CN1225126A - 多肽的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在YAP3蛋白酶活性有所降低的基因改造酵母细胞中生产短链多肽的一种新方法,这些短链多肽包括具有多达三个二硫键并且/或者具有富含碱性氨基酸残基的结构的多肽,以及具有开放结构的短链多肽,如胰高血糖素、胰高血糖素样肽和它们的功能性类似物。本发明还进一步包括经基因改造的酵母细胞,以及制备所述酵母细胞的方法。

Description

多肽的生产方法
                    发明领域
本发明涉及在基因改造酵母细胞中生产短链多肽的一种新方法，这些多肽链包括具有多达三个二硫键并且/或者具有富含碱性氨基酸残基的结构的多肽，以及具有开放结构的短链多肽，例如胰高血糖素、胰高血糖素样肽和它们的功能类似物，所述基因改造酵母细胞，和制备所说酵母细胞的方法。
                    发明背景
对于许多种类的多肽，例如胰高血糖素、胰高血糖素样肽和它们的功能类似物来说，用包含编码所说蛋白质之DNA序列的合适表达载体转化酵母细胞后，已在酵母中成功地对这些异源蛋白质进行了表达。由于其稳定的产量和安全性，优选酵母特别是酿酒酵母作为生产具有药用价值之多肽的宿主微生物。
但是，人们常发现表达产物是具有不同氨基酸链长的各种目的多肽前体的异源混合物。许多可被pep4基因产物激活的蛋白酶导致了酵母蛋白质的降解。常利用诸如pep4-3突变之类在PEP4基因上的突变减少细胞的蛋白酶解作用以使我们感兴趣的异源蛋白质产量和质量都可得到提高。EP341215描述了将缺少羧肽酶yscα活性的酵母菌株用于异源蛋白水蛭素的表达中。由于内源性酵母蛋白酶对初始表达产物的翻译后作用，野生型酵母菌株产生了在C末端序列各不相同的各种脱硫水蛭素(desulphatohirudin)的混合物。而缺乏羧肽酶yscα活性的酵母突变菌株不能从异源蛋白质的C末端除去氨基酸，因此产生的是完整蛋白质。
利用缺乏蛋白酶A、B、Y和/或S活性的酵母菌株只能部分地降低外源基因产物的随机蛋白酶解。
在酵母中表达异源蛋白质所遇到的另一问题是产率低，这可能是由于在蛋白质内部位点的异常加工引起了胞内区室内和质膜上的蛋白酶解加工，例如，人甲状旁腺素的分泌(Gabrielsen等，基因，90:255-262,1990；Rokkones等，生物技术杂志，33:293-306,1994)，以及酿酒酵母中β-内啡肽的分泌(Bitter等人，美国国家科学院院报，81:5330-5334,1984)。有的多肽，如具有大约10-55个氨基酸或更短链，并且没有二硫键或有一些二硫键，而且/或者富含碱性氨基酸的多肽，如β-内啡肽、胰高血糖素和胰高血糖素样肽，当在异源宿主中表达时，由于它们具有短链开放并且不稳定的结构，因而可能对胞内、胞外的蛋白酶解降解特别敏感，从而产生不均一的产物。
WO95/23857公开了重组型人白蛋白(rHA)在酵母细胞中的生产，该蛋白质是一种非常大的载体型蛋白质，通过17个二硫键交联，分子量约66KD，所述酵母细胞中酵母天冬氨酰蛋白酶(Yap3p)的蛋白酶解活性水平有所降低，而使不需要的45kD rHA片段的水平有所降低，并且与相应的单倍体YAP3野生型酵母株中产生的rHA相比，单倍体Δyap3酵母株产生的回收rHA的产率提高了30-50％。
在此之前，Bourbonnais等人(Biochimie 76:226-233,1994)已指出尽管YAP3蛋白酶基因产物与Kex2p的底物专一性有重叠，但其在体外有独特的底物专一性，他们还指出Yap3p专一地切割促生长素抑制素原(prosomatostatin)中潜在加工位点处存在的精氨酸C-末端。此外，Cawley等人(生物化学杂志，271:4168-4176,1996)已测定了Yap3p在许多激素原底物如牛胰岛素原中切割单一或成对碱性残基加工位点的体外专一性及相对效率。
本发明的目的是提供一种在酵母表达系统中生产分泌多肽的改进方法，所述多肽在多肽链中具有多达约55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并在结构中具有0到3个二硫键，优选不超过一个二硫键。优选的多肽例子是胰高血糖素和胰高血糖素样肽、CRF以及截短的和/或C末端或N末端截短的和/或N末端延伸形式的可卡因苯异丙胺调节的转录物(cocaine amphetamine regulated transcript,CART)。更可取的是，本发明多肽的产量有相当大的提高，例如与常规酵母表达系统相比，所说多肽的产量高两倍以上。
在二倍体酵母培养物中生产异源多肽常常是有利的，这是因为在单倍体酵母培养物例如生产规模的连续发酵物中某些遗传缺损可能会在表型上表现出来，另一个原因是二倍体中多肽产量可能比单倍体中要高一些(Fu等人，生物技术进展，12:145-148,1996；Mead等人，生物技术信件(Biotechnol.Letters),8:391-396,1986)。
使用本发明方法生产符合上述标准的其它多肽对本领域技术人员而言是显而易见的，这些多肽包括诸如胰岛素和胰岛素类似物、促肾上腺皮质激素、血管紧张肽原、心房肽、强啡肽、内啡肽、galanin、胃泌素、胃泌素释放肽、神经肽Y片段、胰抑制素、胰多肽、促胰液素、血管活性肠肽、生长激素释放因子、促黑素细胞激素、神经降压素、肾上腺肽、甲状旁腺激素和相关肽、促生长素抑制素及相关肽、脑钠尿肽、降钙素、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)(参看本文SEQ ID NO:3)、胸腺素和硬骨鱼紧张肽；还有这些肽和其它多肽的同源或其它方面的相关肽以及片段(如EEID-CART55-102，参看本文SEQ ID NO:2)，只要符合一定的标准，即该多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键。
                         发明概述
可利用本发明的方案达到上述确定的目的，该方法包括培养酵母，所述酵母中Yap3蛋白酶(Yap3p)或其同系物的活性有所降低，该酵母已被含有与编码一种多肽之DNA序列可操作性地相连的酵母启动子的杂合载体所转化，所述多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键，例如胰高血糖素或胰高血糖素样肽；以及分离所述多肽。更可取的是，该酵母细胞通过YAP3基因的破坏而缺乏Yap3p活性。
