JP2020520639A - S2又はs2’ポケット中の突然変異を有するサブチリシンバリアント - Google Patents
S2又はs2’ポケット中の突然変異を有するサブチリシンバリアント Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020520639A JP2020520639A JP2019563434A JP2019563434A JP2020520639A JP 2020520639 A JP2020520639 A JP 2020520639A JP 2019563434 A JP2019563434 A JP 2019563434A JP 2019563434 A JP2019563434 A JP 2019563434A JP 2020520639 A JP2020520639 A JP 2020520639A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- mutation
- enzyme
- position corresponding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 127
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 title description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 209
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims abstract description 141
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 105
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 83
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 claims abstract description 58
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 claims abstract description 58
- 102220477838 Arf-GAP with GTPase, ANK repeat and PH domain-containing protein 11_S33D_mutation Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 102220198147 rs1057519886 Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 102200094891 rs121913566 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 102220120384 rs886042566 Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 102220587526 Putative uncharacterized protein FLJ13197_N62W_mutation Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 102220499813 Carbonic anhydrase 2_N62D_mutation Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 13
- 102200083933 rs80358213 Human genes 0.000 claims abstract description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 8
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 117
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 117
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 74
- 150000002148 esters Chemical group 0.000 claims description 51
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 41
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 36
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 35
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 20
- 150000007970 thio esters Chemical group 0.000 claims description 18
- 102220499800 Carbonic anhydrase 2_N62V_mutation Human genes 0.000 claims description 10
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 5
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 5
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 5
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 102220281620 rs551111938 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 claims description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 4
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims 2
- 239000002667 nucleating agent Substances 0.000 claims 2
- JPOKAKNGULMYHZ-UILVTTEASA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N)C1=CC=C(O)C=C1 JPOKAKNGULMYHZ-UILVTTEASA-N 0.000 claims 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 abstract description 36
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 20
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 103
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 95
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 51
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 101500027298 Homo sapiens Sperm histone HP2 Proteins 0.000 description 24
- 102400000927 Sperm histone HP2 Human genes 0.000 description 24
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 24
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N Methanesulfonic acid Chemical compound CS(O)(=O)=O AFVFQIVMOAPDHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- -1 methyl- Chemical group 0.000 description 18
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 16
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 15
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 15
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 13
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 13
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 13
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 12
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 12
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 10
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 9
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 229940098779 methanesulfonic acid Drugs 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 8
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 8
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 7
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 7
- 229930182852 proteinogenic amino acid Natural products 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 7
- HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N Exenatide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N 0.000 description 6
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 6
- 150000001408 amides Chemical group 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 6
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 150000001576 beta-amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 4
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 4
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 150000003857 carboxamides Chemical group 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 3
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 3
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 3
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 3
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 3
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108010004034 stable plasma protein solution Proteins 0.000 description 3
- 108010037022 subtiligase Proteins 0.000 description 3
- NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N thymalfasin Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NZVYCXVTEHPMHE-ZSUJOUNUSA-N 0.000 description 3
- JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 2-methyltetrahydrofuran Chemical compound CC1CCCO1 JWUJQDFVADABEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 2
- PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 3-[bis(2-carboxyethyl)phosphanyl]propanoic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PBVAJRFEEOIAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- XVVOERDUTLJJHN-UHFFFAOYSA-N Lixisenatide Chemical compound C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1C(CCC1)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NCC(=O)NC(C)C(=O)N1C(CCC1)C(=O)N1C(CCC1)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(CCCCN)C(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)C(NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCSC)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)C(N)CC=1NC=NC=1)C(C)O)C(C)O)C(C)C)CC1=CC=CC=C1 XVVOERDUTLJJHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010078233 Thymalfasin Proteins 0.000 description 2
- 102400000800 Thymosin alpha-1 Human genes 0.000 description 2
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DJPVONPSNBLDSU-UHFFFAOYSA-A [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O DJPVONPSNBLDSU-UHFFFAOYSA-A 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012431 aqueous reaction media Substances 0.000 description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 description 2
- 230000001808 coupling effect Effects 0.000 description 2
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 230000002641 glycemic effect Effects 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 108010004367 lixisenatide Proteins 0.000 description 2
- 229960001093 lixisenatide Drugs 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000003439 radiotherapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 229960004231 thymalfasin Drugs 0.000 description 2
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 2
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 2
- IVWWFWFVSWOTLP-YVZVNANGSA-N (3'as,4r,7'as)-2,2,2',2'-tetramethylspiro[1,3-dioxolane-4,6'-4,7a-dihydro-3ah-[1,3]dioxolo[4,5-c]pyran]-7'-one Chemical compound C([C@@H]1OC(O[C@@H]1C1=O)(C)C)O[C@]21COC(C)(C)O2 IVWWFWFVSWOTLP-YVZVNANGSA-N 0.000 description 1
- 125000006273 (C1-C3) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006701 (C1-C7) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1,3,3,3-hexafluoropropan-2-ol Chemical compound FC(F)(F)C(O)C(F)(F)F BYEAHWXPCBROCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-7-azabenzotriazole Chemical compound C1=CN=C2N(O)N=NC2=C1 FPIRBHDGWMWJEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710171219 30S ribosomal protein S13 Proteins 0.000 description 1
- XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 4-fluoro-L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(F)C=C1 XWHHYOYVRVGJJY-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- NTFTULBKHJJQAW-HNNXBMFYSA-N 9h-fluoren-9-ylmethyl n-[(2s)-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]carbamate Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NTFTULBKHJJQAW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical class [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100337060 Caenorhabditis elegans glp-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N Carbamic acid Chemical compound NC(O)=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 108060002063 Cyclotide Proteins 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N D-alpha-phenylglycine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 1
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 239000006173 Good's buffer Substances 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073961 Insulin Aspart Proteins 0.000 description 1
- 108010089308 Insulin Detemir Proteins 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- FYZPCMFQCNBYCY-WIWKJPBBSA-N Insulin degludec Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](Cc3c[nH]cn3)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc3ccccc3)C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc3c[nH]cn3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc3ccc(O)cc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc3ccc(O)cc3)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc3ccc(O)cc3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccccc2)C(=O)N[C@@H](Cc2ccccc2)C(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N2CCC[C@H]2C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O)C(O)=O)C(O)=O)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC FYZPCMFQCNBYCY-WIWKJPBBSA-N 0.000 description 1
- COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N Insulin glargine Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(=O)NCC(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 COCFEDIXXNGUNL-RFKWWTKHSA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 description 1
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Natural products N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010026809 Peptide deformylase Proteins 0.000 description 1
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLSWIYLPEUIQAV-UHFFFAOYSA-N Semaglutide Chemical compound CCC(C)C(NC(=O)C(Cc1ccccc1)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CCCCNC(=O)COCCOCCNC(=O)COCCOCCNC(=O)CCC(NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O)C(O)=O)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(NC(=O)C(Cc1ccccc1)NC(=O)C(NC(=O)CNC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C)(C)NC(=O)C(N)Cc1cnc[nH]1)C(C)O)C(C)O)C(C)C)C(=O)NC(C)C(=O)NC(Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(C)C)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O DLSWIYLPEUIQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710135785 Subtilisin-like protease Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010049264 Teriparatide Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910001413 alkali metal ion Chemical class 0.000 description 1
