CN101868541A - 生产氨肽酶的方法 - Google Patents

Abstract

公开了一种有效生产氨肽酶的方法。该方法包括以下步骤：或用一种氨肽酶基因和一种中性蛋白酶基因转化入宿主细菌，或用氨肽酶基因转化一部分宿主细菌，而用中性蛋白酶基因转化另一部分宿主细菌；在培养基中培养用氨肽酶基因和中性蛋白酶基因转化了的宿主细菌或用氨肽酶基因转化的宿主细菌和用中性蛋白酶基因转化的宿主细菌的混合物，以表达氨肽酶和中性蛋白酶基因，回收由培养混合物中产生的氨肽酶。

Description

生产氨肽酶的方法

技术领域

本发明涉及一种生产氨肽酶的方法，尤其涉及利用大肠杆菌生产氨肽酶的改进方法。

背景技术

自从20世纪80年代重组DNA技术建立以来，利用大肠杆菌广泛生产了真核简单蛋白，其提供了低成本的生产。在自然发生的生物体中，许多蛋白质首先被合成为非活性前体蛋白的形式，随后经蛋白水解酶切割(如，除去氨基末端(N-末端)的甲硫氨酸)或其它处理，以形成成熟蛋白质。但是，由原核大肠杆菌生产的真核蛋白质经常具有一个或更多非必需氨基酸残基，例如甲硫氨酸，其来源于启始密码子并保留在其N-末端。具有此类一个或更多非必需氨基酸残基的蛋白质若作为药物施用于人，则可引起诸如过敏反应的抗原抗体反应。因此，此类非必需氨基酸残基应被除去。

在具有从蛋白的氨基末端(N-末端)开始一个一个地切割氨基酸残基的活性的氨肽酶中，已知多种各有不同的种类，例如特异性不同。因此，已报道利用氨肽酶将前体蛋白转化为其相应的成熟蛋白的方法(例如专利文献1，专利文献2和专利文献3).

例如，当使用重组大肠杆菌生产人生长激素时，其以一种前体人生长激素的形式获得，该形式的N-末端保留有一个甲硫氨酸残基，并因此其氨基酸序列N-末端以诸如“Met-Phe-Pro......”等的形式开始。在氨肽酶中，那些具有其切割肽键的反应在蛋白质的脯氨酸前的一个残基停止的性质的氨肽酶能选择性单独除去人生长激素前体N-末端的甲硫氨酸。众所周知，人成熟生长激素可使用此类氨肽酶从前体人生长激素获得，通过这样的方法生产的含有人成熟生长激素的药物制剂目前也供应于制药市场。

迄今已知道不同种类的氨肽酶，它们适用于除去正如包含在人前体生长激素中的N-末端甲硫氨酸(专利文献4，专利文献5)。一种此类氨肽酶是溶蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)的氨肽酶。该酶的生产是通过以由4个结构域(信号肽、N-末端前肽、成熟域和C-末端前肽)组成的前蛋白原(preproprotein)的形式翻译实现。溶蛋白弧菌的氨肽酶具有以下益处：其发现于溶蛋白弧菌已培养了特定时间长度的培养基中，且其随后可容易的从细胞中分离，例如通过离心。但是，它有一个很大的缺陷：即，由于发现于这种培养基中的氨肽酶量少，生产工业需求的氨肽酶需要大型设备，且证实是昂贵的。因此，已进行研究以修饰溶蛋白弧菌氨肽酶基因使之适应在大肠杆菌中表达，通过例如用PelB取代其分泌信号，并因此通过大肠杆菌生产和分泌氨肽酶。但是，这种方法的生产效率至多是使用溶蛋白弧菌自身的情况的约三倍。

总的来说，氨肽酶(AP)一旦以非活性形式翻译产生后，即被转化为活性形式，其机制尚未完全清楚。已知在一些与溶蛋白弧菌相近的种中，AP通过某种蛋白酶的切割转化为活性形式(非专利文献1，非专利文献2)。此外，在溶蛋白弧菌的培养物中发现了一种中性蛋白酶[vibriolysin：nprV](非专利文献3，非专利文献4，非专利文献5)。弧菌溶血素(Vibriolysin)是一种胞外锌金属蛋白酶，其通过以一种肽链的形式翻译而产生，该肽链的组成是：由氨基酸1-24组成的信号肽，由氨基酸25-196组成的N-末端肽和剩下的形成成熟蛋白质的氨基酸197-609。尚未清楚弧菌溶血素在由溶蛋白弧菌生产氨肽酶中的作用。

