JPH03501685A - ウロキナーゼ誘導体の製造方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ウロキナーゼ誘導体の製造方法 交」光」 本発明は、ウロキナーゼ誘導体の新規な製造方法に係る。

九豆血１１ 血液凝固過程は一連の自己触媒反応から成り、最後にフィブリン網が形成される 。フィブリンは血餅（凝固血栓〉の中核部分を成す不溶性タンパク質である。血 餅形成過程では、まずフィブリン（Ｉ！維素）が形成され、次いで血小板、白血 球及び赤血球のごとき他の血液成分を取り込んで集塊が形成される。この血液成 分の集塊は血栓と呼ばれており、血栓の形成もしくは成長が生じた状態または血 栓の存在する状態を血栓症という。

トロンビンは正常な凝血の際にプロトロンビンから誘導される酵素であり、トロ ンビンのタンパク質分解作用によってフィブリノーゲンからフィブリンが形成さ れる。血管または体細胞が損傷されると、プロトロンビンをトロンビンに変換す るプロトロンビン活性化因子が遊離される。トロンビンはいくつかの補助因子の 存在下に可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリンに転換する。例えば、血管 が破れると、粗面が発生し、この面に血小板が粘着して傷口を一部閉鎖する。こ れがプロトロンビン活性化因子の増殖を開始させる。プロトロンビン活性化因子 がプロトロンビンをトロンビンに変換し、次にトロンビンがフィブリノーゲンを フィブリンに転換し、不溶性タンパク質であるフィブリン網が血餅を形成する。

止血機能を果たしたフィブリンは通常は消化されて可溶性産物となる。

プラスミンは血栓溶解系、即ち血餅溶解系の活性部分であり、高いフィブリン特 異性を有する。血液中に存在するプラスミノーゲンはその活性化因子例えば尿の プラスミノーゲン活性化因子（ｕ−Ｐ＾）に触媒される反応によってプラスミン に転換される。

高分子量形のヒト尿の活性化因子は、フィブリン結合親和性が低く、クリングル ドメイン、即ち配列相同領域を１個有する。　Ｐｅｎｎ１ｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ）、３０１．２１４〜２２１（１９８３）、実際、高分子量形の ヒト尿の活性化因子即ちウロキナーゼ（ＵＫＩ）は、フィブリンまたはフィブリ ノーゲンに対する特異的親和性を全く示さない。

ネイティブな即ち天然のヒト高分子量ＵＫＩは、腎臓で合成され尿に排泄される セリンプロテアーゼである。ヒト組織からは主として２つの分子量形のｔｌＫｌ が単離されその特性が決定された。即ち、高分子量形は分子量約５４，０００ダ ルトン、低分子量形は分子量約３１，０００ダルトンを有していた。

高分子量ｕＫ１は尿中に主として存在する天然の形態であり、低分子量ＵＫＩは 高分子量ｔｌＫ１が酵素によって分解された形態であると考えられる。双方のＵ ＫＩとも、１個のジスルフィド結合によって結合された２本の鎖を含むことが知 見されＮＯ３−末端側即ちＡ鎖は、プラスミノーゲンクリングルとほぼ相同の単 一クリングルドメインを有し、酵素の活性中心はＣＯＯト末端側即ちＢ鎖に局在 する。　Ｒｏｂｂｉｎｓ他、Ｂｉｏｅｈｅ−ｍｉｓｔｒｙ、　２５．３６０３〜 ３６１１（１９８６）。

本文中では、非天然形の（ｎｏｔｒｎａｔｉｖｅ）ウロキナーゼをＵＫ２と総称 する。慣行により高分子量ＵＫＩにおいての順番で表現して、ウロキナーゼ分子 のＮＨ２末端から夫々１５８位及び１５９位のリジン（Ｌｙｓ）とイソロイシン （Ｉｌｅ）との間で開裂が生じ、２本鎖ウロキナーゼ（ＵＫＺ＋）を形成し得る 。２本の鎖は１４８位のシスティン（Ｃｙｓ）と２７９位のシスティン（Ｃｙｓ ）との間に存在するジスルフィド結合１個によって互いに結合されている。この ＵＫＺ形は高分子量ＬＩＫＩよりも発色性基質に対して活性である。しかしなが ら、プラスミノーゲン結合性も大きい、　Ｌｉｊｎｅｎ他、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、、　２６１．１２５３〜１２５８（１９８６）：Ｃｏｌ　ｆｅｎ他、 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、２６１．　１２５９−１２６６（１９８６）　、 高分子量ウロキナーゼを１３５位のＬｙｓの後で開裂することによってより小さ い形態のυに２２が形成され得る。

また別の形態のＵＫ２．は、高分子量ＵＫＩの１４４位のロイシン（Ｌｅｕ）か ら始まって１５７位及び１５８位の２つのアミノ酸即ちフェニルアラニン（Ｐｈ ｅ）及びＬｙｓが欠失した分子鎖を含む。

間のジスルフィド結合１個によって互いに結合されている。

即ち、２本の鎖は、、１４４位から１５６位までの１３個の残基を含む短いＡ鎖 と、１５９位から始まりほぼ４１１位にｃｏｏｎ＝末端を有し酵素の活性中心を 含む長いＢ鎖とから成る０本文中で以後Ａペプチド断片と指称する１３残基のペ プチドは、アミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｂｅ−［；１ｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ− Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−＾ｒｇ−Ｐｒｏ−＾ｒｇを有する。ＵＫ２． 形のウロキナーゼは市販されており、＾ｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ によって登録商標「＾ＢＢＯＫ　ＩＮＡＳＥＪとして販売されている。