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000655 anti-hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- RCHHVVGSTHAVPF-ZPHPLDECSA-N apidra Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3N=CNC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CNC=N1 RCHHVVGSTHAVPF-ZPHPLDECSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150009206 aprE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000008406 cosmetic ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N dicarbon monoxide Chemical compound [C]=C=O VILAVOFMIJHSJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N dioleoyl phosphatidic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(O)=O)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC MHUWZNTUIIFHAS-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 1
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N humalog Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 WNRQPCUGRUFHED-DETKDSODSA-N 0.000 description 1
- 229940038661 humalog Drugs 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 229960004225 insulin degludec Drugs 0.000 description 1
- 108010050259 insulin degludec Proteins 0.000 description 1
- 229960003948 insulin detemir Drugs 0.000 description 1
- 229960002869 insulin glargine Drugs 0.000 description 1
- 229960000696 insulin glulisine Drugs 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N levemir Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(=O)NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=2N=CNC=2)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=2C=CC=CC=2)C(C)C)CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)CSSC[C@H](NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H](CSSC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UGOZVNFCFYTPAZ-IOXYNQHNSA-N 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 238000005897 peptide coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 102200025035 rs786203989 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 229950011186 semaglutide Drugs 0.000 description 1
- 108010060325 semaglutide Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- CILIXQOJUNDIDU-ASQIGDHWSA-N teduglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 CILIXQOJUNDIDU-ASQIGDHWSA-N 0.000 description 1
- 108010073046 teduglutide Proteins 0.000 description 1
- 229960002444 teduglutide Drugs 0.000 description 1
- LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N teixobactin Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H]1C(N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C[C@@H]2NC(=N)NC2)C(=O)N[C@H](C(=O)O[C@H]1C)[C@@H](C)CC)=O)NC)C1=CC=CC=C1 LMBFAGIMSUYTBN-MPZNNTNKSA-N 0.000 description 1
- OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N teriparatide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 OGBMKVWORPGQRR-UMXFMPSGSA-N 0.000 description 1
- 229960005460 teriparatide Drugs 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 101150079396 trpC2 gene Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/02—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution
- C07K1/026—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length in solution by fragment condensation in solution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21062—Subtilisin (3.4.21.62)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
− 75〜83位に対応するアミノ酸の欠失;
− S221に対応するアミノ酸位置における突然変異(この突然変異は、S221C又はS221セレノシステインであり、好ましくは、S221Cである);
− F189W、F189Y、S33D、S33T、N218D、N218T、N218E、N62D、N62S、N62W、及びN62Y
に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される少なくとも1つのさらなる突然変異;
及び
好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置における突然変異;
を含み、
アミノ酸位置は、配列番号2により表されるサブチリシンBPN’の配列に従って定義される酵素に関する。
水を含む流体中でカップリングを実施し、本発明による酵素によりカップリングを触媒する方法に関する。
−オープンギャップのコスト:デフォルト=タンパク質について11
−延長ギャップのコスト:デフォルト=タンパク質について1
−予測値:デフォルト=10
−ワードサイズ:デフォルト=megablastについて28/タンパク質について3。
− サブチリシンBPN’中の75〜83位に対応するアミノ酸の欠失;
− S221に対応するアミノ酸位置における突然変異(この突然変異は、サブチリシンBPN’中のS221C又はS221セレノシステイン、好ましくは、S221Cである);
− サブチリシンBPN’中のF189W、F189Y、S33D、S33T、N218D、N218T、N218E、N62D、N62S、N62W、及びN62Y
に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される少なくとも1つのさらなる突然変異。
− M222P及びY217H;
− M222P及びY217G;
− M222G及びY217F;又は
− M222G及びY217G
である。
a)酵素をコードする遺伝子を機能的に発現する組換え宿主細胞、例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌(E.coli)又はバシラス属(Bacillus)を提供すること;
b)酵素的に活性な酵素の発現を提供する条件下で前記宿主細胞を培養すること;及び
c)前記微生物宿主から発現された酵素を回収すること
を含む方法に関する。
突然変異誘発、クローニング及び発現
BS149−DMと示される酵素は、75〜83位に対応するアミノ酸の欠失を有し、追加の突然変異Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、Y217L、N218S、S221C、P225A、T254A及びQ271Eを含む配列番号2に対応する。Hisタグを有するBS149−DMをコードする遺伝子を、pUB−110ベース大腸菌(E.coli)−枯草菌(B.subtilis)シャトルベクター(すなわち、pBS42又はpBES(国際公開第2016/056913号パンフレットも参照)中にクローニングした。対応するアミノ酸配列を、サブチリシンBPN’ナンバリングスキームに従ってナンバリングする。アミノ酸−107〜−1は、完全成熟時に開裂除去されるシグナル配列、プレ配列及びプロ配列を含む。アミノ酸1〜275は、完全触媒活性を示す成熟酵素を含む。迅速で効率的な精製を可能とするため、アミノ酸275の後にC末端Hisタグを付着させる。カルシウム結合部位の除去の結果として、BS149−DMは、サブチリシンBPN’中のL75、N76、N77、S78、I79、G80、V81、L82及びG83に対応するアミノ酸を含むサブチリシンBPN’と比較した9つのアミノ酸の欠失を含有する。BS149−DMについてのサブチリシンBPN’ナンバリングを維持するため、ナンバリングを74から83まで飛ばす。シャトルベクター中で、遺伝子の発現はaprEプロモーターの制御下である。得られたプラスミドpBES−BS149DMHISを大腸菌(E.coli)TOP10中で繁殖させ、枯草菌(B.subtilis)GX4935(trpC2 metB10 lys−3ΔnprEΔaprE)中に形質転換した。pBES−BS149DMHISをテンプレートとして使用して、Quikchange法(Agilent)により突然変異誘発を実施した。或いは、当分野において公知の部位特異的突然変異誘発の他の方法を使用することができる(Sambrook et al.,1989)。或いは、DNAをGenScript,USAにより合成し、それぞれのシャトルベクター中に取り込んだ。
目的サブチリシンバリアント遺伝子を有するプラスミドを含有する枯草菌(B.subtilis)の単一微生物コロニーを、カナマイシン(10μg/mL)を有する5mLのLB中で37℃において振盪インキュベーター中で植菌した。抗生物質(カナマイシン10μg/mL)及びアミノ酸(100mg/LのTrp、100mg/LのMet及び100mg/LのLys)が補給された30mLのテリフィックブロスに、0.6mLの一晩培養物を添加した。細胞を37℃において振盪インキュベーター(200rpm)中で48時間成長させた。細胞を遠心分離(30分間、4,000rpm、4℃)により回収した。培地(30mL)をデカントし、Amicon遠心分離ユニット(15ml、10kDaのMWのカットオフ)上で2回の遠心分離ステップ(15分間、4000rpm、4℃)において濃縮した。次いで、濃縮した培地(0.5ml)を緩衝液A(25mMのトリシン、pH7.5、0.5MのNaCl)と、3回の洗浄/濃縮ステップ(14mlの緩衝液A、10分間、4,000rpm、4℃)で交換した。Hisタグ精製のため、Talon樹脂(2.5ml、Clonetech)をプラスチックカラムカートリッジに添加した。樹脂を5mLのMilliQ水により洗浄し、5mLの緩衝液Aにより平衡化した。粗製酵素をカラム上に負荷し、オービタルシェーカーにおいて4℃において一晩インキュベートした。インキュベーション後、樹脂を25mLの緩衝液Aにより洗浄した。酵素を15mLの緩衝液B(25mMのトリシン、pH7.5、0.5MのNaCl、0.5Mのイミダゾール)により溶出させた。溶出物をAmicon遠心分離ユニット(15ml、10kDaのMWのカットオフ)上で遠心分離(30分間、4000rpm、4℃)により濃縮し、緩衝液を25mMのトリシン、pH7.5に、3回の洗浄/濃縮ステップ(15mlの緩衝液、10分間、4,000rpm、4℃)で交換した。
Abrahmsen,L,J Tom,J Burnier,K A Butcher,A Kossiakoff,and J A Wells.1991.“Engineering Subtilisin and Its Substrates for Efficient Ligation of Peptide Bonds in Aqueous Solution.”Biochemistry 30(17)(April 30):4151−9.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2021606.