[专利文献1]日本专利申请公开号.H62-244381[专利文献2]日本专利申请公开号.H62-500003[专利文献3]日本专利申请公开号.2004-533263[专利文献4]WO86/01229[专利文献5]美国专利号5569598[非专利文献1]S.Nirasawa等，(1999)Biochim Biophys Acta.Aug17；1433(1-2)：335-42[非专利文献2]ZZ.Zhang等，(2000)Biochem J.Sep 15；350Pt 3：671-6[非专利文献3]J.Prescott等，(1976)Methods Enzymol.45404-415[非专利文献4]D.Durham(1990)Appl Environ Microbiol.Aug；56(8)：2277-81[非专利文献5]S.Shinoda等，(2004)Handbook of Proteolytic Enzymes，第二版，399-40

发明内容

[本发明要解决的技术问题]

与上述背景相对，本发明的目的是提供一种以提高的效率生产氨肽酶的方法。[解决问题的方法]

通过使溶蛋白弧菌氨肽酶基因和一种在相同细菌中产生的中性蛋白酶——弧菌溶血素(nprV)基因在大肠杆菌中共表达，本发明的发明人成功在培养上清中获得了氨肽酶，其效率比使用大肠杆菌细胞转化体可能获得的效率更高。进一步的，通过修饰nprV基因的核苷酸序列，本发明的发明人成功使这种转化体大肠杆菌细胞以惊人的高效率稳定生产氨肽酶并分泌到胞外。本发明基于这些发现而完成。

本发明提供一下：1.一种生产氨肽酶的方法，包含以下步骤：或者用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化宿主细菌，或者用氨肽酶基因转化一部分宿主细菌而用中性蛋白酶基因转化另一部分宿主细菌，在培养基中培养用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化了的宿主细菌，或培养用氨肽酶基因转化的宿主细菌和用中性蛋白酶基因转化的宿主细菌的混合物，使氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都得到表达，和收集培养混合物中产生的氨肽酶。2.根据上述1的生产方法，其中收集氨肽酶的步骤包括收集释放到培养上清液中的氨肽酶。3.根据上述1或2的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因各自是来源于属于与宿主细菌所属种不同种的细菌的基因。4.根据上述1到3任一所述的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都来源于属于一个和相同种的细菌。5.根据上述1到4任一所述的生产方法，其中氨肽酶基因是这样一种基因，其编码的氨肽酶的特征是其导致的肽键切割反应在脯氨酸残基前的一个残基终止。6.根据上述1到5任一所述的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都来源于溶蛋白弧菌。7.根据上述1到6任一所述的生产方法，其中宿主细菌是大肠杆菌。8.根据上述1到7任一所述的生产方法，其中当氨肽酶以其前蛋白原形式存在时，具有如SEQ ID NO：4定义的氨基酸序列。9.根据上述1到8任一所述的生产方法，其中中性蛋白酶是弧菌溶血素。10.根据上述1到9任一所述的生产方法，其中以其成熟蛋白形式存在的弧菌溶血素具有如SEQ ID NO：18定义的氨基酸序列。11.根据上述1到9任一所述的生产方法，弧菌溶血素基因在其N-末端肽区域携带突变。12.根据上述1到11任一所述的生产方法，其中该变异是发生在N-末端肽区域中第158位氨基酸残基的Ala到Val的突变。13.一种作为编码弧菌溶血素前肽的核苷酸的弧菌溶血素基因，包括如SEQ ID NO：15定义的核苷酸序列。14.根据上述13的弧菌溶血素基因，该基因包含如SEQ ID NO：15定义的核苷酸序列和跟随此核苷酸序列的如SEQ ID NO：17定义的核苷酸序列。15.根据上述14的弧菌溶血素基因，包含编码信号序列的核苷酸序列，跟随信号序列的如SEQ ID NO：15定义的核苷酸序列，和跟随SEQ IDNO：15定义的核苷酸序列的如SEQ ID NO：17定义的核苷酸序列。16.一种作为大肠杆菌中表达弧菌溶血素的表达载体的质粒，包含根据上述13到15之一的DNA。17.一种通过导入来自溶蛋白弧菌的弧菌溶血素基因和氨肽酶基因以使细胞表达两种基因而转化了的大肠杆菌细胞。18.根据上述17的大肠杆菌细胞，其中所述弧菌溶血素基因在其前肽区域携带导致氨基酸残基突变的变异。19.一种通过导入根据上述16的质粒和另一种作为包含来源于溶蛋白弧菌的氨肽酶基因的表达载体的质粒而转化了的大肠杆菌细胞。[发明效果]

