KR20200007840A - S2 또는 s2' 포켓에 돌연변이를 갖는 서브틸리신 변이체 - Google Patents

S2 또는 s2' 포켓에 돌연변이를 갖는 서브틸리신 변이체 Download PDF

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티모 나위옌스
페테르 얀 레오나르트 마리오 퀴에드플리히
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엔지펩 비.브이.
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Abstract

본 발명은, SEQ ID NO: 2로 표시되는 서브틸리신 BPN' 또는 그의 동족체 서열과 비교하여 하기 돌연변이를 포함하는, 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체에 관한 것이며, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서브틸리신 BPN'의 서열에 따라 정의된다: - 위치 75 내지 83에 상응하는 아미노산의 결실; - S221에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이로서, S221C 또는 S221셀레노시스테인(selenocysteine), 바람직하게는 S221C에 상응하는, 돌연변이; - F189W, F189Y, S33D, S33T, N218D, N218T, N218E, N62D, N62S, N62W, 및 N62Y에 상응하는 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 돌연변이; 바람직하게는 P225에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이. 추가로 본 발명은 펩타이드를 효소적으로 합성하는 것에 관한 것이다.

Description

S2 또는 S2' 포켓에 돌연변이를 갖는 서브틸리신 변이체
본 발명은 효소에 관한 것이며, 이 효소는 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체이다. 추가로, 본 발명은 상기 효소가 사용되는, 펩타이드를 효소적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
펩타이드는 예를 들어 제약, 식품 또는 사료 성분, 또는 미용 성분으로서 많은 용도를 갖는다.
펩타이드를 합성하는 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다. 올리고펩타이드는 고도로 최적화된 공정을 통해 용액 중에서 또는 고체상에서 단계적인 방식으로 화학적으로 합성될 수 있다. 그러나, 10 내지 15개 아미노산보다 긴 펩타이드는 종종 부반응으로 인해 합성하기가 매우 어렵고, 결과적으로 정제가 곤란하다. 따라서, 10개 아미노산보다 긴 펩타이드는, 예를 들어 20개 아미노산의 펩타이드를 만들기 위한 10 + 10 축합에서와 같이, 용액 중에서 후속하여 화학적으로 축합되는 측쇄 보호된 올리고펩타이드 단편의 고체상 합성의 조합에 의해 종종 합성된다. 화학적 측쇄 보호된 올리고펩타이드 단편 축합의 주요 단점은 아실 공여체의 C-말단 아미노산 잔기의 활성화 시에 라세미화가 발생한다는 것이다. 대조적으로, 효소-촉매 펩타이드 커플링은 라세미화가 전혀 없고, 화학적 펩타이드 합성에 비해 측쇄 작용기 상에서의 부반응의 부재와 같은 몇 가지의 다른 이점을 갖는다. 산업적 적용의 경우, 동역학적 접근법에 기반한, 즉, 아실 공여체 C-말단 에스테르를 사용하는 효소적 펩타이드 합성 개념이 가장 매력적이다(예를 들어, 문헌[N. Sewald and H.-D. Jakubke, in: "Peptides: Chemistry and Biology", 1st reprint, Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2002] 참조).
화학-효소적 펩타이드 합성은 화학적 합성, 발효를 사용하거나 화학적 커플링 단계와 효소적 커플링 단계를 조합하여 개별적으로 합성된 올리고펩타이드 단편들의 효소적 커플링을 수반할 수 있다. 수성 용액 중에서의 올리고펩타이드 단편들의 효소적 축합에 관해 일부 보고서가 발표되었다(문헌[Kumaran et al. Protein Science, 2000, 9, 734]; 문헌[Bj
Figure pct00001
rup et al. Bioorg. Med. Chem. 1998, 6, 891]; 문헌[Homandberg et al. Biochemistry, 1981, 21, 3387]; 문헌[Komoriya et al. Int. J. Pep. Prot. Res. 1980, 16, 433]).
바실러스 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens)(SEQ ID NO: 2)로부터의 서브틸리신인 서브틸리신 BPN'의 활성 부위를 변경함으로써 수성 용액 중에서의 올리고펩타이드들의 축합이 유의하게 개선될 수 있음이 웰스(Wells) 등에 의해 밝혀졌다(US 5,403,737). 2개의 돌연변이, 즉, S221C 및 P225A가 도입되었을 경우, 야생형 서브틸리신 BPN'와 비교하여 500배 증가된 합성 대 가수분해 비(S/H 비)를 갖는, 서브틸리가제(subtiligase)라 불리는 서브틸리신 BPN' 변이체가 수득되었다. 추가의 실험에서, 웰스 등은 서브틸리가제에 5개의 추가적인 돌연변이, 즉, M50F, N76D, N109S, K213R 및 N218S를 부가하여 효소를 더욱 안정적으로 만들었다(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 12544]). 스타빌리가제(stabiligase)라 불리는 새로운 돌연변이체는 소듐 도데카설페이트 및 구아니디늄 하이드로클로라이드에 약간 더 내성인 것으로 나타났지만, 가수분해가 여전히 주요 부반응이었다. 예를 들어, 펩타이드 카복시아미도메틸-에스테르(Cam-에스테르)는, 스타빌리가제를 사용하여 44%의 수율로 펩타이드 아민에 리게이션되었다. 이 예에서, 10 당량의 펩타이드 C-말단 에스테르가 사용되었으며, 이에 따라 9.56 당량의 펩타이드 C-말단 에스테르가 C-말단 에스테르 작용기에서 가수분해되었고, 0.44 당량만이 펩타이드 아민에 리게이션되어 생성물을 형성하였다. 아마도 이러한 이유로, 본 발명자들이 아는 한, 지난 20년 동안 서브틸리가제 또는 스타빌리가제는 효소적 펩타이드 합성에서 산업적으로 적용된 적이 없었다.
WO 2016/056913에서, SEQ ID NO: 2로 표시되는 서브틸리신 BPN' 또는 그의 동족체 서열과 비교하여 하기 돌연변이를 포함하는, 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체를 제공함으로써, 수성 환경에서 펩타이드 합성에 사용될 경우 서브틸리가제 또는 스타빌리가제와 같은 효소가 직면하는 바람직하지 않게 높은 가수분해 활성에 대한 해결책이 제공된다: 위치 75 내지 83에 상응하는 아미노산의 결실, S221에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이, S221C 또는 S221셀레노시스테인인 돌연변이, 및 바람직하게는 하나 이상의 추가의 돌연변이. 특히, 상기 효소는 2개의 펩타이드 단편의 축합 또는 펩타이드의 고리화에 의해 펩타이드를 제조하는 효소적 방법에서 유용하며, 수성 반응 매질에서 서브틸리신 BPN'에 비해 개선된 합성 대 가수분해(S/H) 비 및 안정성을 제공한다. 또한, 단백질이 또 다른 펩타이드에 효과적으로 커플링되는 방법이 개시되어 있다.
단편 축합 또는 고리화에 의한 펩타이드의 효소적 합성에 사용될 수 있는 추가의 효소가 필요한 실정이다. 일반적으로, 이러한 필요성은, 특히 특정 펩타이드를 만들기 위한 도구의 팔레트(palette)를 넓히기 위해 존재한다.
특히, S/H 비를 유지하거나 개선하면서 펩타이드 아실 공여체 및 펩타이드 친핵체에 대한 넓은 기질 범위를 제공하는, 추가의 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체를 제공할 필요가 있다.
커플링 부위의 끝에서 2번째(penultimate) 포켓, 즉, 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체의 S2' 포켓 및/또는 S2 포켓에 하나 이상의 특정 돌연변이를 갖는 효소를 제공함으로써 이러한 필요성이 충족되는 것으로 현재 밝혀졌다. 특히, S2' 포켓에서의 하나 이상의 특정 돌연변이는 펩타이드 친핵체의 P2' 위치뿐만 아니라 펩타이드 친핵체의 P1' 위치에 대해서도 기질 범위를 넓힌다. 특히, S2 포켓에서의 하나 이상의 특정 돌연변이는 펩타이드 아실 공여체의 P2 위치뿐만 아니라 펩타이드 친핵체의 P1' 및 P2' 위치에 대해서도 기질 범위를 넓힌다.
따라서, 본 발명은, SEQ ID NO: 2로 표시되는 서브틸리신 BPN' 또는 그의 동족체 서열과 비교하여 하기 돌연변이를 포함하는, 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체인 효소로서, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서브틸리신 BPN'의 서열에 따라 정의되는, 효소에 관한 것이다:
- 위치 75 내지 83에 상응하는 아미노산의 결실;
- S221에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이로서, S221C 또는 S221셀레노시스테인(selenocysteine), 바람직하게는 S221C인 돌연변이;
- F189W, F189Y, S33D, S33T, N218D, N218T, N218E, N62D, N62S, N62W, 및 N62Y에 상응하는 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 돌연변이; 및
바람직하게는 P225에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이.
본 발명에 따른 효소는 촉매로서 유용하다. 효소는 일반적으로 펩타이드 결합의 형성과 관련하여 촉매 활성을 갖는다(축합 활성). 특히, 효소는 리가제 활성 또는 사이클라제 활성을 갖는다.
따라서, 추가로 본 발명은, (a) 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르와 (b) N-말단 비보호된 아민을 갖는 펩타이드 친핵체를 커플링하는 단계를 포함하는, 펩타이드를 효소적으로 합성하는 방법으로서, 커플링은 물을 포함하는 유체에서 수행되고, 커플링은 본 발명에 따른 효소에 의해 촉매되는, 방법에 관한 것이다.
따라서, 추가로 본 발명은, N-말단 비보호된 아민을 갖는 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르를 고리화 단계에 적용하는 단계를 포함하는, 적어도 12개 아미노산의 사이클릭 펩타이드를 효소적으로 합성하는 방법으로서, 상기 고리화는 물을 포함하는 유체에서 수행되고, 고리화는 본 발명에 따른 효소에 의해 촉매되는, 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 펩타이드 및 펩타이드-접합체로 연장된 단백질을 포함하는, 펩타이드를 제조하는 공지된 방법에 대한 유용한 대안을 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 효소는, 특히 물을 포함하는 반응 매질에서, 보다 구체적으로는 수성 매질에서, 전형적으로 1 초과, 바람직하게는 2 이상, 특히 5 이상의 높은 S/H 비를 나타내면서 펩타이드 결합의 형성에서 촉매 활성을 갖는다. 이 지수의 상한값은 중요하지 않은데, 실제로 이는 예를 들어 100 이하, 특히 20 이하일 수 있다.
특히, 본 발명은, 특히 수성 반응 매질에서, S/H 비를 적어도 실질적으로 유지하거나 개선하면서 (더) 넓은 기질 범위를 갖는 효소를 제공한다.
도 1a: BS149-DMGF 및 BS149-DMGF + F189W/Y의 P2' 기질 범위.
도 1b: BS149-DMPH 및 BS149-DMPH + F189W의 P2' 기질 범위.
도 1c: BS149-DMPHNV 및 BS149-DMPHNV + F189W의 P2' 기질 범위
도 1d: BS149-DMPHNV 및 BS149-DMPHNV + F189W의 P1' 기질 범위
도 2: BS149-DMGFN 및 BS149-DMGFN + N218D/T에 대한 P2' 기질 범위
도 3: BS149-DMPHV 및 BS149-DMPHV + S33D/T에 대한 P2 기질 범위.
도 4: BS149-DMPHV 및 BS149-DMPHV + N62D/S/W/Y에 대한 P2 기질 범위.
도 5: BS149-DM PHN F189W 및 BS149-DM PHN F189W + N218D에 대한 P2' 기질 범위.
도 6: BS149-DMPHNWDV S33D, BS149-DMPHNWDV N62S 및 BS149-DMPHNWDV S33D + N62S에 대한 P2 기질 범위
도 7: BS149-DMPHNWDV S33T, BS149-DMPHNWDV N62V/W 및 BS149-DMPHNWDV S33T + N62W/V에 대한 P2 기질 범위
본 발명의 목적상, "합성 대 가수분해 비"(S/H 비)는, 효소적으로 합성된 (올리고)펩타이드 생성물의 양을, 에스테르기 또는 티오에스테르기가 가수분해된 (올리고)펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르의 양으로 나눈 값을 의미한다. S/H 비를 결정하는 것에 대한 더 상세한 내용은 WO 2016/056913을 참조한다.
적어도 실시예에 기재된 조건 하에서, 서브틸리신 BPN'의 S/H 비로 나눈 본 발명에 따른 효소의 S/H 비는 일반적으로 100 초과, 바람직하게는 250 이상, 더욱 바람직하게는 500 이상, 특히 1000 이상이다. 이 지수의 상한값은 중요하지 않은데, 이는 무한대에 근접할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "또는(or)"은 달리 명시되지 않거나 '....또는 ...(either ….or…)'을 의미하는 문맥으로부터 나온 것이 아니면 "및/또는"으로 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 단수형의 용어는 달리 명시되지 않거나 단수형만을 언급하는 문맥으로부터 나온 것이 아니면 "적어도 하나"로 정의된다.
