JPH07316199A - ラットプロテア−ゼインヒビタ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】従来その詳細が不明であったラットＬＡＣＩ、
ラットＬＡＣＩ遺伝子を単離してその詳細を明確にする
と共に、遺伝子工学的にラットＬＡＣＩを製造する方法
を提供する。 【構成】ラットＬＡＣＩのアミノ酸一次構造、ラットＬ
ＡＣＩを暗号化する遺伝子、ラットＬＡＣＩ遺伝子を含
む遺伝子配列若しくは前記ラットＬＡＣＩ遺伝子を含む
遺伝子配列を用いて宿主細胞を形質転換する操作と、当
該宿主細胞を培養する操作とを含む、ラットプロテア−
ゼインヒビタ−の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ラットのプロテア−ゼ
インヒビタ−、より詳しくはラットのリポ蛋白質結合性
プロテア−ゼインヒビタ−（ＬＡＣＩ）、およびこれを
暗号化する遺伝子（ｃＤＮＡ）に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】哺乳動物の凝固カスケ−ドには内因性
（intrinsic)と外因性（extrinsic)の２つの経路がある
とされている。外因性凝固反応のインヒビタ−として
は、ヘパリ存在化でXa因子やトロンビンの活性を阻害す
るアンチトロンビンIII が良く知られているが、VIIa因
子に対する特異的なインヒビタ−については永い間不明
であった。VIIa因子は補助因子である組織因子（ＴＦ）
と結合してIX因子あるいはX因子を活性化するが、通常
組織障害が起こった場合にＴＦが組織から血流中に漏れ
出て来ることが外因性凝固のトリガ−となっている。

【０００３】組織因子による活性化反応の阻害因子が血
漿中にあることはしかしながら古くから知られており、
Rapaportらによりextrinsic pathway inhibitor (EPI）
(Rao, L.V.M.とRapaport,S.I.,Blood,69, 645 (1988))
、Broze,Jr. らによりlipoprotein-associated coagul
ation inhibitor (LACI) ( Broze, G.J.Jr., ら、Bloo
d,71, 335 (1988)) と別々に名づけられ、研究が進めら
れた。本発明においてはこれをリポ蛋白質結合性プロテ
ア−ゼインヒビタ−あるいは単にＬＡＣＩと呼ぶことに
する。

【０００４】Broze,Jr. らのグル−プは１９８８年にヒ
ト肝臓および胎盤のｃＤＮＡライブラリ−をスクリ−ニ
ングし、ＬＡＣＩの遺伝子を単離した（Wun, T-C. ら，
J.Biol.Chem.,263, 6001 (1988))。遺伝子から推定され
たアミノ酸配列によるとこのポリペプチドは３つのKuni
tz型プロテア−ゼインヒビタ−ドメインを有し、かつＮ
末端付近とＣ末端付近にそれぞれ酸性アミノ酸、塩基性
アミノ酸を極端に多く含むという独特の構造をとってい
ることが明らかになった。またこの遺伝子を動物細胞
（Ｃ１２７）で発現させるとVIIa因子・ＴＦ複合体およ
びXa因子を阻害することが確かめられ、しかも第１、第
２のKunitz型プロテア−ゼインヒビタ−ドメインがそれ
ぞれ異なる働きを持っているなど様々の知見が得られ
た。(Girard,T.J. ら、Nature、338, 518 (1989))。ま
たこの組換え体ＬＡＣＩはウサギを用いたモデル実験に
おいてＴＦに依存した一過性の肺血栓形成およびフィブ
リノ−ゲンの低下を抑制することが示され、医薬品とし
ての可能性も議論されるようになってきている(Day, K.
C.ら、Blood 、76, 1538 (1990))。

【０００５】一方ＬＡＣＩの生理的な作用についてはま
だ不明なことが多く、疾病との関連も明らかにされてい
ない。心筋梗塞、肺梗塞、脳梗塞などの臨床的に重要な
血栓症関連の疾患が生じる前に凝固亢進状態が存在する
と言われており、凝固・線溶マ−カ−の測定はその重要
性を増しつつある。ＬＡＣＩは初めて見出だされた特異
的なVIIa因子・ＴＦ複合体のインヒビタ−であり、今後
の研究の進展が期待されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】現在までに研究されて
いるＬＡＣＩは、ヒト血漿あるいはヒト培養細胞由来の
ものだけであり、凝固因子の研究材料として好適なウシ
あるいは実験動物として有用な齧歯類のＬＡＣＩに関す
る報告はほとんどない。本発明者らはラット血漿のＬＡ
ＣＩ様活性を測定し、このＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨ
ＤＬ各画分ごとの量的な変動を解析してきた（Thrombos
is and Haemostasis 65, 950 (1991)) 。