本发明能使宿主细菌，特别是大肠杆菌，产生氨肽酶，尤其是来源于溶蛋白弧菌的氨肽酶，其比先前更具效率并将该酶释放到培养基中。特别的，当引入来源于溶蛋白弧菌的中性蛋白酶作为与氨肽酶共表达的中性蛋白酶时，本发明大大提高了培养基中氨肽酶的生产效率，并且，通过向中性蛋白酶的氨基酸序列中引入突变，惊人的提高了生产效率。

附图简述

[图1]图1显示了(a)载体pRL-AP、(b)载体pET-AP和(c)载体pCDF-nprV的重组部分。[图2]图2是载体pRL-PelB-AP的基因图谱。[图3]图3是一幅图表，分别显示了在40℃和42℃下诱导BL21/pRL-AP表达后培养上清和细胞裂解液中的氨肽酶活性(AP酶活性)。[图4]图4是载体pET-43.1b(+)的基因图谱。[图5]图5是一幅图表，分别显示了在25℃用1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET-AP表达后，培养上清液和细胞裂解液中的氨肽酶活性(AP酶活性)。[图6]图6是载体pCDF-1b的基因图谱。[图7]图7是一幅图表，分别显示了在25℃用1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET-AP和BL21(DE3)/pET-AP&pCDF-nprV表达后，培养悬液和细胞裂解液中的氨肽酶活性。[图8]图8是一幅图表，显示了在25℃用1mM IPTG诱导BL21(DE3)/pET-AP和BL21(DE3)/pET-AP&pCDF-nprV表达后，培养悬液中的氨肽酶活性。

本发明的最佳实施方式本发明中，当用编码氨肽酶和中性蛋白酶的基因转化宿主细菌时，包含氨肽酶基因的表达载体和包含中性蛋白酶的另一种表达载体可被一起导入相同宿主细菌以将其转化。可替代的，可用一种包含氨肽酶基因和中性蛋白酶基因两者的表达载体转化宿主菌。进一步的，也可将包含氨肽酶基因的表达载体导入一部分细菌以使其转化，同时将含有中性蛋白酶基因的表达载体导入另一部分细菌使它们转化。在最后一个例子中，两种分别单独转化了一种或另一种基因的宿主菌在其为表达各自基因而进行培养之前进行混合。

虽然可使用为本领域技术人员所已知的不同的氨肽酶之一，特别优选的是一种来源于溶蛋白弧菌的氨肽酶。

虽然可使用为本领域技术人员所已知的不同的中性肽酶之一，特别优选的是一种来源于溶蛋白弧菌的中性蛋白酶。

虽然可使用通不同的细菌作为宿主菌，优选使用大肠杆菌，由于其成本低廉并易于操控。

在本发明中，术语“弧菌溶血素基因”不仅包括野生型基因(SEQID NO：1)，而且包括携带在不消极影响弧菌溶血素的酶活性的表达的范围内的变异的基因。氨基酸的突变可包括插入、替换、删除和添加，且发生突变的氨基酸的数量一般而言是一个到若干(如1到5)。特别的，在弧菌溶血素的N-末端肽区域引入氨基酸突变可为弧菌溶血素以其活性形式在大肠杆菌中稳定表达带来有利影响。弧菌溶血素氨基酸序列的变异可通过在编码该蛋白质的基因的核苷酸序列中诱导突变而引入。可以借助熟知的技术向基因中的目标位点或随机的引入突变。通过向宿主菌分别引入具有诱发突变的弧菌溶血素基因和氨肽酶基因以使之转化，并测量培养宿主菌以使两基因表达后产生的活性氨肽酶的量，使氨肽酶具有更高产量的弧菌溶血素突变体可轻易的筛选得到。

[实施例]