即ちＢｌに局在する活性中心とを保持している。υに２形のウロキナーゼはまた 、フィブリンまたはフィブリノーゲンに対する特異的親和性を全く有していない 。

心筋梗塞、深静脈血栓症及び肺動脈塞栓症で生じる血栓を溶解するために、現行 の臨床療法では１ＪＫ２を使用して血液中の線維素溶解（ｔｉ溶）系を活性化さ せる方法をしばしば用いる。この全身性活性化によってフィブリノーゲンが分解 され循環プラスミノーゲン及びその他の血液凝固因子が減少する。　Ｖｅｒｓｔ ｒａｅｔｅ、　Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ、　１８５〜２００．　ＣＲＣＰｒｅ ｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　ＦＬ＜１９８０）。プラスミノーゲンは活性 酵素プラスミンに転換される。プラスミンが血液中を自由に循環していると全身 性活性化が促進され、従って、フィブリノーゲンも含めて多数のタンパク質が分 解される。プラスミノーゲンの全身性活性化の理由は、ウロキナーゼがプラスミ ノーゲンに対して常に特異的結合親和性を有しており血栓の部位に存在するフィ ブリンに対しては特異性を有していないことにある。Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ、　 Ｆｉｂｒ’ｎｏｌ　ｓ’ｓ。

１８５〜２００．　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｅａ　Ｒａｔｏｎ、　ＦＬ（１９ ８０）、全身性線維素分解状態が著しく且つフィブリノーゲンレベルが極めて低 いと大出血の危険がある。　Ｃｏ１１ｅｎ他、Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ。

７４、８３８〜８４２（１９８６）。

従って、全身性合併症を抑制し大出血の危険を減らすために、特異的血栓結合性 を有する合成ペプチドをｕ−ＰＡ型ラウロキナーゼ組み込むことが望まれている 。

従来技術でも、ウロキナーゼ誘導体に血栓結合性を与えることが試みられた。触 媒作用を有するＵＫの残基のカルボキシル末端ドメインを、還元プラスミンから 回収されたプラスミンのアミン末端クリングル領域と結合させた。２つの成分の 混合物を酸化させ、ハイブリッドを単離した。

Ｒｏｂｂｉｎｓ他、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５．　３６０３〜３６１ １（１９８６）。

Ｓｕ＋ｅｉ等は、高分子量ウロキナーゼ（ＵＫＩ）を２−メルカプトエタノール で穏やかに還元しカルボキシメチル化することによって機能的に活性の２本の鎖 、即ちＨ鎖とＬ鎖とを形成する方法を発表した（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

２５８、８０１４〜８０１９（１９８３））、この方法では、結合ジスルフィド 架橋が１つだけ還元される。

大腸菌で発現された組換え高分子量１本鎖ウロキナーゼを、グルタチオン触媒系 を用いて再フォールドする方法も試行された。　Ｍｉｎｋｌｅｒ　＆　Ｂｌａｂ ｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５．４０４１〜４０４５　（１９８６ ）。この還元−再酸化過程は緩慢であり、グアニジンの存在下に４８時間を要し 、得られる収率は低い。

Ｍａｋｓ　ｉｍｅｎｋｏ等の方法（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 　３８．２７７〜２８８　（１９８５））では、非還元低分子量ウロキナーゼに 対するヘパリンの結合をカルボジイミドで促進することによってヘパリン−ウロ キナーゼ誘導体を形成した。

Ｍａｋｓ　ｉｍｅｎｋｏ等はまた、カルボジイミドで活性化した低分子量２本鎖 ウロキナーゼに脂肪族ジアミンのスペーサーを介してフィブリノーゲンを付着さ せることによって別のウロキナーゼ誘導体をＸ成した（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。３８゜２８９〜２９５（１９８５））。

ｌｉへｌｉ 本発明は、ウロキナーゼ誘導体の製造方法に係る。前記のごとく定義しＵＫ２　 、ど命名したウロキナーゼのＡペプチド断片（高分子量ウロキナーゼ中の１４４ 位がら１５６位までに対応する２本鎖ウロキナーゼ分子の１３残基がら成る断片 ）をまず除去し、所望のスルフヒドリル含有化合物例えばスルフヒドリルを含有 する合成の前記Ａペプチドを酸化によって結合し構造を復元する。

本発明では説明の便宜上、種々の普通アミノ酸を示すためにペプチド業界で常用 の以下の略号を用いる。

アミノ酸　３文字記号　１文字記号 アラニン　Ａｌａ　Ａ アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　八ｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　八ｓｐ　ｌ） システィン　Ｃｙｓ　（ グルタミン　Ｇｌｎ　Ｑ グルタミンａに　ｌ　ｕ　Ｅ グリシン　Ｇｌ、　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ イソロイシン　Ｉｌｅ　Ｉ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ トリプトファン　Ｔｒｐ　Ｈ チロシン　Ｔｙｒ　Ｙ バリン　Ｖａｌ　Ｖ 本文中で使用された「原（親）ウロキナーゼ分子」なる用語は、ジスルフィド結 合１個によって小さい非触媒ペプチド鎖（Ａ）！７ｒ片に結合された触媒活性の 大きいポリペプチド鎖を有する低分子量ウロキナーゼ分子を意味する。ここで例 示された原ウロキナーゼはυに２．であり、これは前記に定義したように、高分 子量ＵＫＩの１４４位のロイシン（Ｌｅｕ）に始まり２つのアミノ酸即ち１５７ 位のＰｈｅ及び１５８位のＬｙｓが欠失し間のジスルフィド結合１個によって互 いに結合されている。

