JPH0310694A - トロンビン阻害活性を有するポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、トロンビン阻害活性を有するポリペプチド、
およびその製造法に関するものである。

〔従来の技術〕

近時増加傾向にある疾病として、血栓症が注目を浴びて
いる。血栓とは、血管内に於いて血液が凝固して生じた
塊で、これが形成される病的現象を血栓症と言う、血栓
の形成は血管内皮の変化ことに硬化性、炎症性の変化が
ある部位に頻発することが知られているが、これらの病
変は加齢とともに急速に増加し、しかも、世界的に寿命
が延びてきていることも血栓症増加の原因となっている
。血栓は、全身血中で、トロンビンが病的に活性化され
た結果、微小血管系にフィブリンが沈着することが原因
で形成されることが知られている、血栓症は、血栓によ
る血管控の狭窄、閉塞をもたらし、主要臓器、例えば、
心、脳、肺などの臓器に虚血性病変や梗塞を生じ、それ
らの機能障害を招来する。これらの血栓症は、さらに近
年、腎炎や肺臓炎などの免疫学的機序による臓器炎の発
生病理や、臓器、代用血管移植時の随伴病変として注目
されている。また、主として微小血管内で血栓が多発す
る病的状態として知られている汎発性血管向凝固症候群
（Ｄ　Ｉ　Ｃ）が特異な病態として注目を浴びている。

このＤＩＣという概念が提唱されたのは１９６０年代で
、当初ＤＩＣはきわめて珍しい症候群と考えられていた
。しかし、近年に至り、ＤＩＣは決して珍しいものでな
いことが明らかとなり、しかも、これまで各種疾患の末
期に生じる出血や臓器症状として十分に説明されないま
ま見過ごされてきた各種の臨床症状がＤＩＣの結果とし
て理解されるようになってきている。

血栓症の臨床病理学的例としては、脳卒中や心筋梗塞、
深部静脈血栓症や四肢動脈の閉塞、肺血栓や眼底血栓な
どがあるが、これらのものを専門領域で種々臓器のもの
を合計すれば、罹病率でも死因でも各種疾患中第１位を
しめるといわれている。

従って、血栓症の臨床的ならびにその病理学的意義は今
後ますます重要になると考えられる。

このような血栓症の治療剤として、アンチトロンビン■
を介して作用するヘパリンや、ビタミンに依存性の血液
凝固因子の生合成を阻害する抗ビタミンに剤が知られて
いる。また、別のトロンビン阻害剤として、非ペブタイ
ド系の蛋白分解酵素阻害剤としてメシル酸ガベギサート
剤が知られている。このものは、プラスミン、カリクレ
イン、トリプシン等の生理的に重要な意義を有する酵素
に対する阻害効果もあり、その使用には慎重な配慮が必
要となる。

従来からよく知られているヘパリンは、ＤＩＣを始めと
する血栓症に繁用される抗血栓剤であるが、その作用は
アンチトロンビン■の凝固阻止作用を加速することにあ
るため、ＤＩＣやネフロゼに合併した血栓症のごとく、
アンチトロンビン■が減少した血栓症の治療には有効で
ないと考えられる（参考文献１）、このような点から、
ＤＩＣを含む血栓症の予防薬、あるいは、治療薬として
の可能性のある新規な抗血栓剤の開発は、治療医学、予
防医学において重要なことである。

このような薬効を有する抗血栓剤としてＨＶＩ型ヒルジ
ンに期待が寄せられている。

ＨＶＩ型ヒルジンとは、真核生物である医用ヒル（旧ｒ
ｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）の唾液腺に存在する
トロンビン阻害活性を有するポリペプチドである。

ＨＶＩ型ヒルジンは、６５アミノ酸残基からなり、また
構造上の特徴としては、トロンビン阻害活性の発現に必
須な３個の分子内Ｓ−３結合の存在が知られている。特
に、ＨＶＩ型ヒルジンは、トロンビンおよびプレトロン
ビン２に対し作用特異性がきわめて高く（解離定数：０
．８×１０−′″）（参考文献２）、トロンビン以外で
は活性化第■因子が阻害されるのみである。すなわち、
ＨＶｌ型ヒルジンは血液凝固に関与る酵素以外の酵素は
阻害することがない、また、ＨＶＩ型ヒルジンは、毒性
が極めて低く、非抗原性であるといわれており、かつ、
生物活性を有した型ですみやかに腎臓から尿中に排泄さ
れる（参考文献３）。

これらの点から、ＨＶＩ型ヒルジンは、従来の抗血栓剤
に代わるきわめて有用なりＩＣを含む血栓症の予防薬、
あるいは、治療薬としての可能性を有している。

（発明が解決しようとする課題） 組換えＤＮＡ技術が出現する以前のＨＶＩ型ヒルジンの
生産は、ヒルから直接抽出することによりなされていた
。しかしながら、この方法では、少量のヒルジンを得る
ためにも多量の絶食ヒルを必要とし、また、粗製ヒルジ
ンを得るにも、かなり複雑な精製工程と時間を有するも
のであった。

例えば、純度約１０％程度の、しかもＨＶＩ型ヒルジン
以外にもヒル由来の夾雑蛋白の多い粗製ヒルジンを調製
するにも２から３週間絶食させたヒルのホモジネートを
熱水抽出したものから、エタノール沈殿、アセトン分別
沈殿、ベントナイトによる吸着と脱着、等電点沈殿を行
う必要があった、さらに、純品としてのＨＶＩ型ヒルジ
ンを得るには、この粗製ヒルジンを用いて、ＥＣＴＥＯ
ＬＡ　　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅカラムクロマトグラフィ、
５ｈｅｐａｈｄｅｘ　　ＣＭ−２５カラムクロマトグラ
フイー、５ｈｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２５によるゲル濾
過を行う必要があり、収率は０．００１％にも達しない
と報告されている（参考文献４）、このように少量しか
えられないため、ＨＶＩ型ヒルジンは医薬として実用上
利用できず、ＨＶＩ型ヒルジンの優れた特性から期待さ
れる治療的利用はいまだ達成されていない。

近年、組換えＤＮＡ技術により微生物を宿主として、通
常その微生物には存在しない異種遺伝子を発現させ、異
種遺伝子産物を多量に生産することが可能となりつつあ
る。

微生物を宿主として用いる組換えＤＮＡ技術による物質
生産は、大きく菌体内生産と面体外分泌生産とに分けら
れる。

菌体内生産の場合、異種遺伝子産物を菌体内に効率よく
生産することが可能であるが、異種遺伝子産物の菌体内
プロテアーゼによる分解、多量に生産させた場合に観察
される封入体の形成および、異種遺伝子産物のアミノ末
端への転写開始コドンであるメチオニンの付加などの問
題点がある。

これらの問題点はすべて、異種遺伝子産物を菌体外に分
泌させることにより解決されることが最近の研究により
明らかとなってきた（参考文献５）、さらに、菌体外生
産の場合は目的とする異種遺伝子産物の精製が容易とな
り、しかも異物混入の恐れも顕著に減少できるという利
点を有している。

以上記載してきたように、異種遺伝子産物を分泌生産さ
せることは物質生産上大きな意義を有するものである。

ＨＶＩ型ヒルジンに関しても菌体内生産と菌体外の分泌
生産の報告がある。

前者の場合、すなわち、大腸菌を宿主としたＨｖｌ型ヒ
ルジンの菌体内生産の場合、菌体内に０．２■／１−Ａ
６６０相当のトロンビン阻害活性を有するＨＶＩ型ヒル
ジンの蓄積しか認められなかったと報告（参考文献６）
されている、このように少量のＨＶＩ型ヒルジンしか蓄
積しなかった原因は、おそら＜Ｓ−Ｓ結合が正確に架橋
されていないトロンビン阻害活性を保持しない不活性型
ヒルジンが蓄積したためと考えられた。

後者の場合、すなわち、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端上流
に分泌シグナルが結合した型の前駆体蛋白質として菌体
内で発現させ、菌体外へ分泌させれば、菌体内生産の問
題点を回避してＨ■１型ヒルジンが菌体外に分泌される
ことが期待される。

このような観点から、大腸菌、および酵母を宿主とした
Ｈｖｌ型ヒルジンの分泌生産について報告されている。

大腸菌を宿主としたＨＶＩ型ヒルジンの分泌生産の場合
、特に、Ｊ、Ｄｏｄｔら（参考文献７）が指摘している
ような問題点が生じた。すなわち、彼らは大腸菌のアル
カリ性ホスファターゼの分泌シグナルの直後に成熟ＨＶ
Ｉ型ヒルジンを結合させた分泌プラスミドを構築し、大
腸菌を宿主としてＨＶＩ型ヒルジンの分泌を試みた。こ
の場合、ＨＶＩ型ヒルジンの他に、ＨＶＩ型ヒルジンの
Ｎ末端上流に３つのアミノ酸が付加したポリペプチドも
分泌された。このポリペプチドのトロンビン阻害活性は
ＨＶＩ型ヒルジンの約５００分の１に低下してしまうこ
とが判明した。