Fahnestock SR,Fisher KE:Expression of the staphylococcal protein A gene in Bacillus subtilis by gene fusions utilizing the promoter from a Bacillus amyloliquefaciens alpha−amylase gene.J Bacteriol.1986 Mar;165(3):796−804
Kawamura,Fujio,and Roy H.Doi.Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases.J Bacteriol.1984 Oct;160(1):442−4
Ruan,Biao,Viktoriya London,Kathryn E Fisher,D Travis Gallagher,and Philip N Bryan.Engineering substrate preference in subtilisin:structural and kinetic analysis of a specificity mutant.Biochemistry.2008 Jun 24;47(25):6628−36.
Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.1989.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.
Wells,James A,Eugenio Ferrari,Dennis J Henner,David A Estell,and Ellson Y Chen.
Cloning,sequencing,and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis.Nucleic Acids Res.1983 Nov 25;11(22):7911−25.
材料及び方法
特に記述のない限り、化学薬品は市販源から入手し、さらに精製することなく使用した。逆相カラム(Phenomenex、C18、5μmの粒子サイズ、150×4.6mm)を使用するHP1090液体クロマトグラフ上で40℃において分析的HPLCを実施した。220nmにおいてUV−VIS204リニア分光光度計を使用してUV検出を実施した。勾配プログラムは、以下のとおりであった:0から25分間まで、5%から98%の溶出剤Bのリニア勾配ランプ及び25.1から30分間まで、5%の溶出剤B(溶出剤A:H2O中0.5mL/Lのメタンスルホン酸(MSA)、溶出剤Bアセトニトリル中0.5mL/LのMSA)。流速は、0から25.1分間まで、1mL/分及び25.2から29.8分間まで、2mL/分、次いで30分間における停止まで再び1mL/分であった。インジェクション容量は、20μLであった。固定相カラム(Pursuit XRs、C18、10μmの粒子サイズ、500×41.4mm)を使用するVarian PrepStarシステム上で分取HPLCを実施した。逆相カラム(Phenomenex、C18、5μmの粒子サイズ、150×4.6mm)を使用するAgilent 1200シリーズ液体クロマトグラフ上で40℃においてLC−MSを実施した。UV検出及び勾配プログラムは、分析的HPLCについて記載のとおりであった。Agilent 6130四重極LC/MSシステムを使用して分子量を決定した。
1グラムのFmoc−Leu−Wang樹脂(0.72mmol/グラムの負荷)をDCM(2×2分間、10mL)及びDMF(2×2分間、10mL)により洗浄し、ピペリジン/DMF(1/4、v/v、2×8分間、10mL)を使用してFmoc脱保護した。DMF(2×2分間、10mL)、DCM(2×2分間、10mL)及びDMF(2×2分間、10mL)による洗浄後、DCM(45分間、10mL)中でDCC(4当量)及びHOAt(4当量)を使用してヨード酢酸(4当量)を樹脂にカップリングさせた。DMF(2×2分間、10mL)、DCM(2×2分間、10mL)及びTHF(2×2分間、10mL)による洗浄後、DMF/THF(1/1、v/v、10mL)中で4当量のFmoc−Xxx−OH及び10当量のDiPEAを使用して50℃において20時間、樹脂にFmoc保護アミノ酸を負荷した。ここで、及び本開示の他の部分において、「Xxx」は、1つのアミノ酸(以下の実施例に属する図面に示される可変部)を意味する。
1グラムのRink樹脂(4−((2,4−ジメトキシフェニル)(Fmoc−アミノ)メチル)フェノキシアルキルリンカー、0.64mmol/グラムの負荷)をDCM(2×2分間、10mL)及びDMF(2×2分間、10mL)により洗浄し、ピペリジン/DMF(1/4、v/v、2×8分間、10mL)を使用してFmoc脱保護した。標準的SPPSプロトコルに従ってペプチドを伸長させた(Weng C.Chan and Peter White,OUP Oxford,2000)。TFA/TIS/水の混合物(95/2.5/2.5、v/v/v、15mL)を使用して樹脂からの開裂及び側鎖脱保護を120分間実施した。MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を使用して粗製ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離により回収し、MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)により2回洗浄し、次いでアセトニトリル/水(1/1、v/v、50mL)から凍結乾燥させた。
プロトコル1の1つによる所望の配列のSPPS後、ピペリジン/DMF(1/4、v/v、2×8分間、10mL)を使用して樹脂結合ペプチドをFmoc脱保護した。樹脂をDMF(2×2分間、10mL)、DCM(2×2分間、10mL)及びDMF(2×2分間、10mL)により洗浄し、Ac2O(10容量%)、DiPEA(5容量%)、HOBt(0.2重量%)のDMF(2×10分間、10mL)中混合物を使用してペプチドN末端アミン官能基をアセチル化した。樹脂をDMF(3×2分間、10mL)及びDCM(3×2分間、10mL)により洗浄した。TFA/TIS/水の混合物(95/2.5/2.5、v/v/v、15mL)を使用して樹脂からの開裂及び側鎖脱保護を120分間実施した。MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)を使用して粗製ペプチドを沈殿させた。沈殿したペプチドを遠心分離により回収し、MTBE/n−ヘプタン(1/1、v/v、50mL)により2回洗浄し、次いでアセトニトリル/水(1/1、v/v、50mL)から凍結乾燥させた。
注:BS149−DMと示される酵素は、75〜83位に対応するアミノ酸の欠失を有し、追加の突然変異Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、Y217L、N218S、S221C、P225A、T254A及びQ271Eを含む配列番号2に対応する。実施例1〜5において使用される全ての他の酵素は、BS149−DMのそれら全ての突然変異と、実施例に挙げられる追加の突然変異を有する。上記の技術を使用してBS149−DM及びさらなる突然変異を有する酵素を産生した。
