JP3277227B2 - 血液凝固阻害ペプチドの製造法 - Google Patents
血液凝固阻害ペプチドの製造法Info
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- JP3277227B2 JP3277227B2 JP22072992A JP22072992A JP3277227B2 JP 3277227 B2 JP3277227 B2 JP 3277227B2 JP 22072992 A JP22072992 A JP 22072992A JP 22072992 A JP22072992 A JP 22072992A JP 3277227 B2 JP3277227 B2 JP 3277227B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は血液凝固阻害ペプチドの
製造法に関する。より詳細には、血栓症の治療・予防に
有用であり、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのアミノ酸配列か
らなる血液凝固阻害ペプチドの製造法に関する。
製造法に関する。より詳細には、血栓症の治療・予防に
有用であり、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのアミノ酸配列か
らなる血液凝固阻害ペプチドの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】生体内における血栓形成は、播種性血管
内凝固症候群（ＤＩＣ）、虚血性心疾患などの重篤な疾
患をもたらす。血栓は血管内で血液が凝固した状態であ
り、以下の過程で起こることが知られている。即ち、血
管内皮に損傷があるとその部分のコラーゲンに血小板が
凝集し、その過程で血液凝固過程が活性化され、血漿中
のフィブリノーゲン（血液凝固Ｉ因子）が繊維状のフィ
ブリンに転換し、フィブリン網を形成し、ここに赤血球
や白血球が取り込まれ強固な血栓となる。
内凝固症候群（ＤＩＣ）、虚血性心疾患などの重篤な疾
患をもたらす。血栓は血管内で血液が凝固した状態であ
り、以下の過程で起こることが知られている。即ち、血
管内皮に損傷があるとその部分のコラーゲンに血小板が
凝集し、その過程で血液凝固過程が活性化され、血漿中
のフィブリノーゲン（血液凝固Ｉ因子）が繊維状のフィ
ブリンに転換し、フィブリン網を形成し、ここに赤血球
や白血球が取り込まれ強固な血栓となる。
【０００３】より詳細には、フィブリノーゲンは分子量
約３４万の糖タンパク質であり、分子量がそれぞれ６．
５万、５．５万、４．７万のＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖の
３種類のサブユニットが互いにＳ−Ｓ結合により（Ａα
−Ｂβ−γ）2を形成している。フィブリノーゲンはＡ
α鎖とＢβ鎖のＮ末端Arg16-Gly17、Arg14-Gly15結合が
トロンビン（活性化ＩＩ因子）により加水分解され、そ
れぞれフィブリノペプチドＡとＢを遊離してフィブリン
に転ずる。この時、Ｎ末端領域に存在し、凝集に関与す
る反応基が露出し、フィブリノーゲンのＤ画分中の反応
基と結合してポリマーを形成し、ゲル化する。さらに、
活性化ＸＩＩＩ因子の作用によりγ鎖間の分子間架橋が
形成されフィブリンが安定化される。
約３４万の糖タンパク質であり、分子量がそれぞれ６．
５万、５．５万、４．７万のＡα鎖、Ｂβ鎖及びγ鎖の
３種類のサブユニットが互いにＳ−Ｓ結合により（Ａα
−Ｂβ−γ）2を形成している。フィブリノーゲンはＡ
α鎖とＢβ鎖のＮ末端Arg16-Gly17、Arg14-Gly15結合が
トロンビン（活性化ＩＩ因子）により加水分解され、そ
れぞれフィブリノペプチドＡとＢを遊離してフィブリン
に転ずる。この時、Ｎ末端領域に存在し、凝集に関与す
る反応基が露出し、フィブリノーゲンのＤ画分中の反応
基と結合してポリマーを形成し、ゲル化する。さらに、
活性化ＸＩＩＩ因子の作用によりγ鎖間の分子間架橋が
形成されフィブリンが安定化される。
【０００４】現在、血栓症の治療薬法としては、主とし
て３つの方法、即ち、血小板の凝集を阻害する方法；
フィブリンの凝集を阻害する方法；血栓を溶解する
方法が採用されている。このうちの血小板凝集阻害剤
としてはチクロビジン、シロスタゾールなどが、のフ
ィブリン凝集阻害剤としてはヘパリンなどが、の血栓
溶解剤としてはプラスミノーゲンアクチベーター、ウロ
キナーゼなどが知られている。また、医薬品としてのみ
ならず、日常の摂取を通して血栓症の予防などを図る機
能性食品も活発に研究されている。
て３つの方法、即ち、血小板の凝集を阻害する方法；
フィブリンの凝集を阻害する方法；血栓を溶解する
方法が採用されている。このうちの血小板凝集阻害剤
としてはチクロビジン、シロスタゾールなどが、のフ