【０００７】ＴＦは凝固関連タンパク質のなかでも種差
が大きく、ＴＦと結合するＬＡＣＩにも種差のあること
が推定され、事実、組換えヒトＬＡＣＩを用いた実験で
各種動物のプロトロンビン時間の延長作用は大きく異な
ることが示されている（Day.K.C. ら、前出）。このこ
とは齧歯類殊にラットを用いた実験ではラットのＬＡＣ
Ｉを用いることが必要であることを意味している。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、凝固動態
の観察の容易な実験動物であるラットのＬＡＣＩを実験
材料として用いるためにはこれを暗号化する遺伝子を単
離し、その構造を解析し、さらには遺伝子配列に基づい
た組換えタンパク質を生産することが必要であると考
え、鋭意研究を行い本発明を完成した。すなわち本発明
は、以下のアミノ酸配列（以下、単に配列１という）か
らなるラットＬＡＣＩである。 （Ｎ末端） Met Thr Asn Lys Leu Lys Lys Asp His Ala Phe Trp Ala Ala Val Cys Leu Leu Leu Ser Ile Val Pro Glu Leu Leu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Asp Asp Asp Thr Ile Asn Thr Asp Ser Glu Leu Arg Pro Met Lys Pro Leu His Thr Phe Cys Ala Met Lys Ala Glu Asp Gly Pro Cys Lys Ala Met Ile Arg Ser Tyr Tyr Phe Asn Met Asn Ser His Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Arg Phe Asp Thr Leu Glu Glu Cys Arg Lys Thr Cys Ile Pro Gly Tyr Lys Lys Thr Thr Ile Lys Thr Thr Ser Gly Ala Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Phe Met Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Ser Lys Gln Cys Glu Gln Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Ser Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Arg Asn Thr Cys Glu Asp Pro Val Asn Glu Val Gln Lys Gly Asp Tyr Val Thr Asn Gln Ile Thr Val Thr Asp Arg Thr Thr Val Asn Asn Val Val Ile Pro Gln Ala Thr Lys Ala Pro Ser Gln Trp Asp Tyr Asp Gly Pro Ser Trp Cys Leu Glu Pro Ala Asp Ser Gly Leu Cys Lys Ala Ser Glu Lys Arg Phe Tyr Tyr Asn Pro Ala Ile Gly Lys Cys Arg Gln Phe Asn Tyr Thr Gly Cys Gly Gly Asn Asn Asn Asn Phe Thr Thr Lys Gln Asp Cys Asn Arg Ala Cys Lys Lys Asp Ser Ser Lys Lys Ser Ser Lys Arg Ala Lys Thr Gln Arg Arg Arg Lys Ser Phe Val Lys Val Met Tyr Glu Asn Ile His （Ｃ末端） また本発明は、配列１のラットＬＡＣＩを暗号化する遺
伝子配列であり、特に以下の塩基配列（以下、単に配列
２という）からなるラットＬＡＣＩ遺伝子である。