명사(예를 들어, 화합물, 첨가제 등)를 단수형으로 언급할 경우, 단수형만을 언급하는 문맥으로부터 나온 것이 아니면 복수형이 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원과 관련하여, 용어 "약"은 주어진 값으로부터 특히 10% 이하, 보다 구체적으로는 5% 이하, 보다 더 구체적으로는 3% 이하의 편차를 의미한다.
용어 "필수적인(필수적으로)" 또는 "(적어도) 실질적인(실질적으로)"은 명시되는 것의 일반적인 특징 또는 기능을 갖는다는 것을 나타내기 위해 본원에서 일반적으로 사용된다. 정량화 가능한 특징을 언급할 경우, 특히 이 용어는 그 특징의 최대치의 적어도 75%, 보다 구체적으로는 90% 초과, 보다 더 구체적으로는 98% 초과임을 나타내기 위해 사용된다. 용어 "본질적으로 없는"은 물질이 존재하지 않거나(유효 출원일에 이용 가능한 분석 방법으로 달성 가능한 검출 한계 미만이거나), 상기 물질이 본질적으로 없는 생성물의 특성에 유의하게 영향을 미치지 않을 정도의 적은 양으로 존재함을 나타내기 위해 본원에서 일반적으로 사용된다. 실제로, 정량적인 견지에서, 물질의 함량이 이것이 존재하는 생성물의 총 중량을 기준으로 0 내지 0.1 중량%, 특히 0 내지 0.01 중량%, 보다 구체적으로는 0 내지 0.005 중량%인 경우, 생성물은 그 물질이 본질적으로 없는 것으로 일반적으로 간주된다.
입체이성질체들이 존재하는 화합물을 언급할 경우, 화합물은 그러한 입체이성질체들 중 임의의 것 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 거울상 이성질체가 존재하는 아미노산으로 언급될 경우, 아미노산은 L-거울상 이성질체, D-거울상 이성질체 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 천연 입체이성질체가 존재하는 경우, 화합물은 바람직하게는 천연 입체이성질체이다.
용어 'pH'는 겉보기 pH, 즉, 표준의 보정된 pH 전극으로 측정된 바와 같은 pH에 대해 본원에서 사용된다.
본 발명의 목적상, "펩타이드"는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 사슬을 의미한다. 따라서, 일반적으로 펩타이드는, 형식적인 물 손실과 함께 하나의 아미노 카복실산 분자(즉, 아미노산)의 카보닐 탄소로부터 또 다른 아미노 카복실산 분자의 질소 원자로 공유 결합을 형성함으로써 적어도 개념적으로 2개 이상의 아미노 카복실산 분자로 구성된 아미드이다. 용어 '펩타이드'는 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 포함한다. 용어 '펩타이드'는 일반적으로 알파-아미노산으로 형성된 구조에 적용되지만, 펩타이드는 다른 아미노산, 예컨대 하나 이상의 베타-아미노산 및/또는 하나 이상의 감마-아미노산을 포함할 수 있다. 펩타이드는 선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있다. 펩타이드는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 단일 사슬을 가질 수 있거나, 펩타이드는 복수의 사슬(즉, 키메라 펩타이드)을 가질 수 있다. 펩타이드가 둘 이상의 사슬로 구성되는 경우, 각 사슬은 일반적으로 3개 이상의 아미노산 분자로 구성된다.
펩타이드의 아미노산 서열은 1차 구조로 지칭된다.
일 구현예에서, 펩타이드에는 2차 구조가 본질적으로 없고 3차 구조가 본질적으로 없다.
추가의 구현예에서, 펩타이드는 2차 구조를 갖는다. 2차 구조는 개별 아미노산과 펩타이드 골격 사이의 상호 작용에 의한, 알파-나선 및 베타-시트(또는 베타-가닥)와 같은, 일반적으로 매우 규칙적인 국소 하위 구조이다.
일 구현예에서, 펩타이드(키메라 펩타이드일 수 있음)는 3차 구조를 갖는다. 3차 구조는 일반적으로 다수의 상호 작용, 특히, 수소 결합, 소수성 상호 작용, 반데르발스 상호 작용, 이온 상호 작용 및 이황화물 결합에 의해 형성된다. 2차 구조는 또한 3차 구조에 기여할 수 있다. 3차 구조는 3차원 형상(이는 본질적으로 안정적인 환경에서, 예컨대 온도 변화가 없는 경우 및 펩타이드가 존재하는 매질에 변화가 없는 경우 등에서 본질적으로 고정됨)을 제공한다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 3차 구조는 임의의 고정된 3차원 구조가 결여된 랜덤 코일(random coil) 펩타이드 사슬과 상이하다. 인슐린, 알부민, 항체, 펩타이드-기반 수용체 리간드와 같은 단백질은 3차 구조를 갖는 펩타이드의 예이다. 또한, 다양한 펩타이드-기반 호르몬이 3차 구조를 갖는다. 그의 예는 에리트로포이에틴 EPO 및 펩타이드-기반 성장 인자를 포함한다.
이황화물 결합(이황화물 다리)는 전형적으로 (산화에 의해 형성된) 2개의 시스테인 단위 사이의 결합이다. 따라서, 동일한 펩타이드 사슬(아미노산 서열) 내의 2개의 아미노산은, 아미노산 서열에서 인접 아미노산들이 아닌 경우에도 공유 결합될 수 있다. 또한, 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있는, 제1 펩타이드 사슬의 제1 시스테인과 제2 펩타이드 사슬의 제2 시스테인 사이에 이황화물 결합이 형성되어 펩타이드를 형성할 수 있다. 그러한 펩타이드는 하나 초과의 펩타이드 사슬을 포함한다. 하나 초과의 펩타이드 사슬로 구성된 펩타이드의 예는 인슐린이고, 여기서 상이한 사슬들은 이황화물 결합을 통해 결합되어 있다.
일 구현예에서, 커플링되거나 고리화된(커플링되거나 고리화될) 펩타이드는 본질적으로 아미노산 단위로 이루어진다. 추가의 구현예에서, 커플링되거나 고리화된(커플링되거나 고리화될) 펩타이드는 본질적으로 아미노산 단위 및 보호기로 이루어진다.
일 구현예에서, 커플링되거나 고리화될 펩타이드는 2개 이상의 아미노산의 펩타이드 사슬과 탄수화물 또는 지방산과 같은 또 다른 잔기의 접합체이다. 이들 펩타이드는 각각 글리코펩타이드 및 리포펩타이드로 불린다. 지방산은, 예를 들어 용해도를 변화시키기 위해 사용될 수 있다. 적합한 지방산의 예는 C8 내지 C24 포화 지방산 및 C8 내지 C24 불포화 지방산이다.
추가의 구현예에서, 커플링되거나 고리화된(커플링되거나 고리화될) 펩타이드는 폴리알킬렌 글리콜과 같은 합성 친수성 중합체로 변형된 펩타이드이다. 특히 바람직한 폴리알킬렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜이다. 그러한 중합체는, 예를 들어 용해도, 또는 (예컨대, 혈장에서의) 생체내 반감기를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 커플링되거나 고리화된(커플링되거나 고리화될) 펩타이드는 펩타이드와 폴리시알산의 접합체이다.
커플링되거나 고리화된(커플링되거나 고리화될) 펩타이드는 펩타이드와, 영상화제, 방사선 치료제, 독소 또는 또 다른 비펩타이드성 제제, 예를 들어, 킬레이트제 또는 비펩타이드성 생물학적 활성 모이어티의 접합체일 수 있다.
일 구현예에서, 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르 및/또는 펩타이드 친핵체는 생물학적 활성 펩타이드, 예를 들어, 인슐린 수용체 리간드 또는 호르몬이다. 바람직한 인슐린 수용체 리간드는 인간 인슐린, 돼지 인슐린, 휴마로그(Humalog), 아스파트(aspart), 인슐린 글루리신(glulisine), 인슐린 데테미르(detemir), 인슐린 데글루덱(degludec), 및 글라진(glargine) 인슐린이다.
바람직한 호르몬은 성장 인자이다.
추가로, 본 발명에 따라 합성될 수 있거나 본 발명에 따른 커플링 반응에서 기질로서 사용될 수 있는 생물학적 활성 펩타이드의 바람직한 예는 엑세나타이드(Exenatide), 엑세나타이드 유사체(예컨대, Glp-1, 테두글루타이드(Teduglutide), 글루카곤, 릭시세나타이드(Lixisenatide), 리라글루타이드(Liraglutide) 및 세마글루타이드(Semaglutide)의 군으로부터 선택된 유사체), 티모신(Thymosin)-알파-1, 티모신-알파-1 유사체, 테리파라타이드(Teriparatide), 이들 중 임의의 것의 서열 및 하나 이상의 추가의 아미노산 단위를 하나 이상 포함하는 펩타이드를 포함한다. 엑세나타이드, 릭시세나타이드 또는 그의 유사체를 포함하는 접합체는 제2형 진성 당뇨병의 치료에서, 특히, 메트포르민을 복용하지만 적절한 혈당 제어를 달성하지 못한 제2형 진성 당뇨병 환자의 혈당 제어를 개선하기 위한 보조 요법으로 사용될 수 있다. 티모신-알파-1 또는 그의 유사체를 포함하는 접합체는 세포-매개 면역을 향상시킴으로써 혜택을 받는 환자에서 사용될 수 있다. 이들 약제학적 펩타이드 중 하나 이상에 대한 본 발명에 따른 특히 적합한 합성 방법은, 선택적으로 PCT/NL2016/050501 또는 WO 2016/056913과 조합된 본 개시에 기초할 수 있다.
일 구현예에서, 펩타이드를 효소적으로 합성하는 방법은, 영상화제 모이어티(예를 들어, 발색성, 형광성, 인광성, 방사성), 방사선-치료용 모이어티 또는 생물학적 활성 펩타이드를 함유하고 특정 부위, 예를 들어, 특정 기관 조직으로 제1 펩타이드를 표적화하여 전달하기 위한 단백질을 함유하는 펩타이드를 합성하는 데 사용된다. 그러한 구현예에서, 단백질은 영상화제 모이어티, 방사선-치료용 모이어티 또는 생물학적 활성 펩타이드를 함유하는 또 다른 펩타이드에 커플링된다. 이들 중 어느 하나는 펩타이드 친핵체, 또는 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르일 수 있다.
그러한 목적에 적합한 단백질의 잘 알려진 예는 항체, 특히, 면역글로불린 또는 그의 부분, 예컨대 면역글로불린의 항원-결합 단편(Fab) 또는 단일-도메인 항체(나노바디)이다. 본 발명에 따라 커플링될 수 있는 항체의 특정 예는 IgG, IgA, IgE, IgM 및 IgD이다.
일 구현예에서, 또 다른 (생물학적 활성) 펩타이드의 반감기를 증가시키기에 적합한 단백질이, 특히 그 (생물학적 활성) 펩타이드의 혈장 반감기를 증가시키기 위해, 다른 (생물학적 활성) 펩타이드에 커플링된다. 알부민은 또 다른 (생물학적 활성) 펩타이드의 반감기를 증가시키기 위해 커플링될 수 있는 단백질의 예이다. 이들 중 어느 하나는 펩타이드 친핵체, 또는 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르일 수 있다.
전형적으로, 펩타이드(이 용어는 올리고펩타이드, 단백질 및 키메라 펩타이드를 포함함)는 최대 약 35,000개의 아미노산 단위, 특히 3 내지 20,000개의 아미노산 단위, 보다 구체적으로는 4 내지 5,000개의 아미노산 단위, 바람직하게는 6 내지 1000개의 아미노산 단위를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 펩타이드는 500개 이하, 특히 200개 이하, 보다 구체적으로는 100개 이하의 아미노산 단위를 포함한다. 특히 바람직한 구현예에서, 펩타이드는 적어도 10개의 아미노산 단위, 더욱 구체적으로 적어도 15개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산 또는 적어도 40개의 아미노산을 포함한다.
"올리고펩타이드"는 본 발명의 맥락에서 2 내지 200개 아미노산 단위, 특히 5 내지 100개 아미노산 단위, 보다 구체적으로는 10 내지 50개 아미노산 단위로 구성된 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 목적상, "펩타이드 결합"은 (i) 하나의 알파-아미노산의 알파-아미노 말단 또는 하나의 베타-아미노산의 베타-아미노 말단과 (ii) 다른 하나의 알파-아미노산의 알파-카복실 말단 또는 다른 하나의 베타-아미노산의 베타-카복실 말단 사이의 아미드 결합을 의미한다. 바람직하게는, 펩타이드 결합은 하나의 알파-아미노산의 알파-아미노 말단과 또 다른 알파-아미노산의 알파-카복실 말단 사이에 존재한다.
본 발명의 목적상, "사이클릭 펩타이드"는 펩타이드 사슬을 의미하고, 여기서 분지형 또는 선형 펩타이드의 알파-아미노 말단과 알파-카복실 말단은 펩타이드 결합을 통해 연결되어 적어도 12개 아미노산 단위의 고리 구조를 형성한다. 사이클릭 펩타이드는 특히 12 내지 200개 아미노산 단위로 구성되고, 보다 구체적으로는 12 내지 100개 아미노산 단위로 구성되고, 바람직하게는 12 내지 50개 아미노산 단위로 구성된다.