利用已破坏YAP3的酵母株生产多肽可导致其产率比相应的YAP3野生型酵母株明显提高约达2倍，甚至可达10倍，所述多肽在多肽链中具有1-70个氨基酸，优选1-40个氨基酸，更优选10-30个氨基酸，并在结构中具有不超过一个二硫键，例如由胰高血糖素前体基因编码的多肽，包括胰高血糖素、GRPP、GLP-1、GLP-2和它们的功能类似物。已发现用已破坏YAP3的酵母株生产异源多肽可使该异源多肽产率比利用相应的YAP3野生型酵母株获得的产率明显提高约达2倍，甚至可达10倍，所述异源多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键。这种多肽的例子有由胰高血糖素前体基因编码的多肽，包括胰高血糖素、GRPP、GLP-1、GLP-2和它们的功能类似物，或CRF，如本文中SEQ ID NO:3所示，或CART截短的和/或N-末端延伸的形式，优选本文SEQ ID NO:2所示的EEID-CART55- 102。利用本发明方法生产异源多肽的另一有利之处是，由于降低了蛋白酶解的降解水平，因而分泌产物的均一性得到了提高。
本发明人还发现，本发明方法中利用已破坏YAP3的二倍体酵母可大大提高分泌型异源多肽产量水平，与相应的野生型单倍体酵母的产率水平相比提高约2倍，甚至可达9倍。
适宜地，此酵母是缺乏功能性YAP3基因的酿酒酵母。然而，其它酵母属也可能含有等效的蛋白酶，即Yap3p同系物，如WO95/23857和Clerc等(色谱学杂志，B.662:245-259,1994)中所示的毕赤酵母属和克鲁维酵母属。通常说来，如果一个基因的翻译产物序列与Yap3p有50％以上相同，则该基因就被认为是Yap3p的同系物。Komano和Fuller(美国国家科学院院报，92:10752-10756,1995)已从酿酒酵母中鉴定出了Mkc7天冬氨酰蛋白酶，该蛋白酶与Yap3p比较相近(53％相同)。酵母的其它天冬氨酰蛋白酶包括PEP4、BAR1的基因产物，序列与YAP3开放阅读框架部分同源的开放阅读框架的基因产物，例如YAP3-link(由GenBank acc.NO.X89514：位置25352-26878所编码)、YIV9(Swiss Prot acc.NO.P40583)和天冬氨酰蛋白酶(Ⅳ)(由GenBank acc.NO.U28372：位置326-2116所编码)。按照最近接受的酵母基因组命名，在此提到的酵母基因名称YAP3、YAP3 link、YIV9、NO4和MKC7分别对应于酵母的开放阅读框架YLR120C、YLR121C、YIR039C、YDR349C和YDR144C。此外，开放阅读框架YGL259W的基因产物也包括在酵母天冬氨酰蛋白酶内。
酵母的例子有酿酒酵母，克鲁弗酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克鲁维酵母，多形汉逊酵母，巴斯德毕赤酵母，Pichia methanolica，克鲁弗毕赤酵母，Yarrowia lipolytica，假丝酵母，产朊假丝酵母，可可假丝酵母，地霉和Geotrichum fermentans。
去除蛋白酶活性的一个合适途径是破坏编码该蛋白酶的宿主基因，从而产生不可回复地丢失了编码该蛋白酶之基因的全部或部分(包括调节和/或编码区)的菌株，或者另一种方法是，可通过传统的诱变方法或引入特异点突变来降低或去除蛋白酶活性。其它可适于降低蛋白酶活性的办法包括在酵母中引入反义和/或核酶构建体，如Atkins等(反义和发育，5:295-305,1995)和Nasr等(分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.),249:51-57,1995)。破坏本发明方法中所用酵母株内YAP3基因的一个可取方法已由Rothstein作了描述(酶学方法，194:281-301,1991)。
本文所用词语“胰高血糖素或胰高血糖素样肽”可以是来源于人类或其它动物，以及重组体或半合成来源，它们包括胰高血糖素家族所有成员，如GRPP(胰高血糖素样肽相关多肽)、胰高血糖素、GLP-1(胰高血糖素样肽1)和GLP-2(胰高血糖素样肽2)，其中包括截短和/或N-末端延伸的形式，如GLP-1(7-36)；还包括类似物，如GLP-1(7-35)R36A GLP-2 F22Y,GLP-2 A19T+34Y.GLP-2 A2G和GLP-2 A19T，及具有1-3个氨基酸改变、添加或/和缺失的其它类似物。用于本发明多肽表达的cDNA包括优化了密码子的形式以在酵母中表达。
整个说明书和权利要求书中用单字母或三字母表示氨基酸均符合IUPAC-IUB生物化学命名委员会所通过的规则(1974)，该规则收集于IUPAC-IUB生物化学命名委员会暂定规则和建议合编本(第二版，马里兰，1975)。
本发明另一方面是经一种杂合载体转化的酵母细胞的培养物，所述杂合载体中含有编码一种多肽的多核苷酸序列，优选DNA序列，该多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或20-30个氨基酸，最优选25-35个氨基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键，所述多核苷酸序列或DNA序列可操作性地连接了编码酵母启动子和前导序列(原序列或前原序列)的多核苷酸序列或DNA序列和/或对欲在酵母中表达所述多肽并将其分泌出来所必需的其它多核苷酸序列或DNA序列，所述酵母细胞培养物的特征在于该细胞内Yap3p活性有所降低(优选通过破坏YAP3基因)，该酵母细胞培养物是单倍体或二倍体(优选二倍体)酵母细胞的培养物。
另一方面，本发明提供了一种酵母细胞培养物，该酵母细胞含有编码一种多肽的多核苷酸序列以及编码分泌信号的第二种多核苷酸序列，从而使所述多肽可在酵母细胞内表达并从中分泌出来，该多肽具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或20-30个氨基酸，最优选25-35个氨基酸，并且在结构中具有0-3个二硫键，优选有一个或没有二硫键，所述酵母细胞培养物的特征在于所述酵母细胞内Yap3蛋白酶的活性有所降低。优选该酵母细胞是已被包含所述多核苷酸序列的杂合载体转化的二倍体酵母细胞，且优选该酵母细胞缺乏Yap3p活性，这可通过破坏YAP3基因而方便地达到。