【０００９】 （５´側） ATG ACT AAC AAA CTG AAG AAA GAC CAC GCC TTC TGG GCG GCT GTG TGT CTG CTG CTT AGC ATT GTT CCT GAG CTT CTT AAT GCT CTG CCC GAG GAA GAC GAT GAT ACA ATA AAC ACA GAT TCC GAG CTG CGG CCA ATG AAA CCG TTG CAT ACA TTC TGT GCA ATG AAG GCG GAA GAC GGG CCC TGC AAA GCA ATG ATA CGG AGT TAT TAT TTC AAT ATG AAC AGT CAC CAG TGT GAA GAA TTT ATA TAC GGG GGA TGC AGA GGA AAC AAG AAC CGA TTT GAT ACT CTG GAA GAG TGT AGG AAA ACA TGC ATA CCA GGT TAT AAA AAG ACA ACT ATA AAG ACA ACA TCT GGA GCA GAA AAG CCA GAT TTC TGC TTC TTG GAA GAG GAT CCT GGA ATC TGC CGA GGT TTC ATG ACC AGG TAT TTT TAT AAC AAC CAG TCA AAG CAG TGT GAA CAA TTC AAG TAC GGC GGT TGC CTG GGC AAC AGC AAC AAC TTT GAG ACC TTG GAG GAG TGC AGG AAC ACC TGT GAG GAT CCA GTG AAT GAG GTA CAG AAG GGT GAC TAC GTA ACT AAT CAA ATT ACT GTA ACT GAT CGC ACT ACT GTA AAT AAC GTG GTG ATT CCT CAG GCT ACC AAA GCG CCC AGC CAA TGG GAC TAT GAT GGC CCT TCA TGG TGT CTT GAA CCA GCA GAC AGT GGA TTA TGT AAA GCC AGT GAG AAA AGA TTC TAC TAC AAC CCA GCC ATT GGG AAA TGC CGT CAA TTT AAC TAC ACT GGA TGT GGG GGA AAT AAT AAT AAT TTT ACT ACC AAA CAA GAT TGT AAT AGA GCA TGT AAA AAA GAT TCC TCC AAA AAA AGC TCA AAA AGA GCA AAG ACC CAA AGA AGA AGG AAG TCT TTC GTG AAA GTC ATG TAC GAA AAT ATT CAT （３´側） また本発明は、このラットＬＡＣＩ遺伝子を含む、例え
ばプラスミド等の遺伝子配列である。

【００１０】更に本発明は、ラットＬＡＣＩ遺伝子を含
む遺伝子配列を用いて宿主細胞を形質転換する操作と、
当該宿主細胞を培養する操作とを含む、ラットＬＡＣＩ
の製造方法である。以下本発明を詳細に説明する。

【００１１】本発明により新たに提供されるラットＬＡ
ＣＩは、配列１に見られるように、３０２個のアミノ酸
を含む蛋白質であり、そのＮ末端にメチオニン（Ｍｅ
ｔ）を有するものである。本発明が提供するラットＬＡ
ＣＩは、配列１と同一の一次構造を有する蛋白質は勿
論、そのＮ末端側又はＣ末端側に他のアミノ酸やペプチ
ド、更には蛋白質が付加されたラットＬＡＣＩ様蛋白質
をも包含する。

【００１２】また、その３０２個のアミノ酸配列中の一
又は複数のアミノ酸が、ラットＬＡＣＩ活性を消失しな
い範囲で削除又は他のアミノ酸に置換されたものや、活
性を消失しない範囲で本来の３０２個のアミノ酸配列中
に一又は複数のアミノ酸が挿入されたものであっても良
い。

【００１３】本発明のラットＬＡＣＩは、後に説明する
遺伝子工学的方法により製造することができる。

【００１４】ラットＬＡＣＩを暗号化する遺伝子は、そ
のコドンが翻訳された場合に先に説明したラットＬＡＣ
Ｉを発現する全ての遺伝子を包含する。このような遺伝
子の一例として、配列２で示される塩基配列からなるラ
ットＬＡＣＩ遺伝子が例示できる。ところで、配列２で
示される塩基配列からなるラットＬＡＣＩ遺伝子は、ラ
ットのゲノム中に存在するＬＡＣＩ遺伝子と同一の塩基
配列を有するものであり、その一部をプロ−ブとして使
用し、ラット遺伝子ライブラリ−等から（全長の）ラッ
トＬＡＣＩ遺伝子を調製する場合等には、特に好まし
い。

【００１５】本発明が提供するラットＬＡＣＩ遺伝子
は、前記したようにラット遺伝子ライブラリ−から調製
することができるが、化学的合成法を用いて調製しても
良い。また、ラットＬＡＣＩ遺伝子は、デオキシリボ核
酸からなるものであってもリボ核酸からなるものであっ
ても良いが、ラットＬＡＣＩを製造するために遺伝子工
学的に使用する場合等には、安定性に優れたデオキシリ
ボ核酸からなるラットＬＡＣＩ遺伝子が好ましい。

【００１６】ラットＬＡＣＩ遺伝子を含む遺伝子配列と
しては、例えば後の実施例で示されるような5'及び／又
は3'非翻訳領域の塩基配列を含む遺伝子配列や、又例え
ばプロモ−タ−配列等を含んでいる、ラットＬＡＣＩ遺
伝子のクロ−ニング用／発現用のベクタ−等、結果とし
てラットＬＡＣＩ遺伝子を発現させ、ラットＬＡＣＩを
製造し得る配列を意味する。なお、これらベクタ−の形
状としては、ファ−ジ状及びプラスミド状いずれの状態
であっても良いが、長期安定性等を考慮した場合、プラ
スミド状のものが好ましい。例えばこれらベクタ−は、
自己複製等の観点から、通常はプラスミド状のものが使
用される。