虽然本发明将在下面进一步详细描述涉及的实施例，这并未意味着本发明仅限于实施例。

[参考实施例1]使用转化体大肠杆菌生产氨肽酶基因组DNA由溶蛋白弧菌制备，氨肽酶(AP)基因以下列方法克隆。

(1)克隆氨肽酶基因使用“GenElute Bacterial Genomic DNA kit”(西格玛公司(Sigma)，No.NA2100)，从3.0mL的溶蛋白弧菌细胞培养物中提取基因组DNA，所述细胞培养物在含有0.8％营养肉汤(迪夫科公司(Difco)，No.234000)和3.0％NaCl的培养基中于26℃过夜培养(14hrs)(具体步骤依照试剂盒中的说明书实施)。随后使用提取的基因组DNA作为模板，使用2个引物(如下)通过PCR扩增氨肽酶(AP)基因(反应条件：94℃2min；随后94℃15sec、55℃30sec、68℃90sec，共30轮；随后68℃7min)，由此获得的扩增产物连接到克隆载体pGEM-T easy(由普洛美卡公司(Promega)提供)。●引物BaRBFL41：CGGGATCCTAAGGAGGTTATCATATGAAATATACCAAAACG(SEQ ID NO：1)(在核苷酸3-8的“GGATCC”构成BamHI位点)●引物No-FL33R：CGGCGGCCGCTTATCAGAAAGTGCTGGCTTTCA(SEQ ID NO：2)(在核苷酸3-10的“GCGGCCGC”构成一个NotI位点)使用该反应混合物，转化了感受态大肠杆菌(E.coli)细胞，从随后形成的一个菌落中提取质粒。分析该质粒的DNA序列并证实在序列中不含错误。AP基因的核苷酸序列及其相应氨基酸序列分别表示为SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4。

(2)替换分泌信号序列随后，AP基因的分泌信号序列被胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的PelB分泌信号序列所替换。首先，PelB分泌信号序列通过使4个寡核苷酸(显示如下)彼此连接而构建。具体的，下述单链DNAs(i)Pelb-1F和(ii)Pelb-2R，和(iii)Pelb-3F和(iv)PelB-4R分别进行PCR，两种PCR扩增产物随后彼此连接并进行PCR以形成PelB分泌信号序列(PCR条件：94℃2min；随后98℃10sec，55℃30sec，68℃30sec。第一轮反应5个循环，第二轮反应35个循环)。AP基因的5’-末端部分被该PelB分泌信号序列(利用BamHI/MunI位点)所替换以形成PelB-AP序列。(i)PelB-1F：ACGGGATCCTAAGGAGGTTATCATATGAAATACCTGCTGCCCAC(SEQ ID NO：5)(ii)PelB-2R：CAGGAGCAGCAGACCAGCAGCAGCGGTGGGCAGCAGGTATTTCAT(SEQ ID NO：6)(iii)PelB-3F：GCTGGTCTGCTGCTCCTGGCTGCCCAACCCGCGATGGCCGAAG(SEQ ID NO：7)(iv)PelB-4R：CGCACCAATTGAGATCCACACTTTGTCTTCGGCCATCGCGGGTT(SEQ ID NO：8)原始分泌信号序列的核苷酸序列(63个碱基)显示为SEQ ID NO：9，替换前者的PelB分泌信号的核苷酸序列(66个碱基)显示为SEQ IDNO：10。

(3)PelB-AP整合入载体pRL。由分泌信号已被PelB分泌信号替换而获得的AP基因(PelB-AP)被克隆到具有温度依赖的pRL启动子的pRL载体中，以构建AP表达载体，“pRL-AP”(图1)。即，质粒pCE30(ATCC37830)(Elvin CM等，1990，Gene87，123-126)购自ATCC。构建该质粒以便使其具有位于克隆位点上游的λ噬菌体的pL启动子，与其串联排布的pR启动子，和它们的更远上游的λc1857的核苷酸序列(一种温度敏感阻遏基因)，并使其在30℃下启动子转录受到阻遏，且如果在42℃下培养则整合基因将表达。修饰该质粒使之紧随λ启动子后含有NotI位点以获得pRL载体。pRL载体事先用BamHI和NotI消化，且纯化其载体区域。也通过同样方式消化PelB-AP序列并纯化由此形成的序列。将这些DNA片段连接，使用由此得到的DNA转化已制备感受态的大肠杆菌细胞以使之形成菌落。从菌落提取质粒，通过限制性酶切割并随后测序，确定其序列。由此获得的质粒命名为pRL-PelB-AP(图2)。