본 발명의 맥락에서 "아미노산 측쇄"는 임의의 단백질생성 또는 비단백질생성 아미노산 측쇄를 의미한다.
단백질생성 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩되는 아미노산이다. 단백질생성 아미노산은 알라닌(Ala), 발린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 메티오닌(Met), 시스테인(Cys), 아스파라긴(Asn), 글루타민(Gln), 티로신(Tyr), 트립토판(Trp), 글리신(Gly), 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu), 히스티딘(His), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 프롤린(Pro) 및 페닐알라닌(Phe)을 포함한다. 셀레노시스테인(Sec, U)은 아미노산이며, 그 구조는 시스테인에 상응하는데, 단, 이는 황 원자 대신에 셀레늄을 함유한다. 단백질생성 아미노산은 상기 아미노산의 L-입체이성질체이다(입체이성질체 형태를 갖지 않는 글리신은 제외함).
비단백질생성 아미노산은 특히 D-아미노산, L- 또는 D-페닐글리신, DOPA(3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌), 베타-아미노산, 4-플루오로-페닐알라닌, 또는 Cα-알킬화 아미노산 중에서 선택될 수 있다.
용어 "(티오)에스테르"는 본원에서 문구 "에스테르 또는 티오에스테르"의 약칭으로서 사용된다.
단백질 또는 폴리펩타이드, 특히 효소와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이된" 또는 "돌연변이"는, 야생형 또는 자연 발생적 단백질 또는 폴리펩타이드 서열 내의 적어도 하나의 아미노산이 이러한 아미노산을 인코딩하는 핵산의 돌연변이 유발을 통해 상이한 아미노산으로 대체되거나, 그 서열 내로 삽입되거나, 그 서열로 첨가되거나, 그 서열로부터 결실되었음을 의미한다. 돌연변이 유발은 당업계에 잘 알려진 방법이며, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989)]에 기재된 바와 같은 PCR에 의한 또는 올리고뉴클레오타이드-매개 돌연변이 유발을 통한 부위-지정 돌연변이 유발을 포함한다. 유전자와 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "돌연변이된" 또는 "돌연변이"는, 그 유전자의 핵산 서열 또는 그의 조절 서열 내의 적어도 하나의 뉴클레오타이드가 돌연변이 유발을 통해 상이한 뉴클레오타이드로 대체되거나, 그 서열 내로 삽입되거나, 그 서열로 첨가되거나, 그 서열로부터 결실되어, 정성적이거나 정량적으로 변경된 기능을 갖는 단백질 서열의 전사를 야기하거나 그 유전자의 넉아웃(knock-out)을 야기했음을 의미한다.
본 명세서에서, 아미노산 치환을 나타내기 위한 약칭은 치환되는 아미노산의 단일 문자 아미노산 코드에 이어, 단백질 아미노산 서열에서 치환이 이루어지는 위치를 표시하는 번호를 사용한다. 이 번호는 야생형 아미노산 서열의 아미노산 위치이다. 따라서, 돌연변이된 아미노산 서열의 경우, 이는 야생형 효소 내에서 그 번호를 갖는 위치에 상응하는 아미노산 위치이다. 더 낮은 위치에서의 하나 이상의 다른 돌연변이(부가, 삽입, 결실 등)로 인해, 실제 위치는 동일할 필요가 없다. 당업자는 일반적으로 알려진 정렬 기법, 예컨대 NEEDLE을 이용하여 상응하는 위치를 결정할 수 있을 것이다. 번호에는 그곳에 있는 야생형 아미노산을 대체하는 아미노산의 단일 문자 코드가 뒤따른다. 예를 들어, F189W는 위치 189에 상응하는 위치에서 페닐알라닌이 트립토판으로 치환되는 것을 나타낸다. X는 치환될 아미노산 이외의 임의의 다른 단백질생성 아미노산을 나타내기 위해 사용된다. 예를 들어, F189X는 위치 189에 상응하는 위치에서 페닐알라닌이 임의의 다른 단백질생성 아미노산으로 치환되는 것을 나타낸다.
용어 "리가제"는 제1 펩타이드의 C-말단과 또 다른 펩타이드의 N-말단을 커플링하는 것에 의한 펩타이드 결합의 형성을 촉매함으로써 2개의 펩타이드의 커플링에서 촉매 활성을 갖는 효소에 대해 본원에서 사용된다.
스케쳐(Schechter) 및 베르거(Berger)에 의해 정의된 바와 같이, 리가제를 포함하는 프로테아제 내의 활성 부위 잔기는 하위부위(subsite)들로 명명되는 연속 포켓들으로 구성된다. 각각의 하위부위 포켓은 본원에서 서열 위치로 지칭되는 펩타이드 기질 서열 내의 상응하는 잔기에 결합한다. 이 정의에 따르면, 기질 서열 내의 아미노산 잔기는 절단 부위로부터 바깥쪽으로 ...-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-...(잘라지기 쉬운 결합은 P1과 P1' 위치 사이에 위치함)로 연속적으로 번호가 매겨지는 한편, 활성 부위 내의 하위부위(포켓)는 -S4-S3-S2-S1-S1'-S2'-S3'-S4'-로 상응하게 표지된다.(문헌[Schechter and Berger, Biochem Biophys Res Commun. 1967 Apr 20;27(2):157-62.]). 모든 프로테아제가 상기 하위부위의 전부를 갖는 것은 아님을 주목해야 한다. 예를 들어, S3' 및/또는 S4' 포켓은 본 발명에 따른 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체에 없을 수 있다.
본 발명의 목적상, "S1, S2, S3 및 S4 포켓"은 펩타이드 아실 공여체의 아미노산과 상호 작용하는 프로테아제(특히, 리가제)의 아미노산을 의미한다. 아실 공여체 펩타이드의 C-말단 아미노산(첫 번째 아미노산; P1)은 프로테아제의 S1 포켓 내의 아미노산과 상호 작용한다. 아실 공여체 펩타이드의 끝에서 2번째 아미노산(C-말단 단부로부터의 2번째 아미노산; P2)은 프로테아제의 S2 포켓 내의 아미노산과 상호 작용하고, 3번째 아미노산(P3)은 S3과 상호 작용하며, 4번째 아미노산(P4)은 S4 포켓과 상호 작용한다. 프로테아제의 S1 내지 S4 결합 포켓은, 프로테아제의 1차 구조에서는 떨어져 있을 수 있지만 3차원 공간에서는 근접한 몇몇 아미노산에 의해 정의된다. 본 발명의 목적상, S1' 및 S2' 포켓은 펩타이드 친핵체의 N-말단 아미노산과 상호 작용하는 프로테아제의 아미노산을 의미한다. 펩타이드 친핵체의 N-말단 아미노산은 프로테아제의 S1' 포켓 내의 아미노산과 상호 작용한다. 펩타이드 친핵체의 N-말단 끝에서 2번째 아미노산은 프로테아제의 S2' 포켓 내의 아미노산과 상호 작용한다. 프로테아제의 S1' 및 S2' 결합 포켓은, 프로테아제의 1차 구조에서는 떨어져 있을 수 있지만 3차원 공간에서는 근접한 몇몇 아미노산에 의해 정의된다.
괄호 사이에 있는 효소 부류(EC)를 참조하여 효소가 언급될 경우, 효소 부류는 효소가 국제 분자생물학 및 생화학 연합의 명명 위원회(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, NC-IUBMB)에 의해 제공된 효소 명명법(Enzyme Nomenclature)에 기초하여 분류되거나 분류될 수 있는 부류이며, 이 명명법은 http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/에서 찾을 수 있다. 특정 부류로 (아직) 분류되지 않았지만 그와 같이 분류될 수 있는 다른 적합한 효소를 포함시키고자 한다.
동족체는 전형적으로 그것이 동족체인 펩타이드 또는 효소와 공통되는 의도된 기능을 가지는데, 예컨대 동일한 반응, 특히 본 발명에 따른 방법의 효소적 커플링 또는 고리화 반응을 촉매할 수 있다.
아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열은 특정 수준의 유사성을 나타낼 경우 상동성이라고 한다. 두 상동성 서열이 밀접하게 관련되어 있는지 또는 더 먼 관계인지는 각각 높거나 낮은 "동일성 퍼센트" 또는 "유사성 퍼센트"로 표시된다.
용어 "상동성", "상동성 퍼센트", "동일성 퍼센트" 또는 "유사성 퍼센트"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 2개의 아미노산 서열의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해, 완전한 서열들이 최적 비교 목적으로 정렬되는 것으로 본원에서 정의된다. 두 서열 사이의 정렬을 최적화하기 위해, 비교되는 두 서열 중 임의의 것에 갭이 도입될 수 있다. 그러한 정렬은 비교되는 서열들의 전장에 걸쳐 수행된다. 대안적으로, 정렬은 더 짧은 길이, 예를 들어 약 20개, 약 50개, 약 100개 이상의 핵산 또는 아미노산에 걸쳐 수행될 수 있다. 동일성 백분율은 보고된 정렬된 영역에 걸친 두 서열 사이의 동일한 일치부의 백분율이다.
서열들의 비교 및 두 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 이루어질 수 있다. 당업자는 두 서열을 정렬하고 두 서열 사이의 상동성을 결정하기 위해 몇몇 상이한 컴퓨터 프로그램이 이용 가능하다는 사실을 알고 있을 것이다(문헌[Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley]). 두 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 두 서열의 정렬을 위한 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.(문헌[Needleman, SB and Wunsch, CD (1970) J. Mol. Biol. 48, pp 443-453]). 니들만-분쉬 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 NEEDLE에서 구현되었다. 본 발명의 목적상, EMBOSS 패키지로부터의 NEEDLE 프로그램이 사용되었다(버전 2.8.0 이상, 문헌[EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,I. and Bleasby,A. Trends in Genetics 16, (6) pp 276―277], http://emboss.bioinformatics.nl/). 단백질 서열의 경우, EBLOSUM62가 치환 행렬에 대해 사용된다. 다른 행렬이 지정될 수 있다. 아미노산 서열의 정렬에 사용되는 선택적 파라미터는 10의 갭-개방 페널티(gap-open penalty) 및 0.5의 갭 연장 페널티(gap extension penalty)이다. 당업자는 상이한 이들 파라미터 모두가 약간 상이한 결과를 산출할 것이지만, 상이한 알고리즘을 사용할 경우 두 서열의 전체 동일성 백분율은 유의하게 변경되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
두 정렬된 서열 사이의 상동성 또는 동일성은 다음과 같이 계산된다: 정렬 내의 총 갭 개수를 감산한 후 정렬의 총 길이로 나눈 두 서열 모두에서 동일한 아미노산을 나타내는 정렬 내의 상응하는 위치의 개수. 본원에 정의된 바와 같은 동일성은 NOBRIEF 옵션을 사용하여 NEEDLE로부터 얻을 수 있으며, 프로그램의 출력물에서 "최장-동일성"으로 표지된다. 본 발명의 목적상, 두 서열 사이의 동일성(상동성) 수준은, NEEDLE 프로그램을 사용하여 수행될 수 있는 바와 같은 "최장-동일성"의 정의에 따라 계산된다.
폴리펩타이드 서열, 특히 효소 서열은 서열 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위해, 예를 들어, 다른 패밀리 구성원 또는 관련 서열을 확인하기 위해, "질의 서열(query sequence)"로서 추가로 사용될 수 있다. 그러한 검색은 BLAST 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해 공개적으로 이용 가능하다. BLASTP가 아미노산 서열에 대해 사용된다. BLAST 프로그램은 다음을 디폴트(default)로 사용한다:
- 갭 개방 코스트(cost to open gap): 단백질의 경우 디폴트 = 11
- 갭 연장 코스트(cost to extend gap): 단백질의 경우 디폴트 = 1
- 예상 값: 디폴트 = 10
- 워드사이즈(wordsize): 메가블라스트(megablast)의 경우 디폴트 = 28/단백질의 경우 디폴트 = 3.
또한, 아미노산 서열 질의와 검색된 상동성 서열 사이의 국소 동일성(상동성)의 정도는 BLAST 프로그램에 의해 결정된다. 그러나, 특정 임계치를 초과하는 일치를 제공하는 서열 세그먼트들만이 비교된다. 따라서, 프로그램은 이러한 일치하는 세그먼트들에 대해서만 동일성을 계산한다. 따라서, 이러한 방식으로 계산된 동일성은 국소 동일성으로 지칭된다.
용어 "동족체"는 본원에서, 동족체 펩타이드 또는 효소와 비교되는 펩타이드, 특히 효소와, 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는, 특히 펩타이드, 보다 구체적으로는 효소에 대해 사용된다. 명백하게, 서열 동일성은 100% 미만일 것이다. 서열 동일성의 백분율은 돌연변이의 개수 및 동족체와 비교되는 펩타이드(효소)의 길이에 좌우될 것이다. '최장 동일성' 정렬에서는 결실이 고려되지 않는다.
본 발명의 목적상, "축합"이란 펩타이드의 C-말단 카복실산 작용기와 친핵체, 특히 또 다른 펩타이드의 N-말단 아민 작용기 사이의 새로운 아미드 결합의 형성을 의미한다.