２本の鎖は１４４位から１５６位の１３残基のペプチドを含む短いＡｌと、１５ ９位に始まりほぼ４１１位にＣＯＯ［（−末端を有する長いＢ鎖とから成る。

本文中で使用された「スルフヒドリル含有化合物」または「スルフヒドリル含有 基を有する化合物」なる用語は、チオール化合物、システィン含有ペプチドまた はタンパク質並びにスルフヒドリル含有ペプチドのごとく少なくとも１つのＳｔ （基を有する化合物である。スルフヒドリル含有化合物は天然産生物でもよくま たは当業者に公知の技術のいずれかによって合成されたものでもよい。

本文中で使用された「合成ペプチド」なる用語は、所望の特性、例えばヒト血栓 中に存在する諸成分に対する特異的血栓結合能を示すスルフヒドリル含有ペプチ ドを意味する。

本文中で使用された「合成Ａペプチド」なる用語は、ウロキナーゼ分子から遊離 されたＡペプチド断片に置換されるべき合成Ａペプチドを意味する。

本文中で使用された「還元剤」なる用語は、クリ−ランド試薬のような生化学反 応でタンパク質及び酵素に対して使用される公知の還元剤を意味する。当業者は 適当な還元剤を容易に確認できる。適当な還元剤の例として特にメルカプトエタ ノール及びジうオドレイトール（ＤＴＴ）がある０本発明では還元剤としてＤＴ Ｔを使用するのが好ましル）。

本発明の合成ペプチドは、当業者に公知の任意の方法によって合成され得る。固 相ペプチド合成に関しては、Ｊ、　Ｍ。

Ｓｔｅｗａｒｔ　＆　Ｊ、　Ｄ、　Ｙｏｕｎｇの５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ 　ｔ±ｄｅ　Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ。

Ｈ，Ｈ，Ｆｒｅｅａａｎ　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９６３） に多くの方法が概説されている。従来の溶液合成に関しては、Ｇ、　５ｃｈｒｏ ｄｅｒ＆　Ｋ、ＬｕｐｋｅのＴｈｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅｓ、ｖｏｌ、１．　Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｕ＋Ｙｏｒｋ（１９６５）を参照するとよい。

これらの方法では概して、１つ以上のアミノ酸または適宜保護されたアミノ酸を 順次に付加してペプチド鎖を成長させる０通常は、第１アミノ酸のアミノ基また はカルボキシル基を適当な保護基で保護する３次に、保護された誘導体形のアミ ノ酸を不活性固体担体に付着させるかまたは溶液中に維持し、アミド結合の形成 に適した条件下で直後に配列すべきアミノ酸を付加する。付加されるアミノ酸は 適宜保護された相補（アミンまたはカルボキシル）基を有している０次いで、こ の新しく付加されたアミノ酸残基から保護基を除去し、（適宜保護された）その 次のアミノ酸を付加する。この手順を順次継続する。所望の全部のアミノ酸を適 正配列に結合した後で、残留する保護基（及び任意の固体担体）を順次または同 時に除去して最終ポリペプチドを得る。この一般手順を簡単に修正して成長鋳に 同時に２つ以上のアミノ酸を付加することも可能である０例えば、保護されたト リペプチドと適宜保護されたジペプチドとを（キラル中心のラセミ化が生じない 条件下に）結合させ、脱保護後にペンタペプチドを得ることが可能である。

本発明の合成ペプチドの製造では、同相ペプチド合成を使用する方法が特に好ま しい、この方法を使用すると、アミノ酸のαアミノ官能基が酸または塩基感受性 基によって保護される。かかる保護基は、ペプチド結合形成の際の条件に対して 安定であり、同時に成長ペプチド鎖の破壊または該ペプチド鎖に内在するキラル 中心のラセミ化を生じることなく容易に除去され得るという特性を有していなけ ればならない。適当な保護基の例は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、 ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニ ル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、（α、α） −ジメチル−３゜５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、０−ニトロフェニ ルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニル メチルオキシカルボニル等である。ｅｏｃ保護基が好ましい。

固相ペプチド合成方法においてはＣ末端アミノ酸を適当な固体担体に付着させる 。この合成に有用な適当な固体担体は、段階的縮合−脱保護反応の試薬及び反応 条件に不活性であり、使用溶媒に不溶な物質から成る。適当な担体の例は、クロ ロメチルポリスチレンージビニルベンゼンポリマー、ヒドロキシメチルーポリス チレンージビニルベンゼンポリマー等である。

保護されたアミノ酸の順次結合は、当業界でよく知られた自動ポリペプチドシン セサイザーで行なう、α−Ｎ−保護基の除去は、例えばトリフルオロ酢酸のメチ レンクロリド溶液、塩酸のジオキサン溶液、塩酸の酢酸溶液またはその他の強酸 溶液中で行なう。保護されたアミノ酸の各々を、好ましくは約３．５モル過剰の ０．４Ｈ濃度にて導入し、ジクロロメタン、ジクロロメタン／ＤＭＦ混合物、Ｄ ＭＦのごとき溶媒中で結合させる。特にほぼ周囲温度のメチレンクロリドが好ま しい、結合剤の例は、ジクロロメタン中のＤＣＣ１単独もしくは）ｌＯＢｔの存 在下のＮ、Ｎ’−ジ−イソプロピルカルボジイミド（ＤＬＩＣ）もしくはその他 のカルボジイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、その他のＮ−ヒドロキシイ ミドまたはオキシム、並びに対称無水物である。