P2’ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのP1’及びP2’ポケット基質特異性のマッピング:
様々な突然変異体のP1’及びP2’ポケット基質特異性を決定するため、以下の2つの標準反応を実施した。800μLのリン酸緩衝液(100mM、pH8.0)を、100μLのトリペプチドC末端アミド原液(300μLの水中の0.01mmolの、P1’ポケットについてのH−Xxx−Leu−Arg−NH2.2TFA及びP2’ポケットについてのH−Ala−Xxx−Arg−NH2.2TFA)及び100μLのペンタペプチドC末端Cam−エステル原液(1200μLの水中の0.01mmolのAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA)の混合物に添加した。この混合物に、5.5μgの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた(150rpm)。30分後、反応混合物の550μLのアリコートを抜き取り、500μLのMSA/水(1/99、v/v)によりクエンチし、LC−MSにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残りのペンタペプチドC末端Cam−エステルピークを積分した。面積%産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残りのペンタペプチドC末端Cam−エステルの量の合計により割ったものと定義する。
P2’ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのP2’ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のP2’ポケット基質特異性を決定するため、以下の反応を実施した。最初に、基質プレミックス(20μl)を、10mMのペンタペプチドCam−エステルAc−Asp−Phe−Ser−Lys−Leu−OCam.TFA及び15mMのC末端アミドH−Ala−Xxx−Lys−Lys(DNP)Lys−NH2.2TFA(DNPは、ジニトロフェニル保護基である)の最終濃度を有するそれぞれの水中原液から調製した。この混合物に、TCEP(トリス−(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、0.1mg/ml)が補給された1Mのトリシン緩衝液pH8.5中の20μlの酵素溶液を添加した。ウェル当たり合計0.4μgの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた(150rpm)。30分後、反応混合物の10μLのアリコートを抜き取り、150μLのMSA/水(2/98、v/v)によりクエンチし、350μlの水により希釈し、LC−MSにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残りのペンタペプチドC末端Cam−エステルピークを積分した。面積%産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残りのペンタペプチドC末端Cam−エステルの量の合計により割ったものと定義する。データをスクリーニングにおいて得られた最大変換率に関して100%に正規化した。
P2ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのP2ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のP2ポケット基質特異性を決定するため、以下の標準反応を実施した。800μLのリン酸緩衝液(100mM、pH8.0)を、100μLのトリペプチドC末端アミド原液(300μLの水中の0.01mmolのH−Ala−Leu−Arg−NH2.2TFA)及び200μLのペンタペプチドC末端Cam−エステル原液(1.2mLの水中の0.01mmolのAc−Asp−Phe−Ser−Xxx−Leu−OCam.TFA+1mLのアセトニトリル)の混合物に添加した。Xxx位におけるアミノ酸が異なるこれら全てのペプチドエステルとのカップリングを実施した。
P2ポケット中の突然変異を有する様々な酵素バリアントのP2ポケット基質特異性のマッピング
様々な突然変異体のP2ポケット基質特異性を決定するため、以下の反応を実施した。最初に、基質プレミックス(15μl)を、10mMのペンタペプチドCam−エステルAc−Asp−Phe−Ser−Xxx−Leu−OCam.TFA及び10mMのC末端アミドH−Ala−Leu−Lys−Lys(DNP)−Lys−NH2.2TFAの最終濃度を有するそれぞれの水中原液から調製した。この混合物に、TCEP(トリス−(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩、0.1mg/ml)が補給された1Mのトリシン緩衝液pH8.5中の50μlの酵素溶液を添加した。ウェル当たり合計0.25μgの酵素を添加し、反応混合物を室温において振盪させた(150rpm)。30分後、反応混合物の25μLのアリコートを抜き取り、475μLのMSA/水(2/98、v/v)によりクエンチし、500μlの水により希釈し、LC−MSにより分析した。カップリング産物、加水分解したペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残りのペンタペプチドC末端Cam−エステルピークを積分した。面積%産物は、規定の反応時間内の、産物の量を産物、加水分解したペンタペプチドC末端Cam−エステル及び残りのペンタペプチドC末端Cam−エステルの量の合計により割ったものと定義する。
BS149−DMPHV及びBS149−DMPHNV+F189Wを使用する2つの断片からのエキセナチドの合成
2つ組(duplo)において、300mgのH−His1−Gly2−Glu3−Gly4−Thr5−Phe6−Thr7−Ser8−Asp9−Leu10−Ser11−Lys12−Gln13−Met14−Glu15−Glu16−Glu17−Ala18−Val19−Arg20−Leu21−OCam−Leu−OH.3TFA及び200mgのH−Phe22−Ile23−Glu24−Trp25−Leu26−Lys27−Asn28−Gly29−Gly30−Pro31−Ser32−Ser33−Gly34−Ala35−Pro36−Pro37−Pro38−Ser39−NH2.2TFAを1mLのリン酸緩衝液(0.2M)中で溶解させ、水性NaOH(5M)を使用してpHを8.3に調整した。この混合物に、100μLのBS149−DMPHV(1mg/mL、実験1)又は100μLのBS149−DMPHNV+F189W(1mg/mL、実験2)を添加し、反応混合物を37℃において振盪させた(200rpm)。60分後、反応混合物を9mLのMSA/水(1/9、v/v)によりクエンチし、LC−MSにより分析した。Cam−エステル出発材料、加水分解したC末端Cam−エステル及びエキセナチド産物ピークを積分した。エキセナチド産物の量は、BS149−DMPHV(実験1)について89%(11%の加水分解)及びBS149−DMPHNV+F189W(実験2)について97%(3%の加水分解)であった。