펩타이드의 "유사체"라는 용어는 특히 상기 펩타이드의 구조적 유사체 및/또는 기능적 유사체인 펩타이드에 대해 사용된다. 기능적 유사체는 동일한 생체내 표적(예를 들어, 세포막 상의 동일한 표적 수용체)을 가지며; 구조적 유사체는 아미노산 서열에서 높은 유사성을 갖는다. 펩타이드의 기능적 유사체는 전체 아미노산 서열에 걸쳐, 예를 들어 약 50% 이하의 비교적 낮은 아미노산 서열 동일성을 갖지만, 이들이 유사체인 펩타이드에 대해 아미노산 서열의 세그먼트에서, 예컨대 N-말단 부분 근처 또는 C-말단 부분 근처에서 높은 서열 동일성(이에 따라 높은 구조적 유사성)을 가질 수 있다. 특히 구조적 유사체는 펩타이드가 유사체인 펩타이드의 아미노산 서열과 적어도 60%, 보다 구체적으로는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
명확성 및 간결한 설명을 위해, 특징들이 동일하거나 개별적인 구현예들의 일부로서 본원에 설명되지만, 본 발명의 범위는 설명된 특징들의 전부 또는 일부의 조합을 갖는 구현예들을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 본원에서 구체적으로 정의되지 않은 본원에서 사용된 용어는 WO 2016/056913에 정의된 바와 같거나, 그곳에 정의되지 않은 경우에는 통상의 일반 지식에 따라 사용된다.
펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르는 전형적으로 활성화된 (티오)에스테르이다. 즉, 이는 효소적 커플링 반응에 참여할 수 있는 카복시 에스테르기 또는 카복시 티오에스테르기를 함유한다. 원칙적으로, 임의의 (치환되거나 비치환된) 알킬 또는 (치환되거나 비치환된) 아릴 (티오)에스테르가 사용될 수 있다. 효소적 커플링 반응에 참여할 수 있는 (티오)에스테르의 전형적인 예는 메틸-, 에틸, 프로필-, 이소프로필-, 페닐-, 벤질-(예컨대 p-카복시-벤질-), 2,2,2-트리클로로에틸-, 2,2,2-트리플루오로에틸-, 시아노메틸- 및 카복시아미도메틸-(티오)에스테르이다.
특히 양호한 결과는 화학식 펩타이드-(C=O)-O-CX1X2-C(=O)N-R1R2로 표시되는 카복시아미도메틸-유형 에스테르로 얻어졌다. 여기서, 각각의 X1 및 X2는 독립적으로 수소 원자 또는 알킬기를 나타낸다. 양호한 결과는 X1 및 X2가 모두 수소 원자일 때(펩타이드-(C=O)-O-CH2-C(=O)N-R1R2)에 달성되었다. 여기서 R1은 수소 원자 또는 알킬기를 나타내고, R2는 수소 원자 또는 알킬기, 또는 아미노산의 측쇄 작용기 상에서 또는 아미노산들의 하나 이상의 측쇄 작용기들 상에서 선택적으로 보호된 C-말단 카복시아미드 또는 카복실산 작용기를 갖는 아미노산 또는 펩타이드 잔기를 나타낸다. 여기서, 각 알킬기는 독립적으로 (치환되거나 비치환된) C1 내지 C7 알킬기, 바람직하게는 (치환되거나 비치환된) 선형 C1 내지 C6 알킬기, 더욱 바람직하게는 (치환되거나 비치환된) 선형 C1 내지 C3 알킬기를 나타낼 수 있고, 가장 바람직하게는 메틸기일 수 있다. 양호한 결과는, 특히, R1 및 R2 둘 모두가 수소 원자를 나타내거나, R1은 수소 원자를 나타내고 R2는 아미노산의 측쇄 작용기 상에서 또는 아미노산들의 하나 이상의 측쇄 작용기들 상에서 선택적으로 보호된 C-말단 카복시아미드 또는 카복실산 작용기를 갖는 아미노산 또는 펩타이드 잔기를 나타내는, 본 발명의 방법에서 달성되었다. 특히 양호한 결과는, X1, X2, R1 및 R2가 수소 원자일 경우, Cam-에스테르를 사용하는 경우에 달성되었다.
또한 특히 양호한 결과는, 카복실 치환된 벤질 에스테르, 특히 화학식 펩타이드-(C=O)-O-CH2-C6H4-CO2E로 표시되는 p-카복실 치환된 벤질 에스테르로 얻어졌는데, 여기서 E는 수소 원자, 양 하전된 염 이온, 예컨대 암모늄 이온, 또는 아미노산의 측쇄 작용기 상에서 또는 아미노산들의 하나 이상의 측쇄 작용기들 상에서 선택적으로 보호된 C-말단 카복시아미드 또는 카복실산 작용기를 갖는 아미노산 또는 펩타이드 잔기를 나타낸다. 또한 양호한 결과는 화학식 펩타이드-(C=O)-O-CH2-C6H4-CO2E로 표시되는 p-카복실 치환된 벤질 에스테르로 얻어졌는데, 여기서 E는 상기한 바와 같이 정의되고, 페닐 고리(상기 화학식 중의 C6H4) 내의 하나 이상의 수소 원자는 하이드록시, 알콕시, 아릴옥시 또는 할로겐과 같은 치환기에 의해 대체된다.
펩타이드 C-말단 (티오)에스테르는 N-말단 비보호되거나 N-말단 보호될 수 있다.
용어 'N-말단 보호'는 펩타이드의 N-말단 아민기에 보호기가 제공되어, 일반적으로 또 다른 펩타이드 또는 동일한 펩타이드 분자의 C-말단 카복실기에 커플링되는 것으로부터 N-말단 아민기를 적어도 실질적으로 보호하는 것을 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
특히, 양호한 결과는 보호된 측쇄 작용기가 없는 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르로 달성되었다.
일 구현예에서, 하나 이상의 측쇄 작용기(특히 하이드록실기, 카복실기 또는 아민기), 예를 들어 모든 측쇄 작용기에 보호기가 제공된다. 바람직한 구현예에서, 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 P4 및 P1 위치에 있는 아미노산의 측쇄 작용기(특히 하이드록실기, 카복실기 또는 아민기)에만 보호기가 제공된다. 적합한 보호기는 당업자에게 공지되어 있다. 카복실산기는 예를 들어 사이클로헥실기, 벤질기 또는 알릴기로 보호될 수 있고; 아민 작용기는 예를 들어 알릴옥시카보닐기 또는 트리플루오로아세틸기로 보호될 수 있다.
펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 활성화된 C-말단 (티오)에스테르기는 고체상 합성을 이용하여 라세미화 없이 높은 수율 및 순도로 합성될 수 있다. R1이 수소 원자를 나타내고 R2가 아미노산의 측쇄 작용기 상에서 또는 아미노산들의 하나 이상의 측쇄 작용기들 상에서 선택적으로 보호된 C-말단 카복실산 작용기를 갖는 아미노산 또는 펩타이드 잔기를 나타내는, 카복시아미도메틸 유형의 (티오)에스테르를 사용하는 것의 추가적인 이점은, 이들의 활성화된 C-말단 에스테르기 또는 티오에스테르기가 저렴하고 산업적으로 이용 가능한 2-클로로트리틸클로라이드 수지를 사용하여 합성될 수 있다는 것이다.
펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 활성화된 C-말단 (티오)에스테르기는 또한 용액상 합성 또는 미생물을 사용한 발효에 의해 합성될 수 있다. 발효를 사용하여 펩타이드 (티오)에스테르를 얻기 위한 신뢰할 만한 방법은 소위 인테인(intein) 발현을 통한 것이다(예를 들어, 문헌[E.K. Lee, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2010, 9, 11-18] 참조). 다양한 인테인 발현 시스템 키트는 상업적으로 이용 가능하다(예를 들어, IMPACT™키트). 펩타이드 (티오)에스테르의 발효적 생산을 위한 다른 방법은 당업계에 공지되어 있다.
펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 C-말단 아미노산 및 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 다른 아미노산은 원칙적으로 임의의 단백질생성 또는 비단백질생성 아미노산일 수 있다. 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 C-말단 부분의 아미노산 서열이 커플링 효소의 아미노산 선호도로 인해 및/또는 펩타이드의 2차 또는 3차 구조로 인해 커플링 효소에 의해 잘 인식되지 않거나 그에 접근할 수 없는 경우, 1차 구조(아미노산 서열)는 C-말단에서 신장될 수 있다. 본질적으로 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 C-말단은, 효소적 커플링 반응을 위한 효소에 의한 양호한 인식 및 효소 내로의 접근성을 보장하기 위해 다수의 아미노산으로 신장된다. 당업자는 본원에 개시된 정보 및 통상의 일반 지식에 기초하여 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르를 신장시키는 방법을 알 것이다. 일반적으로 신장을 위한 아미노산의 개수는 1 내지 10의 범위에 있지만, 원칙적으로 더 많을 수 있다. 양호한 결과는, 4개의 아미노산 잔기를 이용한 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 신장, 예를 들어 -Phe-Ser-Lys-Leu-(티오)에스테르에 의해 얻어졌다.
특히 (선택적으로 N-말단 보호된) 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르는 화학식 I의 화합물로 표시될 수 있다.
[화학식 I]
Figure pct00002
여기서 Q는 OR 또는 SR 모이어티를 나타낸다. R은 (치환되거나 비치환된) 알킬 또는 (치환되거나 비치환된) 아릴기를 나타낼 수 있다.
여기서 P1은 수소 또는 N-말단 보호기를 나타낸다. 적합한 N-말단 보호기는 펩타이드의 합성에 사용될 수 있는 N-보호기이다. 그러한 기는 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 N-보호기의 예는 카바메이트 또는 아실 유형 보호기, 예를 들어 'Cbz'(벤질옥시카보닐), 'Boc'(tert-부틸옥시카보닐), 'For'(포르밀), 'Fmoc'(9-플루오레닐메톡시카보닐), 'PhAc'(펜아세틸) 및 'Ac'(아세틸)을 포함한다. For, PhAc 및 Ac 기는 도입되어 효소인 펩타이드 데포르밀라제(Peptide Deformylase), PenG 아실라제 또는 아실라제(Acylase)를 각각 사용하여 효소적으로 절단될 수 있다. 화학적 절단 방법은 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
여기서, n은 적어도 2의 정수이다. n은 특히 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 또는 적어도 10일 수 있다. 원칙적으로 n에 대한 상한은 없지만, 일반적으로 n은 특히 10.000 이하, 1000 이하, 500 이하, 예를 들어 100 이하, 50 이하 또는 40 이하일 수 있다.
여기서, 각각의 RA 및 각각의 RB는 독립적으로 수소 원자 또는 유기 모이어티, 바람직하게는 아미노산 측쇄를 나타낸다. 따라서, RA가 n개의 아미노산 단위 모두에서 동일할 필요는 없다. 마찬가지로, RB가 n개의 아미노산 단위 모두에서 동일할 필요는 없다. 선택적으로, 하나 이상의 측쇄 작용기는 보호기를 함유할 수 있다.
펩타이드 친핵체의 아미노산 단위는 원칙적으로 임의의 단백질생성 또는 비단백질생성 아미노산으로부터 선택될 수 있다.
특히, 펩타이드 친핵체는 화학식 II의 화합물로 표시될 수 있다.
[화학식 II]
Figure pct00003
용어 'C-말단 보호'는 펩타이드의 C-말단 카복실기에 보호기가 제공되어, 일반적으로 또 다른 펩타이드 또는 동일한 펩타이드 분자의 N-말단 아민기에 커플링되는 것으로부터 카복실기를 적어도 실질적으로 보호하는 것을 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
여기서, n, RA 및 RB는 상기 정의된 바와 같다.
여기서 P2는 아민 모이어티 또는 OR 모이어티를 나타낸다.
P2가 아민 모이어티를 나타내는 경우, 아민 모이어티는 화학식 NR3R4로 표시될 수 있고, 여기서 R3 및 R4는 각각 개별적으로 임의의 (치환되거나 비치환된) 알킬기 또는 (치환되거나 비치환된) 아릴기를 나타낼 수 있다. 특히, R3 및 R4 중 하나는 수소 원자이고 다른 하나는 (치환되거나 비치환된) 알킬기이다. 양호한 결과는 특히 R3 및 R4 둘 모두가 수소 원자인 경우에 얻어졌다.
P2가 OR 모이어티를 나타내는 경우, R은 C-말단 보호기 또는 양이온, 예를 들어 1가 양이온, 예컨대 3치환되거나 4치환된 암모늄 이온 또는 알칼리 금속 양이온 또는 H를 나타낼 수 있다.
R이 C-말단 보호기인 경우, 이는 특히 선택적으로 치환된 알킬기일 수 있다. 바람직하게는 이는 t-알킬기이지만, 원칙적으로 당업자에게 공지된 바와 같은 임의의 다른 보호성 에스테르일 수 있다. t-알킬은 원칙적으로 임의의 보호성 3차 알킬기일 수 있다. 바람직하게는 t-알킬은 t-부틸(2-메틸-2-프로필), t-펜틸(2-메틸-2-부틸) 및 t-헥실(2,3-디메틸-2-부틸)의 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서, 펩타이드 친핵체는 C-말단 보호된다. 또 다른 구현예에서, 이는 C-말단 보호되지 않는다.