向18μL感受态细胞(大肠杆菌BL21菌株)中加入2μL pRL-PelB-AP质粒溶液。将该混合物置于冰上30分钟，随后42℃热处理18秒，将其接种到LB+氨苄青霉素(Amp)平板上并于30℃过夜。随机选择菌落于30℃在含有100μg/mL Amp的LB培养基中摇动培养(200rpm)过夜。为诱导表达，该过夜培养混合物用LB+Amp培养基稀释10倍，在30℃摇动培养(200rpm)3小时，接着当其温度升至40℃或42℃后，进一步培养4.5小时。将培养混合物以12000rpm离心5分钟以使上清液和沉淀物分离。随后如下所述测量上清液中的酶活等，将沉淀物按下述步骤处理以提取酶。

(4)酶的提取向沉淀物加入1/5体积的BugBuster(塔卡拉生物公司(Takara Bio))，室温轻轻搅拌10分钟后，混合物15000rpm离心10分钟以分离上清液和沉淀。用作为细胞裂解物的上清液测量酶活。

(5)AP酶活的测量使用一种合成底物(L-pNA)测量获得的AP的酶活性。作为指导，使用J.Prescott等(1971)J.Biol.Chem.246(6)1756-1764和J.Prescott等(1976)Methods Enzymol.45530-543中描述的方法，按照以下描述进行测量。首先，10μL样品加入100μL底物溶液[50mM Tris HCl含有1mM亮氨酸-对硝基苯胺(西格玛，L-2158)，0.5mM的N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)，5μM硫酸锌(pH 8.0)]，反应在室温下进行30分钟。向其中加入300μL终止溶液(0.1M HCl)并混合后，将100μL混合溶液转移到96孔板上，并在平板读取器上读取OD值(405nm)(表1)。分别的，使用一种氨肽酶(西格玛，A-8200)作为标准产生标定曲线，测定每个样品的AP活性。结果，测定了细胞提取物中的AP活性，如图3所示，而培养上清液中几乎未检测到活性。

[表1]表1.氨肽酶(单位：mU/mL)

	40℃	42℃
			培养上清液	检测限度以下	检测限度以下
细胞裂解物	370.5	158.2

(6)将PelB-取代的AP基因克隆入pET大体上，在较低温度培养被认为是有益于分泌表达的。因此，为了检测较低温度下的诱导，将PelB-取代AP基因克隆入含有T7启动子的pET载体，以形成AP表达载体，“pET-AP”(图1)。即，pET-43.1b(+)(诺瓦根公司(Novagen)，70940-3)(图4)购自默克公司(Merck&Co.)，用NdeI和NotI消化，除去其Nus-tag部分，纯化载体区域。事先制备好的pRL-PelB-AP也同样地用NdeI和NotI消化，纯化其PelB-AP。连接两片段，用此连接产物转化JM109以形成菌落。由随机挑选的菌落制备质粒，通过使用NdeI和NotI进行限制性酶处理而选择适合的克隆。由此获得的质粒命名为pET-AP。

(7)AP的表达得到的pET-AP导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株，后者接着在25℃的温度条件下用1mM IPTG诱导表达AP。即，将1μL pET-AP溶液加入50μLBL21-star(DE3)感受态细胞(Invitrogen，C6010-03)，将混合物冰浴30分钟后，在42℃下热处理30秒。将该混合物接种到LB+氨苄青霉素(Amp)平板上，在30℃下过夜。随机挑选菌落，于30℃下在含有100μg/mL Amp的LB培养基中摇动培养(220rpm)16小时。用LB培养基将培养物稀释20倍，在进一步于30℃下摇动培养3小时(220rpm)后，加入IPTG至终浓度为1mM，于25℃下将混合物进一步摇动培养16-20小时(220rpm)。将培养物以3000rpm离心30分钟，用上清液进行AP酶活性测量。

(8)AP酶活性的测量AP酶活性的测量方法与上述(5)的描述类似，得到如下结果。

[表2]表2.氨肽酶活性(单位：mU/mL)