BS149−DM+222P+217H+225N+107V+189Wを使用するシクロチドMcoTI−IIの合成
1mgのH−Ile−Leu−Lys−Lys−Cys−Arg−Arg−Asp−Ser−Asp−Cys−Pro−Gly−Ala−Cys−Ile−Cys−Arg−Gly−Asn−Gly−Tyr−Cys−Gly−Ser−Gly−Ser−Asp−Gly−Gly−Val−Cys−Pro−Lys−OCam−Leu−OHを1mLのリン酸緩衝液(1M)中で溶解させ、水性NaOH(5M)を使用してpHを8.3に調整した。この混合物に、10μLのBS149−DM+222P+217H+225N+107V+189W(1mg/mL)を添加し、反応混合物を周囲温度において静置しておいた。60分後、反応混合物を9mLのMSA/水(1/9、v/v)によりクエンチし、LC−MSにより分析した。Cam−エステル出発材料、加水分解したCam−エステル及び環式McoTI−II産物ピークを積分した。環式産物の量は、93%(7%の加水分解)であった。
配列番号1:サブチリシンBPN’アミノ酸−107〜275をコードする野生型遺伝子
ENA|K02496|K02496.1 B.サブチリシンBPN’バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)
Claims (19)
- サブチリシンBPN’バリアント又はそのホモログである酵素であって、配列番号2により表されるサブチリシンBPN’又はそのホモログ配列と比較した以下の突然変異:
− 75〜83位に対応するアミノ酸の欠失;
− S221に対応するアミノ酸位置における突然変異であって、前記突然変異は、S221C又はS221セレノシステイン、好ましくは、S221Cに対応する突然変異;
− F189W、F189Y、S33D、S33T、N218D、N218T、N218E、N62D、N62S、N62W、及びN62Y
に対応するアミノ酸位置からなる群から選択される少なくとも1つのさらなる突然変異;
好ましくは、P225に対応するアミノ酸位置における突然変異
を含み、
前記アミノ酸位置は、配列番号2により表されるサブチリシンBPN’の配列に従って定義される酵素。 - F189W又はF189Yに対応し、好ましくは、F189Wに対応するアミノ酸位置における前記酵素のS2’ポケット中の突然変異を含む、請求項1に記載の酵素。
- N218に対応する前記アミノ酸位置におけるアミノ酸が、N、D又はTである、請求項2に記載の酵素。
- N218D、N218T又はN218Eに対応し、好ましくは、N218Dに対応するアミノ酸位置における前記酵素の前記S2’ポケット中の突然変異を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の酵素。
- S33D又はS33Tに対応し、好ましくは、S33Dに対応するアミノ酸位置における前記酵素の前記S2ポケット中の突然変異を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の酵素。
- S33Dに対応するアミノ酸位置における前記酵素の前記S2ポケット中の突然変異を含み、N62Sに対応する前記S2’ポケット中の突然変異をさらに含む、請求項5に記載の酵素。
- S33Tに対応するアミノ酸位置における前記酵素の前記S2ポケット中の突然変異を含み、N62W又はN62Vに対応する前記S2’ポケット中の突然変異をさらに含む、請求項5に記載の酵素。
- M222P、Y217H、P225N、F189W、N218D及びI107Vに対応する突然変異をさらに含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の酵素。
- N62D、N62S、N62Y又はN62Wに対応し、好ましくは、N62Dに対応するアミノ酸位置における前記酵素の前記S2ポケット中の突然変異を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の酵素。
- F189、N218、S33及びN62に対応する位置の群から選択される少なくとも2つの位置、好ましくは、少なくとも3つの位置が突然変異を含み、
F189に対応する前記位置における前記突然変異が、F189Y又はF189Wに対応し;
N218に対応する前記位置における前記突然変異が、N218D、N218T又はN218Eに対応し;
S33に対応する前記位置における前記突然変異が、S33D又はS33Tに対応し;
F62に対応する前記位置における前記突然変異が、N62D、N62S、N62W又はN62Yに対応する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の酵素。 - F189、N218、S33及びN62に対応する位置の群から選択される4つ全ての位置が突然変異を含み、
F189に対応する前記位置における前記突然変異が、F189Y又はF189Wに対応し;
N218に対応する前記位置における前記突然変異が、N218D、N218T又はN218Eに対応し;
S33に対応する前記位置における前記突然変異が、S33D又はS33Tに対応し;
F62に対応する前記位置における前記突然変異が、N62D、N62S、N62W又はN62Yに対応する、請求項10に記載の酵素。 - P225N、P225D、P225S、P225C、P225G、P225A、P225T、P225V、P225I、P225L、P225H及びP225Qに対応し、好ましくは、P225N、P225D、P225S、P225C、P225G、P225A又はP225Tに対応するアミノ酸位置の群から選択されるP225に対応する前記アミノ酸位置における突然変異を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の酵素。
- 配列番号2のQ2、S3、P5、S9、I31、K43、M50、A73、E156、G166、G169、S188、Q206、N212、T254及びQ271に対応するアミノ酸位置における突然変異の群から選択される1〜16個、特に6〜15個、より特に12〜14個の突然変異を含み、好ましくは、前記突然変異の1つ以上、より好ましくは、前記突然変異の少なくとも6つ、最も好ましくは、前記突然変異の少なくとも12個が、Q2K、S3C、P5S、S9A、I31L、K43N、M50F、A73L、E156S、G166S、G169A、S188P、Q206C、N212G、T254A及びQ271Eに対応する位置の群から選択される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の酵素。
- ペプチドを酵素的に合成する方法であって、(a)ペプチドC末端エステル又はチオエステル及び(b)N末端無保護アミンを有するペプチド求核剤をカップリングさせることを含み、
水を含む流体中で前記カップリングを実施し、
請求項1〜13のいずれか一項に記載の酵素により前記カップリングを触媒する方法。 - 前記ペプチドC末端エステル若しくはチオエステル又は前記ペプチド求核剤が、タンパク質である、請求項14に記載の方法。