특히, 양호한 결과는 보호된 측쇄 작용기가 없는 펩타이드 친핵체로 달성되었다.
일 구현예에서, 펩타이드 친핵체의 하나 이상의 측쇄 작용기(특히, 하나 이상의 하이드록실기, 카복실기 또는 아민기)에 보호기가 제공된다. 적합한 보호기는 당업자에게 공지되어 있다. 카복실산기는 예를 들어 사이클로헥실기, 벤질기 또는 알릴기로 보호될 수 있고; 아민 작용기는 예를 들어 알릴옥시카보닐기 또는 트리플루오로아세틸기로 보호될 수 있다.
펩타이드 친핵체는 당업계에 공지된 방법을 이용하여, 예컨대 고체상 합성, 용액상 합성 또는 미생물을 사용한 발효에 의해 합성될 수 있다. 펩타이드 친핵체의 N-말단 아미노산 및 펩타이드 친핵체의 다른 아미노산은 원칙적으로 임의의 단백질생성 또는 비단백질생성 아미노산일 수 있다. 펩타이드 친핵체의 N-말단 부분의 아미노산 서열이 커플링 효소의 아미노산 선호도로 인해 또는 펩타이드 친핵체의 2차 또는 3차 구조로 인해 커플링 효소에 의해 잘 인식되지 않거나 그에 접근할 수 없는 경우, 1차 구조(아미노산 서열)는 N-말단에서 신장될 수 있다. 본질적으로 펩타이드 친핵체의 N-말단은, 효소적 커플링 반응을 위한 커플링 효소에 의한 양호한 인식 및 그 효소로의 접근성을 보장하기 위해 다수의 아미노산으로 신장된다. 당업자는 본원에 개시된 정보 및 통상의 일반 지식에 기초하여 펩타이드 친핵체를 신장시키는 방법을 알 것이다. 일반적으로 신장을 위한 아미노산의 개수는 1 내지 10의 범위에 있지만, 원칙적으로 더 많을 수 있다. 양호한 결과는 3개의 아미노산 잔기, 예를 들어 H-Ser-Tyr-Arg를 사용한 펩타이드 친핵체의 신장에 의해 얻어졌다.
본 발명에 따른 효소는 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체이다.
특히, 본 발명은 단리된 효소(유기체에서 생성되는 경우 그것이 발현된 유기체(전형적으로 재조합 유기체)로부터 단리되거나 그것이 합성된 반응 매질로부터 단리됨)를 제공한다.
특히, 본 발명의 효소는 본 발명의 목적상 미정제 형태로 단리되거나, 예를 들어 문헌[Smith and Johnson, Gene 67:31-40 (1988)]에 개시된 단일-단계 정제 방법과 같은 임의의 적합한 기법에 의해 실질적으로 정제되어 단리된 것으로 간주된다.
본 발명의 효소는 적어도 실질적으로 순수한 형태(예를 들어, 75 중량% 초과, 80 중량% 초과), 또는 하나 이상의 다른 성분과의 혼합물, 예를 들어 저장 용액(stock solution) 형태, 특히 수성 완충 용액으로 제공될 수 있다.
본 개시는, 특히 서브틸리신 BPN' 변이체로 간주되는, 본 발명의 효소의 다양한 예를 제공한다. 앞서 이미 기재된 바와 같이, 본 발명의 효소는 적어도 다음을 포함할 것이다:
- 서브틸리신 BPN' 중의 위치 75 내지 83에 상응하는 아미노산의 결실;
- 서브틸리신 BPN' 중의 S221에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이로서, S221C 또는 S221셀레노시스테인, 바람직하게는 S221C인, 돌연변이;
- 서브틸리신 BPN' 중의 F189W, F189Y, S33D, S33T, N218D, N218T, N218E, N62D, N62S, N62W, 및 N62Y에 상응하는 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 돌연변이.
F189W 또는 F189Y에 상응하는 돌연변이는, 특히 펩타이드 친핵체의 P2' 및 P1' 위치에 있는 아미노산과 관련하여, (더) 넓은 기질 범위에 대해 매우 바람직한 한편, 만족스러운 S/H 비가 유지되거나 S/H 비가 개선된다. 이들 2개의 돌연변이 중에서, F189W가 특히 바람직하다. 유리하게는, F189W 또는 F189Y에 상응하는 돌연변이, 특히 F189W에 상응하는 돌연변이를 갖는 효소는 또한 N218D에 상응하는 돌연변이를 갖는다. 유리하게는, N218D에 상응하는 돌연변이 및 F189W 또는 F189Y에 상응하는 돌연변이를 갖는 효소는 M222P, Y217H 또는 P225N에 상응하는 적어도 하나의 돌연변이, 바람직하게는 이들 각각을 추가로 갖는다.
N218D, N218T 또는 N218E에 상응하는 돌연변이는 펩타이드 친핵체의 P2' 위치 및/또는 P1' 위치에 있는 아미노산과 관련하여 (더) 넓은 기질 범위에 대해 바람직한 한편, 만족스러운 S/H 비가 유지되거나 S/H 비가 개선된다. 이들 돌연변이 중에서 N218D가 특히 바람직하다.
S33D 또는 S33T에 상응하는 돌연변이는, 특히 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 P2 위치 및/또는 펩타이드 친핵체의 P1' 위치 및/또는 P2' 위치에 있는 아미노산과 관련하여, (더) 넓은 기질 범위에 대해 매우 바람직한 한편, 만족스러운 S/H 비가 유지되거나 S/H 비가 개선된다. 이들 두 돌연변이 중에서, S33D가 특히 바람직하다.
N62D, N62S, N62W, N62Y에 상응하는 돌연변이는, 특히 펩타이드 C-말단 (티오)에스테르의 P2 위치, 및/또는 펩타이드 친핵체의 P1' 및/또는 P2' 위치에 있는 아미노산과 관련하여, (더) 넓은 기질 범위에 대해 바람직한 한편, 만족스러운 S/H 비가 유지되거나 S/H 비가 개선된다. 이들 돌연변이 중에서, N62D가 특히 바람직하다.
특히, 양호한 결과는, S33D에 상응하는 아미노산 위치에서 효소의 S2 포켓에 돌연변이를 포함하고 N62S에 상응하는 S2' 포켓에 돌연변이를 추가로 포함하는 효소로 달성되었다. 추가로, 특히, 양호한 결과는, S33T에 상응하는 아미노산 위치에서 효소의 S2 포켓에 돌연변이를 포함하고 N62W 또는 N62V에 상응하는 S2' 포켓에 돌연변이를 추가로 포함하는 효소로 달성되었다. S33에 상응하는 위치에 있는 특정 아미노산과 N62에 상응하는 위치에 있는 특정 아미노산의 그러한 조합을 갖는 효소는 S33 위치에 있는 특정 아미노산(D 또는 T) 또는 N62 위치에 있는 특정 아미노산 (W 또는 V)를 갖는 비교 효소에 비해 구별되는 기질 특이성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 조합은 S/H 비 및 효소적 커플링 활성의 측면에서 상승 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 바람직하게는, 상승 효과를 위해 및/또는 구별되는 기질 특이성을 제공하기 위해, S33D + N62S 또는 S33T + N62W 또는 S33T + N62V에 상응하는 돌연변이를 갖는 상기 효소는 M222P, Y217H 및 I107V에 상응하는 돌연변이, 더욱 바람직하게는 M222P, Y217H, P225N, F189W, N218D 및 I107V에 상응하는 돌연변이를 추가로 포함한다.
특히 바람직한 구현예에서, 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체는 F189, N218, S33 및 N62에 상응하는 위치의 군으로부터 선택된 위치에 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 적어도 3개, 가장 바람직하게는 4개의 돌연변이를 포함한다. 여기서, 가장 바람직하게는, F189에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 F189Y 또는 F189W에 상응하고, N218에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 N218D, N218T 또는 N218E에 상응하고, S33에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 S33D 또는 S33T에 상응하고, N62에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 N62D, N62S, N62W 또는 N62Y에 상응한다.
본 발명의 효소는 서브틸리신 BPN'과 비교하여 추가의 돌연변이, 특히 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 돌연변이를 가질 수 있는데, 단, 이는 펩타이드의 제조에서 효소적 단편 축합 활성(커플링 활성) 또는 고리화 활성을 갖는다.
본 발명에 따른 효소, 특히 본 발명의 서브틸리신 BPN' 변이체의 동족체가 돌연변이 유발에 의해 유도될 수 있는 주형 효소로서의 서브틸리신 BPN'에 대한 대안은 다른 서브틸리신, 특히 서브틸리신 BPN'와 적어도 50%의 상동성을 갖는 서브틸리신이다.
적합한 서브틸리신의 서열은, 2014년 8월 11일자로 이용 가능한 UNIPROT 서열 데이터베이스(http://www.uniprot.org/)로부터, 서브틸리신 BPN'(SEQ ID 2)를 질의로 하여 데이터베이스를 BLAST함으로써 검색될 수 있다. 그러나 서열 검색은 UNIPROT 또는 그 날짜로 제한되지 않는다. 당업자는 대안적 서열 수탁기관에 질의하거나 시퀀싱에 의해 추가적인 동족체 서열을 수집하는 방법을 알고 있다(예를 들어, 문헌[Zooming in on metagenomics: molecular microdiversity of Subtilisin Carlsberg in soil. Gabor E, Niehaus F, Aehle W, Eck J.J Mol Biol. 2012 Apr 20;418(1-2):16-20] 참조). 특히, 추가로 본 발명은, 서브틸리신 BPN'의 L75 내지 G83에 상응하는 아미노산의 적어도 상기 결실, 서브틸리신 BPN' 중의 위치 221에 상응하는 위치에 있는 시스테인 또는 셀레노시스테인 및 본 청구항 1에 있는 상기 추가의 돌연변이 중 적어도 하나를 갖는 변이체에 관한 것이다.
서브틸리신 BPN'의 서열은 SEQ ID NO: 2(성숙 형태)에 제공된다. 서브틸리신 BPN' 아미노산 -107 내지 275를 인코딩하는 유전자는 SEQ ID NO: 1에 제공된다. 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 동족체는 WO 2016/056913에 따른 효소에 기초할 수 있는데, 단, 이는 싱기 언급된 돌연변이를 갖는다.
SEQ ID NO: 3은, Ca2+ 결합 루프의 결실, S221 돌연변이(S221X로 표시됨), 위치 S33, N62, E156, G166, F189, N218(모두 X로 표시되며, 임의의 단백질생성 아미노산을 나타내는데, 단, 적어도 하나는 돌연변이임), 및 X로 표시된 P225 위치(임의의 단백질생성 아미노산, 바람직하게는 본원의 다른 곳에 정의된 바와 같은 돌연변이)를 갖는, 본 발명에 따른 서브틸리신 BPN' 변이체를 나타낸다. 추가의 바람직한 효소는 하나 이상의 추가적인 돌연변이, 특히 본원의 다른 곳에서 또는 본원에 참고로 포함된 WO 2016/056913에서 확인되는 바와 같은 하나 이상의 추가의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 효소의 S221에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이는 바람직하게는 S221C이다.
P225에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이는 일반적으로 관심있는 커플링 또는 고리화 반응에 대한 S/H 비에 유리하다. 돌연변이는 일반적으로 P225N, P225D, P225S, P225C, P225G, P225A, P225T, P225V, P225I, P225L, P225H, P225Q의 군, 바람직하게는 P225N, P225D, P225S, P225C 및 P225G의 군, 더욱 바람직하게는 P225N 또는 P225D으로부터 선택된다.
양호한 효소 안정성을 위해, 바람직하게는 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체는 SEQ ID NO: 2의 Q2, S3, P5, S9, I31, K43, M50, A73, E156, G166, G169, S188, Q206, N212, N218, T254 및 Q271에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이의 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이, N218에서의 특정 돌연변이는 S/H 비 및/또는 기질 범위와 관련하여 더욱 유리하다. 일 구현예에서, N218에 상응하는 위치는 돌연변이되지 않는 한편, 효소 안정성은 이 위치가 돌연변이된 효소와 비교하여 적어도 실질적으로 유지된다.
바람직하게는 (양호한 효소 안정성에 바람직한) 상기 하나 이상의 돌연변이는 Q2K, S3C, P5S, S9A, I31L, K43N, M50F, A73L, E156S, G166S, G169A, S188P, Q206C, N212G, T254A 및 Q271E의 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 구현예에서, 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체는 Q2K, S3C, P5S, S9A, I31L, K43N, M50F, A73L, E156S, G166S, G169A, S188P, Q206C, N212G, T254A 및 Q271E의 군으로부터 선택된 상기 돌연변이 중 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 8개, 보다 구체적으로는 적어도 12개를 포함한다.
바람직한 구현예에서 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체는 SEQ ID NO: 2의 G100, S125, L126, G127, P129, 및 N155에 상응하는 아미노산 위치에서 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
특정 구현예에서, 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체는 M222 및 Y217에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이를 포함하며, 돌연변이는 다음과 같다:
-M222P 및 Y217H;
-M222P 및 Y217G;
-M222G 및 Y217F; 또는
-M222G 및 Y217G.
추가의 구현예에서, 서브틸리신 BPN' 또는 그의 동족체는 SEQ ID NO: 2의 Y104, I107, S101, G102, 128, L135 및 P168에 상응하는 아미노산 위치에서 돌연변이의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 이러한 돌연변이 또는 돌연변이들은 특히 Y104F, Y104S, I107V, I107A, L135N, L135S, L135D 또는 L135A의 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 효소적 커플링 반응 또는 효소적 고리화 반응은 각각 전형적으로 물을 포함하는 유체에서 수행된다. 바람직하게는 반응은 완충 유체에서 수행된다. 물 함량은 일반적으로 총 액체를 기준으로 10 내지 100 부피%, 바람직하게는 20 부피% 이상, 바람직하게는 40 부피% 이상, 특히 50 부피% 이상, 특히 60 부피% 이상이다. 특히 양호한 결과는 70 내지 100 부피%의 물, 보다 구체적으로는 90 내지 100 부피%, 95 내지 100 부피% 또는 98 내지 100 부피%의 물을 포함하는 반응 매질에서 달성되었다. 용어 '수성'은 적어도 실질적으로 물로 이루어진 매질에 대해 사용된다.
원칙적으로, 임의의 완충액이 적합하다. 양호한 완충액은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[David Sheehan in Physical Biochemistry, 2nd Ed. Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim 2009]; http://www.sigmaaldrich.com/life-science/core-bioreagents/biological-buffers/learning-center/buffer-calculator.html을 참조한다.
펩타이드 단편 축합을 위한 완충액의 pH는 적어도 5, 특히 적어도 6, 바람직하게는 적어도 7일 수 있다. 요망되는 pH는 일반적으로 11 미만, 특히 10 미만, 더욱 더 바람직하게는 9 미만이다. 일반적으로 효소적 단편 축합을 위한 최적 pH는 7 내지 9이다. 고리화 반응의 경우, 최적 pH는 상이할 수 있다. 고리화 반응을 위한 pH는 적어도 3, 특히 적어도 4, 바람직하게는 적어도 5일 수 있다. 요망되는 pH는 일반적으로 11 미만, 특히 10 미만, 바람직하게는 9 미만이다. 일반적으로 효소적 고리화 반응을 위한 최적 pH는 5 내지 9이다.
높은 S/H 비 때문에, 축합 반응에서 높은 수율에 도달하기 위해 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르, 또는 펩타이드 친핵체를 일반적으로 많은 정도로 필요로 하지 않는다. 일반적으로 (a) 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르 대 (b) 펩타이드 친핵체의 비는 1:5 내지 5:1, 바람직하게는 1:3 내지 3:1의 범위, 더욱 바람직하게는 1.0:2.5 내지 2.5:1.0의 범위, 특히 1:2 내지 2:1의 범위, 보다 구체적으로는 1:1.5 내지 1.5:1의 범위이다. 대략적으로 화학량론적 비가 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 방법에서, 펩타이드 단편의 용해도를 개선시키거나 반응 수율을 개선시키기 위해 반응이 수행되는 유체에 첨가제를 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 그러한 첨가제는 염 또는 유기 분자, 예를 들어 구아니디늄 하이드로클로라이드, 우레아, 소듐 도데카설페이트 또는 트윈(Tween)일 수 있다.
반응은 완전 수성 액체 또는 물과 수 혼화성 공용매, 예컨대 N,N-디메틸포름아미드(DMF), N-메틸-피롤리디논(NMP), N,N-디메틸아세트아미드(DMA), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세토니트릴, 에테르, 예컨대 테트라하이드로푸란(THF), 2-메틸-테트라하이드로푸란(Me-THF) 또는 1,2-디메톡시에탄, 또는 (할로겐화) 알코올, 예컨대 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, tert-부탄올, 2,2,2-트리플루오로에탄올(TFE), 1,1,1,3,3,3-헥사플루오로이소프로판올의 혼합물, 또는 이들 유기 용매의 혼합물에서 수행될 수 있다. 서브틸리신 BPN' 변이체의 안정성 및 펩타이드 기질의 용해도에 따라, 공용매의 양은 바람직하게는 70 부피% 미만, 더욱 바람직하게는 60 부피% 미만, 더욱 더 바람직하게는 50 부피% 미만, 가장 바람직하게는 40% 미만이다.
사용될 효소가 충분한 활성 및 안정성을 나타내는 온도가 선택되는 한, 원칙적으로 효소적 단편 축합 또는 고리화 동안의 온도는 중요하지 않다. 그러한 온도는 관례적으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 온도는 적어도 -10℃, 특히 적어도 0℃ 또는 적어도 10℃일 수 있다. 일반적으로, 온도는 70℃ 이하, 특히 60℃ 이하 또는 50℃ 이하일 수 있다. 당업자는 통상의 일반 지식 및 본원에 개시된 정보에 기초한 일상적인 실험을 통해, 특정 효소적 단편 축합 또는 고리화를 위한 특정 효소에 대한 최적 온도 조건을 쉽게 확인할 수 있다. 일반적으로, 온도는 유리하게는 20℃ 내지 50℃의 범위이다.
일반적으로 본 발명의 효소는 재조합 방법에 의해, 특히 발현시에 효소적으로 활성인 본 발명의 서브틸리신 BPN' 변이체를 야기하도록 돌연변이된 서브틸리신 BPN' DNA의 발현에 의해 생성된다.
따라서, 추가로 본 발명은 본 발명에 따른 효소를 제조하는 재조합 방법에 관한 것으로, 상기 방법은:
a) 효소를 인코딩하는 유전자를 기능적으로 발현시키는 재조합 숙주 세포, 예를 들어 E. 콜라이(E. coli) 또는 바실러스(Bacillus)와 같은 박테리아 세포를 제공하는 단계;
b) 효소적으로 활성인 효소의 발현을 제공하는 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
c) 상기 미생물 숙주로부터 발현된 효소를 회수하는 단계를 포함한다.
추가로 본 발명은 본 발명에 따른 효소를 인코딩하는 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
추가로 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에 관한 것으로, 이 폴리뉴클레오타이드는 효소를 발현할 수 있다.
본 발명에 대한 촉매로서 본 발명에 따른 효소의 사용은, 상기 기재된 바와 같이, 펩타이드의 고리화 또는 펩타이드 친핵체로의 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르의 커플링을 넘어서 연장된다.
효소는 펩타이드 결합이 아닌 아미드 결합의 형성에 사용될 수 있지만, 펩타이드 결합의 형성을 촉매하는 경우에 사용하는 것이 효소의 특히 바람직한 용도이다.
본 발명은 이제 하기 실시예에 의해 비제한적으로 예시될 것이다.
실시예
본 발명에 따른(본 발명에 따라 사용하기 위한) 효소의 생산
돌연변이 유발, 클로닝 및 발현
BS149-DM으로 표시된 효소는 위치 75 내지 83에 상응하는 아미노산의 결실을 가지며 추가적인 돌연변이인 Q2K, S3C, P5S, S9A, I31L, K43N, M50F, A73L, E156S, G166S, G169A, S188P, Q206C, N212G, Y217L, N218S, S221C, P225A, T254A 및 Q271E를 포함하는 SEQ ID NO:2에 상응한다. His-태그를 갖는 BS149-DM을 코딩하는 유전자를 pUB-110 기반 E. 콜라이-B. 서브틸리스(B. subtilis) 셔틀 벡터(즉, pBS42 또는 pBES)로 클로닝하였다(또한 WO2016/056913 참조). 상응하는 아미노산 서열은 서브틸리신 BPN' 번호매김 체계에 따라 번호가 매겨진다. 아미노산 -107 내지 -1은 신호 서열, 프리(pre) 서열, 및 완전 성숙시에 절단되는 프로(pro) 서열을 포함한다. 아미노산 1 내지 275는 완전한 촉매 활성을 나타내는 성숙 효소를 포함한다. 빠르고 효율적인 정제를 가능하게 하기 위해, 아미노산 275 이후에 C-말단 His-태그가 부착된다. 칼슘 결합 부위를 제거한 결과, BS149-DM은 서브틸리신 BPN' 중의 L75, N76, N77, S78, I79, G80, V81, L82 및 G83에 상응하는 아미노산을 포함하는 서브틸리신 BPN'과 비교하여 9개의 아미노산의 결실을 함유한다. BS149-DM에 대한 서브틸리신 BPN' 번호매김을 유지하기 위해, 번호매김은 74에서 83으로 점프한다. 셔틀 벡터에서, 유전자의 발현은 aprE 프로모터의 제어 하에 있다. 생성된 플라스미드 pBES-BS149DMHIS를 E. 콜라이 TOP10에서 증식시키고 B. 서브틸리스 GX4935(trpC2 metB10 lys-3ΔnprEΔaprE) 내로 형질전환시켰다. pBES-BS149DMHIS를 주형으로 사용하여, 퀵체인지(Quikchange) 방법(Agilent)에 의해 돌연변이 유발을 수행했다. 대안적으로, 당업계에 공지된 부위 지정 돌연변이 유발을 위한 다른 방법이 사용될 수 있다(문헌[Sambrook et al., 1989.]). 대안적으로, DNA는 미국 GenScript에 의해 합성되었고 각각의 셔틀 벡터 내로 통합되었다.
His-태그를 지닌 합성 서브틸리신 BPN' 변이체의 생산 및 정제:
관심있는 서브틸리신 변이체 유전자를 갖는 플라스미드를 함유하는 B. 서브틸리스의 단일 미생물 콜로니를 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 카나마이신(10 ㎍/mL)과 함께 5 mL LB에 접종하였다. 항생제(10 ㎍/mL의 카나마이신) 및 아미노산(100 mg/L의 Trp, 100 mg/L의 Met 및 100 mg/L의 Lys)이 보충된 30 mL의 테리픽 브로쓰(Terrific Broth)에 0.6 mL의 하룻밤 배양물을 첨가하였다. 세포를 진탕 인큐베이터(200rpm)에서 37℃에서 48시간 동안 성장시켰다. 세포를 원심분리(30분, 4,000 rpm, 4℃)에 의해 수거하였다. 배지(30 mL)를 따라 내고, 2회의 원심분리 단계(15분, 4000 rpm, 4℃)로 아미콘(Amicon)-원심분리 유닛(15 ml, 10 kDa MW 컷오프) 상에서 농축시켰다. 이어서 농축된 배지(0.5 ml)를 3회의 세척/농축 단계(14 ml의 완충액 A, 10분, 4,000 rpm, 4℃)로 완충액 A(25 mM 트리신(Tricine), pH 7.5, 0.5 M NaCl)로 교환하였다. His-태그 정제를 위해 탈론(Talon) 수지(2.5 ml, Clonetech)를 플라스틱 컬럼 카트리지에 첨가하였다. 수지를 5 mL의 MilliQ 물로 세척하고, 5 mL의 완충액 A로 평형화시켰다. 미정제 효소를 컬럼 상에 로딩하고, 4℃에서 회전식 진탕기(orbital shaker)에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 수지를 25 mL의 완충액 A로 세척하였다. 효소를 15 mL의 완충액 B(25 mM 트리신, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 0.5 M 이미다졸)로 용리하였다. 용리물을 원심분리(30분, 4000 rpm, 4℃)에 의해 아미콘-원심분리 유닛(15 ml, 10 kDa MW 컷오프) 상에서 농축시키고, 완충액을 3회의 세척/농축 단계(15 ml의 완충액, 10분, 4,000 rpm, 4℃)로 25 mM 트리신(pH 7.5)으로 교환하였다.
순도 및 효소 농도를 상기 기재된 바와 같이 결정하였다. 순도는 90% 초과였다. 약 0.1 내지 2 mg/ml의 수득된 효소를 함유하는 수득된 수성 용액(25 mM 트리신, pH 7.5)을 올리고펩타이드 단편 축합 및 고리화를 위해 그대로 사용하였다.
참고문헌
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효소적 단편 축합 및 고리화 예
재료 및 방법
달리 언급되지 않는 한, 화학 물질은 상업적 공급원으로부터 입수하여 추가 정제 없이 사용하였다. 40℃에서 역상 컬럼(Phenomenex, C18, 5 ㎛ 입자 크기, 150 × 4.6 mm)을 사용하여 HP1090 액체 크로마토그래프 상에서 분석 HPLC를 수행하였다. UV-VIS 204 선형 분광계를 사용하여 220 nm에서 UV 검출을 수행하였다. 구배 프로그램은 다음과 같았다: 5% 내지 98% 용리액 B의 0 내지 25분 및 5% 용리액 B의 25.1 내지 30분 선형 구배 램프(ramp)(용리액 A: H2O 중 0.5 mL/L의 메탄 설폰산(MSA), 용리액 B 아세토니트릴 중 0.5 mL/L의 MSA). 유량은 0 내지 25.1분에서 1 mL/분, 25.2 내지 29.8분에서 2 mL/분, 30분째에서 멈출 때까지 다시 1 mL/분이었다. 주입 부피는 20 μL였다. 고정상 컬럼(Pursuit XRs, C18, 10 ㎛ 입자 크기, 500 × 41.4 mm)을 사용하여 배리안 프렙스타(Varian PrepStar) 시스템 상에서 제조 HPLC를 수행하였다. LC-MS를 40℃에서 역상 컬럼(Phenomenex, C18, 5 ㎛ 입자 크기, 150 × 4.6 mm)을 사용하여 Agilent 1200 시리즈 액체 크로마토그래프 상에서 수행하였다. UV 검출 및 구배 프로그램은 분석 HPLC에 대해 기재된 바와 같았다. 분자량은 Agilent 6130 사중극자 LC/MS 시스템을 사용하여 결정하였다.