培养上清	141.4
		细胞裂解物	1485.7

如表2所见，在培养物中观察到高AP活性，比使用溶蛋白弧菌的情况观察到的活性高3倍。但是，根据这个系统，其只有分泌到培养基中的总AP活性的不到10％，而不少于90％未分泌而发现于细胞裂解物中(图5)。该结果与迄今为止在文献中报道的相似，未能在培养基中有效获得AP活性。

[实施例1]中性蛋白酶和氨肽酶的共表达本发明的发明人意图使nprV和AP通过下列方法在大肠杆菌中共表达。

(1)弧菌溶血素(nprV)基因的克隆编码中性蛋白酶nprV(前蛋白原)的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，相应氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。在SEQ ID NO：11中，核苷酸1-72编码信号序列，核苷酸73-588编码前肽序列，核苷酸589-1830编码成熟蛋白。在SEQ ID NO：12中，分别由，氨基酸1-24构成信号序列，氨基酸25-196为前肽序列，氨基酸197-609为本发明要求保护的蛋白。

使用“(1)克隆氨肽酶基因”部分中制备的基因组DNA作为模板，通过下述方法用PCR克隆nprV基因。使用Blend Tag-plus(TOYOBO，BTQ-201)进行PCR。下述序列的寡核苷酸被用作引物。(i)nprV_NcoI_FW引物(5’-GCATAATCCATGGCAAAATAAAACACAACGTCACATCAACTGGC-3’：SEQ ID NO：13，核苷酸8-13，CCATGG，提供一个NcoI位点)(ii)nprV_NotI_BamHI_RV引物(5’-GCATAATGCGGCCGCGGATCCATTAGTCAGCACGCAAAGTTACACC-3’：SEQ ID NO：14，核苷酸8-22，CCATGG，提供NotI和BamHI位点)反应条件由以下组成[94℃/2min；(94℃/30sec，从60到54℃(-1℃/循环)/30sec，72℃/2.5min)×7循环；(94℃/30sec，53℃/30sec，72℃/2.5min)×30循环，4℃/∞]。

(2)pCDF-nprv表达载体的构建克隆的nprV基因(紧随起始密码子“ATG”之后具有插入的“GCA”(编码Ala)，以引入NcoI位点)被克隆到T7启动子下以形成nprV表达载体，“pCDF-nprV”(图1)。即，pCDF-1b(Novagen，71330-3)(图6)购自默克公司。该质粒以及以上制备的nprV基因PCR产物分别用NcoI和NotI消化。将他们分别纯化后，将两片段彼此连接，用由此获得的连接产物转化JM109以使其形成菌落。由随机挑选的菌落制备质粒，使用NcoI和NotI通过限制性酶处理选择合适的克隆。分析核苷酸序列并证实该序列没有发生突变。将获得的质粒命名为pCDF-nprV。

(3)弧菌溶血素和氨肽酶在大肠杆菌中共表达将该表达载体和前述载体pET-AP导入BL21(DE3)菌株的大肠杆菌细胞，25℃下用1mM IPTG诱导该细胞表达AP和nprV。通过氯化钙法将“(6)将PelB-取代的AP基因克隆入pET”部分中产生的BL21star(DE3)/pET-AP制备成感受态细胞，用在上述(2)中构建的pCDF-nprV质粒进行转化。使用Amp和链霉素(Sm)进行选择后，用一个生长的菌落进行表达实验。随机挑选一个菌落，在含有100μg/mL Amp和40μg/mL Sm的LB培养基中于30℃下摇动培养(220rpm)16小时。用LB培养基做20倍稀释后，30℃下继续进一步摇动培养(220rpm)3小时，加入IPTG至终浓度为1mM，于25℃下进一步摇动培养16-20小时(220rpm)。将培养混合物以3000rpm离心30分钟，用上清液进行AP酶活性和蛋白酶活性测量。

(4)蛋白酶活性的测量向150μL底物溶液(50mM Tris-HCl，含有0.1％偶氮酪蛋白(azocasein)，pH 7.4)加入10μL样品，在37℃下反应10分钟。向其中加入150μL终止溶液(10％TCA)并使混合物冰浴10分钟。在4℃下12000rpm离心4分钟后，将上清液转移到96孔板并在平板读取器上读取OD₄₂₀值。

表3氨肽酶活性(单位：mU/mL)