可将编码多肽的DNA与多种其它的DNA序列连接以引入一合适宿主中，所述多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并且在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键。伙伴DNA将取决于宿主的性质、将DNA导入宿主的方式以及期望的是附加体维持状态还是整合入宿主染色体中。
一般说来，可将DNA以适当的方向和正确的阅读框架插入一表达载体如质粒中以进行表达。然后通过标准技术将该载体导入宿主中，并且通常必需进行选择以获得已被转化的宿主细胞。
如果期望发生整合，则将DNA以适当的方向和正确的阅读框插入到一酵母整合质粒载体如pJJ215、pJJ250、pJJ236、pJJ248、pJJ242(Jones & Prakash，酵母，6:363,1990)或pDP6(Fleig等，基因，46:237,1986)中以进行表达，该DNA两侧是任何非必需酵母基因的同源序列、转座子序列或核糖体基因。优选两侧序列是酵母蛋白酶基因或用作选择标记的基因。然后通过使用Rothstein(酶学方法，194:281-301,1991)和Cregg等(生物技术，11:905-910,1993)所示的标准技术，经两侧序列中发生的同源重组而将该DNA整合入宿主染色体上。
然后，在由于本发文所公开的教导而使本领域技术人员所共知的合适条件下，将已转化了本发明重组DNA的宿主细胞培养足够长时间，以使本发明方法中欲生产的多肽得到表达和分泌，然后可回收该多肽，正如我们所知。优选的多肽范例是胰高血糖素、胰高血糖素样肽、CRF和EEID-CART55-102，或它们的功能性类似物。
有用的酵母质粒载体包括POT(Kjeldsen等，基因，170:107-112,1996)和YEp13、YEp24(Rose和Broach，酶学方法，185:234-279,1990)和pG质粒(Schena等，酶学方法，194:289-398,1991)。
酿酒酵母的转化方法包括原生质球转化、乙酸锂转化和电穿孔，参见《酶学方法》，194卷，1991年。优选的转化如本文实施例中所述。
对酿酒酵母合适的启动子包括MFα1启动子、半乳糖诱导型启动子(如GAL1、GAL7和GAL10启动子)、糖酵解酶启动子(包括TPI和PGK启动子)、TRP1启动子、CYCI启动子、CUP1启动子、PHO5启动子、ADH1启动子和HSP启动子。毕赤酵因属中合适的启动子是AOXI(甲醇利用)启动子。
转录终止信号优选真核基因3’旁侧序列，其中含有适当的转录终止和多聚腺苷酸化信号。合适的3’旁侧序列可以是诸如与所用表达控制序列即启动子天然相连的基因的那些序列。
用于提供本发明多肽的分泌性表达的DNA构建体中包含一段DNA序列，该DNA序列中包括一个通过酵母加工信号而与该多肽连接的前导序列。该前导序列包括一段信号肽(“前序列”)以用于穿越内质网的蛋白质转运，并且任选地可包含一附加序列(“原序列”)，在多肽被释放到周围培养基中之前，该序列在酵母细胞中可以被切割，也可以不被切割。有用的前导序列是小鼠α-淀粉酶的信号肽、酿酒酵母MFα1、YAP3、BARI、HSP150的信号肽，克鲁弗酵母MFα信号肽，还有酿酒酵母MFα1、YAP3、PRC、HSP150和克鲁弗酵母MFα的前原序列，以及WO92/11378、WO90/10075和WO95/34666中所述的合成前导序列。此外，可按照WO95/35384中所述，以具有N-末端延伸的形式提供欲根据本发明方法生产的多肽。
本发明也涉及具有降低了的Yap3p活性的酵母的制备方法，该方法包括以下步骤：a)提供一含有YAP3基因一部分并且适于转化到酵母细胞中的杂合质粒；b)通过缺失YAP3片段从而破坏YAP3基因，并代之以插入URA3基因以获得Δyap3∷URA3基因破坏质粒；c)提供一种酵母Δura3缺失突变体；d)用上述质粒转化所述突变体；e)在无尿嘧啶的培养基上选择出Δyap3∷URA3缺失突变体。本发明还进一步涉及用反义技术制备Yap3p活性有所降低的酵母的方法。
此外，欲按本发明方法生产的多肽可以方便地以与N-或C-末端标记相偶联的形式表达，或者以前体或融合蛋白形式表达，尽管表达多肽的全长可能超过总共55或70个氨基酸。
                        附图简述
图1显示pS194质粒的构建。
图2显示质粒pME834和pME1389的构建。
图3为人胰高血糖素表达质粒pMT703的限制性图谱。
图4是人GLP-1(7-37)表达质粒pLaC253的限制性图谱。
图5是人GLP-2表达质粒pKV210的限制性图谱。
图6是pME973质粒的限制性图谱，其中包含插入于YEp13质粒中的编码HO(同宗配合)核酸内切酶和Ura3p的基因。
                        发明详述
本发明优选的实施方案如下表1所示。只要具备本领域的知识，每个熟练技术人员可以很清楚地知道如何利用相似的构建体通过本发明方法生产其他多肽以及它们的功能性类似物，所述多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键。
表1
前序列(信号序列)       原序列     异源蛋白质
MFα1(1-19) MFα1(20-85)  胰高血糖素
MFα1(1-19) MFα1(20-81)MAKR  DDDDK-胰高血糖素
MFα1(1-19) MFα1(20-85)  GLP-1(7-37)
YAP3(1-21) LA191KR  GLP-1(7-35)R36A
spx32 LaC212  GRPP
MFα1(1-19) MFα1(20-81)MAKR  GLP-2
HSP150(1-18) HSP150(19-67)-WIIAENTTLANVAMAKR  GLP-2
MFα1(1-19) MFα1(20-81)MAKR  GLP-2类似物F22Y
MFα1(1-19) MFα1(20-81)MAKR  GLP-2类似物A19T,+34Y
MFα1(1-19) MFα1(20-81)MAKR  GLP-2类似物A19T
MFα1(1-19) MFα1(20-81)MAKR  GLP-2类似物A2G
MFα1(1-19) MFα1(20-81)MAXKRX=肽键或Y或S或K或E或ARS  胰高血糖素或降钙素
1LA19，参见本文SEQ ID NO:1和WO95/34666,2spx3-LaC212，参见WO89/02463和WO90/10075。
本文所用的啤酒酵母株的遗传背景如下所示：
