトグラフィーを介するタンパク質の精製 Ｃｕ−キレート−カラムの有価ピークを濃縮し、かつ２０　ｍＭ　Ｎ　ａ−リン 酸塩、１０ｍＭ　ＮａＣ１ｐＨ５゜０（緩衝液Ａ）まで再緩衝した。その後に、 モノ　５ＦＰＬＣ−カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）上にのせ た。

緩衝液ＡＩＯカラム量を用いてカラムをすすぐことにより、結合していない物質 を溶離後に、カラムを、緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００　ｍ　Ｍ 　ＮａＣ１、ｐＨ８，５）０〜６６％の組み合わせたｐＨ−及び塩−直線勾配を 用いて、８５分間溶離させた。この条件下で新規タンパク質は、緩衝液ＢＩＯ〜 ３０％で、カラムから溶離した。

溶離を、２８０　ｎｍでのＵＶ−測定もしくはのせたフラクションのアリコート の活性測定により追跡した。

活性を有するフラクションを集め、脱塩し、かつ濃縮乾固させた。試料は、更に 使用するまで一２０℃で保存した。

ｄ）逆相（ｒ）ＨＰＬＣによるタンパク質の精製濃縮乾固させたＣｕ−キレート −クロマトグラフィーの有価フラクションを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ ）−溶液中に入れ、かつＣ−４逆相カラム（ｒＰ３０４、Ｂｉｏｒａｄ、ミュン ヘン）上で、更に精製した。この工程において、大きな及び小さな単位のタンパ ク質を分離した。カラムの溶離は、０〜５０％のアセトニトリル−直線勾配（Ｔ ＦＡｏ、１％中）の設定により、９０分で１ｍｌ／分の流速で達成された。

溶離の経過は、２１０ｎｍでのＵｖ−測定により追跡した。この条件下で、この タンパク質に関係した一連のタンパク質は、アセトニトリル３５〜４５％で溶離 した。このタンパク質に属するタンパク質バンドを分別させ、かつａ刑の除去の 後にペプチド形成のためのタンパク質分解性消化作用をさせる。

ｅ）タンパク質分解性分断後に得られるデスタビラーゼ−ペプチドの逆相（ｒ） ＨＰＬＣを用いる分離トリプシン（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｇｒａｄｅ、ペーリンガ ーマンハイム）もしくはエンドプロテアーゼＧＩｕＣ（べ−リンガーマンハイム ）を用いる酵素的消化により得られるペプチド混合物にＯ，１％ＴＦＡを加え、 かつＣ−ｔＳ逆相ＨＰＬＣ−カラム（ｒ　ｐ　３１８、Ｂｉｏｒａｄ、ミュンヘ ン）上で分離させた。その際、２時間にわたって、溶液Ｃ（水中ＴＦＡ０．１％ ）から溶液Ｄ（アセトニトリル中ＴＦＡ０．１％）の直線勾配を設定した。１ｍ ｌ／分の流速で、溶離を２ＬＯｎｍでのＵＶ−測定により追跡した。分離された ペプチドを分別し、かつ個々のペプチドのアミノ酸−配列をベブチドシークエネ ータ−（アプライド・バイオシステムス；　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ）上で測定した。

配列表中に示した配列が測定された。

タンパク質の特性付け ５ＤＳ−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動及び引き続く銀染色法により、バン ド３個が認識される（ｐｈａｒｍａｃｉａによるＬｏｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 ｗｅｉｇｈｔ　ｍａｋｅｒ）　：バンド１個は、見掛は分子量５７０００Ｄａを 有し、かつバンド２個は、３００００Ｄａを有する。分子量を分子ふるいクロマ トグラフィー（ＴＳＫ　Ｇ３０００、緩衝液＝２０ｍＭ　Ｎａ、ＨＰＯ４０，Ｉ Ｍ　ＮａＣ１ｐＨ７，０、特表平６−５０００７０　（４） 流速：０．７ｍｌ／分）により測定すると、このタンパク質は、見掛は分子量約 ４４０００　（±５０００Ｄａ）Ｄａを示す。特異活性は、約５８０Ｕ／ｍｇで ある。この活性の測定のために、つぎの試験を使用した二緩衝液（５ｍＭトリス 　ｐＨ８，４，０，０１％トウイーン９８０）５０μｌ、発色試薬（γ−グルタ ミルーｐ−ニドＯアニリド、１ｍｇ／ｍ１）５０μｌを試料６０５０μｌと共に ３７℃でインキュベーションし、かつ引き続き吸光度の増加を４０５ｎｍで測定 した。

ＩＵは、γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド１μモルを３７℃で１分間で変換 させ、かつこれにより４０５ｎｍの吸収増大を生じさせる酵素活性として定義し た。

この天然タンパク質は、腑タンパク質であり、これは、コンカナバリンＡ−カラ ムからのマンノース−依存溶離により証明される。

プロテアーゼ−抑制物質、例えばシスタチン（（：ｙｓｔａｔｉｎ）Ｃ（１０μ ｇ／ｍｌ）、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）（１００μｇ／ｍｌ）及びベ ンズアミジン（Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｌ）　（１０ｍＭ）は、活性を抑制しない。