また、酵母を宿主とした異種遺伝子産物の分泌生産の場
合は、特に、異種遺伝子産物のＣ末端側のアミノ酸残基
の欠失がするという問題点が指摘されている（参考文献
８）、実際に、酵母を宿主としたＨＶＩ型ヒルジン分泌
生産の場合も、ＨＶｌ型ヒルジンが培養液ｌｌ中に１０
■蓄積した（参考文献９）、しかし、この場合、ＨＶＩ
型ヒルジンの他にも、トロンビン阻害活性の低下した１
１■１型ヒルジンのＣ末端の１ないし２アミノ酸残基を
欠失したヒルジンの存在も認められたと報告されている
（参考文献１０）。

このような問題点を回避するため、本発明者らは、蛋白
質を多量に分泌する能力を有し、酵素、アミノ酸、核酸
等の生産に使用される工業用微生物として使用経験の豊
富なバチルス属細菌を宿主として用いるＨＶＩ型ヒルジ
ンの分泌生産について検討した。特に、バチルス属細菌
の中でも、遺伝学的、生化学的、分子生物学的、応用微
生物学的知見が多く蓄積されているバチルス・ズブチリ
スを宿主として用いる方法に検討を加えた。このような
特徴を有するバチルス・ズブチリスを宿主とした異種遺
伝子産物の菌体外分泌の試みについては既にいくつかの
報告がある（参考文献１１、参考文献１２）が、バチル
ス・ズブチリスを宿主とした真核生物由来の蛋白質を多
量に分泌生産させることは必ずしも容易でないことも報
告されている（参考文献１３）。

このような状況のなかで、後述の製造例１に示すように
、本発明者らは、バチルス・アミロリキファシエンスの
中性プロテアーゼ遺伝子を用いた異種遺伝子産物発現分
泌ベクターを構築した。これを用いて、比較例１に示す
ＨＶＸ型ヒルジン分泌プラスミドを構築した。さらに、
このプラスミドで形質転換したバチルス・ズブチリスを
用いて、比較例２に示すように、培養液１，１当り８０
から１１００ａのＨＶＩ型ヒルジンを分泌させることに
成功した。しかしながら、この場合、少量ではあるが、
Ｓ−３結合が正確に架橋されていないと考えられるトロ
ンビン阻害活性を有さない不活性型ヒルジンが混在する
ことが判明した。

すでに記載したように、大腸菌でＨＶＩ型ヒルジンを菌
体内生産させた場合も、このような不活性型ヒルジンが
生成されたことから、バチルス・ズブチリスを宿主とし
た場合にも不活性型ヒルジンが生成される原因の一つと
して、分泌効率の悪さが考えられた。この場合、分泌効
率を改良すれば、このようなＳ−３結合が正確に架橋さ
れていないものの混在率が低下すると考えられた。他方
、このような分泌効率は、分泌シグナルのＣ末端アミノ
酸残基と異種遺伝子産物のＮ末端アミノ酸残基とからな
る結合領域のアミノ酸配列により影響されることを、Ｐ
ａ１ｖａ（参考文献１４）らと５ｃｈｅｉｎら（参考文
献１５）が報告している。彼らの報告は、異種遺伝子産
物を菌体外に分泌するために必要な分泌シグナルのＣ末
端アミノ酸と目的とする異種遺伝子産物のＮ末端アミノ
酸が、本来の分泌シグナルの切断点のアミノ酸配列と異
なったものとなる時には分泌効率が低下してしまうこと
を示唆するものである。

両者の結合領域のアミノ酸配列を本来の分泌シグナルの
配列と同じくする方法として、目的の異種蛋白質のＮ末
端配列を置換する方法、両者の結合領域に本来の分泌シ
グナルの切断点のアミノ酸配列が再現されるようなりＮ
Ａ配列を有する結合領域を導入する方法が考えらる。後
者の方法には後述するような結合領域に由来するアミノ
酸残基付加による活性低下の問題点があるため、本発明
者らは、前者の方法について検討した。しかし、ＨＶ　
ｌ型ヒルジンのＮ末端領域のアミノ酸配列（１から５位
）は、ＨＶＩ型ヒルジンのＣ末端活性部位の構造保持に
関係している点で重要な配列（参考文献１６）で、この
部分の変更は活性保持に大きな影響を与える６例えば、
前述しているように、この部分の上流に３残基のアミノ
酸が附加した型のポリペプチドのトロンビン阻害活性は
、Ｈ■１型ヒルジンのトロンビン阻害活性に比べて１１
５００に低下したと報告されている（参考文献７）、こ
のことから、Ｈｖｌ型ヒルジンのＮ末端領域のアミノ酸
配列は、トロンビン阻害活性の発現において重要な役割
を果たしていることが明確に理解できる。このことは、
ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端領域を置換することにより、
本来の分泌シグナルの切断部位のアミノ酸配列を再現し
た場合、たとえＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端アミノ酸残基
が置換されたポリペプチドの分泌蓄積量が上昇しても、
このポリペプチドのトロンビン阻害活性は低下してしま
う可能性が高いことを示唆するものである。

本発明の課題は、血栓症の予防薬あるいは治療薬として
使用可能な高いトロンビン阻害活性を有するポリペプチ
ドを効率よく生産することであり、組換えＤＮＡ技術に
よりトロンビン阻害活性を有するポリペプチドを効率よ
く産生ずる製造方法を提供することである。この目的の
ためには、バチルス・ズブチリスで効率よく分泌され、
しかもトロンビン阻害活性がＨＶＩ型ヒルジンより低下
してしまうことのない、トロンビン阻害活性を有するポ
リペプチドのアミノ酸配列を見いだすことが必要となる
。

（課題を解決するための手段） 上記の点に鑑み本発明者らは、後述の比較例１、および
比較例２において述べるように、バチルス・アミロリキ
ファシエンスの中性プロテアーゼの分泌シグナルがＨＶ
Ｉ型ヒルジンの分泌生産に有用であることを見いだした
。しかし、さらに高い分泌効率を達成するため、ＨＶＩ
型ヒルジンのＮ末端領域アミノ酸配列を改変してＨＶＩ
型ヒルジンの有する高いトロンビン阻害活性を失うこと
なく分泌生産量を高めることが出来るポリペプチドの前
駆体について検討した。その結果、ＨＶＩ型ヒルジンの
Ｎ末端領域の二つのアミノ酸残基を置換することにより
、その高いトロンビン阻害活性を低下せしめることなく
、効率よくバチルス・ズブチリスの菌体外に分泌生産さ
れるポリペプチドの構造を見いだし、遂に本発明を完成
した。このポリペプチドは、バチルス・アミロリキファ
シエンスの中性プロテアーゼの分泌シグナルの直後にＨ
ＶＩ型ヒルジンのＮ末端領域を以下に記すように改変し
た型のアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを結合させ
た型を有するいわゆる分泌前の前駆体の構造を有してい
る。この前駆体は、分泌の過程でその分泌シグナルが除
去され、成熟型のトロンビン阻害活性を有するポリペプ
チドとなる、このポリペプチドは、ＨＶＩ型ヒルジンよ
りも効率よく分泌され、その有するトロンビン阻害活性
がＨＶＩ型ヒルジンと同等のレベルであることを見出し
、本発明を完成した。

本発明の高いトロンビン阻害活性を有するポリペプチド
とは、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端のバリン、およびＮ末
端から５残基目のアスパラギン酸をそれぞれアラニン、
およびグルタミン酸に置換したものである。また、本発
明は、バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテ
アーゼ遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部位の下
流にトロンビン阻害活性を有する特許請求の範囲の請求
項１に記載するポリペプチドの前駆体をコードするＤＮ
Ａ断片を結合させたＤＮＡ断片がベクターＤＮＡに結合
していることを特徴とする分泌プラスミド、およびこの
分泌プラスミドで形質転換して得た形質転換株、さらに
この形質転換株を培養し、その培養上清からトロンビン
阻害活性を有するポリペプチドを回収するトロンビン阻
害活性を存するポリペプチドの製造法に関するものであ
る。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で言うプロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼが
認識し結合するＤＮＡ配列をいう。

一般に、ＲＮＡの合成開始点を“＋１″とし、その上流
のＤＮＡ配列を並べると、そこから約１０塩基のところ
に共通性の高いＤＮＡ配列の存在が知られている。その
ＤＮＡ配列は、５’　ＴＡＴＡＡＴ３’　であＪ）、　
−１０８１域“トイわれティる。さらに約３５塩基上流
のところにも共通性の高いＤＮＡ配列の存在が知られて
おり、そのＤＮＡ配列は、５”　ＴＴＧＡＣＡ３’であ
り、　−３５領域“といわれている０通常、　　　　３
５ＳＩ域“はＲＮＡポリメラーゼの認識のため、　−１
０領域“はその結合のために必要とされている（参考文
献１７）。

バチルス・ズブチリスは幾つかの種類のＲＮＡポリメラ
ーゼを持つことが知られている。この多様性は、バチル
ス・ズブチリスの複雑な発現制御を伴う胞子形成の過程
において重要な役割を果たしている。とくに、栄養増殖
期にあるＲＮＡポリメラーゼの大部分はσ５５型ＲＮＡ
ポリメラーゼであり、従って大部分の遺伝子の転写はこ
れによって行われることが知られている（参考文献１８
）。