E11-3C      MATα YAP3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 URA3
SY107       MATα YAP3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3
ME1487      MATα Δyap3∷URA3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3
ME1656      MATα Δyap3∷ura3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3
ME1684      MATa Δyap3∷URA3∷Δylr121c pep4-3 Δtpi∷LEU2
            leu2Δura3
ME1695      MATα Δyap3∷ura3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3
ME1719      MATa/α Δyap3∷URA3/Δyap3∷ura3 pep4-3/pep4-3
            Δtpi∷LEU2/Δtpi∷LEU2 leu2/leu2 Δura3/Δura3
MT663       MATa/α YAP3/YAP3 pep4-3/pep4-3 Δtpi∷LEU2/Δtpi∷LEU2
            leu2/leu2 URA3/URA3 HIS4/his4
以下实施例进一步对本发明作了说明，但它们并不能被认为是对本发明保护范围的限制。前文及下面实施例中所公开的特征分别或它们的任何组合对于以多种形式实现本发明都可能是重要的。
实施例1:Δyap3∷URA3基因破坏
Δura3缺失突变的构建如下：
用StyⅠ消化pJJ244(包括URA3基因1.2kb HindⅢ片段的pUC18)，用Klenow聚合酶补平，并进行自身连接。产生的质粒被称为pS194，其中含有缺失了84bp StyⅠ-StyⅠ片段的URA基因，参见图1。
Δyap3∷URA3基因破坏质粒pME1389构建如下：
将pME768(Egel-Mitani等，酵母6:127-137,1990)中包含YAP3基因的2.6kb SacⅠ-PstⅠ片段插入pIC19R(Marsh等，基32:481-485,1984)的2.6kb SacⅠ-PstⅠ片段中，产生的质粒是pME834。用HindⅢ消化pME834以缺失0.7kb YAP3片段，再代之以插入URA3基因(Rose等，基因，29:113-124,1984)的1.2kb HindⅢ片段，形成的质粒是pME1389。质粒pME834和pME1389的构建过程以图解形式示于图2中。
用线性化pS194(BsgⅠ消化)转化酿酒酵母株E11-3C(MATαYAP3 pep4-3Δtpi∷LEU2 leu2 URA3)(参见ATCC20727，美国专利4766073)，以制得Δura缺失突变。通过在含有5-FOA(5-氟-乳清酸)的基本培养基平板上进行选择得到称为SY107的Δura3突变体。
然后用已被SalⅠ和SacⅠ切割的质粒pME1389转化SY107菌株(MATα YAP3 pep4-3 Δtpi∷LEU2 leu2 Δura3)，并分离出Δyap3∷URA3的3kb片段以用于转化。在无尿嘧啶的基本培养基平板上选择出Δyap3∷URA3缺失突变体。用PCR和Southern杂交对URA3转化体进行鉴定以确证Δyap3∷URA3片段在YAP3位点的正确整合。分离出Δyap3∷URA3缺失突变体(MATαΔyap3∷URA3 pep4-3Δtpi∷LEU2leu2Δura3)，称为ME1487。
实施例2：二倍体Δyap3/Δyap3菌株的构建
用EMS(甲磺酸乙酯)诱变ME1487，在含5-FOA的平皿上选择出ura3突变体。然后通过用图6所示的pME973瞬时转化选择出的分离菌之一-ME1656而使其进行交配型转换(mating type switch)(Herskowitz和Jensen，酶学方法，194:132-146,1991)。pME973中含有插入到YEp13质粒(Rose和Broach，酶学方法，185:234-279,1990)中编码HO(同宗配合)核酸内切酶及URA3的基因。从瞬时转化体中筛选出单倍体菌株ME1695，该菌株已从MATα转换为MATa，并具有以下遗传背景：MATaΔyap3∷ura3 pep4-3Δtpi∷LEU2 leu2Δura3。
然后通过显微操作将ME1695与ME1487杂交(Sherman和Hicks，酶学方法，194:21-37,1991)以得到Δyap3/Δyap3二倍体。从产生的二倍体中，选择出具有下述遗传背景的株系ME1719:MATa/αΔyap3∷ura3/Δyap3∷URA3 pep4-3/pep4-3 Δtpi∷LEU2/Δtpi∷LEU2leu2/leu2 Δura3/Δura.
实施例3
Δyap3∷URA3∷Δylr121c双破坏菌株的构建
为了构建一个编码YAP3和YLR121C的两个紧密连接基因的一步基因破坏菌株，合成了以下两个寡核苷酸引物：P1长57bp:YLR121C/URA3引物5′-GAT CGA ACG GCC ATG AAA AAT TTG TAC TAG CTA ACG
AGC AAA GCT TTT CAA TTC AAT-3′P2长57bp:YAP3/URA3引物5′-CCA GAA TTT TTC AAT ACA ATG GGG AAG TTG TCG TAT
TTA TAA GCT TTT TCT TTC CAA-3′
P1和P2各含有分别对应于YLR121C和YAP3编码区内序列的40个核苷酸，还含有一个HindⅢ酶切位点(AAGCTT)和对应于URA3基因(YEL021W)旁侧序列的12个核苷酸。以URA3基因作模板，利用P1和P2进行PCR，产生的1248bp PCR片段中包含了URA3选择性标记，此标记旁侧是来源于YAP3或YLR121C编码区的40个核苷酸。然后将PCR片段转化到ME1655中，再如实施例1中所述，选择出Δyap3∷URA3∷Δylr121c缺失突变体并对其进行表征。分离出Δyap3∷URA3∷Δylr121c突变体ME1684，其具有下述遗传背景：MATαΔyap3∷URA3∷Δylr121c pep4-3Δtpi∷LEU2 leu2Δura3.