１００４ＭボレートｐＨ８，４と一緒になった１００μＭセリンは、酵素活性の 約５０％を抑制する。この酵素は、１〜５ｍＭＨｇｃｌユの添加により完全に抑 制される。更に、還元及び酸化したグルタチオンは、この酵素を抑制する。

トリトン（Ｔｒｉ℃Ｏｎ）”’　Ｘ−１００は、活性にほとんど影響せず、か− ）ＳＤＳによる変性（Ｄｅｎａｔｕｒｉｅｒｕｎｇ）の前に、保護することがで きる。ｐＨ−至適は、ｐＨ８〜９である。しかし、この酵素は、ｐＨ１２までな お活性である。更に、基質の非特異的加水分解は、既に重要である。

線維素−溶解作用の証明 ＴＢＳ（＝１０ｍＭトリス／ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１）中の 濃度４　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのウシフイブリノゲン（Ｍｉｌｅｓ　Ｎｏ、８２− ０２２２−４　；因子Ｘｌｌ＋含有）ｌＯＯμｌに、ウシトロンビン（Ｓｉｇｍ ａ　Ｎｏ、Ｔ６６３４．２５ｍＭ酢酸カルシウムを有するＴＢＳ中５０／ｍ１） １０μｌを加え、かつ３７℃で２〜５時間、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏ　 ｒｆ　）−反応容器中でインキュベーションする。その際に、安定な、因子ＸＩ 　ｌ１ａ−架橋した繊維素凝塊が生じる。

これを１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，５，１５０ｍＭＮａＣ１を用いて１回 洗浄し、かつ引き続き水蛭の唾液分泌物２００μｌと共にインキュベーションす る（２０時間、３７℃）、５％モノクロル酢酸１ｍｌの添加後に、上澄（ＯＤ　 ２８０ｎｍ）中の遊離タンパク質質量を測定する。

例２ １、ｍ−ＲＮＡの単離 ＲＮＡを、水蛭全てから、グアニジニウムチオシアネート中での溶解及び引き続 ＜ＣｓＣ１−クッション（Ｋｉｓｓｅｎ）を介する遠心濾過後に得た。３′−末 端にポリＡを含有するＲＮＡの部分（ポリＡ＋）をオリゴ（ｄＴ）−アフィニテ ィークロマトグラフィーによって単離した。双方の方法工程は、サンブローク等 の（１９８９）　ｒモレキュラー・クローニング」第２版、Ｃ３Ｈ−Ｐｒｅｓｓ 、７．１９〜７．２２及び７．２６〜７．２９頁の記載のようにして実施した。

２、ＤＮＡ−プローブの製造 ポリメラーゼ一連鎖反応（ＰＣＲｌこの技術の詳細はサンブローク等、Ｋａｐｉ ｔｅｌ１４参照）を用いるｃＤＮＡ−断片のクローニングのために、ペプチド− 配列：Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒから出 発した。公知の遺伝コードに基づいて、このアミノ酸配列を核酸配列に書換える 。この遺伝コードの公知の縮重（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔ　１ｏｎ）故に、多くの位 置に、多くの核酸を導入することができる。その際、ｍＲＮＡ鎖の配列には、次 の５７６の可能性が生じる：５’　ＧＧＮＡＡＲＧＡＹＡＴＨＡＴＨＡＡＲＡＡ ＲＴＡ３’複雑性を減少させるために、オリゴヌクレオチド各１４４個の４群を 合成した（Ａ−Ｄ３１６）。同様に、相補鎖（ｃＤＮＡ−鎖）から、オリゴヌク レオチド各１４４個の４群を合成した（逆Ａ−Ｄ　３１６）。

２、ペプチド配列として、ペプチド： ＋１ｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕを使用した 。核酸コードへの書換え後に、ｍ　ＲＮ　Ａ鎖のために次の１７２８の可能性が 生じる：５’　ＡＴ）［ＧＴＮＣＡＲＧＡＲＡＴＨＣＡＲＴＣＮＧＡ３’５’　 ＡＴＨＧ丁Ｎ（：ＡＲＧＡＲＡＴＨＣＡＲＡＧＹＧＡ３　’これらの配列を、オ リゴヌクレオチド各１４４個当たり１２群に合成した（Ａ−Ｌ　３１７）。同様 に、相補鎖（ｃＤＮＡ−鎖）から、オリゴヌクレオチド各１４４個の１２群（逆 Ａ−Ｌ　３１７）を合成した。

この合成をアプライド・バイオシステムス　ＤＮＡ−シンセサイザー（Ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｚｅｒ）Ｔｙｐ　３６０Ａを用いて実施した。オリゴヌクレオチドを保 護基の除去後に、ゲル電気泳動により、アシルアミド／原素ゲルを介して精製し た。