- 前記タンパク質が、抗体、抗体断片、ペプチドベース受容体リガンド、アルブミン、ビオチン、成長因子、ホルモン及びナノボディの群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記ペプチドC末端エステル若しくはチオエステル、前記ペプチド求核剤、又はその両方が、2〜100個のアミノ酸単位、特に5〜50個のアミノ酸単位、より特に8〜40個のアミノ酸単位を有するペプチド鎖を含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチドC末端エステル若しくはチオエステルが、ペプチドC末端エステル若しくはチオエステルと、ポリアルキレングリコール(特にポリエチレングリコール)、脂肪酸及びポリシアル酸の群から選択される部分とのコンジュゲートであり、並びに/又は前記ペプチド求核剤が、ペプチド求核剤と、ポリアルキレングリコール(特にポリエチレングリコール)、脂肪酸及びポリシアル酸の群から選択される部分とのコンジュゲートである、請求項14〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも12個のアミノ酸の環式ペプチドを酵素的に合成する方法であって、N末端無保護アミンを有するペプチドC末端エステル又はチオエステルを環化ステップに供することを含み、水を含む流体中で前記環化を実施し、
請求項1〜13のいずれか一項に記載の酵素により前記環化を触媒する方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP17171981.8A EP3404036A1 (en) | 2017-05-19 | 2017-05-19 | Subtilisin variants having a mutation in the s2 or s2' pocket |
EP17171981.8 | 2017-05-19 | ||
PCT/NL2018/050332 WO2018212658A1 (en) | 2017-05-19 | 2018-05-18 | Subtilisin variants having a mutation in the s2 or s2' pocket |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020520639A true JP2020520639A (ja) | 2020-07-16 |
JP7246323B2 JP7246323B2 (ja) | 2023-03-27 |
Family
ID=58765716
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019563434A Active JP7246323B2 (ja) | 2017-05-19 | 2018-05-18 | S2又はs2’ポケット中の突然変異を有するサブチリシンバリアント |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10336994B2 (ja) |
EP (2) | EP3404036A1 (ja) |
JP (1) | JP7246323B2 (ja) |
KR (1) | KR20200007840A (ja) |
CN (1) | CN110621687A (ja) |
CA (1) | CA3060389A1 (ja) |
WO (1) | WO2018212658A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20240043897A1 (en) | 2021-02-12 | 2024-02-08 | Fresenius Kabi Ipsum S.R.L. | Subtilisin variants and their use |
EP4122944A1 (en) | 2021-07-21 | 2023-01-25 | EnzyTag B.V. | Enzymatic synthesis of cyclic peptides |
WO2024133313A1 (en) | 2022-12-19 | 2024-06-27 | Enzypep B.V. | Thermostable subtilisin variants and their use |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996027671A1 (en) * | 1995-03-03 | 1996-09-12 | Genentech, Inc. | Subtilisin variants capable of cleaving substrates containing basic residues |
JP2013506022A (ja) * | 2009-09-25 | 2013-02-21 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ変異体の使用 |
WO2016056913A1 (en) * | 2014-10-10 | 2016-04-14 | Enzypep B.V. | Peptide fragment condensation and cyclisation using a subtilisin variant with improved synthesis over hydrolysis ratio |
JP2017079756A (ja) * | 2009-12-09 | 2017-05-18 | ダニスコ・ユーエス・インク | プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE69131834T2 (de) | 1990-08-09 | 2000-05-31 | Genentech, Inc. | Serinproteasevarianten mit peptidligase aktivität |
EP1071793A2 (en) * | 1998-03-26 | 2001-01-31 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Tryptophan biosynthetic enzymes |
US6541235B1 (en) * | 2000-09-29 | 2003-04-01 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Calcium free subtilisin mutants |
-
2017
- 2017-05-19 EP EP17171981.8A patent/EP3404036A1/en not_active Withdrawn
-
2018
- 2018-05-18 WO PCT/NL2018/050332 patent/WO2018212658A1/en unknown
- 2018-05-18 CA CA3060389A patent/CA3060389A1/en active Pending
- 2018-05-18 KR KR1020197034972A patent/KR20200007840A/ko not_active Application Discontinuation