实施例4
转化酵母
为了制备酵母感受态细胞，在100ml YPGGE培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％甘油，2％半乳糖，1％乙醇)中将酵母单倍体菌株SY107和ME1487或二倍体ME1719菌株培养至OD600=0.2。通过在2000rpm离心5分钟收获细胞，并用10ml水洗涤1次。再将细胞重新悬浮于10ml SED(1M山梨醇，25mM Na2EDTA pH8,6.7mg/ml二硫苏糖醇)中，在30℃保温15分钟。通过离心收获细胞，并重新悬浮于10ml SCE(1M山梨醇，0.1M柠檬酸钠，10mMNa2EDTA,pH5.8)+2mg Novozyme SP234中并于30℃保温30分钟。通过离心收获细胞，用10ml 1.2M山梨醇洗涤细胞1次，随后用10ml CAS(1M山梨醇，10mM氯化钙，10mM Tris-HCl pH7.5)再洗涤细胞1次后，再离心收获细胞，最后重新悬浮于2ml CAS中。以每Eppendorf管各100μl的小份分装感受态细胞，并冻存于-80℃。
转化过程操作如下：将冷冻的感受态细胞(100μl)迅速融化并加入1μg质粒DNA。于室温温育细胞15分钟，加入1ml PEG(20％聚乙二醇4000,10mM CaCl2,10mM Tris-HCl,pH7.5)。于室温放置30分钟后，通过在2000rpm离心15分钟收获细胞，再重新悬浮于100μlSOS(1M山梨醇，1/2体积YPGGE,0.01％尿嘧啶，7mM CaCl2)中。于30℃保温2小时后，再离心细胞并将其重新悬浮于0.5ml 1M山梨醇中。然后将细胞与6ml顶层琼脂(含有2.5％琼脂的YPD)一起涂布于YPD平板(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)上。将平板放于30℃培养3-5天直至长出转化体。
实施例5
异源蛋白质表达质粒
下述实施例中所用的酵母-大肠杆菌穿梭载体含有一外源蛋白质表达盒，该表达盒中包括一编码前导序列及其后的目的异源多肽的DNA序列，所述DNA序列被可操作性地置于POT质粒(Kjeldsen等，1996，出处同前)中酿酒酵母TPI启动子和TPI终止子之间，所述前导序列是MFα1前原序列及其修饰序列。范例如下所示：
表2
前序列(信号序列) 原序列 异源蛋白质 质粒
MFα1(1-19) MFα1(20-85) 胰高血糖素 pMT703 图3
MFα1(1-19) MFα1(20-85) GLP-1(7-37) pLaC253 图4
MFα1(1-19) MFα1(20-81)MAKR GLP-2 pKV210 图5
MFα1(1-19) MF(α1(20-81)MAKR CRF1-41 pKV241
MF1(1-19) MFα1(20-81)MAKR EEID-CART55-102 pSX647
实施例6
胰高血糖素的表达
将人胰高血糖素表达质粒pMT703(参见图3)转化到三个菌株如YAP3已被破坏的单倍体菌株ME1487(Δyap3)、YAP3已被破坏的二倍体菌株ME1719(Δyap3/Δyap3)和YAP3野生型菌株SY107(YAP3 WT)中。通过在YPD平板(1％w/v酵母提取物，2％w/v蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂)中将葡萄糖用作碳源来选择转化体。ME1532和YES1746是分别获自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pMT703转化体，而ME1530则是获自SY107(YAP3 WT)的pMT703转化体。在5ml YPD液体培养基中于30℃、200rpm振荡培养转化体3天。于2500rpm离心5分钟后收获培养物上清液，用反相HPLC分析1ml上清液。如表3所示的生产水平是两个独立分离转化体之培养物的平均值(实验1)，或是3个转化体混合培养物的值(实验2)，校正生产水平，从而将单倍体YAP3野生型的生产水平设为100％。HPLC分析表明ME 1532或YES1746比ME1530多生产约4-6倍的胰高血糖素。
用于胰高血糖素检测的HPLC装置：
HPLC柱：  4×250mm Novo Nordisk YMC-OdDMeSi C185μm。
柱温：    50℃
流速：    1ml/min
HPLC溶剂：
          A：0.2M Na2SO4中的10％(v/v)乙腈，0.04M
          H3PO4，用乙醇胺将pH调至2.3
          B：水中的50％(v/v)乙腈
注射体积：150μl用23.6％-32.9％的乙腈在40分钟内将胰高血糖素从HPLC柱中洗脱出来。
表3
转化体 宿主 质粒 胰高血糖素水平
实验1 实验2
ME1530 SY107 pMT703 100％ 100％
ME1532 ME1487 pMT703 596％ 469％
YES1746 ME1719 pMT703 未测 587％
实施例7
GLP-1(7-37)的表达
将人GLP-1(7-37)表达质粒pLaC253(参见图4)转化到ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)和SY107(YAP3 WT)中。如实施例6所述对转化体进行选择和分析。ME1535和YES1823是分别得自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pLaC253转化体，而ME1534是得自SY107(YAP3 WT)的pLaC253转化体。表4所示的生产水平是两个独立分离转化体之培养物的平均值(实验1)或3个转化体混合培养物的值(实验2)，校正生产水平，以将单倍体YAP3野生型的生产水平设为100％。HPLC分析表明ME1535或YES1823生产的GLP-1(7-37)比ME1530多约2-3倍。
用于GLP-1(7-37)检测的HPLC装置：
除了GLP-1是用31.2％-41.2％的乙腈在40分钟内从HPLC柱上洗脱下来的以外，其余参数与实施例6中所述相同。
表4
转化体 宿主 质粒   GLP-1(7-37)水平
实验1 实验2
ME1534 SY107 pLaC253 100％ 100％
ME1535 ME1487 pLaC253 287％
YES1823 ME1719 pLaC253 未测 161％
实施例8
GLP-2的表达
将人GLP-2表达质粒pKV210(参见图5)转化到ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)和SY107(YAP3 WT)中。如实施例6所述对转化体进行选择和分析。ME1615和YES1827是分别得自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pKV210转化体，而ME1614则是得自SY107(YAP3 WT)的pKV210转化体。表5所示的生产水平是2个独立分离转化体之培养物的平均值(实验1)或3个转化体混合培养物的值(实验2)，校正生产水平，以将YAP3野生型的产量水平视为100％。HPLC分析表明ME1615和YES1827生产的GLP-2比ME1614多约6-11倍。