	AP	AP+nprV
			培养上清液	76.2	403.3
细胞裂解物	361	21.5

表4蛋白酶活性(OD₄₂₀)

	AP	AP+nprV
			培养上清液	0.009	0.126
细胞裂解物	-0.001	0.001

如表3所见，在向大肠杆菌导入AP和nprV两者的情况下培养上清液获得的AP活性比单独导入AP的情况高5-6倍。这是溶蛋白弧菌产生AP活性的15-20倍。此外，如表4所见，在AP和nprV共表达的大肠杆菌细胞中，在上清液中观察到高蛋白酶活性。有趣的是，在AP和nprV共表达的大肠杆菌细胞提取物中几乎未检测到AP活性(图7)。这揭示了AP和nprV的共表达不仅增加了培养上清中AP向其活性形式的转化，也增加了AP分泌到培养基中的效率。

[实施例2]突变型中性蛋白酶和氨肽酶的共表达(1)突变型中性蛋白酶的制备向nprV随机引入突变以获得可在大肠杆菌中以活性形式稳定表达的突变型nprV(命名为nprV-R)。也就是，一种可在体内诱导变异的XL1-Red突变菌株(Stratagene，Cat#200129)被用于进行突变的随机引入。用以上制备的nprV表达载体pCDF-nprV转化XL1-Red突变菌株，用由此得到的转化体接种到琼脂+40μg/mL Sm平板。于37℃培养24小时后，挑选300个菌落并植入10mL LB+40μg/mL Sm中，在37℃下培养18小时后，用碱性-SDS法纯化质粒。用这些质粒转化BL21(DE3)细胞，用这些细胞接种LB琼脂+1.5％脱脂牛奶+40μg/mL Sm+1mM IPTG平板(15mm平板×2)。37℃培养16小时后，获得约4000菌落/平板。在两个平板(8000菌落)中，只有一个菌落分解脱脂牛奶，在其周围形成晕环。将该菌落悬浮于1.5mL LB+40μg/mL Sm中，37℃过夜培养后，用GenElute Plasmid Miniprep试剂盒(Sigma，#PLN350)进行纯化。证实获得的nprV-R的核苷酸序列。发现nprV-R在2个位点具有突变。它们是：(1)第11个氨基酸Trp(计数时包括了紧随第一个Met后插入的丙氨酸)到该氨基酸序列的终止密码子(Opal：TGA)的突变，其是由于在信号区域核苷酸序列的核苷酸33(计数时包括紧随起始密码子后插入的GCA)发生G到A的突变，和(2)在前蛋白原的氨基酸序列第183位氨基酸Ala(计数时包括紧随第一个Met后插入的丙氨酸)到Val的突变，其是由于在N-末端前肽区域的核苷酸序列的核苷酸548(计数时包括紧随起始密码子后插入的GCA)发生C到T的突变。

(2)突变型中性蛋白酶和氨肽酶的共表达随后，为实现AP和nprV-R的共表达，用pET-AP转化BL21(DE3)/pCDF-nprV-R以产生BL21(DE3)/pCDF-nprV-R&pET-AP。将随机选择的克隆悬浮于1mL LB+100μg/mL Amp+40μg/mL Sm中，30℃培养5小时，随即在加入IPTG至终浓度为1mM后，继续于30℃培养17小时。通过3000rpm离心30分钟而获得上清液。测量上清液中的AP活性。结果，在突变中性蛋白酶基因和AP基因共表达的大肠杆菌中观察到的AP活性比AP基因被单独导入的对照(BL21(DE3)/pET-AP)中高不少于20倍(图8)。这揭示了突变型中性蛋白酶和氨肽酶的共表达使培养基中活性氨肽酶高效生产。

分别的，上述中性蛋白酶包括的突变(1)发现于信号序列，后者发现于N-末端前肽序列中。若由前者的突变建立的密码子被识别为终止密码子，翻译会停止于此。但是，由于实际上观察到了如上述结果所示的nprV活性，该密码子被认为经过通读并很可能被翻译为硒代半胱氨酸。已证实一种仅信号序列的突变回复正常的突变型基因获得了相同的结果(数据未显示)。因此，信号序列内的突变是非必需的。

