JPH0552189B2 - - Google Patents
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は安定化されたヒト−プロウロキナーゼ
様ポリペプチド及びその製造方法に関する。 本発明の安定化されたヒト−プロウロキナーゼ
は各種の蛋白質分解酵素に対して安定であり、こ
のため、これを高収率且つ高純度で製造すること
ができる。また、これらがヒトや動物に投与され
た場合、生体内で酵素により加水分解されにくい
から、それらによつてもたらされる薬効が長時間
持続することが期待される。 他方、本発明の、ヒト−プロウロキナーゼ様ポ
リペプチドをコードするDNAセグメントを含有
する遺伝子系を用る場合、該ポリペプチドが効率
よく発現され、従つて、該ポリペプチドが経済的
に有利に製造される。 〔従来の技術〕 ヒト−ウロキナーゼは人尿中に微量に存在する
酵素であり、不活性のプラスミノーゲンをプラス
ミンに活性化する作用を有し、生成したプラスミ
ンはフイブリンを溶解することができる。このウ
ロキナーゼはジスルフイド結合により連結された
２本のポリペプチド鎖からなる。これに対してヒ
ト−プロウロキナーゼは前記の２本のポリペプチ
ド鎖がアミド結合によつて連結された１本鎖ポリ
ペプチドであり、このプロウロキナーゼ自体は前
記の活性を有しないが、１個のアミド結合が切断
されることにより、活性を有する前記のウロキナ
ーゼに転換される。ウロキナーゼは、成熟ウロキ
ナーゼとも称される。 ヒト−ウロキナーゼは前記の作用を有するた
め、血栓溶解治療薬として使用されている。ヒト
−ウロキナーゼは静脈注射薬として用いられると
ころから高度な精製品が要求されるが、一般にウ
ロキナーゼは不安定な酵素であり精製工程で分解
されやすいといわれている。例えば人尿より製造
されたウロキナーゼは分子量約54000の高分子ウ
ロキナーゼと分子量が約33000の低分子ウロキナ
ーゼから成り、この低分子ウロキナーゼは高分子
ウロキナーゼがプロテアーゼによつて切断されて
生ずる。この切断部位は成熟高分子ウロキナーゼ
のＮ末端のセリンから135番目と136番目の２個の
リジン残基間のペプチド結合であることが示唆さ
れている。このような切断は、人尿からのウロキ
ナーゼの精製過程においてのみならず、DNA組
換技法によつて産生されたプロウロキナーゼの精
製過程においても同様に生じ、さらにはプロウロ
キナーゼを静脈注射した場合にも血漿中に含まれ
るトリプシン様プロテアーゼによつて生ずると予
想される。 しかしながら、生体内でのフイブリンの溶解に
際しては高分子ウロキナーゼの方が低分子ウロキ
ナーゼよりも効果的であると考えられる（文献
１）。従つて、天然ヒト高分子ウロキナーゼと同
様の活性を有し且つプロテアーゼによつて分解さ
れにくい安定化されたウロキナーゼをもたらす安
定化されたプロウロキナーゼ及びその製造方法が
強く求められている。しかしながら、アミノ酸を
変換することによるこのような安定化されたプロ
ウロキナーゼ及びその製造方法は知られていな
い。 ヒト−プロウロキナーゼは、分子量約54000の
１本鎖構造のポリペプチドとして単離された（文
献２，３）。グレビツチ等は、このプロウロキナ
ーゼが体内に投与されてウロキナーゼに転換され
た場合には、ウロキナーゼが直接投与された場合
に比べて血栓溶解活性が強く、また副作用である
フイブリノーゲン分解性の少ないことを報告して
おり（文献４）新しい血栓溶解剤としての可能性
を示唆している。プロウロキナーゼが投与された
場合、この活性化は血栓の存在する局所において
血栓に吸着している少量のプラスミンによつてな
されるために、言い換えるとプロウロキナーゼは
血栓特異的に活性化されるため血中の阻害剤の影
響を受けにくく、また副作用も少ないと考えられ
ている。 ところがこの活性化は非常に起こり易く、プロ
ウロキナーゼが一旦ウロキナーゼに活性化されれ
ば、自らの酵素活性によりその分解が急速に進行
する。この結果、生体内においては血栓溶解活性
が長時間持続することができない。また、前記の
活性化がプロウロキナーゼの製造過程で生じた場
合、プロウロキナーゼが高分子ウロキナーゼに分
解され、これがさらに低分子ウロキナーゼに分解
されて製品中の低分子ウロキナーゼの含量が増加
する（文献５）。 従つて、比較的活性化されにくく、そしてそれ
故に前記のごとき天然ヒト−プロウロキナーゼが
有する欠点を有しない新しいタイプのヒト−プロ
ウロキナーゼが求められている。しかしながら、
そのような改良されたヒト−プロウロキナーゼは
知られていない。 ところで、従来、ウロキナーゼは人尿から抽出
精製することによつて製造れている。しかしなが
ら、この方法においては原料である人尿の安定供
給に問題があり必ずしも工業的に優れた方法とは
言い難い。一方、最近ではヒト腎細胞を分離、継
代培養してウロキナーゼを製造する方法が開発さ
れている（文献29）。しかしながらこの組織培養
法においては、治療薬として有効な高分子ウロキ
ナーゼの産生が代を経るに従つて減少し、低分子
ウロキナーゼの産生が増加することが報告されて
おり（文献６）、実用的なウロキナーゼの製造方
法としては必ずしも理想的とは言えない。 特開昭59−51300には遺伝子工学的手法による
ウロキナーゼの製造方法が開示されている。しか
しながらウロキナーゼの発現が具体的に確認され
ている方法は、ウロキナーゼをコードする遺伝子
をtrpE遺伝子と連結してtrpEとウロキナーゼの
融合蛋白質を発現せしめ、これを切断して低分子
ウロキナーゼを得る方法であつて、プロウロキナ
ーゼの直接発現は確認されていない。また、前記
融合蛋白質の発現量は示されていない。 以上のように、プロウロキナーゼを効果的に発
現させ、これを経済的に製造する方法は知られて
いない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従つて、この発明は、生体外及び生体内におい
て種々の酵素により分解され難く、そのために高
純度の製品として容易に製造することができ、そ
して生体内に投与された場合に血栓に対してより
特異性が高く、且つ血栓溶解についての改良され
た持続性をもたらす安定化されたヒト−プロウロ
キナーゼ様ポリペプチド、該ポリペプチドを製造
するための遺伝子系、及びこの遺伝子系を用いる
該ポリペプチドの製造方法を提供するものであ
る。 〔問題点を解決するための手段〕 従つて、この発明は、次の式： （Met）−１ Ser −135 Ｘ −157 Ｙ − （式中、Metは場合によつては存在するメチオ
ニンであり、SerはＮ−末端の１位に存在するセ
リンであり、Ｘは135位に存在するリジン、又は
塩基性アミノ酸以外のアミノ酸であり、Ｙは157
位に存在するフエニルアラニン又は酸性アミノ酸
であり、そして実線部分は天然ヒト−プロウロキ
ナーゼのアミノ酸配列の対応する部分と同一のア
ミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジンである場
合にはＹはフエニルアラニンではない、）で表わ
されるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のア
ミノ酸配列を有する安定化されたヒト−プロウロ
キナーゼ様ポリペプチドを提供する。 この発明はまた、前記の安定化されたヒト−プ
ロウロキナーゼ様ポリペプチドをコードする、大
腸菌において効率的に発現するDNAを提供する。 この発明はさらに、前記のDNA、前記プロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドの発現のための制御領
域、及び大腸菌中で複製するのに必要なDNA配
列を含有するプラスミドを提供する。 この発明はさらに、前記のプラスミドにより形
質転換された大腸菌を提供する。 この発明はさらに、前記大腸菌を用いる前記ヒ
ト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドの製造方法
を提供する。 〔具体的な説明〕 Ａ 安定化されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリ
ペプチド この発明の安定化されたヒト−プロウロキナー
ゼ様ポリペプチドは、次の式： （Met）−１ Ser −135 Ｘ −157 Ｙ − （式中、Metは場合によつては存在するメチオ
ニンであり、SerはＮ−末端の１位に存在するセ
リンであり、Ｘは135位に存在するリジン、又は
塩基性アミノ酸以外のアミノ酸であり、Ｙは157
位に存在するフエニルアラニン又は酸性アミノ酸
であり、そして横線部分は天然ヒト−プロウロキ
ナーゼのアミノ酸配列の対応する部分と同一のア
ミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジンである場
合にはＹはフエニルアラニンではない、）で表わ
されるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のア
ミノ酸配列を有する。 ウロキナーゼは410個のアミノ酸からなる蛋白
質でありそのアミノ酸配列はすでに知られている
（文献８および９）。ウロキナーゼのプラスミノー
ゲンアクチベーター活性はそのＣ−末端側の275
個のアミノ酸からなるペプチド部分によりもたら
されることが知られているが、この部分のみから
成るペプチドはプラスミノーゲンに対する親和性
が低いことが指摘されている（文献７）。前記の
活性部分のみから成るペプチドは低分子ウロキナ
ーゼと称され、他方、アミノ酸410個から成るウ
ロキナーゼは高分子ウロキナーゼと称される。前
記のごとく、低分子ウロキナーゼは、プラスミノ
ーゲンとの親和性が低いと考えられるため、高分
子ウロキナーゼの含有率が高いウロキナーゼ製品
が強く求められている。 従つて、ウロキナーゼの前駆体であるプロウロ
キナーゼについても、低分子化しにくいものが好
ましい。本発明者等は、プロウロキナーゼのＮ−
末端のセリンを１位として135位に位置するリジ
ンを、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸に変えるこ
とによつて、135位と136位の２個のリジン間の切
断（ウロキナーゼにおける高分子ウロキナーゼか
ら低分子ウロキナーゼへの変化に相当する）が生
じ難くなり、しかもそのようにアミノ酸が置き換
えられた変形されたポリペプチドが、天然プロウ
ロキナーゼと同様の生理的性質（活性化されてウ
ロキナーゼが活性を示す性質）を有するという驚
くべき事実を見出した。 本発明の安定化されたプロウロキナーゼ様ポリ
ペプチドは、前記の一般式において、Ｘはリジン
か、又は塩基性アミノ酸以外のアミノ酸のいずれ
かであるが、Ｘがリジンである場合には、後で詳
細に説明するように、Ｙはフエニルアラニンでは
ない。Ｘの塩基性アミノ酸以外のアミノ酸として
は、目的ポリペプチドの生理学的性質に不都合な
影響を与えない中性アミノ酸又は酸性アミノ酸で
あれば何でもよく、例えばアラニン、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン
酸、フエニルアラニン、グリシン、イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニン、セリン、スレオニ
ン、バリン、トリプトフアン、チロシン、プロリ
ン等を挙げることができ、具体例として例えば、
酸性アミノ酸のアミドであるアスパラギン又はグ
ルタミン；ヒドロキシアミノ酸であるセリン又は
スレオニン；酸性アミノ酸であるグルタミン酸又
はアスパラギン酸；分枝鎖中性アミノ酸であるイ
ソロイシン、ロイシン又はバリン等に分けること
ができる。本発明者等はヒト−プロウロキナーゼ
の135位のリジンを実際にグルタミン、スレオニ
ン、グルタミン酸、又はイソロイシンのいずれか
で置き換えたペプチドを調製し、それらの135−
136位間の切断に対する抵抗性及び生理的活性を
調べたところ、いずれのポリペプチドも135−136
位間の切断に対する高い耐性を有し、しかも天然
プロウロキナーゼの生理学的性質を保持している
ことが確認された。この事実から、135位のリジ
ンが塩基性アミノ酸以外のアミノ酸により置換さ
れたプロウロキナーゼは、２個の塩基性アミノ酸
を認識して該２個の塩基性アミノ酸間の結合を切
断する各種のプロテアーゼに対して安定化された
こと、及びウロキナーゼ活性のために135位のア
ミノ酸は必ずしもリジンである必要はないことが
合理的に結論される。 プロウロキナーゼは、Ｎ−末端のセリンを１位
として158番目のリジンと159番目のイソロイシン
の間のペプチド結合がプラスミン、トリプシン等
のプロテアーゼにより切断されることにより、ウ
ロキナーゼに活性化される。そして一旦活性化さ
れれば、ウロキナーゼは自らの蛋白質分解活性に
より分解され低分子化され、活性を失う。従つ
て、生体内において持続的なウロキナーゼ活性を
得るには、前記の切断を抑制することが望まし
い。他方、156位のアルギニンと157位のフエニル
アラニンとの間のペプチド結合はトロンビン等に
より切断され、この切断はウロキナーゼ活性を低
下せしめる。 本発明者等は157位のフエニルアラニンを酸性
アミノ酸であるアスパラギン酸又はグルタミン酸
で置き換えることによつて、トロンビン等による
前記の切断が抑制され、しかもこのような置換に
よつて天然プロウロキナーゼの生理的性質がなん
ら失われないという驚くべき事実を見出した。こ
の事実は、この切断に関与するプラスミン、トリ
プシンなどのプロテアーゼは158番目のリジン残
基側鎖の陽電荷を認識しており、この近傍のアミ
ノ酸たとえば157番目のフエニルアラニンの代わ
りに側鎖に負電荷をもつ酸性アミノ酸を導入する
ことによつてプロテアーゼの認識を抑制すること
により、切断速度を低下せしめることができると
考えることにより合理的に説明することができ
る。 本発明においては、前記Ｘ及びＹの組合わせの
具体例として次のようなポリペプチドを調製し
た。 記 号 Ｘ Ｙ 1pm Gln Phe pm2 Thr Phe E135 Glu Phe I135 Ile Phe pm3 Lys Asp Q135D157 Gln Asp E135D157 Glu Asp 上記の各種のポリペプチドを、後で詳細に記載
するように、Ｘにおける置換の効果についてはト
リプシンに対する感受性により、そしてＹにおけ
る置換の効果についてはプラスミンに対する感受
性、及びトロンビンに対する感受性により調べ
た。この結果、前記の置換はいずれも目的とする
安定化効果をもたらし、しかもこれらの置換によ
つて天然プロウロキナーゼ本来の生理的性質が失
われないことが確認された。従つて、これらの事
実は、前記の推定される安定化機構と相まつて、
前に定義したＸとＹのすべての組合わせからなる
ポリペプチドは本発明の安定化効果を発揮するも
のと、合理的に推定させる。従つて、前に定義し
たＸとＹの組合わせからなるプロウロキナーゼ様
ポリペプチドはすべて本発明の範囲に属する。 前記一般式中の横線で示されるアミノ酸配列
は、天然のヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配
列の対応する部分と同一である。天然ヒト−プロ
ウロキナーゼのアミノ酸配列として、ヒト−腎臓
由来のmRNAに対応するcDNAによりコードさ
れている、アミノ酸411個から成る配列を挙げる
ことができる。このアミノ酸配列は第４−１図〜
第４−３図にアルフアベツトの大文字３文字から
なるアミノ酸記号により示されている。 前記一般式中、（Met）−は、プロウロキナーゼ
のＮ−末端の１位のSerに隣接してそのＮ末端側
に存在する場合があるメチオニンを示す。後に詳
細に記載するこの発明の製造方法によれば、Ｎ末
端に翻訳開始コドンに由来するメチオニンを有す
るポリペプチドが発現されるが、このメチオニン
が大腸菌の細胞内の酵素により除去されることに
よつてＮ末端にメチオニンが付加されていないポ
リペプチドが得られることがある。従つて、本発
明はこのメチオニンを有するポリペプチド及び有
しないポリペプチドの両者を包含する。 本発明の安定化されたヒト−プロウロキナーゼ
様ポリペプチドは、上に詳細に記載したアミノ酸
配列を有するポリペプチドのほかに、これと実質
上同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含
する。ここで、“実質上同じアミノ酸配列”とは、
上記のアミノ酸配列中のＸ及びＹ以外の少数個の
アミノ酸が他のアミノ酸によつて置き換えられて
おり、又は除去されており、あるいは上記のアミ
ノ酸配列に少数個のアミノ酸が付加されている
が、しかしなおプロ−ウロキナーゼの生理的性質
及び本発明の特徴である安定性をもたらすアミノ
酸配列を意味する。特定の生理活性を有するポリ
ペプチド中の該生理活性に関与しない領域におい
てアミノ酸配列に変更を加えても、該生理活性が
影響を受けない場合があることは、当業者により
良く知られている。従つて、そのような変更を含
むポリペプチドも、本発明の特徴を保持している
限り本発明の範囲に属するものである。 Ｂ ヒト−プロウロキナーゼの遺伝子系 この発明はさらに、安定化されたヒト−プロウ
ロキナーゼを製造するために有用な遺伝子系に関
する。ここで、遺伝子系とは、目的とするヒト−
プロウロキナーゼ様ポリペプチドをコードする
DNAセグメント、このDNAセグメントを含有す
るプラスミド、及びこのプラスミドが導入された
宿主を包含する。 本発明の代表的なDNAには、Ｎ−末端の複数
個のアミノ酸をコードするコドンが大腸菌中で高
頻度で使用されるコドンであり、そして前記Ｎ−
末端の複数個のアミノ酸並びに前記Ｘ及びＹをコ
ードするコドン以外のコドンがヒト腎臓由来の
mRNAに対応するcDNA中の対応するアミノ酸
のコドンと同一であるDNAが包含される。 ヒト−プロウロキナーゼのごとき多数のアミノ
酸からなる蛋白質をコードする遺伝子としては、
その蛋白質を天然に産生する生物細胞すなわちヒ
ト細胞由来のDNAセグメント、例えばプロ−ウ
ロキナーゼをコードするｍ−RNAに対して得ら
れたcDNAを用いるのが便利であり、このような
高分子蛋白質をコードするDNAを合成すること
は不可能ではないが、多大の努力を必要とする。
他方、大腸菌中で蛋白質を効果的に発現せしめる
には大腸菌において高頻度で使用されているコド
ンから成る遺伝子を使用するのが好ましいと考え
られるが、ヒト由来のcDNAにおいてはこのよう
な条件は十分に満足されず、このような条件を満
足させるDNAを得るには化学合成に頼らざるを
得ない。 本発明者等は、ヒト−プロウロキナーゼをコー
ドする遺伝子といて主としてヒト由来のcDNAを
用い、このcDNAの内プロ−ウロキナーゼのＮ端
の少数個のアミノ酸をコードするコドンのみを、
大腸菌において高頻度で使用されているコドンか
らなる合成DNAで置き換えることによつて、大
腸菌中で効果的に発現される遺伝子が得られる。 前記の合成DNA部分のコドンの選択に当つて
はさらに、天然型ウロキナーゼ遺伝子（cDNA）
の16塩基の逆向き繰り返し配列を消失せしめるこ
とによつてmRNAの折りたたみ構造の形成を防
止し、さらに、mRNAのレベルにおいて、本発
明の発現プラスミドの好ましい具体例において使
用されるメタピロカテカーゼ遺伝子（C230）の
SD配列付近の塩基配列と、ヒト−プロウロキナ
ーゼ遺伝子の5′端の塩基配列との相補的構造を消
失せしめてこれら相補的会合を防止するように選
択するのが好ましい。さらに、翻訳開始コドン
ATGの次の塩基がＡとなるように第１位のアミ
ノ酸であるセリンのコドンを選択するのが好まし
い。 この発明の好ましい態様においては、上記のよ
うに設計されたコード領域のＮ末端アミノ酸であ
るセリンのコドンに隣接してその上流にメチオニ
ンをコードする翻訳開始コドンATGを設けるこ
とによつて、高分子ウロキナーゼの直接発現を可
能にする。さらに、この発明の好ましい態様にお
いては、このコード領域のDNAを発現ベクター
に挿入した場合に、この発明の好ましい発現ベク
ターにおいて使用されるメタピロカテカーゼ遺伝
子のSD配列と挿入されたプロウロキナーゼ遺伝
子のATG間の距離及び構造が、天然のメタピロ
カテカーゼ遺伝子におけるそれと同一になるよう
に、前記ATGに隣接してその上流に制限酸素
Aatの確認配列、 5′ Ｃ（ATG）3′ 3′TGCAG（TAC）5′ を設ける。 従つて、この発明の最も好ましい態様において
は、ヒト−プロウロキナーゼをコードするcDNA
の内、ヒト−プロウロキナーゼのＮ端の６個のア
ミノ酸をコードするDNA配列及びその上流が第
１図に示すように変えられ、その他のコード領域
においてはcDNAのDNA配列（該当する場合に
はアミノ酸Ｘ又はＹをコードするための変異を含
む）が使用される。なお、この領域中には、組換
体のスクリーニング及び他のDNA配列への置換
を可能にするため制限酵素部位Sstが設けられ
ている。 第５図には、変形された本発明の塩基配列の１
例が示されている。この塩基配列においては、ア
スパラギン、グルタミン酸、ロイシン、ヒスチジ
ン、グルタミン及びプロリンのコドンとして大腸
菌において高頻度で使用されるコドンか使用され
ている。さらに、この塩基配列においては、ヒト
−プロウロキナーゼの直接発現を可能にするた
め、天然cDNAに存在するリーダー配列が除去さ
れ、それに代えて、ヒト−プロウロキナーゼの第
１アミノ酸であるセリンのコドンに隣接してその
上流にメチオニンをコードする翻訳開始コドン
ATGが設けられており、さらに発現プラスミド
への挿入を可能にするためにAat部位が設けら
れている。 一般式中、Ｘが塩基性アミノ酸以外のアミノ酸
である場合には、Ｘがリジンである場合のcDNA
のコドンに代えて目的とする塩基性アミノ酸以外
のアミノ酸をコードするコドンを用いなければな
らない。135番目のリジンのコドンに代るコドン
としては該当するアミノ酸をコードし大腸菌中で
容易に発現され得るものであれば何でもよいが、
例えば135番目のアミノ酸としてグルタミンを用
いる場合には、CAAからなるコドンを用いるの
が好ましく、スレオニンを用いる場合にはACA
が好ましい。さらに、各アミノ酸について例えば
次のようなコドンを用いることができる。 135番目のアミノ酸 コドン アラニン GCA アスパラギン AAC アスパラギン酸 GAC グルタミン酸 GAA フエニルアラニン TTC グリシン GGT イソロイシン ATC ロイシン CTG メチオニン ATG セリン AGC バリン GTA トリプトフアン TGG チロシン TACプロリン CCG 一般式中、Ｙが酸性アミノ酸である場合には、
Ｙがフエニルアラニンである場合のcDNAのコド
ンに代えて酸性アミノ酸をコードするコドンを用
いなければならない。157番目のフエニルアラニ
ンのコドンに代わるコドンとしては該当するアミ
ノ酸をコードし大腸菌中で容易に発現され得るも
のであれば何でもよいが、例えば157番目のアミ
ノ酸としてアスパラギン酸を用いる場合には、
GATからなるコドンを用いるのが好ましく、グ
ルタミン酸を用いる場合にはGAAが好ましい。 (2) プラスミド この発明のヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプ
チドを発現せしめるためには、動物細胞中で機能
するベクターを用いてもよいが、前記コード領域
と共に前記遺伝子を、微生物、特に大腸菌中で発
現せしめるために必要な発現制御領域及び大腸菌
中で複製するために必要な領域を含んで成るプラ
スミドを用いるのが好ましい。発現制御領域とし
ては大腸菌中で外来性遺伝子を発現するために有
用な任意の系を用いることができ、例えば、tac，
PL，lacUV5，PR，trp，lpp等のプロモーター／
オペレーター系を使用する。特に、tacプロモー
ター／オペレーター系、PLプロモーター／オペ
レーター系及びtrpプロモーター／オペレーター
系が好ましい。またSD配列としては、例えば、
メタピロカテカーゼ遺伝子のSD配列（C230SD）
（文献10）、lacSD等を使用することができる。 本発明のポリペプチドを発現することができる
プラスミドとして、例えば次のものを挙げること
ができる。
様ポリペプチド及びその製造方法に関する。 本発明の安定化されたヒト−プロウロキナーゼ
は各種の蛋白質分解酵素に対して安定であり、こ
のため、これを高収率且つ高純度で製造すること
ができる。また、これらがヒトや動物に投与され
た場合、生体内で酵素により加水分解されにくい
から、それらによつてもたらされる薬効が長時間
持続することが期待される。 他方、本発明の、ヒト−プロウロキナーゼ様ポ
リペプチドをコードするDNAセグメントを含有
する遺伝子系を用る場合、該ポリペプチドが効率
よく発現され、従つて、該ポリペプチドが経済的
に有利に製造される。 〔従来の技術〕 ヒト−ウロキナーゼは人尿中に微量に存在する
酵素であり、不活性のプラスミノーゲンをプラス
ミンに活性化する作用を有し、生成したプラスミ
ンはフイブリンを溶解することができる。このウ
ロキナーゼはジスルフイド結合により連結された
２本のポリペプチド鎖からなる。これに対してヒ
ト−プロウロキナーゼは前記の２本のポリペプチ
ド鎖がアミド結合によつて連結された１本鎖ポリ
ペプチドであり、このプロウロキナーゼ自体は前
記の活性を有しないが、１個のアミド結合が切断
されることにより、活性を有する前記のウロキナ
ーゼに転換される。ウロキナーゼは、成熟ウロキ
ナーゼとも称される。 ヒト−ウロキナーゼは前記の作用を有するた
め、血栓溶解治療薬として使用されている。ヒト
−ウロキナーゼは静脈注射薬として用いられると
ころから高度な精製品が要求されるが、一般にウ
ロキナーゼは不安定な酵素であり精製工程で分解
されやすいといわれている。例えば人尿より製造
されたウロキナーゼは分子量約54000の高分子ウ
ロキナーゼと分子量が約33000の低分子ウロキナ
ーゼから成り、この低分子ウロキナーゼは高分子
ウロキナーゼがプロテアーゼによつて切断されて
生ずる。この切断部位は成熟高分子ウロキナーゼ
のＮ末端のセリンから135番目と136番目の２個の
リジン残基間のペプチド結合であることが示唆さ
れている。このような切断は、人尿からのウロキ
ナーゼの精製過程においてのみならず、DNA組
換技法によつて産生されたプロウロキナーゼの精
製過程においても同様に生じ、さらにはプロウロ
キナーゼを静脈注射した場合にも血漿中に含まれ
るトリプシン様プロテアーゼによつて生ずると予
想される。 しかしながら、生体内でのフイブリンの溶解に
際しては高分子ウロキナーゼの方が低分子ウロキ
ナーゼよりも効果的であると考えられる（文献
１）。従つて、天然ヒト高分子ウロキナーゼと同
様の活性を有し且つプロテアーゼによつて分解さ
れにくい安定化されたウロキナーゼをもたらす安
定化されたプロウロキナーゼ及びその製造方法が
強く求められている。しかしながら、アミノ酸を
変換することによるこのような安定化されたプロ
ウロキナーゼ及びその製造方法は知られていな
い。 ヒト−プロウロキナーゼは、分子量約54000の
１本鎖構造のポリペプチドとして単離された（文
献２，３）。グレビツチ等は、このプロウロキナ