用于GLP-2检测的HPLC装置：HPLC柱：Vydac214 TP54柱。流速：  1ml/minHPLC溶剂：
    A：0.1％TFA
    B：于乙腈中的0.07％TFA
在60分钟内用在20％-80％乙腈中的0.07％TFA将GLP-2从HPLC柱中洗脱下来。
表5
转化体 宿主 质粒 GLP-2水平
实验1 实验2
ME1614 SY107 pLaC210 100％ 100％
ME1615 ME1487 pLaC210 1130％ 682％
YES1827 ME1719 pLaC210 未测 675％
实施例9
CRF1-41(本文的SEQ ID NO:3)的表达
将人促肾上腺皮质激素释放因子(CRF1-41)表达质粒pKV241(相当于图5中的pKV210，只是其中的MFα1-pre-pro(1-81)MAKR-GLP2被MFα1-pre-pro(1-81)MAKR-CRF1-41所取代)转化到ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)和SY107(YAP3 WT)中。按实施例6中所述对转化体进行选择和分析。ME1813和YES1810是分别得自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pKV241转化体，而ME1812是得自SY107(YAP3 WT)的pKV241转化体。表6所示的产量水平是3个转化体混合培养物的值(实验2)，校正产量水平以将单倍体YAP3野生型的产量水平视为100％。如实施例8中所述完成HPLC分析，结果表明ME1813或YES1810比ME1812多生产CRF1-41约8-9倍。
表6
转化体 宿主 质粒 CRF1-41水平
实验1 实验2
ME1812 SY107 pKV241 未测 100％
ME1813 ME1487 pKV241 未测 834％
YES1810 ME1719 pKV241 未测 911％
实施例10
EEID-CART55-102(本文的SEQ ID NO:2)的表达
将人可卡因和苯异丙胺调控的转录物的N末端延伸(EEID)片段(EEID CART55-102)表达质粒pSX637(相当于图5的pKV210，只是其中的MFα1-pre-pro(1-81)MAKR-GLP2被MFα1-pre-pro(1-81)MAKR-EEID-CART55-102所取代)转化到ME1487(Δyap3)、ME1719(Δyap3/Δyap3)和SY107(YAP3 WT)中。如实施例6中所述对转化体进行选择和分析。ME1817和YES1820是分别得自ME1487(Δyap3)和ME1719(Δyap3/Δyap3)的pSX637转化体，而ME1816则是得自SY107(YAP3 WT)的pSX637转化体。表7所示的产量水平是来自3个转化体混和培养物的值(实验2)，校正产量水平，以将单倍体YAP3野生型的产量水平设为100％。如实施例8中所述进行HPLC分析，结果表明ME1817或YES1820比ME1816多生产EEID-CART55-102约2-3倍。
表7
转化体 宿主 质粒 EEID-CART55-102水平
实验1 实验2
ME1816 SY107 pSX637 未测 100％
ME1817 ME1487 pSX637 未测 216％
YES1820 ME1719  pSX637 未测 282％
实施例11
表8给出了被具有不同前原序列(前导序列)的表达质粒转化了的ME1487(Δyap3)中人胰高血糖素、GLP-1(1-37)和GLP-2表达水平的数据。除了表8中所列的细节外，表达质粒如图5所述。校正表达产率，以将MT663(YAP3/YAP3)转化体中的产率设为100％。
表8
    前序列(信号序列)     原序列  异源蛋白质    表达质粒 酵母转化体  产率％ME1487
   MFα1(1-19)        MFα(20-81)MAKR  胰高血糖素     pKV216    ME1652    267
   YAP3(1-21)                LA19-KR  胰高血糖素     pKV225    ME1780    333
   MFα1(1-19)     MFα(20-81)MARS KR  胰高血糖素     pKV217    ME1691    400
   MFα1(1-19)     MFα(20-81)MARK KR  胰高血糖素     pKV223    ME1692    185
   MFα1(1-19)     MFα(20-81)MARE KR  胰高血糖素     pKV238    ME1727    167
   MFα1(1-19)   MFα(20-81)MAERLE KR  胰高血糖素     pKV237    ME1726    189
   MFα1(1-19)   MFα(20-81)MAKELE KR  胰高血糖素     pKV236    ME1725    234
   MFα1(1-19)        MFα(20-81)MAKR  GLP-1(1-37)     pKV230    ME1718    189
   MFα1(1-19)        MFα(20-81)MAKR  GLP-2A19T     pKV219    ME1677    411
   MFα1(1-19)        MFα(20-81)MAKR  GLP-2A2G     pKV220    ME1678    360
   MFα1(1-19)        MFα(20-81)MAKR  GLP-2F22Y     pKV249    ME1781    280
                         序列表SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征
(A)长度：41个基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1Gln Pro Ile Asp Asp Thr Glu Ser Asn Thr Thr Ser Val Asn Leu1               5                   10                  15Met Ala Asp Asp Thr Glu Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr Thr Leu
            20                  25                  30Ala Leu Asp Val Val Asn Leu Ile Ser Met Ala