本発明の分泌プラスミにおける、プロモーターの’１０
？ｆＪ域“、および　　−３５領域”と考えられるＤＮ
Ａ配列は、特許請求の範囲の請求項６に記載のＤＮＡ配
列のうち、それぞれ５′末端から１７９番目の塩基であ
るＴから開始する５″ＴＡＴＴＡＴ３’　、および２０
２番目の塩基であるＴから開始する５’　ＴＴＧＣＡＧ
３”である。

このＤＮＡ配列は、バチルス・ズブチリスの栄養増殖期
の主たるＲＮＡポリメラーゼであるσ５５型ＲＮＡポリ
メラーゼの認識配列、結合配列であるコンセンサスな−
３５および一１０領域の配列と高い相同性を有している
（参考文献１日）。

また、リボゾーム結合部位とはＲＮＡポリメラーゼによ
り合成されたｍＲＮＡがリボゾームと結合するＤＮＡ配
列を指す。

−ａに、リボゾーム結合部位は開始コドンの５から９塩
基上流に共通にみられるＤＮＡ配列で、１６ＳｒＲＮＡ
の３′末端のＤＮＡ配列と相補的なりＮＡ配列を措す。

微生物の種類によって、その１６ＳｒＲＮＡのＤＮＡ配
列は異なるが、バチルス・ズブチリスの１６ＳｒＲＮＡ
のＤＮＡ配列は３“ｔＪｃｔＪｔＪｔＪｃｃｔＪｃｃ５
’であることが知られている（参考文献１８）。

本発明の分泌プラスミドのりボゾーム結合部位と考えら
れるＤＮＡ配列は、特許請求の範囲の請求項６に記載の
ＤＮＡ配列において、５゛末端から２３６番目の塩基で
あるＡから開始する５’ＡＡＡＧＧＧＧＧ３’である。

このＤＮＡ配列は、バチルス・ズブチリスの１６ＳｒＲ
ＮＡと掻めて高い相補性を有するものである。

これらのブロモター、およびリボゾーム結合部位をコー
ドするＤＮＡ配列は、遺伝子の発現に重要な役割を果た
す、また、これらのＤＮＡ配列は、遺伝子の発現効率に
関係していることは今日広く知られている（参考文献１
８）。

バチルス属細菌を宿主として所望の蛋白質の遺伝子を発
現させる場合は、バチルス属細菌のＲＮＡポリメラーゼ
及びリボゾームが、プロモータ及びリボゾーム結合部位
に対して厳格な特異性を持つため（参考文献１８）、そ
れらの領域はバチルス属細歯由来であることが望ましい
（参考文献１９）。

分泌蛋白質は、菌体内でその成熟蛋白質のＮ末端上流に
分泌シグナルが付加した型の前駆体蛋白質として合成さ
れるが、この前駆体蛋白質は、分泌の過程で分泌シグナ
ルは除去され成熟蛋白質として菌体外に分泌される（参
考文献２０）、ここで、成熟蛋白質とは２分泌蛋白質か
らそれ自身の分泌シグナルが除去された蛋白質をさす、
また、分泌シグナルとは、成熟蛋白質のＮ末端上流に存
在する２０から３０アミノ酸残基によりなるポリペプチ
ドを指す０分泌シグナルには０次のような特徴がある。

すなわち、Ｎ末端近くに塩基性アミノ酸の存在、中央部
に疎水性アミノ酸のクラスターの存在、および分泌シグ
ナルの切断部位に小さな側鎖を有するアミノ酸の存在が
知られている。

このポリペプチドは、分泌の過程で除去されるものであ
り、前駆体蛋白質の細胞膜通過において重要な役割を果
たすと考えられている（参考文献２０）。

本発明の分泌プラスミドの構築に用いたバチルス・アミ
ロリキファシエンスの中性プロテアーゼの分泌シグナル
であるアミノ酸配列は、Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ４１ｙ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ａｌａ−＾１トＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−５ｅ
ｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
−Ｇ！ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−＾１ａ−であり、典型的な
分泌シグナルの構造を有している。

この分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列は、本発明の
特許請求の範囲の請求項６に示すＤＮＡ配列のうち５′
末端から２５１番目の塩基であるＧから開始する、５’
　ＧＴＧＣ，Ｃ；ＴＴＴＡＣ，ＧＴＡＡＧＡＡＡＴＴＧ
ＴＣＴＡＧＴＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＡ
ＴＧＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＣ；ＣＣＣ；
ＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＣＣＧＣＴ３’である。

本発明者らは、比較例１に記載したように、バチルス・
アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプ
ロモーター、リボゾーム結合部位および分泌シグナルの
直後にＨＶＩ型ヒルジンをコードするＤＮＡ断片を結合
させることによりＨｖｌ型ヒルジン分泌プラスミドを構
築した。さらに、比較例２に示すように、このプラスミ
ドでバチルス・ズブチリスを形質転換して得た形質転換
株を培養することにより培養上清中に）ＴＶＩ型ヒルジ
ンを分泌させることに成功した。しかしながら、この場
合、少量ではあるがＳ−８結合が正確に架橋されていな
いためトロンビン阻害活性を有しない不活性型ヒルジン
が混在することが判明した。大腸菌を用いてＨＶＩ型ヒ
ルジンを菌体内に生産させた場合もこのような不活性型
ヒルジンが生成したことから、バチルス・ズブチリスに
おけるこのような不活性型ヒルジンが生成される原因の
一つとして分泌効率の低さが考えられた。すなわち、バ
チルス・ズブチリスを宿主とした場合もヒルジンの分泌
効率が低下したために不活性ヒルジンが形成されると考
えられたので、この問題を回避する方法として分泌効率
を改善することが有用であることが示唆された。そこで
、ＨＶＩ型ヒルジン分泌プラスミドにおける分泌シグナ
ルと成熟ヒルジンとの結合部位のアミノ酸配列、すなわ
ち分泌シグナルの切断点のアミノ酸配列を改変すること
により、この不活性型ヒルジンを活性型ヒルジンに変換
することついて検討した。すなわち、Ｐａ１ｖａら（参
考文献１４）、５ｃｈｉｅｎら（参考文献１５）は、分
泌シグナルと異種蛋白質の結合に由来する分泌シグナル
の本来のアミノ酸配列から他のアミノ酸配列への変更が
、異種蛋白質の分泌生産性効率に与える影響ついて報告
している。

すなわち、Ｐａ　ｌｖａらは、分泌蛋白質の一つである
バチルス・アミロリキファシエンスのαアミ−ラーゼ遺
伝子の分泌シグナルの切断点を含む領域（Ａｌａ−Ｖａ
ｌ）の直後に、または５アミノ酸残基からなる結合領域
（＾５ｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ）を介して
成熟インターフェロン（ＩＦＮ）をコードするＤＮＡ断
片を結合させ、ヒトＩＦＮタンパクの分泌を試みた。こ
の場合、分泌シグナルは除去されたが、分泌されたイン
ターフェロンは、成熟インターフェロンのＮ末端上流に
１個（Ｖａｌ）　、または６個（Ｖａｌ−＾５ｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ）のアミノ酸が付加した型
の融合蛋白質が分泌蓄積され、それらの量は、培養液１
Ｎあたり０．５　ｍ　ｇから１ｍｇであったと報告して
いる。一方、５ｃｈｅｉｎらは、Ｐａ１ｖａらと同じα
−アミラーゼ遺伝子の分泌シグナルのＣ末端のアミノ酸
（Ａｌａ）をコードする領域の直後に、成熟インターフ
ェロン（ＩＦＮ）をコードするＤＮＡ断片を結合させ、
ヒトＩＦＮの分泌を試みた。しかしながら、この場合、
多量の前駆体ＩＦＮ、あるいは成熟ＩＦＮが細胞膜に留
まり、培地中への分泌は、少量であったと報告されてい
る。

また、分泌シグナルの切断部位の構造と分泌効率・膜透
過の関係について検討がなされている（参考文献２１）
、その結果、正確な切断部位の切断には切断部位のアミ
ノ酸配列が重要な役割を果たしていることが判明した。

以上のことは、分泌シグナルと異種遺伝子産物の結合領
域に本来の分泌シグナルのアミノ酸配列が再現されてい
るものの方が、異種蛋白質の分泌生産性が高まる可能性
があることを示唆している、その理由としては本来の分
泌シグナルの切断部位であるアミノ酸配列は、変更され
た切断部位に比べ、シグナルペプチダーゼにより容易に
切断されるためと考えられる。このような本来の分泌シ
グナルの切断部位を再現するためには、分泌シグナルの
Ｃ末端と目的とする異種遺伝子のＮ末端をコードする塩
基配列の間に、本来の分泌シグナルのアミノ酸配列を再
現しうる塩基配列を有する結合領域を挿入する方法、あ
るいはＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端アミノ酸配列を本来の
分泌シグナルの切断部位であるアラニル−アラニンを再
現しうるようアラニンに変更することを含むＮ末端領域
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の変更を行う方
法の２通りの方法が考えられた。

前者の場合、すなわち、分泌シグナルのＣ末端とＨＶＩ
型ヒルジンのＮ末端の間に本来の分泌シグナルの切断点
のアミノ酸配列を再現する挿入領域を設けた場合は、Ｎ
末端に余計なアミノ酸が附加した融合蛋白質が分泌され
る場合がある（参考文献１４）、とくに、ＨＶＩ型ヒル
ジンの場合はこのような付加アミノ酸の存在は先に示し
た文献（参考文献７）にある如く著しいトロンビン阻害
活性の低下を招くことが指摘されている。