固相合成の終わりに、完全に保護されたポリペプチドを樹脂から分離する。樹脂 担体に対する結合がベンジルエステル型結合である場合は、プロリンＣ末端をも つペプチドに対してはアルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンによるアミ ツリシスで開裂し、グリシンＣ末端をもつペプチドに対しては例えばアンモニア ／メタノールまたはアンモニア／エタノールによるアミツリシスで開裂する。こ の際、温度は約り０℃〜約５０℃である。または、例えばメタノールとのエステ ル交換反応及びアミツリシスを順次行なうか、または直接アミド交換反応を行な ってペプチドを樹脂から分離してもよい、保護されているペプチドをここでシリ カゲルクロマトグラフィーで精製してもよく、または次の段階に直接移行させて もよい。ポリペプチドから側鎖保護基を除去するためには、アミツリシス産物を 例えばアニソール及びジメチルホスファイトまたはその他のカルボニウムスカベ ンジャーの存在下に無水液体フッ化水素で処理する。フッ化水素処理は、温度約 −１０℃〜約＋１０℃で約１５分間〜１時間行なう。

完全に脱保護されたポリペプチドを以下の一連のクロマトグラフィー処理のいず れかまたは全部を用いて精製する。

酢酸塩形の弱塩基性樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィー、非誘導体化ポ リスチレン−ジビニルベンゼン（例えばＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＸＡＤ）を用いた 疎水性吸着クロマトグラフィー、シリカゲル吸着クロマトグラフィー、カルボキ シメチルセルロースを用いたイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ　ｅ　ｐ　ｂ　 ａ　ｄ　ｅ　ｘＣ−２５、ＬＨ−２０または向流分配を用いた分配クロマトグラ フィー、高性能液体クロマトグラフィー（ＥＩＰＬＣ）、特にオフチロールオク タデシルシリル−シリカ結合相をカラムに充填しな逆相ＨＰＬＣ。

一般には、原ＵＫ２．をアルギニンで希釈し還元する。系に過剰の合成Ａペプチ ドを添加し、反応を進行させて合成Ａペプチドをウロキナーゼ分子に組み込む、 その後、ウロキナーゼ誘導体を単離し得る。

緩衝液中の原ｔｌＫ２．を、ウロキナーゼ分子を最大まで飽和させるに十分な量 即ち約７０ｍＭ〜約２５０ｍＭのアルギニンで希釈する。より詳細に後述するご とく、アルギニンの添加はウロキナーゼ分子を安定させジスルフィド架橋の過還 元を防止する。

ちの３つを還元するために、約１ｍ１１〜約２５−１好ましくは約２．５ｍＭ〜 約２０１１ＩＭの還元剤を系に添加する。より詳細に後述するごとく、還元剤の 濃度が約１ｍＭ〜約２５ｍＭの範囲内においてはウロキナーゼ誘導体の処理結果 が還元剤の濃度に左右されない、言い替えると、還元剤の濃度の増加はウロキナ ーゼの還元速度を促進するが、得られるウロキナーゼ誘導体には影響を与えない 。

は２〜４時間で還元した後、例えば５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ　６（１０００ＨＣＯ ）透析管を使用し透析によって還元剤を除去し得る。還元剤が除去されると、２ つのジスルフィド架橋が酸化され構造が天然立体配座に再生する。天然立体配座 に再生する段階は、正しいジスルフィド架橋の形成を補助し、ウロキナーゼ誘導 体に所望の生物学的親和性を与えるために必要である。

還元剤を除去した後に、合成Ａペプチドのごときスルフヒドリル含有化合物を系 に添加し、所望のウロキナーゼ誘導体を形成する反応を進行させる０例えばウロ キナーゼのアミド分解活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を測定 することによってジスルフィド架橋の還元の程度を決定し得る。トリペプチドウ ロキナーゼの発色性基質Ｌ−ピログルタミルグリシル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニ トロアニリド（Ｓ−２４４４）に対するアミド分解活性は、還元中にはジスルフ ィド架橋の還元によって減少し、還元剤の除去中にはジスルフィド架橋の再形成 によって増加する。還元ＵＫ２．のアミド分解活性を好ましくは原ＵＫ２．のア ミド分解活性の約５％〜約２５％、より好ましくは約１５％〜約２５％、最も好 ましくは約２０％の値まで減少させる。還元ＵＫ２３のアミド分解活性が原ＵＫ ２コのアミド分解乙 活性の約５％〜約２５％の値まで低下したとき、５つのジスルフィド架橋のうち の３つが還元されている。

または、ウロキナーゼのアミド分解活性が原ＵＫ２．の約５％〜約２５％の値に 低下するまでアルギニンの存在下にウロキナーゼを還元し、透析処理の開始の際 または透析処理中に合成Ａペプチドを添加してもよい。

環ウロキナーゼ濃度に比較して、１５〜３０モル過剰、好ましくは３０モル過剰 の合成Ａペプチドを系に添加する０合成Ａペプチドと還元ウロキナーゼとの衝突 頻度を最大にし且つウロキナーゼ誘導体の回収を最大にするためには３０モル過 剰の合成Ａペプチドが好ましい。約１時間後に例えばゲル濾過樹脂のごとき分子 篩材料を収容したカラムに通してウロキナーゼ誘導体を単離し得る。適当な分子 篩材料は０．１Ｍリン酸塩ｐＨ７で平衡させたＧ−７５型５ｅｐｈａｄｅｘゲル である。