【００１７】ラットＬＡＣＩ遺伝子を含む遺伝子配列
は、例えば前記した発現用ベクタ−であれば、ラットＬ
ＡＣＩ遺伝子の他に、発現制御のためのプロモ−タ−や
遺伝子配列自身の複製のための遺伝子、タ−ミネ−タ−
領域、終始コドン、翻訳開始配列等を含んでいることが
好ましい。ここで、プロモ−タ−は、ラットＬＡＣＩの
発現に使用する宿主との関係で適宜決定され、例えば宿
主細胞として動物細胞を使用するのであれば、ＳＶ４０
プロモ−タ−等が例示できる。

【００１８】以上に説明したラットＬＡＣＩ遺伝子を含
む遺伝子配列の調製方法を、ラットＬＡＣＩ発現用ベク
タ−を調製する場合について簡単に説明すれば、プロモ
−タ−、ラットＬＡＣＩ遺伝子、終始コドン、タ−ミネ
−タ−領域等を、５´側から連続的にかつラットＬＡＣ
Ｉ遺伝子がラットＬＡＣＩを発現し得るように結合さ
せ、更に自己の複製のための遺伝子等を結合させて、環
状とすることが例示できる。塩基間の結合は、Ｔ₄ ＤＮ
Ａリガ−ゼ等により行うことができる。

【００１９】以上に説明したラットＬＡＣＩ遺伝子を含
む遺伝子配列により適当な宿主細胞を形質転換し、これ
を培養することでラットＬＡＣＩを製造することができ
る。宿主細胞は、ラットＬＡＣＩ遺伝子を含む遺伝子配
列中に含まれる、ラットＬＡＣＩ遺伝子の発現を制御す
るプロモ−タ−が機能し得るものを選択すれば良いが、
言い換えれば、使用する宿主細胞に従って、プロモ−タ
−を選択しても良い。

【００２０】ラットで製造される天然のＬＡＣＩは、糖
鎖が付加された糖蛋白質であることが予想される。従っ
て、糖鎖の付加されたラットＬＡＣＩを製造しようとす
る場合には、糖鎖を付加することのできるＣＨＯ細胞や
ＣＯＳ細胞等を使用すると良い。またこのような動物細
胞を宿主細胞として使用した場合には、細胞中で製造さ
れたラットＬＡＣＩは培養液中に遊離されるため、後の
抽出、精製操作のうえでも好ましい。ここで、前記した
ＳＶ４０プロモ−タ−を、これら細胞中で機能し得るプ
ロモ−タ−として例示できる。

【００２１】宿主細胞の形質転換及び形質転換された宿
主細胞の培養操作は、通常の方法に従えば良い。使用し
たプロモ−タ−が、外部からの刺激を受けて機能する性
質のものである場合には、培養操作中にプロモ−タ−を
機能させることで、使用したプロモ−タ−が終始機能す
る性質のものである場合には単に培養操作を継続するこ
とで、ラットＬＡＣＩを製造することができる。

【００２２】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００２３】実施例１ プロ−ブの調製 ラット肝から定法に従って全ＲＮＡを抽出し、この全Ｒ
ＮＡを鋳型にしてｃＤＮＡを合成した。具体的にはＲＮ
Ａ（１μg/μl) 8μl にオリゴdT（0.3 μg/μl)10μl
と蒸留滅菌水50μl を加え、70℃、10分間の処理を行な
い、これに胎盤由来 RNaseインヒビタ−（114 U/μl ）
4 μl 、5 倍濃縮緩衝液混合物（0.25MTris-HCl（pH 8.
3）、0.73M KCl 、15mM MgCl₂ 、5mM DTT ）20μl 、1
0mM dNTP 5 μl 、逆転写酵素（34.8U/μl ）4 μl を
加えて37℃、30分間のインキュベ−ションを行なってｃ
ＤＮＡを合成した。

【００２４】上記反応液 5.3μl に10倍濃縮緩衝液混合
物（ 0.1M Tris-HCl（pH8.3 ）、0.5M KCl、15mM MgCl
₂ 、0.1%ゼラチン（w/v)） 5μl と滅菌蒸留水を加え、
全量を50μl とした。これに２種類のＰＣＲプライマ−
（40 pmole／μl)各1.25μlとTaq ＤＮＡポリメラ−ゼ
(5U/μl)0.25μl を加えてＰＣＲを行なった。ＰＣＲプ
ライマ−としては、Wun, T-C. ら（J.Biol.Chem.,263,
6001 (1988) ）の 413番目から431 番目に相当する 4種
類のオリゴヌクレオチド、^5' GAATTCTTGAAAGTCTGGAAGAGTG ^3'、^5' GAATTCTTGAAAGTCTGGAAGAATG ^3'、^5' GAATTCTTGAAAGTCTGGAGGAGTG ^3'、^5' GAATTCTTGAAAGTCTGGAGGAATG ^3' と、 619番目から 637番目に相当する 4種類のオリゴヌ
クレオチド、^5' GAATCCCCAGTGTCTCAAAATTGTT ^3'、^5' GAATCCCCAGTGTCTCAAAATTATT ^3'、^5' GAATCCCCAGTGTCTCAAAGTTGTT ^3'、^5' GAATCCCCAGTGTCTCAAAGTTATT ^3' を、化学的に合成して用いた。反応は94℃（ 1分間）、
25℃（ 1分間）、72℃（ 1分間）のサイクルを10回繰り
返し、さらに95℃（ 1分間）、45℃（ 1分間）、72℃
（ 3分間）のサイクルを20回繰り返して行なった。

【００２５】反応終了後、増幅されたＤＮＡをEco RI-B
am HI で消化後、pUC13 ベクタ−に組み込んでプロ−ブ
の調製を完成した。

【００２６】実施例 ２ ラットｃＤＮＡライブラリ−
のスクリ−ニング λｇｔ１０ベクタ−に組み込まれたラットｃＤＮＡライ
ブラリ−(Clontech 社製）を購入し、上記プロ−ブを用
いたプラ−クハイブリダイゼ−ションによるスクリ−ニ
ングを行なった。具体的にはpUC13 ベクタ−からEco RI
-Bam HI によりプロ−ブ配列を切り出し、これを定法に
従い、マルチプライミングキット（アマシャム社製）と
α−³²P dCTPを用いて放射能標識した。ｃＤＮＡライブ
ラリ−から 3×10⁶ クロ−ンのプラ−クをスクリ−ニン
グ（ハイブリダイゼ−ション条件7%PEG 、10% SDS 、60
℃、フィルタ−の洗浄条件 0.1×SSC 、0.1% SDS、60
℃）し、その結果３つの陽性クロ−ンを得た。これらは
制限酵素による切断様式が同一であったため同一のクロ
−ンと考えられた。これらのうちの一つについてｃＤＮ
Ａ挿入部分の全配列をジデオキシ法（Sanger,F. ら、Pr
oc.Natl.Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977))により決定
した。その結果、3'末端の欠如した、5'末端の非翻訳領
域を含むラットＬＡＣＩ遺伝子（ｃＤＮＡ）が調製され
た。この断片は図１及び２に示す全長ラットＬＡＣＩ遺
伝子の、1 から836 番目の塩基配列に相当するものであ
る。

【００２７】実施例 ３ ｍＲＮＡの３´末端を含む部
分のクロ−ニング ラットＬＡＣＩｍＲＮＡの3'末端を含む部分をクロ−ニ
ングするために、Frohman,F.A.とMartin,G.R.(Techniqu
e 1, 165 (1989))の開発したNestedＰＣＲ法の原理を
適用した。まず実施例１に記した方法でラット肝ｍＲＮ
ＡからｃＤＮＡを合成した。但し、本実施例において
は、オリゴdTの代わりにオリゴdTの5'側にXho I-Sal I
の配列が連結したオリゴヌクレオチド（アダプタ−d
T）、^5' GACTCGAGTCGACATCGTTTTTTTTTTTTTTTTT^3' を用いた。

【００２８】得られたｃＤＮＡを鋳型としてNestedＰＣ
Ｒを行なった。第 1回目のＰＣＲはラットＬＡＣＩ遺伝
子の 616番目から 639番目の塩基配列に相当するオリゴ
ヌクレオチド、^5' TCCAGTGAATGAGGTACAGAAGGG^3' と、Xho I-Sal I の配列が連結したアダプタ−、^5' GACTCGAGTCGACATCG ^3' との間で、第２回目のＰＣＲはラットＬＡＣＩ遺伝子の
748番目から 748番目に相当するオリゴヌクレオチド、^5' AAGCTTGGATCCATGGTGTCTTGAACCAGCAGAC^3' と、上記アダプタ−との間で行なった。

【００２９】第１回目のＰＣＲの反応液組成は上記鋳型
ｃＤＮＡ 1μl 、10倍濃縮緩衝液混合物 5μｌ、10mM d
NTP 1 μl 、２種類のＰＣＲプライマ−（40 pmole／μ
l)各1.25μl 、Taq ＤＮＡポリメラ−ゼ(5U/μl)0.25μ
l であり、温度条件は94℃（ 1分間）、45℃（ 2分
間）、72℃（ 3分間）のサイクルを40回繰り返すように
設定した。第２回目のＰＣＲは、ｃＤＮＡの代わりに上
記反応物 1μｌを鋳型とし、第１回目と同一の反応液組
成、温度条件で行なった。

【００３０】第２回目のＰＣＲ産物をアガロ−スゲル電
気泳動にかけ、^5' GAGAAAAGATTCTACTACAACCCAG ^3' なるオリゴヌクレオチド（ラットＬＡＣＩの 791番目か
ら 815番目に相当）をプロ−ブとして、ハイブリダイゼ
−ションにより、目的のＤＮＡが増幅されていることを
確認した。

【００３１】ＰＣＲ産物をSal I とBam HIで切断し Blu
escript II SK+ベクタ−に組み込むことでクロ−ニング
を完成した。以上のようにして調製され、実施例２にお
いて取得されたラットＬＡＣＩ遺伝子断片の3'側と重複
する断片を有する 7つの独立のクロ−ンについて塩基配
列を決定し、コンセンサス配列を最終的な塩基配列とし
た。

【００３２】実施例２及び本実施例により解明された、
ラットＬＡＣＩ遺伝子の塩基配列を図１、図２に示す。

【００３３】実施例 ４ 全長ラットＬＡＣＩ遺伝子の
調製 実施例２で得られた組換え体ファ−ジＤＮＡから、Eco
RI消化によりｃＤＮＡ挿入部分を調整し、これをpUC119
ベクタ−のEco RI部位に挿入した。

【００３４】一方、実施例３で得られた組換え体プラス
ミドＤＮＡから、Bam HI−Sal I 断片を調製し、これを
pUC119ベクタ−のBam HI−Sal I 部位に挿入した。

【００３５】次に、それぞれのｃＤＮＡ挿入部分の重な
りのある領域に、以下の手法によりPst I 制限部位を導
入した。まず、図２における 752番目の塩基（Ｔ）から
774番目（Ｇ）に相当する配列のうち、763 番目の塩基
（Ａ）をＴに置換したオリゴヌクレオチド、^5' TGTCTTGAACCTGCAGACAGTGG ^3' を化学的に合成し、これを鋳型プライマ−として、それ
ぞれのpUC119にクロ−ニングされたラットＬＡＣＩ遺伝
子（断片）に変異を導入し、同一のオリゴヌクレオチド
をプロ−ブとして用いたハイブリダイゼ−ション試験及
びPst I 消化実験を行って変異が導入されたことを確認
した。

【００３６】続いて、5'側の断片を含む、前記変異導入
プラスミドＤＮＡをEco RI−Pst Iで消化し、約770 bp
のｃＤＮＡ挿入部分を調製した。3'側の断片を含む変異
導入プラスミドも同様にEco RI−Pst I で消化し、前記
約770 bpのｃＤＮＡを挿入した。

【００３７】導入した変異を除去するために、図２にお
ける 752番目の塩基（Ｔ）から 774番目（Ｇ）に相当す
るオリゴヌクレオチド、^5' TGTCTTGAACCAGCAGACAGTGG ^3' を化学的に合成し、これを鋳型プライマ−として再度変
異を導入し、全長ラットＬＡＣＩ遺伝子（翻訳領域）を
含むプラスミド（pUC119）を調製した。

【００３８】

【発明の効果】本発明は、ラットＬＡＣＩとこれを暗号
化するラットＬＡＣＩ遺伝子、ラットＬＡＣＩ遺伝子を
含む遺伝子配列、ラットＬＡＣＩ遺伝子を含む遺伝子配
列で形質転換する操作と形質転換された宿主細胞を培養
する操作を含むラットＬＡＣＩの製造方法である。