また、後者の方法においても、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末
端側のアミノ酸配列は、その高いトロンビン阻害活性の
保持に重要な役割を果たすと報告されている点（参考文
献２２）から、困難な課題となっている。この課題を本
発明者らは鋭意検討した末、以下に示す如く本発明を完
成した。

すなわち、比較例１に示すＨＶＩ型ヒルジン分泌プラス
ミドに於ける分泌シグナルのＣ末端のアミノ酸とＨＶＩ
型ヒルジンのＮ末端のアミノ酸とが結合する分泌シグナ
ルの切断部位のアミノ酸配列がアラニル−バリンであり
、本来の中性プロテアーゼの分泌シグナルの切断点のア
ラニル−アラニンと異なることに着目した。

一方、ＨＶＩ型ヒルジンのトロンビン阻害活性発現のメ
カニズムはすでに研究されている。これによると、ヒル
ジンＣ末端（残基５６−６５）が、トロンビンに結合し
トロンビンの立体構造が顕著に変化した結果、トロンビ
ン阻害活性が発現すると考えられている（参考文献２３
）。

また、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端（残基１−５）のアミ
ノ酸配列は、すでに報告されているように、ＨＶＩ型ヒ
ルジンのＣ末端活性部位の構造保持に係している点く参
考文献１６）で、重要な配列であると考えられている。

これらのことから、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端領域を置
換することにより結合領域にシグナルペプチダーゼによ
る本来の切断点を創設した場合、たとえＨＶＩ型ヒルジ
ンのＮ末端領域が置換されたポリペプチドが効率よく培
養液中に分泌されても、分泌されたポリペプチドは、弱
いトロンビン阻害活性しか有していない可能性の高いこ
とが容易に推察される。

一方、近年、組換えＤＮＡ技術を利用して、人工的に変
異を起こした蛋白質を自由に作り出すシステムが整って
きている。その結果、より活性の強いもの、より安定な
もの、全く新しい機能を持つ蛋白質を作り出すことを目
的とした“蛋白工学“と称される学問体系が整備されつ
つある。しかしながら、現実には蛋白質の改変に指導原
理となりうる原理が存在せず、合目的な蛋白質の改造が
行えないのが現状である。上述したようなヒルジンのＮ
末端部分を改変して、本来の分泌シグナルの切断点を再
現した際にトロンビン阻害活性を低下せしめないような
改造の方法について何ら指導原理がないのが現状である
。

そこで、本発明者らは、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端のア
ミノ酸をバリンからアラニンに変えた影響を最少にする
ため、トロンビン阻害活性の発現に重要であると指摘さ
れているＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端の１残基目から５残
基目の改変を試み、Ｎ末端のバリンをアラニンに、Ｎ末
端から５残蟇目のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換
したポリペプチドが優れた分泌効率と高いトロンビン阻
害活性を保証するものであることを見いだし、本発明を
完成した。すなわち、本発明の実施例１および実施例２
で示すように、高いトロンビン阻害活性ををする、天然
には存在しない新たなポリペプチドをバチルス・ズブチ
リスを宿主とする系において効率よく分泌生産できるこ
とを見いだしたのである。

本発明でいうトロンビン阻害活性を有するポリペプチド
のアミノ酸配列は、　＾１ａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ
−Ｇ　ｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉ　ｕ−５ｅｒ−Ｇ
　１ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−
Ｃｙｓ−［；１ｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−＾５ｎ−Ｌｙｓ−
Ｃｙｓ−Ｔｉｅ−Ｌｅｕ−［；１ｙ−３ｅｒ−Ａｓｐ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−＾ＳトＧ　Ｉｎ−Ｃｙｓ　−
Ｖａ　ｌ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｇ　ｌｕ４１ｙ−Ｔｈ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒ。

Ｇｌｎ−５ｅｒ−ｔｌｉｓ−＾５ｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−
＾５ｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎであり、このポ
リペプチドをコードするＤＮＡ配列は、５’　ＧＣＣＧ
ＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡＣ；ＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧ
ＣＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＡＴＧＴＣ；ＡＡＧ
ＡＡＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡ
ＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＣＣＡ
ＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＡＧ
ＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＡＣＣＧＣＡＡＴＣＴＣＡ
ＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴ
ＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＡ３’である。

また、本発明でいうトロンビン阻害活性を有するポリペ
プチドの前駆体とは、バチルス・アミロリキファシエン
スの中性プロテアーゼの分泌シグナルのＣ末端直後にト
ロンビン阻害活性を存するポリペプチドが結合した型の
ポリペプチドをさす、すなわち、本発明でいうトロンビ
ン阻害活性を有するポリペプチドの前駆体のアミノ酸配
列は、Ｍｅｔ−Ｇ　１ｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌ
ｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−ＶａｌＡ　ｌ
ａ−Ａ　Ｉａ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅ　ｔ−５ｅｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｅ−５ｅｔ−ＬｅｕＰｒｏ−Ｇ　１
ｙ−Ｖａ　Ｉ−Ｇ　ｌｎ−Ａ　１ａ−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ
　−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇ　Ｉｕ−ＣｙｓＴｈｒ−Ｇ　ｌ
　ｕ　−５ｅｒ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｇ　ｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅ
ｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−ＧｌｕＧｌｙ−５ｅｒ−
Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−＾
５ｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｙ−５
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇ
　Ｉｎ−Ｃｙｓ−Ｖａ　ｌ　−Ｔｈｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　
Ｉ　ｕ−Ｇ　１ｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｇ　Ｉｒ１−５ｅｒ−Ｈ１ｓ−Ａｓｒ＋−Ａｓｐ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ　１ｕ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎであり、
このポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は各アミノ酸
残基礎に対応するコドンをつないでいくことにより得ら
れる０通常、一つのアミノ酸に対応して複数のコドンが
対応するので上記のアミノ酸配列を指定するＤＮＡ配列
も数多く存在する０本発明者らは、それらのうち、５’
　ＧＴＧＧＧＴＴＴＡＧＣ；ＴＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣ
ＴＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＴＴＣＣ
ＴＴＴＡＴ（、ＡにＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧ
ＣＣＧＧＧＴＣＴＴＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣ；ＴＴＴＡＴ
ＡＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＧＡＣＡＡＡ
ＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＡＡ
ＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴ
ＡＴＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡ
ＡＴＣＡＡＴＣ、ＴＣ；ＴＴＡＣＡＧＧＡＣ；ＡＡＣＧ
ＡＡＣＡＣＣＣＡＡＡＣＣＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＡＡＴ
ＧＡＴＣ；ＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＣ。

ＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＡ３’
のＤＮＡ配列を用いた。このＤＮＡ配列は化学的に合成
されたフラグメントをアッセンブルする方法により容易
に得られる６本発明者らは、このＤＮＡ配列を数多く存
在する同じアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の中か
ら選定するにあたり以下の点に留意した。

すなわち、近年、多くの遺伝子のＤＮＡ配列が明らかと
なり、遺伝子におけるコドン利用頻度を調べることが可
能となった。その結果、各生物間におけるコドン利用頻
度に差があることが判明した。そこで、効率よく発現さ
せるためにそのＤＮＡ配列を化学的に合成する場合、宿
主として用いる生物の至適コドンが多く含まれるように
ＤＮＡ配列を設計するのが一般的に行われている。一般
に一つのアミノ酸残基をコードするコドンが一種類に限
定されないことから、本発明の分泌プラスミドの構築に
おいても、何種類かのトロンビン阻害活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列が考えられた０本発明
の場合、特に、バチルス・ズブチリスを宿主として発現
させることを考えて、バチルス・ズブチリス用の至適コ
ドンが多く含まれるように設計されているＤＮＡ配列を
用いた。

本発明者らは、実施例１および実施例２に述べるように
、ヒルジンを多量に分泌する能力を有する分泌蛋白質を
コードする遺伝子を鋭意探索した結果、バチルス・アミ
ロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子を選択し
、さらに分泌シグナルをコードするＤＮＡ断片を結合さ
せることにより、ＨＶＩ型ヒルジンを分泌させることに
成功した。

この場合の分泌プラスミドを構成するベクターＤＮＡと
しては、バチルス属細菌で複製可能なものであれば如何
なるものでも使用可能である０通常よく用いられるもの
としてスタフィロコッカス属由来のプラスミドｐＵＢ１
１０、ｐ’ｒｐｓ、ｐＣ１９４、ｐＤＢ９、ｐＢＤ６４
、ｐＢｃ１６、ｐＥ１９４等およびその誘導体を挙げる
ことができる。上記のプラスミドを有するバチルス・ズ
ブチリスは、いずれもオハイオ大学バチルスストックセ
ンター（住所；４８４Ｗｅｓも　１２ｔｈＡｖｅｎｕｅ
　　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ　　Ｏｈｉ。

４３２１０　　ＵＳＡ）で万人に分譲されるものである
。

とくに、本発明で用いるベクターＤＮＡとしては、バチ
ルス属細菌で複製可能なプラスミドであれば如何なるも
のでもよいが、分子生物学的知見の蓄積が多く、かつバ
チルス属細菌で安定に保持される点からｐＵＢｌｌｏが
よい。