프로토콜 1: 올리고펩타이드-OCam-Leu-OH 에스테르를 하기 기재된 바와 같이 합성하였다:
1 g의 Fmoc-Leu-Wang 수지(0.72 mmol/g의 로딩을 사용함)를 DCM(2 x 2분, 10 mL) 및 DMF(2 x 2분, 10 mL)로 세척하고, 피페리딘/DMF(1/4, v/v, 2 x 8분, 10 mL)을 사용하여 Fmoc-탈보호시켰다. DMF(2 x 2분, 10 mL), DCM(2 x 2분, 10 mL) 및 DMF(2 x 2분, 10 mL)로 세척한 후, DCM(45분, 10 mL) 중의 DCC(4 당량) 및 HOAt(4 당량)를 사용하여 요오도아세트산(4 당량)을 수지에 커플링시켰다. DMF(2 x 2분, 10 mL), DCM(2 x 2분, 10 mL) 및 THF(2 x 2분, 10 mL)로 세척한 후, 50℃에서 20시간 동안 DMF/THF(1/1, v/v, 10 mL) 중의 4 당량의 Fmoc-Xxx-OH 및 10 당량의 DiPEA를 사용하여 수지에 Fmoc-보호 아미노산을 로딩하였다. 여기에서 그리고 본 개시의 다른 부분에서 'Xxx'는 하나의 아미노산(하기 실시예에 속하는 도면에 나타낸 바와 같이 가변적임)을 나타낸다.
DMF(2 x 2분, 10 mL), DCM(2 x 2분, 10 mL) 및 DMF(2 x 2분, 10 mL)로 세척한 후, 표준 SPPS 프로토콜에 따라 펩타이드를 신장시켰다(문헌[Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000]). 수지로부터의 절단 및 측쇄 탈보호는 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIS) 및 물의 혼합물(95/2.5/2.5, v/v/v, 15 mL)을 사용하여 120분 동안 수행하였다. 미정제 펩타이드를 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE)/n-헵탄(1/1, v/v, 50 mL)을 사용하여 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 원심분리에 의해 수집하고 MTBE/n-헵탄(1/1, v/v, 50 mL)으로 2회 세척한 후, 아세토니트릴/물(1/1, v/v, 50 mL)로부터 동결 건조시켰다.
프로토콜 2: 올리고펩타이드 C-말단 아미드 친핵체를 하기 기재된 바와 같이 합성하였다:
1 g의 Rink 수지(4-((2,4-디메톡시페닐)(Fmoc-아미노)메틸)페녹시 알킬 링커, 0.64 mmol/g의 로딩을 사용함)를 DCM(2 x 2분, 10 mL) 및 DMF(2 x 2분, 10 mL)로 세척하고, 피페리딘/DMF(1/4, v/v, 2 x 8분, 10 mL)를 사용하여 Fmoc-탈보호시켰다. 표준 SPPS 프로토콜에 따라 펩타이드를 신장시켰다(문헌[Weng C. Chan and Peter White, OUP Oxford, 2000]). 수지로부터의 절단 및 측쇄 탈보호를 TFA/TIS/물의 혼합물(95/2.5/2.5, v/v/v, 15 mL)을 사용하여 120분 동안 수행하였다. 미정제 펩타이드를 MTBE/n-헵탄(1/1, v/v, 50 mL)을 사용하여 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 원심분리에 의해 수집하고 MTBE/n-헵탄(1/1, v/v, 50 mL)으로 2회 세척한 후, 아세토니트릴/물(1/1, v/v, 50 mL)로부터 동결 건조시켰다.
프로토콜 3: N-아세틸-보호 올리고펩타이드 활성화된 에스테르를 하기 기재된 바와 같이 합성하였다:
프로토콜 1 중 하나에 따른 요망되는 서열의 SPPS 후, 수지 결합된 펩타이드를 피페리딘/DMF(1/4, v/v, 2 x 8분, 10 mL)를 사용하여 Fmoc-탈보호시켰다. 수지를 DMF(2 x 2분, 10 mL), DCM(2 x 2분, 10 mL) 및 DMF(2 x 2분, 10 mL)로 세척하고, DMF(2 x 10분, 10 mL) 중의 Ac2O(10 부피%), DiPEA(5 부피%), HOBt(0.2 중량%)의 혼합물을 사용하여 펩타이드 N-말단 아민 작용기를 아세틸화시켰다. 수지를 DMF(3 x 2분, 10 mL) 및 DCM(3 x 2분, 10 mL)으로 세척하였다. 수지로부터의 절단 및 측쇄 탈보호를 TFA/TIS/물의 혼합물(95/2.5/2.5, v/v/v, 15 mL)을 사용하여 120분 동안 수행하였다. 미정제 펩타이드를 MTBE/n-헵탄(1/1, v/v, 50 mL)을 사용하여 침전시켰다. 침전된 펩타이드를 원심분리에 의해 수집하고, MTBE/n-헵탄(1/1, v/v, 50 mL)으로 2회 세척한 후, 아세토니트릴/물(1/1, v/v, 50 mL)로부터 동결 건조시켰다.
커플링 예
주의: BS149-DM으로 표시된 효소는 위치 75 내지 83에 상응하는 아미노산의 결실을 가지며 추가적인 돌연변이인 Q2K, S3C, P5S, S9A, I31L, K43N, M50F, A73L, E156S, G166S, G169A, S188P, Q206C, N212G, Y217L, N218S, S221C, P225A, T254A 및 Q271E를 포함하는 SEQ ID NO: 2에 상응한다. 실시예 1 내지 5에 사용된 다른 모든 효소는 BS149-DM의 이러한 모든 돌연변이 + 실시예에 언급된 바와 같은 추가적인 돌연변이를 갖는다. BS149-DM 및 추가의 돌연변이를 갖는 효소는 상기 기재된 기술을 이용하여 생성하였다.
실시예 1: P2' 포켓에 돌연변이를 갖는 상이한 효소 변이체의 P1' 및 P2' 포켓 기질 특이성의 맵핑:
상이한 돌연변이체의 P1' 및 P2' 포켓 기질 특이성을 결정하기 위해, 하기 2 가지의 표준 반응을 수행하였다. 800 μL의 인산염 완충액(100 mM, pH 8.0)을, 100 μL의 트리펩타이드 C-말단 아미드 저장 용액(300 μL의 물 중의, P1' 포켓의 경우 0.01 mmol H-Xxx-Leu-Arg-NH2 .2TFA 및 P2' 포켓의 경우 H-Ala-Xxx-Arg-NH2 .2TFA)과 100 μL의 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 저장 용액(1200 μL의 물 중의 0.01 mmol Ac-Asp-Phe-Ser-Lys-Leu-OCam.TFA)의 혼합물에 첨가하였다. 이 혼합물에 5.5 ㎍의 효소를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 진탕시켰다(150 rpm). 30분 후, 반응 혼합물의 분취량 550 μL를 취출하고, 500 μL의 MSA/물(1/99, v/v)로 켄칭하고, LC-MS에 의해 분석하였다. 커플링 생성물, 가수분해된 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 및 잔류 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 피크를 적분하였다. 생성물 면적%는, 지정된 반응 시간 이내에서의 생성물, 가수분해된 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 및 잔류 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르의 양의 합계로 나눈 생성물의 양으로 정의된다.
BS149-DM + 222G + 217F(BS149-DMGF) 및 BS149-DM + 222G + 217F + 189W/Y (BS149-DMGF + 189W/Y) 및 BS149-DM + 222P + 217H(BS149-DMPH) 및 BS149-DM + 222P + 217H + 189W(BS149-DMPH + 189W)에 대한 P2' 기질 범위는 각각 도 1a 및 도 1b에 도시되어 있다.
BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 107V(BS149-DMPHNV) 및 BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 107V + F189W(BS149-DMPHNV + 189W)에 대한 P2' 및 P1' 기질 범위는 각각 도 1c 및 도 1d에 도시되어 있다.
BS149-DM + 222G + 217F + 225N + 218N(BS149-DMGFN) 및 BS149-DM + 222G + 217F + 225N + N218D/T(BS149-DMGFN + N218D/T)에 대한 P2' 기질 범위는 도 2에 도시되어 있다.
결론: 돌연변이 F189W 및 F189Y는 P2' 기질 범위 및 커플링 효율과 관련하여 긍정적인 효과를 갖는다(도 1a 내지 도 1c).
P2' 돌연변이 F189W는 P1' 기질 범위 및 커플링 효율과 관련하여 명백히 긍정적인 효과를 갖는다(도 1d).
돌연변이 N218D 및 N218T는 P2' 기질 범위 및 커플링 효율과 관련하여 긍정적인 효과를 갖는다(도 2).
실시예 2: P2' 포켓에 돌연변이를 갖는 상이한 효소 변이체의 P2' 포켓 기질 특이성의 맵핑.
상이한 돌연변이체의 P2' 포켓 기질 특이성을 결정하기 위해, 하기 반응을 수행하였다. 먼저, 기질 프리믹스(premix)(20 ㎕)를, 물 중의 저장 용액 각각으로부터 10 mM의 펜타펩타이드 Cam-에스테르 Ac-Asp-Phe-Ser-Lys-Leu-OCam.TFA. 및 15 mM의 C-말단 아미드 H-Ala-Xxx-Lys-Lys(DNP)Lys-NH2 .2TFA(DNP는 디니트로페닐 보호기임)의 최종 농도로 제조하였다. 이 혼합물에 TCEP(트리스-(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드, 0.1 mg/mL)가 보충된 1 M 트리신 완충액(pH 8.5) 중의 효소 용액 20 ㎕를 첨가하였다. 총 0.4 ㎍의 효소를 웰당 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 진탕시켰다(150 rpm). 30분 후, 반응 혼합물의 분취량 10 μL를 취출하고, 150 μL의 MSA/물(2/98, v/v)로 켄칭하고, 350 ㎕의 물로 희석하고, LC-MS에 의해 분석하였다. 커플링 생성물, 가수분해된 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 및 잔류 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 피크를 적분하였다. 생성물 면적%는, 지정된 반응 시간 이내에서의 생성물, 가수분해된 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 및 잔류 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르의 양의 합계로 나눈 생성물의 양으로 정의된다. 스크리닝에서 얻은 최고 전환율과 관련하여 데이터를 100%로 정규화하였다.
BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 189W(BS149-DM PHN F189W) 및 BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 189W + 218D(BS149-DM PHN F189W + N218D)에 대한 P2' 기질 범위는 도 5에 도시되어 있다.
결론: S2' 포켓에서 확인된 단일 양성 돌연변이의 조합은 상가적 효과를 가지며 커플링 수율과 P2' 기질 범위를 추가로 개선시킨다.
실시예 3: P2 포켓에 돌연변이를 갖는 상이한 효소 변이체의 P2 포켓 기질 특이성의 맵핑
상이한 돌연변이체의 P2 포켓 기질 특이성을 결정하기 위해, 하기 표준 반응을 수행하였다. 800 μL의 인산염 완충액(100 mM, pH 8.0)을 100 μL의 트리펩타이드 C-말단 아미드 저장 용액(300 μL의 물 중의 0.01 mmol H-Ala-Leu-Arg-NH2.2TFA)과 200 μL의 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 저장 용액(1.2 m의 물 + 1 mL의 아세토 니트릴 중의 0.01 mmol Ac-Asp-Phe-Ser-Xxx-Leu-OCam.TFA)의 혼합물에 첨가하였다. Xxx 위치에 있는 아미노산이 상이한, 이러한 모든 펩타이드 에스테르와의 커플링을 수행하였다.
이 혼합물에 5.5 ㎍의 효소를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 진탕시켰다(150 rpm). 30분 후, 반응 혼합물의 분취량 550 μL를 취출하고, 500 μL의 MSA/물(1/99, v/v)로 켄칭하고, LC-MS에 의해 분석하였다. 커플링 생성물, 가수분해된 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 및 잔류 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 피크를 적분하였다. 생성물 면적%는, 지정된 반응 시간 이내에서의 생성물, 가수분해된 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 및 잔류 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르의 양의 합계로 나눈 생성물의 양으로 정의된다.
BS149-DM + 222P + 217H + 107V(BS149-DMPHV) 및 BS149-DM + 222P + 217H + 107V + S33D/T(BS149-DMPHV + S33D/T)에 대한 P2 기질 범위는 도 3에 도시되어 있다.
BS149-DM + 222P + 217H + 107V(BS149-DMPHV) 및 BS149-DM + 222P + 217H + 107V + N62D/S/W/Y(BS149-DMPHV + N62D/S/W/Y)에 대한 P2 기질 범위는 도 4에 도시되어 있다.
결론: 돌연변이 S33D 및 S33T는 P2 기질 범위 및 커플링 효율과 관련하여 긍정적인 효과를 갖는다. S33T와 비교하여 S33D가 더 우수하다(도 3).