ィブリン凝集阻害剤としてはヘパリンなどが、の血栓
溶解剤としてはプラスミノーゲンアクチベーター、ウロ
キナーゼなどが知られている。また、医薬品としてのみ
ならず、日常の摂取を通して血栓症の予防などを図る機
能性食品も活発に研究されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】高活性を有し且つ副作
用の少ない血栓症治療薬は常に求められており、Laudan
o & Doolittle はGly-Pro-Arg（フィブリノペプチドＡ
が遊離した後のフィブリンα鎖のＮ末端配列に相当す
る）及びGly-Pro-Arg-Proがフィブリンの凝集を阻害す
ることを報告している[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A., Vol.75, p3085 (1978), Biochemistry, Vol.19, p1
013(1980)]。また、フィブリノーゲンのフラグメントＤ
1由来のペプチドもフィブリンの凝集を阻害するとされ
ている(米国特許第4,455,290号)。上記のGly-Pro-Argは
優れたフィブリン凝集阻害作用を有し、構造的にも３つ
のアミノ酸からなるペプチドである。しかし、化学合成
により製造する場合には、保護基の付加・脱離、反応性
基の活性化などが必要であり、さらに立体構造を維持し
ながら反応させなければならないなど操作が煩雑であ
る。
用の少ない血栓症治療薬は常に求められており、Laudan
o & Doolittle はGly-Pro-Arg（フィブリノペプチドＡ
が遊離した後のフィブリンα鎖のＮ末端配列に相当す
る）及びGly-Pro-Arg-Proがフィブリンの凝集を阻害す
ることを報告している[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.
A., Vol.75, p3085 (1978), Biochemistry, Vol.19, p1
013(1980)]。また、フィブリノーゲンのフラグメントＤ
1由来のペプチドもフィブリンの凝集を阻害するとされ
ている(米国特許第4,455,290号)。上記のGly-Pro-Argは
優れたフィブリン凝集阻害作用を有し、構造的にも３つ
のアミノ酸からなるペプチドである。しかし、化学合成
により製造する場合には、保護基の付加・脱離、反応性
基の活性化などが必要であり、さらに立体構造を維持し
ながら反応させなければならないなど操作が煩雑であ
る。
【０００６】上記の問題に鑑みて、本発明者等はGly-Pr
o-Argを簡便且つ経済的に製造する方法を研究した結
果、安価に得られる天然タンパク質の１つであるコラー
ゲンには、Gly-Pro-Argの配列が１分子につき２０残基
程度含まれていることに着目し、コラーゲンからの上記
ペプチドを製造する方法を検討し、本発明を完成した。
即ち、哺乳動物のコラーゲンは、屠殺後の牛、豚などの
副産物として多量に回収することができ、また日常、食
肉などとして大量に消費されているタンパク質であり、
医薬、機能性食品などの原料として価格、安全性などの
面で極めて有利な物質である。コラーゲンは、Gly-Pro-
X(Xは任意のアミノ酸)の多数の繰返しにより構成され、
その中にはGly-Pro-Argの配列が１分子につき２０残基
程度含まれており、本発明者等はコラーゲンを酵素的に
加水分解することにより、Gly-Pro-Argを得ることがで
きることを見出した。本発明はかかる知見に基づいてな
されたもので、本発明はフィブリン凝集阻害活性を有す
るGly-Pro-Argの新規な製造法を提供することを目的と
する。なお、コラーゲン自体は、これまでも医療、化粧
品などの分野で多用されていたが、酵素加水分解による
コラーゲン由来ペプチドを実用化した例は知られていな
い。
o-Argを簡便且つ経済的に製造する方法を研究した結
果、安価に得られる天然タンパク質の１つであるコラー
ゲンには、Gly-Pro-Argの配列が１分子につき２０残基
程度含まれていることに着目し、コラーゲンからの上記
ペプチドを製造する方法を検討し、本発明を完成した。
即ち、哺乳動物のコラーゲンは、屠殺後の牛、豚などの
副産物として多量に回収することができ、また日常、食
肉などとして大量に消費されているタンパク質であり、
医薬、機能性食品などの原料として価格、安全性などの
面で極めて有利な物質である。コラーゲンは、Gly-Pro-
X(Xは任意のアミノ酸)の多数の繰返しにより構成され、
その中にはGly-Pro-Argの配列が１分子につき２０残基
程度含まれており、本発明者等はコラーゲンを酵素的に
加水分解することにより、Gly-Pro-Argを得ることがで
きることを見出した。本発明はかかる知見に基づいてな
されたもので、本発明はフィブリン凝集阻害活性を有す