３、ｃＤＮＡの製造 ポリＡ’−ＲＮＡ　ｌ　２　Ｘ　３μｇを市販で入手可能なｃＤＮＡ−合成キッ ト（Ｓｙｎｔｈｅｓｅｋｉｔｓ　；ベーリンガー・マンハイム、Ｂｅ５ｔ、Ｎｏ 、　１０１３８８２）を用い、プライマーとしてオリゴ（ｄＴ）＋ｓを用いて、 １本鎖のｃＤＮＡに書換えた。合成を、１時間後に、９５℃まで加熱することに より（５分）中断し、かつ低分子成分をｒ　ｃＤＮＡスパンカラム（Ｓｐｕｎ　 Ｃｏｌｕｍｎ）Ｊ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｎｏ、２７−５０９９）を介して除 去した。

４、ＰＣＲ反応 特表平６−５０００７０　（５） ポリメラーゼ一連鎖反応（ＰＣＲ）の方法は、サンブローク等、Ｋａｐｉｔｅｌ 　１４中に記載されている。この方法は、ＤＮＡ−セグメントを複製する。この ためには、ＤＮＡ　（この場合１本鎖のｃＤＮＡ）の他に、相補オリゴヌクレオ チド１組が必要である。更に、１方のオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ−鎖に対 して相補的であり、他方は、ｃＤＮＡ−鑞に対して相補的であるべきである０次 いで、ＰＣＲ−反応は、双方のオリゴヌクレオチドの間にセグメントを複製し、 かつクローニングすることを可能にする。全部で、９６のＰＣＲ−反応が実施さ れ、その際、それぞれオリゴヌクレオチド基３１６と逆３１７もしくは逆３１６ と、３１７とを組合せた。それぞれの反応のために、ｃＤＮＡ−パッチの１／１ ０　（ＲＮＡ０．３ＩＬｇ）を使用した。このＰＣＲ−反応をパーキン−エルマ ー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社の装置（ＤＮＡ−Ｔｈｅｒｍｏ　Ｃｙｃｌｅ ｒ）で、４０サイクルで、それぞれ９５℃で２分、５０℃で２分及び７２℃で２ 分実施した。

オリゴヌクレオチド混合物３１６Ｂ： ５’　ＧＧＣＡＡＲＧＡＹＡＴＨＡＴＨＡＡＲＡＡＲＴＡ３’と３１７逆■： ５’　ＴＣＡＣＴＴＴＧＤＡＴＹＴＣＹＴＧＮＡＣＤＡＴ３’とを組合せて、５ ９０ｂｐ、の大きさのＤＮＡ−フラグメントが得られた。このフラグメントを調 合アガロースゲルから単離し、かつ５′−ホスフェート残基の付加（「キナーゼ 化Ｊ　；　Ｋｉｎａｓｉｅｒｅｎ）後に、クローニングベクターｐｕｃ１８のＳ ｍａｌ−切断位置中にクローニングすることができた。このクローンを、Ｄｅｓ ｔ−ｐ’ｃｒｌと称した。キメラプラスミドのＤＮＡを、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ 　ＣＭＫ　６０３）中で繁殖させ、かつ継代物（Ｐａｓｓａｇｉｅｒ）のＤＮＡ −配列をサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）法により測定することができた（配列表：配 列１３）。

ここで必要な方法は、サンブローク等の文献（１９８９）中に詳述されている。

配列１３は、ＤＮＡ−配列及びこれに属するタンパク質配列である。この配列は 、ペプチド１１の一部分で始まり、かつペプチド１の一部分で終わる。ヌクレオ チド３０７〜３３３の配列は、ペプチド９の暗号化である。

配列表 配列　ｌ： Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＡＳｎ 配列　２： 配列　３： 配列　４ 配列　５ 配列　６ 配列　７ 配列　８ １１ｅ　ｒｌｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｈａ　Ｓｅｒ配列　９ 配列　１２ 配列　１３ 国際調査報告 □□”’　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０１９９６国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　ＣＩ、５　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７１５４ 　８３１４−４ＣＣＯ７Ｋ　７１０６　Ｚ　８３１８−４Ｈ７１０８７５３７− ４Ｈ ＣＯ７Ｋ　９９：００ （７２）発明者　ケルヴアー、ヴオルフガングドイツ連邦共和国　デー−６７１ ８グリュンシュタット　アウフ　デム　ライメン　１０Ｉ （７２）発明者　シュトウルーベ、カールーヘルマンドイツ連邦共和国　デー− ６７２０シュバイアー　クルトーシュマッハーーシュトラーセ　４９アー （７２）発明者　ビアロヤシ、シークフリートドイツ連邦共和国　デー−６８３ ６オフタースハイム　ガルテンシュトラーセ　あ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．配列表中に記載の配列１〜１３を有し、かつε−（γ−グルタミル）−リジ ン−結合を切断するタンパク質並びにその突然変異タンパク質及び匹敵しうる作 用を有する天然変種。
2. ２．請求項１記載のタンパク質の製法において、これを公知遺伝子技術により製 造することを特徴とする、請求項１記載のタンパク質の製法。
3. ３．請求項１記載によるタンパク質のための暗号化されたＤＮＡ。
4. ４．疾病の予防に使用するための、請求項１記載のタンパク質。