돌연변이 N62D 및 N62S는 P2 기질 범위 및 커플링 효율과 관련하여 긍정적인 효과를 갖는다. 돌연변이 N62W 및 N62Y는 특정 기질 세트에 대해 선호도를 갖는다(도 4).
실시예 4: P2 포켓에 돌연변이를 갖는 상이한 효소 변이체의 P2 포켓 기질 특이성의 맵핑
상이한 돌연변이체의 P2 포켓 기질 특이성을 결정하기 위해, 하기 반응을 수행하였다. 먼저, 기질 프리믹스(15 ㎕)를, 물 중의 저장 용액 각각으로부터 10 mM의 펜타펩타이드 Cam-에스테르 Ac-Asp-Phe-Ser-Xxx-Leu-OCam.TFA 및 10 mM의 C-말단 아미드 H-Ala-Leu-Lys-Lys(DNP)-Lys-NH2.2TFA의 최종 농도로 제조하였다. 이 혼합물에 TCEP(트리스-(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드, 0.1 mg/ml)가 보충된 1 M 트리신 완충액(pH 8.5) 중의 효소 용액 50 ㎕를 첨가하였다. 총 0.25 ㎍의 효소를 웰당 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 진탕시켰다(150 rpm). 30분 후, 반응 혼합물의 분취량 25 μL를 취출하고, 475 μL의 MSA/물(2/98, v/v)로 켄칭하고, 500 μl의 물로 희석하고, LC-MS에 의해 분석하였다. 커플링 생성물, 가수분해된 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 및 잔류 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 피크를 적분하였다. 생성물 면적%는, 지정된 반응 시간 이내에서의 생성물, 가수분해된 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르 및 잔류 펜타펩타이드 C-말단 Cam-에스테르의 양의 합계로 나눈 생성물의 양으로 정의된다.
BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 189W + 218D + 107V + S33D(BS149-DMPHNWDV S33D), BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 189W + 218D + 107V + N62S(BS149-DMPHNWDV N62S) 및 BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 189W + 218D + 107V + S33D + N62S (BS149-DMPHNWDV S33D + N62S)에 대한 P2 기질 범위가 도 6에 도시되어 있다.
결론: S2 포켓에서의 돌연변이(위치 33 및 62)의 조합은 명백한 상승 효과를 보여준다. S33D + N62S의 조합은 단일 S33D 또는 N62S 변이체를 능가한다. 또한, 조합 돌연변이체는 또한 구별되는 특이성 프로파일을 갖는다.
BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 189W + 218D + 107V + S33T(BS149-DMPHNWDV S33T), BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 189W + 218D + 107V + N62V/W(BS149-DMPHNWDV N62V/W) 및 BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 189W + 218D + 107V + S33T + N62V/W(BS149-DMPHNWDV S33T + N62V/W)에 대한 P2 기질 범위는 도 7에 도시되어 있다.
결론: 위치 33 및 62에서의 돌연변이의 조합은 P2 기질 범위와 관련하여 상승 효과를 갖는다. S33T + N62V와 S33T + N62W의 조합은 단일 S33T, N62V 또는 N62W 변이체를 능가한다.
실시예 5: BS149-DMPHV 및 BS149-DMPHNV + F189W를 사용한 2개의 단편으로부터의 엑세나타이드의 합성.
듀플로(duplo)에서, 300 mg의 H-His1-Gly2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Leu10-Ser11-Lys12-Gln13-Met14-Glu15-Glu16-Glu17-Ala18-Val19-Arg20-Leu21-OCam-Leu-OH.3TFA 및 200 mg의 H-Phe22-Ile23-Glu24-Trp25-Leu26-Lys27-Asn28-Gly29-Gly30-Pro31-Ser32-Ser33-Gly34-Ala35-Pro36-Pro37-Pro38-Ser39-NH2.2TFA를 1 mL의 인산염 완충액(0.2 M)에 용해시키고, 수성 NaOH(5 M)를 사용하여 pH를 8.3으로 조정하였다. 이 혼합물에 100 μL의 BS149-DMPHV(1 mg/mL, 실험 1) 또는 100 μL의 BS149-DMPHNV + F189W(1 mg/mL, 실험 2)를 첨가하고, 반응 혼합물을 37℃에서 진탕시켰다(200 rpm). 60분 후, 반응 혼합물을 9 mL의 MSA/물(1/9, v/v)로 켄칭하고, LC-MS에 의해 분석하였다. Cam-에스테르 출발 물질, 가수분해된 Cam-에스테르 및 엑세나타이드 생성물 피크를 적분하였다. 엑세나타이드 생성물의 양은 BS149-DMPHV(실험 1)의 경우 89%(11% 가수분해)였고, BS149-DMPHNV + F189W(실험 2)의 경우 97%(3% 가수분해)였다.
결론: 돌연변이 F189W는 커플링 효율 및 반응 수율에 대해 긍정적인 효과를 갖는다.
실시예 6: BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 107V + 189W를 사용한 사이클로타이드(cyclotide) McoTI-II의 합성.
1 mg의 H-Ile-Leu-Lys-Lys-Cys-Arg-Arg-Asp-Ser-Asp-Cys-Pro-Gly-Ala-Cys-Ile-Cys-Arg-Gly-Asn-Gly-Tyr-Cys-Gly-Ser-Gly-Ser-Asp-Gly-Gly-Val-Cys-Pro-Lys-OCam-Leu-OH를 1 mL의 인산염 완충액(1 M)에 용해시키고, 수성 NaOH(5 M)를 사용하여 pH를 8.3으로 조정하였다. 이 혼합물에 10 μL의 BS149-DM + 222P + 217H + 225N + 107V + 189W(1 mg/mL)를 첨가하고, 반응 혼합물을 주위 온도에서 정치시켰다. 60분 후, 반응 혼합물을 9 mL의 MSA/물(1/9, v/v)로 켄칭하고, LC-MS에 의해 분석하였다. Cam-에스테르 출발 물질, 가수분해된 Cam-에스테르 및 사이클릭 McoTI-II 생성물 피크를 적분하였다. 사이클릭 생성물의 양은 93%(7% 가수분해)였다.
서열
SEQ ID NO: 1: 서브틸리신 BPN' 아미노산 -107 내지 275를 인코딩하는 야생형 유전자
ENA|K02496|K02496.1 B. 서브틸리신(B. Subtilisin) BPN' 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스
Figure pct00005
SEQ ID NO: 2: 야생형 서브틸리신 BPN'(성숙)
>SUBT_BACAM 서브틸리신 BPN' 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스 성숙 1 내지 275
Figure pct00006
SEQ ID NO: 3: Ca2+ 결합 루프의 결실, S221 돌연변이(S221X), S33, N62, F189, N218 돌연변이 위치 및 P225 돌연변이 위치를 갖는 서브틸리신 BPN' 변이체
Figure pct00007

Claims (19)

  1. SEQ ID NO: 2로 표시되는 서브틸리신 BPN' 또는 그의 동족체 서열과 비교하여 하기 돌연변이를 포함하는, 서브틸리신 BPN' 변이체 또는 그의 동족체인 효소로서, 아미노산 위치는 SEQ ID NO: 2로 표시되는 서브틸리신 BPN'의 서열에 따라 정의되는, 효소:
    - 위치 75 내지 83에 상응하는 아미노산의 결실;
    - S221에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이로서, S221C 또는 S221셀레노시스테인(selenocysteine), 바람직하게는 S221C에 상응하는, 돌연변이;
    - F189W, F189Y, S33D, S33T, N218D, N218T, N218E, N62D, N62S, N62W, 및 N62Y에 상응하는 아미노산 위치로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의 돌연변이;
    바람직하게는 P225에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이.
  2. 제1항에 있어서, F189W 또는 F189Y에 상응하는, 바람직하게는 F189W에 상응하는 아미노산 위치에서 상기 효소의 S2' 포켓에 돌연변이를 포함하는, 효소.
  3. 제2항에 있어서, N218에 상응하는 아미노산 위치에 있는 아미노산은 N, D 또는 T인, 효소
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, N218D, N218T 또는 N218E에 상응하는, 바람직하게는 N218D에 상응하는 아미노산 위치에서 상기 효소의 S2' 포켓에 돌연변이를 포함하는, 효소.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, S33D 또는 S33T에 상응하는, 바람직하게는 S33D에 상응하는 아미노산 위치에서 상기 효소의 S2 포켓에 돌연변이를 포함하는, 효소.
  6. 제5항에 있어서, S33D에 상응하는 아미노산 위치에서 상기 효소의 S2 포켓에 돌연변이를 포함하고, N62S에 상응하는 S2' 포켓에 돌연변이를 추가로 포함하는, 효소.
  7. 제5항에 있어서, S33T에 상응하는 아미노산 위치에서 상기 효소의 S2 포켓에 돌연변이를 포함하고, N62W 또는 N62V에 상응하는 S2' 포켓에 돌연변이를 추가로 포함하는, 효소
  8. 제5항, 제6항 또는 제7항에 있어서, M222P, Y217H, P225N, F189W, N218D 및 I107V에 상응하는 돌연변이를 추가로 포함하는, 효소.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, N62D, N62S, N62Y 또는 N62W에 상응하는, 바람직하게는 N62D에 상응하는 아미노산 위치에서 상기 효소의 S2 포켓에 돌연변이를 포함하는, 효소.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 위치는, F189, N218, S33 및 N62에 상응하는 위치의 군으로부터 선택된 바람직하게는 3개의 위치에서 돌연변이를 포함하고,
    F189에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이는 F189Y 또는 F189W에 상응하고;
    N218에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이는 N218D, N218T 또는 N218E에 상응하고;
    S33에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이는 S33D 또는 S33T에 상응하고;
    F62에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이는 N62D, N62S, N62W 또는 N62Y에 상응하는, 효소.
  11. 제10항에 있어서, F189, N218, S33 및 N62에 상응하는 위치의 군으로부터 선택된 4개의 위치 모두는 돌연변이를 포함하고,
    F189에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이는 F189Y 또는 F189W에 상응하고;
    N218에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이는 N218D, N218T 또는 N218E에 상응하고;
    S33에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이는 S33D 또는 S33T에 상응하고;
    F62에 상응하는 위치에서의 상기 돌연변이는 N62D, N62S, N62W 또는 N62Y에 상응하는, 효소.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, P225N, P225D, P225S, P225C, P225G, P225A, P225T, P225V, P225I, P225L, P225H 및 P225Q에 상응하는, 바람직하게는 P225N, P225D, P225S, P225C, P225G, P225A 또는 P225T에 상응하는 아미노산 위치의 군으로부터 선택된 P225에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이를 포함하는, 효소.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, SEQ ID NO: 2의 Q2, S3, P5, S9, I31, K43, M50, A73, E156, G166, G169, S188, Q206, N212, T254 및 Q271에 상응하는 아미노산 위치에서의 돌연변이의 군으로부터 선택된 1 내지 16개, 특히 6 내지 15개, 보다 구체적으로는 12 내지 14개의 돌연변이를 포함하며, 바람직하게는 상기 돌연변이 중 하나 이상, 더욱 바람직하게는 상기 돌연변이 중 적어도 6개, 가장 바람직하게는 상기 돌연변이 중 12개 이상은 Q2K, S3C, P5S, S9A, I31L, K43N, M50F, A73L, E156S, G166S, G169A, S188P, Q206C, N212G, T254A 및 Q271E에 상응하는 위치의 군으로부터 선택되는, 효소.
  14. (a) 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르와 (b) N-말단 비보호된 아민을 갖는 펩타이드 친핵체를 커플링하는 단계를 포함하는, 펩타이드를 효소적으로 합성하는 방법으로서,
    상기 커플링은 물을 포함하는 유체에서 수행되고,
    상기 커플링은 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 효소에 의해 촉매되는, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르 또는 상기 펩타이드 친핵체는 단백질인, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 단백질은 항체, 항체-단편, 펩타이드-기반 수용체 리간드, 알부민, 바이오틴, 성장 인자, 호르몬 및 나노바디의 군으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르, 상기 펩타이드 친핵체, 또는 둘 모두는 2 내지 100개의 아미노산 단위, 특히 5 내지 50개의 아미노산 단위, 보다 구체적으로는 8 내지 40개의 아미노산 단위를 갖는 펩타이드 사슬을 포함하는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르는 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르와 폴리알킬렌 글리콜(특히, 폴리에틸렌 글리콜), 지방산 및 폴리시알산의 군으로부터 선택된 모이어티의 접합체이고/이거나 상기 펩타이드 친핵체는 펩타이드 친핵체와 폴리알킬렌 글리콜(특히 폴리에틸렌 글리콜), 지방산 및 폴리시알산의 군으로부터 선택된 모이어티의 접합체인, 방법.
  19. N-말단 비보호된 아민을 갖는 펩타이드 C-말단 에스테르 또는 티오에스테르를 고리화 단계에 적용하는 단계를 포함하는, 적어도 12개 아미노산의 사이클릭 펩타이드를 효소적으로 합성하는 방법으로서, 상기 고리화는 물을 포함하는 유체에서 수행되고,
    상기 고리화는 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 효소에 의해 촉매되는, 방법.
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