るGly-Pro-Argの新規な製造法を提供することを目的と
する。なお、コラーゲン自体は、これまでも医療、化粧
品などの分野で多用されていたが、酵素加水分解による
コラーゲン由来ペプチドを実用化した例は知られていな
い。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の血液凝固阻害ペ
プチドの製造法は、コラーゲンを酵素的に加水分解し、
Gly-Pro-Argからなるペプチドを得ることからなる。上
記の構成からなる本発明において、出発原料として使用
されるコラーゲンは特に限定されず、例えば、豚皮、牛
皮の他、豚、牛、羊、モルモット、ラットなどの各種臓
器（胎盤等）、部位（結合組織、骨組織等）などに由来
するコラーゲンを用いることができる。また、使用され
る酵素としては、例えば、Clostridium histolyticum由
来又はAchromobacter iophagus由来のコラゲナーゼが挙
げられるが、種々の微生物から報告されている類似特異
性を有する酵素を利用することもできる。さらに、コラ
ゲナーゼの他に、トリプシン(類似特異性酵素を含む)と
アミノペプチターゼ(類似特異性酵素を含む)を組合せて
使用することもできる。好適には上記のコラゲナーゼが
使用され、コラゲナーゼは、コラーゲン分子中のGly-Pr
o-Xの繰返し配列のうち、Glyのアミノ基側ペプチド結合
を特異的に加水分解する性質を有することから、コラー
ゲン分子からGly-Pro-Xを容易に遊離させることができ
る。
プチドの製造法は、コラーゲンを酵素的に加水分解し、
Gly-Pro-Argからなるペプチドを得ることからなる。上
記の構成からなる本発明において、出発原料として使用
されるコラーゲンは特に限定されず、例えば、豚皮、牛
皮の他、豚、牛、羊、モルモット、ラットなどの各種臓
器（胎盤等）、部位（結合組織、骨組織等）などに由来
するコラーゲンを用いることができる。また、使用され
る酵素としては、例えば、Clostridium histolyticum由
来又はAchromobacter iophagus由来のコラゲナーゼが挙
げられるが、種々の微生物から報告されている類似特異
性を有する酵素を利用することもできる。さらに、コラ
ゲナーゼの他に、トリプシン(類似特異性酵素を含む)と
アミノペプチターゼ(類似特異性酵素を含む)を組合せて
使用することもできる。好適には上記のコラゲナーゼが
使用され、コラゲナーゼは、コラーゲン分子中のGly-Pr
o-Xの繰返し配列のうち、Glyのアミノ基側ペプチド結合
を特異的に加水分解する性質を有することから、コラー
ゲン分子からGly-Pro-Xを容易に遊離させることができ
る。
【０００８】コラーゲンと酵素の反応は、使用する酵素
の種類などに応じて、適宜の条件下で行うことができる
が、例えば、酵素としてコラゲナーゼを用いる場合、コ
ラーゲンを、適当な緩衝液（例えば、Tris-HCl pH7.2）
中、コラゲナーゼの存在下、室温〜加温下、好ましくは
３７℃程度で、１０〜２４時間程度、好ましくは１８時
間程度加水分解することにより行われる。なお、反応系
には、必要に応じて、酵素の活性化剤として、金属イオ
ンなどを添加してもよい。酵素の使用量は、コラーゲン
の仕込み量、反応温度などに応じて適宜調整される。酵
素反応液からのGly-Pro-Argの分離・精製は、ペプチド
の分離・精製に用いられる慣用の手段で行うことができ
る。例えば、酵素反応終了後、加熱処理（例えば、１０
０℃、１５分程度）して酵素を不活化した後、濾過、遠
心分離などの適当な手段で固液分離し、得られる液を限
外濾過、逆浸透、ゲル濾過などの分離処理に付して高分
子物質（例えば、分子量４００より大の物質）を除去し
た後、カラムクロマトグラフィー［例えば、ＳＰ−セフ
ァデックスＣ２５カラム（ファルマシア社製）等］、高
速液体クロマトグラフィー［例えば、ＣＭ Memsep 101
0(ミリポア社製)、LiChrosorb RP-Select-B(メルク社
製)等］などの手段を用いて分離・精製してGly-Pro-Arg
を得ることができる。本発明の方法により得られたGly-
Pro-Argは、前述のようにフィブリン凝集阻害作用を有
しており、医薬品、機能性食品などとして利用される。
の種類などに応じて、適宜の条件下で行うことができる
が、例えば、酵素としてコラゲナーゼを用いる場合、コ
ラーゲンを、適当な緩衝液（例えば、Tris-HCl pH7.2）
中、コラゲナーゼの存在下、室温〜加温下、好ましくは
３７℃程度で、１０〜２４時間程度、好ましくは１８時
間程度加水分解することにより行われる。なお、反応系
には、必要に応じて、酵素の活性化剤として、金属イオ
ンなどを添加してもよい。酵素の使用量は、コラーゲン
の仕込み量、反応温度などに応じて適宜調整される。酵
素反応液からのGly-Pro-Argの分離・精製は、ペプチド
の分離・精製に用いられる慣用の手段で行うことができ
る。例えば、酵素反応終了後、加熱処理（例えば、１０
０℃、１５分程度）して酵素を不活化した後、濾過、遠
心分離などの適当な手段で固液分離し、得られる液を限
外濾過、逆浸透、ゲル濾過などの分離処理に付して高分
子物質（例えば、分子量４００より大の物質）を除去し
た後、カラムクロマトグラフィー［例えば、ＳＰ−セフ
ァデックスＣ２５カラム（ファルマシア社製）等］、高
速液体クロマトグラフィー［例えば、ＣＭ Memsep 101
0(ミリポア社製)、LiChrosorb RP-Select-B(メルク社
製)等］などの手段を用いて分離・精製してGly-Pro-Arg
を得ることができる。本発明の方法により得られたGly-
Pro-Argは、前述のようにフィブリン凝集阻害作用を有
しており、医薬品、機能性食品などとして利用される。
【０００９】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて説明する
が、本発明は実施例に限定されるものではない。 実施例１コラーゲンからのGly-Pro-Argの製造 豚皮由来コラーゲン３ｇを１２０ｍｌの緩衝液（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．２，１００ｍＭ ＣａＣ
ｌ2）に分散させ、これにClostridium histolyticum由
来のコラゲナーゼ(シグマ社製)３．６万ユニットを添加
し、３７℃、１８時間、撹拌しながら反応させた。つい
で、１１０℃、１５分間加熱処理した後、反応液をアミ
コン社製限外濾過膜（ＰＭ−１０）（分画分子量１万）
に通して精製し、分子量１万以上の高分子物質を除去し
た水溶液を得た。更に、本水溶液をミリポア社製逆浸透
膜（分画分子量４００）に通して分子量４００以下のペ
プチドを回収した。回収したペプチド水溶液は高速液ク
ロ装置に装着したミリポア社製ＣＭ ＭｅｍＳｅｐ １
０１０カートリッジに添加し、０〜０．５Ｍの塩化ナト
リウムのグラジエントで溶出し、化学合成したGly-Pro-
Argと同一のリテンションタイムのピークを回収した。
回収したGly-Pro-Arg含有フラクションは濃縮後、メル
ク社製LiChrosorb RP-Select Bカラムに添加し、０．１
％トリフルオロ酢酸存在下、７から６３％のアセトニト
リルのグラジエントで溶出し精製した。回収したGly-Pr
o-Argの溶液は、減圧乾固し最終標品とした。本標品の
一部をメタンスルホン酸の存在下、１１０℃で２４時間
加水分解した後、日立８３５型アミノ酸分析計にてアミ
ノ酸組成を分析した。その結果、Gly(1)、Pro(0.7)、Ar
g(0.8)であり、理論値とほぼ一致した。
が、本発明は実施例に限定されるものではない。 実施例１コラーゲンからのGly-Pro-Argの製造 豚皮由来コラーゲン３ｇを１２０ｍｌの緩衝液（５０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．２，１００ｍＭ ＣａＣ
ｌ2）に分散させ、これにClostridium histolyticum由
来のコラゲナーゼ(シグマ社製)３．６万ユニットを添加
し、３７℃、１８時間、撹拌しながら反応させた。つい
で、１１０℃、１５分間加熱処理した後、反応液をアミ
コン社製限外濾過膜（ＰＭ−１０）（分画分子量１万）
に通して精製し、分子量１万以上の高分子物質を除去し
た水溶液を得た。更に、本水溶液をミリポア社製逆浸透
膜（分画分子量４００）に通して分子量４００以下のペ
プチドを回収した。回収したペプチド水溶液は高速液ク
ロ装置に装着したミリポア社製ＣＭ ＭｅｍＳｅｐ １
０１０カートリッジに添加し、０〜０．５Ｍの塩化ナト
リウムのグラジエントで溶出し、化学合成したGly-Pro-
Argと同一のリテンションタイムのピークを回収した。
回収したGly-Pro-Arg含有フラクションは濃縮後、メル
ク社製LiChrosorb RP-Select Bカラムに添加し、０．１
％トリフルオロ酢酸存在下、７から６３％のアセトニト
リルのグラジエントで溶出し精製した。回収したGly-Pr
o-Argの溶液は、減圧乾固し最終標品とした。本標品の
一部をメタンスルホン酸の存在下、１１０℃で２４時間
加水分解した後、日立８３５型アミノ酸分析計にてアミ
ノ酸組成を分析した。その結果、Gly(1)、Pro(0.7)、Ar
g(0.8)であり、理論値とほぼ一致した。
【００１０】
【発明の効果】本発明の製造法においては、天然高分子
であり且つ安価なコラーゲンを原料としてGly-Pro-Arg
を得ることができる。従って、本発明によれば、血液凝
固阻害ペプチドであるGly-Pro-Argを化学合成によら
ず、安全且つ廉価に大量生産することが可能となる。