本発明の分泌プラスミドは、実施例に記載するように、
中性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター、リボゾーム結
合部位および分泌シグナルをコードする領域の直後に異
種蛋白質をコードするＤＮＡ断片を結合できる型の異種
蛋白質発現分泌ベクターにトロンビン阻害活性を有する
ポリペブチドをコードするＤＮＡ断片を挿入結合し構築
したものである。その結果、該分泌プラスミドによりコ
ードされるポリペプチドは、特許請求の範囲の請求項２
に記載するアミノ酸配列をもつトロンビン阻害活性を有
するポリペプチドのＮ末端上流に２７アミノ酸残基から
なるアミノ酸配列が付加した型の前駆体型のポリペプチ
ドである０本発明の分泌プラスミドの構築は、化学的に
合成した特許請求の範囲の請求項６に記載のＤＮＡ配列
を含むＤＮＡ断片と適当な制限酵素で切断したバチルス
属細菌で複製可能なベクターＤＮＡ断片とを常用の連結
技術を用いて結合することにより容易に実施可能である
。この場合、２つのＤＮＡ断片は、たとえば、共通の制
限酵素部位を介して、および／または合成りＮＡリンカ
−を用いることにより、および／または平滑末端結合に
より連結されることが可能である。

バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ
遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部位、および分
泌シグナルをコードする領域の下流にトロンビン阻害活
性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を結合
させたＤＮＡ断片が上記に記載したベクターＤＮＡと結
合して構築された分泌プラスミドは、これを用いてバチ
ルス・ズブチリスを形質転換して形質転換株を得ること
ができる。

バチルス・ズブチリスの形質転換の方法としては、当業
界で用いられている方法ならばいかなる方法を用いるこ
とが可能である０例えば、Ｃｈａｎｇらの方法（参考文
献２４）により行うことができる。この方法は、３段階
に分けることができる。

１、バチルス・ズブチリスを等張渡において、リゾチウ
ムで処理することによる細胞壁のないバチルス・ズブチ
リス、すなわちプロトプラストを生成させる過程 ２、ポリエチレングリコール溶液を用いた、ベクターＤ
ＮＡによるプロトプラストの形質転換を行う過程 ３、再生培地におけるプロトプラストの細胞壁の再生と
形質転換されたバチルス・ズブチリスを選択する過程 得られた形質転換株を用い、トロンビン阻害活性を有す
るポリペプチドを得るにはその菌株を通常の方法で液体
培養すればよい０例えば、２Ｎの三角フラスコに、４０
０ｄのＬＢ培地（参考文献２５）に形質転換株を植菌し
た後、３７℃で、約２０時間、好ましくは最大収量のト
ロンビン阻害活性を有するポリペプチドが分泌産生され
るまで、振盪を行いながら培養する方法がある。

本発明の形質転換株は、資化可能な炭素源、窒素源、お
よび無機塩源を含む液体培地で培養される０例えば、通
常よく用いられる液体培地としてＬＢ培地が挙げられる
。

また、ここで用いる菌株としては、本発明の分泌プラス
ミドで形質転換されるバチルス属細凹なら如何なるもの
でもよいが、遺伝学的、生化学的、分子生物学的、応用
微生物学的知見が多（蓄積されており、かつ安全性も高
い点からバチルス・スブチリスがよい。

培養液からのトロンビン阻害活性を有するポリペプチド
の調製は、培養上清から回収精製を行えば実施可能であ
る０本発明者らは、この培養上清のｐＨを塩酸で３に調
整した後、７０℃で１５分間処理して生じた蛋白性の沈
殿を遠心で除いて得られた上清画分にトロンビン阻害活
性を有するポリペプチドは残存し、しかもその存在比は
、全蛋白に対し２３％と高まり極めて夾雑蛋白の少ない
ものとなることを見い出した。その結果、培養液中に分
泌されたトロンビン阻害活性を有するポリペプチドは、
この上清から、陽イオン交換クロマトグラフィーと陰イ
オン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフ
ィーにより容易に精製できる。

本発明者らは、比較例１に示したＨＶＩ型ヒルジン分泌
プラスミドでバチルス・ズブチリスを形質転換して得た
形質転換株を、比較例２に示す条件で培養することによ
り、１０■／２・Ａ６６０相当のトロンビン阻害活性を
有するポリペプチドが分泌蓄積されることを見い出した
。さらに、本発明者らは、このＨＶＩ型ヒルジン分泌プ
ラスミドの改良を行って構築した本発明の実施例１に示
した分泌プラスミドを用いて形質転換されたバチルス・
ズブチリスを用いて、実施例２に示す条件で培養するこ
とにより、１８■／２・Ａ６６０相当のトロンビン阻害
活性を有するポリペプチドが比較例２の場合よりも効率
よ（分泌蓄積されることを見い出した。なお、この時の
バチルス・ズブチリスの生育度を示す培養液の吸光度（
Ａ６６０）は、いずれの場合も、１０であった。この単
位（Ｉ１ｇ／ｊ２−Ａ６６０）は、培養上清（１１＞に
蓄積したトロンビン阻害活性を有するポリペプチドの量
（■）を、培養液のバチルス・ズブチリスの生育度を示
す吸光度（Ａ６６０）で割った値を示す。

実施例２で調製した培養上清（１２）のｐＨを塩酸で３
に調整した後、７０’Ｃで１５分間処理して生じた蛋白
性の沈殿を遠心で除いて得られた上清画分から、陽イオ
ン交情クロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラ
フィーおよび逆相クロマトグラフィーを用いて精製後、
培養液１１から７０ｍｇのトロンビン阻害活性を有する
ポリペプチドを得ることが可能であることが判明し、本
発明を完成したのである。

また、本発明の分泌プラスミドは、中性プロテアーゼ遺
伝子の分泌シグナル領域の３゛末端直後に、Ｎ末端のバ
リンをアラニンに、５残基目のグルタミン酸をアスパラ
ギン酸に１換した改変ヒルジンのＤＮＡ断片の５′末端
が直接結合した型のＤ　Ｎ　Ａ　ｉＪＩ域を有しおり、
このプラスミドで形質転換して得た形質転換株の菌体内
あるいは、細胞膜において、中性プロテアーゼ分泌シグ
ナルのＣ末端に存在するアミノ酸の直後にトロンビン阻
害活性を有するポリペプチドのＮ末端に存在するアミノ
酸が結合した型のポリペプチドの前駆体が合成されると
考えられる。

一般に、分泌の過程において、分泌シグナルは除去され
ることが知られてる。しかしながら、単に分泌蛋白質を
コードする遺伝子のプロモーターリボゾーム結合部位、
および分泌シグナルをコードする領域の直後に、異種蛋
白質をコードするＤ’ＪＡ断片を結合させただけでは、
菌体内で合成されると考えられる分泌シグナルの下流に
異種蛋白質が結合した型の前駆体蛋白質から分泌シグナ
ルが除去された異種蛋白質を効率よく分泌させ得ない場
合のあることを５ｃｈｅｉｎら（参考文献１５）が報告
している。また、彼らの報告は効率よく異種蛋白質を分
泌させる方法に何ら教示するところでない０本発明にお
いも、中性プロテアーゼ分泌シグナルのＣ末端に存在す
るアミノ酸の直後にＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端領域のア
ミノ酸配列を置換したトロンビン阻害活性を有するポリ
ペプチドのＮ末端が結合した型の前駆体蛋白質から、分
泌ングナルが除去された改変ヒルジンが分泌されるかど
うかは不明であった。しかも、すでに述べたように、ヒ
ルジンのＮ末端領域のアミノ酸配列（ｌから５位）は、
トロンビン阻害活性の発現に関する配列の構造保持にお
いて重要な役割を果たしていることから、このＮ末端領
域のアミノ酸を置換して構築したポリペプチドが、たと
え効率よく分泌されても、トロンビン阻害活性は低下し
てしまう可能性が高いであろうことが想像された。

本発明者らは、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端領域のアミノ
酸を置換した結果、本発明の場合、驚くべきことに、本
発明の実施例に示すように、形質転換されたバチルス・
ズブチリスによって、ＨＶｌ型ヒルジンと同レベルのト
ロンビン阻害活性を有するポリペプチドが、しかもＨＶ
Ｉ型ヒルジンの場合よりも効率よく分泌されることを見
いだした。

（作用） 本発明の一態様として示すように、バチルス・アミロリ
キファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプロモータ
ー、リボゾーム結合部位および分泌シグナル領域を利用
して分泌プラスミドを構築し、バチルス・ズブチリスに
導入して得た形質転換株を培養することにより、ヒル由
来のＨＶＩ型ヒルジンと同レベルのトロンビン阻害活性
を有するポリペプチドが高い効率で培養上清中に分泌さ
せることが可能となった。すなわち、バチルス・ズブチ
リスを宿主とした系で効率よく分泌されるトロンビン阻
害活性を有するポリペプチドを見いだし、そのポリペプ
チドを墳養上清から簡単な方法で回収精製できるトロン
ビン阻害活性を有するポリペプチドの製造法が確立され
た。

