JPS62143686A - 安定化されたヒト−プロウロキナ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は安定化されたしトープロウロキナーゼ様ポリペ
プチド、ヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡセグメント、・該ＤＮＡセグメントを含有
するプラスミド、該プラスミドを含有する大腸菌、及び
この大腸菌を用いるヒト−プロウロキナーゼ様ポリペブ
チ１′の製造方法に関する。

本発明の安定化されたヒト−プロウロキナーゼは各種の
蛋白質分解酵素に対して安定であり、このため、これを
高収率且つ高純度で製造することができる。また、これ
らがヒトや動物に投与された場合、生体内で酵素により
加水分解されにくいから、それによってもたらされる薬
効が長時間持続することが期待される。

他方、本発明の、ヒトープロウロキナーゼ様ボリペブチ
ドをコードするＤＮＡセグメン１〜を含有する遺伝子系
を用る場合、該ポリペプチドが効率よく発現され、従っ
て、該ポリペプチドが経済的に有利に製造される。

〔従来の技術〕

ヒト−ウロキナーゼは人尿中に微量に存在する酵素であ
り、不活性のプラスミノーゲンをプラスミンに活性化す
る作用を有し、生成したプラスミンはフィブリンを溶解
することができる。このウロキナーゼはジスルフィド結
合により連結された２木のポリペプチド鎖からなる。こ
れに対してヒト−プロウロキナーゼは前記の２木のポリ
ペプチド鎖がアミド結合によって連結された１本鎖ポリ
ペプチドであり、このプロウロキナーゼ自体は前記の活
性を有しないが、１個のアミド結合が切断されることに
より、活性を有する前記のウロキナーゼに転換される。

ウロキナーゼは、成熟ウロキナーゼとも称される。

ヒト−ウロキナーゼは前記の作用を有するため、血栓溶
解治療薬として使用されでいる。ヒト−ウロキナーゼは
静脈注射薬として用いられるところから高度な精製品が
要求されるが、一般にウロキナーゼは不安定な酵素であ
り精製工程で分解されやすいといわれている。例えば人
尿より製造されたウロキナーゼは分子量約５４，０００
の高分子ウロキナーゼと分子量が約３３，０００の低分
子ウロキナーゼから成り、この低分子ウロキナーゼは高
分子ウロキナーゼがプロテアーゼによって切断されて生
ずる。この切断部位は成熟高分子ウロキナーゼのＮ末端
のセリンから１３５番目と１３６番目の２個のりジン残
基間のペプチド結合であることが示唆されている。この
ような切断は、人尿からのウロキナーゼの精製過程にお
いてのみならず、ＤＮＡ組換技法によって産生されたプ
ロウ１１−１−ナービの精製過程においても同様に生し
、さらにはプロウロキナーゼを静脈注射した場合にも血
漿中に含まれるトリプシン様プロテアーゼによって生ず
ると予想される。

しかしながら、生体内でのフィブリンの溶解に際しては
高分子ウロキナーゼの方が低分子ウロキナーゼよりも効
果的であると考えられる（文献１）。

従って、天然ヒト高分子ウロキナーゼと同様の活性を有
し且つプロテアーゼによって分解されにくい安定化され
たウロキナーゼをもたらす安定化されたプロウロキナー
ゼ及びその製造方法が強く求められている。しかしなが
ら、アミノ酸を変換することによるこのような安定化さ
れたプロウロキナーゼ及びその製造方法は知られていな
い。

ヒト−プロウロキナーゼは、分子量約５４０００の１本
鎖構造のポリペプチドとして単離された（文献２．３）
。ブレピッチ等は、このプロウロキナーゼが体内に投与
されてウロキナーゼに転換された場合には、ウロキナー
ゼが直接投与された場合に比べて血栓溶解活性が強く、
また副作用であるフィブリノーゲン分解性の少ないこと
を報告しており（文献４）新しい血栓溶解剤としての可
能性を示唆している。プロウロキナーゼが投与された場
合、この活性化は血栓の存在する局所において血栓に吸
着している少量のプラスミンによってなされるために、
言い換えるとプロウロキナーゼは血栓特異的に活性化さ
れるため血中の阻害剤の影響を受けにくく、また副作用
も少ないと考えられている。

ところがこの活性化は非常に起こり易く、プロウロキナ
ーゼが一旦ウロキナーゼに活性化されれば、自らの酵素
活性によりその分解が急速に進行する。この結果、生体
内においては血栓熔解活性が長時間持続することができ
ない。また、前記の活性化がプロウロキナーゼの製造過
程で生じた場合、プロウロキナーゼが高分子ウロキナー
ゼに分解され、これがさらに低分子ウロキナーゼに分解
されて製品中の低分子ウロキナーゼの含量が増加する（
文献５）。

従って、比較的活性化されにくく、そしてそれ故に前記
のごとき天然ヒト−プロウロキナーゼが存する欠点を有
しない新しいタイプのヒト−プロウロキナーゼが求めら
れている。しかしながら、そのような改良されたヒト−
プロウロキナーゼは知られていない。

ところで、従来、ウロキナーゼは人尿から抽出精製する
ことによって製造れている。しかしながら、この方法に
おいては原料である人尿の安定供給に問題があり必ずし
も工業的に優れた方法とは言い難い。一方、最近ではヒ
ト腎細胞を分離、継代培養してウロキナーゼを製造する
方法が開発されている（文献２９）。しかしながらこの
組織培養法においては、治療薬として有効な高分子ウロ
キナーゼの産生が代を経るに従って減少し、低分子ウロ
キナーゼの産生が増加することが報告されており（文献
６）、実用的なウロキナーゼの製造方法としては必ずし
も理想的とは言えない。

特開昭５９−５１３００には遺伝子工学的手法によるウ
ロキナーゼの製造方法が開示されている。しかしながら
ウロキナーゼの発現が具体的に確認されている方法は、
ウロキナーゼをコードする遺伝子をｔｒｐＥ遺伝子と連
結してｔｒｐｎとウロキナーゼの融合蛋白質を発現せし
め、これを切断して低分子ウロキナーゼを得る方法であ
って、プロウロキナーゼの直接発現は確認されていない
。また、前記融合蛋白質の発現量は示されていない。

以上のように、プロウｒ：Ｉギナーゼを効果的に発現さ
せ、これを経済的に製造する方法は知られでいない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、この発明は、生体外及び生体内において種々の
酵素により分解され運り、そのために高純度の製品とし
て容易に製造することができ、そして生体内に投与され
た場合に面枠に対してより特異性が高く、且つ血栓溶解
についての改良された持続性をもたらす安定化されたヒ
ト−プロウロキナーゼ様ポリペプチド、該ポリペプチド
を製造するための遺伝子系、及びこの遺伝子系を用いる
該ポリペプチドの製造方法を提供するものである。

〔問題点を解決するための手段〕

従って、この発明は、次の式： （式中、Ｍ　ｅ　ｔは場合によっては存在するメチオニ
ンであり、ＳｅｔはＮ−末端の１位に存在するセリンで
あり、Ｘは１３５位に存在するリジン、又は塩基性アミ
ノ酸以外のアミノ酸であり、Ｙは１５７位に存在するフ
ェニルアラニン又は酸性アミノ酸であり、そして実線部
分は天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列の対応
する部分と同一のアミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリ
ジンである場合にはＹはフェニルアラニンではない、）
で表わされるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のア
ミノ酸配列を有する安定化されたヒト−プロウロキナー
ゼ様ポリペプチドを提供する。

この発明はまた、前記の安定化されたヒト−プロウロキ
ナーゼ様ポリペプチドをコードする、大腸菌において効
率的に発現するＤＮＡを提供する。

この発明はさらに、前記のＤＮＡ、前記プロウロキナー
ゼ様ポリペプチドの発現のための制御領域、及び大腸菌
中で複製するのに必要なりＮＡ配列を含有するプラスミ
ドを提供する。

この発明はさらに、前記のプラスミドにより形質転換さ
れた大腸菌を提供する。

この発明はさらに、前記大腸菌を用いる前記ヒト−プロ
ウロキナーゼ様ポリペプチドの製造方法を提供する。

〔具体的な説明〕

Ａ、Ｓ′定化されたヒト−プロウロキナーゼ　ポリペプ
チド この発明の安定化されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリ
ペプチドは、次の式： （式中、Ｍｅｔは場合によっては存在するメチオニンで
あり、ＳｅｔはＮ−末端の１位に存在するセリンであり
、Ｘは１３５位に存在するリジン、又は塩基性アミノ酸
以外のアミノ酸であり、Ｙは１５７位に存在するフェニ
ルアラニン又は酸性アミノ酸であり、そして横線部分は
天然ヒ１−ブロウロ４−ナーゼのアミノ酸配列の対応す
る部分と同一のアミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジ
ンである場合にはＹはフェニルアラニンではない、）で
表わされるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のアミ
ノ酸配列を有する。

ウロキナーゼは４１０個のアミノ酸からなる蛋白質であ
りそのアミノ酸配列はすでに知られている（文献８およ
び９）。つ１７キナーゼのプラスミノーゲンアクチヘー
ター活性はそのＣ−末端側の２７５個の７ミノ酸からな
るペプチド部分によりもたらされることが知られている
が、この部分のみから成るペプチドはプラスミノーゲン
に対する親和性が低いことが指摘されている（文献７）
。前記の活性部分のみから成るペプチドは低分子ウロキ
ナーゼと称され、他方、アミノ酸４１０個から成るウロ
キナーゼは高分子ウロキナーゼと称される。

前記のごとく、低分子ウロキナーゼは、プラスミノーゲ
ンとの親和性が低いと考えられるため、高分子ウロキナ
ーゼの含有率が高いウロキナーゼ製品が強く求められて
いる。

従、って、ウロキナーゼの前駆体であるプロウロキナー
ゼについても、低分子化しにくいものが好ましい。本発
明者等は、プロウロキナーゼのＮ−末端のセリンを１位
として１３５位に位置するリジンを、塩基性アミノ酸以
外のアミノ酸に変えることによって、１３５位と１３６
位の２個のリジン間の切断（ウロキナーゼにおける高分
子ウロキナーゼから低分子ウロキナーゼへの変化に相当
する）が生じ難くなり、しかもその、Ｌうにアミノ酸が
置き換えられた変形されたポリペプチドが、天然プロウ
ロキナーゼと同様の生理的性質（活性化されてウロキナ
ーゼが活性を示す性質）を有するという驚くべき事実を
見出した。

本発明の安定化されたプロウロキナーゼ様ポリペプチド
は、前記の一般式において、Ｘはリジンか、又は塩基性
アミノ酸以外のアミノ酸のいずれかであるが、Ｘがリジ
ンである場合には、後で詳細に説明するように、Ｙはフ
ェニルアラニンではない。Ｘの塩基性アミノ酸以外のア
ミノ酸としては、目的ポリペプチドの生理学的性質に不
都合な影響を与えない中性アミノ酸又は酸性アミノ酸で
あれば何でもよく、例えばアラニン、アスパラギン、ア
スパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、フェニルア
ラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニ
ン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チ
ロシン、プロリン等を挙げることができ、具体例として
例えば、酸性アミノ酸のアミドであるアスパラギン又は
グルタミン；ヒドロキシアミノ酸であるセリン又はスレ
オニン；酸性アミノ酸であるグルタミン酸又はアスパラ
ギン酸；分枝鎖中性アミノ酸であるイソロイシン、ロイ
シン又はバリン等に分けることができる。本発明者等は
ヒト−プロウロキナーゼの１３５位のリジンを実際にグ
ルタミン、スレオニン、グルタミン酸、又はイソロイシ
ンのいずれかで置き換えたペプチドを調製し、それらの
１３５〜１３６位間の切断に対する抵抗性及び生理的活
性を調べたところ、いずれのポリペプチドも１３５−１
３６位間の切断に対する高い耐性を有し、しかも天然プ
ロウロキナーゼの生理学的性質を保持していることが確
認された。この事実から、１３５位のリジンが塩基性ア
ミノ酸以外のアミノ酸により置換されたブロウロキ（２
Ｊ） ナーゼは、２個の塩基性アミノ酸を認識して該２個の塩
基性アミノ酸間の結合を切断する各種のプロテアーゼに
対して安定化されたこと、及びウロキナーゼ活性のため
に１３５位のアミノ酸は必ずしもリジンである必要はな
いことが合理的に結論される。

プロウロキナーゼは、Ｎ−末端のセリンを１位として１
５８番目のリジンと１５９番目のイソロイシンの間のペ
プチド結合がプラスミン、トリプシン等のプロテアーゼ
により切断されることにより、ウロキナーゼに活性化さ
れる。そして一旦活性化されれば、ウロキナーゼは自ら
の蛋白質分解活性により分解され低分子化され、活性を
失う。従って、生体内において持続的なウロキナーゼ活
性を得るには、前記の切断を抑制することが望ましい。

他方、１５６位のフルギニンと１５７位のフェニルアラ
ニンとの間のペプチド結合はトロンビン等により切断さ
れ、この切断はウロキナーゼ活性を低下せしめる。

本発明者等は１５７位のフェニルアラニンを酸性アミノ
酸であるアスパラギン酸又はグルタミン酸で置き換える
ことによって、トロンビン等による前記の切断が抑制さ
れ、しかもこのような置換によって天然プロウロキナー
ゼの生理的性質がなんら失われないという驚くべき事実
を見出した。この事実は、この切断に関与するプラスミ
ン、トリプシンなどのプロテアーゼは１５８番目のりジ
ン残基側鎖の陽電荷を認識しており、この近傍のアミノ
酸たとえば１５７番目のフェニルアラニンの代わりに側
鎖に負電荷をもつ酸性アミノ酸を導入することによって
プロテアーゼの認識を抑制することにより、切断速度を
低下せしめることができると考えることにより合理的に
説明することができる。

本発明においては、前記Ｘ及びＹの組合わせの具体例と
して次のようなポリペプチドを調製した。

記−号　　　　−×−Ｎ− １ｐｍ　　　　　Ｇｉｎ　　　Ｐｈｇ ｐｍ２　　　　　Ｔ　ｈ　ｒ　　　Ｐ　ｈ　ｅＥ１３５
　　　　　　　Ｇｌｕ　　　　　Ｐｈｅ１１３５　　　
　　　　　Ｔ　　Ｉ　　ｅ　　　　　Ｐ　ｈ　　ｅｐｍ
３　　　　　　　　Ｌｙｓ　　　　ＡｓｐＱ１３５Ｄ１
５７　　　Ｇ　１　ｎ　　　Ａ　ｓ　ｐＥ１３５Ｄ１５
７　　　　Ｇ　ｌ　　ｕ　　　　Ａ　ｓ　ｐ上記の各種
のポリペプチドを、後で詳細に記載するように、Ｘにお
ける置換の効果についてはトリプシンに対する感受性に
より、そしてＹにおける置換の効果についてはプラスミ
ンに対する感受性、及びトロンビンに対する感受性によ
り調べた。

この結果、前記の置換はいずれも目的とする安定化効果
をもたらし、しかもこれらの置換によって天然プロウロ
キナーゼ本来の４１ミ理的性質が失われないことが確認
された。従って、これらの事実は、前記の推定される安
定化機構と相まって、前に定義したＸとＹのすべての組
合わせからなるポリペプチドは本発明の安定化効果を発
揮するものと、合理的に推定させる。従って、前に定義
したＸとＹの組合わせからなるプロウロキナーゼ様ポリ
ペプチドはすべて本発明の範囲に属する。

前記一般式中の横線で示されるアミノ酸配列は、天然の
ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列の対応する部分
と同一である。天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸
配列として、ヒト−腎臓由来のｍＲＮＡに対応するｃＤ
ＮＡによりコードされている、アミノ酸４１１個から成
る配列を挙げることができる。このアミノ酸配列は第４
−１図〜第４−３図にアルファベントの大文字３文字か
らなるアミノ酸記号により示されている。

前記一般式中、（Ｍｅｔ）−は、プロウロキナーゼのＮ
−末端の１位のＳｅｔに隣接してそのＮ末端側に存在す
る場合があるメチオニンを示す。後に詳細に記載するこ
の発明の製造方法によれば、Ｎ末端に翻訳開始コドンに
由来するメチオニンを有するポリペプチドが発現される
が、このメチオニンが大腸菌の細胞内の酵素により除去
されることによってＮ末端にメチオニンが付加されてい
ないポリペプチドが得られることがある。従って、本発
明はこのメチオニンを有するポリペプチド及び有しない
ポリペプチドの両者を包含する。

本発明の安定化されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリペ
プチドは、」−に詳細に記載したアミノ酸配列を有する
ポリペプチドのほかに、これと実質上同じアミノ酸配列
を有するポリペプチドを包含する。ここで、“実質上同
じアミノ酸配列”とは、上記のアミノ酸配列中のＸ及び
Ｙ以外の少数個のアミノ酸が他のアミノ酸によって置き
換えられており、又は除去されており、あるいは」１記
のアミノ酸配列に少数個のアミノ酸が（＝Ｊ加されでい
るが、しかしなおブローウロキナーゼの生理的性質及び
本発明の特徴である安定性をもたらすアミノ酸配列を意
味する。特定の生理活性を有するポリペプチド中の該生
理活性に関与しない領域においてアミノ酸配列に変更を
加えても、該生理活性が影響を受けない場合があること
は、当業者により良く知られている。従って、そのよう
な変更を含むポリペプチドも、本発明の特徴を保持して
いる限り本発明の範囲に属するものである。

Ｂ、ヒトーブロウロキ　−ゼの゛　云　ムこの発明はさ
らに、安定化されたヒト−プロウロキナーゼを製造する
ために有用な遺伝子系に関する。ここで、遺伝子系とは
、目的とするヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドを
コードするＤＮＡセグメント、このＤＮＡセグメントを
含有するプラスミド、及びこのプラスミドが導入された
宿主を包含する。

本発明の代表的なりＮＡには、Ｎ−末端の複数個のアミ
ノ酸をコードするコドンが大腸菌中で高頻度で使用され
るコドンであり、そして前記Ｎ−末端の複数個のアミノ
酸並びに前記Ｘ及びＹをコードするコドン以外のコドン
がヒト腎臓由来のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ中の対応
するアミノ酸のコドンと同一であるＩ）ＮＡが包含され
る。