进一步的，突变(2)是N-末端前肽(在该突变型nprV-R中的氨基酸26-197，其中紧随N-末端甲硫氨酸后插入一个单独氨基酸：分别的，突变型N-末端前肽的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：15，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：16)中的突变(SEQ ID NO：15中的第473位核苷酸的C到T的突变，和由此产生的SEQ ID NO：16中第158位氨基酸的Ala到Val的突变)。因此，该突变不影响成熟nprV(分别的，SEQ ID NO：12的氨基酸197-609，成熟nprV的核苷酸序列显示为SEQ ID NO：17，相应的氨基酸序列为SEQ ID NO：18)的核苷酸或氨基酸序列。认为虽然野生型N-末端前肽抑制弧菌溶血素活性，其可通过导入氨基酸突变(2)而阻止，由此有助于活性的稳定表达。

工业实用性

本发明大大提高了氨肽酶的生产效率。因此，本发明作为生产用于选择性除去连接于蛋白质的N-末端的额外氨基酸的氨肽酶的方法是有益的，所述蛋白质是在药物和食品生产中由微生物产生的，尤其是N-末端第二个氨基酸残基是脯氨酸的蛋白质，例如人生长激素，G-CSF，IL-2，等等。

Claims (19)

1.一种生产氨肽酶的方法，包含以下步骤：

用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化宿主细菌，或者用氨肽酶基因转化一部分宿主细菌而用中性蛋白酶基因转化另一部分宿主细菌，

在培养基中培养用氨肽酶基因和用中性蛋白酶基因转化了的宿主细菌，或培养用氨肽酶基因转化的宿主细菌和用中性蛋白酶基因转化的宿主细菌的混合物，使氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都得到表达，和

收集培养混合物中产生的氨肽酶。

2.根据权利要求1的生产方法，其中收集氨肽酶的步骤包括收集释放到培养上清液中的氨肽酶。

3.根据权利要求1或2的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因均是来源于属于与宿主细菌所属种不同的种的细菌的基因。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都来源于属于一个和相同种的细菌。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的生产方法，其中氨肽酶基因是这样一种基因，其编码的氨肽酶的特征是该氨肽酶导致的肽键切割反应在脯氨酸残基前的一个残基终止。

6.根据权利要求述1到5中任一项所述的生产方法，其中氨肽酶基因和中性蛋白酶基因都来源于溶蛋白弧菌(V.proteolyticus)。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的生产方法，其中宿主细菌是大肠杆菌。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的生产方法，其中当氨肽酶以其前蛋白原形式存在时，具有如SEQ ID NO：4定义的氨基酸序列。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的生产方法，其中中性蛋白酶是弧菌溶血素。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的生产方法，其中以其成熟蛋白形式存在的弧菌溶血素具有如SEQ ID NO：18定义的氨基酸序列。

11.根据权利要求1到9中任一项所述的生产方法，弧菌溶血素基因在其N-末端肽区域携带突变。

12.根据权利要求1到11中任一项所述的生产方法，其中突变是发生在N-末端肽区域中第158位氨基酸残基的Ala到Val的突变。

13.一种作为编码弧菌溶血素前肽的核苷酸的弧菌溶血素基因，包括如SEQ ID NO：15定义的核苷酸序列。

14.根据权利要求13弧菌溶血素基因，其中该基因包含如SEQ IDNO：15定义的核苷酸序列和跟随前述核苷酸序列的如SEQ ID NO：17定义的核苷酸序列。

15.根据权利要求14的弧菌溶血素基因，包含编码信号序列的核苷酸序列，跟随前述核苷酸序列的如SEQ ID NO：15定义的核苷酸序列，和跟随SEQ ID NO：15定义的核苷酸序列的如SEQ ID NO：17定义的核苷酸序列。

16.一种质粒，该质粒是一种表达载体，用于在大肠杆菌中表达弧菌溶血素，其中，该质粒包含根据权利要求13到15任一项所述的DNA。

17.一种大肠杆菌细胞，其中，该细胞已通过导入来自溶蛋白弧菌的弧菌溶血素基因和氨肽酶基因以使该细胞表达所述两种基因而被转化。

18.根据权利要求17的大肠杆菌细胞，其中弧菌溶血素基因在其前肽区域携带导致氨基酸残基突变的变异。

19.一种大肠杆菌细胞，其中，该细胞已通过导入根据权利要求16所述的质粒和另一种作为包含来源于溶蛋白弧菌的氨肽酶基因的表达载体的质粒而被转化。

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