〔実施例〕

以下２本発明を具体例で説明するが本発明は。

この例により何ら限定されるものではない。

製造例１ （異種蛋白質発現分泌ベクターｐＮＰＡ２２５の構築） バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ
遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部位および分泌
シグナルをコードする領域の直後に異種蛋白質をコード
するＤＮＡ断片を挿入結合することの可能な異種蛋白質
発現分泌ベクターｐＮＰＡ２２５は第１図に示した方法
に従って構築した。

プラスミドｐＮＰＡ８４は、中性プロテアーゼ遺伝子の
プロモーター、リボゾーム結合部位、分泌シグナルおよ
び、プロペブタイドの上流域をコードする領域の下流に
、成熟α−アミラーゼタンパクをコードするＤＮＡ断片
が結合したＤＮＡ断片を有するアミラーゼ分泌プラスミ
ドである。成熟α−アミラーゼ遺伝子とは、天然に存在
するロイシンから始まるα−アミラーゼ活性を有する蛋
白質をコードするＤＮＡ断片を指す、このプラスミドｐ
ＮＰＡ８４を含む形質転換株ＭＴ−８４００（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−９２３）から、ｐ　ＮＰＡ８４をＴａｂａｋ
らの方法（参考文献２６）を用いて調製した。このｐＮ
ＰＡ８４ＤＮＡを制限酵素Ｈｐａｌｌ（全酒造製）と制
限酵素ＢａｍＨＩ　（全酒造製）とで分解して生じた約
７．８ＫｂのＤＮＡ断片（以下、ＤＮＡ断片Ａとする）
をアガロースゲルを用いた電気泳動により精製した。こ
のＤＮＡ断片Ａは、中性プロテアーゼ遺伝子のプロモー
ター、リボゾーム結合部位およびＣ末端領域を欠く分泌
シグナルをコードする９Ｎ域を含んでいる。一方、中性
プロテアーゼ遺伝子の分泌シグナル領域の直後に制限酵
素５ｔｕｌ切断部位を創製するために、ｌ　５ｍｅ　ｒ
と１８ｍａ　ｒの２種類の合成オリゴヌクレオチド（５
’　ＧＧＧＴＧＴＴＣＡＧＧＣＣＴＧ３’　、５’　Ｇ
ＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣ３’　）を改良ト
リエステル法（参考文献２７）で合成した。２種類の合
成オリゴヌクレオチド各１μｇをＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼ（全酒造製）、およびｄＡＴＰ　（ファルマシ
ア製）を用いてリン酸化した（参考文献２８）。次に、
これらの反応生成物を混ぜ、熱湯中で３分間加熱後、ゆ
っくりと冷却することにより２種類の合成オリゴヌクレ
オチドをアニールした。然る後に、ＤＮＡ断片Ａ（０，
５μｇ）とアニールした合成オリゴヌクレオチド（ｌｌ
！ｇ）をＴ４リガーゼ（全酒造製）を用いて結合し、ハ
イブリッドプラスミドｐＮＰＡ２２５を得た。

比較例１ （ＨＶＩ型ヒルジン分泌プラスミドｐＭＰＨ２０８の構
築） プラスミドｐＮＰＨ２０Ｂは第２図に示した方法に従っ
て構築した。

まず、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端から１０残基目までの
アミノ酸をコードするＤＮＡ１ｆｆ域を含むＤＮＡ断片
を構築するために、２種のオリゴヌクレオチド（５’　
ＣＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡＴＴＧＣＡＣＡＧＡ
ＡＴＣＣＧ（１，ＡＴＧ３’５’　ＧＡＴＣＣＡＴＣＣ
ＧＧＡＴＴＣＴＧＴＧＴＡＡＴＣＴＧＴＡＴＡＡＡＣＡ
ＡＣＧＧ３’）を常法に従って合成した。

次に、得られた合成オリゴヌクレオチド各１μｇは、リ
ン酸化後アニールした。これと制限酵素５ｔｕｌと制限
酵素ＢａｍＨＩとで切断したｐＮＰＡ２２５　ＤＮＡ　
（０，５μｇ）とをＴ４リガーゼ（全酒造製）を用いて
結合させ、中性プロテアゼ遺伝子の分泌シグナルをコー
ドする領域の直後にＨＶＩ型ヒルジンをコードするＤＮ
Ａ断片のＮ末端領域ＣＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端から１
０アミノ酸残基目までに対応）が結合したバイブツリド
ブラスミドｐＮＰＡ２２５ΔＨを得た。

Ｈ■１型ヒルジンのアミノ酸配列に対応するコドンをバ
チルス・ズブチリスで多く用いられているコドン、すな
わち至適コドン（参考文献２９）から選んで化学合成し
た合成りＮＡとベクターｐＢＲ３２２ＤＮＡとから構築
したプラスミドｐ４０１４による形質転換株（ＦＥＲＭ
　　Ｐ−９９２４）は既に寄託しである。ＨＶＩ型ヒル
ジンをコードするＤＮＡ断片は、この形質転換株ｐ４０
１４から次のようにして得た。まず、ｐ４０１４を制限
酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩとで切断すること
により、ＨＶＩ型ヒルジンを含むＤＮＡ断片を調製した
。このＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｅ１３の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩと制限酵素ＢａｍＨ１ｑＪ断部位に挿入結合さ
せたバイブツリドブラスミドｐ３００９を構築した（第
３図）、このｐ３００９ＤＮＡ（２μｇ）を制限酵素Ａ
ｃｃｌｌ■とＨｉｎｄｒｌｌ　とで分解することにより
、ＨＶｌ型ヒルジンの１１番目からＣ末端までのアミノ
酸配列をコードするＤ　Ｎ　Ａ　８ｉ域を含むＤＮＡ断
片（ＤＮＡ断片Ｂ）を調製アガロースゲル電気泳動によ
って精製した。このＤＮＡ断片（１μｇ）とＰＮＰＡ２
２５ΔＨを制限酵素Ａ　ｃ　ｃ　ＩＩＩ　とＨｉｎｄｒ
ｌｌ　とで分解した結果生じた約６．　ＯＫ　ｂのＤＮ
Ａ断片（ＤＮＡ断片Ｃ）（１μｇ）をＴ４リガーゼを用
いて結合し、ＨＶＩ型ヒルジン分泌プラスミドｐＮＰＨ
２０８を構築した。このｐＮＰＨ２０Ｂは、バチルス・
アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプ
ロモーター、リボゾーム結合部位および分泌シグナルを
コードする領域の直後に成熟Ｈ■１型ヒルジンをコード
するＤＮＡ断片が結合したＤＮＡ配列を含むバイブリド
プラスミドである。

比較例２ （１ｔＶ１型ヒルジン分泌プラスミドによるＨＶＩ型ヒ
ルジンの分泌生産） 比較例１で構築したプラスミドｐＮＰＨ２０８を用いて
、バチルス・ズブチリスＭＴ−４３０株（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−１０７９）をＣｈａｎｇらの方法（参考文献２４
）に従い形質転換した。得られた形質転換株ＭＴ−２０
８（ＦＲＥＭ　　Ｐ−ＩＱ０２Ｂ）を２倍濃度のＬＢ培
地を用いて、３７℃で２０時間振盪培養した。得られた
培養上清中のトロンビン阻害活性を測定した。トロンビ
ン阻害活性は、トロンビンに対する合成基質Ｈ−Ｄ−フ
ェニルアニル−Ｌ−ビベコリルーＬアルギニルーｐ−ニ
トロアニリド氷解活性の阻害度を測定することによった
（参考文献３０）、すなわち、５０μｌのトロンビン（
持出製薬製）溶液（２０ＩＵ／ｄ）と緩衝液（５０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，０）５０μ２を中性か
ら酸性で混合し、室温で２分間プレインキエベートした
のち５０μ２を、Ｈ−Ｄ−フェニルアニル−し−ビペコ
リルーＬ−アルギニルーｐ−ニトロアニリド（第−化学
薬品株式会社製）溶液に加えた（基質終濃度。

０．２５ｍＭ）、反応開始後ｐ−ニトロアニリドの遊離
を波長４０５ｎｍで測定し、単位時間当りの吸収の増加
をａとした０次に、緩衝液の代わりに、試料溶液を加え
、同様の操作を行い、波長４０５ｎｍの吸収の増加を測
定し、その値をｂとした（ａ−ｂ）／ａを算出すること
により、培養上清のトロンビン阻害活性を測定した。ト
ロンビン阻害活性ＩＵｎｉｔは、トロンビンＩＮＩＴ（
Ｕｎｉｔを中和するものとして定義される。

２倍濃度のＬＢ培地を用いて３７°Ｃで２０時間培養後
の培養上清には、培地１２あたり８０から１００■のト
ロンビン阻害活性を有するＨＶＩ型ヒルジンの蓄積が認
められた。なお、この時のバチルス・ズブチリスの生育
度を示す培養液の吸光度（Ａ６６０）は、１０であった
。

また、培養上清にトリクロロ酢酸を添加して得た沈殿を
５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅで解析した結果は、シグマ社より購
入したＨＶＩ型ヒルジンを精製して得たヒルジン標品と
同じサイズの蛋白質が多量に培養上清中に蓄積している
ことを示した。また、この蛋白質は、ゲルスキャナーデ
ンシトメーターで解析した結果、ＭＴ−２０８株の培養
上清中のＨＶＩ型ヒルジンの存在量は５％にも及んだ、
この上清を７０°Ｃで１５分間加熱処理して生じた蛋白
性の沈殿を遠心で除いて得られた上滑両分中にトロンビ
ン阻害活性は残存し、しかも、全蛋白質に対するＨＶＩ
型ヒルジンの存在比が２０％と高まり夾雑蛋白質の極め
て少ないものとなることが判明した。ＨＶＩ型ヒルジン
は、この上清から、ＤＥＡＥ−セファロースカラムクロ
マトグラフィー、ＣＭ−セファロースカラムクロマトグ
ラフィーにより精製した。すなわち、培養上清を熱処理
して得られた上清画分を、２０ｍＭ）リス塩酸バッファ
ー（ｐＨ８，０）で洗浄したＤＥＡＥ−セファロースカ
ラムに添加した後、０から０．５ＭのＮａＣ１の濃度勾
配により溶出した。得られたトロンビン阻害活性を有す
る両分を集め、２０ｍＭ酢酸ナトリウム塩酸バッファー
（ｐＨ３，０）に対して透析した後、２０ｍＭ酢酸ナト
リウム塩酸バッファー（ｐＨ３，０）で洗浄したＣＭ−
セファロースカラムに添加した。溶出は、０から０．２
ＭのＮａＣ１の濃度勾配で行った。溶出したトロンビン
阻害活性を有する百分を集め５ｙｎｃｈｒｏＰａｃｋ　
ＲＰ８　（ＳｙｎＣｈｒｏｍ、　Ｉｎｃ、製）カラムを
用いた逆相カラムクロマトグラフィーを行い、トロンビ
ン阻害活性を有するフラクシヨン、および少量のトロン
ビン阻害活性を有さないフラクシヨンを回収した。それ
らのフラクシヨンに含まれるポリペプチドを５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより解析した結果、５ＤＳ−ＰＡＧＥ的に１バ
ンドであり、しかもシグマ社より購入したヒル由来のＨ
ＶＩ型ヒルジンを精製して得たＨＶＩ型ヒルジン標品と
同じサイズの分子量を有していることが判明した。そこ
で、それらの蛋白質を用いて、そのＮ末端アミノ酸配列
を決定した（参考文献３１）ところ、ともにＶａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐであることが判明し、ヒ
ル由来のＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端アミノ酸配列に一致
した。

これらことがら、ＨＶＩ型ヒルジン分泌プラスミドで形
質転換されたバチルス・ズブチリスにより分泌生産され
るＨＶＩ型ヒルジンと同じ分子量を有するポリペプチド
は、トロンビン阻害活性の有無にかかわらず、分泌シグ
ナル部分が正確に除去されて分泌されることが判明した
。

また、トロンビン阻害実験の結果、トロンビン阻害活性
を有する蛋白質は、化学量論的にトロンビンと１：１．
１４で反応することが明らかとなった。

これらのことは、また、ＨＶＩ型ヒルジン分泌プラスミ
ドで形質転換されたバチルス・ズブチリスにより分泌生
産されるトロンビン阻害活性を有するポリペプチドは、
トロンビン阻害活性に関してヒル由来のＨＶＩ型ヒルジ
ンと同じ活性を有するものであることを示すものである
。一方、ＨＶｌ型ヒルジンと同じ構造を有しているにも
かかわらず、トロンビン阻害活性を有さない不活性型の
ポリペプチドは、トロンビン阻害活性の発現に重要なＳ
−３結合が正確に架橋されていないポリペプチドである
と考えられる。

実施例１ （分泌プラスミドｐＮＰＨ１４１の構築）プラスミドｐ
ＮＰＨ１４１は第４図に示した方法に従って構築した。

まず、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端のバリン、Ｎ末端から
５残蟇目のアスパラギン酸を、それぞれアラニン、およ
びグルタミン酸に置換したポリペプチドのＮ末端から１
０残蟇目までのアミノ酸をコードするＤ　Ｎ　Ａ　６ｉ
域を含むＤＮＡ断片を構築するために、２種のオリゴヌ
クレオチド（５’　ＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡ
ＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＧＡＴＧ３’　、５’　
ＧＡＴＣＣＡＴＣＣＧＧＡＴＴＣＴＧＴＧＣＡＣＴＣＴ
ＧＴＡＴＡＡＡＣＧＧＣＧＧ３’　）を常法に従って合
成した０次に、得られた合成オリゴヌクレオチド各１μ
ｇは、リン酸化後アニールした。これと制限酵素Ｓｔｕ
　Ｉと制限酵素ＢａｍＨＩとで切断したｐＮＰＡ２２５
　ＤＮＡ　（０，５μｇ）とをＴ４リガーゼ（宝酒造製
）を用いて結合させ、中性プロテアーゼ遺伝子の分泌シ
グナルをコードする領域の直後にＨＶＩ型ヒルジンのＮ
末端のバリン、Ｎ末端から５残蟇目のアスパラギン酸を
、それぞれアラニン、およびグルタミン酸に置換したポ
リペプチドをコードするＤＮＡ断片のＮ末端領域が結合
したバイブリドプラスミドｐＮＰＨ２２５を得た。

ＨＶＩ型ヒルジンをコードするＤＮＡ断片は。

形質転換株Ｐ４０１４から比較例１で示した方法に従っ
て調整した。すなわち、ｐ４０１４を制限酵素Ｅｃ　ｏ
ＲＩと制限酵素ＢａｍＨＩとで切断することにより、ヒ
ルジンを含むＤＮＡ断片を調製した。このＤＮＡ断片を
プラスミドｐＵｃ１３の制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素
ＢａｍＨＩ切断部位に挿入結合させたバイブツリドブラ
スミドＰ３００９を構築した。このｐ３ＱＯ９ＤＮＡ（
２μｇ）を制限酵素Ａｃｃｌｌｌ　とＨｉｎｄｌｌｌと
で分解することにより、ＨＶＩ型ヒルジンの１１番目か
らＣ末端までのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ　ＳＪ
［域を含むＤＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｂ）を調製アガロー
スゲル電気泳動によって精製した。このＤＮＡ断片（１
μｇ）とｐＮＰＨ２２５を制限酵素Ａｃｃｌｌｌ　とＨ
ｊｎｄｌｌｌとで分解した結果生じた約６．ＯＫｂのＤ
ＮＡ断片（ＤＮＡ断片Ｃ）　　（１μｇ）をＴ４リガー
ゼを用いて結合し、本発明の分泌プラスミドｐＮＰＨ１
４１を構築した。このｐＮＰＨ１４１は、バチルス・ア
ミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプロ
モータ、リボゾーム結合部位および分泌シグナルをコー
ドする領域の直後にＮ末端のバリン、および５残基目の
アスパラギン酸を、それぞれアラニン。

およびグルタミン酸に置換したポリペプチドをコードす
るＤＮＡ断片が結合したＤＮＡ配列を含むバイブリドプ
ラスミドである。

実施例２ （分泌プラスミドによるトロンビン、阻害活性を有する
ポリペプチドの分泌生産） 実施例１で構築したプラスミドｐＮＰＨ２０Ｂを用いて
、バチルス・ズブチリスＭＴ−４３０株（ＦＥＲＭ　　
ＢＰ−１０７９）をＣｈａｎｇらの方法（参考文献２４
）に従い形質転換した。得られた形質転換株ＭＴ−１４
１（ＦＲＥＭ　　ＢＰ−２４０３）を２倍濃度のＬＢ培
地を用いて、３７℃で２０時間振盪培養した。得られた
培養上清中のトロンビン阻害活性を常法に従って測定し
た。

２倍濃度のＬＢ培地を用いて３７゛Ｃで２０時間培養後
の培養上清には、培地１２あたり１８０から２００１ｇ
のトロンビン阻害活性を有するポリペプチドの蓄積が認
められた。このことは、ＨＶＩ型ヒルジンのＮ末端のバ
リン、およびＮ末端から５残基目のアスパラギン酸をそ
れぞれアラニン、およびグルタミン酸に置換したポリペ
プチドは、ＨＶＩ型ヒルジンよりも効率よく分泌された
ためと考えられる。なお、この時のバチルス・ズブチリ
スの生育度を示す培養液の吸光度（Ａ６６０）は、１０
であった。

また、培養上清にトリクロロ酢酸を添加して得た沈殿を
５ＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果は、シグマ社より購入
したＨ■１型ヒルジンを精製して得たＨＶＩ型ヒルジン
標品と同じサイズの蛋白質が多量に培養上清中に蓄積し
ていることを示した、また、この蛋白質は、ゲルスキャ
ナーデンシトメーターで解析した結果、ＭＴ−１４１株
の培養上清中のトロンビン阻害活性を有するポリペプチ
ドの存在量は７％にも及んだ、この上清を７０℃で１５
分間加熱処理して生じた蛋白性の沈殿を遠心で除いて得
られた上清百分中に、トロンビン阻害活性は残存し、し
かも、全蛋白質に対するトロンビン阻害活性を有するポ
リペプチドの存在比が２３％と高まり夾雑蛋白質の極め
て少ないものとなることが判明した。