            35                  40SEQ ID NO:2的有关信息(ⅰ)序列特征：
(A)长度：52个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:2Glu Glu Ile Asp Ile Pro Ile Tyr Glu Lys Lys Tyr Gly Gln Val1               5                   10                  15Pro Met Cys Asp Ala Gly Glu Gln Cys Ala Val Arg Lys Gly Ala
            20                  25                  30Arg Ile Gly Lys Leu Cys Asp Cys Pro Arg Gly Thr Ser Cys Asn
            35                  40                  45Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu
            50SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特征：
(A)长度：41个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓朴结构：线性(ⅱ)分子类型：肽(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:3:Ser Glu Glu Pro Pro Ile Ser Leu Asp Leu Thr Phe His Leu Leu1                5                   10                 15Arg Glu Val Leu Glu Met Ala Arg Ala Glu Gln Leu Ala Gln Gln
             20                  25                 30Ala His Ser Asn Arg Lys Leu Met Glu Ile Ile
             35                  40

Claims (38)

1．在酵母内生产短链多肽的方法，该方法包括培养一种具有降低了的Yap3蛋白酶或其同系物活性的酵母，所述酵母已被一种杂合载体所转化，该载体中含有与编码一种多肽的DNA序列可操作性地连接的酵母启动子，所述多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键，以及分离所述多肽。
2．在酵母中生产具开放结构的短链多肽的方法，该方法包括培养具有降低了的Yap3蛋白酶或其同系物活性的酵母，所述酵母已被一杂合载体所转化，该载体含有与编码一种多肽的DNA序列可操作性地相连的酵母启动子，所述多肽在多肽链中具有10-50个氨基酸，优选15-40个氨基酸，更优选20-30个氨基酸，并在结构中具有不超过一个二硫键，以及分离所述多肽。
3．按照权利要求1或2的方法，其中所述酵母缺乏Yap3蛋白酶活性。
4．按照权利要求1至3中任何一项的方法，其中所述酵母是二倍体酵母。
5．按照权利要求1至4中任何一项的方法，其中所述酵母选自由下述组成之组：酿酒酵母、克鲁弗酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、Pichia methanolica、克鲁弗毕赤酵母、Yarrowia lipolytica、假丝酵母、产朊假丝酵母、可可假丝酵母、地霉和Geotrichum fermentans。
6．按照权利要求5的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
7．按照上述权利要求中任何一项的方法，其中所述酵母另外还具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶选自由下述基因所编码的蛋白酶之组：BAR1、STE13、PRA、PRB、KEX1、PRC、CPS和YAP3同系物MKC7、YAP3-link(由GeneBank acc.No.X89514：位置25352-26878)、YIV9(Swiss Prot acc.No.P40583)，以及天冬氨酰蛋白酶(Ⅳ)(由GeneBank acc.No.U28372：位置326-2116)基因。
8．按照权利要求1-6中任何一项的方法，其中所述酵母另外还具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶选自由STE13、PRA、PRB、KEX1和PRC基因所编码的蛋白酶之组。
9．按照权利要求1-6中任何一项的方法，其中所述酵母另外还具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶是由酵母开放阅读框架YGL259W所编码的天冬氨酰蛋白酶或者选自由KEX2基因和酵母开放阅读框架YCR045C和YOR003W所编码的丝氨酸蛋白酶之组。
10．按照前述权利要求中任何一项的方法，其中所述酵母另外还具有pep4-3突变。
11．按照前述权利要求中任何一项的方法，其中所述杂合载体中含有可操作性地连接了第一种DNA序列的酵母启动子以及含酵母转录终止信号的DNA序列，所述第一种DNA序列以正确阅读框架与编码一种多肽的第二种DNA序列相连，该第一种DNA序列编码前序列(信号序列)或前原序列之类的前导序列，所述多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键。
12．按照权利要求1-9中任何一项的方法，其中所述杂合载体中含有可操作性地连接了第一种DNA序列的酵母启动子以及含有酵母转录终止信号的DNA序列，所述第一种DNA序列以正确阅读框架与编码一种多肽的第二种DNA序列相连，该第一种DNA序列编码前序列(信号序列)或前原序列之类的前导序列，所述多肽在多肽链中具有10-50个氨基酸，优选15-40个氨基酸，更优选20-30个氨基酸，并在结构中具有不超过一个二硫键。
13．按照权利要求11或12的方法，其中所述酵母启动子选自由下述组成之组：MFα1启动子，CYC1启动子，半乳糖诱导型启动子如GAL1、GAL7和GAL10启动子，包括TPI和PGK启动子等在内的糖酵解酶启动子，TRP1启动子，CUP1启动子、PHO5启动子，ADH1启动子和HSP启动子。
14．按照权利要求11或12的方法，其中所述杂合载体中包含的第一种DNA序列编码小鼠α-淀粉酶的信号肽，酿酒酵母MFα1、BAR1、YAP3、HSP150及克鲁弗酵母MFα信号肽，或者编码酿酒酵母MFα1、YAP3、PRC、HSP150和克鲁弗酵母MFα的前原序列，和/或WO92/11378、WO90/10075和WO95/34666中所述的合成前导序列。