ーゼが体内に投与されてウロキナーゼに転換され
た場合には、ウロキナーゼが直接投与された場合
に比べて血栓溶解活性が強く、また副作用である
フイブリノーゲン分解性の少ないことを報告して
おり（文献４）新しい血栓溶解剤としての可能性
を示唆している。プロウロキナーゼが投与された
場合、この活性化は血栓の存在する局所において
血栓に吸着している少量のプラスミンによつてな
されるために、言い換えるとプロウロキナーゼは
血栓特異的に活性化されるため血中の阻害剤の影
響を受けにくく、また副作用も少ないと考えられ
ている。 ところがこの活性化は非常に起こり易く、プロ
ウロキナーゼが一旦ウロキナーゼに活性化されれ
ば、自らの酵素活性によりその分解が急速に進行
する。この結果、生体内においては血栓溶解活性
が長時間持続することができない。また、前記の
活性化がプロウロキナーゼの製造過程で生じた場
合、プロウロキナーゼが高分子ウロキナーゼに分
解され、これがさらに低分子ウロキナーゼに分解
されて製品中の低分子ウロキナーゼの含量が増加
する（文献５）。 従つて、比較的活性化されにくく、そしてそれ
故に前記のごとき天然ヒト−プロウロキナーゼが
有する欠点を有しない新しいタイプのヒト−プロ
ウロキナーゼが求められている。しかしながら、
そのような改良されたヒト−プロウロキナーゼは
知られていない。 ところで、従来、ウロキナーゼは人尿から抽出
精製することによつて製造れている。しかしなが
ら、この方法においては原料である人尿の安定供
給に問題があり必ずしも工業的に優れた方法とは
言い難い。一方、最近ではヒト腎細胞を分離、継
代培養してウロキナーゼを製造する方法が開発さ
れている（文献29）。しかしながらこの組織培養
法においては、治療薬として有効な高分子ウロキ
ナーゼの産生が代を経るに従つて減少し、低分子
ウロキナーゼの産生が増加することが報告されて
おり（文献６）、実用的なウロキナーゼの製造方
法としては必ずしも理想的とは言えない。 特開昭59−51300には遺伝子工学的手法による
ウロキナーゼの製造方法が開示されている。しか
しながらウロキナーゼの発現が具体的に確認され
ている方法は、ウロキナーゼをコードする遺伝子
をtrpE遺伝子と連結してtrpEとウロキナーゼの
融合蛋白質を発現せしめ、これを切断して低分子
ウロキナーゼを得る方法であつて、プロウロキナ
ーゼの直接発現は確認されていない。また、前記
融合蛋白質の発現量は示されていない。 以上のように、プロウロキナーゼを効果的に発
現させ、これを経済的に製造する方法は知られて
いない。 〔発明が解決しようとする問題点〕 従つて、この発明は、生体外及び生体内におい
て種々の酵素により分解され難く、そのために高
純度の製品として容易に製造することができ、そ
して生体内に投与された場合に血栓に対してより
特異性が高く、且つ血栓溶解についての改良され
た持続性をもたらす安定化されたヒト−プロウロ
キナーゼ様ポリペプチド、該ポリペプチドを製造
するための遺伝子系、及びこの遺伝子系を用いる
該ポリペプチドの製造方法を提供するものであ
る。 〔問題点を解決するための手段〕 従つて、この発明は、次の式： （Met）−１ Ser −135 Ｘ −157 Ｙ − （式中、Metは場合によつては存在するメチオ
ニンであり、SerはＮ−末端の１位に存在するセ
リンであり、Ｘは135位に存在するリジン、又は
塩基性アミノ酸以外のアミノ酸であり、Ｙは157
位に存在するフエニルアラニン又は酸性アミノ酸
であり、そして実線部分は天然ヒト−プロウロキ
ナーゼのアミノ酸配列の対応する部分と同一のア
ミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジンである場
合にはＹはフエニルアラニンではない、）で表わ
されるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のア
ミノ酸配列を有する安定化されたヒト−プロウロ
キナーゼ様ポリペプチドを提供する。 この発明はまた、前記の安定化されたヒト−プ
ロウロキナーゼ様ポリペプチドをコードする、大
腸菌において効率的に発現するDNAを提供する。 この発明はさらに、前記のDNA、前記プロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドの発現のための制御領
域、及び大腸菌中で複製するのに必要なDNA配
列を含有するプラスミドを提供する。 この発明はさらに、前記のプラスミドにより形
質転換された大腸菌を提供する。 この発明はさらに、前記大腸菌を用いる前記ヒ
ト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドの製造方法
を提供する。 〔具体的な説明〕 Ａ 安定化されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリ
ペプチド この発明の安定化されたヒト−プロウロキナー
ゼ様ポリペプチドは、次の式： （Met）−１ Ser −135 Ｘ −157 Ｙ − （式中、Metは場合によつては存在するメチオ
ニンであり、SerはＮ−末端の１位に存在するセ
リンであり、Ｘは135位に存在するリジン、又は
塩基性アミノ酸以外のアミノ酸であり、Ｙは157
位に存在するフエニルアラニン又は酸性アミノ酸
であり、そして横線部分は天然ヒト−プロウロキ
ナーゼのアミノ酸配列の対応する部分と同一のア
ミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジンである場
合にはＹはフエニルアラニンではない、）で表わ
されるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のア
ミノ酸配列を有する。 ウロキナーゼは410個のアミノ酸からなる蛋白
質でありそのアミノ酸配列はすでに知られている
（文献８および９）。ウロキナーゼのプラスミノー
ゲンアクチベーター活性はそのＣ−末端側の275
個のアミノ酸からなるペプチド部分によりもたら
されることが知られているが、この部分のみから
成るペプチドはプラスミノーゲンに対する親和性
が低いことが指摘されている（文献７）。前記の
活性部分のみから成るペプチドは低分子ウロキナ
ーゼと称され、他方、アミノ酸410個から成るウ
ロキナーゼは高分子ウロキナーゼと称される。前
記のごとく、低分子ウロキナーゼは、プラスミノ
ーゲンとの親和性が低いと考えられるため、高分
子ウロキナーゼの含有率が高いウロキナーゼ製品
が強く求められている。 従つて、ウロキナーゼの前駆体であるプロウロ
キナーゼについても、低分子化しにくいものが好
ましい。本発明者等は、プロウロキナーゼのＮ−
末端のセリンを１位として135位に位置するリジ
ンを、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸に変えるこ
とによつて、135位と136位の２個のリジン間の切
断（ウロキナーゼにおける高分子ウロキナーゼか
ら低分子ウロキナーゼへの変化に相当する）が生
じ難くなり、しかもそのようにアミノ酸が置き換
えられた変形されたポリペプチドが、天然プロウ
ロキナーゼと同様の生理的性質（活性化されてウ
ロキナーゼが活性を示す性質）を有するという驚
くべき事実を見出した。 本発明の安定化されたプロウロキナーゼ様ポリ
ペプチドは、前記の一般式において、Ｘはリジン
か、又は塩基性アミノ酸以外のアミノ酸のいずれ
かであるが、Ｘがリジンである場合には、後で詳
細に説明するように、Ｙはフエニルアラニンでは
ない。Ｘの塩基性アミノ酸以外のアミノ酸として
は、目的ポリペプチドの生理学的性質に不都合な
影響を与えない中性アミノ酸又は酸性アミノ酸で
あれば何でもよく、例えばアラニン、アスパラギ
ン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン
酸、フエニルアラニン、グリシン、イソロイシ
ン、ロイシン、メチオニン、セリン、スレオニ
ン、バリン、トリプトフアン、チロシン、プロリ
ン等を挙げることができ、具体例として例えば、
酸性アミノ酸のアミドであるアスパラギン又はグ
ルタミン；ヒドロキシアミノ酸であるセリン又は
スレオニン；酸性アミノ酸であるグルタミン酸又
はアスパラギン酸；分枝鎖中性アミノ酸であるイ
ソロイシン、ロイシン又はバリン等に分けること
ができる。本発明者等はヒト−プロウロキナーゼ
の135位のリジンを実際にグルタミン、スレオニ
ン、グルタミン酸、又はイソロイシンのいずれか
で置き換えたペプチドを調製し、それらの135−
136位間の切断に対する抵抗性及び生理的活性を
調べたところ、いずれのポリペプチドも135−136
位間の切断に対する高い耐性を有し、しかも天然
プロウロキナーゼの生理学的性質を保持している
ことが確認された。この事実から、135位のリジ
ンが塩基性アミノ酸以外のアミノ酸により置換さ
れたプロウロキナーゼは、２個の塩基性アミノ酸
を認識して該２個の塩基性アミノ酸間の結合を切
断する各種のプロテアーゼに対して安定化された
こと、及びウロキナーゼ活性のために135位のア
ミノ酸は必ずしもリジンである必要はないことが
合理的に結論される。 プロウロキナーゼは、Ｎ−末端のセリンを１位
として158番目のリジンと159番目のイソロイシン
の間のペプチド結合がプラスミン、トリプシン等
のプロテアーゼにより切断されることにより、ウ
ロキナーゼに活性化される。そして一旦活性化さ
れれば、ウロキナーゼは自らの蛋白質分解活性に
より分解され低分子化され、活性を失う。従つ
て、生体内において持続的なウロキナーゼ活性を
得るには、前記の切断を抑制することが望まし
い。他方、156位のアルギニンと157位のフエニル
アラニンとの間のペプチド結合はトロンビン等に
より切断され、この切断はウロキナーゼ活性を低
下せしめる。 本発明者等は157位のフエニルアラニンを酸性
アミノ酸であるアスパラギン酸又はグルタミン酸
で置き換えることによつて、トロンビン等による
前記の切断が抑制され、しかもこのような置換に
よつて天然プロウロキナーゼの生理的性質がなん
ら失われないという驚くべき事実を見出した。こ
の事実は、この切断に関与するプラスミン、トリ
プシンなどのプロテアーゼは158番目のリジン残
基側鎖の陽電荷を認識しており、この近傍のアミ
ノ酸たとえば157番目のフエニルアラニンの代わ
りに側鎖に負電荷をもつ酸性アミノ酸を導入する
ことによつてプロテアーゼの認識を抑制すること
により、切断速度を低下せしめることができると
考えることにより合理的に説明することができ
る。 本発明においては、前記Ｘ及びＹの組合わせの
具体例として次のようなポリペプチドを調製し
た。 記 号 Ｘ Ｙ 1pm Gln Phe pm2 Thr Phe E135 Glu Phe I135 Ile Phe pm3 Lys Asp Q135D157 Gln Asp E135D157 Glu Asp 上記の各種のポリペプチドを、後で詳細に記載
するように、Ｘにおける置換の効果についてはト
リプシンに対する感受性により、そしてＹにおけ
る置換の効果についてはプラスミンに対する感受
性、及びトロンビンに対する感受性により調べ
た。この結果、前記の置換はいずれも目的とする
安定化効果をもたらし、しかもこれらの置換によ
つて天然プロウロキナーゼ本来の生理的性質が失
われないことが確認された。従つて、これらの事
実は、前記の推定される安定化機構と相まつて、
前に定義したＸとＹのすべての組合わせからなる
ポリペプチドは本発明の安定化効果を発揮するも
のと、合理的に推定させる。従つて、前に定義し
たＸとＹの組合わせからなるプロウロキナーゼ様
ポリペプチドはすべて本発明の範囲に属する。 前記一般式中の横線で示されるアミノ酸配列
は、天然のヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配
列の対応する部分と同一である。天然ヒト−プロ
ウロキナーゼのアミノ酸配列として、ヒト−腎臓
由来のmRNAに対応するcDNAによりコードさ
れている、アミノ酸411個から成る配列を挙げる
ことができる。このアミノ酸配列は第４−１図〜
第４−３図にアルフアベツトの大文字３文字から
なるアミノ酸記号により示されている。 前記一般式中、（Met）−は、プロウロキナーゼ
のＮ−末端の１位のSerに隣接してそのＮ末端側
に存在する場合があるメチオニンを示す。後に詳
細に記載するこの発明の製造方法によれば、Ｎ末
端に翻訳開始コドンに由来するメチオニンを有す
るポリペプチドが発現されるが、このメチオニン
が大腸菌の細胞内の酵素により除去されることに
よつてＮ末端にメチオニンが付加されていないポ
リペプチドが得られることがある。従つて、本発
明はこのメチオニンを有するポリペプチド及び有
しないポリペプチドの両者を包含する。 本発明の安定化されたヒト−プロウロキナーゼ
様ポリペプチドは、上に詳細に記載したアミノ酸
配列を有するポリペプチドのほかに、これと実質
上同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含
する。ここで、“実質上同じアミノ酸配列”とは、
上記のアミノ酸配列中のＸ及びＹ以外の少数個の
アミノ酸が他のアミノ酸によつて置き換えられて
おり、又は除去されており、あるいは上記のアミ
ノ酸配列に少数個のアミノ酸が付加されている
が、しかしなおプロ−ウロキナーゼの生理的性質
及び本発明の特徴である安定性をもたらすアミノ
酸配列を意味する。特定の生理活性を有するポリ
ペプチド中の該生理活性に関与しない領域におい
てアミノ酸配列に変更を加えても、該生理活性が
影響を受けない場合があることは、当業者により
良く知られている。従つて、そのような変更を含
むポリペプチドも、本発明の特徴を保持している
限り本発明の範囲に属するものである。 Ｂ ヒト−プロウロキナーゼの遺伝子系 この発明はさらに、安定化されたヒト−プロウ
ロキナーゼを製造するために有用な遺伝子系に関
する。ここで、遺伝子系とは、目的とするヒト−
プロウロキナーゼ様ポリペプチドをコードする
DNAセグメント、このDNAセグメントを含有す
るプラスミド、及びこのプラスミドが導入された
宿主を包含する。 本発明の代表的なDNAには、Ｎ−末端の複数
個のアミノ酸をコードするコドンが大腸菌中で高
頻度で使用されるコドンであり、そして前記Ｎ−
末端の複数個のアミノ酸並びに前記Ｘ及びＹをコ
ードするコドン以外のコドンがヒト腎臓由来の
mRNAに対応するcDNA中の対応するアミノ酸
のコドンと同一であるDNAが包含される。 ヒト−プロウロキナーゼのごとき多数のアミノ
酸からなる蛋白質をコードする遺伝子としては、
その蛋白質を天然に産生する生物細胞すなわちヒ
ト細胞由来のDNAセグメント、例えばプロ−ウ
ロキナーゼをコードするｍ−RNAに対して得ら
れたcDNAを用いるのが便利であり、このような
高分子蛋白質をコードするDNAを合成すること
は不可能ではないが、多大の努力を必要とする。
他方、大腸菌中で蛋白質を効果的に発現せしめる
には大腸菌において高頻度で使用されているコド
ンから成る遺伝子を使用するのが好ましいと考え
られるが、ヒト由来のcDNAにおいてはこのよう
な条件は十分に満足されず、このような条件を満
足させるDNAを得るには化学合成に頼らざるを
得ない。 本発明者等は、ヒト−プロウロキナーゼをコー
ドする遺伝子といて主としてヒト由来のcDNAを
用い、このcDNAの内プロ−ウロキナーゼのＮ端
の少数個のアミノ酸をコードするコドンのみを、
大腸菌において高頻度で使用されているコドンか
らなる合成DNAで置き換えることによつて、大
腸菌中で効果的に発現される遺伝子が得られる。 前記の合成DNA部分のコドンの選択に当つて
はさらに、天然型ウロキナーゼ遺伝子（cDNA）
の16塩基の逆向き繰り返し配列を消失せしめるこ
とによつてmRNAの折りたたみ構造の形成を防
止し、さらに、mRNAのレベルにおいて、本発
明の発現プラスミドの好ましい具体例において使
用されるメタピロカテカーゼ遺伝子（C230）の
SD配列付近の塩基配列と、ヒト−プロウロキナ
ーゼ遺伝子の5′端の塩基配列との相補的構造を消
失せしめてこれら相補的会合を防止するように選
択するのが好ましい。さらに、翻訳開始コドン
ATGの次の塩基がＡとなるように第１位のアミ
ノ酸であるセリンのコドンを選択するのが好まし
い。 この発明の好ましい態様においては、上記のよ
うに設計されたコード領域のＮ末端アミノ酸であ
るセリンのコドンに隣接してその上流にメチオニ
ンをコードする翻訳開始コドンATGを設けるこ
とによつて、高分子ウロキナーゼの直接発現を可
能にする。さらに、この発明の好ましい態様にお
いては、このコード領域のDNAを発現ベクター
に挿入した場合に、この発明の好ましい発現ベク
ターにおいて使用されるメタピロカテカーゼ遺伝
子のSD配列と挿入されたプロウロキナーゼ遺伝
子のATG間の距離及び構造が、天然のメタピロ
カテカーゼ遺伝子におけるそれと同一になるよう
に、前記ATGに隣接してその上流に制限酸素
Aatの確認配列、 5′ Ｃ（ATG）3′ 3′TGCAG（TAC）5′ を設ける。 従つて、この発明の最も好ましい態様において
は、ヒト−プロウロキナーゼをコードするcDNA
の内、ヒト−プロウロキナーゼのＮ端の６個のア
ミノ酸をコードするDNA配列及びその上流が第
１図に示すように変えられ、その他のコード領域
においてはcDNAのDNA配列（該当する場合に
はアミノ酸Ｘ又はＹをコードするための変異を含
む）が使用される。なお、この領域中には、組換
体のスクリーニング及び他のDNA配列への置換
を可能にするため制限酵素部位Sstが設けられ
ている。 第５図には、変形された本発明の塩基配列の１
例が示されている。この塩基配列においては、ア
スパラギン、グルタミン酸、ロイシン、ヒスチジ
ン、グルタミン及びプロリンのコドンとして大腸
菌において高頻度で使用されるコドンか使用され
ている。さらに、この塩基配列においては、ヒト
−プロウロキナーゼの直接発現を可能にするた
め、天然cDNAに存在するリーダー配列が除去さ
れ、それに代えて、ヒト−プロウロキナーゼの第
１アミノ酸であるセリンのコドンに隣接してその
上流にメチオニンをコードする翻訳開始コドン
ATGが設けられており、さらに発現プラスミド
への挿入を可能にするためにAat部位が設けら
れている。 一般式中、Ｘが塩基性アミノ酸以外のアミノ酸
である場合には、Ｘがリジンである場合のcDNA
のコドンに代えて目的とする塩基性アミノ酸以外
のアミノ酸をコードするコドンを用いなければな
らない。135番目のリジンのコドンに代るコドン
としては該当するアミノ酸をコードし大腸菌中で
容易に発現され得るものであれば何でもよいが、
例えば135番目のアミノ酸としてグルタミンを用
いる場合には、CAAからなるコドンを用いるの
が好ましく、スレオニンを用いる場合にはACA
が好ましい。さらに、各アミノ酸について例えば
次のようなコドンを用いることができる。 135番目のアミノ酸 コドン アラニン GCA アスパラギン AAC アスパラギン酸 GAC グルタミン酸 GAA フエニルアラニン TTC グリシン GGT イソロイシン ATC ロイシン CTG メチオニン ATG セリン AGC バリン GTA トリプトフアン TGG チロシン TACプロリン CCG 一般式中、Ｙが酸性アミノ酸である場合には、
Ｙがフエニルアラニンである場合のcDNAのコド
ンに代えて酸性アミノ酸をコードするコドンを用
いなければならない。157番目のフエニルアラニ
ンのコドンに代わるコドンとしては該当するアミ
ノ酸をコードし大腸菌中で容易に発現され得るも
のであれば何でもよいが、例えば157番目のアミ
ノ酸としてアスパラギン酸を用いる場合には、
GATからなるコドンを用いるのが好ましく、グ
ルタミン酸を用いる場合にはGAAが好ましい。 (2) プラスミド この発明のヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプ
チドを発現せしめるためには、動物細胞中で機能
するベクターを用いてもよいが、前記コード領域
と共に前記遺伝子を、微生物、特に大腸菌中で発
現せしめるために必要な発現制御領域及び大腸菌
中で複製するために必要な領域を含んで成るプラ
スミドを用いるのが好ましい。発現制御領域とし
ては大腸菌中で外来性遺伝子を発現するために有
用な任意の系を用いることができ、例えば、tac，
PL，lacUV5，PR，trp，lpp等のプロモーター／
オペレーター系を使用する。特に、tacプロモー
ター／オペレーター系、PLプロモーター／オペ
レーター系及びtrpプロモーター／オペレーター
系が好ましい。またSD配列としては、例えば、
メタピロカテカーゼ遺伝子のSD配列（C230SD）
（文献10）、lacSD等を使用することができる。 本発明のポリペプチドを発現することができる
プラスミドとして、例えば次のものを挙げること
ができる。
【表】
(3) プラスミドが導入される宿主
前記のプラスミドが導入される宿主としては、
動物細胞、微生物、例えば細菌、酵母等を使用す
ることができるが、細菌、特に大腸菌を使用する
のが好ましい。 本発明の宿主大腸菌としては、腸管寄生性のな
い無毒大腸菌株、例えばエシエリシヤ・コリ
（Escherichia coli）Ｋ−12株に由来する任意の
菌株を使用することができ、例えばJM83，
JM103，JM105，RB791，SM32，N99，RR1，
W3110，χ1776等を使用することができる。 Ｃ 遺伝子系の作製 この発明に係る遺伝子の作製方法の１例は次の
段階すなわち、 (1) ヒト−プロウロキナーゼを完全にコードする
DNA断片を調製する段階； (2) 前記ヒト−プロウロキナーゼのポリペプチド
の135番目のアスパラギン酸をコードするコド
ンに変化を生じさせ、塩基性アミノ酸以外のア
ミノ酸をコードするコドンに転換する段階； (3) 前記ヒト−プロウロキナーゼのポリペプチド
の157番目のアミノ酸をコードするコドンに変
化を生じさせ、酸性アミノ酸をコードするコド
ンに転換する段階； (4) 前記(1)，(2)及び(3)により調製したいずれか２
種類のDNA断片を連結して目的とする安定化
されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチド
をコードするDNA断片を調製する段階；及び、 (5) 前記ポリペプチドのＮ端の少数個のアミノ酸
をコードする前記DNAセグメント中の部分を、
同じアミノ酸をコードし且つ大腸菌中で発現さ
れやすいコドンからなるDNA断片によつて置
き換える段階； を含んで成る。 上記(1)〜(5)の段階の内、段階(1)は必須である
が、段階(2)〜(3)は目的とするヒト−プロウロキナ
ーゼ様ポリペプチドのタイプに応じて選択実施さ
れ、実施の順序は任意に選択することができる。
効率的に発現する遺伝子を得るには段階(5)をも実
施するのが好ましく、この段階を実施する順番は
任意に選択することができる。 本発明の遺伝子系のDNAセグメントは勿論全
合成の手段によつてもよい。その際、天然コドン
に代えて大超菌で発現されやすいコドンを採用す
ることができる。 本発明に関する各種プラスミドの作製の系統図
を第１図に示し、具体的な方法を実施例及び参考
例に記載する。 Ｄ 遺伝子の発現及び発現生成物の特徴付け 前記のようにして作製したプラスミドを適当な
宿主、例えば大腸菌JM103、大腸菌W3110等に形
質転換し、この形質転換体を適当な培地、例えば
50μg／mlのアンピシリンを含有する場合がある
Ｌ−培地中で培養し、大腸菌が一定量、例えば
550nmにおいて吸光度0.3〜0.5まで、増殖した時
に遺伝子の発現を誘導する。この誘導は使用する
プラスミドのプロモーターの種類により異る。例
えば、プラスミドpMUP1pmを使用する場合に
は、これらのプラスミドで形質転換された大腸菌
を30℃で培養し、そして培養温度を42℃に上昇せ
しめることにより誘導する。また、プラスミド
pMUT4Lpm2、又はpMUT4Lpm3を使用する場
合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（IPTG）により誘導する。さらに、プラ
スミドptrpUK2（I135），ptrpUK2（E135），
ptrpUK2（Q135D157），又はptrpUK2
（E135D157）を使用する場合には、培養菌体濃度
が一定値、例えば550nmにおける吸光度0.3〜0.5
に達したときにインドール酢酸を添加することに
より誘導することができる。 このようにして遺伝子の発現を誘導した後、目
的とするポリペプチドを生成せしめるためにさら
に３〜10時間培養する。次に、こうして培養され
た細胞を集め、そして常法に従つて、例えば後の
実施例に具体的に記載する方法に従つて、目的ポ
リペプチドを含有する無細胞抽出液を得る。次
に、場合によつては、これらの抽出液から、抗ウ
ロキナーゼモノクローナル抗体が結合したセフア
ロースカラムによるアフイニテイークロマトグラ
フイーを行なうことによつてプロウロキナーゼ様
ペプチドを精製する。 この発明においては、上記のようにして調製し
た抽出液について、酵素活性、分子量、トリプシ
ン感受性、プラスミン感受性、及びトロンビン感
受性について試験した。 (1) 酵素活性の測定 合成基質法；試料100μに0.2mM Ｓ−2444
（Ｌ−ピログルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ンＰ−ニトロアニリド，Kabi社、スウエーデ
ン）、0.1M Tris−HCl（PH7.5）、0.01％Triton Ｘ
−100を700μ加え37℃にて30分間インキユベー
トした後酢酸100μを加えて反応を停止し、
405nmにおける吸光度を測定する。 フイブリン平板法；１％牛フイブリノーゲン
（Miles社のbovine fibrinogen，95％clottable）、
0.25％アガロースを含む67mMリン酸緩衝液（PH
7.4）に最終濃度１ユニツト／mlとなるようにト
ロンビンを加えて作成したフイブリン平板上に
10μの試料をスポツトし37℃にて16時間インキ
ユベート後の溶解円の面積を測定し標準ウロキナ
ーゼ（日本曹達(株)製）と比較して活性を測定す
る。 (2) 分子量の測定 抽出液サンプルを、２−メルカプトエタノール
を含まない条件でレムリー等の方法（文献30）に
より、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分離し、次にフイブリンオートグラフイーによ
り可視化して標準サンプルと比較することにより
測定する。 (3) トリプシン感受性 サンプルをトリプシンで処理した後、前記(2)の
方法により、処理物中の酵素活性を有する生成物
の分子量を測定する。この試験により、135位の
アミノ酸の置換によるプロウロキナーゼの安定化
を確認する。 (4) プラスミン感受性 サンプルの酵素活性をフイブリン平板法にて測
定し、500IU／mlとなるように50mMベロナール
緩衝液、0.1M NaCl 0.001％ Tween80を含む
溶液に希釈する。これらの溶液100μにプラス
ミンをそれぞれ1μg，2μg，5μg加え、37℃にてイ