であり且つ安価なコラーゲンを原料としてGly-Pro-Arg
を得ることができる。従って、本発明によれば、血液凝
固阻害ペプチドであるGly-Pro-Argを化学合成によら
ず、安全且つ廉価に大量生産することが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 秀興 茨城県つくば市東１丁目１番３号 通商 産業省工業技術院微生物工業技術研究所 内 (72)発明者 前田 英勝 茨城県つくば市東１丁目１番３号 通商 産業省工業技術院微生物工業技術研究所 内 (72)発明者 野仲 功 茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番 日本 ハム株式会社中央研究所内 (72)発明者 羽多 實 茨城県つくば市緑ケ原３丁目３番 日本 ハム株式会社中央研究所内 審査官 本間 夏子 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ ｃｔａ（1985）Ｖｏｌ．1164，Ｎｏ. ２，ｐ．215−218 Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ ｃｔａ（1985）Ｖｏｌ．955，Ｎｏ．１, ｐ．43−49 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 コラーゲンを酵素的に加水分解し、Ｇ
ｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇからなるペプチドを得ることを特
徴とする血液凝固阻害ペプチドの製造法。 - 【請求項２】 酵素が、Clostridium histolyticum由
来又はAchromobacter iophagus由来のコラゲナーゼであ
る請求項１記載の血液凝固阻害ペプチドの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22072992A JP3277227B2 (ja) | 1992-07-28 | 1992-07-28 | 血液凝固阻害ペプチドの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22072992A JP3277227B2 (ja) | 1992-07-28 | 1992-07-28 | 血液凝固阻害ペプチドの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0646875A JPH0646875A (ja) | 1994-02-22 |
| JP3277227B2 true JP3277227B2 (ja) | 2002-04-22 |
Family
ID=16755613
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22072992A Expired - Lifetime JP3277227B2 (ja) | 1992-07-28 | 1992-07-28 | 血液凝固阻害ペプチドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3277227B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3343712B2 (ja) * | 1995-12-27 | 2002-11-11 | 宮城化学工業株式会社 | 非抗原性安定化剤および生理活性物質 |
| JP4033877B2 (ja) | 2005-09-29 | 2008-01-16 | 株式会社ファンケル | Ｉ型コラーゲン産生促進用組成物 |
| JP2009284798A (ja) * | 2008-05-28 | 2009-12-10 | Uha Mikakuto Co Ltd | ジペプチジルペプチダーゼｉｖ阻害剤の製造方法 |
-
1992
- 1992-07-28 JP JP22072992A patent/JP3277227B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８５）Ｖｏｌ．１１６４，Ｎｏ．２，ｐ．２１５−２１８ |
| Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８５）Ｖｏｌ．９５５，Ｎｏ．１，ｐ．４３−４９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0646875A (ja) | 1994-02-22 |
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Legal Events
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