トロンビン阻害活性を有するポリペプチドは、この上清
から、比較例２で行った方法により精製した。この場合
、比較例２に示したＨＶＩ型ヒルジン分泌生産の場合と
異なり、不活性型ヒルジン分泌蓄積は認められなかった
。この得られたトロンビン阻害活性を有するポリペプチ
ドは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ的に１バンドであり、しかもシ
グマ社より購入したヒル由来のＨＶＩ型ヒルジンを精製
して得たＨＶＩ型ヒルジン標品と同じサイズの分子量を
有していることが判明した。そこで、得られた精製ポリ
ペプチドを用いて、そのＮ末端アミノ酸配列を決定した
ところ、　Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＴｈｒＧｌｕであ
ることが判明した。

これらことから、本発明の分泌プラスミドで形質転換さ
れたバチルス・ズブチリスにより分泌生産されるポリペ
プチドは、分泌シグナル部分が正確に除去されて分泌さ
れることが判明した。

また、トロンビン阻害実験の結果、この精製ＨＶｌ型ヒ
ルジンは、化学量論的にトロンビンと１：１．３４で反
応することが明らかとなった。

これらのことは、また、本発明の分泌プラスミドで形質
転換されたバチルス・ズブチリスにより分泌生産される
ポリペプチドが、トロンビン阻害活性に関してヒル由来
のＨＶＩ型ヒルジンと同じ活性を有するものであること
を示すものである。

（文献−覧） Ｉ　　　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ＋Ｒ，口。；Ｓｅｍ１ｎ、
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ｌ、、；　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６７８３５２１　　
山口　京二ら、；　現代化学、増刊１゜２２　　Ｍａｏ
　ＳＪＴ、、；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｏｒｙ　２７．
８１７０−８１７３２３　　Ｌｏｉｓｏｎ　Ｇ、　ｅｔ
　ａｌ、、；ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　６２４　　
　Ｃｈａｎｇ、Ｓ、　　ｅｔ　　ａｔ、；　　門ｏ１．
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、＋１６８＋２５　　Ｍａｎｔａｔ
ｉｓ、Ｔ　ｅｔ　ａｌ、；”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ　。

ｐ４４０．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ２６　　Ｔａｂａｋ　Ｉ（、Ｆ、　
ｅｔ　ａｌ、　　ｉ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、、５２７　　ＣｒｅａＪ、　ｅｔ　ａｌ、、；Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７５．５
７６５（１９７８） ２８　　Ｇｏｅｄｄｅｌ　、Ｄ、Ｖ、　ｅｔ　ａｌ、＋
；Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、７６．１０６−１１０．１９７９２
９　０ｇａｓａｗａｒａ、Ｎ、ＨＧｅｎｅ、４０，１４
５−１５０（１９８５）３０　　Ｃｈａｎｇ、Ｊ、；Ｆ
！！ＢＳ　Ｌｅｔｔ、　　１６４．　３０７−３１３゜
３１　　Ｈｅｗｉｃｋ　Ｒ，Ｍ、　　ｅｔ　ａｌ、、；
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５６゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、異種蛋白質発現分泌ベクターｐＮＰＡ２２５
の構築法を示す図である。 第２図は、ＨＶＩ型ヒルジン分泌プラスミドｐＮＰＨ２
０８の構築法を示す図である。 第３図は、ヒルジンをコードするＤＮＡ塩基配列を含む
バイブリドプラスミドｐ３００９の構築法である。 第４図は、ヒルジン分泌プラスミドｐＮＰＨ１４１の構
築法を示す図である。 なお、第１図、第２図、第３図、第５図においてＰｍは
、中性プロテアーゼ遺伝子のプロモータ領域を、ＳＤは
、中性プロテアーゼ遺伝子のりボゾーム結合部位を、ｐ
ｒｅは、中性プロテアーゼ遺伝子の分泌シグナルをコー
ドする領域を、Δｐｒｏは中性プロテアーゼ遺伝子のプ
ロペブタイドの上流域を、α−ａｍｙｌａｓｅはアルフ
ァーアミラーゼをコードするＤＮＡ配列を、Ｈは、ヒル
ジンをコードするＤＮＡ配列を、ΔＨ′は、改変ヒルジ
ンをコードするＤＮＡ配列の上流域を、ΔＨは、ＨＶＩ
型ヒルジンをコードするＤＮＡ配列の上流域を、Δｐｒ
ｏｔｅａｓｅは中性プロテアーゼの後半部分を示す。 また、第１図、第３図、第４図において、Ａはアデニン
を、Ｃはシトシンを、Ｇはチミンを、Ｇはグアニンを示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）アミノ酸配列が下記のアミノ酸であることを特徴
   とするトロンビン阻害活性を有するポリペプチドの前駆
   体。 Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌ
   ｅｕ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌ
   ａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ
   −Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−
   Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａ１−Ｔｙｒ−丁ｈｒ−Ｇ
   ｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
   ｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ
   −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−
   Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌ
   ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙ
   ｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ
   −Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
   Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａ
   ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌ
   ｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ （２）アミノ酸配列が下記のアミノ酸であることを特徴
   とするトロンビン阻害活性を有するポリペプチド。 Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｔ
   ｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅ
   ｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−ＧＩｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
   −Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−
   Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓ
   ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇ１ｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌ
   ｎ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
   −Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−
   Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇ
   ｌｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙ
   ｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（３）請求項１に記載のトロンビン
   阻害活性を有するポリペプチドの前駆体をコードする下
   記のＤＮＡ配列。 ５′ＧＴＧＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣ
   ＴＡＧＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧ
   ＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＧ
   ＴＴＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡＧＴＧ
   ＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＧＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴ
   ＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＧＴＧ
   ＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＡＧＧ
   ＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴ
   ＧＴＴＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＡＣ
   ＣＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴ
   ＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡ
   ＣＡＡ３′（４）請求項２に記載のトロンビン阻害活性
   を有するポリペプチドをコードする下記ＤＮＡ配列。 ５′ＧＣＣＧＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡＧＴＧＣＡＣＡＧＡ
   ＡＴＣＣＧＧＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＴＴＡＴＧＴ
   ＧＡＡＧＡＡＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧ
   ＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＡＧＧＡＴＣＴＧＡ
   ＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴＧＴＴＡＣＡ
   ＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＡＣＣＧＣＡＡＴ
   ＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧＡＡＧＡ
   ＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡＣＡＡ３′（
   ５）バチルス・アミロリキファシエンスの中性プロテア
   ーゼ遺伝子のプロモーター、およびリボゾーム結合部位
   をコードする領域の下流にトロンビン阻害活性を有する
   ポリペプチドの前駆体をコードするＤＮＡ断片を結合さ
   せたＤＮＡ配列が、ベクターＤＮＡに結合していること
   を特徴とする分泌プラスミド。 （６）下記に示すものであることを特徴とする請求項５
   に記載するＤＮＡ配列が、ベクターＤＮＡに結合してい
   ることを特徴とする分泌プラスミド。 ５′ＧＡＴＣＴＴＡＡＣＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＡＴＣ
   ＡＴＴＴＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＴＣＡＴＴ
   ＴＴＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＣＧＴＣＡＴＴＣＧＡ
   ＣＴＣＡＴＧＴＣＴＡＡＴＣＣＡＡＣＡＣＧＴＣＴＣＴ
   ＣＴＣＧＧＣＴＴＡＴＣＣＣＣＴＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣ
   ＧＣＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＡＴＣＴ
   ＡＴＣＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＴＴ
   ＴＴＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＴＧＣＧＡＧＡＴＴＧＣＴ
   ＧＧＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＣＡＡＴＡＴＡＡＧＴＴＴＴ
   ＣＡＴＴＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＴＴＡ
   ＴＴＧＴＧＧＧＴＴＴＡＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＣ
   ＴＡＧＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧ
   ＡＧＴＴＴＡＡＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＧＧＧＴＧ
   ＴＴＣＡＧＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＡＴＡＣＡＧＡＧＴＧ
   ＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＧＧＡＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴ
   ＴＴＡＴＧＴＧＡＡＧＡＡＴＣＴＡＡＴＧＴＴＴＧＴＧ
   ＧＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＴＡＧＧ
   ＡＴＣＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＧＴ
   ＧＴＴＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＡＣ
   ＣＧＣＡＡＴＣＴＣＡＴＡＡＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＴＴ
   ＴＧＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＡ
   ＣＡＡ３′ （７）ベクターＤＮＡが、バチルス属細菌で複製可能な
   プラスミドであることを特徴とする請求項５あるいは６
   に記載の分泌プラスミド。 （８）請求項７に記載のバチルス属細菌で複製可能なプ
   ラスミドが、ｐＵＢ１１０であることを特徴とする分泌
   プラスミド。 （９）請求項５から８に記載した分泌プラスミドから任
   意に選択される一つの分泌プラスミドにより形質転換さ
   れた形質転換株。 （１０）形質転換される微生物が、バチルス・ズブチリ
   スであることを特徴とする請求項９に記載の形質転換株
   。 （１１）請求項１０に記載する形質転換株を培養し、そ
   の培養上清からトロンビン阻害活性を有するポリペプチ
   ドを回収することを特徴とするトロンビン阻害活性を有
   するポリペプチドの製造法。