15．按照前述权利要求中任何一项的方法，其中编码多肽的DNA序列选自由编码下述的DNA序列组成之组：胰高血糖素家族诸如GRPP(胰高血糖素样肽相关多肽)、胰高血糖素、GLP-1(胰高血糖素样肽1)和GLP-2(胰高血糖素样肽2)，其中包括截短的形式如GLP-1(7-36)，还包括它们的类似物，如GLP-1(7-35)R36A GLP-2 F22Y、GLP-2 A19T+34Y.GLP-2A2G和GLP-2 A19T，以及具有1-3个氨基酸改变、添加和/或缺失的其它类似物。
16．按照权利要求1-14中任何一项的方法，其中编码多肽的DNA序列选自编码下述的DNA序列组：CRF和CART截短的或N末端延伸形式，优选EEID-CART55-102。
17．一种酵母细胞培养物，其含有编码一种多肽的DNA序列和编码可使所述多肽从酵母中分泌出来之前导序列的第二种DNA序列，所述多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键，所述酵母细胞培养物特征在于其具有降低了的Yap3p活性。
18．按照权利要求17的酵母细胞培养物，其已被含有所述DNA序列和所述第二种DNA序列的杂合载体所转化。
19．一种酵母细胞培养物，其含有编码一种多肽的DNA序列和编码可使所述多肽从酵母中分泌出来之前导序列的第二种DNA序列，所述多肽在多肽链中具有10-50个氨基酸，优选15-40个氨基酸，更优选20-30个氨基酸，并在结构中具有不超过一个二硫键，所述酵母细胞培养物的特征在于：所述酵母细胞具有降低了的Yap3p活性。
20．按照权利要求19的培养物，其已被含有所述DNA序列和所述第二种DNA序列的杂合载体所转化。
21．按照权利要求17-20中任何一项的培养物，其中所述酵母细胞缺乏Yap3p活性。
22．按照权利要求17-21中任何一项的培养物，其中所述酵母细胞是二倍体。
23．按照权利要求17-22中任何一项的培养物，其中所述酵母选自由下述组成之组：酿酒酵母、克鲁弗酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、Pichiamethanolica、克鲁弗毕赤酵母、Yarrowia lipolytica、假丝酵母、产朊假丝酵母、可可假丝酵母、地霉和Geotrichum fermentans。
24．按照前一权利要求的培养物，其中所述酵母是酿酒酵母。
25．按照权利要求17-24中任何一项的培养物，其中所述酵母细胞另外还具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶选自由下述基因所编码的蛋白酶之组：BAR1、STE13、PRA、PRB、KEX1、PRC、CPS和YAP3同系物MKC7、YAP3-link(由Genbank acc.No.X89514：位置25352-26878)、YIV9(Swiss Prot acc.NO.P40583)、天冬氨酰蛋白酶(Ⅳ)(由GenBank acc.No.U28372：位置326-2116)基因。
26．按照权利要求17-24中任何一项的培养物，其中所述酵母细胞另外还具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶选自由STE13、PRA、PRB、KEX1和PRC基因所编码的蛋白酶之组。
27．按照权利要求17-24中任何一项的培养物，其中所述酵母另外还具有降低了的蛋白酶活性，所述蛋白酶是由酵母开放阅读框架YGL259W编码的天冬氨酰蛋白酶或者选自由KEX2基因和酵母开放阅读框架YCR045C和YOR003W所编码的丝氨酸蛋白酶之组。
28．按照权利要求17-27中任何一项的培养物，其中所述酵母细胞另外还具有pep4-3突变。
29．按照权利要求17-28中任何一项的培养物，其中所述杂合载体中含有可操作性地连接了第一种DNA序列的酵母启动子以及含酵母转录终止信号的DNA序列，所述第一种DNA序列以正确阅读框与编码一种多肽的第二种DNA序列相连，该第一种DNA序列编码前序列(信号序列)或前原序列之类的前导序列，所述多肽在多肽链中具有多达55个氨基酸，优选10-50个氨基酸，更优选15-40或25-35个氨基酸，并在结构中具有0-3个二硫键，优选不超过一个二硫键。
30．按照权利要求17-28中任何一项的培养物，其中所述杂合载体中含有可操作性地连接了第一种DNA序列的酵母启动子以及含有酵母转录终止信号的DNA序列，所述第一种DNA序列以正确阅读框架与编码一种多肽的第二种DNA序列相连，该第一种DNA序列编码前序列(信号序列)或前原序列之类的前导序列，所述多肽在多肽链中具有10-50个氨基酸，优选15-40个氨基酸，更优选20-30个氨基酸，并在结构中具有不超过一个二硫键。
31．按照权利要求29或30的培养物，其中所述酵母启动子选自由下述组成之组：MFα1启动子，CYC1启动子，半乳糖诱导型启动子如GAL1、GAL7和GAL10启动子，包括TPI和PGK启动子等在内的糖酵解酶启动子，TRP1启动子，CUP1启动子，PHO5启动子，ADH1启动子和HSP启动子。
32．按照权利要求29或30的培养物，其中所述第一种DNA序列是小鼠α-淀粉酶的信号肽，酿酒酵母MFα1、BAR1、YAP3和HSP150以及克鲁弗酵母MFα的信号肽，或者是酿酒酵母MFα1、YAP3、PRC、HSP150和克鲁弗酵母MFα的前原序列，和/或WO92/11378、WO90/10075和WO95/34666中所述的合成前导序列。
33．按照权利要求17-32中任何一项的培养物，其中编码多肽的DNA序列是编码胰高血糖素家族内多肽的DNA序列，例如GRPP(胰高血糖素样肽相关多肽)、胰高血糖素、GLP-1(胰高血糖素样肽1)和GLP-2(胰高血糖素样肽2)，包括截短的形式如GLP-1(7-36)，还包括类似物如GLP-1(7-35)R36AGLP-2 F22Y、GLP-2 A19T+34Y.GLP-2 A2G和GLP-2A19T，以及具有1-3个氨基酸改变、添加或/和缺失的其它类似物。
34．按照权利要求17-32中任何一项的培养物，其中编码多肽的DNA序列选自编码下述的DNA序列组：CRF及截短和/或N末端延伸的CART，优选EEID-CART55-102。
35．制备具有降低了的Yap3p活性的酵母的方法，该方法包括以下步骤：a)提供一种含有YAP3基因的一部分并适于转化到酵母细胞中的杂合载体；b)通过缺失YAP3片段从而破坏YAP3基因，并代之以插入URA3基因以获得Δyap3∷RA3基因破坏质粒；c)提供一种酵母Δura3缺失突变体；d)用所述质粒转化所述突变体；和e)在无尿嘧啶的培养基中选择出Δyap3∷URA3缺失突变体。
36．用反义技术制备Yap3p活性有所降低的酵母的方法。
37．按照权利要求35或36的方法，其中所述酵母是酿酒酵母。
38．本文所述特性的任何新特性或组合。
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