【００３９】本発明は、ラットＬＡＣＩの一次構造、そ
れを暗号化する遺伝子の塩基配列を初めて明らかとする
ものであり、それにより、特に遺伝子工学的にラットＬ
ＡＣＩを製造することが可能となる。

【００４０】本発明のラットＬＡＣＩによれば、実験動
物系として有用なラットを使用し、ＬＡＣＩの本来の生
理活性を知ることができる。また、遺伝子工学的に製造
されたラットＬＡＣＩにおいては、糖鎖が付加され又は
付加されていないラットＬＡＣＩを自由に製造すること
が可能となるから、ＬＡＣＩにおける糖鎖の役割等を調
査するうえでも、有用である。また、ラットを用いた実
験系において、ラットＬＡＣＩの活性を阻害する因子を
スクリ−ニングできれば、ヒトＬＡＣＩ阻害剤のスクリ
−ニングの重要な知見となる。

【００４１】ラットＬＡＣＩ遺伝子は、ラットＬＡＣＩ
を製造するうえで、特に重要な意味を有している。例え
ばラットＬＡＣＩをラットから取得しようとすれば、大
量のラットが必要となり、複雑な精製操作を行なわなけ
ればならない。しかも、そのようにして取得した場合に
は、操作上のロスが生じることが予想され、大量にラッ
トＬＡＣＩを調製することは困難であろうし、また、他
の夾雑蛋白質等による汚染が避けられない。これに対
し、本発明のラットＬＡＣＩ遺伝子を使用して遺伝子工
学的に製造すれば、大量のラットＬＡＣＩを、他のラッ
ト蛋白質の汚染なしに製造することが可能となる。

【００４２】本発明が提供するラットＬＡＣＩ遺伝子
は、大腸菌、枯草菌、酵母、糸状菌、昆虫細胞、哺乳動
物細胞等の異種の細胞でのラットＬＡＣＩの製造を保証
するものであり、糖鎖が付加され、又は糖鎖が付加され
ていないラットＬＡＣＩを自由に製造することを可能に
する。更には、ラットＬＡＣＩ誘導体を調製する際の材
料として利用したり、アンチセンス制御因子としても利
用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、実施例４において調製されたラットＬ
ＡＣＩ遺伝子の塩基配列の一部を示すものであり、その
1番目の塩基（Ｇ）から 810番目の塩基（Ａ）までが示
されている。図中、二列に記載された上側の記号は、Ｄ
ＮＡの塩基を示すものであり、下側の記号は上部に位置
するコドンにより暗号化されるアミノ酸を示すものであ
る（記号は、通常の生化学で使用される記号と同様の意
味である）。図中の数字は、取得した遺伝子の3'末端の
塩基を 1と数えた場合の塩基の番号を示している。また
図中の＊の記号は、図２の＊と連続することを示してい
る。図１において、 1番目の塩基（Ｇ）から88番目の塩
基（Ａ）は、5'側非翻訳領域であり、89番目の塩基
（Ａ）以後の塩基が翻訳領域である。また、開始コドン
ＡＴＧは、ヒトＬＡＣＩ等とのホモロジ−を考慮して決
定されている。

【図２】図２は、実施例４において調製されたラットＬ
ＡＣＩ遺伝子の塩基配列の一部を示すものであり、その
811番目の塩基（Ｃ）から1228番目の塩基（Ａ）までが
示されている。図中、二列に記載された記号等の意味は
図１における記号の意味と同一であり、図中の＊は図１
中の＊と連続することを示している。図２において、 9
94番目の塩基（Ｔ）以前の塩基は翻訳領域であり、995
番目の塩基（Ｔ）以後の塩基は3'非翻訳領域である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/55 ＡＣＢ

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下のアミノ酸配列からなるラットプロテ
   ア−ゼインヒビタ−。 （Ｎ末端） Met Thr Asn Lys Leu Lys Lys Asp His Ala Phe Trp Ala Ala Val Cys Leu Leu Leu Ser Ile Val Pro Glu Leu Leu Asn Ala Leu Pro Glu Glu Asp Asp Asp Thr Ile Asn Thr Asp Ser Glu Leu Arg Pro Met Lys Pro Leu His Thr Phe Cys Ala Met Lys Ala Glu Asp Gly Pro Cys Lys Ala Met Ile Arg Ser Tyr Tyr Phe Asn Met Asn Ser His Gln Cys Glu Glu Phe Ile Tyr Gly Gly Cys Arg Gly Asn Lys Asn Arg Phe Asp Thr Leu Glu Glu Cys Arg Lys Thr Cys Ile Pro Gly Tyr Lys Lys Thr Thr Ile Lys Thr Thr Ser Gly Ala Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Phe Met Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Ser Lys Gln Cys Glu Gln Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly Asn Ser Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Arg Asn Thr Cys Glu Asp Pro Val Asn Glu Val Gln Lys Gly Asp Tyr Val Thr Asn Gln Ile Thr Val Thr Asp Arg Thr Thr Val Asn Asn Val Val Ile Pro Gln Ala Thr Lys Ala Pro Ser Gln Trp Asp Tyr Asp Gly Pro Ser Trp Cys Leu Glu Pro Ala Asp Ser Gly Leu Cys Lys Ala Ser Glu Lys Arg Phe Tyr Tyr Asn Pro Ala Ile Gly Lys Cys Arg Gln Phe Asn Tyr Thr Gly Cys Gly Gly Asn Asn Asn Asn Phe Thr Thr Lys Gln Asp Cys Asn Arg Ala Cys Lys Lys Asp Ser Ser Lys Lys Ser Ser Lys Arg Ala Lys Thr Gln Arg Arg Arg Lys Ser Phe Val Lys Val Met Tyr Glu Asn Ile His （Ｃ末端）
2. 【請求項２】請求項１に記載のアミノ酸配列を暗号化す
   るラットプロテア−ゼインヒビタ−遺伝子。
3. 【請求項３】以下の塩基配列からなる請求項２に記載の
   ラットプロテア−ゼインヒビタ−遺伝子。 （５´側） ATG ACT AAC AAA CTG AAG AAA GAC CAC GCC TTC TGG GCG GCT GTG TGT CTG CTG CTT AGC ATT GTT CCT GAG CTT CTT AAT GCT CTG CCC GAG GAA GAC GAT GAT ACA ATA AAC ACA GAT TCC GAG CTG CGG CCA ATG AAA CCG TTG CAT ACA TTC TGT GCA ATG AAG GCG GAA GAC GGG CCC TGC AAA GCA ATG ATA CGG AGT TAT TAT TTC AAT ATG AAC AGT CAC CAG TGT GAA GAA TTT ATA TAC GGG GGA TGC AGA GGA AAC AAG AAC CGA TTT GAT ACT CTG GAA GAG TGT AGG AAA ACA TGC ATA CCA GGT TAT AAA AAG ACA ACT ATA AAG ACA ACA TCT GGA GCA GAA AAG CCA GAT TTC TGC TTC TTG GAA GAG GAT CCT GGA ATC TGC CGA GGT TTC ATG ACC AGG TAT TTT TAT AAC AAC CAG TCA AAG CAG TGT GAA CAA TTC AAG TAC GGC GGT TGC CTG GGC AAC AGC AAC AAC TTT GAG ACC TTG GAG GAG TGC AGG AAC ACC TGT GAG GAT CCA GTG AAT GAG GTA CAG AAG GGT GAC TAC GTA ACT AAT CAA ATT ACT GTA ACT GAT CGC ACT ACT GTA AAT AAC GTG GTG ATT CCT CAG GCT ACC AAA GCG CCC AGC CAA TGG GAC TAT GAT GGC CCT TCA TGG TGT CTT GAA CCA GCA GAC AGT GGA TTA TGT AAA GCC AGT GAG AAA AGA TTC TAC TAC AAC CCA GCC ATT GGG AAA TGC CGT CAA TTT AAC TAC ACT GGA TGT GGG GGA AAT AAT AAT AAT TTT ACT ACC AAA CAA GAT TGT AAT AGA GCA TGT AAA AAA GAT TCC TCC AAA AAA AGC TCA AAA AGA GCA AAG ACC CAA AGA AGA AGG AAG TCT TTC GTG AAA GTC ATG TAC GAA AAT ATT CAT （３´側）
4. 【請求項４】請求項２に記載のラットプロテア−ゼイン
   ヒビタ−遺伝子を含む遺伝子配列。
5. 【請求項５】ラットプロテア−ゼインヒビタ−遺伝子の
   クロ−ニング用又は発現用ベクタ−である請求項４に記
   載の遺伝子配列。
6. 【請求項６】請求項４に記載の遺伝子配列を用いて宿主
   細胞を形質転換する操作と、当該宿主細胞を培養する操
   作とを含む、ラットプロテア−ゼインヒビタ−の製造方
   法。