ンキユベートし経時的に10μ採取して5μgのダ
イズトリプシンインヒビターを加えて反応を停止
し、Ｓ−2444による合成基質法によつて活性を測
定する。プロウロキナーゼはプラスミンにより
158位のリジンと159位のイソロイシンの間が切断
されて活性化されるため、プラスミン処理により
分解されにくいことが157位のアミノ酸の置換に
よるプロウロキナーゼ様ポリペプチドの安定化の
指標となる。 (5) トロンビン感受性 サンプルの酵素活性をフイブリン平板法にて測
定し、50IU／mlとなるように50mMベロナール
緩衝液、0.1M NaCl 0.001％ Tween80を含む
溶液に希釈する。これらの溶液１mlにトロンビン
１ユニツトを加え、37℃にて30分間インキユベー
トする。100μを採取して天然型酵素について
は1μgのプラスミンで37℃、30分間、変異体につ
いては5μgのプラスミンで37℃、60分間処理し、
Ｓ−2444による合成基質法で活性を測定する。ト
ロンビンを加えずに同様の操作を行なつたものを
対照としてトロンビン処理後の残存活性を求め
る。プロウロキナーゼは、トロンビンにより156
位のアルギニンと157位のフエニルアラニンとの
間の結合が切断された場合ウロキナーゼ活性が低
下する。従つてトロンビン処理後の残存活性が低
下しないことが、157位のアミノ酸の置換により
プロウロキナーゼ様ポリペプチドが安定化された
ことを意味する。 結 果 (1) 酵素活性 この発明のプラスミドにより形質転換された大
腸菌から得られたサンプルはすべて、前記(1)に記
載した酵素活性の測定において、目的の活性を示
した。 (2) トリプシン感受性 135位のアミノ酸及び157位のアミノ酸がいずれ
も置換されていないプロウロキナーゼ様ポリペプ
チドをコードするプラスミドpMUP1；135位の
アミノ酸のみが置換されているプロウロキナーゼ
様ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するプ
ラスミドpMUP1pm，pMUT4Lpm2，ptrpUK2
（I135）及びptrpUK2（E135）；並びに135位のア
ミノ酸及び157位のアミノ酸が共に置換されてい
るプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコードする
遺伝子を含有するプラスミドptrpUK2
（Q135D157）及びptrpUK2（E135D157）のいず
れかにより形質転換された大腸菌から調製したサ
ンプルは、pMUP1由来のサンプルを除きいずれ
もトリプシン処理に対して耐性を示した。 例えば、プラスミドpMUP1及びpMUP1pmの
それぞれを大腸菌W3110に形質転換し、これらの
形質転換菌をＬ−ブロス中で30℃にて培養し、
600nmの0.Dが0.3に達したとき培養温度を42℃に
上昇せしめることにより遺伝子を発現せしめた。 培養菌体を集め、その無細胞抽出液を調製し
た。これらの抽出液についてSDSポリアクリルア
ミドゲル−フイブリンオートグラフイーにより分
子量を推定したところ、いずれの抽出液について
も分子量は約５万であつた（第１３図中レーン２
及び４）。また、両抽出液をトリプシンで処理し
た後同様にして分子量を測定したところ、
pMUP1由来の抽出液においては分子量約３万の
生成物が生じていたが、pMUP1pm由来の抽出液
においては分子量約３万の生成物はほとんど生じ
なかつた（第１３図中レーン３及び５）。 以上の結果から、pMUP1由来の生成物はトリ
プシンによつて容易に低分子化されるのに対して
pMUP1pm由来の本発明の生成物はトリプシンに
より低分子化されないことが明らかである。 同様にして、プラスミドpMUT4Lpm2を大腸
菌JM103に形質転換し、この形質転換菌をＬ−ブ
ロス中で37℃にて550nmにおける吸光度が約0.5
になるまで培養し、誘導剤としてIPTG（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最
終濃度が1mMとなるように添加し、37℃にてさ
らに培養し遺伝子を発現せしめた。この培養菌体
を上記同様に処理し、生成物を上記と同様にして
分析した。 この結果を第１４図に示す。この図中レーン１
は標準ウロキナーゼ（１ユニツト）、レーン２は
pMUP1により形質転換された大腸菌からの粗抽
出液をトリプシンで処理したもの、レーン３は
pMUT4Lpm2により形質転換された大腸菌から
の粗抽出液をトリプシンで処理したもの、レーン
４はpMUPlpmにより形質転換された大腸菌から
の粗抽出液をトリプシン処理したものの結果を示
す。この結果から明らかな通り、pMUT4Lpm2
に由来する遺伝子産物もトリプシンにより低分子
化されにくい。 前記の分子量約５万の生成物及び約３万の生成
物はそれぞれ高分子ウロキナーゼ及び低分子ウロ
キナーゼに相当するものと考えられる。これらの
分子量が人尿由来の標準ウロキナーゼのそれに比
べてやや小さいのは、大腸菌内では糖鎖の付加が
生じないためであると推定される。 135位のアミノ酸置換の普遍性 上記の結果は、ヒト−プロウロキナーゼと実質
的に同一のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端のセリン
から135番目のリジンがグルタミン、スレオリン、
グルタミン酸、又はイソロイシンにより置き換え
られているヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチド
がいずれも天然ヒト−プロウロキナーゼと同様に
フイブリン分解活性すなわちウロキナーゼ活性を
示し、しかも天然ヒト−プロウロキナーゼと異り
トリプシンにより分解されにくいことを明瞭に示
している。 このことは、高分子ウロキナーゼのＮ末端から
135番目と136番目の２個の塩基性アミノ酸（リジ
ン）の間のペプチド結合がトリプシン様プロテア
ーゼにより切断されて低分子ウロキナーゼが生成
するとする推定が正しいことを示している。さら
に、Ｎ末端から135番目のアミノ酸が前記のアミ
ノ酸である場合、いずれもトリプシンによる前記
切断が生じ難いことは、第135位のアミノ酸が塩
基性アミノ酸以外のいずれのアミノ酸であつて
も、135位のアミノ酸と136位のアミノ酸との間の
ペプチド結合が切断され難くなることを示してい
る。 さらに、Ｎ末端から135位目のアミノ酸が、天
然ヒト−ウロキナーゼの様にリジンであつても、
又本発明のヒトウロキナーゼ様ポリペプチドのよ
うに前記のアミノ酸であつてもウロキナーゼ活性
が生ずることは、この135位目のアミノ酸の種類
のいかんはウロキナーゼ活性にとつて必須ではな
いことを示している。 しかも、多くのプロテアーゼは塩基性アミノ酸
を認識すると言われているので、Ｎ末端から135
番目のアミノ酸が塩基性アミノ酸以外のアミノ酸
であればこの明細書において具体的に開示したポ
リペプチドの場合と同様の結果が発揮されると考
えられる。 (3) プラスミン及びトロンビン感受性 157位のアミノ酸のみが置換されているプロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドをコードする遺伝子を
含有するプラスミドpMUT4Lpm3；並びに135位
のアミノ酸及び157位のアミノ酸の両者が置換さ
れているプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有するプラスミドptrpUK2
（Q135D157）及びptrpUK2（E135D157）のいず
れかにより形質転換された大腸菌から調製された
サンプルではいずれもプラスミンによる活性化の
速度が天然型プロウロキナーゼの場合に比べて低
かつた。この結果の１例を第１５図のグラフに示
す。 このグラフから明らかなごとく、この発明の
157位のアミノ酸が置換されたプロウロキナーゼ
様ポリペプチドは、天然形のそれに比べてプラス
ミンにより分解（活性化）されにくいことが明ら
かである。 トロンビン処理した後の残存酵素活性は次の通
りであつた。
動物細胞、微生物、例えば細菌、酵母等を使用す
ることができるが、細菌、特に大腸菌を使用する
のが好ましい。 本発明の宿主大腸菌としては、腸管寄生性のな
い無毒大腸菌株、例えばエシエリシヤ・コリ
（Escherichia coli）Ｋ−12株に由来する任意の
菌株を使用することができ、例えばJM83，
JM103，JM105，RB791，SM32，N99，RR1，
W3110，χ1776等を使用することができる。 Ｃ 遺伝子系の作製 この発明に係る遺伝子の作製方法の１例は次の
段階すなわち、 (1) ヒト−プロウロキナーゼを完全にコードする
DNA断片を調製する段階； (2) 前記ヒト−プロウロキナーゼのポリペプチド
の135番目のアスパラギン酸をコードするコド
ンに変化を生じさせ、塩基性アミノ酸以外のア
ミノ酸をコードするコドンに転換する段階； (3) 前記ヒト−プロウロキナーゼのポリペプチド
の157番目のアミノ酸をコードするコドンに変
化を生じさせ、酸性アミノ酸をコードするコド
ンに転換する段階； (4) 前記(1)，(2)及び(3)により調製したいずれか２
種類のDNA断片を連結して目的とする安定化
されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチド
をコードするDNA断片を調製する段階；及び、 (5) 前記ポリペプチドのＮ端の少数個のアミノ酸
をコードする前記DNAセグメント中の部分を、
同じアミノ酸をコードし且つ大腸菌中で発現さ
れやすいコドンからなるDNA断片によつて置
き換える段階； を含んで成る。 上記(1)〜(5)の段階の内、段階(1)は必須である
が、段階(2)〜(3)は目的とするヒト−プロウロキナ
ーゼ様ポリペプチドのタイプに応じて選択実施さ
れ、実施の順序は任意に選択することができる。
効率的に発現する遺伝子を得るには段階(5)をも実
施するのが好ましく、この段階を実施する順番は
任意に選択することができる。 本発明の遺伝子系のDNAセグメントは勿論全
合成の手段によつてもよい。その際、天然コドン
に代えて大超菌で発現されやすいコドンを採用す
ることができる。 本発明に関する各種プラスミドの作製の系統図
を第１図に示し、具体的な方法を実施例及び参考
例に記載する。 Ｄ 遺伝子の発現及び発現生成物の特徴付け 前記のようにして作製したプラスミドを適当な
宿主、例えば大腸菌JM103、大腸菌W3110等に形
質転換し、この形質転換体を適当な培地、例えば
50μg／mlのアンピシリンを含有する場合がある
Ｌ−培地中で培養し、大腸菌が一定量、例えば
550nmにおいて吸光度0.3〜0.5まで、増殖した時
に遺伝子の発現を誘導する。この誘導は使用する
プラスミドのプロモーターの種類により異る。例
えば、プラスミドpMUP1pmを使用する場合に
は、これらのプラスミドで形質転換された大腸菌
を30℃で培養し、そして培養温度を42℃に上昇せ
しめることにより誘導する。また、プラスミド
pMUT4Lpm2、又はpMUT4Lpm3を使用する場
合にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ
ノシド（IPTG）により誘導する。さらに、プラ
スミドptrpUK2（I135），ptrpUK2（E135），
ptrpUK2（Q135D157），又はptrpUK2
（E135D157）を使用する場合には、培養菌体濃度
が一定値、例えば550nmにおける吸光度0.3〜0.5
に達したときにインドール酢酸を添加することに
より誘導することができる。 このようにして遺伝子の発現を誘導した後、目
的とするポリペプチドを生成せしめるためにさら
に３〜10時間培養する。次に、こうして培養され
た細胞を集め、そして常法に従つて、例えば後の
実施例に具体的に記載する方法に従つて、目的ポ
リペプチドを含有する無細胞抽出液を得る。次
に、場合によつては、これらの抽出液から、抗ウ
ロキナーゼモノクローナル抗体が結合したセフア
ロースカラムによるアフイニテイークロマトグラ
フイーを行なうことによつてプロウロキナーゼ様
ペプチドを精製する。 この発明においては、上記のようにして調製し
た抽出液について、酵素活性、分子量、トリプシ
ン感受性、プラスミン感受性、及びトロンビン感
受性について試験した。 (1) 酵素活性の測定 合成基質法；試料100μに0.2mM Ｓ−2444
（Ｌ−ピログルタミル−グリシル−Ｌ−アルギニ
ンＰ−ニトロアニリド，Kabi社、スウエーデ
ン）、0.1M Tris−HCl（PH7.5）、0.01％Triton Ｘ
−100を700μ加え37℃にて30分間インキユベー
トした後酢酸100μを加えて反応を停止し、
405nmにおける吸光度を測定する。 フイブリン平板法；１％牛フイブリノーゲン
（Miles社のbovine fibrinogen，95％clottable）、
0.25％アガロースを含む67mMリン酸緩衝液（PH
7.4）に最終濃度１ユニツト／mlとなるようにト
ロンビンを加えて作成したフイブリン平板上に
10μの試料をスポツトし37℃にて16時間インキ
ユベート後の溶解円の面積を測定し標準ウロキナ
ーゼ（日本曹達(株)製）と比較して活性を測定す
る。 (2) 分子量の測定 抽出液サンプルを、２−メルカプトエタノール
を含まない条件でレムリー等の方法（文献30）に
より、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り分離し、次にフイブリンオートグラフイーによ
り可視化して標準サンプルと比較することにより
測定する。 (3) トリプシン感受性 サンプルをトリプシンで処理した後、前記(2)の
方法により、処理物中の酵素活性を有する生成物
の分子量を測定する。この試験により、135位の
アミノ酸の置換によるプロウロキナーゼの安定化
を確認する。 (4) プラスミン感受性 サンプルの酵素活性をフイブリン平板法にて測
定し、500IU／mlとなるように50mMベロナール
緩衝液、0.1M NaCl 0.001％ Tween80を含む
溶液に希釈する。これらの溶液100μにプラス
ミンをそれぞれ1μg，2μg，5μg加え、37℃にてイ
ンキユベートし経時的に10μ採取して5μgのダ
イズトリプシンインヒビターを加えて反応を停止
し、Ｓ−2444による合成基質法によつて活性を測
定する。プロウロキナーゼはプラスミンにより
158位のリジンと159位のイソロイシンの間が切断
されて活性化されるため、プラスミン処理により
分解されにくいことが157位のアミノ酸の置換に
よるプロウロキナーゼ様ポリペプチドの安定化の
指標となる。 (5) トロンビン感受性 サンプルの酵素活性をフイブリン平板法にて測
定し、50IU／mlとなるように50mMベロナール
緩衝液、0.1M NaCl 0.001％ Tween80を含む
溶液に希釈する。これらの溶液１mlにトロンビン
１ユニツトを加え、37℃にて30分間インキユベー
トする。100μを採取して天然型酵素について
は1μgのプラスミンで37℃、30分間、変異体につ
いては5μgのプラスミンで37℃、60分間処理し、
Ｓ−2444による合成基質法で活性を測定する。ト
ロンビンを加えずに同様の操作を行なつたものを
対照としてトロンビン処理後の残存活性を求め
る。プロウロキナーゼは、トロンビンにより156
位のアルギニンと157位のフエニルアラニンとの
間の結合が切断された場合ウロキナーゼ活性が低
下する。従つてトロンビン処理後の残存活性が低
下しないことが、157位のアミノ酸の置換により
プロウロキナーゼ様ポリペプチドが安定化された
ことを意味する。 結 果 (1) 酵素活性 この発明のプラスミドにより形質転換された大
腸菌から得られたサンプルはすべて、前記(1)に記
載した酵素活性の測定において、目的の活性を示
した。 (2) トリプシン感受性 135位のアミノ酸及び157位のアミノ酸がいずれ
も置換されていないプロウロキナーゼ様ポリペプ
チドをコードするプラスミドpMUP1；135位の
アミノ酸のみが置換されているプロウロキナーゼ
様ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するプ
ラスミドpMUP1pm，pMUT4Lpm2，ptrpUK2
（I135）及びptrpUK2（E135）；並びに135位のア
ミノ酸及び157位のアミノ酸が共に置換されてい
るプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコードする
遺伝子を含有するプラスミドptrpUK2
（Q135D157）及びptrpUK2（E135D157）のいず
れかにより形質転換された大腸菌から調製したサ
ンプルは、pMUP1由来のサンプルを除きいずれ
もトリプシン処理に対して耐性を示した。 例えば、プラスミドpMUP1及びpMUP1pmの
それぞれを大腸菌W3110に形質転換し、これらの
形質転換菌をＬ−ブロス中で30℃にて培養し、
600nmの0.Dが0.3に達したとき培養温度を42℃に
上昇せしめることにより遺伝子を発現せしめた。 培養菌体を集め、その無細胞抽出液を調製し
た。これらの抽出液についてSDSポリアクリルア
ミドゲル−フイブリンオートグラフイーにより分
子量を推定したところ、いずれの抽出液について
も分子量は約５万であつた（第１３図中レーン２
及び４）。また、両抽出液をトリプシンで処理し
た後同様にして分子量を測定したところ、
pMUP1由来の抽出液においては分子量約３万の
生成物が生じていたが、pMUP1pm由来の抽出液
においては分子量約３万の生成物はほとんど生じ
なかつた（第１３図中レーン３及び５）。 以上の結果から、pMUP1由来の生成物はトリ
プシンによつて容易に低分子化されるのに対して
pMUP1pm由来の本発明の生成物はトリプシンに
より低分子化されないことが明らかである。 同様にして、プラスミドpMUT4Lpm2を大腸
菌JM103に形質転換し、この形質転換菌をＬ−ブ
ロス中で37℃にて550nmにおける吸光度が約0.5
になるまで培養し、誘導剤としてIPTG（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最
終濃度が1mMとなるように添加し、37℃にてさ
らに培養し遺伝子を発現せしめた。この培養菌体
を上記同様に処理し、生成物を上記と同様にして
分析した。 この結果を第１４図に示す。この図中レーン１
は標準ウロキナーゼ（１ユニツト）、レーン２は
pMUP1により形質転換された大腸菌からの粗抽
出液をトリプシンで処理したもの、レーン３は
pMUT4Lpm2により形質転換された大腸菌から
の粗抽出液をトリプシンで処理したもの、レーン
４はpMUPlpmにより形質転換された大腸菌から
の粗抽出液をトリプシン処理したものの結果を示
す。この結果から明らかな通り、pMUT4Lpm2
に由来する遺伝子産物もトリプシンにより低分子
化されにくい。 前記の分子量約５万の生成物及び約３万の生成
物はそれぞれ高分子ウロキナーゼ及び低分子ウロ
キナーゼに相当するものと考えられる。これらの
分子量が人尿由来の標準ウロキナーゼのそれに比
べてやや小さいのは、大腸菌内では糖鎖の付加が
生じないためであると推定される。 135位のアミノ酸置換の普遍性 上記の結果は、ヒト−プロウロキナーゼと実質
的に同一のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端のセリン
から135番目のリジンがグルタミン、スレオリン、
グルタミン酸、又はイソロイシンにより置き換え
られているヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチド
がいずれも天然ヒト−プロウロキナーゼと同様に
フイブリン分解活性すなわちウロキナーゼ活性を
示し、しかも天然ヒト−プロウロキナーゼと異り
トリプシンにより分解されにくいことを明瞭に示
している。 このことは、高分子ウロキナーゼのＮ末端から
135番目と136番目の２個の塩基性アミノ酸（リジ
ン）の間のペプチド結合がトリプシン様プロテア
ーゼにより切断されて低分子ウロキナーゼが生成
するとする推定が正しいことを示している。さら
に、Ｎ末端から135番目のアミノ酸が前記のアミ
ノ酸である場合、いずれもトリプシンによる前記
切断が生じ難いことは、第135位のアミノ酸が塩
基性アミノ酸以外のいずれのアミノ酸であつて
も、135位のアミノ酸と136位のアミノ酸との間の
ペプチド結合が切断され難くなることを示してい
る。 さらに、Ｎ末端から135位目のアミノ酸が、天
然ヒト−ウロキナーゼの様にリジンであつても、
又本発明のヒトウロキナーゼ様ポリペプチドのよ
うに前記のアミノ酸であつてもウロキナーゼ活性
が生ずることは、この135位目のアミノ酸の種類
のいかんはウロキナーゼ活性にとつて必須ではな
いことを示している。 しかも、多くのプロテアーゼは塩基性アミノ酸
を認識すると言われているので、Ｎ末端から135
番目のアミノ酸が塩基性アミノ酸以外のアミノ酸
であればこの明細書において具体的に開示したポ
リペプチドの場合と同様の結果が発揮されると考
えられる。 (3) プラスミン及びトロンビン感受性 157位のアミノ酸のみが置換されているプロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドをコードする遺伝子を
含有するプラスミドpMUT4Lpm3；並びに135位
のアミノ酸及び157位のアミノ酸の両者が置換さ
れているプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含有するプラスミドptrpUK2
（Q135D157）及びptrpUK2（E135D157）のいず
れかにより形質転換された大腸菌から調製された
サンプルではいずれもプラスミンによる活性化の
速度が天然型プロウロキナーゼの場合に比べて低
かつた。この結果の１例を第１５図のグラフに示
す。 このグラフから明らかなごとく、この発明の
157位のアミノ酸が置換されたプロウロキナーゼ
様ポリペプチドは、天然形のそれに比べてプラス
ミンにより分解（活性化）されにくいことが明ら
かである。 トロンビン処理した後の残存酵素活性は次の通
りであつた。
【表】
以上の結果は、157位のアミノ酸が置換された
プロウロキナーゼ様ポリペプチドはトロンビンに
対して不活性化されにくいことを示している。 以上のごとく、135位のリジンが塩基性アミノ
酸以外のアミノ酸により置き換えられているヒト
−プロウロキナーゼ様ポリペプチド、157位のフ
エニルアラニンが酸性アミノ酸により置き換えら
れているヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチ
ド、及びこれら両アミノ酸が上記のように置き換
えられているヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプ
チドは、この発明において定義されるアミノ酸の
範囲内において、いずれも、天然型ヒト−プロウ
ロキナーゼと同様の生理的活性を有し、しかも、
トリプシン、プラスミン、トロンビン等のプロテ
アーゼ類に対して極めて安定化されていることが
明らかである。 このことは、本発明の安定化されたヒト−プロ
ウロキナーゼ様ポリペプチドが、血栓溶解剤等の
医薬の活性成分として有望であることを示してい
る。 なお、本発明に従つて157位のアミノ酸が置換
されたプロウロキナーゼ様ポリペプチドは、生体
内に投与された場合、活性化されるまでにかなり
の時間がかかり、且つ効果が持続性であるため、
血栓形成に対する予防薬としても有望である。 次に実施例及び参考例によりこの発明をさらに
具体的に説明する。但し、この発明の範囲がこれ
らの実施例により限定されるものではない。 参考例１ mRNAの調製 J.M.Chirgwinらの方法（文献11）に従い、グ
アニジンチオシアナートを用いる方法によつて
mRNAを調製した。 −80℃に凍結しておいた腎組織20gを液体窒素
中でワーリングブレンダーにて破砕し、5Mグア
ニジンチオシアナート溶液（5Mグアニジンチオ
シアナート、0.5％Ｎ−ラウロイルサルコシンナ
トリウム、25mM酒石酸ナトリウム、0.1Mメト
カプトエタノール、0.1％アンチフオームＡ）80
mlに懸濁した。この液をテフロンホモゲナイザー
で均質化し、20G1/2注射針を用いて核酸を剪断
した。5.7M CsCl 12mlに前記溶液24mlを重層し、
ベツクマン超遠心機SW28ローターにより15℃に
て24時間、25000rpmで遠心後、粗全RNAを回収
した。 ２％酢酸カリウム溶液に粗全RNAを溶解し、
２倍容量のエタノールを加えて、−20℃にて一晩
放置後、沈澱を遠心により回収精製した。 ポリ(A)+RNAはH.Avivらの方法（文献12）に
従い、オリゴ（dT）セルロースカラムクロマト
グラフイーにより全RNAから単離精製した。 腎組織10gからの収量は、全RNAは約３mgで
あり、その２〜３％がポリ(A)+RNAであつた。 参考例２ cDNAライブラリー（）の作製 参考例１で得られたポリ(A)+RNA40μgを用い
てcDNA合成を行つた。オリゴ（dT）12-1840μgを
プライマーとして、逆転写酵素40ユニツトを用い
て、42℃にて２時間反応させて第一鎖を合成し、
鋳型のmRNAをアルカリ処理で除き、第二鎖の
合成を100ユニツトのE.coliDNAポリメラーゼ
IKlenow断片を用いて行つた。 S1ヌクレアーゼでヘアピン部をとり除き、末
端デオキシヌクレオチジル転移酵素により、二重
鎖cDNAの3′端に（dC）10-20鎖を結合し、約
400ngの（dC）テイルcDNAを得た。 これを市販の（dG）テイルpBR322（PstI部）
（New England Nuclear製）800ngとアニール
し、大腸菌χ1776を、Hanahanの方法（文献13）
により形質転換し、テトラサイクリン耐性で且つ
アンピシリン感受性の形質転換菌約２×105個か
らなるcDNAライブラリー（）を得た。 これらの形質転換菌についてアルカリ溶菌法に
よる迅速単離法（文献14）によりcDNA挿入断片
の大きさを調べた。 参考例３ cDNAライブラリー検索用プローブと
しての合成DNAオリゴマーの調製 G.J.Sfeffens等（文献８）及びGunzlar等（文
献９）により報告されたヒトウロキナーゼのアミ
ノ酸配列Asn169．Gln.Pro.Trp.Phe173に対応する
mRNAに相補的な14塩基からなる下記のDNAオ
リゴマー16種類をホスホトリエステル法により合
成した。 5′AACCAAGGTTGATT 3′ AACCAAGGTTGGTT AACCAGGGTTGATT AACCACGGTTGATT AACCACGGTTGGTT AACCATGGTTGATT AACCATGGTTGGTT AACCAAGGCTGATT AACCAAGGCTGGTT AACCAGGGCTGATT AACCAGGGCTGGTT AACCACGGCTGATT AACCACGGCTGGTT AACCATGGCTGATT AACCATGGCTGGTT AACCAGGGTTGGTT これら16種類のDNAオリゴマーをUKプロー
ブと称する。 また、確認用プローブとしてMet283．Try.
Asn.Asp.Pro287に対応するmRNAに相補的な14
塩基から成る下記のDNAオリゴマー８種類の
DNAオリゴマーを同様にして合成した。 5′GGATCATTATACAT 3′ GGATCGTTATACAT GGATCGTTGTACAT GGATCATTGTACAT GGGTCATTATACAT GGGTCGTTATACAT GGGTCGTTGTACAT GGGTCATTGTACAT これら８種類のDNAオリゴマーをUKプロー
ブと称する。 これら、UKプローブ及びUKプローブの
それぞれ200ngずつを、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて3000Ci／mmole32PγATPにより
5′端放射能標識を行い、コロニーハイブルダイゼ
ーシヨン用プローブとした。 参考例４ cDNAライブラリー（）検索 (1) 検索 15μg／mlのテトラサイクリンを含有するLB寒
天培地に、オートクレーブ殺菌したニトロセルロ
ースフイルター（0.45μm，TYPE TM−２）
（東洋濾紙製）を置き、約2000個の形質転換菌コ
ロニーが生育するように、実施例２において調製
した形質転換菌を撒いた。37℃にて８時間培養し
た後、２枚のニトロセルロースフイルターにレプ
リカ（複写）し、これをさらに37℃にて３時間培
養した。最初のニトロセルロースフイルターをマ
スターフイルターとし、後者の２枚を、15μg／
mlのテトラサイクリン及び100μg／mlのクロラム
フエニコールを含有するLB寒天培地に移し、37
℃にて一晩培養した。次に、Grunstein Hogness
の変法（文献15）に従つて0.5M NaOH及び
1.5M NaCl上に３分間フイルターを置き、コロ
ニーの溶菌及びDNAの変性を行い、0.5M Tris
−HCl（PH7.6）及び1.5M NaCl上で中和し、フイ
ルターを風乾し、そして80℃にて２時間焼成し
た。 次に、フイルターを４×SSC中で60℃にて30分
間ずつ洗浄し、続いて４×SSC，10×Denhardt
及び50μg／ml変性E.coli−DNA中で60℃にて１
時間プレハイブリダイゼーシヨンを行い、さらに
0.1mM ATP及び放射能標識UKプローブ（約
107cpm／フイルター）を加えて37℃にて16時間
ハイブリダイゼーシヨンを行つた。４×SSC中で
39℃にて６〜８回洗浄した後、フイルターを風乾
し、オートラジオグラフイーにより、UKプロー
ブとハイブリダイブする形質転換菌を検索し
た。この方法により８×104個のコロニーから21
個の候補クローンを得た。これらのクローンのプ
ラスミドをpKYU1〜pKYU21と称する。 得られた候補クローン21個を上記と同様に処理
し、UKプローブとハイブリダイズするクロー
ンを得た。このクローン中のプラスミドを
pKYU21と称する（第３図）。 (2) pKYU21プラスミドDNAの特性 pKYU21プラスミドDNAを各種の制限酵素で
消化し、Maxam−Gilbert法（文献16）により、
又はMl3mp8にサブクローン化した後ジデオキシ
チエインターミネーシヨン法（文献17）により、
塩基配列の決定を行つた。これをウロキナーゼの
公知のアミノ酸配列と対照した結果、cDNAは低
分子ウロキナーゼのコード領域を完全に含むが、
高分子ウロキナーゼのコード領域中の5′端領域の
約100bpのDNAが欠損していることが確認され
た。 参考例５ プライマー延長反応によるcDNAライ
ブラリー（）の作製 参考例４(2)において決定した塩基配列に基づ
き、89Ser.Asp.Ala.Leu.Glu93に対応するmRNA
の配列に相補的な15塩基から成るDNAオリゴマ
ー： 5′CTGAAGAGCATCAGA 3′ をホスホトリエステル法によつて合成した。 鋳型としてポリ(A)+RNAを100μgを用い、
Agarwall等（文献18）、又はStewart等（文献
19）の方法に基づき、5′端32P-標識プライマー1
μgと共に逆転写酵素100ユニツトにより第１鎖
cDNAを合成し、次にE.coliDNAポリメラーゼ
IKlenow断片100ユニツトを用いて第２鎖を合成
した。次にS1ヌクレアーゼにより一重鎖DNAを
消化し、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を
用いて3′端に（dC）ｎ鎖を付加した。このdCテ
イルインサート（cDNA）とdGテイルベクター
（ｐ BP322）とをアニールした後、大腸菌
χ1776を形質転換して約５×104個の形質転換体か
らなるcDNAライブラリー（）を得た。 参考例６ cDNAライブラリー（）の検索 参考例５において得た形質転換菌を、参考例４
(1)に記載した方法と同様にして処理しハイブリダ
イゼーシヨンを行つた。この場合pKYU21から
の150bp Pst−Bgl5′端消化断片を、α32
PdCTP（3000Ci／mmole）を用いてニツクトラ
ンスレーシヨン法（文献13）により放射能標識し
たものをプローブとして用いた。ハイブリダイゼ
ーシヨンを60℃にて行つた。 次に、２×SSCにより60℃にて２〜３回フイル
ターを洗浄し、風乾し、オートラジオグラフイー
により上記のプローブとハイブリダイズするクロ
ーンを検索した。約３×104個のクローンから８
個の陽性クローンを得た。これらのクローン中の
プラスミドpPE1〜pPE8と称する これらのプラ
スミドDNAを制限酵素Pstで消化した結果、プ
ラスミドpPE3（第２図）が約420bpのcDNA挿入
部を含有することが確認された。 このプラスミドpPE3のDNAを制限酵素Pst
で消化して得られた断片をM13mp8にサブクロー
ン化し、ジデオキシチエインターミネーシヨン法
（文献17）により塩基配列の決定を行つたところ、
プロウロキナーゼ遺伝子の5′端側の十分な長さの
コード領域を含み、さらに翻訳開始コドンATG
の上流に66bpから成る5′非翻訳領域を含むことが
確認された（第２図）。 参考例７ プロウロキナーゼ遺伝子の作製（第３
図） 低分子ウロキナーゼの完全なコード領域を含む
プラスミドpKYU21のDNA5μgをそれぞれ10ユ
ニツトずつの制限酵素Bg1及びHindにより
二重消化し、そして電気溶出して、約5.7Kbの
DNA断片を得、他方同プラスミドpKYU21の
DNAをそれぞれ10ユニツトずつのBgl及び
Ncoにより二重消化し、そして電気溶出して
66bpのDNA断片を得た。また、参考例６におい
て得たプラスミドpPE3のDNA5μgをそれぞれ10
ユニツトずつのNco及びHindにより二重消
化して約1.1kbDNA断片を得た。これら３種の
DNA断片はフエノール／クロロホルム抽出を繰
り返し、２倍量のエタノールで沈澱をすることに
より精製回収した。これら３種類のDNA断片を
T4DNAリガーゼにより連結し、大腸菌χ1776を
形質転換した。得られた形質転換体をアルカリ溶
菌法による迅速単離法により調べ、プロウロキナ
ーゼの完全な遺伝子を含むプラスミドpKYU22
を有するクローンを得た。このクローンエシエリ
シヤ・コリ（Escherichia coli）χ1766／
pKYU22は1985年１月11日に工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第8041号（FERMP
−8041）として寄託され、1986年１月22日に微工
研条寄第968号（FERM BP−968）として、ブ
タペスト条約に基く国際寄託に移管された。 参考例８ プラスミドpKYU22の挿入部の塩基
配列の決定 プラスミドpKYU22の挿入部の塩基配列を、
Maxam−Gilbert法、及びM13mp8にサブクロー
ン化した後のジデオキシチエインターミネーシヨ
ン法により決定した。この結果を第４−１図〜第
４−３図に示す。この結果と文献20に記載されて
いる塩基配列とを比較した場合、254番目のアミ
ノ酸Asnのコドン（AAT）（文献ではAAC）、
360番目（第４−２図中のアミノ酸の番号）のア
ミノ酸LeuのコドンCTG（文献ではCTA）、365番
目のアミノ酸ProのコドンCCA（文献ではCCC）、
及び366番目のアミノ酸GlnのコドンCAG（文献で
はCAA）において相互に異なつていた。AATは
大腸菌において翻訳されにくいコドンであるが、
CTG及びCAGはともに大腸菌において翻訳され
やすい（使用頻度が高い）と言われ、大腸菌にお
ける発現にとつて有利となる。なお、CCCは
CCAより若干有利であると考えられる。 参考例９ 5′端を変形したプロウロキナーゼ遺伝
子の合成（第５図） 参考例７において作製した、プロウロキナーゼ
をコードする天然型cDNAの5′端部分の約30bpの
構造を、プロウロキナーゼ遺伝子がシユードモナ
ス由来のC230遺伝子のSD配列のもとで大腸菌中
で効率よく発現されるように変形した。 下記の、29塩基、15塩基及び20塩基からなる３
種類の単鎖DNAオリゴマーをホスホトリエステ
ル法により合成した。
5′CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCG
Ｔ 3′ 3′TGCAGTACTCGTTGC 5′ 3′TCGAGGTGGTCCAAGGCAGC 5′ 次に、これら３種類の合成DNAオリゴマー
1μgずつを95℃にて２分間加熱処理した後、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼにより5′端燐酸化し、セ
ツプパツク（C18）カラム（Waters製）により精
製し、乾燥した後、20mM Tris−HCl（PH7.6）、
10mM MgCl2の溶液50μに溶解し、95℃にて２
分間加熱した後室温まで徐冷し、12℃にて一晩保
持することによつてアニールし、下記に示す二重
鎖DNAを得た。 5′
CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT
3′ 3′TGCAGTACTCGTTGCTCGAGGTGGTCC
ＡＡＧＧＣＡＧＣ Aat Sst BstNI Taq 一方、プラスミドpKYU22のDNA5μgを制限
酵素Bgl及びAatにより二重消化し、約
5.7KbのDNA断片を電気溶出により回収した。
他方、同じプラスミドpKYU22のDNA5μgを制
限酵素Pst及びBglにより二重消化し、電気
溶出して約400bpのDNA断片を得。さらにこれ
を制限酵素Taqで消化して電気溶出することに
より約260bpのDNA断片を回収した。これら２
種類のDNA断片はフエノール／クロロホルム抽
出および２倍量のエタノールによる沈澱により精
製回収した。 これら２種類のDNA断片と、前記の合成二重
鎖DNAオリゴマーとをT4DNAリガーゼにより
連結し、大腸菌χ1776を形質転換した。形質転換
体をアルカリ溶菌法による迅速単離法により調
べ、変形されたプロウロキナーゼ遺伝子を含有す
るプラスミドpKMU1を有するクローン、エシエ
リシヤ・コリ（Escherichia coli）χ1776／
pKMU1を得た。このプラスミドpKMU1が導入
された大腸菌エシエリシヤ・コリ（Escherichia
coli）χ1776／pKMU1は工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第8040号（FERMP−
8040）として寄託されている。 参考例10 プロウロキナーゼの直接発現型プラス
ミド（pMUT4L）の作製（第６図） 参考例９において得られた5μgのプラスミド
pKMU1を制限酵素Aat10ユニツトにより消化
し、子牛消化管ホスフアターゼ（CIP）で処理
し、単離した。他方、5μgのプラスミドpTCM1
を制限酵素Aat10ユニツトにより消化し、電気
溶出法により約500bpのDNA断片を単離した。
これら２種類のDNA断片はフエノール／クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱を繰り返すこと
によつて精製回収した。 両者をT4DNAリガーゼにより連結し、大腸菌
JM103に形質転換した。形質転換体をアルカリ溶
菌法による迅速単離法によつて調べ、tacプロモ
ーター／オペレーター及びC230SD配列がプロウ
ロキナーゼ遺伝子に対して正方向に入つたプラス
ミドpMUT1Lを有するクローンを得た。 前記のプラスミドpTCM1は、発明者等によつ
て作製された新規なプラスミドであつて、tacプ
ロモーター／オペレーター、lacSD及びC230SD
配列から成る発現制御領域、並びにC230構造遺
伝子を含有する。このプラスミドが導入された大
腸菌エシエリシヤ・コリ（Escherichia coli）
JM103／pTCM1は工業技術院微生物工業技術研
究所に、微工研菌寄第7779号（FERM Ｐ−
7779）として寄託されている。 プラスミドpMUT1Lにおいては、tacプロモー
ター／オペレーター、lacSD及びC230SDからな
る発現制御領域の下流の適切な位置に本発明の変
形されたプロウロキナーゼ遺伝子が挿入されてい
る。 次にプラスミドpKK223−３（文献22−23およ
び24）5μgを制限酵素Hind10ユニツトで消化
し、子牛消化管ホスフアターゼ（P.L.
Biochemicals）で処理した。 一方、前記のようにして得た1μgのプラスミド
pMUT1Lを４ユニツトの制限酵素Draで消化
し、この消化断片と5′端燐酸化したHindリン
カー（dCAAGCTTG）1μgとをT4DNAリガー
ゼにより連結し、次に12ユニツトの制限酵素
Hindで消化し、0.15M NaCl溶液とし、等容
量のフエノール／クロロホルムで抽出後、これに
２倍容量のエタノールを加えてDNAを沈澱せし
め、16000tpm、４℃にて沈澱物を集め、これを
乾燥した。 このpMUT1L消化断片と、前記のpKK223−
３のHind消化断片とをT4DNAリガーゼによ
り連結し、大腸菌JM103を形質転換した。これら
の形質転換菌をアルカリ溶菌法による迅速単離法
により調べ、プラスミドpMUT2Lを含むクロー
ンエシエリシヤ・コリ（Escherichia coli）
JM103／pMUT2Lを得た。 このプラスミドは、プロウロキナーゼ遺伝子の
上流に前記の発現制御領域を有すると共に、下流
にpKK223−３由来の大腸菌のリボゾーム遺伝子
の転写ターミネーター（rrnB，T1T2）を有す
る。 なお、プラスミドpKK223−３はPharmacia
Ｐ−Ｌ Biochemicalsから販売されており、容
易に入手することができる。 5μgのプラスミドpMUT2Lを、10ユニツトずつ
の制限酵素Sph及びTth111 によりより消化
し、フエノール／クロロホルム抽出後、エタノー
ルで沈澱せしめ、回収したDNAを0.1mMの
dGTP，dCTP，dATP及びTTPの存在下でT4
ポリメイラーゼを用いて末端を平滑化し、
T4DNAリガーゼにより再環化した。これを大腸
菌JM103に形質転換し、50μg／mlのアンピシリ
ンを含有するLB寒天培地上にコロニーを形成せ
しめ、アルカリ溶菌法による迅速単離法（文献
14）で調べ、プラスミドpMUT4Lを含むクロー
ンエシエリシヤ・コリ（Escherichia coli）
JM103／pMUT4Lを得た。 実施例１ M13フアージを用いる135位のアミノ
酸のコドンへの特異的塩基置換変異の導入(1) １ １本鎖鋳型DNAの調製（第７図） プラスミドpKYU22及びフアージM13pm8二本
鎖DNAそれぞれ1μgずつを、10mM TrisHCl（PH
7.5）、7mM MgCl2、7mM β−メルカプトエタ
ノール及び50mM NaClを含有する溶液20μ中
で、５ユニツトのPstを用いて37℃にて１時間
消化した。フエノール処理、エタノール沈澱によ
つてそれぞれのDNA断片を回収し、両者を混合
した後、66mM Tris−HCl（PH7.5）、5mM
MgCl2、5mM DTT及び1mM ATPを含有する
溶液20μ中で100ユニツトのT4DNAリガーゼを
用いて12℃にて16時間連結反応を行つた。反応
後、反応液を用いてメツシング等の方法（文献
25）に従つて大腸菌JM103を形質転換し、0.02％
Ｘ−gal及び1mM IPTGを含有する軟寒天と共に
プレートし、37℃にて一晩培養した。組換体によ
つて形成された白いプラークより一本鎖型DNA
を調製した。すなわち、白いプラークをつまよう
じの先端で釣り、大腸菌JM103が生育している
1.5mlの２×YT培養液（1.6％バクトトリプトン、
１％酵母エキストラクト及び0.5％NaCl）中に懸
濁して37℃にて５時間培養し、そして培養液上清
から、ポリエチレングリコール沈澱、フエノール
処理及びエタノール沈澱によつて一本鎖組換体フ
アージDNAを回収した。 得られた一本鎖DNAを鋳型としてメツシング
らの方法（文献25）に従つてジデオキシ法により
塩基配列を決定し、クローニングされた一本鎖
DNAの配列を確認した。第７図に示すように、
コーデイング鎖及びアンチコーデイング鎖が得ら
れた。 ２ オリゴヌクレオチドをプライマーとする二本
鎖DNAの合成（第８図） 上記のようにして得られた一本鎖DNAの内、
クローン化されたアンチコーデイング鎖を鋳型と
して用い、合成オリゴヌクレオチド： 5′GATGGACAAAAGCCC 3′ をプライマー(1)として、DNAポリメラーゼ
Klenow断片による修復反応を行つた。すなわ
ち、鋳型一本鎖DNA0.5pmoleに5′末端を燐酸化
したプライマー2pmoleを加え、そして7mM
Tris−HCl（PH7.5），0.1mM EDTA，20mM
NaCl及び7mM MgCl2を含有する溶液10μ中で
60℃にて20分間インキユベートし、続いて23℃に
て20分間インキユベートした。さらに、この反応
混合物に、dATP，dGTP，dTTP及びdCTPを
それぞれ0.5mMになるように加え、全体を20μ
としてDNAポリメラーゼKlenow断片２ユニツ
トを加え、そして23℃にて20分間インキユベート
した。続いて、10mM ATPを1μ及びT4DNA
リガーゼ１ユニツトを加え、12℃にて一晩インキ
ユベートした。 ３ S1ヌクレアーゼによる消化 上記のようにして得られた二本鎖DNAからバ
ツクグラウンドとなる未反応の一本鎖DNAを除
去するためにS1ヌクレアーゼによる消化を行つ
た。すなわち、上記反応液2μを280mM NaCl，
4.5mM ZnCl2，30mM NaOAc（PH４〜4.5）を含
有する反応液25μに溶解し、2.3ユニツトのS1ヌ
クレアーゼを加えて26℃にて30分間処理した。反
応後、0.25M Tris−HCl（PH8.0）10μを加えて
反応を停止した。 ４ 大腸菌JM103の形質転換 上記反応液10μを用いてメツシング等の法
（文献25）に従い大腸菌JM103を形質転換した。 ５ 変異体の検索 上記のようにして得られたフアージプラークに
ついて、プライマーとして用いたオリゴヌクレオ
チド（32Pで標識したもの）をプローブとして用
いて、プラークハイブリダイゼーシヨンによる変
異体フアージのスクリーニングを行つた。すなわ
ち、ベントン・デイビス等の方法（文献26）に従
つて軟寒天培地からニトロセルロースフイルター
にプラークを移し、真空中80℃にて２時間ベーキ
ングした。このニトロセルロースフイルターを６
×SSC，10×Denhardt溶液中で、32Pで標識した
プライマーオリゴヌクレチオチドをプローブとし
て23℃にて一晩ハイブリダイゼーシヨンを行つ
た。次に、このフイルターを６×SSC中で4.6℃
にて洗浄し、そしてオートラジオグラフイーを行
い陽性シグナルを示す変異体フアージプラークを
単離した。この変異体フアージから変異２本鎖型
フアージDNA（pml）を得た。 ６ 変異体DNAの塩基配列の決定 変異体フアージDNAを鋳型としてジデオキシ
法により塩基配列を決定し、一塩基置換変異が生
じたことを確認した。 実施例２ M13フアージを用いる135位のアミノ
酸のコドンへの特異的塩基置換変異の導入(2) 実施例１で用いたものと同じ組換え体M13フア
ージー本鎖DNA（ウロキナーゼ遺伝子のアンチコ
ーデイング鎖がクローニングされている。）を鋳
型として新たなオリゴヌクレオチド変異原剤によ
る部位特異的変異導入をおこなつた。但し、プラ
イマー(2)として次の合成オリゴヌクレオチド： 5′GGAACAAAGCCCTCCTCT 3′ を用いた。この18塩基のオリゴヌクレオチドは一
本鎖鋳型DNA中のウロキナーゼ遺伝子と相補的
であるがリジンコドンAAAがスレオニンコドン
ACAへと一塩基のみ変化している。 このオリゴヌクレオチドをプライマーとして試
験管内で二本鎖DNAを合成した。すなわち、鋳
型一本鎖DNA0.5pmoleに5′末端をリン酸化した
プライマー2pmoleを加え、そして7mM Tris−
HCl（PH7.5），0.1mM EDTA，20mM NaCl及び
7mM MgCl2を含有する溶液10μ中で、60℃に
て20分間インキユベートし、続いて23℃にて20分
間インキユベートした。さらにこの反応混合物に
dATP，dGTP，dTTP、及びdCTPをそれぞれ
0.5mMになるように加え、全体を20μとして
DNAポリメラーゼKlenow断片２ユニツトを加
え、そして23℃にて20分間インキユベートした。
続いて10mM ATPを1μ及びT4DNAリガーゼ
１ユニツトを加え、12℃にて一晩インキユベート
した。上記反応液を直接、メツシング等の方法
（文献25）に従つて大腸菌JM103に形質転換した。
このようにして上記反応液1μ当たり約１万個
のフアージプラークが得られた。 得られたプラークを軟寒天培地からベントン・
デイビス等の方法（文献26）に従つてニトロセル
ロースフイルターに移したのち、真空中80℃にて
２時間ベーキングした。このニトロセルロースフ
イルターを６×SSC，10×Denhardt溶液中で32P
で標識したプライマーオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして37℃にて一晩ハイブリダイゼーシヨン
を行つた。次にこのフイルターを６×SSC中で52
℃にて洗浄し、そしてオートラジオグラフイーを
行い陽性シグナルを示す変異体フアージプラーク
を単離した。この変異体フアージから変異体２本
鎖型フアージDNA（pm2）を得た。変異体DNA
の塩基配列は、変異体フアージDNAを鋳型とす
るジデオキシ法により塩基配列を決定し、目的と
する一塩基置換変異が生じたことを確認した。 同様にして、例えば下記の右欄の変異剤オリゴ
ヌクレオチドを用いることにより、135番目のア
ミノ酸リジンに代る下記左欄のアミノ酸をコード
するコドンを導入することができる。
プロウロキナーゼ様ポリペプチドはトロンビンに
対して不活性化されにくいことを示している。 以上のごとく、135位のリジンが塩基性アミノ
酸以外のアミノ酸により置き換えられているヒト
−プロウロキナーゼ様ポリペプチド、157位のフ
エニルアラニンが酸性アミノ酸により置き換えら
れているヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチ
ド、及びこれら両アミノ酸が上記のように置き換
えられているヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプ
チドは、この発明において定義されるアミノ酸の
範囲内において、いずれも、天然型ヒト−プロウ
ロキナーゼと同様の生理的活性を有し、しかも、
トリプシン、プラスミン、トロンビン等のプロテ
アーゼ類に対して極めて安定化されていることが
明らかである。 このことは、本発明の安定化されたヒト−プロ
ウロキナーゼ様ポリペプチドが、血栓溶解剤等の
医薬の活性成分として有望であることを示してい
る。 なお、本発明に従つて157位のアミノ酸が置換
されたプロウロキナーゼ様ポリペプチドは、生体
内に投与された場合、活性化されるまでにかなり
の時間がかかり、且つ効果が持続性であるため、
血栓形成に対する予防薬としても有望である。 次に実施例及び参考例によりこの発明をさらに
具体的に説明する。但し、この発明の範囲がこれ
らの実施例により限定されるものではない。 参考例１ mRNAの調製 J.M.Chirgwinらの方法（文献11）に従い、グ
アニジンチオシアナートを用いる方法によつて
mRNAを調製した。 −80℃に凍結しておいた腎組織20gを液体窒素
中でワーリングブレンダーにて破砕し、5Mグア
ニジンチオシアナート溶液（5Mグアニジンチオ
シアナート、0.5％Ｎ−ラウロイルサルコシンナ
トリウム、25mM酒石酸ナトリウム、0.1Mメト
カプトエタノール、0.1％アンチフオームＡ）80
mlに懸濁した。この液をテフロンホモゲナイザー
で均質化し、20G1/2注射針を用いて核酸を剪断
した。5.7M CsCl 12mlに前記溶液24mlを重層し、
ベツクマン超遠心機SW28ローターにより15℃に
て24時間、25000rpmで遠心後、粗全RNAを回収
した。 ２％酢酸カリウム溶液に粗全RNAを溶解し、
２倍容量のエタノールを加えて、−20℃にて一晩
放置後、沈澱を遠心により回収精製した。 ポリ(A)+RNAはH.Avivらの方法（文献12）に
従い、オリゴ（dT）セルロースカラムクロマト
グラフイーにより全RNAから単離精製した。 腎組織10gからの収量は、全RNAは約３mgで
あり、その２〜３％がポリ(A)+RNAであつた。 参考例２ cDNAライブラリー（）の作製 参考例１で得られたポリ(A)+RNA40μgを用い
てcDNA合成を行つた。オリゴ（dT）12-1840μgを
プライマーとして、逆転写酵素40ユニツトを用い
て、42℃にて２時間反応させて第一鎖を合成し、
鋳型のmRNAをアルカリ処理で除き、第二鎖の
合成を100ユニツトのE.coliDNAポリメラーゼ
IKlenow断片を用いて行つた。 S1ヌクレアーゼでヘアピン部をとり除き、末
端デオキシヌクレオチジル転移酵素により、二重
鎖cDNAの3′端に（dC）10-20鎖を結合し、約
400ngの（dC）テイルcDNAを得た。 これを市販の（dG）テイルpBR322（PstI部）
（New England Nuclear製）800ngとアニール
し、大腸菌χ1776を、Hanahanの方法（文献13）
により形質転換し、テトラサイクリン耐性で且つ
アンピシリン感受性の形質転換菌約２×105個か
らなるcDNAライブラリー（）を得た。 これらの形質転換菌についてアルカリ溶菌法に
よる迅速単離法（文献14）によりcDNA挿入断片
の大きさを調べた。 参考例３ cDNAライブラリー検索用プローブと
しての合成DNAオリゴマーの調製 G.J.Sfeffens等（文献８）及びGunzlar等（文
献９）により報告されたヒトウロキナーゼのアミ
ノ酸配列Asn169．Gln.Pro.Trp.Phe173に対応する
mRNAに相補的な14塩基からなる下記のDNAオ
リゴマー16種類をホスホトリエステル法により合
成した。 5′AACCAAGGTTGATT 3′ AACCAAGGTTGGTT AACCAGGGTTGATT AACCACGGTTGATT AACCACGGTTGGTT AACCATGGTTGATT AACCATGGTTGGTT AACCAAGGCTGATT AACCAAGGCTGGTT AACCAGGGCTGATT AACCAGGGCTGGTT AACCACGGCTGATT AACCACGGCTGGTT AACCATGGCTGATT AACCATGGCTGGTT AACCAGGGTTGGTT これら16種類のDNAオリゴマーをUKプロー
ブと称する。 また、確認用プローブとしてMet283．Try.
Asn.Asp.Pro287に対応するmRNAに相補的な14
塩基から成る下記のDNAオリゴマー８種類の
DNAオリゴマーを同様にして合成した。 5′GGATCATTATACAT 3′ GGATCGTTATACAT GGATCGTTGTACAT GGATCATTGTACAT GGGTCATTATACAT GGGTCGTTATACAT GGGTCGTTGTACAT GGGTCATTGTACAT これら８種類のDNAオリゴマーをUKプロー
ブと称する。 これら、UKプローブ及びUKプローブの
それぞれ200ngずつを、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼを用いて3000Ci／mmole32PγATPにより
5′端放射能標識を行い、コロニーハイブルダイゼ
ーシヨン用プローブとした。 参考例４ cDNAライブラリー（）検索 (1) 検索 15μg／mlのテトラサイクリンを含有するLB寒
天培地に、オートクレーブ殺菌したニトロセルロ
ースフイルター（0.45μm，TYPE TM−２）
（東洋濾紙製）を置き、約2000個の形質転換菌コ
ロニーが生育するように、実施例２において調製
した形質転換菌を撒いた。37℃にて８時間培養し
た後、２枚のニトロセルロースフイルターにレプ
リカ（複写）し、これをさらに37℃にて３時間培
養した。最初のニトロセルロースフイルターをマ
スターフイルターとし、後者の２枚を、15μg／
mlのテトラサイクリン及び100μg／mlのクロラム
フエニコールを含有するLB寒天培地に移し、37
℃にて一晩培養した。次に、Grunstein Hogness
の変法（文献15）に従つて0.5M NaOH及び
1.5M NaCl上に３分間フイルターを置き、コロ
ニーの溶菌及びDNAの変性を行い、0.5M Tris
−HCl（PH7.6）及び1.5M NaCl上で中和し、フイ
ルターを風乾し、そして80℃にて２時間焼成し
た。 次に、フイルターを４×SSC中で60℃にて30分
間ずつ洗浄し、続いて４×SSC，10×Denhardt
及び50μg／ml変性E.coli−DNA中で60℃にて１
時間プレハイブリダイゼーシヨンを行い、さらに
0.1mM ATP及び放射能標識UKプローブ（約
107cpm／フイルター）を加えて37℃にて16時間
ハイブリダイゼーシヨンを行つた。４×SSC中で
39℃にて６〜８回洗浄した後、フイルターを風乾
し、オートラジオグラフイーにより、UKプロー
ブとハイブリダイブする形質転換菌を検索し
た。この方法により８×104個のコロニーから21
個の候補クローンを得た。これらのクローンのプ
ラスミドをpKYU1〜pKYU21と称する。 得られた候補クローン21個を上記と同様に処理
し、UKプローブとハイブリダイズするクロー
ンを得た。このクローン中のプラスミドを
pKYU21と称する（第３図）。 (2) pKYU21プラスミドDNAの特性 pKYU21プラスミドDNAを各種の制限酵素で
消化し、Maxam−Gilbert法（文献16）により、
又はMl3mp8にサブクローン化した後ジデオキシ
チエインターミネーシヨン法（文献17）により、
塩基配列の決定を行つた。これをウロキナーゼの
公知のアミノ酸配列と対照した結果、cDNAは低
分子ウロキナーゼのコード領域を完全に含むが、
高分子ウロキナーゼのコード領域中の5′端領域の
約100bpのDNAが欠損していることが確認され
た。 参考例５ プライマー延長反応によるcDNAライ
ブラリー（）の作製 参考例４(2)において決定した塩基配列に基づ
き、89Ser.Asp.Ala.Leu.Glu93に対応するmRNA
の配列に相補的な15塩基から成るDNAオリゴマ
ー： 5′CTGAAGAGCATCAGA 3′ をホスホトリエステル法によつて合成した。 鋳型としてポリ(A)+RNAを100μgを用い、
Agarwall等（文献18）、又はStewart等（文献
19）の方法に基づき、5′端32P-標識プライマー1
μgと共に逆転写酵素100ユニツトにより第１鎖
cDNAを合成し、次にE.coliDNAポリメラーゼ
IKlenow断片100ユニツトを用いて第２鎖を合成
した。次にS1ヌクレアーゼにより一重鎖DNAを
消化し、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素を
用いて3′端に（dC）ｎ鎖を付加した。このdCテ
イルインサート（cDNA）とdGテイルベクター
（ｐ BP322）とをアニールした後、大腸菌
χ1776を形質転換して約５×104個の形質転換体か
らなるcDNAライブラリー（）を得た。 参考例６ cDNAライブラリー（）の検索 参考例５において得た形質転換菌を、参考例４
(1)に記載した方法と同様にして処理しハイブリダ
イゼーシヨンを行つた。この場合pKYU21から
の150bp Pst−Bgl5′端消化断片を、α32
PdCTP（3000Ci／mmole）を用いてニツクトラ
ンスレーシヨン法（文献13）により放射能標識し
たものをプローブとして用いた。ハイブリダイゼ
ーシヨンを60℃にて行つた。 次に、２×SSCにより60℃にて２〜３回フイル
ターを洗浄し、風乾し、オートラジオグラフイー
により上記のプローブとハイブリダイズするクロ
ーンを検索した。約３×104個のクローンから８
個の陽性クローンを得た。これらのクローン中の
プラスミドpPE1〜pPE8と称する これらのプラ
スミドDNAを制限酵素Pstで消化した結果、プ
ラスミドpPE3（第２図）が約420bpのcDNA挿入
部を含有することが確認された。 このプラスミドpPE3のDNAを制限酵素Pst
で消化して得られた断片をM13mp8にサブクロー
ン化し、ジデオキシチエインターミネーシヨン法
（文献17）により塩基配列の決定を行つたところ、
プロウロキナーゼ遺伝子の5′端側の十分な長さの
コード領域を含み、さらに翻訳開始コドンATG
の上流に66bpから成る5′非翻訳領域を含むことが
確認された（第２図）。 参考例７ プロウロキナーゼ遺伝子の作製（第３
図） 低分子ウロキナーゼの完全なコード領域を含む
プラスミドpKYU21のDNA5μgをそれぞれ10ユ
ニツトずつの制限酵素Bg1及びHindにより
二重消化し、そして電気溶出して、約5.7Kbの
DNA断片を得、他方同プラスミドpKYU21の
DNAをそれぞれ10ユニツトずつのBgl及び
Ncoにより二重消化し、そして電気溶出して
66bpのDNA断片を得た。また、参考例６におい
て得たプラスミドpPE3のDNA5μgをそれぞれ10
ユニツトずつのNco及びHindにより二重消
化して約1.1kbDNA断片を得た。これら３種の
DNA断片はフエノール／クロロホルム抽出を繰
り返し、２倍量のエタノールで沈澱をすることに
より精製回収した。これら３種類のDNA断片を
T4DNAリガーゼにより連結し、大腸菌χ1776を
形質転換した。得られた形質転換体をアルカリ溶
菌法による迅速単離法により調べ、プロウロキナ
ーゼの完全な遺伝子を含むプラスミドpKYU22
を有するクローンを得た。このクローンエシエリ
シヤ・コリ（Escherichia coli）χ1766／
pKYU22は1985年１月11日に工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第8041号（FERMP
−8041）として寄託され、1986年１月22日に微工
研条寄第968号（FERM BP−968）として、ブ
タペスト条約に基く国際寄託に移管された。 参考例８ プラスミドpKYU22の挿入部の塩基
配列の決定 プラスミドpKYU22の挿入部の塩基配列を、
Maxam−Gilbert法、及びM13mp8にサブクロー
ン化した後のジデオキシチエインターミネーシヨ
ン法により決定した。この結果を第４−１図〜第
４−３図に示す。この結果と文献20に記載されて
いる塩基配列とを比較した場合、254番目のアミ
ノ酸Asnのコドン（AAT）（文献ではAAC）、
360番目（第４−２図中のアミノ酸の番号）のア
ミノ酸LeuのコドンCTG（文献ではCTA）、365番
目のアミノ酸ProのコドンCCA（文献ではCCC）、
及び366番目のアミノ酸GlnのコドンCAG（文献で
はCAA）において相互に異なつていた。AATは
大腸菌において翻訳されにくいコドンであるが、
CTG及びCAGはともに大腸菌において翻訳され
やすい（使用頻度が高い）と言われ、大腸菌にお
ける発現にとつて有利となる。なお、CCCは
CCAより若干有利であると考えられる。 参考例９ 5′端を変形したプロウロキナーゼ遺伝
子の合成（第５図） 参考例７において作製した、プロウロキナーゼ
をコードする天然型cDNAの5′端部分の約30bpの
構造を、プロウロキナーゼ遺伝子がシユードモナ
ス由来のC230遺伝子のSD配列のもとで大腸菌中
で効率よく発現されるように変形した。 下記の、29塩基、15塩基及び20塩基からなる３
種類の単鎖DNAオリゴマーをホスホトリエステ
ル法により合成した。
5′CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCG
Ｔ 3′ 3′TGCAGTACTCGTTGC 5′ 3′TCGAGGTGGTCCAAGGCAGC 5′ 次に、これら３種類の合成DNAオリゴマー
1μgずつを95℃にて２分間加熱処理した後、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼにより5′端燐酸化し、セ
ツプパツク（C18）カラム（Waters製）により精
製し、乾燥した後、20mM Tris−HCl（PH7.6）、
10mM MgCl2の溶液50μに溶解し、95℃にて２
分間加熱した後室温まで徐冷し、12℃にて一晩保
持することによつてアニールし、下記に示す二重
鎖DNAを得た。 5′
CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT
3′ 3′TGCAGTACTCGTTGCTCGAGGTGGTCC
ＡＡＧＧＣＡＧＣ Aat Sst BstNI Taq 一方、プラスミドpKYU22のDNA5μgを制限
酵素Bgl及びAatにより二重消化し、約
5.7KbのDNA断片を電気溶出により回収した。
他方、同じプラスミドpKYU22のDNA5μgを制
限酵素Pst及びBglにより二重消化し、電気
溶出して約400bpのDNA断片を得。さらにこれ
を制限酵素Taqで消化して電気溶出することに
より約260bpのDNA断片を回収した。これら２
種類のDNA断片はフエノール／クロロホルム抽
出および２倍量のエタノールによる沈澱により精
製回収した。 これら２種類のDNA断片と、前記の合成二重
鎖DNAオリゴマーとをT4DNAリガーゼにより
連結し、大腸菌χ1776を形質転換した。形質転換
体をアルカリ溶菌法による迅速単離法により調
べ、変形されたプロウロキナーゼ遺伝子を含有す
るプラスミドpKMU1を有するクローン、エシエ
リシヤ・コリ（Escherichia coli）χ1776／
pKMU1を得た。このプラスミドpKMU1が導入
された大腸菌エシエリシヤ・コリ（Escherichia
coli）χ1776／pKMU1は工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第8040号（FERMP−
8040）として寄託されている。 参考例10 プロウロキナーゼの直接発現型プラス
ミド（pMUT4L）の作製（第６図） 参考例９において得られた5μgのプラスミド
pKMU1を制限酵素Aat10ユニツトにより消化
し、子牛消化管ホスフアターゼ（CIP）で処理
し、単離した。他方、5μgのプラスミドpTCM1
を制限酵素Aat10ユニツトにより消化し、電気
溶出法により約500bpのDNA断片を単離した。
これら２種類のDNA断片はフエノール／クロロ
ホルム抽出およびエタノール沈澱を繰り返すこと
によつて精製回収した。 両者をT4DNAリガーゼにより連結し、大腸菌
JM103に形質転換した。形質転換体をアルカリ溶
菌法による迅速単離法によつて調べ、tacプロモ
ーター／オペレーター及びC230SD配列がプロウ
ロキナーゼ遺伝子に対して正方向に入つたプラス
ミドpMUT1Lを有するクローンを得た。 前記のプラスミドpTCM1は、発明者等によつ
て作製された新規なプラスミドであつて、tacプ
ロモーター／オペレーター、lacSD及びC230SD
配列から成る発現制御領域、並びにC230構造遺
伝子を含有する。このプラスミドが導入された大
腸菌エシエリシヤ・コリ（Escherichia coli）
JM103／pTCM1は工業技術院微生物工業技術研
究所に、微工研菌寄第7779号（FERM Ｐ−
7779）として寄託されている。 プラスミドpMUT1Lにおいては、tacプロモー
ター／オペレーター、lacSD及びC230SDからな
る発現制御領域の下流の適切な位置に本発明の変
形されたプロウロキナーゼ遺伝子が挿入されてい
る。 次にプラスミドpKK223−３（文献22−23およ
び24）5μgを制限酵素Hind10ユニツトで消化
し、子牛消化管ホスフアターゼ（P.L.
Biochemicals）で処理した。 一方、前記のようにして得た1μgのプラスミド
pMUT1Lを４ユニツトの制限酵素Draで消化
し、この消化断片と5′端燐酸化したHindリン
カー（dCAAGCTTG）1μgとをT4DNAリガー
ゼにより連結し、次に12ユニツトの制限酵素
Hindで消化し、0.15M NaCl溶液とし、等容
量のフエノール／クロロホルムで抽出後、これに
２倍容量のエタノールを加えてDNAを沈澱せし
め、16000tpm、４℃にて沈澱物を集め、これを
乾燥した。 このpMUT1L消化断片と、前記のpKK223−
３のHind消化断片とをT4DNAリガーゼによ
り連結し、大腸菌JM103を形質転換した。これら
の形質転換菌をアルカリ溶菌法による迅速単離法
により調べ、プラスミドpMUT2Lを含むクロー
ンエシエリシヤ・コリ（Escherichia coli）
JM103／pMUT2Lを得た。 このプラスミドは、プロウロキナーゼ遺伝子の
上流に前記の発現制御領域を有すると共に、下流
にpKK223−３由来の大腸菌のリボゾーム遺伝子
の転写ターミネーター（rrnB，T1T2）を有す
る。 なお、プラスミドpKK223−３はPharmacia
Ｐ−Ｌ Biochemicalsから販売されており、容
易に入手することができる。 5μgのプラスミドpMUT2Lを、10ユニツトずつ
の制限酵素Sph及びTth111 によりより消化
し、フエノール／クロロホルム抽出後、エタノー
ルで沈澱せしめ、回収したDNAを0.1mMの
dGTP，dCTP，dATP及びTTPの存在下でT4
ポリメイラーゼを用いて末端を平滑化し、
T4DNAリガーゼにより再環化した。これを大腸
菌JM103に形質転換し、50μg／mlのアンピシリ
ンを含有するLB寒天培地上にコロニーを形成せ
しめ、アルカリ溶菌法による迅速単離法（文献
14）で調べ、プラスミドpMUT4Lを含むクロー
ンエシエリシヤ・コリ（Escherichia coli）
JM103／pMUT4Lを得た。 実施例１ M13フアージを用いる135位のアミノ
酸のコドンへの特異的塩基置換変異の導入(1) １ １本鎖鋳型DNAの調製（第７図） プラスミドpKYU22及びフアージM13pm8二本
鎖DNAそれぞれ1μgずつを、10mM TrisHCl（PH
7.5）、7mM MgCl2、7mM β−メルカプトエタ
ノール及び50mM NaClを含有する溶液20μ中
で、５ユニツトのPstを用いて37℃にて１時間
消化した。フエノール処理、エタノール沈澱によ
つてそれぞれのDNA断片を回収し、両者を混合
した後、66mM Tris−HCl（PH7.5）、5mM
MgCl2、5mM DTT及び1mM ATPを含有する
溶液20μ中で100ユニツトのT4DNAリガーゼを
用いて12℃にて16時間連結反応を行つた。反応
後、反応液を用いてメツシング等の方法（文献
25）に従つて大腸菌JM103を形質転換し、0.02％
Ｘ−gal及び1mM IPTGを含有する軟寒天と共に
プレートし、37℃にて一晩培養した。組換体によ
つて形成された白いプラークより一本鎖型DNA
を調製した。すなわち、白いプラークをつまよう
じの先端で釣り、大腸菌JM103が生育している
1.5mlの２×YT培養液（1.6％バクトトリプトン、
１％酵母エキストラクト及び0.5％NaCl）中に懸
濁して37℃にて５時間培養し、そして培養液上清
から、ポリエチレングリコール沈澱、フエノール
処理及びエタノール沈澱によつて一本鎖組換体フ
アージDNAを回収した。 得られた一本鎖DNAを鋳型としてメツシング
らの方法（文献25）に従つてジデオキシ法により
塩基配列を決定し、クローニングされた一本鎖
DNAの配列を確認した。第７図に示すように、
コーデイング鎖及びアンチコーデイング鎖が得ら
れた。 ２ オリゴヌクレオチドをプライマーとする二本
鎖DNAの合成（第８図） 上記のようにして得られた一本鎖DNAの内、
クローン化されたアンチコーデイング鎖を鋳型と
して用い、合成オリゴヌクレオチド： 5′GATGGACAAAAGCCC 3′ をプライマー(1)として、DNAポリメラーゼ
Klenow断片による修復反応を行つた。すなわ
ち、鋳型一本鎖DNA0.5pmoleに5′末端を燐酸化
したプライマー2pmoleを加え、そして7mM
Tris−HCl（PH7.5），0.1mM EDTA，20mM
NaCl及び7mM MgCl2を含有する溶液10μ中で
60℃にて20分間インキユベートし、続いて23℃に
て20分間インキユベートした。さらに、この反応
混合物に、dATP，dGTP，dTTP及びdCTPを
それぞれ0.5mMになるように加え、全体を20μ
としてDNAポリメラーゼKlenow断片２ユニツ
トを加え、そして23℃にて20分間インキユベート
した。続いて、10mM ATPを1μ及びT4DNA
リガーゼ１ユニツトを加え、12℃にて一晩インキ
ユベートした。 ３ S1ヌクレアーゼによる消化 上記のようにして得られた二本鎖DNAからバ
ツクグラウンドとなる未反応の一本鎖DNAを除
去するためにS1ヌクレアーゼによる消化を行つ
た。すなわち、上記反応液2μを280mM NaCl，
4.5mM ZnCl2，30mM NaOAc（PH４〜4.5）を含
有する反応液25μに溶解し、2.3ユニツトのS1ヌ
クレアーゼを加えて26℃にて30分間処理した。反
応後、0.25M Tris−HCl（PH8.0）10μを加えて
反応を停止した。 ４ 大腸菌JM103の形質転換 上記反応液10μを用いてメツシング等の法
（文献25）に従い大腸菌JM103を形質転換した。 ５ 変異体の検索 上記のようにして得られたフアージプラークに
ついて、プライマーとして用いたオリゴヌクレオ
チド（32Pで標識したもの）をプローブとして用
いて、プラークハイブリダイゼーシヨンによる変
異体フアージのスクリーニングを行つた。すなわ
ち、ベントン・デイビス等の方法（文献26）に従
つて軟寒天培地からニトロセルロースフイルター
にプラークを移し、真空中80℃にて２時間ベーキ
ングした。このニトロセルロースフイルターを６
×SSC，10×Denhardt溶液中で、32Pで標識した
プライマーオリゴヌクレチオチドをプローブとし
て23℃にて一晩ハイブリダイゼーシヨンを行つ
た。次に、このフイルターを６×SSC中で4.6℃
にて洗浄し、そしてオートラジオグラフイーを行
い陽性シグナルを示す変異体フアージプラークを
単離した。この変異体フアージから変異２本鎖型
フアージDNA（pml）を得た。 ６ 変異体DNAの塩基配列の決定 変異体フアージDNAを鋳型としてジデオキシ
法により塩基配列を決定し、一塩基置換変異が生
じたことを確認した。 実施例２ M13フアージを用いる135位のアミノ
酸のコドンへの特異的塩基置換変異の導入(2) 実施例１で用いたものと同じ組換え体M13フア
ージー本鎖DNA（ウロキナーゼ遺伝子のアンチコ
ーデイング鎖がクローニングされている。）を鋳
型として新たなオリゴヌクレオチド変異原剤によ
る部位特異的変異導入をおこなつた。但し、プラ
イマー(2)として次の合成オリゴヌクレオチド： 5′GGAACAAAGCCCTCCTCT 3′ を用いた。この18塩基のオリゴヌクレオチドは一
本鎖鋳型DNA中のウロキナーゼ遺伝子と相補的
であるがリジンコドンAAAがスレオニンコドン
ACAへと一塩基のみ変化している。 このオリゴヌクレオチドをプライマーとして試
験管内で二本鎖DNAを合成した。すなわち、鋳
型一本鎖DNA0.5pmoleに5′末端をリン酸化した
プライマー2pmoleを加え、そして7mM Tris−
HCl（PH7.5），0.1mM EDTA，20mM NaCl及び
7mM MgCl2を含有する溶液10μ中で、60℃に
て20分間インキユベートし、続いて23℃にて20分
間インキユベートした。さらにこの反応混合物に
dATP，dGTP，dTTP、及びdCTPをそれぞれ
0.5mMになるように加え、全体を20μとして
DNAポリメラーゼKlenow断片２ユニツトを加
え、そして23℃にて20分間インキユベートした。
続いて10mM ATPを1μ及びT4DNAリガーゼ
１ユニツトを加え、12℃にて一晩インキユベート
した。上記反応液を直接、メツシング等の方法
（文献25）に従つて大腸菌JM103に形質転換した。
このようにして上記反応液1μ当たり約１万個
のフアージプラークが得られた。 得られたプラークを軟寒天培地からベントン・
デイビス等の方法（文献26）に従つてニトロセル
ロースフイルターに移したのち、真空中80℃にて
２時間ベーキングした。このニトロセルロースフ
イルターを６×SSC，10×Denhardt溶液中で32P
で標識したプライマーオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして37℃にて一晩ハイブリダイゼーシヨン
を行つた。次にこのフイルターを６×SSC中で52
℃にて洗浄し、そしてオートラジオグラフイーを
行い陽性シグナルを示す変異体フアージプラーク
を単離した。この変異体フアージから変異体２本
鎖型フアージDNA（pm2）を得た。変異体DNA
の塩基配列は、変異体フアージDNAを鋳型とす
るジデオキシ法により塩基配列を決定し、目的と
する一塩基置換変異が生じたことを確認した。 同様にして、例えば下記の右欄の変異剤オリゴ
ヌクレオチドを用いることにより、135番目のア
ミノ酸リジンに代る下記左欄のアミノ酸をコード
するコドンを導入することができる。
【表】
なお、上記のオリゴヌクレオチドプライマーを
用いる点突然変異導入法に代えて、135番目のリ
ジンのコドンの代りに他のアミノ酸、例えばグル
タミン、スレオニン等のコドンを有するがその他
のコドンが変化していないDNA断片を合成し、
これを天然mRNAよりのcDNAの対応する部分
と組換えることによつても変異を導入することが
できる。 前記のようにして得られた変異体フアージ
DNAをPstで切り出して変異した挿入部を得、
これを完全なコード領域の対応部分と置き換えた
後、このコード領域を例えば大腸菌用発現用ベク
ターに挿入し、これを大腸菌に形質転換して該大
腸菌を培養することにより、本発明のポリペプチ
ドを発現せしめることができる。 実施例３ ヒト−プロウロキナーゼ遺伝子を含有
する大腸菌用発現プラスミド（pMUP1）の作
製（第９図） PLプロモーター及びメタピロカテカーゼ由来
のSD配列を含むpYTU1（文献27）をベクターと
して、ヒト腎臓由来のウロキナーゼcDNA（ウロ
キナーゼのＮ端の複数個のアミノ酸のコドンが前
記のごとく置換されている）の発現プラスミドを
作製した。すなわち、10μgのプラスミドpYTU1
を10mM Tris−HCl（PH7.4），7mM MgCl2及び
150mM NaClを含有する反応液100μ中で、10
ユニツトのSal及び10ユニツトのAatを用い
て37℃にて２時間消化し、アガロース電気泳動に
より約4.5KbのSal−Aatベター断片を単離し
た。 一方、10μgのプラスミドpKMU1を、10mM
Tris−HCl（PH7.4），7mM MgCl2及び60mM
NaClを含む反応液100μ中にて、10ユニツトの
Draにより37℃にて２時間消化し、次に
0.66mMとなるようにATPを加え、Salリンカ
ーDNA（5′GGTCGACC3′）1μg及びT4DNAリガ
ーゼ100ユニツトを加えて12℃にて一晩反応を行
つた。次に、フエノール処理及びエタノール沈澱
によつてDNA断片を回収し、10mM Tris−HCl
（PH7.4），7mM MgCl2及び150mM NaClを含有
する反応液100μ中で、10ユニツトずつのAat
及びSalにより37℃にて２時間消化し、そして
アガロース電気泳動によつて約2.2Kbのヒトウロ
キナーゼ遺伝子断片を単離した。これら２種類の
DNA断片それぞれ1μgを混合し、66mM Tris−
HCl（PH7.4），7mM MgCl2，0.66mM ATP及び
10mMジチオスレイトールを含有する反応液20μ
中で100ユニツトのT4DNAリガーゼにより12
℃にて１晩連結反応を行つた。 この反応液を用いて大腸菌HB101を形質転換
し、形成されたコロニーをアルカリ溶菌法による
迅速単離によりスクリーニングし、プラスミド
pMUP1を有するクローンを得た。この菌よりプ
ラスミドDNAを調製した。 実施例４ プラスミドpMUP1pmの作製（１０
図） ウロキナーゼのＮ末端から135番目のリジンの
コドンAAAがグリタミンのコドンCAAに変異し
たcDNA断片を含有する変異体N13フアージ二本
鎖DNAと、PLプロモーター及びC230SD配列の
下流にプロウロキナーゼの構造遺伝子を有するプ
ラスミドpMUP1を用いて、変異した遺伝子を含
む大腸菌用発現プラスミドを作製した。 すなわち、10μgの変異体M13二本鎖DNAを
Pstにより完全消化し、約1.2Kb断片を単離し
た。 一方、10μgのプラスミドpMUP1をPstによ
り部分消化し、約1.2Kb断片のみが除去された約
5.4Kbの断片を単離した。 これらのそれぞれをフエノール処理及びエタノ
ール沈澱により回収した後混合し、T4DNAリガ
ーゼを用いて12℃にて１番連結反応を行い、反応
混合物を用いて大腸菌HB101を形質転換し、形
成されたコロニーをアルカリ溶菌法による迅速単
離法によりスクリーニングし、pMUP1pmを含む
クローンを得た。このプラスミドpMUP1pmが導
入された大腸菌エシエリシヤ・コリ（Escheria
coli）χ1776／pMUP1pmは、1985年１月11日に
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
8042号（FERMP−No.8042）として寄託され、
1986年１月22日に微工研条寄第969号（FERM
BP969）としてブタペスト条約に基づく国際寄託
に移管された。 プラスミドpMUP1pmは本発明の代表的なプラ
スミドであり、PLプロモーター及びC230SD配列
の下流の適切な位置にヒトプロウロキナーゼ様ポ
リペプチドをコードするコード領域を含有し、こ
のコード領域においては該ポリペプチドのＮ端の
６個のアミノ酸のコドンが大腸菌中で発現されや
すくコドンにより置き換えられており、さらに
135番目のアミノ酸であるリジンのコドンAAAが
グルタミンのコドンCAAに変えられている。 実施例５ プラスミドpMUT4Lpm2の作製（第
９図及び第１０図を参照のこと） 大腸菌tacプロモーターの下流に上記点突然変
異を有するヒト−プロウロキナーゼ構造遺伝子を
挿入した発現型プラスミドpMUT4Lpm2を以下
のようにして作製した。 10μgの変異体M13二本鎖DNA（pm2）をPst
により完全消化し、約1.2Kb断片を単離した。一
方、10μgのプラスミドpMUT4LをPstにより部
分消化し、約1.2Kb断片のみが除去された約
4.6Kbの断片を単離した。 これらのそれぞれをフエノール処理およびエタ
ノール沈澱により回収した後混合し、T4DNAリ
ガーゼを用いて12℃にて一晩連結反応を行い、反
応混合物を用いて大腸菌HB101を形質転換し、
形成されたコロニーをアルカリ溶菌法による迅速
単離法によりスクリーニングし、pMUT4Lpm2
を含むクローンを得た。プラスミド
pMUT4Lpm2が導入された大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）χ1776／
pMUT4Lpm2は、1985年４月18日に工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8188号
（FERMP−No.8188号）として寄託され、1986年
１月22日に微工研条寄第970号（FERM BP970）
としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され
た。 プラスミドpMUT4Lpm2もまた本発明の代表
的なプラスミドであり、tacプロモーターの下流
の適切な位置にヒト−プロウロキナーゼ様ポリペ
プチドをコードするコード領域を含有し、このコ
ード領域においては該ポリペプチドのＮ端の６個
のアミノ酸のコドンが大腸菌中で発現されやすい
コドンにより置き換えられており、さらに135番
目のアミノ酸であるリジンのコドンAAAがスレ
オニンのコドンACAに変えられている。 実施例６ M13フアージを用いる157位のアミノ
酸のコドンへの特異的塩基置換変異の導入 (1) 一本鎖鋳型DNAの調製 プラスミドpKYU22及びフアージM13mp8二本
鎖DNAそれぞれ1μgずつを、10mM Tris−HCl