例えばＨｏｌｍｂｅｒｇ等によってＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔ ａ、４４５．２１５〜２２２（１９７６）に記載されているように、市販のＵＫ ２．調製物をｐ−アミノベンズアミジン＝Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに吸着させること によって更に精製し得る。０．４ＨのＮａＣｆ１０．ＩＭのリン酸塩（ｐＨ７， ０）によって平衡させたカラムにタンパク質を吸着させ、０．４ＨのＮａＣ１， ０，１Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ４，０で溶出させる。

また、９℃で数箇月間保存したＵＫ２．は、還元及び酸化段階後のアミド分解活 性が低下した誘導体を与えることが知見された。対照的に、新しく単離され凍結 乾燥して保存されたＵＫ２．を使用すると、８０％を上回るアミド分解活性を有 するウロキナーゼ誘導体が得られた。

使用されるバッファに厳密な制約はなく、当業者は適当なバッファを容易に確認 できる。使用可能なバッファの例は、酢酸ナトリウム、ＥＤＴ＾、リン酸塩等で ある。中性バッファは、低ｐｎまたは高ｐＨのバッファに比較して、立体配座に 及ぼす影響が小さく、従ってタンパク質構造の安定性に及ぼす影響が小さい、更 に、当業界では一般に、還元には中性１１Ｆ＋がより有効であると考えられてい る。従って、好ましくはｐＨ範囲約５．０〜約８．０のバッファ、より好ましく はｐＩＩ約７のリン酸塩のごときバッファを使用する。

アルギニンは、３つのジスルフィド架橋に限定されたジスルフィド還元が生じた ウロキナーゼ分子を安定させるために使用される。還元剤の濃度を増加させると 、Ａペプチド断片の遊離速度が促進されるが、所与の還元剤濃度ではアルギニン がＡペプチド断片が減量するほどペプチド遊離を遅らせる作用を果たす、更に、 アルギニンを使用しない場合には、還元後のウロキナーゼのアミド分解活性が十 分に回復しない。

アルギニンのｆ＆適濃度は、ディクソンプロットから計算されるウロキナーゼ阻 害の見掛けＫｉ値によって概算できる。

Ｄｉｘｏｎ、　Ｍ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、、　５５．１７０〜１７１（１ ９５３）、　）リペプチドウロキナーゼの発色性基質Ｌ−ピログルタミルグリシ ル−Ｌ−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２４４４）を使用すると、見掛 けＫｉ値は７０ｍＭである（７点回帰係数ｒは０．９８）、ウロキナーゼ分子を 飽和させる最小必要濃度は見掛けＫｉ値７０１以上の濃度である０選択されたア ルギニン濃度がウロキナーゼ分子を最大まで飽和させ、前述のごときジスルフィ ド架橋の過還元を防止する効果を与えるのが好ましい、従って、望ましいアルギ ニンの濃度は、約７０ｍＭ〜約２５０ＩＩＭ、好ましくは約２５０＋ｅＭである 。

還元剤の濃度が増加すると、ウロキナーゼ分子の還元速度が促進され、Ａペプチ ド断片の遊離速度が促進される。

例えば、アルギニンの存在下にＤＴＴ濃度１ｍＭ〜２０−Ｈに調整されたリン酸 塩バッファ（ｐＨ７）中のウロキナーゼ溶液（ｂａｙ／ｉ１）は、ＤＴＴ濃度の 増加がペプチド遊離の速度を増加させることを示す、しかしながら°、前述のご とくアルギニンの存在下では、種々の還元剤濃度におけるアミド分解活性の低下 がＡペプチド断片の減量に対応する。従って、還元剤の濃度を変化させると、還 元速度は変化するが、還元可能な５つのジスルフィド架橋のうちの３つに限定さ れた還元が生じる。

３つのジスルフィド架橋の還元は、例えばウロキナーゼのアミド分解活性の定量 、得られるＳｔｌ基の滴定、または還元ウロキナーゼの逆相クロマトグラフィー によって観測できる。好ましくは、ウロキナーゼのアミド分解活性の増減を定量 することによって還元を観測する。　Ｈａｙａｓｈｉ等、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅ ｓ、、　２２．５７３−５７８（１９８１）の方法を用い、０．１μ９〜１μ２ のウロキナーゼと１０μｌの１０ｍＭのＳ−２４４４基質とをアッセイバッファ （周囲温度の５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００１のＮａＣｆ、　ｐＨ７゜４）中で混 合することによってウロキナーゼのアミド分解活性を定量し得る。この方法で、 ＵＫ２．が平均活性１２５ｔｌ／μｉを有することが知見された。アミド分解活 性が通常は２〜４時間でウロキナーゼの初期値の１５％〜２５％に低下したとき に、に ζつのジスルフィド架橋のうちの３つが還元されている。

次に還元剤を系から除去する。好ましくは、例えば５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ　６（ １０００ＭＷＣＯ）透析管を用い溶液を透析して還元剤を除去する。極めて好ま しくは、溶液透析に際し、１００倍容の０．ＩＭのリン酸塩、０．２Ｍのアルギ ニンｐＨ７を２回使用し、各透析段階を約９０〜１００分間ずつ行なう、この間 にアミド分解活性がυに２．の初期値の約７０％〜約８０％に増加する。このア ミド分解活性増加は、２つのジスルフィド架橋が再形成されて分子が天然立体配 座に再生されたことに起因する。しかしながら、例えば逆相クロマトグラフィー のごとき別の方法で酸化状態を観測することも可能である。

アミド分解活性が原ウロキナーゼの初期値の約７０％〜８０％に増加すると、Ａ ペプチド断片と同様に少なくとも１つのスルフヒドリル基を必ず含む合成Ａペプ チドを原ウロキナーゼの１５〜３０モル過剰で添加する０合成ペプチドと触媒鎖 との衝突頻度を最大にするためには３０倍過剰が好ましい。

約１時間後にウロキナーゼ誘導体を単離し得る。例えば、溶液を５ｅｐｈａｄｅ ｘ　Ｇ−７５のごときゲル濾過樹脂または同様の性能特性を有するその他のゲル 濾過樹脂に通す。

ウロキナーゼ誘導体の組成をタンパク質配列決定によって確認する。一般には、 ポリペプチドをアミノ酸サブユニットまたは配列に分割し、これらのサブユニッ トを例えばＦＩＰＬＣ分析によって同定する０本発明では、ウロキナーゼ誘導体 を自動エドマン分解によって同定した。エドマン過程では、フェニルイソチオシ アナートをペプチドの遊離アミノ基と定量的に反応させ、対応するフェニルチオ カルバモイルペプチドを生じさせる。無水酸で処理するとＮ末端残基がフェニル チオカルバモイルアミノ酸として分離し、ペプチド鎖の残部を元のまま（ｉｒ＋ ｔａｃｔ）残す０次に、フェニルチオカルバモイルアミノ酸を環化し、対応する フェニルチオヒダントイン誘導体を形成させる。この誘導体を、例えばガスクロ マトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーによって分離できる。または、フ ェニルチオカルバモイル誘導体として除去されたＮ末端残基を同定するために、 Ｎ末端残基の除去前後のペプチドのアミノ酸組成を決定するだけでもよい。これ は減算式エドマン過程である。このエドマン過程は例えば八ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉ ｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、社製の自動シーケンサ４７０１＾型または４７７ 型のごとき自動シーケンサにおいて実施され得る。

以下の実施例の記載より本発明が更に十分に理解されよう、これらの実施例は代 表例として提示されたものであり、本発明はこれらの記載に限定されない。

え４涯上 ｑヱ」Ｐ−アミノ外ヱ二ｌむ」ム匡ｑ■すＬｌに竺透専−制ＵＫ２．の残基１〜 １３を含むＡＭ断片を除去し、合成Ａペプチドで置換した。この合成Ａペプチド は、フィブリノーゲンのα鎖のアミン末端側のフィブリン結合領域である［：Ｐ Ｉ’ｔＰを含み、この［；ＰＲＰがアミノヘキサン酸を介して８残基のペプチド 配列ＬＫＦＱＣ（：ＱＫに結合されたものである。

（ａ）ＵＫ２．、の精製 （八ｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手しな）新しく単離された１］ Ｋ２．を、０．４Ｍｃ７）ＮａＣｆ、０．１Ｍのリン酸塩ｐ　Ｉ＋　７　、０で 平衡させたｐ−アミノベンズアミジン−５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに吸着させて 精製し、０．４ＨのＮａＣｌ２．０．１Ｍの酢酸ナトリウムｐＨ４，０で溶出し た。　Ｈｏｌｍｂｅｒｇ等、ＢｉｏｃｈｉＬＢｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ、　４４ ５，２１５〜２２２（１９７６）。

（ｂ）合成Ａペプチドの合成 自動ポリペプチドシンセサイザー（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３ ０＾Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）を使用し前述のごとき固相ペプ チド合成方法によって合成Ａペプチドを調製した。結合反応にはＢＯＣ保護アミ ノ酸を使用した。＾ｒ８、Ｃｙｓ、Ｌｙｓ及びＴｈｒを夫々組み込むためにＢＯ Ｃ−Ａｒｇ（）シル）、ＢＯＣ−Ｃｙｓ（４−ＣＨ。

−ベンジル）、ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｃ１−’カルボベンゾキシ）及びＢＯＣ−Ｔｈ ｒ（ベンジル）を使用した。ペプチドをＢＯＣ−アミノアシルポリスチレン樹脂 に付着させることによ−）でペプチドの構築を開始し、対称無水物（ｓｙｍｍｅ ｔｒｉｃａｌ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を用い各アミノ酸につき２つの結合の形成 を原次行なった。＾ｒｇ及びＧｌｕに対してはヒドロキシベンゾトリアゾールエ ステルを用い重複結合方式に従った。ペプチドを樹脂から分離し、無水液状ＨＦ ／アニソール（９：１．１時間）で処理して側鎖保護基を除去した。樹脂を酢酸 エチル／ジエチルエーテル（に１、樹脂１ｇあたり１００１１りで洗浄し、ペプ チドを１０％酢酸水溶液で抽出し凍結乾燥した。Ｂｅｃｋｍａｎ　６３００　Ａ ｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ａｎａｌｙｚｅｒのごときアミノ酸アナライザーを用い、 加水分解物のアミノ酸分析（６ＮのＨＣｌ、１１０℃、２４４時間を行なってペ プチドの組成を決定し、所望の配列に一致するアミノ酸組成を有することを知見 した。

（ｃ）１つのシス−イン−５ｌｌ　を　るム　Ａベブ　ド即ち（：ＰＲＰ−アミ ノヘキサン　−ＬＫＦＱＣＧＱＫの組込み０．１Ｍリン酸塩（ｐ）１７）中で約 １〜２Ｈ／贋！のＵＫ２．溶液を等容の０．５Ｍアルギニン水溶液（ｐＨ７）で 希釈した。新しい原液の１Ｍ水溶液からの還元剤ＤＴＴを添加し、ＤＴＴの最終 濃度を１０１６Ｍに調整した。０．１Ｎｇ〜１μｓのＵＫ２．、還元υに２ｉま たはＵＫ２．誘導体と、　１０４ｆｆの１０ｍＭのＳ−２４４４基質とを、アッ セイバッファ　（５０ＪのＴｒｉｓ、１１００ａのＮａｐ／！、　ｐ［Ｉ７．４ 、周囲温度）中で混合し、アミド分解性基質Ｓ−２４４４に対するアミド分解活 性を定量した。

４０６ｎｍの吸光度の増加を５分間にわたって観測した。　４０６ｎｍの吸光度 の増加がＩＵ／分のときこれを酵素活性の１単位（Ｕ）と定義する。　ｔｌＫ２ ．は１２５Ｕ／μ２の平均活性を有していることが知見された。

観測中の還元ＵＫ２ｓのアミド分解活性がｔｌＫ２．の初期値の約２０％まで減 少したとき、５ｐｅｃｔｒｉｐｏｒ　６（１０００ＭＷＣＯ）透析管を用い、０ ．２Ｍのアルギニンを含有する１００倍容の０．１Ｍリン酸塩ｐＨ７に対して反 応溶液を周囲温度で約９０分間透析した。

次いで、透析バッファを交換し、新しい透析バッファに対して反応溶液を更に約 ９０分間透析した。２回目の透析後に、透析液をＤＴＮＢ　（エルマン試薬即ち ＳＨ試薬）滴定によって測定すると溶液は検出可能なりＴＴを含有していなかっ た。更に、アミド分解活性はＵに２．の初期値の５５％〜６５％の値まで増加し 、ウロキナーゼ分子の構造が天然立体配置に再生されていた（これは逆相Ｃ−４ ＨＰＬＣカラムにおける天然タンパク質に特有の保持時間の存在によって証明さ れる）。

１つのシスティン−ＳＲ残基を含有する合成Ａペプチド即ちにＰＲＰ−アミノヘ キサン酸−ＬＫＦＱＣにＱＫを、ｔｌＫ２．の濃度の３０倍のモル過剰で添加し た。反応を約１時間道行させる０次にウロキナーゼ誘導体を単離し、０．１Ｍの リン酸塩（ｐＨ７）で平衡させた１、５Ｘ９０ｃｍ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７ ５分子篩ゲルが過カラムに試料を通して精製した。Ｃ−４ペプチド／タンパク質 カラムを用いる逆相クロマトグラフィーＨＰＬＣ分析、及び、９０％水、０．１ ％（ｖ／ｖ）ＴＦ＾／１０％アセトニトリルから４０％水、０．１％（ｖ／ｖ） ＴＦ＾／６０％アセトニトリルまでの１％／分及び１ｌｌ分の勾配を室温で用い た分析によれば、誘導体は天然ウロキナーゼの位置に溶出し余剰ペプチドは除去 されていた。

上記の手順を繰り返し、誘導体を収率７０％〜８０％で回収した。誘導体は、ｔ ｌＫ２．の初期値の８０％〜１００％のアミド分解活性を有していた。

え良ＩＬ ＧＰＲＰ〜アミノへ　ン　−ＬＫＦＣＧＱＫウロキナーゼ舌導実施例１と同様に してＵに２．を１０＋ｌＩＮのＩＩＴＴと２５０ｍＭのアルギニンとの存在下に アミド分解活性が２０％に低下するまで還元した９合成Ａペプチド即ちにＰＲＰ −アミノヘキサン酸−ＬＫＦＱＣにＱＫを添加し透析を開始した。標記化合物を 収率７５％で回収した。

去」１殊」− にＡＣＤＶ−７ミ／　ヘン−ＬＫＦＱＣＧＱＫ７　Ｄ　＋　−Ｊｔ！合成Ａペプ チド即ちＧＡにＤＶ−アミノヘキサン酸−ＬＫＦＱＣ［；ＱＫを用い実施例１の 手順で所望の標記化合物を得た。

えＩ１支 ヘパリン−ＬＫＦＱＣＧＱＫウロキナーゼ誘導体ヘパリン−ＬＫＦＱＣにＱＫ合 成Ａペプチドを用い実施例１の手順で所望のウロキナーゼ誘導体を得た。

ヘパリン−ＬＫＦＱＣＣＱＫ合成ペプチドは、ヘパリンをペプチド構造ＬＫＦＱ Ｃ（：ＱＫに結合することによって調製した。１Ｍピリジン−ＨＣｊ！（ｐＨ５ ＞中に１５０６のヘパリンを含有するＩＭｌの溶液に２５Ｂのカルボジイミドを ９℃で添加した。１０分後、１Ｍピリジン−１（ＣＮバッファ中に１ｍＭのペプ チドＬＫＦＱＣＧＱＫを含有する１、Ｏｉｌの溶液を添加した。９℃で２４時間 維持後、５ｐｅｃｔｒａ−ｐｏｒ　６（１０００８ＷＣＯ）透析管を使用し１０ ００倍容の水を４回交換して溶液を透析した。　）ＩＰＬｃ逆相クロマトグラフ ィーによって２５７ｎｍの吸光度（Ｐｈｅに由来する吸光）及び前記ペプチドピ ークの消滅を測定し、これに基づいて計算した結合ペプチドの収率は７５％であ った。０．４６Ｘ２５ｃｍのＶｙｄａｃ　Ｃ−４ペプチド／タンパク質カラム（ Ｒ（ｉｎｉｎ　Ｉｎ５ｔｒｕｅ＋ｅｎｔ　Ｃｏ、、　Ｈｏｂｕｒｎ。

Ｈ＾）を用いて逆相クロマトグラフィー分析を行ない、９０％水、０．１％（ｖ ／ｖ）ＴＦ＾／１０％アセトニトリルから４０％水、０．１％ｈ／ｖ）ＴＦ、Ａ ／６０％アセトニトリルまでの１％／分の勾配により周囲温度で展開させた。

得られた誘導体は見掛は分子量約６０．０００（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５カ ラム）を有し１００％活性であった。

え１鰹１ 八ＡＨＥＥＩＣＴＮＥ（：ＶＭ−７ミ／ヘ−’Ｆｔ７　−ＬＫＦＱＣＧＫウロキ ナーゼ１１監 合成人ペプチドに代えてヒト血漿フィブロネクチンのコラーゲン結合領域を含む ペプチドを用い実施例１に記載の手順でコラーゲン結合ウロキナーゼ誘導体を製 造し得る。

ヒト血漿フィブロネクチンのコラーゲン結合領域をペプチド構造ＬＫＦＱＣ［ｌ ；ＱＫに結合させることによってコラーゲン結合合成ペプチドを調製する。

え１九り にＰＲＰ−アミノへ　ン　−ＣＳウロ　ナーゼ号（：ＰＲＰ−アミノヘキサン酸 −Ｃｙｓ合成Ａペプチドを用い実施例１の平原で所望のウロキナーゼ誘導体を調 製した。

え１九二 ［：ＰＲＰ−アミノヘキサン酸〜′γミノヘキサン酸−ＣＳウロ糺九二（１１船 （：ＰＲＰ−アミノヘキサン酸−アミノヘキサン酸−Ｃｙｓ合成Ａペプチドを用 い実施例１の手順で所望のウロキナーゼ誘導体を調製した。

種々の条件に適応するように本発明の範囲内で手順の細部を様々に変更及び修正 し得ることは理解されよう、当業者は本文及び請求の範囲を更に検討することに よって本発明の別の目的及び利点を知見されるであろう。本発明方法が本文中で 詳細に説明した合成Ａペプチド以外のスルフヒドリル（ＳＨ）含有化合物に適用 できることも当業者には明らかであろう０例えば、本発明方法は、千オール化合 物、システィン含有ペプチドもしくはタンパク質、またはコラーゲンのごときフ ィブリン以外の成分に親和性を示し得るスルフヒドリル含有ペプチドを取込むた めに使用することも可能である。

国際調査報告 −一１１１−一一−ＰＣＴ／τＪＳＢ９１０４５５４

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）原ウロキナーゼ分子をアルギニンで飽和させ、（ｂ）飽和した原ウロ キナーゼ分子を、３つのジスルフィド架橋を還元させるに十分な量の還元剤と反 応させ、（ｃ）還元剤を除去し、 （ｄ）還元ウロキナーゼ分子とスルフヒドリル含有基を有する少なくとも約１５ 〜約３０モル過剰の所望化合物とを反応させることを特徴とするウロキナーゼ誘 導体の製造方法。
2. ２．スルフヒドリル含有基を有する化合物が合成ペプチドであることを特徴とす る請求項１に記載の方法。
3. ３．段階（ｃ）で還元剤を除去する前にスルフヒドリル含有基を有する化合物を 添加することを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. ４．スルフヒドリル含有基を有する化合物がウロキナーゼ分子の少なくとも約３ ０モル過剰になるように、スルフヒドリル含有基を有する化合物を添加すること を特徴とする請求項１に記載の方法。
5. ５．アルギニンを少なくとも約７０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度範囲で添加するこ とを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. ６．還元段階が更に、ジスルフィド架橋の還元の観測を含み、この観測では、ト リペプチドウロキナーゼの発色性基質Ｌ−ピログルタミルグリシル−Ｌ−アルギ ニル−ｐ−ニトロアニリドに対する還元ウロキナーゼ分子のアミド分解活性を、 同じ基質に対する原ウロキナーゼのアミド分解活性との比較によって定量するこ とを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ７．還元ウロキナーゼのアミド分解活性が未還元の原ウロキナーゼ分子の値の約 ５％〜約２５％の値に達するまでジスルフィド架橋の還元を観測し、その後に還 元剤を除去することを特徴とする請求項６に記載の方法。
8. ８．　１本鎖ペプチド【配列があります】が原ウロキナーゼ分子から除去され ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. ９．（ａ）Ａ鎖とＢ鎖との双方を含み、高分子量天然ウロキナーゼ分子の１４４ 位のロイシンで始まり夫々１５７位及び１５８位の２つのアミノ酸即ちフェニル アラニン及びリジンが欠失し、Ａ鎖が１４４位から１５６位までのアミノ酸配列 【配列があります】を含み、 Ｂ鎖が１５９位に始まってＣＯＯＨ−末端を含んでおり、２本の鎖が夫々１４８ 位及び２７９のシステインとシステイととの間のジスルフィド結合１個によって 互いに結合された原ウロキナーゼ分子を用い、原ウロキナーゼ分子をアルギニン で飽和させ、 （ｂ）飽和した原ウロキナーゼ分子を３つのジスルフィド架橋を還元させるに十 分な量の還元剤と反応させ、（ｃ）還元剤を除去し、 （ｄ）還元ウロキナーゼ分子を少なくとも約１５〜約３０モル過剰の所望の合成 ペプチドと反応させることを特徴とするウロキナーゼ誘導体の製造方法。
10. １０．段階（ｃ）で還元剤を除去する前に合成ペプチドを添加することを特徴と する請求項９に記載の方法。