ヒト−プロウロキナーゼのごとき多数のアミノ酸からな
る蛋白質をコードする遺伝子としては、その蛋白質を天
然に産生ずる生物細胞すなわちヒト細胞由来のＤＮＡセ
グメント、例えばブローウロキナーゼをコードするｍ−
ＲＮＡに対して得られたｃＤＮＡを用いるのが便利であ
り、このような高分子蛋白質をコードするＤＮＡを合成
することは不可能ではないが、多大の努力を必要とする
。

他方、大腸菌中で蛋白質を効果的に発現せしめるには大
腸菌において高頻度で使用されているコドンから成る遺
伝子を使用するのが好ましいと考えられるが、ヒト由来
のｃＤＮＡにおいてはこのような条件は十分に満足され
ず、このような条件を満足させるＤＮＡを得るには化学
合成に頼らざるを得ない。

本発明者等は、ヒト−プロウロキナーゼをコードする遺
伝子として主としてヒト由来のｃ　ＤＮＡを用い、この
ｃＤＮＡの内ブローウロキナーゼのＮ端の少数個のアミ
ノ酸をコードするコドンのみを、大腸菌において高頻度
で使用されているコドンからなる合成りＮＡＴ：置き換
えることによって、大腸菌中で効果的に発現される遺伝
子が得られる。

前記の合成りＮＡ部分のコドンの選択に当ってはさらに
、天然型ウロキナーゼ遺伝子（ｃＤＮＡ）の１６塩基の
逆向き操り返し配列を消失せしめることによってｍ　Ｒ
Ｎへの折りたため構造の形成を防止し、さらに、ｍ　Ｒ
Ｎへのｔノヘルにおいて、本発明の発現プラスミドの好
ましい具体例において（２Ｂ） 使用されるメタビロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）のＳ
Ｄ配列付近の塩基配列と、ヒト−プロウロキナーゼ遺伝
子の５′端の塩基配列との相補的構造を消失せしめてこ
れら相補的会合を防止するように選択するのが好ましい
。さらに、翻訳開始コドンＡＴＧの次の塩基がＡとなる
ように第１位のアミノ酸であるセリンのコドンを選択す
るのが好ましい。

この発明の好ましい態様においては、上記のように設計
されたコード領域のＮ末端アミノ酸であるセリンのコド
ンに隣接してその上流にメチオニンをコードする翻訳開
始コドンＡＴＧを設けることによって、高分子ウロキナ
ーゼの直接発現を可能にする。さらに、この発明の好ま
しい態様においては、このコード領域のＩ）ＮＡを発現
ベクターに挿入した場合に、この発明の好ましい発現ベ
クターにおいて使用されるメタビロ力テカーゼ遺伝子の
ＳＤ配列と挿入されたプロウロキナーゼ遺伝子のＡＴＧ
間の距離及び構造が、天然のメタピロ力テカーゼ遺伝子
におけるそれと同一になるように、前記ＡＴＧに隣接し
てその上流に制限酸素Ａ１■の確認配列、 ５′　　　　　　Ｃ（八ＴＧ）３　’ ３　’　　ＴＧＣＡＧ（ＴＡＣ）５　。

を設ける。

従って、この発明の最も好ましい態様においては、ヒト
−プロウロキナーゼをコードするｃＤＮＡＯ内、ヒト−
プロウロキナーゼのＮ端の６個のアミノ酸をコードする
ＤＮＡ配列及びその上流が第１図に示すように変えられ
、その他のコード領域においてはｃＤＮＡのＤＮＡ配列
（該当する場合にはアミノ酸Ｘ又はＹをコードするため
の変異を含む）が使用される。なお、この領域中には、
組換体のスクリーニング及び他のＤＮＡ配列への置換を
可能にするため制限酵素部位主１丁が設けられている。

第５図には、変形された本発明の塩基配列の１例が示さ
れている。この塩基配列においては、アスパラギン、グ
ルタミン酸、ロイシン、ヒスチジン、グルタミン及びプ
ロリンのコドンとして大腸菌において高頻度で使用され
るコドンか使用されている。さらに、この塩基配列にお
いては、ヒト−プロウロキナーゼの直接発現を可能にす
るため、天然ｃＤＮＡに存在するリーダー配列が除去さ
れ、それに代えて、ヒト−プロウロキナーゼの第１アミ
ノ酸であるセリンのコドンに隣接してその一ヒ流にメチ
オニンをコードする翻訳開始コドンＡＴＧが設けられて
おり、さらに発現プラスミドへの挿入を可能にするため
にＡａｔ１１部位が設けられている。

一般式中、Ｘが塩基性アミノ酸以外のアミノ酸である場
合には、Ｘがリジンである場合のｃＤＮＡのコドンに代
えて目的とする塩基性アミノ酸以外のアミノ酸をコード
するコドンを用いなければならない。１３５番目のリジ
ンのコドンに代るコドンとしては該当するアミノ酸をコ
ードし大腸菌中で容易に発現され得るものであれば何で
もよいが、例えば１３５番目のアミノ酸としてグルタミ
ンを用いる場合には、ＣＡＡからなるコドンを用いるの
が好ましく、スレオニンを用いる場合にはＡＣＡが好ま
しい。さらに、各アミノ酸について例えば次のようなコ
ドンを用いることができる。

１３５　　目のアミノ　　　　　　　コドンアラニン　
　　　　　　　　　　ＯＣＡアスパラギン　　　　　　
　　　ＡＡＣアスパラギン＃　　　　　　　　ＧＡＣグ
ルタミン酸　　　　　　　　　　ＧＡＡフェニルアラニ
ン　　　　　　　ＴＴＣグリシン　　　　　　　　　　
　ＧＧＴイソロイシン　　　　　　　　　ＡＴＣロイシ
ン　　　　　　　　　　　ＣＴＧメチオニン　　　　　
　　　　　ＡＴＧセリン　　　　　　　　　　　ＡＧＣ バリン　　　　　　　　　　　ＧＴＡ トリプトファン　　　　　　　　　ＴＧＧチロシン　　
　　　　　　　　　ＴＡＣプロリン　　　　　　　　　
　　　ＣＣＧ一般式中、Ｙが酸性アミノ酸である場合に
は、Ｙがフェニルアラニンである場合のｃ　ＤＮＡのコ
トンに代えて酸性アミノ酸をコードするコドンを用いな
ければならない。１５７番目のフェニルアラニンのコド
ンに代わるコドンとしては該当するアミノ酸をコードし
大腸菌中で容易に発現され得るものであれば何でもよい
が、例えば１５７番目のアミノ酸としてアスパラギン酸
を用いる場合には、ＧＡＴからなるコドンを用いるのが
好ましく、グルタミン酸を用いる場合にはＧＡＡが好ま
しい。

（２）　　プラスミド この発明のヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドを発
現せしめるためには、動物細胞中で機能するヘクターを
用いてもよいが、前記コード領域と共に前記遺伝子を、
微生物、特に大腸菌中で発現せしめるために必要な発現
制御領域及び大腸菌中で複製するために必要な領域を含
んで成るプラスミドを用いるのが好ましい。発現制御領
域としては大腸菌中で外来性遺伝子を発現するために有
用な任意の系を用いることができ、例えば、ｔａｃ　　
、　ＰＬ　　、　１ａｃＵＶ５．　ＰＲ、ｔｒｐ　　＋
　Ｉｐｐ等のプロモーター／オペレーター系を使用する
。特に、ｔａｃプロモーター／オペレーター系、ＰＬプ
ロモーター／オペレーター系及びｔｒｐプロモーター／
オペレーター系が好ましい。またＳＤ配列としては、例
えば、メタピロカテカーゼ遺伝子のＳＤ配列（Ｃ２３０
ＳＤ）　（文献１０）　、１ａｃＳＤ等を使用すること
ができる。

本発明のポリペプチドを発現することができるプラスミ
ドとして、例えば次のものを挙げ、ることができる。

ブースミ゛の　、　　　　ｘ　　　　　ｙｐＭＵＰｌｐ
ｍ　　　　　　　　Ｇｌ　ｎ　　　　　ＰｈｅｐＭＵＴ
４Ｌｐｍ２　　　　　　　Ｔｈｒ　　　　　Ｐｈｅｐｔ
ｒｐＵＫ２（Ｅ１３５）　　　　　Ｇｌｕ　　　　　Ｐ
ｈｅｐｔｒｐＵＫ２（１１３５）　　　　　ｌｉｅ　　
　　　ＰｈｅｐＭＵＴ４Ｌｐｍ３　　　　　　　　　　
　　　　Ｌｙｓ　　　　　　　　　ＡｓｐｐｔｒｐＨＭ
２（Ｑ１３５Ｄ１５７）　　　　　　Ｇｉｎ　　　　　
　　　　ＡｓｐｐｔｒｐＬＩＫ２（Ｅ１３５Ｄ１５７）
　　　Ｇｌｕ　　　　　＾５ｐ（３）　　ブースミ・く
・　　　る 前記のプラスミドが導入される宿主としては、動物細胞
、微生物、例えば細菌、酵母等を使用することができる
が、細菌、特に大腸菌を使用するのが好ましい。

本発明の宿主大腸菌としては、腸管寄生性のない無毒大
腸菌株、例えばニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏ土ｉ）　Ｋ−１２株に由来する任意の菌株
を使用することができ、例えばＪＭ８３　、　ＪＭ１０
３　　。

ＪＭ１０５　　、ＲＢ７９１　．５Ｍ３２．Ｎ９９　　
、ＲＲｌ　　、匈３１１０　　。

χ１７７６等を使用することができる。

Ｃ１遺伝子系の作製 この発明に係る遺伝子の作製方法の１例は次の段階すな
わち、 ＋１１　　ヒト−プロウロキナーゼを完全にコードする
ＤＮＡ断片を調製する段階； （２）前記ヒト−プロウロキナーゼのポリペプチドの１
３５番目のアスパラギン酸をコードするコドンに変化を
生じさせ、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸をコードする
コドンに転換する段階；（３）前記ヒト−プロウロキナ
ーゼのポリペプチドの１５７番目のアミノ酸をコードす
るコドンに変化を生じさせ、酸性アミノ酸をコードする
コドンに転換する段階； （４）前記（］）、（２）及び（３）により調製したい
ずれか２種類のＤＮＡ断片を連結して目的とする安定化
されたヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドをコード
するＤＮＡ断片を調製する段階；及び、（５）前記ポリ
ペプチドのＮ端の少数個のアミノ酸をコードする前記Ｄ
ＮＡセグメント中の部分を、同じアミノ酸をコードし且
つ大腸菌中で発現されやすいコドンからなるＤＮＡ断片
によって置き換える段階； を含んで成る。

上記（１１〜（５）の段階の内、段階（１）は必須であ
るが、段階（２）〜（３）は目的とするヒト−プロウロ
；１−ナーゼ様ポリペプチドのタイプに応じて選択実施
され、実施の順序は任意にｊＨ択することができる。効
率的に発現する遺伝子を得るには段階（５）をも実施す
るのが好ましく、この段階を実施する順番は任意に選択
することができる。

本発明の遺伝子系のＤＮＡセグメントは勿論全合成の手
段によってもよい。その際、天然コドンに代えて大超菌
で発現されやずいコドンを採用することができる。

本発明に関する各種プラスミドの作製の系統図を第１図
に示し、具体的な方法を実施例及び参考例に記載する。

Ｄ、遺伝子の　現　び光匪生戊璽ｐ看徴付は前記のよう
にして作製したプラスミドを適当な宿主、例えば大腸菌
Ｊｌ’ｌ　１．０３、大腸菌Ｗ３１１０等に形質転換し
、この形質転換体を適当な培地、例えば５０μｇ　／　
ｍ　Ｉ！のアンピシリンを含有する場合があるし一培地
中で培養し、大腸菌が一定量、例えば５５０ｎｍにおい
て吸光度０．３〜０．５まで、増殖した時に遺伝子の発
現を誘導する。この誘導は使用するプラスミドのプロモ
ーターの種類により異る。

例えば、プラスミドｐＭｔｌＰ１ｐｍを使用する場合に
は、これらのプラスミドで形質転換された大腸菌を３０
℃で培養し、そして培養温度を４２°Ｃに上昇セしめる
ことにより誘導する。また、プラスミドｐＭＩＪＴ４Ｌ
ｐｍ２　、又はｐＭｔｌＴ４１、ｐｍ３を使用する場合
にはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクＩ・ピラノシド
（ＩＰＴＧ）により誘導する。さらに、プラスミドｐｔ
ｒｐＵＫ２（１１３５）　、ｐｔｒｐＬＩＸ２（Ｅ１３
５）　、ｆｌｔｒｐＬＩＫ２（Ｑ１３５Ｄ１５７）、又
はｐｔｒｐＵＫ２（Ｅ１３５Ｄ１５７）を使用する場合
には、培養菌体濃度が一定値、例えば５５０ｎｍにおけ
る吸光度０．３〜０．５に達したときにインドール酢酸
を添加することにより誘導することができる。

このようにして遺伝子の発現を誘導した後、目的とする
ポリペプチドを４１：成−ｕしめるためにさらに３〜１
０時間培養する。次に、こうして培養された細胞を集め
、そして常法に従って、例えば後の実施例に具体的に記
載する方法に従って、目的ポリペプチドを含有する無細
胞抽出液を得る。次に、場合によっては、これらの抽出
液から、抗ウロキナーゼモノクローナル抗体が結合した
セファロースカラムによるアフィニティークロマトグラ
フィーを行なうことによってプロウロキナーゼ様ペプチ
ドを精製する。

この発明においては、上記のようにして調製した抽出液
について、酵素活性、分子量、トリプシン感受性、プラ
スミン感受性、及びトロンビン感受性について試験した
。

（１）酵素活性の測定 合成基質法；試料１００　ｔＪ　（ｌに０．２ｍＭＳ−
２４４４（Ｌ−ピログルタミル−グリシル−し−アルギ
ニンＰ−ニトロアニリＦ’、Ｋａ１社、スウェーデン）
　、０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！　　（ｐＨ７、
５）　、０．０１％Ｔｒｉ−ｔｏｎ　Ｘ−１００を７０
０　ｐ　Ｉｔ加え３７℃にて３０分間インキュベートし
た後酢酸１００７！／を加えて反応を停止し、４０５ｎ
ｍにおける吸光度を測定する。

フィブリン平板法（１％牛フィブリノーゲン（Ｍｉｌｅ
ｓ社のｂｏｖｉｎｅ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ、　９５％
ｃｌｏｔｔａ−ｂｌｅ）、０．２５％アガロースを含む
６７ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に最終濃度１ユニ
ツト／　ｍ　Ｉｔとなるようにトロンビンを加えて作成
したフィブリン平板法にｌＯμｐの試料をスボソｌ”　
シ３７℃にて１６時間インキュへ−１・後の溶解円の面
積を測定し標準ウロキナーゼ（日本曹達−製）と比、較
して活性を測定する。

（２）分子量の測定 抽出液サンプルを、２−メルカプトエタノールを含まな
い条件でしＪｌり一等の方決（文献３０．）により、Ｓ
ＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、次
にフィブリンオートグラフィーにより可視化して標準サ
ンプルと比較することにより測定する。

（３）トリプシン感受性 サンプルをトリプシンで処理した後、前記（２）の方法
により、処理物中の酵素活性を有する生成物の分子量を
測定する。この試験により、１３５位のアミノ酸の置換
によるプロウロキナーゼの安定化を確認する。

（４）プラスミン感受性 サンプルの酵素活性をフィブリン平板法にて測定し、５
００１０／ｍＩ！、となるように５０ｍＭベロナール緩
衝液、０．１．　Ｍ　ＮａＣ７！０．００１％Ｔｗｅｅ
ｎ　８０を含む溶液に希釈する。これらの溶液１００μ
ｌにプラスミンをそれぞれｌμｇ、２μｇ、５μｇ加え
、３７℃にてインキュベートし経時的に１０μ１採取し
て５μｇのダイズトリプシンインヒビターを加えて反応
を停止し、Ｓ−２４４４による合成基質法によって活性
を測定する。プロウロキナーゼはプラスミンにより１５
８位のリジンと１５９位のイソロイシンの間が切断され
て活性化されるため、プラスミン処理により分解されに
くいことが１５７位のアミノ酸の置換によるプロウロキ
ナーゼ様ポリペプチドの安定化の指標となる。

（５）トロンビン感受性 サンプルの酵素活性をフィブリン平板法にて測定し、５
０４　Ｕ、７　ｍ　（！となるように５０ｍＭへロナー
ル緩衝液、Ｏ，Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌ！　　０．００１％Ｔ
ｗｅｅｎ　８０を含む溶液に希釈する。これらの溶液１
ｎＮ２にトロンビン１ユニツトを加え、３７℃にて３０
分間インキュベートする。１００μβを採取して天然型
酵素については１μｇのプラスミンで３７℃、３０分間
、変異体については５μｇのプラスミンで３７℃、６０
分間処理し、Ｓ−２４４４による合成基質法で活性を測
定する。トロンビンを加えずに同様の操作を行なったも
のを対照としてトロンビン処理後の残存活性を求める。

プロウ［ｔキナーゼは、トロンビンにより　１５６位の
アルギニンと１５７位のフェニルアラニンとの間の結合
が切断された場合ウロキナーゼ活性が低下する。従って
トロンビン処理後の残存活性が低下しないことが、１５
７位のアミノ酸の置換によりプロウロキナーゼ様ポリペ
プチドが安定化されたことを意味する。

結果 ＋１１　　酵素活性 この発明のプラスミドにより形質転換された大腸菌から
得られたサンプルはすべて、前記（１，１に記載した酵
素活性の測定において、目的の活性を示した。

（２）トリプシン感受性 １３５位のアミノ酸及び１５７位のアミノ酸がいずれも
置換されていないプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコ
ードするプラスミドｐＭｔｌＰ１；　１３５位のアミノ
酸のみが置換されているプロウロキナーゼ様ポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含有するプラスミドｐＭＵＰＩ
ｐｍ　、　ｐＭＵＴ４Ｌｐｍ２　、ｐｔｒｐＵＫ２（１
１３５）及びｐｔｒｐＵＫ２（Ｅ１３５）　；並びに１
３５位のアミノ酸及び１５７位のアミノ酸が共に置換さ
れているプロウロキナーゼ様ポリペプチドをコードする
遺伝子を含有するプラスミドｐｔｒｐＵＫ２（Ｑ１３５
Ｄ１５７）及びｐｔｒｐｔｌＫ２（Ｅｌ、３５Ｄ１５７
）のいずれかにより形質転換された大腸菌から調製した
サンプルは、ｐＭＵＰ１由来のサンプルを除きいずれも
トリプシン処理に対して耐性を示した。

例えば、プラスミドρＭＵＰＩ及びｐＭＵＰｌｐｍのそ
れぞれを大腸菌Ｗ３１１０に形質転°換し７、これらの
形質転換菌をＬ−ブロス中で３０℃にて培養し、６００
ｎｍの０．０が０．３に達したとき培養温度を４２°Ｃ
に上昇せしめることにより遺伝子を発現せしめた。

培養菌体を集め、その無細胞抽１（病没を調製した。

これらの抽出液についてＳＤＳポリアクリルアミドゲル
−フィブリンオートグラフィーにより分子量を推定した
ところ、いずれの抽出液についても分子量は約５万であ
った（第１３図中レーン２及び４）。また、両袖出液を
トリプシンで処理した後同様にして分子量を測定したと
ころ、ｐＭＵＰｌ由来の抽出液においては分子量約、′
３万の生成物が生していたが、ｐＭＵＰＩｐｍ由来の抽
出液においては分子量約３万の生成物はほとんど生じな
かった（第１３図中レーン３及び５）。

以上の結果から、ｐＭＵＰ１由来の生成物はトリプシン
によって容易に低分子化されるのに対してｐＭＬＩＰ１
ｐｍ由来の本発明の生成物＆、Ｉ　ｌ・リプシンに、Ｌ
り低分子化されないことが明らかである。

同様にして、プラスミドｐＭＩＪＴ４Ｌｐｍ２を大腸菌
ＪＭ　１０３に形質転換し、この形質転換菌を■、−プ
ロス中で３７℃に７５５０ｎｍにおける吸光度が約０．
５になるまで培養し、誘導剤としてＩＰＴＧ　（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度
が１ｍＭとなるように添加し、３７℃にてさらに培養し
遺伝子を発現せしめた。この培養菌体を上記同様に処理
し、生成物を上記と同様にして分析した。

この結果を第１４図に示す。この図中レーン１は標準ウ
ロキナーゼ（１ユニツト）、レーン２はｐＭＵＰｌによ
り形質転換された大腸菌からの粗抽出液をトリプシンで
処理したもの、レーン３はｐＭＵＴ４Ｌｐｍ２により形
質転換された大腸菌からの粗抽出液をトリプシンで処理
したもの、レーン４はｐＭＬＩＰｌｐｍにより形質転換
された大腸菌からの粗抽出液をトリプシン処理したもの
の結果を示す。この結果から明らかな通り、ｐＭｌｌＴ
４Ｌｐｍ２に由来する遺伝子産物もトリプシンにより低
分子化されにくい。

前記の分子量約５万の生成物及び約３万の生成物はそれ
ぞれ高分子ウロキナーゼ及び低分子ウロキナーゼに相当
するものと考えられる。これらの分子量が大尿由来の標
準ウロキナーゼのそれに比べてやや小さいのは、大腸菌
内では糖鎖の付加が生じないためであると推定される。

１３５立のアミノ　宥　の−゛」生 上記の結果は、ヒト−プロうロキナーゼと実質的に同一
のアミノ酸配列を有し、Ｎ末端のセリンから１３５番目
のリジンがグルタミン、スレオリン、グルタミン酸、又
はイソロイシンにより置き換えられているヒトプロウロ
キナーゼ様ポリペプチドがいずれも天然ヒト−プロウロ
キナーゼと同様にフィブリン分解活性すなわちウロキナ
ーゼ活性を示し、しかも天然ヒト−プロウロキナーゼと
異りトリプシンにより分解されにくいことを明瞭に示し
ている。

このことは、高分子ウロキナーゼのＮ末端から１３５番
目と１３６番目の２個の塩基性アミノ酸（リジン）の間
のペプチド結合がトリプシン様プロテアーゼにより切断
されて低分子ウロキナーゼが生成するとする推定が正し
いことを示している。さらに、Ｎ末端から１３５番目の
アミノ酸が前記のアミノ酸である場合、いずれもトリプ
シンによる前記切断が生じ難いことは、第１３５位のア
ミノ酸が塩基性アミノ酸以外のいずれのアミノ酸であっ
ても、１３５位のアミノ酸と１３６位のアミノ酸との間
のペプチド結合が切断され難くなることを示している。

さらに、Ｎ末端から１３５位目０アミノ酸が、天然ヒト
−ウロキナーゼの様にリジンであっても、又本発明のヒ
トウロキナーゼ様ポリペプチドのように前記のアミノ酸
であってもウロキナーゼ活性が生ずることは、この１３
５位目Ｏ７ミノ酸の種類のいかんばウロキナーゼ活性に
とって必須ではないことを示している。

しかも、多くのプロテアーゼは塩基性アミノ酸を認識す
ると言われているので、Ｎ末端から１３５番目のアミノ
酸が塩基性アミノ酸以外のアミノ酸であればこの明細書
において具体的に開示したポリペプチドの場合と同様の
結果が発揮されると考えられる。

（３）　　プラスミン及びトロンヒフ感受性１５７位の
アミノ酸のみが置換されているプロウロキナーゼ様ポリ
ペブチ１′を＝１−ドする遺伝子を含有するプラスミド
ｐＭＵＴ４Ｌｐｍ３；並びに１３５位のアミノ酸及び１
５７位のアミノ酸の両者が置換されているプロウロキナ
ーゼ様ポリペプチドをコードする遺伝子を含有するプラ
スミドｐｔｒｐ［ＩＫ２（Ｑ１３５Ｄ１５７）及びｐｔ
ｒｐｔｌＫ２（Ｅ１３５Ｄ１５７）のいずれかにより形
質転換された大腸菌から調製されたザンプルではいずれ
もプラスミンによる活性化の速度が天然型プロウロキナ
ーゼの場合に比べζ低かった。この結果の１例を第１５
図のグラフに示す。

このグラフから明らかなごとく、この発明の・１５７位
のアミノ酸が置換されたプロウロキナーゼ様ポリペプチ
ドは、天然形のそれに比べてプラスミンにより分解（活
性化）されにくいことが明らかである。

トロンビン処理した後の残存酵素活性は次の通りであっ
た。

以上の結果は、１５７位のアミノ酸が置換されたプロウ
ロキナーゼ様ポリペプチドはトロンビンに対して不活性
化されにくいことを示している。

以上のごとく、１３５位のリジンが塩基性アミノ酸以外
のアミノ酸により置き換えられているヒト−プロウロキ
ナーゼ様ポリペプチド、１５７位のフェニルアラニンが
酸性アミノ酸により置き換えられているヒト−プロウロ
キナーゼ様ポリペプチド、及びこれら両アミノ酸が上記
のように置き換えられているしトープロウロキナーゼ様
ポリペプチドは、この発明において定義されるアミノ酸
の範囲内において、いずれも、天然型ヒト−プロウロキ
ナーゼと同様の生理的活性を有し、しかも、トリプシン
、プラスミン、トロンビン等のプロテアーゼ類に対して
極めて安定化されていることが明らかである。

このことは、本発明の安定化されたヒト−プロウロキナ
ーゼ様ポリペプチドが、血栓溶解剤等の医薬の活性成分
として有望であることを示している。

次に実施例及び参考例によりこの発明をさらに具体的に
説明する。但し、この発明の範囲がこれらの実施例によ
り限定されるものではない。

アニジンチオシアナートを用いる方法によってｍＲＮＡ
を調製した。

一８０℃に凍結しておいた腎組織２０ｇを液体窒素中で
ワーリングブレンダーにて破砕し、５Ｍグアニジンチオ
シアナートン容液（５Ｍグアニジンチオシ了ナート、０
．５％Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、２少量Ｍ
酒石酸ナトリウム、０．１Ｍメルカプトエタノール、０
．１％アンチフ・オームＡ）８０ｍ／に懸濁した。この
液をテフロンホモゲナイザーで均質化し、２０　Ｇ　’
Ａ注射針を用いて核酸を剪断した。５．７　Ｍ　ＣｓＣ
１１１２ｍ６に前記溶液２４ｍ１を重層し、ベックマン
超遠心機５Ｗ２８０−ターにより１５℃にて２４時間、
２５００Ｏｒｐｍで遠心後、ネ■全ｒ？ＮＡを回収した
。

２％酢酸カリウＪ１熔液に１１全ＲＮΔを溶解し、２倍
容量のエタノールを加えて、−２０℃にて一晩放Ｗ後、
沈澱を遠心により回収精製した。

ポリ（Ａｌ”ＲＮＡは１（、八ｖｉｖ　らの方法（文献
１２）に従い、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラノ、り１
１マドグラフイーにより全ＲＮへから単離４ｎ製した。

腎組織１０ｇからの収量は、全ＲＮＡは約３ｍｇであり
、その２〜３％がポリ（＾）ｌ？ＮＡであった。

考１１例」ユ　ｃＤＮＡライブラリー（Ｉ）の作製参考
例１で得られたポリい）＋ＲＮＡ４０μｇを用いてｃＤ
ＮＡ合成を行った。オリゴ（ｄＴ）＋□−＋８４０μｇ
をプライマーとして、逆転写酵素４０ユニツトを用いて
、４２°Ｃにて２時間反応させて第−ｔＸを合成し、鋳
型のｍＲＮＡをアルカリ処理で除き、第二鎖の合成を１
００ユニツトのＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ　Ｍ
ｌｅｎｏｗ断片を用いて行った。

Ｓ１ヌクレアーゼでヘアピン部をとり除き、末端デオキ
シヌクレオチジル転移酵素により、二重鎖ｃＤＮＡの３
゛端に（ｄＣ）　Ｉ。−２０鎖を結合し、約４００ｎｇ
の（ｄ　Ｃ）テイルｃＤＮＡを得た。

これを市販の（ｄＧ）テイルｐＢＲ３２２（Ｐｓｔ　Ｉ
部〕（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ製）８
００ｎｇとアニールし、大腸菌χ１７７６を、１（ａｎ
ａｈａｎの方法（文献１３）により形質転換し、テトラ
サイクリン耐性で且つアンピシリン感受性の形質転換菌
約２×１０″′個からなるｃ、　Ｄ　Ｎ　Ａライブラリ
ー（１）を得た。

これらの形質転換菌についてアルカリ溶菌法による迅速
単離法（文献１４）によりｃＤＮΔ挿入断片の大きさを
調べた。

訓ｌ Ｇ、Ｊ、　５ｆｅｆｆｅｎｓ等（文献８）及びＧｕｎｚ
ｌｅｒ等（文献９）により報告されたヒトウロキナーゼ
のアミノ酸配列へｓｎ＋６’、ＧＩｎ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ
、ＰｈｅＩ７″に対応するｍＲＮＡに相補的な１４塩基
からなる下記のＤＮＡオリゴマー１６種類をホスホトリ
エステル法により合成した。

５’ＡＡＣＣ八八ＧＧＴＴＧＡＴＴ　　　３’ＡＡＣＣ
ＡＡＧＧＴＴＧＧＴＴ へへＣＣへＧＧＧＴＴＧＡＴＴ ＡＡＣＣＡＣＧＧＴＴＧＡＴＴ Ａ４ＣＣＡＣＧＧＴＴＧＧＴＴ ＡＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＡＴＴ Ａ４ＣＣＡＴＧＧＴＴＧＧＴＴ Ａ４ＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＴＴ Ａ４ＣＣＡＡＧＧＣＴＧＧＴＴ ＡＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＴＴ Ａ’ＡＣＣＡＧＧＧＣＴＧＧＴＴ ＡＡＣＣＡＣＧＧＣＴＧＡＴＴ 八ＡＣＣＡＣＧＧＣＴＧＧＴＴ Ａ４ＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＴ ＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴ ＡＡＣＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＴ これら１６種類のＤＮＡオリゴマーをＵＫプローブ■と
称する。

また、確認用プローブとしてＭｅｔ”’、Ｔｒｙ、Ａｓ
ｎ。

八ｓｐ、Ｐｒｏ”フに対応するｍＲＮＡに相補的な１４
塩基から成る下記のＤＮＡオリゴマー８種類のＤＮＡオ
リゴマーを同様にして合成した。′５°ＧＧＡＴＣＡＴ
ＴＡＴＡＣＡＴ　　３’ＧＧＡＴＣＧＴ’ＴＡＴＡＣＡ
Ｔ ＧＧＡＴＣＧＴＴＧＴＡＣＡＴ ＧＧＡＴＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴ ＧＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＣＡＴ ＧＧＧＴＣＧＴＴＡＴＡＣＡＴ ＧＧＧＴＣＧＴＴＧＴＡＣＡＴ ＧＧＧＴＣＡＴＴＧＴＡＣＡＴ これら８種類のＤＮＡオリゴマーをＵＫプローブ■と称
する。

これら、ＵＫプローブ■及びＬＪ　ＫプローブＨのそれ
ぞれ２０Ｏｎｇずつを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いて３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ”ｒ’　ｒ　Ａ　Ｔ
　Ｐにより５゛端放射能標識を行い、コロニーハイブリ
ダイゼーション用プローブとした。

参（桝土　Ｃ’ＤＮＡライグ四：−リ」」九危（１１検
索 １５μｇ　／　ｍ　１のテｔ・ラサイクリンを含有する
ＬＢ寒天培地に、オートクレーブ殺閑したニトロセルロ
ースフィルター（０，４５Ｉｔ　ｍ　、　ＴＹＰＥ　Ｔ
Ｍ−２）（東洋濾紙製）を置き、約２０００個の形質転
換菌コロニーが生育するように、実施例２において調製
した形質転換菌を撒いた。３７℃にて８時間培養した後
、２枚のニトロセルロースフィルターにレプリカ（複写
）し、これをさらに３７℃にて３時間培養した。最初の
ニトロセルロースフィルターをマスターフィルターとし
、後者の２枚を、１５℃ｇ／ｒｎｊ２のテトラザイクリ
ン及び１００μｇ７ｍｎのクロラムフェニコールを含有
するＬＢ寒天培地に移し、３７℃にて一晩培養した。次
に、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ　）ｌｏｇｎｅｓｓの変法（文
献１５）に従って０、５　Ｍ　ＮａＯＨ及び１．５　Ｍ
　Ｎａ（ｊ！上に３分間フィルターを置き、コロニーの
溶菌及びＤＮＡの変性を行い、０．５　Ｍ　Ｔｒｉｓ−
１１ｃＪ　　（ｐｌ＋　７．６　）及び１．５ＭＮａ（
ｊ２上で中和し、フィルターを風乾し、そして８０℃に
て２時間焼成した。

次に、フィルターを４ＸＳＳＣ中で６０℃にて３０分間
ずつ洗浄し、続いて４ｘＳＳＣ，１０ｘＤｅｎｈａｒｄ
ｔ及び５０　ｐ　ｇ　／ｌｎｌ変性Ｅ、ｃｏｌｉ　−Ｄ
　Ｎ　Ａ中で６０℃にて１時間プレハイフリダイゼーシ
ョンを行い、さらに０．１ｍＭ　　ＡＴＰ及び放射能標
識ＵＫプローブ■　（約１１０７ｃｐ／フイルター）を
加えて３７℃にて１６時間ハイブリダイゼーションを行
った。ａＸＳＳＣ中で３９°Ｃにて６〜８回洗浄した後
、フィルターを風乾し、オートラジオグラフィーにより
、ＵＫプローブＩとハイブリダイブする形質転換菌を検
索した。この方法により８×１０４個のコロニーから２
１個の候補クローンを得た。これらのクローンのプラス
ミドをｐＫＹＵ１〜ｐＫＹＵ２１と称する。

得られた候補クローン２１個を上記と同様に処理し、Ｕ
Ｋプローブ■とハイブリダイズするクローンを得た。こ
のクローン中のプラスミドをｐＫＹＵ２１と称する（第
３図）。

（２１ｐ　Ｋ　Ｙ　Ｕ　２１プラスミドＤＮＡの特性ｐ
ＫＹＬＩ２１プラスミドＤＮＡを各種の制限酵素で消化
し、Ｍａｙａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（文献１６）により
、又はＭｉ３ｍｐ８にサブクローン化した後ジデオキシ
チェインターミネーション法（文献１７）により、塩基
配列の決定を行った。これをウロキナーゼの公知のアミ
ノ酸配列と対照した結果、ｃＤＮＡは低分子ウロキナー
ゼのコード領域を完全に含むが、高分子ウロキナーゼの
コード領域中の５′端領域の約１００ｂｐのＤＮＡが欠
損していることが確認された。

豊考９１５．　　プライマー延　　応によるｃ　ＤＮＡ
参考例４（２）において決定した塩基配列に基づき、”
Ｓｇｒ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ９３に対応す
るｍ　ＲＮ　Ａの配列に相補的な１５塩基から成るＤＮ
Ａオリゴマー　： ５　”　ＣＴＧ＾八ＧＡへにＡＴＣＡＧ八　　３　゛を
ホスホトリエステル法によって合成した。

鋳型としてポリ（Ａ）”ＲＮＡを１００μｇを用い、＾
ｇａｒｖａ１１等（文献１８）、又はＳｔｅｗａｒｔ等
（文献１９）の方法に基づき、５゛端３２ｐ−標識ブラ
イマー１μｇと共に逆転写酵素１００ユニツトにより第
１鎖ｃＤＮＡを合成し、次にＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメ
ラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片１００ユニットを用いて第
２鎖を合成した。次に３１ヌクレアーゼにより一重鎖Ｄ
　Ｎ　Ａを消化し、末端デオキシヌクレオチジル転移酵
素を用いて３′端に（ｄＣ）ｎ鎖を付加した。このｄＣ
テイルインサート（ｃＤＮＡ）とｄＧテイルベクター（
ｐ　ＢＲ３２２）とをアニールした後、大腸菌χ１７７
６を形質転換して約５Ｘ１０’個の形質転換体からなる
ｃＤＮＡライブラリー（ＩＩ）を得た。

皇考班見　ｃＤＮＡライブ−１−（ｎ（７）−参考例５
において得た形質転換閑を、参考例４（ｌｌに記載した
方法と同様にして処理しハイブリダイゼーションを行っ
た。この場合ｐＫＹＵ２１からの１５０ｂｐ江ニ一旦れ
ＩＩ５’端消化端片化断片″′ＰｄＣＴＰ（３０００Ｃ
ｉ／ｍｍｏｌｅ）を用いてニックトランスレーション法
（文献１３）により放射能標識したものをプローブとし
て用いた。ハイブリダイゼーションを６０℃にて行った
。

次に、２×ＳＳＣにより６０℃にて２〜３回フィルター
を洗浄し、風乾し、オートラジオグラフィーにより上記
のプローブとハイブリダイズするクローンを検索した。

約３Ｘ１０’個のクローンから８個の陽性クローンを得
た。これらのクローン中のプラスミドｐＰＥｌ　−ｐＰ
［＋と称する。これらのプラスミドＤＮＡを制限酵素」
ｌで消化した結果、プラスミドｐＰＥ３　（第２図）が
約４２０ｂｐのｃ　ＤＮＡ挿入部を含有することが確認
された。

このプラスミドｐＰＥ３のＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで
消化して得られた断片をＭ１３ｍｐ８にザブクローン化
し、ジデオキシチェインターミネーション法（文献１７
）により塩基配列の決定を行ったところ、プロウロキナ
ーゼ遺伝子の５゛端側の十分な長さのコード領域を含み
、さらに翻訳開始コドンＡＴＧの上流に６６ｂｐから成
る５゛非翻訳領域を含むことが確認された（第２図）。

低分子ウロキナーゼの完全なコード領域を含むプラスミ
ドｐＫＹＬ１２１のＤ　Ｎ　Ａ　５１’　ｔｃをそれぞ
れ１０ユニツトずつの制限酵素用１■及び、！匡１■に
より二重消化し、そして電気溶出して、約５．７　Ｋ　
ｂのＤＮＡ断片を得、他方同プラスミドｐＫＹ’ｔ１２
１のＤＮＡをそれぞれ１０ユニットずつのｕｌＬＩＩ及
びＮｃ。

■により二重消化し、そして電気溶出して６６ｂｐのＤ
ＮＡ断片を得た。また、参考例６において得たプラスミ
ドｐＰＥ３のＤ　Ｎ　Ａ　５　／’　ｇをそれぞれ１０
ユニツトずつのＮｃｏｌ及び１ｌｉｎｄＴＩＩにより二
重消化して約１．ＩＫｂＤＮＡ断片を得た。これら３種
のＤＮＡ断片はフェノール／クロロホルム抽出を繰り返
し、２倍量のエタノールで沈澱をすることにより精製回
収した。これら３種類のＤＮＡ断片を７４ＤＮＡリガー
ゼにより連結し、大腸菌χ１７７Ｇを形質転換した。得
られた形質転換体をアルカリ溶歯法による迅速単離法に
より調べ、プロウロキナーゼの完全な遺伝子を含むプラ
スミドｐＫＹＩＪ２２を有するクローンを得た。このク
ローンニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏ旦）χ１７６６／　ｐＫＹＬ１２２は１９８５年
１月１１日に工業技術院微生物工業技術研究所に徽工研
菌寄第８０４１号（ＦＥＲＭＰ−８０４１）として寄託
され、１９８６年１月２２「１にｔｉ’ｉｋ工研条寄第
り１ｇ号（ＦＥＲＭ　ｌ１Ｐ−７ＪＳ’）　トＬ、−’
Ｃ、フタヘスト条約に基く国際寄託に移管された。

皇考Ｍ五　１プス圭上鄭違〃９」すＪ速ル巳ｕ政刀ｐ基
淀 プラスミドｐＫｙｕ２２の挿入部の塩基配列を、Ｍａｙ
ａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法、及びＭ１３ｍｐ８にサブクロ
ーン化した後のジデオキシチェインターミネーション法
により決定した。この結果を第、ｌ−１図〜第４−３図
に示す。この結果と文献２０に記載されている塩基配列
とを比較した場合、２５４番目のアミノ酸Ａｓｎのコド
ン（ＡＡＴ）’（文献ではΔＡＣ）、３６０番目（第４
−２関巾のアミノ酸の番号）のアミノ酸Ｌｅｕのコドン
ＣＴＧ　（文献ではＣＴＡ）、３６５番目のアミノｆｌ
ｌＰｒｏの７トンＣＣ八（文献ではＣＣＣ）、及び３６
６番目のアミノ酸ＧｉｎのコドンＣＡＧ’（文献ではＣ
ＡＡ）において相互に異なっていた。ＡＡＴは大腸菌に
おいて翻訳されにくいコドンであるが、ＣＴＧ及びＣＡ
Ｇはともに大腸菌において翻訳されやすい（使用頻度が
高い）と言われ、大腸菌における発現にとって有利とな
る。なお、ＣＣＣは・ＣＣＡより若干有利であると考え
られる。

参考例７において作製した、プロウロキナーゼをコード
する天然型ｃＤＮＡの５°端部分の約３０ｂｐの構造を
、プロウロキナーゼ遺伝子がシュ一トモナス出来めＣ２
３０遺伝子のＳＤ配列のもとで大腸菌中で効率よく発現
されるように変形した。

下記の、２９塩基、１５塩基及び２０塩基からなる３種
類の単ｔＡＤＮＡオリゴマーをホスホトリエステル法に
より合成した。

５’　　ＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＴＴＣＣＧＴ　　３’３’　　ＴＧＣＡＧＴＡＣＴ
ＣＧＴＴＧＣ５’３　“　　ＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣ
ＡＡＧＧＣＡＧｅ　　　　５’次に、これら３種類の合
成りＮＡオリゴマー１μｇずつを９５℃にて２分間加熱
処理した後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより５゛
端燐酸化し、セップパソク（ＣＩＢ）カラ、／、ｖ（Ｗ
ａｔＣｒｓ製）により精製し、乾燥した後、２０　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ａｌ１７．６）　、１０ｍＭ
　ＭｇＣ７！ｚの溶液５０μβに溶解し、９５℃にて２
分間加熱した後室温まで徐冷し、１２℃にて一晩保持す
ることによってアニールし、下記に示す二重鎖ＤＮＡを
得た。

５　’　　　　　　ＣＡＴＧＡＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣ
ＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＣＧＴ　　３　　’３’　　ＴＧ
ＣＡＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣ
八八ＧＧＣＡＧＣＡａｔｌＩ　　　　　５ａｔＴ　　Ｂ
ｓへへＩ　　　Ｔａｑ４一方、プラスミドｐＫＹＵ２２
のＤＮＡ５μｇを制限酵素旦■■及び入廷■により二重
消化し、約５．７ＫｂのＤＮＡ＠片を電気溶出により回
収した。他方、同しプラスミドｐＫＹＵ２２のＤＮＡ５
１１ｇを制限酵素凡ｓｔｌ及び旦〔■により二重消化し
、電気溶出して約４００ｂｐのＤＮＡ断片を得。さらに
これを制限酵素−１凹■で消化して電気溶出することに
より約２６０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これら２種
類のＤＮＡ断片はフェノール／クロロホルム抽出および
２倍型のエタノールによる沈澱により梢′Ｍ回収した。

これら２種類のＤＮＡ断片と、前記の合成二重鎖ＤＮＡ
オリゴマーとをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸
菌χ１７７６を形質転換した。形質転換体をアルカリ溶
菌法による迅速単離法により調べ、変形されたプロウロ
キナーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＫＭＵ１を有す
るクローン、エシェリンヤ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｚ　１７７６／　ｐＫＭＩＪｌを得
た。このプラスミドｐＫＭＵＩが滑入された大腸菌ニジ
エリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ、ｈｉａ　ｃｏｌ　
ｉ）　χ１７７６／ｐＫＭＵｌは工業技術院微生物工業
技術研究所に、微工研菌寄第８０４０号（ＦＥＲＭｒ’
−８０４０）　トじ７ＷｉＥすしている。

参考例９において得られた５μｇのプラスミドｐＫＭＵ
１を制限酵素Ａ１１’ｌｌＯユニットにより消化し、子
牛消化管ホスファターゼ（ＣＩ　Ｐ）で処理し、単離し
た。他方、５μｇのプラスミドｐＴｃＭｌを制限酵素人
虹Ｉ［１０ユニツトにより消化し、電気溶出法により約
５００ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。

、＝ｈら２　ＭＨのＤＮＡ断片はフェノール／クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱を繰り返すことによって
精製回収した。

両者をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、大腸菌ＪＭ　
１０３に形質転換した。形質転換体をアルカリ溶菌法に
よる迅速単離法によって調べ、ｔａｃプロモーター／オ
ペレーター及びＣ２３０ＳＤ配列がプロウロキナーゼ遺
伝子に対して正方向に入ったプラスミドｐＭＵＴＩＬを
有するクローンを得た。

前記のプラスミドｐＴｃＭＩ　は、発明者等によって作
製された新規なプラスミドであって、ｔａｃプロモータ
ー／オペレーター、ＩａｃＳＤ及びＣ２３０ＳＤ配列か
ら成る発現制御領域、並びに０２３０構造遺伝子を含有
する。このプラスミドが導入された大腸菌ニジエリシャ
’コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ　１
０３／ｐＴｃＭ１は工業技術院微生物工業技術研究所に
、微工研菌寄第７７７９号（ＰＥＲＭ　Ｐ−７７７９）
として寄託されている。

プラスミドｐＭＵＴＩＬにおいては、ｔａｃプロモータ
ー／オペレーター、１ａｃｓＤ及びＣ２３０Ｓｒｌから
なる発現制御′７４域の下流の適切な位置に本発明の変
形されたプロウロキナーゼ遺伝子が挿入されている。

次にプラスミドｐＫＫ２２３−３　（文献２２−２３お
よび２４）５μｇを制限酵素Ｈｉｎｃ１１［［１０ユニ
ツトで消化し、子牛消化管ホスファターゼ（Ｐ、Ｌ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で処理した。

一方、前記のようにして得た１８ｇのプラスミドｐＭＩ
ＪＴＩＬを４ユニツトの制限酵素Ｄｒａｌで消化し、こ
の消化断片と５゛端燐酸化したＨｉｎｄｆｆｌリンカ−
（ｄＣＡＡＧＣＴＴＧ）　　１８ｇとをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより連結し、次に１２ユニツトの制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩで消化し、０．１５Ｍ　ＮａＣ，ｉ！溶液とし
、等容量のフェノール／クロロホルムで抽出後、これに
２倍容量のエタノールを加えてＤＮＡを沈澱せしめ、１
６０００ｒｐｍ　、４℃にて沈澱物を集め、これを乾燥
した。

このｐＭＵＴＩＬ消化断片と、前記のｐＫＫ２２３−３
の肛屁■消化断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し
、大腸菌ＪＭ　１０３を形質転換した。これらの形質転
換菌をアルカリ溶菌法による迅速単離法により調べ、プ
ラスミドｐＭＵＴ２Ｌを含むクローンニジエリシャ・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ　１０３
／ｐＭｔｌＴ２Ｌを得た。

このプラスミドは、プロウロキナーゼ遺伝子の上流に前
記の発現制御領域を有すると共に、下流にｐＫＸ２２３
−３由来の大腸菌のりボゾーム遺伝子の転写ターミネー
タ−（ｒｒｎＢ、　Ｔ　＋　Ｔ　Ｉ　）を有する。

なお、プラスミドｐＫＫ２２３−：’ｌばｒ’ｈ＋ｉｒ
ｍａｃｉａ　Ｐ　　ＬＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓから販
売されており、容易に入手することができる。

５μｇのプラスミドｐＭＵＴ２Ｌを、１０ユニツトずつ
の制限酵素５狽ｕ及び工ｔｈｌｌｌ　　Ｉによりより消
化し、フェノール／クロロホルム抽出後、エタノールで
沈澱せしめ、回収したＤＮＡを０．１ｍＭのｄＧＴＰ　
、　ｄＣＴＰ　、　ｄＡＴＰ及びＴＴＰの存在下でＴ４
ポリメラーゼを用いて末端を平滑化し、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼにより再環化した。これを大腸菌ＪＭ　１０３に形
質転換し、５０Ｍｇ／ｍ７＋のアンピシリンを含有する
ＬＢ寒天培地上にコロニーを形成せしめ、アルカリ溶菌
法による迅速単離法（文献１４）で調べ、プラスミドｐ
ｌ’１ｔｌＴ４Ｌを含むクローンニジエリシャ・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏ↓」Ｊ、団１０３　／ｐＭ
ＵＴ４Ｌを得た。

の導入（１） １）１本鎖鋳型ＤＮＡの調製（第７図）プラスミドｐＫ
ＹＬ１２２及びファージＭ１３ｐｍ　８二木鎖ＤＮＡそ
れぞれ１μｇずつを、ｌ　Ｏｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１Ｇ
７！（ｐＨ７，５）　、７ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ２．７ｍＭ　
　β−メルカプトエタノール及び５０　ｍ　Ｍ　ＮａＣ
ｊ！を含有する溶液２０μβ中で、５ユニツトのＰｓｔ
Ｉを用いて３７°Ｃにて１時間消化した。フェノール処
理、エタノール沈澱によってそれぞれのＤＮＡ断片を回
収し、両者を混合した後、６６　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｉ
ＩＣ／（ｐＨ７，５）　、５ｍＭ　ＭＩＴＣ７！ｚ　、
５ｍＭ　　ＤＴＴ及び１ｍＭＡＴＰを含有する溶液２０
μｐ中で１０’ＯユニツトのＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
て１２℃にて１６時間連結反応を行った。反応後、反応
液を用いてメッシング等の方法（文献２５）に従って大
腸菌ＪＭ　１０３を形質転換し、０．０２％Ｘ　−ｇａ
ｌ及び１　ｍＭ　ＩＰＴＧを含有する軟寒天と共にプレ
ートし、３７°Ｃにて一晩培養した。組換体によって形
成された白いプラークより一本鎖型ＤＮＡを調製した。

すなわち、白いプラークをつまようじの先端で釣り、大
腸菌ＪＭ　１０３が生育している１、５ｒｌ＋の２ＸＹ
Ｔ培養液（１，６％バタトトリブトン、１％酵母エキス
トラクト及び０．５％ＮａＣｊ２　）中に懸濁して３７
℃にて５時間培養し、そして培養液上清から、ポリエチ
レングリコール沈澱、フェノ−生処理及びエタノール沈
澱によって一本鎖組換体ファージＤＮＡを回収した。

得られた一本鎖１）ＮＡを鋳型としてメソンングらの方
法（文献２５）に従ってジデオキシ法により塩基配列を
決定し、クローニングされ八一本領Ｔ）Ｎへの配列を確
認した。第７図に示すように、コーディング鎖及びアン
チコーディング鎖が得られた。

２）オリゴヌクレオチドをプライマーとする二本鎖ＤＮ
Ａの合成（第８図） 上記のようにして得られた一木Ｉｆｆ　Ｄ　Ｎ　Ａの内
、クローン化されたアンチコーディング鎖を鋳型として
用い、合成オリゴヌクレオチド： ５’　　ＧＡＴＧＧＡＣＡＡ＾八ＧＣＣＣ３”へプライ
マー（１１として、ＤＮＡポリメラーゼ゛Ｋｌｅｎｏｗ
断片による修復反応を行った。すなわち、鋳型一本領Ｄ
　Ｎ　Ａ　０．５　ｐｍｏｌｅに５′末端を燐酸化した
プライマー２ｐｍｏｌｅを加え、そして７ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｊ２　　（ｐＨ７，５）　　、　０．１ｍＭ　　
ＥＤＴＡ　　、　　２　０ｍＭＮａＣｌ２及び７　ｍ　
Ｍ　ＭｇＣｊ！　２を含有する溶液１０μ１中で６０℃
にて２０分間インキュベーｌ〜し、続いて２３℃にて２
０分間インキュベートした。さらに、この反応混合物に
、ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰＸｄＴＴＰ及びｄＣＴＰをそれ
ぞれ０．５ｍＭになるように加え、全体を２０μｌとし
てＤＮＡポリメラーゼ旧ｃｎｏ＋＋断片２ユニットを加
え、そして２３℃にて２０分間インキュベートした。続
いて、１０ｍＭ　　ＡＴＰをｌμｌ及びＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ１ユニットを加え、１２°Ｃにて一晩インキユベー
トした。

３）Ｓｌヌクレアーゼによる消化 上記のようにして得られた二本鎖ＤＮＡからバックグラ
ウンドとなる未反応の一木１４　Ｄ　Ｎ　Ａを除去する
ために３１ヌクレアーゼによる消化を行った。すなわち
、上記反応液２μｌを２８０ｍＭ　ＮａＣｌ２．４．５
ｍＭ　ＺｎＣｊ！ｚ　、３０ｍＭ　Ｎａ０Ａｃ　（ｐｌ
＋４〜４．５）を含有する反応液２５μｌに溶解し、２
．３ユニツトのＳｌヌクレアーゼを加えて２６℃にて３
０分間処理した。反応後、０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（
Ｊ　（ｐＨｓ、　Ｏ）１０μｌを加えて反応を停止した
。

４）大腸菌ＪＭ　１０３の形質転換 」二記反応液１０μｌを用いてメソシング等の方法（文
献２５）に従い大腸菌ＪＭ　１０３を形質転換した。

５）変異体の検索 上記のようにして得られたファージプラークについて、
プライマーとして用いたオリゴヌクレオチド（３２Ｐで
標識したもの）をプローブとして用いて、プラークハイ
ブリダイゼーションによる変異体ファージのスクリーニ
ングを行った。すなわち、ヘントン・ディビス等の方法
（文献２６）に従って軟寒天培地からニトロセルロース
フィルターにプラークを移し、真空中８０°Ｃにて２時
間ベーキングした。このニトロセルロースフィルターを
６ＸＳＳＣ１１０ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液中で、３２ｐ
で標識したプライマーオリゴヌクレオチドをプローブと
して２３℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行った。

次に、このフィルターを６ＸＳＳＣ中で４゜６°Ｃにて
洗浄し、そしてオートラジオグラフィーを行い陽性シグ
ナルを示す変異体ファーシブラークを単離した。この変
異体ファージから変異２本鎖型ファージＤ　Ｎ　Ａ　（
ｐｍｌ）を得た。

６）変異体ＤＮＡの塩基配列の決定 変異体ファージＤＮＡを鋳型としてジデオキシ法により
塩基配列を決定し、−塩基置換変異が生じたことを確認
した。

実施例１で用いたものと同じ組換え体Ｍ１３ファージ一
本鎖ＤＮＡ　（ウロキナーゼ遺伝子のアンチコーディン
グ鎖がクローニングされている。）を鋳型として新たな
オリゴヌクレオチド変異原剤による部位特異的変異導入
をおこなった。但し、プライマー（２）として次の合成
オリゴヌクレオチド：５’ＧＧＡ出ＡＡＧＣＣＣＴＣＣ
ＴＣＴ　　３’を用いた。この１８塩基のオリゴヌクレ
オチドは一本鎖鋳型ＤＮＡ中のウロキナーゼ遺伝子と相
補的であるがリジンコドンΔΔΔがスレオニンコドンＡ
ＣＡへと一塩基のみ変化している。

このオリゴヌクレオチドをプライマーとして試験管内で
二本鎖ＤＮＡを合成した。すなわち、鋳型−末鎖Ｄ　Ｎ
　Ａ　０．５　ｐｍｏｌｅに５゛末端をリン酸化したプ
ライマー２　ｐｍｏｌｅを加え、そして７ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈ（Ｊ！　　（ｐＨ７，５）　　、　Ｏ，］　　ｍＭ
　　ＥＤＴＡ　　、　　２　０ｍＭＮａＣβ及び７ｍＭ
ＭｇＣｊ！２を含有する溶液１０μρ中で、６０℃にて
２０分間インキュベートし、続いて２３℃にて２０分間
インキュベートした。さらにこの反応混合物にｄＡＴＰ
、、ｄＧＴＰ、、ｄＴＴＰ、及びｃｌｃＴＰをそれぞれ
０．５ｍＭになるように加え、全体を２０μｌとしてＤ
ＮＡポリメラーゼ旧ｅｎｏｔｖ断片２ユニットを加え、
そして２３°Ｃにて２０分間インキュベートした。続い
て１０ｍＭ　　、ＡＴＰを１μβ及びＴ４ＤＮＡリガー
ゼ１ユニットを加え、１２”Ｃにて一晩インキユヘート
した。上記反応液を直接、メソシング等の方法（文献２
５）に従って大腸菌用１０３に形質転換した。このよう
にして上記反応液１μｐ当たり約１万個のファージプラ
ークが得られた。

得られたプラークを軟寒天培地からヘントン・ディビス
等の方法（文献２６）に従って二Ｉ・ロセルロースフィ
ルターに移したのち、真空中８０℃にて２時間ベーキン
グした。このニトロセルロースフィルターを６　Ｘ　Ｓ
　Ｓ　Ｃ，１０ＸＤｅｎｈａｒｄｔｌ液中で３２ｐで標
識したプライマーオリゴヌクレオチドをプローブとして
３７℃にて一晩パイプリダイゼーションを行った。次に
このフィルターを６×ＳＳＣ中で５２℃にて洗浄し、そ
してオー１トラジオグラフイーを行い陽性シグナルを示
す変異体ファージプラークを単離した。この変異体ファ
ージから変異体２本鎖型ファージＤ　Ｎ　Ａ　（ｐｍ２
）を得た。

変異体ＤＮＡの塩基配列は、変異体ファージＤＮＡを鋳
型とするジデオキシ法により塩基配列を決定し、目的と
する一塩基置換変異が生じたことを確認した。

同様にして、例えば下記の右欄の変異剤オリゴヌクレオ
チドを用いることにより、１３５番目のアミノ酸すジン
番こ代る下記左欄のアミノ酸をコードするコドンを導入
することができる。

」ぷ瀉げとＬ辷ん酸　　変菫清１オリゴヌクレオチドア
ラニン　　　　　　　５°ＧＡＴＧＧＡＧＣ八八ＡＧＣ
ＣＣ３’アスパラギン　　　　５’　ＧＡＴＧＧＡＡＡ
ＣＡＡＧＣＣＣ３“アスパラギン酸　　　　５　’　Ｇ
ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣ３’グルタミン酸　　　
　　５’　ＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＧＣＣＣ３゜フェニ
ルアラニン　　５’　ＧＡＴＧＧｌ１７Σ工」コ、へへ
ＧＣＣＣ３’グリシン　　　　　　　　５’　　ＧＡＴ
ＧＧＡＧＧＴＡＡＧＣＣＣ３’イソロイシン　　　　５
’　ＧＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＧＣＣＣ３”ロイシン　　
　　　　　５’　ＧＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＣＣＣ３’
メチオニン　　　　　５“ＧＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＧＣ
ＣＣ３’セリン　　　　　　　　５’　ＧＡＴＧＧＡＡ
ＧＣ八八ＧＣＣＣへへバリン　　　　　　　　　　５’
　　ＧＡＴＧＧＡＧＴＡＡＡＧＣＣＣ３’トリプトフア
ン　　　５°ＧＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣ３’チロ
シン　　　　　　５’　ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＡＧＣＣ
Ｃ３’プロリン　　　　　　　５’　ＧＡＴＧＧＡＣＣ
ＧＡＡＧＣＣＣ３”なお、上記のオリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いる点突然変異導入法に代えて、１３５番
目のリジンのコドンの代りに他のアミノ酸、例えばグル
タミン、スレオニン等のコドンを有するがその他のコド
ンが変化していないＤＮＡ断片を合成し、これを天然ｍ
ＲＮＡよりのｃＤＮＡの対応する部分と組換えることに
よっても変異を導入することができる。

前記のようにして得られた変異体ファージＤＮＡをＰｓ
ｔｌで切り出して変異した挿入部を得、これを完全なコ
ード領域の対応部分と置き換えた後、このコード領域を
例えば大腸菌用発現用ベクターに挿入し、これを大腸菌
に形質転換して該大腸菌を培養することにより、本発明
のポリペプチドを発現せしめることができる。

ＰＬプロモーター及びメタピロ力テカーゼ由来のＳＤ配
列を含むｐＹＴＵｌ　　（文献２７）をベクターとして
、ヒト腎臓由来のウロキナーゼｃＤＮＡ（ウロキナーゼ
のＮ端の複数個のアミノ酸のコドンが前記のとと（置換
されている）の発現プラスミドを作製した。すなわち、
１０μｇのプラスミドｐＹＴＵ　１を１０　ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＩＣ＃　（ｐＨ７，４）　　、７　ｍＭＭｇＣ
Ｊ　２及び１５０ｍＭ　Ｈａ（Ｊを含有する反応液１０
０μβ中で、１０ユニツトの）遅」及び１０ユニツトの
入射」を用いて３７°Ｃにて２時間消化し、アガロース
電気泳動により約４．５　Ｋ　ｂの盈旦１−八ａｔＩＩ
ペター断片を単離した。

一方、１０μｇのプラスミドｐＫＭＩＩｌを、１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ２　　（ｐＨ７，４）　、７ｍＭ　
ＭｇＣ７！ｚ及び６０　ｍ　Ｍ　ＮａＣｊ＋を含む反応
液ｔｏｏ、ｕｘ中にて、１０ユニツトのＤｒａｌにより
３７℃にて２時間消化し、次に０．６６ｍＭとなるよう
にＡＴＰを加え、５遅ｊリンカ−ＤＮＡ　（５’ＧＧＴ
ＣＧＡＣＣ３’）１μｇ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１００
ユニットを加えて１２℃にて一晩反応を行った。次に、
フェノール処理及びエタノール沈澱によってＤＮＡ断片
を回収し、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　　（ｐＨ７，
４）　、７ｍＭＭｇＣ＃　！及び１５０ｍＭ　ＮａＣｎ
を含有する反応液１００μｌ中で、１０ユニツトずつの
ＡａｔＨ及びΣ１■により３７℃にて２時間消化し、そ
してアガロース電気泳動によって約２．２　Ｋ　ｂのヒ
トウロキナーゼ遺伝子断片を単離した。これら２種類の
ＤＮＡ断片それぞれ１μｇを混合し、６６ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｊ！　　（ｐ）１７．４）　、７ｍＭ　Ｍｇ１Ｊ
！ｚ　、０．６６ｍＭ　　ＡＴＰ及び１０ｍＭジチオス
レイトールを含有する反応液２０μｌ中で１００ユニツ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼにより１２℃にて１晩連結反応
を行った。

この反応液を用いて大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換し、
形成されたコロニーをアルカリ溶菌法による迅速単離に
よりスクリーニングし、プラスミドｐＭＩＩＰｌを有す
るクローンを得た。この菌よりプラスミドＤＮＡを調製
した。

ス」Ｆ例〕ユ　プラスミドＭＵＰＩＩＩ＋の作　（１０
）ウロキナーゼのＮ末端から１３５番目のリジンのコド
ンＡＡＡがグルタミンのコドンＣＡＡに変異したｃＤＮ
Ａ断片を含有する変異体Ｍ１３ファージ二本鎖ＤＮＡと
、ＰＬプロモーター及びＣ２３０ＳＤ配列の下流にプロ
ウロキナーゼの構造遺伝子を有するプラスミドｐＭＵＰ
１を用いて、変異した遺伝子を含む大腸菌用発現プラス
ミドを作製した。

すなわち、１０μｇの変異体Ｍ１３１本鎖ＤＮＡ（７Ｂ
） をＰｓｔｌにより完全消化し、約１．２　Ｋ　ｂ断片を
単離した。

一方、１０μｇのプラスミドｐＭＵＰＩをＰｓｔｌによ
り部分消化し、約１．２　Ｋ　ｂ断片のみが除去された
約５．４　Ｋ　ｂの断片を単離した。

これらのそれぞれをフェノール処理及びエタノール沈澱
により回収した後混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
１２℃にて１晩連結反応を行い、反応混合物を用いて大
腸菌ＪＩＢ　１．０１を形質転換し、形成されたコロニ
ーをアルカリ溶菌法による迅速単離法によりスクリーニ
ングし、ｐＭｔｌＰｌｐｍを含むクローンを得た。この
プラスミドｐＭ［ＩＰｌｐｍが導入された大腸菌ニジエ
リシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉａ　ｃｏｌｉ）ｘ　１７
７６／ｐＭＵＰ１ｐｍは、１９８５年１月１１日に工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第８０４２号
（ＦＥＲＭＰ−Ｎｏ、８０４２）として寄託され、１９
８６年１月２．２日に徽工研条寄第２げ号（ＦＥＲＭ　
ＢＰ　Ｐｔｆ）としてブタベスト条約に基く国際寄託に
移管された。

プラスミドｐＭＵＰＬｐｍは本発明の代表的なプラスミ
ドであり、ＰＬプロモーター及びＣ２３０ＳＤ配列の下
流の適切な位置にヒトプロウロキナーゼ様ポリペプチド
をコードするコード領域を含有し、このコード領域にお
いては該ポリペプチドのＮ端の６・個のアミノ酸のコド
ンが大腸菌中で発現されやすいコドンにより置き換えら
れており、さらに１３５番目のアミノ酸であるリジンの
コドンＡＡＡがグルタミンのコドンＣＡＡに変えられて
いる。

大腸菌ｔａｃプロモーターの下流に上記点突然変異を有
するヒトープロウロキナーゼ＋ｔｉ造遺伝子を挿入した
発現型プラスミドｐＭＬＩＴ４Ｌｐｍ　２を以下のよう
にして作製した。

１０、ｌｊｇの変異体Ｍ１３１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｐｍ
２）をＰｓｔｌにより完全消化し、約１．２　Ｋ　ｂ断
片を単離した。一方、１０μｇのプラスミドｐＭＵＴ４
ＬをＰｓｔＩにより部分消化し、約１．２　Ｋ　ｂ断片
のみが除去された約４．６　Ｋ　ｂの断片を単離した。

これらのそれぞれをフェノール処理およびエタノール沈
澱により回収した後混合し、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼを
用いて１２℃にて一晩連結反応を行い、反応混合物を用
いて大腸菌ＨＢ　１０１を形質転換し、形成されたコロ
ニーをアルカリ溶菌法による迅速単離法によりスクリー
ニングし、ｐＭＵＴ４Ｌｐｍ　２を含むクローンを得た
。プラスミドｐＭＬＩＴ４Ｌｐｍ　２が導入された大腸
菌ニジエリシャ・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｔ）−χ１７７６／　ｐＭＩＩＴ４Ｌｐｍ２は、１９８
５年４月１８日に工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第８１８８号（ＦＥＲＭＰ−南８１８８号）と
して寄託され、１９８６年１月２２日に微工研条寄第９
７０号（ＦＥＲＭ　ＢＰ７２ｏ）としてブタペスト条約
に基（国際寄託に移管された。

プラスミドｐＭＵＴ４Ｌｐｍ　２もまた本発明の代表的
なプラスミドであり、ｔａｃプロモーターの下流の適切
な位置にヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドをコー
ドするコード領域を含有し、このコード領域においては
該ポリペプチドのＮ端の６個のアミノ酸のコドンが大腸
菌中で発現されやずいコドンにより置き換えられており
、さらに１３５番目のアミノ酸であるリジンのコドンＡ
ＡΔがスレオニンのコドンＡＣＡに変えられている。

プラスミドｐＫＹＵ２２及びファージＭ、１３ｎ＋ｐ８
二木鎖ＤＮＡそれぞれｌμｇずつを、１０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−Ｈ（Ｊ（ｐ）１７．５）　、７ｍＭ　ＭｇＣ＃ｚ
　、７ｍＭβ−メルカプトエタノール及び５０　ｍＭ　
ＮａＣｌ１を含有する溶液２０μｉ中で５ユニツトのＰ
ｓｔｌを用いて３７℃にて１時間消化した。フェノール
処理、エタノール沈澱によってそれぞれのＤＮＡ断片を
回収し、両者を混合した後、６．６　ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ
−ＩＩＣ４（ｐＨ７，５）、５ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｔ　、
５ｍＭ　　ＤＴＴ及び１ｍＭＡＴＰを含有する溶液２０
μβ中で１００ユニツトの７４ＤＮＡリガーゼを用いて
１２℃にて１６時間連結反応を行った。反応後、反応液
を用いてメッシング等の方法（文献２５）に従って大腸
菌ＪＭ１０３を形質転換し、０．０２％Ｘ−ｇａｌ及び
１ｍＶＩＰＴＧを含有する寒天と共にプレートシ、３７
°Ｃにて−晩培養した。組換え体によって形成された白
いプラークより一本鎖ＤＮＡを調製した。

得られた一本鎖ＤＮＡのいくつかを鋳型としてメッシン
グらの方法（文献２５）に従ってジデオキシ法により塩
基配列を決定し、クローニングされた一本鎖ＤＮＡの配
列を確認した。

（２）−・Ｃ１１７Ｅ−ので、− 前記のようにして得た組換え体Ｍ１３ファージ一本ｔｌ
ＮＡ（ウロキナーゼ遺伝子のアンチコーディング鎖がク
ローニングされている。）を鋳型として新たなオリゴヌ
クレオチド変異原剤による部位特異的変異導入をおこな
った。但し、プライマーとして次の合成オリゴヌクレオ
チド５’　　ＧＧＣＣＣＣＧＣＧＡＴＡＡＧ八ＴＴ八　
３゛を用いた。こへ１８へ基のオリゴヌクレオチドは一
本鎖鋳型ＤＮＡ中のウロキナーゼ遺伝子と相補的である
がフェニルアラニンコドンＴＴＴがアスパラギン酸コド
ンＧＡＴへと二塩基が変化している。

このオリゴヌクレオチド−をプライマーとして試験管内
で二本４５　Ｄ　Ｎ　Ａを合成した。すなわち、鋳型−
末鎖Ｄ　Ｎ　Ａ　０．５ｐｍｏｌｅに５′末端をリン酸
化したプライマー２ｐｍｏｌｅを加え、そして７　ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣ４（ｐ）１７．５）　　、　０．１　
　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　、　２　０　　ｍＭ　　ＮａＣ
７！及び７　ｍＭ　ＭｇＣＡ　ｚを含有するＮＨ３，１
Ｏｐｌ中で、６０℃にて２０分間インキュベートし、続
いて２３℃にて２０分間インキュベートした。さらにこ
の反応混合物にｄＡＴＰ、　ｔｌＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、
及びｄＣＴＰをそれぞれ０．５ｍＭの濃度になるように
加え、全体を２０μｌとしてＤＮＡポリメラーゼＫｌｅ
ｎｏｗ断片２ユニットを加え、そして２３℃にて２０分
間インキュベートした。続いて１０ｍＭ　　ＡＴＰを１
μｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１ユニッ（−を加え、１２
℃にて一晩インキユヘートした。上記反応液を直接、メ
ッシング等の方法（文献２５）に従って大腸菌ＪＭ　１
０３に形質転換した。このようにして上記反応液１μｌ
当たり約１万個のファージプラークが得られた。

得られたプラークを軟寒天培地からベントン・ディビス
等の方法（文献２６）に従ってニトロセルロースフィル
ターに移したのち、真空中８０℃にて２時間ベーキング
した。このニトロセルロースフィルターを６　Ｘ　Ｓ　
Ｓ　Ｃ，１０ＸＤｅｎｈａｒｄｔ溶液中で３２ｐで標識
したプライマーオリゴヌクレオチドをプローブとして３
７℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行った。次にこ
のフィルターを６×ＳＳＣ中で５２℃にて洗浄し、そし
てオートラジオグラフィーを行い陽性シグナルを示す変
異体ファージプラークを単離した。この変異体ファージ
から変異体２本鎖型ファージＤ　Ｎ　Ａ　（４ｍ３）を
得た。

、　変異体ＤＮＡの塩基配列は、変異体ファージＤＮＡ
を鋳型とするジデオキシ法により塩基配列を決定し、目
的とする一塩基置換変異が生じたことを確認した。

また変異剤として次のオリゴヌクレオチド：５’　　Ｇ
ＧＣＣＣＣＧＣＧＡＡ八八ＧＡＴＴ＾　３″へへいて、
１５７番目のアミノ酸フェニルアラニンのコドンＴＴＴ
をグルタミン酸のコドンＧＡＡに置きかえることもでき
る。

ス１１新ム７”ｔ　Ｚ　”ｚ　Ｆ　ＭＩ］Ｔ４Ｌｙｌノ
ｕｔ製大腸菌ｔａｃプロモーターの下流に上記点突然変
異を有するヒトウロキナーゼ構造遺伝子を挿入した発現
型プラスミドｐＭＵＴ４Ｌｐｍ　３を以下のようにして
作製した。

１０ｐｇの変異体Ｍ１３二木ｔｌ￥ＤＮＡ（４ｍ３）を
ＰｓｔＩにより完全消化し、約１．２　Ｋ　ｂ断片を単
離した。一方、１０’　／Ｊ　ｇのプラスミドＩｌ１Ｍ
ＩＪＴ４１１．を却■により部分消化し、約１．２　Ｋ
　ｂ断片のみが除去された約４．６　Ｋ　ｂの断片を単
離した。

これらのそれぞれをフェノール処理およびエタノール沈
澱により回収した後混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て１２℃にて一晩連結反応を行い、反応混合物を用いて
大腸菌）Ｉ８１０１を形質転換し、形成されたコロニー
をアルカリ溶菌法による迅速単離法によりスクリーニン
グし、ｐＭＵＴ４Ｌｐｍ　３を含むクローンを得た。プ
ラスミドｐＭＩＩＴ４Ｌｐｍ　３が導入された大腸菌ニ
ジエリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ皿旦）　　
Ｚ　１７７６／　ｐＭＵＴ４Ｌｐｍ　３が１９８５年７
月１１日に工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌
寄第８３４１号（ＦＥＲＭＰ−８３４１）として寄託さ
れ、１９８６年１月２２日に微工研条寄第２７／′号（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−、Ｐ７／）としてブタベスト条約に基
く国際寄託に移管される。

プラスミドｐＭＵＴ４Ｌｐｍ　３は本発明の代表的なプ
ラスミドであり、ｔａｃプロモーターの下流の適切な位
置にヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチドをコードす
るコード領域を含有し、このコード領域においては該ポ
リペプチドのＮ端の６個のアミノ酸のコドンが大腸菌中
で発現されやすいコドンに置き換えられており、さらに
１５７番目のアミノ酸であるフェニルアラニンのコドン
Ｔ　Ｔ　Ｔがアスパラギン酸のコドンＧＡＴに変えられ
ている。

夫旌拠■　プラスミド■Ｅｒ９忙隨」亀上上阿）５μｇ
のプラスミドｐＫＫ２２３−３と３０ユニツトの１印Ｒ
１及び２０ユニツトのＬｕ■を緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−Ｈ（Ｊ！　、、ｐＨ７，５，１０ｍＭＭｇＣｊ！
２．５０　ｍ　Ｍ　Ｎａ（Ｊ、１ｍＭ　　ＤＴＴ）１０
０　ｐＨ中、３７°Ｃで１時間反応させた。この反応液
を０．７％アガロース電気泳動にかけ、アンピシリン耐
性遺転子、複製開始領域及びｒｒｎＢＴ＋Ｔｚ転写終結
領域を含む約２６００塩基対のＤＮＡ断片を慣用法によ
って回収した。

この断片と１ユニツトのフレノウ断片とを緩衝液（５０
ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｊ！　ｐＨ７，２，１０ｍＭ　Ｍ
ｇ。

５０４．０．１　ｍＭ　　ＤＴＴ、　８０８Ｍ　ｄＮＴ
Ｐｓ）　２５μｌ中、２５℃で１時間反応させ、さらに
アルカリフォスファターゼ１ユニツトを加え、６８℃で
０．５時間反応させた。フェノール処理後エタノール沈
澱し、沈澱物を２０μ／ＴＥ緩衝液（１０ｍ　Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ４１Ｃｊ２　ｐＨ８，０，１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ）に
溶解した。

こうして得たＤＮＡ断片を（Ａ）とする。

一方、１０℃ｇのプラスミドｐｓＴＮ１６と２０ユニツ
トの−Ｃ１ａｌ及び２０ユニツトの及びＰｖｕＩＩとを
緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｊ！　ｐＨ７，５，１
０ｍＭＭｇｃ１ｇ、５０ｍＭ　ＮｓＣ７１１ｍＭ　　Ｄ
ＴＴ）１００／ｊβ中３７℃で１時間反応させた、この
反応液を０．７％アガロース電気泳動にかけ、トリプト
ファンオペロンのプロモーター、オペレーター及びリポ
ソーム結合部位を含む約３００塩基対の断片を慣用法（
８Ｂ） により回収した。

この断片と１ユニツトのフレノウ断片を緩衝液（５０ｍ
　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ＃　ｐＨ７，２、Ｉ　Ｏｍ　Ｍ　
Ｍｇ５ＯｎＯ，ｌ　ｍＭ　　ＤＴＴ、　８０．１７Ｍ　
ｄＮＴＰｓ）　２５　ｐｉ中２５℃で１時間反応させた
。フェノール処理後エタノール沈澱し、沈澱物を２０μ
ＪＴＥ緩衝液に溶解した。こうして得たＤＮＡ断片をＣ
Ｂ）とする。

ＤＮＡ断片（Ａ）０．５μｇ及びＤＮＡ断片〔ＢａＯ，
５μｇを緩衝液（６６ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｃｊ！　ｐＨ
７，６，６，６ｍＭ　Ｍｇｃｊｌ！、　、１０ｍＭ　　
ＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ）２０μｌ中Ｔ４ＤＮＡリガーゼ
２．５ユニツトと１５℃で１５時間反応させた。この反
応液を用いて、大腸菌ＨＢ　１０１株を形質転換し、ア
ンピシリン耐性菌の中から、ｐＫＫｔｒｐプラスミドを
有するコロニーをスクリーニングし、慣用法によりプラ
スミドを単離した。

ス崖■エ　プラスミドｔｒＵＫ２のイ　′」１ｕじｌ１
し プラスミドｐＫＫｔｒｐ及びｐｌ’１ＵＴ４Ｌを材料と
して、トリプトフアンプロモーターの下流にヒト−プロ
ウロキナーゼ遺伝子の挿入されたプラスミドｐｔｒｐＵ
Ｋ２を作成した。

すなわち１ｕｇのｐＫＫｔｒｐと５ユニツトのＥｃｏＲ
Ｉを緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｔｌｃｆｆ　ｐｔ（
Ｔ、　５、ｌｏｍＭＭｇ（Ｊ’ｚ　、５０ｍＭ　ＮａＣ
ｌ！、　１ｍＭ　　ＤＴＴ）５０μｌ中、３７℃で２時
間反応後、さらにアルカリホスファターゼ２ユニツトを
加えて６′５℃、３０分間反応した。フェノール処理、
エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した（Ｃ）。

一方１０　ｕ　ｇ　（７）ｐＭＵＴ４Ｌと２０　：Ｌ　
ニア　ト（７）　ＥＣ０ＲＩを上と同様の緩衝液、１０
０．ｕｎｔ中３７℃、２時間反応後１．２％アガロース
ゲル電気泳動によりヒトウロキナーゼ遺伝子のＮ末端部
分を含む６４０ｂｐ断片を単離したＣＤ）。

ＤＮＡ断片（Ｃ）及び（Ｄ）を緩衝液（６６ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−Ｈ（Ｊ　ｐＨ７、６，６，６ｍＭ　ＭｇＣｊ！ｚ
　、１０ｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰ）Ｉ　Ｏ，
ｃｉ中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２．５ユニツ）・と１２℃
で１５時間反応後大腸菌ＨＢ　１０１株に形質転換し、
アンビシリン耐性菌の中からｐｔｒｐＵＫ１プラスミド
を有するコロニーをスクリーニングし情用法によりプラ
スミドを単離した。　続いて１８ｇのｐｔｒｐＵＫｌ　
と５ユニツトの’Ｐｓｔｌを緩衝液（Ｉ　Ｏｍ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨｆＪ！ｐｌ＋７．５．１０ｍＭ　ＭｇＣ６ｚ
　、５０ｍＭ　ＮａＣ６，１ｍＭ　　ＤＴＴ）５０．ｃ
ｌｌ中子７°Ｃ２時間反応後、さらにアルカリホスファ
ターゼ２ユニツトを加えて６５°Ｃ１３０分間反応させ
たフェノール処理、及びエタノール沈澱によりＤＮＡを
回収した（Ｅ）。

一方、１０μｌのｐ　Ｍ　ＩＩ　Ｔ　４　Ｌと２０ユニ
ツトの江■を上と同様の緩衝液１００μρ中３７℃２時
間反応後、０．７％アガロースゲル電気泳動により、ヒ
トウロキナーゼ遺伝子のＣ末端部分を含む１．２　ｋｂ
断片を単離したＣＦ）。

ＤＮＡ断片（Ｅ）及びＣＦ）を緩衝液（６６ｍ　Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＪ　ｐｌ＋　７．６．６．６　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ６ｚ　、１０ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡ、ＴＰ）１０ｐｌ
中でＴ４ＤＮＡリガーゼ２．５ユニツトと１２°Ｃで１
５時間反応後、大腸菌Ｈ８１０１株に形質転換し、アン
ピシリン耐性菌の中からｐｔｒｐｌＪＫ２プラスミドを
有するコロニーをスクリーニングし、惧用法によりプラ
スミドを単離した。

災胤阻上隻　プ支７１．　Ｑ　）’ｐｔｒ吐録月月漫−
Δ作戊実施例１と同一の方法により、但しプライマーと
して次の合成オリゴヌクレオチド： ５　　’　　ＣＡＧＡＴＧＧＡＡＴＡＡＡＧＣＣ３’を
使用して、１３５位のリジンのコドンＡＡＡがイソロイ
シンのコドンへＴへに変異しているＤＮＡ断片が挿入さ
れた変異２木鎖型フアージＭ１３ＲＦ（１１３５）を得
た。

１０ｇｇのＭ１３ＲＦ　（ｒ１３５）をＬｕ１により完
全消化し、約１．２　ｋ　ｂ断片を単離した。一方、１
８ｇのｐｔｒｐｌＪＫ２をＰｓｔＴにより完全消化し、
ベクターとなるＤＮＡ断片約３．４　ｋ　））を中−離
した。これらのそれぞれをフェノール処理及びエタノー
ル沈澱により回収した後混合し、Ｔ４．ＤＮＡリガーゼ
を用いて１２℃にて一晩反応後大腸菌ＨＢ　１０１株に
形質転換してアンピシリン耐性コロニーの中カラｐｔｒ
ｐＵＫ２（１１３５）を含むクローンをスクリーニング
した。この方法の具体的な条件は実施例４に記載したも
のと同一であった。

このプラスミドを含有する大腸菌ニジエリシャ・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ）Ｗ　３１１０／
　ｐｔｒｐｔｌＫ２（１１３５）は、１９８５年１２月
２８日に、ＤＳ　Ｍ−３６２２としてＤｅｕｔｓｃｈｅ
　Ｓａｍｍｅｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍｅｎにブタペスト条約に暴き国際寄託された。

失隻桝上上　プラスミドｔｒＩＪＫ（Ｅ１３５）の実施
例１と同様の方法により、但しプライマーとして次の合
成ヌクレオチド： ５”　ＧＡＴＧＧＡＧＡ＾八八ＧＣＣＴ　　へへを使用
して、１３５位のリジンのコドンＡＡＡがグルタミン酸
のコドンＧＡＡに変異しているＤＮＡ断片が挿入された
変異２本鎖型ファージＭ１３ＲＦ（、Ｅ１３５）を得た
。

次に、このＭ１３ＲＦ　（１３５）とｐｔｒｐＵＫ２と
から、実施例１０に記載した方法と同様にしてプラスミ
ドｐ　ｔｔｐＵＫ２　（Ｅ１３５）を得た。

このプラスミドを含有する大腸菌ニジエリシャ・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊａ　ｃｏｌｔ）Ｗ　３１１０／ｐ
ｔｒｐｌＪＫ２（Ｅ１３５）は、１９８５年１２月２８
日に、ＤＳＭ−３６２１としててＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓ
ａｍｍｅｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓ
ｍｅｎに寄託された。

ｍ上ｌ　プラスミドｔｒ　ＵＫ２（Ｑ１３５Ｄ１５７）
の作成 実施例１と同様の方法により、但しプライマーとして次
の合成ヌクレオチド： ５’　　ＧＡＴＧＧＡＣＡＡ八八ＧＣＣＣへへを使用し
て、１３５位のリジンのコドンＡ’Ａへがグルタミンの
コドンＣＡ、Ａに変異しているＤＮＡ断片が挿入された
変異２本鎖型ファージを得た。

次にこのファージから、実施例１に記載されている方法
と同様にして１本領ファージＤＮＡを得、上記と同様に
して、但し、プライマーとして次の合成オリゴヌクレオ
チド： ５’　　ＧＧＣＣＣＣＧＣ凋＾ＡＧ八ＴＴ八　３゛へ使
用へて、１５７位のフェニルアラニンのコドンＴＴＴを
アスパラギン酸のコドンＧＡＴに変異させることにより
、１３５位のリジンのコドンＡＡＡがグルタミンのコド
ンＣＡＡに変異しており、且つ１５７位のフェニルアラ
ニンのコドンＴＴＴがアスパラギン酸のコドンＧＡＴに
変異しているＤＮＡ断片が挿入された変異２本鎖ファー
ジＭ１３ＲＦ（旧３５Ｉ）１５’７）を得た。

次に、このＭ１３ＲＦ　（Ｑ１３５Ｄ１５７）　　とｐ
ｔｒｐＵＫ２とから、実施例１０に記載した方法と同様
にしてけｐｔｌＫ２（［１１３５０１５７）を得た。

このプラスミドを含有する大腸菌ニジエリシャ・コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｗ　３１１０／ｐ
ｔｒｐＵＫ２（０１３５０１５７）は、１９８５年１２
月２８日に、Ｄ　Ｓ　Ｍ　−３６２３としてＤｅｕｔｓ
ｃｈｅ　Ｓａｍｍｅｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された。

実迦側ＬＬ板　プラスミドｔｒ　１ＩＸ２（Ｅ１３５Ｄ
１５７）実施例１２と同様にして、但し１３５位のリジ
ンのコドンをグルタミン酸のコドンＧＡＡに変異せしめ
るために次の合成ヌクレオチド： ５″　ＧＡＴＧＧＡＧ八八八八ＧＣへへへへ　３’を使
用して、１３５位のリジンのコドンＡＡＡがグルタミン
酸のコドンＧＡＡに変異しており、且つ１５７位のフェ
ニルアラニンのコドンＴＴＴがアスパラギン酸のコドン
ＧＡＴに変異しているＤＮＡ断片が挿入された変異２本
領ファージ旧３ＲＦ　（ｒ！１３５０１５７）を得た。

次に、このＭ１３ＲＦ（Ｅ１３５ｒｌ１５７）　とｔ　
ｒ　ｐ　ＩＩ　Ｋ　２とから、実施例１０に記載した方
法と同様にしてｔｒｐＨＫ２（Ｅ１３５Ｄ１５７）を得
た。

このプラスミドを含有する大腸菌ニジエリシャ・コリ（
ｆｉｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ）Ｗ　３１１０／
ｐｔｒｐＵＫ２（Ｅ１３５０１５７）は、１９８５年１
２月２８日に、Ｄ　Ｓ　Ｍ　−３６２４としてＤｅｕｔ
ｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｅｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏ
ｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された。

実施例３により得たプラスミドｐＭｔｌＰ１及び実施例
４により得たプラスミドｐＭＩＪＰ１ｐｍを大腸菌Ｗ３
１１０に慣用法に従って形質転換し、得られた形質転換
菌を５ｍｌのし一プロス中で３０℃にて培養し、６００
ｒ＋ｍにおける吸光度が約０．３になったとき培養液の
温度を４２℃に上昇さ−Ｕ、さらに３時間培養してウロ
キナーゼ遺伝子を発現・ｕしめた。

プ【】虹平１」−喝ユ　　　、からの云　産　の上記の
培養液５ｍｌから大腸菌Ｗ３１１０の菌体を集め、これ
を７．５Ｍ塩酸グアニジン及び０．０５ＭＴｒｉｓ−Ｈ
（Ｊ　　（ｐＨ７，５）を含有する溶液０．５ｍｌに懸
濁し、室温にて９０分間放置した。次に、この懸濁液を
１１００Ｏｒｐにて１０分間遠心分離し、上清１Ｍ塩酸
グアニジン、０．０５Ｍ　Ｔｒｉｓ’ＨＣＡ　　（ｐＨ
７，５）、２ｍＭ還元剤グルタチオン及び０．２ｍＭ酸
化型グルタチオンを含有する溶液５ｍｌに希釈し、そし
て室温にて一部インキユベートした。次にこれを、１０
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　　（ｐＦ１７．４）及び０．
４　Ｍ　ＮａＣｊ！を含有する容器１００倍容量に対し
て４℃にて４時間透析し、さらに１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＩＩＣ４（ｐＨ７，４）及び０．１　Ｍ　Ｍａｉｌを
含有する溶液１００倍容量に対して２時間透析した。

こうして得られた粗抽出物の一部に３０Ｍｇ／ｍβとな
るようにトリプシンを加え、３７℃にて１時間インキュ
ベートした。対照としてトリプシンの代りに水を加えた
ものを同様にインキュベートした。

これらを、レムリー等の方法に従って、１２．５％ポリ
アクリルアミド及び０．１％ＳＤＳを含有するゲルにお
いて電気泳動した。次に、ゲルを２．５％のＴｒｉ　ｔ
ｏｎＸ−１００に浸して室温１時間インキュベートした
後、フィブリン寒天プレート上に重層し、３７℃にて約
１時間又は２時間インキュベートし、フィブリン寒天プ
レート上の溶解ゾーンの位置から分子量を推定した。比
較のため人尿由来の標準ウロキナーゼも泳動せしめた。

第１３図において、レーン１は標準ウロキナーゼ（１ユ
ニツト）、レーン２はｐＭＵＰｌにより形質転換された
大腸菌からの粗抽出液、レーン３はｐＭＵＰｌにより形
質転換された大腸菌からの粗抽出液をトリプシンで処理
したもの、レーン４はｐＭＵＰｌｐｍにより形質転換さ
れた大腸菌からの粗抽出液、そして、レーン５はｐＭＵ
Ｐｌｐｍにより形質転換された大腸菌からの抽出液をト
リプシンで処理したもの、の泳動図である。

この図から明らかな通り、ｐＭＩＩＰＩに由来する遺転
子産物の分子量は約５万であるが、トリプシン処理によ
ってその一部分が分子量約３万に低分子化した。他方、
ｐＭＵＰｌｐｍに由来する遺伝子産物の分子量も約５万
であるが、トリプシン処理によって低分子化しなかった
。なお、これらの生成物の分子量約５万及び３万が人尿
由来の高分子ウロキナーゼの分子量約５，４万及び低分
子ウロキナーゼの分子量約３．３万に比べてやや低いの
は、大腸菌内では糖鎖の付加が生しないためであると思
われる。

実施■１五　プローウロキナーゼ策ポリペプチドの発現
層 実施例５により得たプラスミドｐＭＵＴ４Ｌｐｍ　２を
大腸菌ＪＭ　１０３に慣用法に従って形質転換し、得ら
れた形質転換菌を５ｍｌのＬ−ブロス中で３７℃にて培
養し、５５０　ｎｍにおける吸光度が約０．５になった
ときＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド）を最終濃度が１．ｍＭとなるように添加する
ことによって発現を誘導し、さらに３時間３７℃にて培
養することによりウロキナーゼ遺転子を発現せしめた。

上記の培養液５ｍｌを実施例１５に記載したのと同様の
方法により処理して粗抽出物を調製し、そして一部分を
トリプシンで処理した。

これらを、レムリー等の方法に従って、１０％ポリアク
リルアミド及び０．１％ＳＤＳを含有するゲルにおいて
電気泳動した。次に、ゲルを２．５％のＴｒｉ　ｔｏｎ
Ｘ−１００に浸して室温で１時間インキュベートした後
、フィブリン寒天プレート上に重層し、３７℃にて約２
時間イン４−ユベートし、フィブリン寒天プレート上の
熔解ゾーンの位置から分子量を推定した。比較のため人
尿由来の標準ウロキナーゼ、及び実施例１５で得られた
トリプシン処理物も泳動せしめた。

この結果を第１４図に示す、この間において、レーン１
は標準ウロキナーゼ（ｌユニット）、レーン２はｐＭｔ
ｌＰｌにより形質転換された大腸菌からの粗抽出液をト
リプシンで処理したもの、レーン３はｐＭＵＴ４Ｌｐｍ
２により形質転換された大腸菌からの粗抽出液をトリプ
シンで処理したもの、レーン４はｐＭＵＰｌｐｍにより
形質転換された大腸菌からの粗抽出液をトリプシンで処
理したもの、の泳動図である。

この図から明らかな通り、ｐＭＵＴ４１、ｐｍ２に由来
する遺伝子産物もｐＭＵＰｌｐｍに由来する遺伝子産物
と同様にトリプシン処理による低分子化が起こりにくい
ことがわかる。なお、これらの生成物の分子量約５万及
び約３万が人尿由来の高分子ウロキナーゼの分子量約５
，４万及び低分子ウロキナーゼの分子量約３．３万に比
べてやや低いのは、大腸菌内ではｔｉｔの付加が生じな
いためであると思われる。

災施拠上ｌ　プロウロ±ナーゼ様ポリペプチドの発現（
３） 実施例７により得たプラスミドｐＭＵＴ４Ｌｐｍ３を大
腸菌ＪＭ　１０３に慣用法に従って形質転換し、得られ
た形質転換菌を５ｍｌのし一ブロス中で３７℃にて培養
し、５５０　ｎｍにおける吸光度が約０．５になったと
きＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ
ラノシド）を最終濃度が１ｍＭとなるように添加するこ
とによって発現を誘＞７１−シ、さらに３時間３７℃に
て培養することによりウロキナーゼ遺伝子を発現せしめ
た。

上記の培養液５ｍｌから大腸菌ＪＭ　１０３の菌体を集
め、これを７．５Ｍ塩酸グアニジン及び、０．０５　Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐＨ７，５）を含有する溶液９．
５　ｍ　Ｉｌに懸濁し、室温にて９０分間放置した。次
に、この懸濁液を１００ＯｒｐＩｒｌにて１０分間遠心
分離し、上清を１Ｍ塩酸グアニジン、０．０５Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ４（Ｃｊ２　　（ｐ＋（７，５）　、２ｍＭ還元型
グルタチオン及び０．２ｍＭ酸化型グルタチオンを含有
する溶液５ｍｌに希釈し、そして室温にて一部インキユ
ベートした。次にこれを、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１
ｃＪ　　（ｐＨ７，４）及び０、４　Ｍ　ＮａＣ１を含
有する溶液１００倍容量に対して４℃にて４時間透析し
、さらに１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐＨ７，４
）及び０．１　Ｍ　Ｎａ（Ｊ！を含有する溶液１００倍
容量に対して２時間透析した。こうして得られた粗抽出
液を、抗ウロキナーゼモノクロナール抗体が結合したセ
ファロースカラムによるアフィニティークロマトグラフ
ィーを行なうことによって変異体（ｐｍ　３　）プロウ
ロキナーゼを精製した。

去旌炎１炙　プロウロキナーゼ柔ポリペプチドｎ里地 実施例１２及び１３によって得たプラスミドｐｔｒｐＨ
Ｋ　２＝＝（口１３５Ｄ１５７）及びｐｔｒｐＵＫ　２
　（Ｅ１３５．Ｄ１５７）を大腸菌Ｗ３１１０に慣用に
従って形質転換し、得られた形質転換菌を５ｍｐのＩ、
−ブロス中で３７℃にて培養し、５５０ｎｍにおける吸
光度が約０．５になったときＩＡＡ（インドール酢酸）
を最終濃度が５０μｇ／ｍｌｌになるように添加するこ
とによって発現を誘導し、さらに３時間３７°Ｃにて培
養することによってウロキナーゼ遺伝子を発現せしめた
。

上記の培養液のうち、ｐｔｒｐＵＫ　２　（口１３５０
１５７）に由来するもの５ｍ７１を実施例１９に記載し
たものと同様の方法により抽出・精製し、変異体（（１
１３５０１５７）プロウロキナーゼ様ポリペプチドを得
た。その一部を以下のようにトリプシンで処理した。サ
ンプルの酵素活性を合成基質法にて測定し、ｌ０ＱＩＵ
／ｍ４となるように５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（、ｐｌ
＋７．４　）、０．１５Ｍ食塩及び０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ−１００を含む溶液に希釈した。この溶液５０μｐ
に対して１■／ｍ７！、２ｒｒｇ／ｍｌ及び３．ｍｇｌ
ｍｅのトリプシン水溶液３μｌを加え、３７℃で６０分
間インキュへ一トシた。次いで５■／ｍＩ！、のダイズ
トリプシンインヒビター水溶液を５μｌ加えて反応を停
止した。対照としてトリプシンの代りに、水を加えたも
のを同様に処理した。

次いで、これらをレムリー等の方法に従って、０．１％
ＳＤＳを含有する１０％−２６％ポリアクリルアミド連
続濃度勾配ゲルにおいて、電気泳動した後、ゲルを２．
５％Ｔｒｉ　ｔｏｎ　Ｘ−１００に浸して室温で小一時
間インキュベートし、フィブリン寒天プレート上に重層
して、３７℃、２時間インキュベートし、フィブリン寒
天プレート上の溶解ゾーンの位置から分子量を推定した
。なお、比較のために、実施例１４によって得られた培
養液を実施例１９に記載したものと同様な方法により抽
出・精製して得た、天然型プロウロキナーゼ様ポリペプ
チド及び変異体（に１１３５）プロウロキナーゼ様ポリ
ペプチドについても同様な処理を行った。これらの結果
を第１６図に示す。この図において、レーン１，２．３
及び４はｐｌ’１ｔｌＰ　１に由来する天然型プロウロ
キナーゼ様ポリペプチドを、それぞれ０゜１．２及び３
■／ｍ７！のトリプシン水溶液を添加して処理したもの
の泳動間である。レーン５，６゜７及び８はｐＭＵＰｌ
ｐｍに由来する変異体（Ｑ　１３５）プロウロキナーゼ
様ポリペプチドを同様にトリプシン処理したものの泳動
図である。レーン９，１０゜１１及び１２は、ｐｔｒｐ
ｕＫ　２　（Ｑ１３５Ｄ１５７）に由来する変異体（０
１３５Ｄ１５７）プロウロキナーゼ様ポリペプチドを同
様にトリプシン処理したものの泳動図である。

この図から明らかな通り、ｐＭＵＰ　Ｉに由来する天然
型プロウロキナーゼ様ポリペプチドの分子量は約５万で
あるが、トリプシンにより、分子量３万に低分子化した
。一方、ｐＭ口Ｐｌｐｍ及びｐｔｒｐＵＫ　２　（Ｑ１
３５Ｔ］１５７）に由来する変異体プロウロキナーゼ様
ポリペプチドはトリプシン処理によって低分子化しなか
った。

灸考■上上　プラスミドＹＴＵＩの 工業技術院微生物工業技術研究所に、微工研菌寄第７７
７６号（ＦＥＲ１’１Ｐｌｔ７？７６）として寄託され
ているニジエリシャ・コリＨＢ　１０１／ｐ、ＨＴ　３
より５慣用の方法を用いてｐＨＴ３プラスミドを得た。

ｐｉ（Ｔ３プラスミド５μｇ及びＢａｍ■１１５Ｕを緩
衝液（１０ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　ｐＨ８，０，
７ｍＭ　ＭｇＣｊ２２．１００ｍＭ　ＮａＣ１１、２ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノール）２０μβ中で３時間反応
させた。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（５０ｒｎ
　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ！　ｐＨ７，２，１０ｍＭ　
Ｍｇ（１ｇ　、０．　］　ｍ、Ｍ　　ＤＴＴ、８０　ｐ
Ｍ　ｄＮＴＰ）　２０１！中、Ｋｌｏｎｏｗ断片１ニー
’−７トと、２２℃で０．５時間反応させた。フェノー
ル処理後、エタノール沈澱を行った。沈澱物を、緩衝液
（１０ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１（Ｊ　ｐＨ７，５，７ｍ
Ｍ　Ｍｇ（４４６０ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ　　β−メ
ルカプトエタノ−ル）２０μβ中、を憇１１２０ユニッ
トと３７℃で３時間反応させた。エタノール沈澱後、沈
澱物を緩衝液（６６ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１（ｊ！　ｐ
Ｈ７，６，６，６ｍＭＭｇＣ７！、、１０ｍＭ　　ＤＤ
Ｔ、１ｍＭ　　ＡＴＰ）２０μｌ中、リガーゼ２．８ユ
ニツトと１５℃で２００時間反応せた。この反応物を用
いて、ニジエリシャ・コリＨ８１６１株を形質転換させ
た。アンピシリン耐性形質転換株の中から、第１８図に
示すようなｐＨＴ３１プラスミドをもつ菌を単離した。

更に、慣用の方法を用いて、ｐＨ７３１プラスミドを得
た。

ｐｌ（Ｔ３１プラスミド１０μｇを緩衝液（１０ｍ　Ｍ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣ７！　ｐＨ７，５，７ｍＭ　Ｍｇ（Ｊ
！、　、５　Ｑｍ　Ｍ　ＮａＣ１，７ｍ　Ｍ　　β−メ
ルカプトエタノール）２０μρ中、Ａａｔｎ　２０ユニ
ツトと３７℃で３時間反応させた。エタノール沈澱後、
沈澱物を緩衝液（６７ｍ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＡ’　ｐ
ｌ＋　８．８．６．７　ｍ　Ｍ　ＭｇＣＩ！　２１０ｍ
Ｍ　　β−メルカプトエタノール、６．７ｍＭＩＥＤＴ
Ａ、　１６．６ｒｎＭ　　（ＮＨ３）ｚｓＯａ、　３３
０　　ｐＭ　　ｄＣＴＰ）　　　２　０μβ中、Ｔ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼ２．８ユニツトと３７℃で１５分間反
応させた。フェノール処理及びエタノール沈澱を行った
後、沈澱物を緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２　
ｐＨ１７，５，７ｍＭＭｇＣ７！ｚ、１５０ｍＭ、　　
ＮａＣｊ！　、０．２ｍＭ　　ＥＤＴＡ、　７ｍＭβ−
メルカプトエタノール）２０μρ中、Σ１■２０ユニッ
トと３７℃で３時間反応させた。このＤＮＡ反応液を１
．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、アンピシリン耐
性遺伝子及び複製開始領域を含む約３０００塩基対のＤ
ＮＡ断片を慣用手段により回収した。このＤＮＡ断片を
ＤＮＡ断片（Ａ）とする。

一方、ｐＨＴ３１プラスミド１０μｇを緩衝液（１００
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　ｐＨ７、５，７ｍＭ　　ｈ
Ｃ７！ｚ　、Ｍｇ−メルカプトエタノール）２０μβ中
、ＥｃｏＲ１３０ユニツトと３７゛Ｃで３時間反応させ
た。エタノール沈澱後、沈澱物を緩衝液（６７ｍ　Ｍ　
Ｔｒｉｓ−ＦＩＣＩＩ　ｐＨ８，８，６，７ｍＭ　Ｍｇ
Ｃ４２ｚ　、１０ｍＭ　　β−メルカプトエタノール、
６．７　ｍＭ　ＥＤＴＡ　、１６．６ｍＭ　（Ｎｕ山ｓ
ｏ、、３３０．ＩＪＭ　ｄｃＴＰ）　２０μβ中、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ２．８ユニツトと３７℃で１５分間
反応させた。フェノール処理及びエタノール沈澱を行っ
た後、沈澱物を緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＩＣ１ｐＨ
７，５，７ｍＭ　　ＭｇＣＮｚ、１５０ｍＭＮａＣｊ！
　ｚ　、０．２　ｍＭＥＤＴＡ、　　７　ｍＭ　　β−
メルカプトエタノール）２０μｌ中、Σａ１１２０ユニ
ットと３７℃で３時間反応させた。このＤＮＡ反応液を
、１．２％アガロースゲル電気泳動にかけ、ｃｌｔｓ及
びＰＬプロモーター・オペレーターを含む約２１００塩
基対のＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をＤＮＡ
断片断片Ｃ色する。ＤＮＡ断片（Ａ）０．５μｇ及びＤ
ＮＡ断片（Ｂ）０．５μｇを緩衝液（６６ｍ　Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｊ！　ｐＨ７，６，６，６ｍ　Ｍ　ＭｇＣｊ
！　ｚｌｏｍＭ　　ＤＴＴ、１ｍＭ　　ＡＴＰ）２０μ
ｍ、中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２．５ユニツトと１５℃で
１５時間反応させた。この反応液を用いて、ニジエリシ
ャ・コリＨＢＩＯＩ株を形質転換し、アンピシリン耐性
菌の中から第１１図に示したｐＹＴＵ１プラスミドをも
つコロニーをスクリーニングし、慣用手段によりプラス
ミドを単離した。

文献 （１）Ｍ、サママ１Ｍ、カスチル、０．マツオ。

Ｍ、ホイラエルッ及び１．Ｒ，リジネン（１９１１２）
　！−ロンボンシス・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍｂ、ｌ
ｌａｅｍｏｓｔａｓ）４７．３６−４０゜ （２）Ｅ、ライヒ等、ジャーナル・オブ・ビオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、）２５互
？２６２−７２６８　（１９８２）。

（３）Ｓ、Ｓ、フセイン、■、ダレウヘイチ、Ｂ。

リピンスキースロンボシス・ヘモスタシス（Ｔｈｒｏｍ
ｂ、Ｉ（ａｅｎｔｏｓｔａｓｉｓ）　４６＋ｌ］（１９
８１）。

（４）Ｖ、ブレウィッチ、Ｒ，パネル、Ｓ、リュイ、ジ
ャーナル・オブ・クリニカル・インベスライゲーション
（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、）７３＋　１７３１
−１７３９　（１９８４）。

（５）Ｃ，フラン、Ｌ、Ｓ、ホール、Ｇ、Ｈ，バーロー
１．１．Ｅ、　）リビー、バイオヒミカ・工・バイオフ
ィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏ
ｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ）４９６．３８４−４００（１
９７７）。

（６）Ｇ、Ｈ，パルロウ、ヨーロピアン・ウロキナーゼ
・シンポジウム（１！ｕｒ、　ｌ１ｒｏｋｉｎａｓｅ　
Ｓｙｍｐ、）（１９８１）　ｐ　１〜５゜ （７）Ｔ、スヤマ等、、Ｍｅｄ、Ｐｏｓｔｇｒａｄｕａ
ｔｅ、　１５＋５４７　（１９７７）　　。

（８）Ｇ、Ｊ、ステフェンス等、ホソベーセイラース・
ジ・フィジオロジカル・ケミストリー（Ｈｏｐｐｅ−５
ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、
）＋　３６３＋１０４３　（１９Ｂ２）。

（９）凱へ、ギャンツラー等、上記、　１０５５（１９
８２）。

（１０）特願昭５９−９７１０６明細書。

（１１）　Ｊ、Ｍ、チルゲイン等、バイオケミストリー
（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１８．５２９４　（１
９７９）。

（１２）　Ｈ，アビブ等、プロシーデインダス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス・オ
プ・ザ・ユナイテッド・ステイ゛ン（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、）　６９．１４０
８（１９７７）。

（１３）　Ｔ、マニアチス等、モレキャラ−・クローニ
ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ）１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　、　ニュー
ヨーク（１９８２）　、　２５４頁。

（１４）　１１．ｃ、ヒルンボイム等、ニュクレイソク
・アンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、）、　　７゜１５１３（１９７９）。

（１５）　Ｍ、グルンスタイン等、プロシーデインダス
・オプ・ザ・ナショナル・アカデミ−・。

オブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイ
ク（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　Ｌｌ、Ｓ
、Ａ、）。

互、　３９６Ｈ１９７５）。

（１６）　Ａ、マキサム等、メソズ・イン・エンチモロ
ギー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
、６５．４９９（１９８０）。

（１７）　Ｊ、メッシング、ニュークレイツク・アシズ
・リサ、−チ（ｔｌｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５
−）＋　　９　。

３０９　（１９８１）。

（１８）−ル、アガーワル等、ジャーナル・オプ・バイ
オロジカル・ケミストリー（Ｊ、１１ｉｏ＋、Ｃｈｅｗ
、）剣６．１０２３（１９８１）　。

（１９）　Ａ、Ｇ、ステフート等、ニュークレイツク・
アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、）、旦。

６５９７、（１９８３）。

（２０）特開、昭５９−５１３００゜ （２１）　Ｔ、イケムラ等、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　ｌｌａｒｂｏｒＳｙｍｐ、Ｑｕａｒｔ、　　Ｂｉｏｌ
、　　４７．　１０８７（１９８３）　　。

（２２）　　Ｊ、プロウシウス等、プラスミド（Ｐｌａ
ｓｍｉｄ）６、１１２（１９８１）。

（２３）　　　Ｊ、プロウシウス、ジーン（Ｇｅｎｅ）
２７゜１５１　（１９８４）。

（２４）　Ｊ、プロウシウス、ジーン（Ｇｅｎｅ）２７
．１６１（１９８４）。

（２５）　Ｊ、メソシング（１，９８３）、メソズ・イ
ン・エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｒｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ）　１０１＋２０−７８゜ （２６）　Ｗ、Ｄ、ベントン、Ｒ８帽デビス（１９７７
）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、　１９６　１
８０゜（２７）特ｉ１＠５９−２７４４７８明細書。

（２８）　Ｓ、　Ｍｉｚｕｓａｗａ、　ｅｔ、　ａｌ、
＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｉｊ　　Ｓ、Ａ、　　８０
　３５８（１９８３）。

（２９）ポール・ポーラエン・ハング特開昭５６−１５
８７９９明細書。

（３０）　Ｕ、　Ｋ、　　レムリー、ネイチ＋　−（Ｎ
ａｔｕｒｅ）２２７゜６８０　（１９８０）。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に関するプラスミドの系統図である。 第２図は、プラスミドｐＰＥ３の制限酵素地図を示す。 第３図は、プラスミドｐＰＥ３とプラスミドｐＫＹｔ１
２１からのプラスミドｐＫＹＵ２２の作製を示す。 第４−１図〜第４−３図は、ヒト−プロ５ウロキナーゼ
の全コード領域を含む天然ｍＲＮＡからのｃＤＮＡの塩
基配列を示す。 第５図は、プラスミドｐＫＹＵ２２と合成りＮＡオリゴ
マーからのプラスミドｐＫＭＵ　ｌの作製を示す。 第・６図は、プラスミドｐｌ（Ｆｌｕ　１とプラスミド
ｐＴｃＭ１からプラスミドｐＭ［ＩＴ４［、等を作製す
る過程を示亨。 第７図は、プラスミドｐＫＹｔ１２２及びファージＭ１
３ｐ　ｍ　８　ＲＦのＤＮＡからの１２００ｂｐ挿入部
を有する一末鎖ファージＤＮＡの作製を示す。 第８図はブライマーを用いる１３５位のアミノ酸のコド
ンへの点変異形成の方法を模式的に示す。 第９図は、プラスミドｐＹＴＵ　ｌ及びｐＫＭＵ　１か
らのプラスミドｐＭＵＰ１の作製を示す。 第１０図は、変異体ファージＭ１３二木鎖ＤＮＡ　（ｐ
ｍｌ）及びプラスミドｐＭ［ＩＰｌからのプラスミドｐ
ＭＬＩＰ１ｐｍの作製を示す。 第１１図はプラスミドｐｓＴＮ１６及びｐＫＫ２２３−
３からのプラスミドｐＫＫｔｒｐの作製を示す。 第１２図はプラスミドｐＫＫｔｒｐ及びｐＭＵＴ４Ｌｐ
ｍｌからのプラスミドｐｔｒＰＵＫ２の作製を示す。 第１３図、第１４図、及び第１６図は、大腸菌で発現さ
れたウロキナーゼのフィブリンオートグラフィーを示す
。 第１５図は天然型プロウロキナーゼと本発明の変異体（
ｐｍ３）プロウロキナーゼとをプラスミンによる活性化
について比較したグラフである。 第１７図はプラスミドｐＨ７３からのプラスミドｐｙＴ
ｕ　１の作製を示す。 第２図 ＰＩＩＥ　’ＩＮＩＲ’ｌ’ｌｌＲＩＬＩＥＧＬｔＪ　
ＡＳＮ　ＧＬＮ　ＰＲＯＴＲＩ’　Ｐｌ（Ｅ　ＭＡＡＩ
Ａ　ＩＩＥ　ＴＹＲＡＲＧＭむＨ工Ｓ　ＡＲＧ　ＧＬＹ
　ＧＩ、Ｙ　５ＥＲＶＡＩ　ｎ止ＴＹＲＶＡＬ　１Ｂ８
〜’ＡＣ八ＣＣＧＧ　ＧＧＧ　ＧＧＣＴＣｒ　ＧＴＣＡ
ＣＣＴＡＣＧＴＧＣＡＡ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　ｇ　ＭＧ　
ＴＩＴ　ＧＡＧ　ＧＩＧ　ＧＡＡ　７ＶＩＣＴＧＣＣＴ
ＧＯ：Ｃ’ＩＣＧ　ａ　ＴＡＴ　Ｍｅ　ＧＡＴ　ＣＣＣ
ＣへＧＣＡＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣ’ＩＣＴ　ＧＡＡ　Ｇ
ＴＣＡｃｅ　ＡＣＸ：：　ＡＡＡＸ１７７６に形質転換 俸 ＴＴＧ　ＣＴＣＧＡＧ　ＧＴＧ　ＧＴＣＣＡＡ　ＧＧＣ
ＡＧＣＢ豆Ｉ ５図 やル ｊｌ １晒ｌ ル　や プラスミン処理時間（＋） ０−０天然型グロウロキナーゼ（プラスミン濃度１０μ
ｇ／ｍｌ）・−・変異体（ｐＭＵＴ４Ｌ　ｐｍ３）プロ
ウロキナーゼ（プラスミン濃度１０μｇ　／ｍ／！　）
ムーム変異体（ｐＭＵＴ４Ｌμη３）プロウロキナーゼ
（プラスミン濃度２０μｇ／ｍ）園−腸変異体（ｐＭＬ
ＪＴ４Ｌｐｒ’ｎ３）プロウロキナーゼ（プラスミン婦
度５０μｇ／ｒｎ１．）俸１５図 １　２　３　４　５６　７　８．９　１０１１１２・−
０←３０に 第１６国 手続補正書（自発） 昭和６１年４月２４．日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 昭和６１年特許願第０１２９８４号 ２、発明の名称 安定化されたヒト−プ１：Ｉウロキナーゼ３、補正をす
る者 事件との関係　　　特許出願人・′ 名称　財団法人　相模中央化学研究所 名称　（２２０，＞　セントラル４ｙ１子株式会社名称
　（５３１）保土谷化学工業株式会社名称　（４３０）
日本曹達株式会社 ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、
補正の対象 （１）明細書の「発明の詳細な説明」の欄。 （２）明細書の「図面の簡単な説明」の欄。 （３）図面。 ６、補正の内容 （１）■明細書第一４９頁第１５行目と第一１６行目と
の間に次の記載を加入する。 「なお、本発明に従って１５７位のアミノ酸が置換され
たプロウロキナーゼ様ポリペプチドは、生体内に投与さ
れた場合、活性化されるまでにかなりの時間がかかり、
且つ効果が持続性であるため、血栓形成に対する予防薬
としても有望である。Ｊ ■　同第１０６頁第４行目と第５行目の間に次の記載を
加入する。 実施例２０によって得られたウロキナーゼ遺伝子産物を
含む培養液を、それぞれ実施例１９に記載したものと同
様の方法により抽出・精製し、変異体（０１３５０１５
７）プロウロキナーゼ様ポリペプチドを得た。次いでヒ
ト正常血漿に、変異体（Ｑ１３５Ｄ１５７）プロウロキ
ナーゼ様ポリペプチド（０，２■／　ｍ　ｊ！　）を１
７９体積加え、３７℃でインキユベートした。０．２及
び５時間後にその一部をとり、５０倍希釈した。 次いでその１６μｌをレムリー等の方法に従って、０．
１％Ｓ　Ｄ、”Ｓを含有する１０％−２６％ポリアクリ
ルアミド連続濃度勾配ゲルにおいて、電気泳動した後、
ゲルを２．５％Ｔｒｉ　ｔｏｎＸ−１００に浸して室温
で小一時間インキュベートし、フィブリン寒天プレート
上に重層して、３７℃、２時間インキュベートし、フィ
ブリン寒天プレート上の溶解ゾーンの位置から分子量を
推定した。なお、比較のために、実施例１４によって得
られた培養液を実施例１９に記載したものと同様な方法
により抽出・精製して得た、天然型プロウロキナーゼ様
ポリペプチド及び変異体（Ｑ１３５）プロウロキナーゼ
様ポリペプチドについても同様な処理を行つた。これら
の結果を図１８に示す。この図においてレーン１．２及
び３はｐＭＵＰ　１に由来する天然型プロウロキナーゼ
様ポリペプチドを、血漿中でそれぞれ０．２及び５時間
インキュベートしたものの泳動図である。レーン４゜５
及び６はｐＭＵＰ　ｌ　ｐｍに由来する変異体（０１３
５）プロウロキナーゼ様ポリペプチドを同様に処理した
ものの泳動図である。また、レーン７゜８及び９はｐｔ
ｒｐＵＫ　２　（旧３５１１１５７）に由来する変異体
（Ｑ１３５１）１５７）プロウロキナーゼ様ポリペプチ
ドを同様に処理したものの泳動図である。 この図から明らかな通り、天然型プロウロキナーゼ様ポ
リペプチド及び変異体（Ｑ１３５）プロウロキナーゼ様
ポリペプチドは、血漿成分と高分子複合体を形成して、
本来の５０にダルトこの位置の溶解ゾーンが減少した。 一方、変異体（Ｑ１３５Ｄ１５７）プロウロキナーゼ様
ポリペプチドは、血漿中において高分子複合体を形成せ
ず、溶解ゾーンの減少が見られなかった。Ｊ（２）明細
書第１１５頁第１６行目の次に下記の記載を加入する。 「第１８図は、本発明のプロウロキナーゼ様ポリペプチ
ドとヒト正常血漿成分との複合体の形成を示す電気泳動
図であって、フィブリン寒天上での溶解ゾーンを示すも
のである。」（３）別紙の第１８図を追加する。 ７、添付書類の目録 （１）第１８図　　　　　　　１通 −８ｆ ０に２０　　““′ ○　乙・　　　−にン ５０に一□ｇｘｐｍｍ−・・・Ｏ 第１８図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の一般式； ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍｅｔは場合によっては存在するメチオニンで
   あり、ＳｅｒはＮ−末端の１位に存在するセリンであり
   、Ｘは１３５位に存在するリジン、又は塩基性アミノ酸
   以外のアミノ酸であり、Ｙは１５７位に存在するフェニ
   ルアラニン又は酸性アミノ酸であり、そして横線部分は
   天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列の対応する
   部分と同一のアミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジン
   である場合にはＹはフェニルアラニンではない、）で表
   わされるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のアミノ
   酸配列を有する安定化されたヒト−プロウロキナーゼ様
   ポリペプチド。 ２、前記Ｘがアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸
   、グルタミン、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリ
   シン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、セリン、
   スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン及びプ
   ロリンから成る群から選択される天然アミノ酸である特
   許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ３、前記Ｘがアスパラギン及びグルタミンから成る群か
   ら選択される酸性アミノ酸のアミドである特許請求の範
   囲第１項に記載のポリペプチド。 ４、前記Ｘがセリン及びスレオニンから成る群から選択
   されるヒドロキシアミノ酸である特許請求の範囲第１項
   記載のポリペプチド。 ５、前記Ｘがグルタミン酸及びアスパラギン酸から成る
   群から選択される酸性アミノ酸である特許請求の範囲第
   １項記載のポリペプチド。 ６、前記Ｘがイソロイシン、ロイシン及びバリンから成
   る群から選択される分枝鎖中性アミノ酸である特許請求
   の範囲第１項記載のポリペプチド。 ７、前記Ｙがアスパラギン酸又はグルタミン酸である特
   許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ８、前記Ｘがグルタミンであり、そして前記Ｙがフェニ
   ルアラニンである特許請求の範囲第１項記載のポリペプ
   チド。 ９、前記Ｘがスレオニンであり、そして前記Ｙがフェニ
   ルアラニンである特許請求の範囲第１項記載のポリペプ
   チド。 １０、前記Ｘがグルタミン酸であり、そして前記Ｙがフ
   ェニルアラニンである特許請求の範囲第１項記載のポリ
   ペプチド。 １１、前記Ｘがイソロイシンであり、そして前記Ｙがフ
   ェニルアラニンである特許請求の範囲第１項記載のポリ
   ペプチド。 １２、前記Ｘがリジンであり、そして前記Ｙがアスパラ
   ギン酸である特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド
   。 １３、Ｘがグルタミン酸であり、そしてＹがアスパラギ
   ン酸である特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド
   。 １４、Ｘがグルタミンであり、そしてＹがアスパラギン
   酸である特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 １５、前記天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列
   がヒト−腎臓由来のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡにより
   コードされているアミノ酸配列である特許請求の範囲第
   １項記載のポリペプチド。 １６、次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍｅｔは場合によっては存在するメチオニンで
   あり、ＳｅｒはＮ−末端の１位に存在するセリンであり
   、Ｘは１３５位に存在するリジン、又は塩基性アミノ酸
   以外のアミノ酸であり、Ｙは１５７位に存在するフェニ
   ルアラニン又は酸性アミノ酸であり、そして横線部分は
   天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列の対応する
   部分と同一のアミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジン
   である場合にはＹはフェニルアラニンではない、）で表
   わされるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のアミノ
   酸配列を有するヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチド
   をコードするＤＮＡセグメント。 １７、Ｎ−末端の複数個のアミノ酸をコードするコドン
   が大腸菌中で高頻度で使用されるコドンであり、そして
   前記Ｎ−末端の複数個のアミノ酸並びに前記Ｘ及びＹを
   コードするコドン以外のコドンがヒト−腎臓由来のｍＲ
   ＮＡに対応するｃＤＮＡ中の対応するアミノ酸のコドン
   と同一である特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡセグ
   メント。 １８、前記Ｎ−末端の複数個のアミノ酸をコードするコ
   ドンが次のコドン： から成る特許請求の範囲第１６項記載のＤＮＡセグメン
   ト。 １９、前記大腸菌において高頻度で使用されるコドンが
   、Ｎ端のコード領域において、逆向き繰り返し配列を構
   成しないように選択されている特許請求の範囲第１７項
   記載のＤＮＡセグメント。 ２０、Ｘがグルタミンである場合、これがコドンＣＡＡ
   でコードされており；Ｘがスレオニンである場合、これ
   がコドンＡＣＡによりコードされており；Ｘがグルタミ
   ン酸である場合、これがコドンＧＡＡによりコードされ
   ており、Ｘがイソロイシンである場合、これがコドンＡ
   ＴＡによりコードされており；Ｙがアスパラギン酸であ
   る場合、これがコドンＧＡＴでコードされており；そし
   てＹがグルタミン酸である場合、これがコドンＧＡＡに
   よりコードされている特許請求の範囲第１６項に記載の
   ＤＮＡセグメント。 ２１、次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍｅｔは場合によっては存在するメチオニンで
   あり、ＳｅｒはＮ−末端の１位に存在するセリンであり
   、Ｘは１３５位に存在するリジン、又は塩基性アミノ酸
   以外のアミノ酸であり、Ｙは１５７位に存在するフェニ
   ルアラニン又は酸性アミノ酸であり、そして横線部分は
   天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列の対応する
   部分と同一のアミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジン
   である場合にはＹはフェニルアラニンではない、）で表
   わされるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のアミノ
   酸配列を有するヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチド
   をコードするＤＮＡセグメント、前記プロウロキナーゼ
   様ポリペプチドの発現のための制御領域、及び大腸菌中
   で複製するのに必要なＤＮＡ配列を含有するプラスミド
   。 ２２、前記発現のための制御領域として、ｔａｃプロモ
   ータ／オペレーター、ｔｒｐプロモータ／オペレーター
   、又はＰ＿Ｌプロモータ／オペレーター、並びにシュー
   ドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄ
   ａ）由来のメタピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２３０）のＳ
   Ｄ配列を含有し、大腸菌中でプロウロキナーゼ様ポリペ
   プチドを発現することができる特許請求の範囲第２１項
   記載のプラスミド。 ２３、前記プロウロキナーゼ様ポリペプチドのＮ−末端
   の複数個のアミノ酸が大腸菌において高頻度で使用され
   るコドンによりコードされており、このコドンが、ｍＲ
   ＮＡレベルにおいて、メタピロカテカーゼ遺伝子（Ｃ２
   ３０）のＳＤ配列付近の塩基配列とプロウロキナーゼ遺
   伝子の５′端の塩基配列とが相補的構造を有しないよう
   に選択されている特許請求の範囲第２２項記載のプラス
   ミド。 ２４、次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍｅｔは場合によっては存在するメチオニンで
   あり、ＳｅｒはＮ−末端の１位に存在するセリンであり
   、Ｘは１３５位に存在するリジン、又は塩基性アミノ酸
   以外のアミノ酸であり、Ｙは１５７位に存在するフェニ
   ルアラニン又は酸性アミノ酸であり、そして横線部分は
   天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列の対応する
   部分と同一のアミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジン
   である場合にはＹはフェニルアラニンではない、）で表
   わされるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のアミノ
   酸配列を有するヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチド
   をコードするＤＮＡセグメント、前記プロウロキナーゼ
   様ポリペプチドの発現のための制御領域、及び大腸菌中
   で複製するのに必要な塩基配列を含有するプラスミドが
   導入された大腸菌。 ２５、次の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｍｅｔは場合によっては存在するメチオニンで
   あり、ＳｅｒはＮ−末端の１位に存在するセリンであり
   、Ｘは１３５位に存在するリジン、又は塩基性アミノ酸
   以外のアミノ酸であり、Ｙは１５７位に存在するフェニ
   ルアラニン又は酸性アミノ酸であり、そして横線部分は
   天然ヒト−プロウロキナーゼのアミノ酸配列の対応する
   部分と同一のアミノ酸配列であるが、但し、Ｘがリジン
   である場合にはＹはフェニルアラニンではない、）で表
   わされるアミノ酸配列、又はこれと実質上同一のアミノ
   酸配列を有するヒト−プロウロキナーゼ様ポリペプチド
   の製造方法であって、該プロウロキナーゼ様ポリペプチ
   ドをコードするコードＤＮＡセグメント、該プロウロキ
   ナーゼ様ポリペプチドを大腸菌中で発現せしめるのに必
   要な発現制御領域及び大腸菌中で複製するために必要な
   領域を含有するプラスミドにより形質転換された大腸菌
   を培養し、培養菌体からプロウロキナーゼ様ポリペプチ
   ドを採取することを特徴とする方法。