（PH7.5），7mM MgCl2，7mMβ−メルカプトエ
タノール及び50mM NaClを含有する溶液20μ
中で５ユニツトのPstを用いて37℃にて１時間
消化した。フエノール処理、エタノール沈澱によ
つてそれぞれのDNA断片を回収し、両者を混合
した後、66mM Tris−HCl（PH7.5），5mM
MgCl2，5mM DTT及び1mM ATPを含有する
溶液20μ中で100ユニツトのT4DNAリガーゼを
用いて12℃にて16時間連結反応を行つた。反応
後、反応液を用いてメツシング等の方法（文献
25）に従つて大腸菌JM103を形質転換し、0.02％
Ｘ−gal及び1mM IPTGを含有する寒天と共にプ
レートし、37℃にて一晩培養した。組換え体によ
つて形成された白いプラークにより一本鎖DNA
を調製した。 得られた一本鎖DNAのいくつかを鋳型として
メツシングらの方法（文献25）に従つてジデオキ
シ法により塩基配列を決定し、クローニングされ
た一本鎖DNAの配列を確認した。 (2) 特異的塩基置換変異の導入 前記のようにして得た組換え体M13フアージ一
本鎖DNA（ウロキナーゼ遺伝子のアンチコーデイ
ング鎖がクローニングされている。）を鋳型とし
て新たなオリゴヌクレオチド変異原剤による部位
特異的変異導入をおこなつた。但し、プライマー
として次の合成オリゴヌクレオチド 5′GGCCCCGCGATAAGATTA 3′ を用いた。この18塩基のオリゴヌクレオチドは一
本鎖鋳型DNA中のウロキナーゼ遺伝子と相補的
であるがフエニルアラニンコドンTTTがアスパ
ラギン酸コドンＧ ＡＴへと二塩基が変化してい
る。 このオリゴヌクレオチドをプライマーとして試
験管内で二本鎖DNAを合成した。すなわち、鋳
型一本鎖DNA0.5pmoleに5′末端をリン酸化した
プライマー2pmoleを加え、そして7mM Tris−
HCl（PH7.5），0.1mM EDTA，20mM NaCl及び
7mM MgCl2を含有する溶液10μ中で、60℃に
て20分間インキユベートし、続いて23℃にて20分
間インキユベートした。さらにこの反応混合物に
dATP，dGTP，dTTP、及びdCTPをそれぞれ
0.5mMの濃度になるように加え、全体を20μと
してDNAポリメラーゼklenow断片２ユニツトを
加え、そして23℃にて20分間インキユベートし
た。続いて10mM ATPを1μ及びT4DNAリガ
ーゼ１ユニツトを加え、12℃にて一晩インキユベ
ートした。上記反応液を直接、メツシング等の方
法（文献25）に従つて大腸菌JM103に形質転換し
た。このようにして上記反応液1μ当たり約１
万個のフアージプラークが得られた。 得られたプラークを軟寒天培地からベントン・
デイビス等の方法（文献26）に従つてニトロセル
ロースフイルターに移したのち、真空中80℃にて
２時間ベーキングした。このニトロセルロースフ
イルターを６×SSC，10×Denhardt溶液中で32P
で標識したプライマーオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして37℃にて一晩ハイブリダイゼーシヨン
を行つた。次にこのフイルターを６×SSC中で52
℃にて洗浄し、そしてオートラジオグラフイーを
行い陽性シグナルを示す変異体フアージプラーク
を単離した。この変異体フアージから変異体２本
鎖型フアージDNA（pm3）を得た。変異体DNA
の塩基配列は、変異体フアージDNAを鋳型とす
るジデオキシ法により塩基配列を決定し、目的と
する一塩基置換変異が生じたことを確認した。 また変異剤として次のオリゴヌクレオチド： 5′GGCCCCGCGAAAAGATTA 3′ を用いて、157番目のアミノ酸フエニルアラニン
のコドンTTTをグルタミン酸のコドンGAAに置
きかえることもできる。 実施例７ プラスミドpMUT4Lpm3の作製 大腸菌tacプロモーターの下流に上記点突然変
異を有するヒトウロキナーゼ構造遺伝子を挿入し
た発現型プラスミドpMUT4Lpm3を以下のよう
にして作製した。 10μgの変異体M13二本鎖DNA（pm3）をPst
により完全消化し、約1.2Kb断片を単離した。一
方、10μgのプラスミドpMUT4LをPstにより部
分消化し、約1.2Kb断片のみが除去された約
4.6Kbの断片を単離した。 これらのそれぞれをフエノール処理およびエタ
ノール沈澱により回収した後混合し、T4DNAリ
ガーゼを用いて12℃にて一晩連結反応を行い、反
応混合物を用いて大腸菌HB101を形質転換し、
形成されたコロニーをアルカリ溶菌法による迅速
単離法によりスクリーニングし、pMUT4Lpm3
を含むクローンを得た。プラスミド
pMUT4Lpm3が導入された大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）χ1776／
pMUT4Lpm3が1985年７月11日に工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第8341号
（FERMP−8341）として寄託され、1986年１月
22日に微工研条寄第971号（FERM BP−971）
としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され
る。 プラスミドpMUT4Lpm3もまた本発明の代表
的なプラスミドであり、tacプロモーターの下流
の適切な位置にヒト−プロウロキナーゼ様ポリペ
プチドをコードするコード領域を含有し、このコ
ード領域においては該ポリペプチドのＮ端の６個
のアミノ酸のコドンが大腸菌中で発現されやすい
コドンに置き換えられており、さらに157番目の
アミノ酸であるフエニルアラニンのコドンTTT
がアスパラギン酸のコドンGATに変えられてい
る。 実施例８ プラスミドpKKtrpの作製（第１１
図） 5μgのプラスミドpKK223−３と30ユニツトの
EcoRI及び20ユニツトのPvuを緩衝液（10mM
Tris−HCl，PH7.5，10mM MgCl2，50mM
NaCl，1mM DTT）100μ中、37℃で１時間反
応させた。この反応液を0.7％アガロース電気泳
動にかけ、アンピシリン耐性遺伝子、複製開始領
域及びrrnBT1T2転写終結領域を含む約2600塩基
対のDNA断片を慣用法によつて回収した。 この断片と１ユニツトのクレノウ断片とを緩衝
液（50mM Tris−Cl PH7.2，10mM Mg，SO4，
0.1mM DTT，80μM dNTPS）25μ中、25℃で
１時間反応させ、さらにアルカリフオスフアター
ゼ１ユニツトを加え、68℃で0.5時間反応させた。
フエノール処理後エタノール沈澱し、沈澱物を
20μTE緩衝液（10mM Tris−HCl PH8.0，
1mM EDTA）に溶解した。こうして得たDNA
断片を〔Ａ〕とする。 一方、10μgのプラスミドpSTN16と20ユニツト
のCla及び20ユニツトの及びPvuとを緩衝液
（10mM Tris−Cl PH7.5，10mM MgC12，
50mM MsCl 1mM DTT）100μ中37℃で１時
間反応させた、この反応液を0.7％アガロース電
気泳動にかけ、トリプトフアンオペロンのプロモ
ーター、オペレーター及びリボソーム結合部位を
含む約300塩基対の断片を慣用法により回収した。 この断片と１ユニツトのクレノウ断片を緩衝液
（50mM Tris−HCl PH7.2，10mM MgSO4，
0.1mM DTT，80μM dNTPS）25μ中、25℃で
１時間反応させた。フエノール処理後エタノール
沈澱し、沈澱物を20μTE緩衝液に溶解した。
こうして得たDNA断片を〔Ｂ〕とする。 DNA断片〔Ａ〕0.5μg及びDNA断片〔Ｂ〕
0.5μgを緩衝液（66mM Tris−Cl PH7.6，
6.6mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP）
20μ中T4DNAリガーゼ2.5ユニツトと15℃で15
時間反応させた。この反応液を用いて、大腸菌
HB101株を形質転換し、アンピシリン耐性菌の
中から、pKKtrpプラスミドを有するコロニーを
スクリーニングし、慣用法によりプラスミドを単
離した。 実施例９ プラスミドptrpUK2の作成（第１２
図） プラスミドpKKtrp及びpMUT4Lを材料とし
て、トリプトフアンプロモーターの下流にヒト−
プロウロキナーゼ遺伝子の挿入されたプラスミド
ptrpUK2を作成した。 すなわち1μgのpKKtrpと５ユニツトのEcoR
を緩衝液（10mM Tris−HCl PH7.5，10mM
MgCl2，50mM NaCl，1mM DTT）50μ中、
37℃で２時間反応後、さらにアルカリホスフアタ
ーゼ２ユニツトを加えて65℃、30分間反応した。
フエノール処理、エタノール沈澱によりDNAを
回収した〔Ｃ〕。 一方10μgのpMUT4Lと20ユニツトのEcoRを
上と同様の緩衝液100μ中37℃、２時間反応後
1.2％アガロースゲル電気泳動によりヒトウロキ
ナーゼ遺伝子のＮ末端部分を含む640bp断片を単
離した。〔Ｄ〕。 DNA断片〔Ｃ〕及び〔Ｄ〕を緩衝液（66mM
Tris−HCl PH7.6，6.6mM MgCl2，10mM
DTT，1mM ATP）10μ中でT4DNAリガーゼ
2.5ユニツトと15℃で15時間反応後大腸菌HB101
株に形質転換し、アンピシリン耐性菌の中から
ptrpUK1プラスミドを有するコロニーをスクリ
ーニングし慣用法によりプラスミドを単離した。
続いて1μgのptrpUK1と５ユニツトのPstIを緩衝
液（10mM Tris−HCl PH7.5，10mM MgCl2，
50mM NaCl，1mM DTT）50μ中37℃で２時
間反応後、さらにアルカリホスフアターゼ２ユニ
ツトを加えて65℃、30分間反応させたフエノール
処理、及びエタノール沈澱によりDNAを回収し
た〔Ｅ〕。 一方、10μのpMUT4Lと20ユニツトのPstIを
上と同様の緩衝液100μ中37℃２時間反応後，
0.7％アガロースゲル電気泳動により，ヒトウロ
キナーゼ遺伝子のＣ末端部分を含む1.2kp断片を
単離した。〔Ｆ〕。 DNA断片〔Ｅ〕及び〔Ｆ〕を緩衝液（66mM
Tris−HCl PH7.6，6.6mM MgCl2，
10mMDTT，1mMATP）10μ中でT4DNAリ
ガーゼ2.5ユニツトと12℃で15時間反応後、大腸
菌HB101株に形質転換し、アンピシリン耐性菌
の中からptrpUK2プラスミドを有するコロニー
をスクリーニングし、慣用法によりプラスミドを
単離した。 実施例10 プラスミドptrpUK2（I135）の作成 実施例１と同一の方法により、但しプライマー
として次の合成オリゴヌクレオチド： 5′CAGATGGAATAAAGCC3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがイソ
ロイシンのコドンATAに変異しているDNA断片
が挿入された変異２本鎖型フアージM13RF
（I135）を得た。 10μgのM13RF（I135）をPstIにより完全消化
し、約1.2kb断片を単離した。一方、1μgの
ptrpUK2をPstIにより完全消化し、ベクターとな
るDNA断片約3.4kbを単離した。これらのそれぞ
れをフエノール処理及びエタノール沈澱により回
収した後混合し、T4DNAリガーゼを用いて12℃
にて一晩反応後大腸菌HB101株に形質転換して
アンピシリン耐性コロニーの中からptrpUK2
（I135）を含むクローンをスクリーニングした。
この方法の具体的な条件は実施例４に記載したも
のと同一であつた。 このプラスミドを含有する大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）w3110／ptrpUK2
（I135）は、1985年12月28日に、DSM−3622とし
てDeutsche Sammelung von
Mikroorganismenにブタペスト条約に基き国際
委託された。 実施例11 プラスミドptrpUK（E135）の作成 実施例１と同様の方法により、但しプライマー
として次の合成ヌクレオチド： 5′GATGGAGAAAAGCCT 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグリ
タミン酸のコドンGAAに変異しているDNA断片
が挿入された変異２本鎖型フアージM13RF
（E135）を得た。 次に、このM13RF（135）とptrpUK2とから、
実施例10に記載した方法と同様にしてプラスミド
ptrpUK2（E135）を得た。 このプラスミドを含有する大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）w3110／ptrpUK2
（E135）は、1985年12月28日に、DSM−3621と
してDeutsche Sammelung von
Mikroorganismenに寄託された。 実施例12 プラスミドptrpUK2（Q135D157）の
作成 実施例１と同様の方法により、但しプライマー
として次の合成ヌクレオチド： 5′GATGGACAAAAGCCC 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグリ
タミンのコドンCAAに変異しているDNA断片が
挿入された変異２本鎖型フアージを得た。 次にこのフアージから、実施例１に記載されて
いる方法と同様にして１本鎖フアージDNAを得、
上記と同様にして、但し、プライマーとして次の
合成オリゴヌクレオチド： 5′GGCCCCGCGATAAGATTA 3′ を使用して、157位のフエニルアラニンのコドン
TTTをアスパラギン酸のコドンGATに変異させ
ることにより、135位のリジンのコドンAAAがグ
ルタミンのコドンCAAに変異しており、且つ157
位のフエニルアラニンのコドンTTTがアスパラ
ギン酸のコドンGATに変異しているDNA断片が
挿入された変異２本鎖フアージM13RF
（Q135D157）を得た。 次に、このM13RF（Q135D157）とptrpUK2と
から、実施例10に記載した方法と同様にして
trpUK2（Q135D157）を得た。 このプラスミドを含有する大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）W3110／ptrpUK2
（Q135D157）は、1985年12月28日に、DSM−
3623としてDeutsche Sammelung von
Mikroorganismenに寄託された。 実施例13 プラスミドtrpUK2（E135D157） 実施例12と同様にして、但し135位のリジンの
コドンをグルタミン酸のコドンGAAに変異せし
めるために次の合成ヌクレオチド： 5′GATGGAGAAAAGCCCT 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグル
タミン酸のコドンCAAに変異しており、且つ157
位のフエニルアラニンのコドンTTTがアスパラ
ギン酸のコドンGATに変異しているDNA断片が
挿入された変異２本鎖フアージM13RF
（E135D157）を得た。 次に、このM13RF（E135D157）とtrpUK2とか
ら、実施例10に記載した方法と同様にして
trpUK2（E135D157）を得た。 このプラスミドを含有する大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）w3110／ptrpUK2
（E135D157）は、1985年12月28日に、DSM−
3624としてDeutsche Sammelung von
Mikroorganismenに寄託された。 実施例14 プロ−ウロキナーゼ様ポリペプチドの
発現(1) 実施例３により得たプラスミドpMUP1及び実
施例４により得たプラスミドpMUP1pmを大腸菌
w3110に慣用法に従つて形質転換し、得られた形
質転換菌を５mlのＬ−ブロス中で30℃にて培養
し、600nmにおける吸光度が約0.3になつたとき
培養液の温度を42℃に上昇させ、さらに３時間培
養してウロキナーゼ遺伝子を発現せしめた。 実施例15 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及びそ
の性質(1) 上記の培養液５mlから大腸菌w3110の菌体を集
め、これを7.5M塩酸グアニジン及び0.05M Tris
−HCl（PH7.5）を含有する溶液0.5mlに懸濁し、室
温にて90分間放置した。次に、この懸濁液を
1000rpmにて10分間遠心分離し、上清1M塩酸グ
アニジン、0.05M Tris−HCl（PH7.5）、2mM還元
剤グルタチオン及び0.2mM酸化型グルタチオン
を含有する溶液５mlに希釈し、そして室温にて一
晩インキユベートした。次にこれを、10mM
Tris−HCl（PH7.4）及び0.4M NaClを含有する容
器100倍容量に対して４℃にて４時間透析し、さ
らに10mM Tris−HCl（PH7.4）及び0.1M NaCl
を含有する容液100倍容量に対して２時間透析し
た。 こうして得られた粗抽出物の一部に30μg／ml
となるようにトリプシンを加え、37℃にて１時間
インキユベートした。対照としてトリプシンの代
りに水を加えたものを同様にインキユベートし
た。 これらを、レムリー等の方法に従つて、12.5％
ポリアクリルアミド及び0.1％SDSを含有するゲ
ルにおいて電気泳動した。次に、ゲルを2.5％の
TritonX−100に浸して室温１時間インキユベー
トした後、フイブリン寒天プレート上に重層し、
37℃にて約１時間又は２時間インキユベートし、
フイブリン寒天プレート上の溶解ゾーンの位置か
ら分子量を推定した。比較のため人尿由来の標準
ウロキナーゼも泳動せしめた。 第１３図において、レーン１は標準ウロキナー
ゼ（１ユニツト）、レーン２はpMUP1により形
質転換された大腸菌からの粗抽出液、レーン３は
pMUP1により形質転換された大腸菌からの粗抽
出液をトリプシンで処理したもの、レーン４は
pMUP1pmにより形質転換された大腸菌からの粗
抽出液、そして、レーン５はpMUP1pmにより形
質転換された大腸菌からの抽出液をトリプシンで
処理したもの、の泳動図である。 この図から明らかな通り、pMUP1に由来する
遺伝子産物の分子量は約５万であるが、トリプシ
ン処理によつてその一部分が分子量約３万に低分
子化した。他方、pMUP1pmに由来する遺伝子産
物の分子量も約５万であるが、トリプシン処理に
よつて低分子化しなかつた。なお、これらの生成
物の分子量約５万及び３万が人尿由来の高分子ウ
ロキナーゼの分子量約5.4万及び低分子ウロキナ
ーゼの分子量約3.3万に比べてやや低いのは、大
腸菌内では糖鎖の付加が生じないためであると思
われる。 実施例16 プロ−ウロキナーゼ様ポリペプチドの
発現(2) 実施例５により得たプラスミドpMUT4Lpm2
を大腸菌JM103に慣用法に従つて形質転換し、得
られた形質転換菌を５mlのＬ−ブロス中で37℃に
て培養し、550nmにおける吸光度が約0.5になつ
たときIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度が1mMとなるよう
に添加することによつて発現を誘導し、さらに３
時間37℃にて培養することによりウロキナーゼ遺
伝子を発現せしめた。 実施例17 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及びそ
の性質(2) 上記の培養液５mlを実施例15に記載したのと同
様の方法により処理して粗抽出物を調製し、そし
て一部分をトリプシンで処理した。 これらを、レムリー等の方法に従つて、10％ポ
リアクリルアミド及び0.1％SDSを含有するゲル
において電気泳動した。次に、ゲルを2.5％の
TritonX−100に浸して室温で１時間インキユベ
ートした後、フイブリン寒天プレート上に重層
し、37℃にて約２時間インキユベートし、フイブ
リン寒天プレート上の溶解ゾーンの位置から分子
量を推定した。比較のため人尿由来の標準ウロキ
ナーゼ、及び実施例15で得られたトリプシン処理
物も泳動せしめた。 この結果を第１４図に示す、この図において、
レーン１は標準ウロキナーゼ（１ユニツト）、レ
ーン２はpMUP1により形質転換された大腸菌か
らの粗抽出液をトリプシンで処理したもの、、レ
ーン３はpMUT4Lpm2により形質転換された大
腸菌からの粗抽出液をトリプシンで処理したも
の、レーン４はpMUP1pmにより形質転換された
大腸菌からの粗抽出液をトリプシンで処理したも
の、の泳動図である。 この図から明らかな通り、pMUT4Lpm2に由
来する遺伝子産物もpMUP1pmに由来する遺伝子
産物と同様にトリプシン処理による低分子化が起
こりにくいことがわかる。なお、これらの生成物
の分子量約５万及び約３万が人尿由来の高分子ウ
ロキナーゼの分子量約5.4万及び低分子ウロキナ
ーゼの分子量約3.3万に比べてやや低いのは、大
腸菌内では糖鎖の付加が生じないためであると思
われる。 実施例18 プロウロキナーゼ様ポリペプチドの発
現(3) 実施例７により得たプラスミドpMUT4Lpm3
を大腸菌JM103に慣用法に従つて形質転換し、得
られた形質転換菌を５mlのＬ−ブロス中で37℃に
て培養し、550nmにおける吸光度が約0.5になつ
たときIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度が1mMとなるよう
に添加することによつて発現を誘導し、さらに３
時間37℃にて培養することによりウロキナーゼ遺
伝子を発現せしめた。 実施例19 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及び精
製(2) 上記の培養液５mlから大腸菌JM103の菌体を集
め、これを7.5M塩酸グアニジン及び0.05M Tris
−HCl（PH7.5）を含有する溶液0.5mlに懸濁し、室
温にて90分間放置した。次に、この懸濁液を
1000rpmにて10分間遠心分離し、上清を1M塩酸
グアニジン、0.05M Tris−HCl（PH7.5）、2mM還
元型グルタチオン及び0.2mM酸化型グルタチオ
ンを含有する溶液５mlに希釈し、そして室温にて
一晩インキユベートした。次にこれを、10mM
Tris−HCl（PH7.4）及び0.4M NaClを含有する溶
液100倍容量に対して４℃にて４時間透析し、さ
らに10mM Tris−HCl（PH7.4）及び0.1M NaCl
を含有する溶液100倍容量に対して２時間透析し
た。こうして得られた粗抽出液を、抗ウロキナー
ゼモノクロナール抗体が結合したセフアロースカ
ラムによるアフイニテイークロマトグラフイーを
行なうことによつて変異体（pm3）プロウロキナ
ーゼを精製した。 実施例20 プロウロキナーゼ様ポリペプチドの発
現(4) 実施例12及び13によつて得たプラスミド
ptrpUK2＝（Q135D157）及びptrpUK2
（E135D157）を大腸菌W3110に慣用に従つて形質
転換し、得られた形質転換菌を５mlのＬ−ブロス
中で37℃にて培養し、550nmにおける吸光度が約
0.5になつたときIAA（インドール酢酸）を最終濃
度が50μg／mlになるように添加することによつ
て発現を誘導し、さらに３時間37℃にて培養する
ことによつてウロキナーゼ遺伝子を発現せしめ
た。 実施例21 大腸菌からの遺伝子産物の抽出精製及
びその性質(4) 上記の培養液のうち、ptrpUK2（Q135D157）
に由来するもの５mlを実施例19に記載したものと
同様の方法により抽出・精製し、変異体
（Q135D157）プロウロキナーゼ様ポリペプチド
を得た。その一部を以下のようにトリプシンで処
理した。サンプルの酵素活性を合成基質法にて測
定し、100IU／mlとなるように50mMトリス塩酸
緩衝液（PH7.4）、0.15M食塩及び0.1％TritonX−
100を含む溶液に希釈した。この溶液50μに対
して１mg／ml、２mg／ml及び３mg／mlのトリプシ
ン水溶液3μを加え、37℃で60分間インキユベ
ートした。次いで５mg／mlのダイズトリプシンイ
ンヒビター水溶液を5μ加えて反応を停止した。
対照としてトリプシンの代りに、水を加えたもの
を同様に処理した。 次いで、これらをレムリー等の方法に従つて、
0.1％SDSを含有する10％−26％ポリアクリルア
ミド連続濃度勾配ゲルにおいて、電気泳動した
後、ゲルを2.5％TritonX−100に浸して室温で小
一時間インキユベートし、フイブリン寒天プレー
ト上に重層して、37℃、２時間インキユベート
し、フイブリン寒天プレート上の溶解ゾーンの位
置から分子量を推定した。なお、比較のために、
実施例14によつて得られた培養液を実施例19に記
載したものと同様な方法により抽出・精製して得
た、天然型プロウロキナーゼ様ポリペプチド及び
変異体（Q135）プロウロキナーゼ様ポリペプチ
ドについても同様な処理を行つた。これらの結果
を第１６図に示す。この図において、レーン１，
２，３及び４はpMUP1に由来する天然型プロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドを、それぞれ０，１，
２及び３mg／mlのトリプシン水溶液を添加して処
理したものの泳動図である。レーン５，６，７及
び８はpMUP1pmに由来する変異体（Q135）プ
ロウロキナーゼ様ポリペプチドを同様にトリプシ
ン処理したものの泳動図である。レーン９，１
０，１１及び１２は、ptrpUK2（Q135D157）に
由来する変異体（Q135D157）プロウロキナーゼ
様ポリペプチドを同様にトリプシン処理したもの
の泳動図である。この図から明らかな通り、
pMUP1に由来する天然型プロウロキナーゼ様ポ
リペプチドの分子量は約５万であるが、トリプシ
ンにより、分子量３万に低分子化した。一方、
pMUP1pm及びptrpUK2（Q135D157）に由来す
る変異体プロウロキナーゼ様ポリペプチドはトリ
プシン処理によつて低分子化しなかつた。 実施例22 大腸菌からの遺伝子産物の抽出・精製
及びその性質(5) 実施例20によつて得られたウロキナーゼ遺伝子
産物を含む培養液を、それぞれ実施例19に記載し
たものと同様の方法により抽出・精製し、変異体
（Q135D157）プロウロキナーゼ様ポリペプチド
を得た。次いでヒト正常血漿に、変異体
（Q135D157）プロウロキナーゼ様ポリペプチド
（0.2mg／ml）を1/9体積加え、37℃でインキユベ
ートした。０，２及び５時間後にその一部をと
り、50倍希釈した。次いでその16μをレムリー
等の方法に従つて、0.1％SDSを含有する10％−
26％ポリアクリルアミド連続濃度勾配ゲルにおい
て、電気泳動した後、ゲルを2.5％TritonX−100
に浸して室温で小一時間インキユベートし、フイ
ブリン寒天プレート上に重層して、37℃、２時間
インキユベートし、フイブリン寒天プレート上の
溶解ゾーンの位置から分子量を推定した。なお、
比較のために、実施例14によつて得られた培養液
を実施例19に記載したものと同様な方法により抽
出・精製して得た、天然型プロウロキナーゼ様ポ
リペプチド及び変異体（Q135）プロウロキナー
ゼ様ポリペプチドについても同様な処理を行つ
た。これらの結果を第１８図に示す。この図にお
いて、レーン１，２および３はpMUP1に由来す
る天然型プロウロキナーゼ様ポリペプチドを、血
漿中でそれぞれ０，２及び５時間インキユベート
したものの泳動図である。レーン４，５及び６は
pMUP1pmに由来する変異体（Q135）プロウロ
キナーゼ様ポリペプチドを同様に処理したものの
泳動図である。また、レーン７，８及び９は、
ptrpUK2（Q135D157）に由来する変異体
（Q135D157）プロウロキナーゼ様ポリペプチド
を同様に処理したものの泳動図である。この図か
ら明らかな通り、天然型プロウロキナーゼ様ポリ
ペプチド及び変異体（Q135）プロウロキナーゼ
様ポリペプチドは、血漿成分と高分子複合体を形
成して、本来の50Kダルトこの位置の溶解ゾーン
が減少した。一方、変異体（Q135D157）プロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドは、血漿中において高
分子複合体を形成せず、溶解ゾーンの減少が見ら
れなかつた。 参考例11 プラスミドpYTU1の作成 工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌
寄第7776号（FERMPNo.7776）として寄託されて
いるエシエリシヤ・コリHB101／PHT3より慣
用の方法を用いてPHT3プラスミドを得た。 PHT3プラスミド5μg及びBamH115Uを緩衝液
（10mM Tris−Hcl PH8.0，7mM MgCl2，
100mM NaCl，2mMβ−メルカプトエタノール）
20μ中で３時間反応させた。エタノール沈澱
後、沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl PH
7.2，10mM MgCl2，0.1mM DTT，80μM
dNTP）20μ中、Klenow断片１ユニツトと、
22℃で0.5時間反応させた。フエノール処理後、
エタノール沈澱を行つた。沈澱物を、緩衝液
（10mM Tris−HCl PH7.5，7mM MgCl260mM
NaCl，7mM β−メルカプトエタノール）20μ
中、Pvu20ユニツトと37℃で３時間反応させ
た。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（66mM
Tris−HCl PH7.6，6.6mM MgCl2，10mM
DTT，1mM ATP）20μ中，リガーゼ2.8ユニ
ツトと15℃で20時間反応させた。この反応物を用
いて、エシエリシヤ・コリHB101株を形質転換
させた。アンピシリン耐性形質転換株の中から、
第１８図に示すようなPHT31プラスミドをもつ
菌を単離した。単に、慣用の方法を用いて、
PHT31プラスミドを得た。 PHT31プラスミド10μgを緩衝液（10mM Tris
−HCl PH7.5，7mM MgCl2，60mM NaCl，
7mM β−メルカプトエタノール）20μ中、
Aat20ユニツトと37℃で３時間反応させた。エ
タノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（67mM Tris
−HCl PH8.8，6.7mM MgCl2，10mM β−メ
ルカプトエタノール，6.7mM EDTA，16.6mM
（NH4）2SO4，330μM dCTP）20μ中，T4DNA
ポリメラーゼ2.8ユニツトと37℃で15分間反応さ
せた。フエノール処理及びエタノール沈澱を行つ
た後、沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl PH
7.5，7mM MgCl2，150mM，NaCl，0.2mM
EDTA，7mMβ−メルカプトエタノール）20μ
中，SalI20ユニツトと37℃で３時間反応させた。
このDNA反応液を1.2％アガロースゲル電気泳動
にかけ、アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始領
域を含む約3000塩基対のDNA断片を慣用手段に
より回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ａ〕
とする。一方、PHT31プラスミド10μgを緩衝液
（100mM Tris−HCl PH7.5，7mM MgCl2，Mβ
−メルカプトエタノール）20μ中、EcoRI30ユ
ニツトと37℃で３時間反応させた。エタノール沈
澱後、沈澱物を緩衝液（67mM Tris−HCl PH
8.8，6.7mM MgCl2，10mM β−メルカプトエ
タノール、6.7mM EDTA，16.6mM（NH4）2
SO4，330μM dCTP）20μ中、T4DNAポリメ
ラーゼ2.8ユニツトと37℃で15分間反応させた。
フエノール処理及びエタノール沈澱を行つた後、
沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl PH7.5，
7mM MgCl2，150mM NaCl2，0.2mMEDTA，
7mM β−メルカプトエタノール）20μ中、
SalI20ユニツトと37℃で３時間反応させた。この
DNA反応液を、1.2％アガロースゲル電気泳動に
かけ、cIts及びPLプロモーター・オペレーターを
含む約2100塩基対のDNA断片を回収した。この
DNA断片をDNA断片〔Ｂ〕とする。DNA断片
〔Ａ〕0.5μg及びDNA断片〔Ｂ〕0.5μgを緩衝液
（66mM Tris−HCl PH7.6，6.6mM MgCl2
10mM DTT，1mM ATP）20μ中、T4DNA
リガーゼ2.5ユニツトと15℃で15時間反応させた。
この反応液を用いて、エシエリシヤ・コリ
HB101株を形質転換し、アンピシリン耐性菌の
中から第１１図に示したpTYU1プラスミドをも
つコロニーをスクリーニングし、慣用手段により
プラスミドを単離した。 文 献 (1) M.サママ，M.カステル，O.マツオ，M.ホイ
ラエルツ及びH.R.リジネン（1982）トロンボ
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用いる点突然変異導入法に代えて、135番目のリ
ジンのコドンの代りに他のアミノ酸、例えばグル
タミン、スレオニン等のコドンを有するがその他
のコドンが変化していないDNA断片を合成し、
これを天然mRNAよりのcDNAの対応する部分
と組換えることによつても変異を導入することが
できる。 前記のようにして得られた変異体フアージ
DNAをPstで切り出して変異した挿入部を得、
これを完全なコード領域の対応部分と置き換えた
後、このコード領域を例えば大腸菌用発現用ベク
ターに挿入し、これを大腸菌に形質転換して該大
腸菌を培養することにより、本発明のポリペプチ
ドを発現せしめることができる。 実施例３ ヒト−プロウロキナーゼ遺伝子を含有
する大腸菌用発現プラスミド（pMUP1）の作
製（第９図） PLプロモーター及びメタピロカテカーゼ由来
のSD配列を含むpYTU1（文献27）をベクターと
して、ヒト腎臓由来のウロキナーゼcDNA（ウロ
キナーゼのＮ端の複数個のアミノ酸のコドンが前
記のごとく置換されている）の発現プラスミドを
作製した。すなわち、10μgのプラスミドpYTU1
を10mM Tris−HCl（PH7.4），7mM MgCl2及び
150mM NaClを含有する反応液100μ中で、10
ユニツトのSal及び10ユニツトのAatを用い
て37℃にて２時間消化し、アガロース電気泳動に
より約4.5KbのSal−Aatベター断片を単離し
た。 一方、10μgのプラスミドpKMU1を、10mM
Tris−HCl（PH7.4），7mM MgCl2及び60mM
NaClを含む反応液100μ中にて、10ユニツトの
Draにより37℃にて２時間消化し、次に
0.66mMとなるようにATPを加え、Salリンカ
ーDNA（5′GGTCGACC3′）1μg及びT4DNAリガ
ーゼ100ユニツトを加えて12℃にて一晩反応を行
つた。次に、フエノール処理及びエタノール沈澱
によつてDNA断片を回収し、10mM Tris−HCl
（PH7.4），7mM MgCl2及び150mM NaClを含有
する反応液100μ中で、10ユニツトずつのAat
及びSalにより37℃にて２時間消化し、そして
アガロース電気泳動によつて約2.2Kbのヒトウロ
キナーゼ遺伝子断片を単離した。これら２種類の
DNA断片それぞれ1μgを混合し、66mM Tris−
HCl（PH7.4），7mM MgCl2，0.66mM ATP及び
10mMジチオスレイトールを含有する反応液20μ
中で100ユニツトのT4DNAリガーゼにより12
℃にて１晩連結反応を行つた。 この反応液を用いて大腸菌HB101を形質転換
し、形成されたコロニーをアルカリ溶菌法による
迅速単離によりスクリーニングし、プラスミド
pMUP1を有するクローンを得た。この菌よりプ
ラスミドDNAを調製した。 実施例４ プラスミドpMUP1pmの作製（１０
図） ウロキナーゼのＮ末端から135番目のリジンの
コドンAAAがグリタミンのコドンCAAに変異し
たcDNA断片を含有する変異体N13フアージ二本
鎖DNAと、PLプロモーター及びC230SD配列の
下流にプロウロキナーゼの構造遺伝子を有するプ
ラスミドpMUP1を用いて、変異した遺伝子を含
む大腸菌用発現プラスミドを作製した。 すなわち、10μgの変異体M13二本鎖DNAを
Pstにより完全消化し、約1.2Kb断片を単離し
た。 一方、10μgのプラスミドpMUP1をPstによ
り部分消化し、約1.2Kb断片のみが除去された約
5.4Kbの断片を単離した。 これらのそれぞれをフエノール処理及びエタノ
ール沈澱により回収した後混合し、T4DNAリガ
ーゼを用いて12℃にて１番連結反応を行い、反応
混合物を用いて大腸菌HB101を形質転換し、形
成されたコロニーをアルカリ溶菌法による迅速単
離法によりスクリーニングし、pMUP1pmを含む
クローンを得た。このプラスミドpMUP1pmが導
入された大腸菌エシエリシヤ・コリ（Escheria
coli）χ1776／pMUP1pmは、1985年１月11日に
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
8042号（FERMP−No.8042）として寄託され、
1986年１月22日に微工研条寄第969号（FERM
BP969）としてブタペスト条約に基づく国際寄託
に移管された。 プラスミドpMUP1pmは本発明の代表的なプラ
スミドであり、PLプロモーター及びC230SD配列
の下流の適切な位置にヒトプロウロキナーゼ様ポ
リペプチドをコードするコード領域を含有し、こ
のコード領域においては該ポリペプチドのＮ端の
６個のアミノ酸のコドンが大腸菌中で発現されや
すくコドンにより置き換えられており、さらに
135番目のアミノ酸であるリジンのコドンAAAが
グルタミンのコドンCAAに変えられている。 実施例５ プラスミドpMUT4Lpm2の作製（第
９図及び第１０図を参照のこと） 大腸菌tacプロモーターの下流に上記点突然変
異を有するヒト−プロウロキナーゼ構造遺伝子を
挿入した発現型プラスミドpMUT4Lpm2を以下
のようにして作製した。 10μgの変異体M13二本鎖DNA（pm2）をPst
により完全消化し、約1.2Kb断片を単離した。一
方、10μgのプラスミドpMUT4LをPstにより部
分消化し、約1.2Kb断片のみが除去された約
4.6Kbの断片を単離した。 これらのそれぞれをフエノール処理およびエタ
ノール沈澱により回収した後混合し、T4DNAリ
ガーゼを用いて12℃にて一晩連結反応を行い、反
応混合物を用いて大腸菌HB101を形質転換し、
形成されたコロニーをアルカリ溶菌法による迅速
単離法によりスクリーニングし、pMUT4Lpm2
を含むクローンを得た。プラスミド
pMUT4Lpm2が導入された大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）χ1776／
pMUT4Lpm2は、1985年４月18日に工業技術院
微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8188号
（FERMP−No.8188号）として寄託され、1986年
１月22日に微工研条寄第970号（FERM BP970）
としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され
た。 プラスミドpMUT4Lpm2もまた本発明の代表
的なプラスミドであり、tacプロモーターの下流
の適切な位置にヒト−プロウロキナーゼ様ポリペ
プチドをコードするコード領域を含有し、このコ
ード領域においては該ポリペプチドのＮ端の６個
のアミノ酸のコドンが大腸菌中で発現されやすい
コドンにより置き換えられており、さらに135番
目のアミノ酸であるリジンのコドンAAAがスレ
オニンのコドンACAに変えられている。 実施例６ M13フアージを用いる157位のアミノ
酸のコドンへの特異的塩基置換変異の導入 (1) 一本鎖鋳型DNAの調製 プラスミドpKYU22及びフアージM13mp8二本
鎖DNAそれぞれ1μgずつを、10mM Tris−HCl
（PH7.5），7mM MgCl2，7mMβ−メルカプトエ
タノール及び50mM NaClを含有する溶液20μ
中で５ユニツトのPstを用いて37℃にて１時間
消化した。フエノール処理、エタノール沈澱によ
つてそれぞれのDNA断片を回収し、両者を混合
した後、66mM Tris−HCl（PH7.5），5mM
MgCl2，5mM DTT及び1mM ATPを含有する
溶液20μ中で100ユニツトのT4DNAリガーゼを
用いて12℃にて16時間連結反応を行つた。反応
後、反応液を用いてメツシング等の方法（文献
25）に従つて大腸菌JM103を形質転換し、0.02％
Ｘ−gal及び1mM IPTGを含有する寒天と共にプ
レートし、37℃にて一晩培養した。組換え体によ
つて形成された白いプラークにより一本鎖DNA
を調製した。 得られた一本鎖DNAのいくつかを鋳型として
メツシングらの方法（文献25）に従つてジデオキ
シ法により塩基配列を決定し、クローニングされ
た一本鎖DNAの配列を確認した。 (2) 特異的塩基置換変異の導入 前記のようにして得た組換え体M13フアージ一
本鎖DNA（ウロキナーゼ遺伝子のアンチコーデイ
ング鎖がクローニングされている。）を鋳型とし
て新たなオリゴヌクレオチド変異原剤による部位
特異的変異導入をおこなつた。但し、プライマー
として次の合成オリゴヌクレオチド 5′GGCCCCGCGATAAGATTA 3′ を用いた。この18塩基のオリゴヌクレオチドは一
本鎖鋳型DNA中のウロキナーゼ遺伝子と相補的
であるがフエニルアラニンコドンTTTがアスパ
ラギン酸コドンＧ ＡＴへと二塩基が変化してい
る。 このオリゴヌクレオチドをプライマーとして試
験管内で二本鎖DNAを合成した。すなわち、鋳
型一本鎖DNA0.5pmoleに5′末端をリン酸化した
プライマー2pmoleを加え、そして7mM Tris−
HCl（PH7.5），0.1mM EDTA，20mM NaCl及び
7mM MgCl2を含有する溶液10μ中で、60℃に
て20分間インキユベートし、続いて23℃にて20分
間インキユベートした。さらにこの反応混合物に
dATP，dGTP，dTTP、及びdCTPをそれぞれ
0.5mMの濃度になるように加え、全体を20μと
してDNAポリメラーゼklenow断片２ユニツトを
加え、そして23℃にて20分間インキユベートし
た。続いて10mM ATPを1μ及びT4DNAリガ
ーゼ１ユニツトを加え、12℃にて一晩インキユベ
ートした。上記反応液を直接、メツシング等の方
法（文献25）に従つて大腸菌JM103に形質転換し
た。このようにして上記反応液1μ当たり約１
万個のフアージプラークが得られた。 得られたプラークを軟寒天培地からベントン・
デイビス等の方法（文献26）に従つてニトロセル
ロースフイルターに移したのち、真空中80℃にて
２時間ベーキングした。このニトロセルロースフ
イルターを６×SSC，10×Denhardt溶液中で32P
で標識したプライマーオリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして37℃にて一晩ハイブリダイゼーシヨン
を行つた。次にこのフイルターを６×SSC中で52
℃にて洗浄し、そしてオートラジオグラフイーを
行い陽性シグナルを示す変異体フアージプラーク
を単離した。この変異体フアージから変異体２本
鎖型フアージDNA（pm3）を得た。変異体DNA
の塩基配列は、変異体フアージDNAを鋳型とす
るジデオキシ法により塩基配列を決定し、目的と
する一塩基置換変異が生じたことを確認した。 また変異剤として次のオリゴヌクレオチド： 5′GGCCCCGCGAAAAGATTA 3′ を用いて、157番目のアミノ酸フエニルアラニン
のコドンTTTをグルタミン酸のコドンGAAに置
きかえることもできる。 実施例７ プラスミドpMUT4Lpm3の作製 大腸菌tacプロモーターの下流に上記点突然変
異を有するヒトウロキナーゼ構造遺伝子を挿入し
た発現型プラスミドpMUT4Lpm3を以下のよう
にして作製した。 10μgの変異体M13二本鎖DNA（pm3）をPst
により完全消化し、約1.2Kb断片を単離した。一
方、10μgのプラスミドpMUT4LをPstにより部
分消化し、約1.2Kb断片のみが除去された約
4.6Kbの断片を単離した。 これらのそれぞれをフエノール処理およびエタ
ノール沈澱により回収した後混合し、T4DNAリ
ガーゼを用いて12℃にて一晩連結反応を行い、反
応混合物を用いて大腸菌HB101を形質転換し、
形成されたコロニーをアルカリ溶菌法による迅速
単離法によりスクリーニングし、pMUT4Lpm3
を含むクローンを得た。プラスミド
pMUT4Lpm3が導入された大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）χ1776／
pMUT4Lpm3が1985年７月11日に工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第8341号
（FERMP−8341）として寄託され、1986年１月
22日に微工研条寄第971号（FERM BP−971）
としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され
る。 プラスミドpMUT4Lpm3もまた本発明の代表
的なプラスミドであり、tacプロモーターの下流
の適切な位置にヒト−プロウロキナーゼ様ポリペ
プチドをコードするコード領域を含有し、このコ
ード領域においては該ポリペプチドのＮ端の６個
のアミノ酸のコドンが大腸菌中で発現されやすい
コドンに置き換えられており、さらに157番目の
アミノ酸であるフエニルアラニンのコドンTTT
がアスパラギン酸のコドンGATに変えられてい
る。 実施例８ プラスミドpKKtrpの作製（第１１
図） 5μgのプラスミドpKK223−３と30ユニツトの
EcoRI及び20ユニツトのPvuを緩衝液（10mM
Tris−HCl，PH7.5，10mM MgCl2，50mM
NaCl，1mM DTT）100μ中、37℃で１時間反
応させた。この反応液を0.7％アガロース電気泳
動にかけ、アンピシリン耐性遺伝子、複製開始領
域及びrrnBT1T2転写終結領域を含む約2600塩基
対のDNA断片を慣用法によつて回収した。 この断片と１ユニツトのクレノウ断片とを緩衝
液（50mM Tris−Cl PH7.2，10mM Mg，SO4，
0.1mM DTT，80μM dNTPS）25μ中、25℃で
１時間反応させ、さらにアルカリフオスフアター
ゼ１ユニツトを加え、68℃で0.5時間反応させた。
フエノール処理後エタノール沈澱し、沈澱物を
20μTE緩衝液（10mM Tris−HCl PH8.0，
1mM EDTA）に溶解した。こうして得たDNA
断片を〔Ａ〕とする。 一方、10μgのプラスミドpSTN16と20ユニツト
のCla及び20ユニツトの及びPvuとを緩衝液
（10mM Tris−Cl PH7.5，10mM MgC12，
50mM MsCl 1mM DTT）100μ中37℃で１時
間反応させた、この反応液を0.7％アガロース電
気泳動にかけ、トリプトフアンオペロンのプロモ
ーター、オペレーター及びリボソーム結合部位を
含む約300塩基対の断片を慣用法により回収した。 この断片と１ユニツトのクレノウ断片を緩衝液
（50mM Tris−HCl PH7.2，10mM MgSO4，
0.1mM DTT，80μM dNTPS）25μ中、25℃で
１時間反応させた。フエノール処理後エタノール
沈澱し、沈澱物を20μTE緩衝液に溶解した。
こうして得たDNA断片を〔Ｂ〕とする。 DNA断片〔Ａ〕0.5μg及びDNA断片〔Ｂ〕
0.5μgを緩衝液（66mM Tris−Cl PH7.6，
6.6mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP）
20μ中T4DNAリガーゼ2.5ユニツトと15℃で15
時間反応させた。この反応液を用いて、大腸菌
HB101株を形質転換し、アンピシリン耐性菌の
中から、pKKtrpプラスミドを有するコロニーを
スクリーニングし、慣用法によりプラスミドを単
離した。 実施例９ プラスミドptrpUK2の作成（第１２
図） プラスミドpKKtrp及びpMUT4Lを材料とし
て、トリプトフアンプロモーターの下流にヒト−
プロウロキナーゼ遺伝子の挿入されたプラスミド
ptrpUK2を作成した。 すなわち1μgのpKKtrpと５ユニツトのEcoR
を緩衝液（10mM Tris−HCl PH7.5，10mM
MgCl2，50mM NaCl，1mM DTT）50μ中、
37℃で２時間反応後、さらにアルカリホスフアタ
ーゼ２ユニツトを加えて65℃、30分間反応した。
フエノール処理、エタノール沈澱によりDNAを
回収した〔Ｃ〕。 一方10μgのpMUT4Lと20ユニツトのEcoRを
上と同様の緩衝液100μ中37℃、２時間反応後
1.2％アガロースゲル電気泳動によりヒトウロキ
ナーゼ遺伝子のＮ末端部分を含む640bp断片を単
離した。〔Ｄ〕。 DNA断片〔Ｃ〕及び〔Ｄ〕を緩衝液（66mM
Tris−HCl PH7.6，6.6mM MgCl2，10mM
DTT，1mM ATP）10μ中でT4DNAリガーゼ
2.5ユニツトと15℃で15時間反応後大腸菌HB101
株に形質転換し、アンピシリン耐性菌の中から
ptrpUK1プラスミドを有するコロニーをスクリ
ーニングし慣用法によりプラスミドを単離した。
続いて1μgのptrpUK1と５ユニツトのPstIを緩衝
液（10mM Tris−HCl PH7.5，10mM MgCl2，
50mM NaCl，1mM DTT）50μ中37℃で２時
間反応後、さらにアルカリホスフアターゼ２ユニ
ツトを加えて65℃、30分間反応させたフエノール
処理、及びエタノール沈澱によりDNAを回収し
た〔Ｅ〕。 一方、10μのpMUT4Lと20ユニツトのPstIを
上と同様の緩衝液100μ中37℃２時間反応後，
0.7％アガロースゲル電気泳動により，ヒトウロ
キナーゼ遺伝子のＣ末端部分を含む1.2kp断片を
単離した。〔Ｆ〕。 DNA断片〔Ｅ〕及び〔Ｆ〕を緩衝液（66mM
Tris−HCl PH7.6，6.6mM MgCl2，
10mMDTT，1mMATP）10μ中でT4DNAリ
ガーゼ2.5ユニツトと12℃で15時間反応後、大腸
菌HB101株に形質転換し、アンピシリン耐性菌
の中からptrpUK2プラスミドを有するコロニー
をスクリーニングし、慣用法によりプラスミドを
単離した。 実施例10 プラスミドptrpUK2（I135）の作成 実施例１と同一の方法により、但しプライマー
として次の合成オリゴヌクレオチド： 5′CAGATGGAATAAAGCC3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがイソ
ロイシンのコドンATAに変異しているDNA断片
が挿入された変異２本鎖型フアージM13RF
（I135）を得た。 10μgのM13RF（I135）をPstIにより完全消化
し、約1.2kb断片を単離した。一方、1μgの
ptrpUK2をPstIにより完全消化し、ベクターとな
るDNA断片約3.4kbを単離した。これらのそれぞ
れをフエノール処理及びエタノール沈澱により回
収した後混合し、T4DNAリガーゼを用いて12℃
にて一晩反応後大腸菌HB101株に形質転換して
アンピシリン耐性コロニーの中からptrpUK2
（I135）を含むクローンをスクリーニングした。
この方法の具体的な条件は実施例４に記載したも
のと同一であつた。 このプラスミドを含有する大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）w3110／ptrpUK2
（I135）は、1985年12月28日に、DSM−3622とし
てDeutsche Sammelung von
Mikroorganismenにブタペスト条約に基き国際
委託された。 実施例11 プラスミドptrpUK（E135）の作成 実施例１と同様の方法により、但しプライマー
として次の合成ヌクレオチド： 5′GATGGAGAAAAGCCT 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグリ
タミン酸のコドンGAAに変異しているDNA断片
が挿入された変異２本鎖型フアージM13RF
（E135）を得た。 次に、このM13RF（135）とptrpUK2とから、
実施例10に記載した方法と同様にしてプラスミド
ptrpUK2（E135）を得た。 このプラスミドを含有する大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）w3110／ptrpUK2
（E135）は、1985年12月28日に、DSM−3621と
してDeutsche Sammelung von
Mikroorganismenに寄託された。 実施例12 プラスミドptrpUK2（Q135D157）の
作成 実施例１と同様の方法により、但しプライマー
として次の合成ヌクレオチド： 5′GATGGACAAAAGCCC 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグリ
タミンのコドンCAAに変異しているDNA断片が
挿入された変異２本鎖型フアージを得た。 次にこのフアージから、実施例１に記載されて
いる方法と同様にして１本鎖フアージDNAを得、
上記と同様にして、但し、プライマーとして次の
合成オリゴヌクレオチド： 5′GGCCCCGCGATAAGATTA 3′ を使用して、157位のフエニルアラニンのコドン
TTTをアスパラギン酸のコドンGATに変異させ
ることにより、135位のリジンのコドンAAAがグ
ルタミンのコドンCAAに変異しており、且つ157
位のフエニルアラニンのコドンTTTがアスパラ
ギン酸のコドンGATに変異しているDNA断片が
挿入された変異２本鎖フアージM13RF
（Q135D157）を得た。 次に、このM13RF（Q135D157）とptrpUK2と
から、実施例10に記載した方法と同様にして
trpUK2（Q135D157）を得た。 このプラスミドを含有する大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）W3110／ptrpUK2
（Q135D157）は、1985年12月28日に、DSM−
3623としてDeutsche Sammelung von
Mikroorganismenに寄託された。 実施例13 プラスミドtrpUK2（E135D157） 実施例12と同様にして、但し135位のリジンの
コドンをグルタミン酸のコドンGAAに変異せし
めるために次の合成ヌクレオチド： 5′GATGGAGAAAAGCCCT 3′ を使用して、135位のリジンのコドンAAAがグル
タミン酸のコドンCAAに変異しており、且つ157
位のフエニルアラニンのコドンTTTがアスパラ
ギン酸のコドンGATに変異しているDNA断片が
挿入された変異２本鎖フアージM13RF
（E135D157）を得た。 次に、このM13RF（E135D157）とtrpUK2とか
ら、実施例10に記載した方法と同様にして
trpUK2（E135D157）を得た。 このプラスミドを含有する大腸菌エシエリシ
ヤ・コリ（Escherichia coli）w3110／ptrpUK2
（E135D157）は、1985年12月28日に、DSM−
3624としてDeutsche Sammelung von
Mikroorganismenに寄託された。 実施例14 プロ−ウロキナーゼ様ポリペプチドの
発現(1) 実施例３により得たプラスミドpMUP1及び実
施例４により得たプラスミドpMUP1pmを大腸菌
w3110に慣用法に従つて形質転換し、得られた形
質転換菌を５mlのＬ−ブロス中で30℃にて培養
し、600nmにおける吸光度が約0.3になつたとき
培養液の温度を42℃に上昇させ、さらに３時間培
養してウロキナーゼ遺伝子を発現せしめた。 実施例15 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及びそ
の性質(1) 上記の培養液５mlから大腸菌w3110の菌体を集
め、これを7.5M塩酸グアニジン及び0.05M Tris
−HCl（PH7.5）を含有する溶液0.5mlに懸濁し、室
温にて90分間放置した。次に、この懸濁液を
1000rpmにて10分間遠心分離し、上清1M塩酸グ
アニジン、0.05M Tris−HCl（PH7.5）、2mM還元
剤グルタチオン及び0.2mM酸化型グルタチオン
を含有する溶液５mlに希釈し、そして室温にて一
晩インキユベートした。次にこれを、10mM
Tris−HCl（PH7.4）及び0.4M NaClを含有する容
器100倍容量に対して４℃にて４時間透析し、さ
らに10mM Tris−HCl（PH7.4）及び0.1M NaCl
を含有する容液100倍容量に対して２時間透析し
た。 こうして得られた粗抽出物の一部に30μg／ml
となるようにトリプシンを加え、37℃にて１時間
インキユベートした。対照としてトリプシンの代
りに水を加えたものを同様にインキユベートし
た。 これらを、レムリー等の方法に従つて、12.5％
ポリアクリルアミド及び0.1％SDSを含有するゲ
ルにおいて電気泳動した。次に、ゲルを2.5％の
TritonX−100に浸して室温１時間インキユベー
トした後、フイブリン寒天プレート上に重層し、
37℃にて約１時間又は２時間インキユベートし、
フイブリン寒天プレート上の溶解ゾーンの位置か
ら分子量を推定した。比較のため人尿由来の標準
ウロキナーゼも泳動せしめた。 第１３図において、レーン１は標準ウロキナー
ゼ（１ユニツト）、レーン２はpMUP1により形
質転換された大腸菌からの粗抽出液、レーン３は
pMUP1により形質転換された大腸菌からの粗抽
出液をトリプシンで処理したもの、レーン４は
pMUP1pmにより形質転換された大腸菌からの粗
抽出液、そして、レーン５はpMUP1pmにより形
質転換された大腸菌からの抽出液をトリプシンで
処理したもの、の泳動図である。 この図から明らかな通り、pMUP1に由来する
遺伝子産物の分子量は約５万であるが、トリプシ
ン処理によつてその一部分が分子量約３万に低分
子化した。他方、pMUP1pmに由来する遺伝子産
物の分子量も約５万であるが、トリプシン処理に
よつて低分子化しなかつた。なお、これらの生成
物の分子量約５万及び３万が人尿由来の高分子ウ
ロキナーゼの分子量約5.4万及び低分子ウロキナ
ーゼの分子量約3.3万に比べてやや低いのは、大
腸菌内では糖鎖の付加が生じないためであると思
われる。 実施例16 プロ−ウロキナーゼ様ポリペプチドの
発現(2) 実施例５により得たプラスミドpMUT4Lpm2
を大腸菌JM103に慣用法に従つて形質転換し、得
られた形質転換菌を５mlのＬ−ブロス中で37℃に
て培養し、550nmにおける吸光度が約0.5になつ
たときIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度が1mMとなるよう
に添加することによつて発現を誘導し、さらに３
時間37℃にて培養することによりウロキナーゼ遺
伝子を発現せしめた。 実施例17 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及びそ
の性質(2) 上記の培養液５mlを実施例15に記載したのと同
様の方法により処理して粗抽出物を調製し、そし
て一部分をトリプシンで処理した。 これらを、レムリー等の方法に従つて、10％ポ
リアクリルアミド及び0.1％SDSを含有するゲル
において電気泳動した。次に、ゲルを2.5％の
TritonX−100に浸して室温で１時間インキユベ
ートした後、フイブリン寒天プレート上に重層
し、37℃にて約２時間インキユベートし、フイブ
リン寒天プレート上の溶解ゾーンの位置から分子
量を推定した。比較のため人尿由来の標準ウロキ
ナーゼ、及び実施例15で得られたトリプシン処理
物も泳動せしめた。 この結果を第１４図に示す、この図において、
レーン１は標準ウロキナーゼ（１ユニツト）、レ
ーン２はpMUP1により形質転換された大腸菌か
らの粗抽出液をトリプシンで処理したもの、、レ
ーン３はpMUT4Lpm2により形質転換された大
腸菌からの粗抽出液をトリプシンで処理したも
の、レーン４はpMUP1pmにより形質転換された
大腸菌からの粗抽出液をトリプシンで処理したも
の、の泳動図である。 この図から明らかな通り、pMUT4Lpm2に由
来する遺伝子産物もpMUP1pmに由来する遺伝子
産物と同様にトリプシン処理による低分子化が起
こりにくいことがわかる。なお、これらの生成物
の分子量約５万及び約３万が人尿由来の高分子ウ
ロキナーゼの分子量約5.4万及び低分子ウロキナ
ーゼの分子量約3.3万に比べてやや低いのは、大
腸菌内では糖鎖の付加が生じないためであると思
われる。 実施例18 プロウロキナーゼ様ポリペプチドの発
現(3) 実施例７により得たプラスミドpMUT4Lpm3
を大腸菌JM103に慣用法に従つて形質転換し、得
られた形質転換菌を５mlのＬ−ブロス中で37℃に
て培養し、550nmにおける吸光度が約0.5になつ
たときIPTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトピラノシド）を最終濃度が1mMとなるよう
に添加することによつて発現を誘導し、さらに３
時間37℃にて培養することによりウロキナーゼ遺
伝子を発現せしめた。 実施例19 大腸菌からの遺伝子産物の抽出及び精
製(2) 上記の培養液５mlから大腸菌JM103の菌体を集
め、これを7.5M塩酸グアニジン及び0.05M Tris
−HCl（PH7.5）を含有する溶液0.5mlに懸濁し、室
温にて90分間放置した。次に、この懸濁液を
1000rpmにて10分間遠心分離し、上清を1M塩酸
グアニジン、0.05M Tris−HCl（PH7.5）、2mM還
元型グルタチオン及び0.2mM酸化型グルタチオ
ンを含有する溶液５mlに希釈し、そして室温にて
一晩インキユベートした。次にこれを、10mM
Tris−HCl（PH7.4）及び0.4M NaClを含有する溶
液100倍容量に対して４℃にて４時間透析し、さ
らに10mM Tris−HCl（PH7.4）及び0.1M NaCl
を含有する溶液100倍容量に対して２時間透析し
た。こうして得られた粗抽出液を、抗ウロキナー
ゼモノクロナール抗体が結合したセフアロースカ
ラムによるアフイニテイークロマトグラフイーを
行なうことによつて変異体（pm3）プロウロキナ
ーゼを精製した。 実施例20 プロウロキナーゼ様ポリペプチドの発
現(4) 実施例12及び13によつて得たプラスミド
ptrpUK2＝（Q135D157）及びptrpUK2
（E135D157）を大腸菌W3110に慣用に従つて形質
転換し、得られた形質転換菌を５mlのＬ−ブロス
中で37℃にて培養し、550nmにおける吸光度が約
0.5になつたときIAA（インドール酢酸）を最終濃
度が50μg／mlになるように添加することによつ
て発現を誘導し、さらに３時間37℃にて培養する
ことによつてウロキナーゼ遺伝子を発現せしめ
た。 実施例21 大腸菌からの遺伝子産物の抽出精製及
びその性質(4) 上記の培養液のうち、ptrpUK2（Q135D157）
に由来するもの５mlを実施例19に記載したものと
同様の方法により抽出・精製し、変異体
（Q135D157）プロウロキナーゼ様ポリペプチド
を得た。その一部を以下のようにトリプシンで処
理した。サンプルの酵素活性を合成基質法にて測
定し、100IU／mlとなるように50mMトリス塩酸
緩衝液（PH7.4）、0.15M食塩及び0.1％TritonX−
100を含む溶液に希釈した。この溶液50μに対
して１mg／ml、２mg／ml及び３mg／mlのトリプシ
ン水溶液3μを加え、37℃で60分間インキユベ
ートした。次いで５mg／mlのダイズトリプシンイ
ンヒビター水溶液を5μ加えて反応を停止した。
対照としてトリプシンの代りに、水を加えたもの
を同様に処理した。 次いで、これらをレムリー等の方法に従つて、
0.1％SDSを含有する10％−26％ポリアクリルア
ミド連続濃度勾配ゲルにおいて、電気泳動した
後、ゲルを2.5％TritonX−100に浸して室温で小
一時間インキユベートし、フイブリン寒天プレー
ト上に重層して、37℃、２時間インキユベート
し、フイブリン寒天プレート上の溶解ゾーンの位
置から分子量を推定した。なお、比較のために、
実施例14によつて得られた培養液を実施例19に記
載したものと同様な方法により抽出・精製して得
た、天然型プロウロキナーゼ様ポリペプチド及び
変異体（Q135）プロウロキナーゼ様ポリペプチ
ドについても同様な処理を行つた。これらの結果
を第１６図に示す。この図において、レーン１，
２，３及び４はpMUP1に由来する天然型プロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドを、それぞれ０，１，
２及び３mg／mlのトリプシン水溶液を添加して処
理したものの泳動図である。レーン５，６，７及
び８はpMUP1pmに由来する変異体（Q135）プ
ロウロキナーゼ様ポリペプチドを同様にトリプシ
ン処理したものの泳動図である。レーン９，１
０，１１及び１２は、ptrpUK2（Q135D157）に
由来する変異体（Q135D157）プロウロキナーゼ
様ポリペプチドを同様にトリプシン処理したもの
の泳動図である。この図から明らかな通り、
pMUP1に由来する天然型プロウロキナーゼ様ポ
リペプチドの分子量は約５万であるが、トリプシ
ンにより、分子量３万に低分子化した。一方、
pMUP1pm及びptrpUK2（Q135D157）に由来す
る変異体プロウロキナーゼ様ポリペプチドはトリ
プシン処理によつて低分子化しなかつた。 実施例22 大腸菌からの遺伝子産物の抽出・精製
及びその性質(5) 実施例20によつて得られたウロキナーゼ遺伝子
産物を含む培養液を、それぞれ実施例19に記載し
たものと同様の方法により抽出・精製し、変異体
（Q135D157）プロウロキナーゼ様ポリペプチド
を得た。次いでヒト正常血漿に、変異体
（Q135D157）プロウロキナーゼ様ポリペプチド
（0.2mg／ml）を1/9体積加え、37℃でインキユベ
ートした。０，２及び５時間後にその一部をと
り、50倍希釈した。次いでその16μをレムリー
等の方法に従つて、0.1％SDSを含有する10％−
26％ポリアクリルアミド連続濃度勾配ゲルにおい
て、電気泳動した後、ゲルを2.5％TritonX−100
に浸して室温で小一時間インキユベートし、フイ
ブリン寒天プレート上に重層して、37℃、２時間
インキユベートし、フイブリン寒天プレート上の
溶解ゾーンの位置から分子量を推定した。なお、
比較のために、実施例14によつて得られた培養液
を実施例19に記載したものと同様な方法により抽
出・精製して得た、天然型プロウロキナーゼ様ポ
リペプチド及び変異体（Q135）プロウロキナー
ゼ様ポリペプチドについても同様な処理を行つ
た。これらの結果を第１８図に示す。この図にお
いて、レーン１，２および３はpMUP1に由来す
る天然型プロウロキナーゼ様ポリペプチドを、血
漿中でそれぞれ０，２及び５時間インキユベート
したものの泳動図である。レーン４，５及び６は
pMUP1pmに由来する変異体（Q135）プロウロ
キナーゼ様ポリペプチドを同様に処理したものの
泳動図である。また、レーン７，８及び９は、
ptrpUK2（Q135D157）に由来する変異体
（Q135D157）プロウロキナーゼ様ポリペプチド
を同様に処理したものの泳動図である。この図か
ら明らかな通り、天然型プロウロキナーゼ様ポリ
ペプチド及び変異体（Q135）プロウロキナーゼ
様ポリペプチドは、血漿成分と高分子複合体を形
成して、本来の50Kダルトこの位置の溶解ゾーン
が減少した。一方、変異体（Q135D157）プロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドは、血漿中において高
分子複合体を形成せず、溶解ゾーンの減少が見ら
れなかつた。 参考例11 プラスミドpYTU1の作成 工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌
寄第7776号（FERMPNo.7776）として寄託されて
いるエシエリシヤ・コリHB101／PHT3より慣
用の方法を用いてPHT3プラスミドを得た。 PHT3プラスミド5μg及びBamH115Uを緩衝液
（10mM Tris−Hcl PH8.0，7mM MgCl2，
100mM NaCl，2mMβ−メルカプトエタノール）
20μ中で３時間反応させた。エタノール沈澱
後、沈澱物を緩衝液（50mM Tris−HCl PH
7.2，10mM MgCl2，0.1mM DTT，80μM
dNTP）20μ中、Klenow断片１ユニツトと、
22℃で0.5時間反応させた。フエノール処理後、
エタノール沈澱を行つた。沈澱物を、緩衝液
（10mM Tris−HCl PH7.5，7mM MgCl260mM
NaCl，7mM β−メルカプトエタノール）20μ
中、Pvu20ユニツトと37℃で３時間反応させ
た。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（66mM
Tris−HCl PH7.6，6.6mM MgCl2，10mM
DTT，1mM ATP）20μ中，リガーゼ2.8ユニ
ツトと15℃で20時間反応させた。この反応物を用
いて、エシエリシヤ・コリHB101株を形質転換
させた。アンピシリン耐性形質転換株の中から、
第１８図に示すようなPHT31プラスミドをもつ
菌を単離した。単に、慣用の方法を用いて、
PHT31プラスミドを得た。 PHT31プラスミド10μgを緩衝液（10mM Tris
−HCl PH7.5，7mM MgCl2，60mM NaCl，
7mM β−メルカプトエタノール）20μ中、
Aat20ユニツトと37℃で３時間反応させた。エ
タノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（67mM Tris
−HCl PH8.8，6.7mM MgCl2，10mM β−メ
ルカプトエタノール，6.7mM EDTA，16.6mM
（NH4）2SO4，330μM dCTP）20μ中，T4DNA
ポリメラーゼ2.8ユニツトと37℃で15分間反応さ
せた。フエノール処理及びエタノール沈澱を行つ
た後、沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl PH
7.5，7mM MgCl2，150mM，NaCl，0.2mM
EDTA，7mMβ−メルカプトエタノール）20μ
中，SalI20ユニツトと37℃で３時間反応させた。
このDNA反応液を1.2％アガロースゲル電気泳動
にかけ、アンピシリン耐性遺伝子及び複製開始領
域を含む約3000塩基対のDNA断片を慣用手段に
より回収した。このDNA断片をDNA断片〔Ａ〕
とする。一方、PHT31プラスミド10μgを緩衝液
（100mM Tris−HCl PH7.5，7mM MgCl2，Mβ
−メルカプトエタノール）20μ中、EcoRI30ユ
ニツトと37℃で３時間反応させた。エタノール沈
澱後、沈澱物を緩衝液（67mM Tris−HCl PH
8.8，6.7mM MgCl2，10mM β−メルカプトエ
タノール、6.7mM EDTA，16.6mM（NH4）2
SO4，330μM dCTP）20μ中、T4DNAポリメ
ラーゼ2.8ユニツトと37℃で15分間反応させた。
フエノール処理及びエタノール沈澱を行つた後、
沈澱物を緩衝液（10mM Tris−HCl PH7.5，
7mM MgCl2，150mM NaCl2，0.2mMEDTA，
7mM β−メルカプトエタノール）20μ中、
SalI20ユニツトと37℃で３時間反応させた。この
DNA反応液を、1.2％アガロースゲル電気泳動に
かけ、cIts及びPLプロモーター・オペレーターを
含む約2100塩基対のDNA断片を回収した。この
DNA断片をDNA断片〔Ｂ〕とする。DNA断片
〔Ａ〕0.5μg及びDNA断片〔Ｂ〕0.5μgを緩衝液
（66mM Tris−HCl PH7.6，6.6mM MgCl2
10mM DTT，1mM ATP）20μ中、T4DNA
リガーゼ2.5ユニツトと15℃で15時間反応させた。
この反応液を用いて、エシエリシヤ・コリ
HB101株を形質転換し、アンピシリン耐性菌の
中から第１１図に示したpTYU1プラスミドをも
つコロニーをスクリーニングし、慣用手段により
プラスミドを単離した。 文 献 (1) M.サママ，M.カステル，O.マツオ，M.ホイ
ラエルツ及びH.R.リジネン（1982）トロンボ
ンシス・ヘモスタシス（Thromb.Haemostas）
47，36−40。 (2) E.ライヒ等、ジヤーナル・オフ・ビオロジカ
ル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）257，7262
−7268（1982）。 (3) S.S.フセイン、V.グレウヘイチ、B.リピンス
キースロンボシス・ヘモスタシス（Thromb.
haentostasis）46，11（1981）。 (4) V.グレウイツチ、R.パネル、S.リユイ、ジヤ
ーナル・オブ・クリニカル・インベスライゲー
シヨン（J.Clin.Invest.）73，1731−1739
（1984）。 (5) C.イラン、L.S.ホール、G.H.バーローI.I.Eト
リビー、バイオヒミカ・エ・バイオフイジカ・
アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）
496，384−400（1977）。 (6) G.H.パウロウ，ヨーロピアン・ウロキナー
ゼ・シンポジウム（Eur.Urokinase Symp.）
（1981）p1〜５。 (7) T.スヤマ等．，Med.Postgraduate，15，547
（1977）。 (8) G.J.ステフエンス等，ホツペーセイラース・
ジ・フイジオロジカル・ケミストリー
（Hoppe−Seyler′sZ.Physiol.Chem.），363，
1043（1982）。 (9) W.A.ギヤンツラー等，上記，1055（1982）。 (10) 特願昭59−97106明細書。 (11) J.M.チルグイン等，バイオケミストリー
（Biochemistry）18，5294（1979）。 (12) H.アビブ等，プロシーデイングス・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
シス・オブ・ザ・ユナイテツド・ステイツ
（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）69．1408
（1977）。 (13) T.マニアチス等，モレキユラ
ー・クローニング（Molecular Cloning）Cold
Spring Harbor Lab.，ニユーヨーク（1982），
254頁。 (14) H.C.ビルンボイム等，ニユクレイツク・ア
シズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.），７，
1513（1979）。 (15) M.グルンスタイン等，プロシーデイング
ス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテツド・
ステイツ（Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.），72，
3961（1975）。 (16) A.アキサム等，メンズ・イン・エンチモロ
ギー（Methods in Enzymology），65，499
（1980）。 (17) J.メツシング，ニユークレイツク・アシズ・
リサーチ（Nucleic Acids Res.），９，309
（1981）。 (18) K.L.アガーワル等，ジヤーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）
256，1023（1981）。 (19) A.G.ステクート等，ニユークレイツク・ア
シズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.），11，
6597（1983）。 (20) 特開，昭59−51300。 (21) T.イケムラ等，Cold Spring Harbor
Symp.Quart.Biol，47，1087（1983）。 (22) J.ブロウシウス等，プラスミド（Plasmid）
６，112（1981）。 (23) J.ブロウシウス，ジーン（Gene）27，151
（1984）。 (24) J.ブロウシウス，ジーン（Gene）27，161
（1984）。 (25) J.メツシング（1983），メンズ・イン・エン
チモロジー（Methods in Enzymology）101，
20−78。 (26) W.D.ベントン，R.W.デビス（1977），サイ
エンス（Science），196 180。 (27) 特願昭59−274478明細書。 (28) S.Mizusawa，et.at.，Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.80 358（1983）。 (29) ポール・ポーウエン・ハング特開昭56−
158799明細書。 (30) U.K.レムリー，ネイチヤー（Nature）
227，680（1980）。
第１図は本発明に関するプラスミドの系統図で
ある。第２図は、プラスミドpPE3の制限酵素地
図を示す。第３図は、プラスミドpPE3とプラス
ミドpKYU21からのプラスミドpKYU22の作製
を示す。第４−１図〜第４−３図は、ヒト−プロ
ウロキナーゼの全コード領域を含む天然mRNA
からのcDNAの塩基配列を示す。第５図は、プラ
スミドpKYU22と合成DNAオリゴマーからのプ
ラスミドpKMU1の作製を示す。第６図は、プラ
スミドpKMU1とプラスミドpTCM1からプラス
ミドpMUT4L等を作製する過程を示す。第７図
は、プラスミドpKYU22及びフアージ
M13pm8RFのDNAからの1200bp挿入部を有する
一本鎖フアージDNAの作製を示す。第８図はプ
ライマーを用いる135位のアミノ酸のコドンへの
点変異形成の方法を模式的に示す。第９図は、プ
ラスミドpYTU1及びpKMU1からのプラスミド
pMUP1の作製を示す。第１０図は、変異体フア
ージM13二本鎖DNA（pm1）及びプラスミド
pMUP1からのプラスミドpMUP1pmの作製を示
す。第１１図はプラスミドpSTN16及びpKK223
−３からのプラスミドpKKtrpの作製を示す。第
１２図はプラスミドpKKtrp及びpMUT4Lpmlか
らのプラスミドptrPUK2の作製を示す。第１３
図、第１４図、及び第１６は、大腸菌で発現され
たウロキナーゼのフイブリンオートグラフイーを
示す。第１５図は天然型プロウロキナーゼと本発
明の変異体（pm3）プロウロキナーゼとをプラス
ミンによる活性化について比較したグラフであ
る。第１７図はプラスミドpHT3からのプラスミ
ドpYTU1の作製を示す。第１８図は、本発明の
プロウロキナーゼ様ポリペプチドとヒト正常血漿
成分との複合体の形成を示す電気泳動図であつ
て、フイブリン寒天上での溶解ゾーンを示すもの
である。
ある。第２図は、プラスミドpPE3の制限酵素地
図を示す。第３図は、プラスミドpPE3とプラス
ミドpKYU21からのプラスミドpKYU22の作製
を示す。第４−１図〜第４−３図は、ヒト−プロ
ウロキナーゼの全コード領域を含む天然mRNA
からのcDNAの塩基配列を示す。第５図は、プラ
スミドpKYU22と合成DNAオリゴマーからのプ
ラスミドpKMU1の作製を示す。第６図は、プラ
スミドpKMU1とプラスミドpTCM1からプラス
ミドpMUT4L等を作製する過程を示す。第７図
は、プラスミドpKYU22及びフアージ
M13pm8RFのDNAからの1200bp挿入部を有する
一本鎖フアージDNAの作製を示す。第８図はプ
ライマーを用いる135位のアミノ酸のコドンへの
点変異形成の方法を模式的に示す。第９図は、プ
ラスミドpYTU1及びpKMU1からのプラスミド
pMUP1の作製を示す。第１０図は、変異体フア
ージM13二本鎖DNA（pm1）及びプラスミド
pMUP1からのプラスミドpMUP1pmの作製を示
す。第１１図はプラスミドpSTN16及びpKK223
−３からのプラスミドpKKtrpの作製を示す。第
１２図はプラスミドpKKtrp及びpMUT4Lpmlか
らのプラスミドptrPUK2の作製を示す。第１３
図、第１４図、及び第１６は、大腸菌で発現され
たウロキナーゼのフイブリンオートグラフイーを
示す。第１５図は天然型プロウロキナーゼと本発
明の変異体（pm3）プロウロキナーゼとをプラス
ミンによる活性化について比較したグラフであ
る。第１７図はプラスミドpHT3からのプラスミ
ドpYTU1の作製を示す。第１８図は、本発明の
プロウロキナーゼ様ポリペプチドとヒト正常血漿
成分との複合体の形成を示す電気泳動図であつ
て、フイブリン寒天上での溶解ゾーンを示すもの
である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の一般式； （Met）−１ Ser −135 Ｘ −157 Ｙ − （式中、Metは場合によつては存在するメチオ
ニンであり、SerはＮ−末端の１位に存在するセ
リンであり、Ｘは135位に存在するリジン、又は
塩基性アミノ酸以外のアミノ酸であり、Ｙは157
位に存在するフエニルアラニン又は酸性アミノ酸
であり、そして横線部分は天然ヒト−プロウロキ
ナーゼのアミノ酸配列の対応する部分と同一のア
ミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジンである場
合にはＹはフエニルアラニンではない、）で表わ
されるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のア
ミノ酸配列を有する安定化されたヒト−プロウロ
キナーゼ様ポリペプチド。 ２ 前記Ｘがアラニン、アスパラギン、アスパラ
ギン酸、グルタミン、グルタミン酸、フエニルア
ラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メ
チオニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプ
トフアン、チロシン及びプロリンから成る群から
選択される天然アミノ酸である特許請求の範囲第
１項記載のポリペプチド。 ３ 前記Ｘがアスパラギン及びグルタミンから成
る群から選択される酸性アミノ酸のアミドである
特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ４ 前記Ｘがセリン及びスレオニンから成る群か
ら選択されるヒドロキシアミノ酸である特許請求
の範囲第１項記載のポリペプチド。 ５ 前記Ｘがグルタミン酸及びアスパラギン酸か
ら成る群から選択される酸性アミノ酸である特許
請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ６ 前記Ｘがイソロイシン、ロイシン及びバリン
から成る群から選択される分枝鎖中性アミノ酸で
ある特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ７ 前記Ｙがアスパラギン酸又はグルタミン酸で
ある特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ８ 前記Ｘがグルタミンであり、そして前記Ｙが
フエニルアラニンである特許請求の範囲第１項記
載のポリペプチド。 ９ 前記Ｘがスレオニンであり、そして前記Ｙが
フエニルアラニンである特許請求の範囲第１項記
載のポリペプチド。 １０ 前記Ｘがグルタミン酸であり、そして前記
Ｙがフエニルアラニンである特許請求の範囲第１
項記載のポリペプチド。 １１ 前記Ｘがイソロイシンであり、そして前記
Ｙがフエニルアラニンである特許請求の範囲第１
項記載のポリペプチド。 １２ 前記Ｘがリジンであり、そして前記Ｙがア
スパラギン酸である特許請求の範囲第１項記載の
ポリペプチド。 １３ Ｘがグルタミン酸であり、そしてＹがアス
パラギン酸である特許請求の範囲第１項に記載の
ポリペプチド。 １４ Ｘがグルタミンであり、そしてＹがアスパ
ラギン酸である特許請求の範囲第１項に記載のポ
リペプチド。 １５ 前記天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ
酸配列がヒト−腎臓由来のmRNAに対応する
cDNAによりコードされているアミノ酸配列であ
る特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 １６ 次の一般式： （Met）−１ Ser −135 Ｘ −157 Ｙ − （式中、Metは場合によつては存在するメチオ
ニンであり、SerはＮ−末端の１位に存在するセ
リンであり、Ｘは135位に存在するリジン、又は
塩基性アミノ酸以外のアミノ酸であり、Ｙは157
位に存在するフエニルアラニン又は酸性アミノ酸
であり、そして横線部分は天然ヒト−プロウロキ
ナーゼのアミノ酸配列の対応する部分と同一のア
ミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジンである場
合にはＹはフエニルアラニンではない、）で表わ
されるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のア
ミノ酸配列を有するヒト−プロウロキナーゼ様ポ
リペプチドの製造方法であつて、該プロウロキナ
ーゼ様ポリペプチドをコードするコードDNAセ
グメント、該プロウロキナーゼ様ポリペプチドを
大腸菌中で発現せしめるのに必要な発現制御領域
及び大腸菌中で複製するために必要な領域を含有
するプラスミドにより形質転換された大腸菌を培
養し、培養菌体からプロウロキナーゼ様ポリペプ
チドを採取することを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60-11033 | 1985-01-25 | ||
| JP1103385 | 1985-01-25 | ||
| JP60-83611 | 1985-04-20 | ||
| JP60-159294 | 1985-07-20 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62143686A JPS62143686A (ja) | 1987-06-26 |
| JPH0552189B2 true JPH0552189B2 (ja) | 1993-08-04 |
Family
ID=11766754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61012984A Granted JPS62143686A (ja) | 1985-01-25 | 1986-01-25 | 安定化されたヒト−プロウロキナ−ゼ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62143686A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989001513A1 (en) * | 1987-08-19 | 1989-02-23 | Sagami Chemical Research Center | Fast-acting prourokinase |
| EP4129334A4 (en) * | 2020-03-31 | 2024-06-12 | National Cancer Center | FUSION PROTEIN FOR DISOLVING A FIBRIN CLOT AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SAID FUSION PROTEIN |
-
1986
- 1986-01-25 JP JP61012984A patent/JPS62143686A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62143686A (ja) | 1987-06-26 |
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