- 2018-05-18 JP JP2019563434A patent/JP7246323B2/ja active Active
- 2018-05-18 EP EP18731214.5A patent/EP3628046A1/en active Pending
- 2018-05-18 CN CN201880031625.0A patent/CN110621687A/zh active Pending
- 2018-11-16 US US16/193,963 patent/US10336994B2/en active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996027671A1 (en) * | 1995-03-03 | 1996-09-12 | Genentech, Inc. | Subtilisin variants capable of cleaving substrates containing basic residues |
JP2013506022A (ja) * | 2009-09-25 | 2013-02-21 | ノボザイムス アクティーゼルスカブ | プロテアーゼ変異体の使用 |
JP2017079756A (ja) * | 2009-12-09 | 2017-05-18 | ダニスコ・ユーエス・インク | プロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 |
WO2016056913A1 (en) * | 2014-10-10 | 2016-04-14 | Enzypep B.V. | Peptide fragment condensation and cyclisation using a subtilisin variant with improved synthesis over hydrolysis ratio |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
CHANG T K ET AL.: "Subtiligase: A tool for semisynthesis of proteins.", PNAS, vol. 91(26), JPN7022001201, 1994, pages 12544 - 12548, ISSN: 0004892909 * |
TOPLAK ANA ET AL.: "Peptiligase, an Enzyme for Efficient Chemoenzymatic Peptide Synthesis and Cyclization in Water.", ADVANCED SYNTHESIS & CATALYSIS, vol. 358(13), JPN7022001200, 2016, pages 2140 - 2147, ISSN: 0004892908 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110621687A (zh) | 2019-12-27 |
KR20200007840A (ko) | 2020-01-22 |
WO2018212658A1 (en) | 2018-11-22 |
CA3060389A1 (en) | 2018-11-22 |
US10336994B2 (en) | 2019-07-02 |
EP3628046A1 (en) | 2020-04-01 |
EP3404036A1 (en) | 2018-11-21 |
US20190078069A1 (en) | 2019-03-14 |
JP7246323B2 (ja) | 2023-03-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10253061B2 (en) | Peptide fragment condensation and cyclisation using a subtilisin variant with improved synthesis over hydrolysis ratio | |
US10883132B2 (en) | Chemo-enzymatic synthesis of Semaglutide, Liraglutide and GLP-1 | |
US10752931B2 (en) | Designing an enzymatic peptide fragment condensation strategy | |
US10858414B2 (en) | Chemo-enzymatic synthesis of semaglutide, liraglutide and GLP-1 | |
JP7246323B2 (ja) | S2又はs2’ポケット中の突然変異を有するサブチリシンバリアント | |
KR20230144058A (ko) | 서브틸리신 변이체 및 그의 용도 | |
WO2017222369A1 (en) | Enzymatic coupling of (oligo)peptides to the b-chain of an insulin receptor ligand | |
EP3299085A1 (en) | Peptide coupling molecule | |
CN117098843A (zh) | 枯草杆菌蛋白酶变体及其用途 | |
WO2024133313A1 (en) | Thermostable subtilisin variants and their use | |
Toplak et al. | General Introduction: Enzymatic Synthesis of Bioactive Peptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210514 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20220309 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220322 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220622 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220622 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221011 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230106 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230221 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230314 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7246323 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |