JP2011024439A - サンプル核酸の調製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】天然皮革製品からサンプル核酸を調製する方法において、天然皮革製品由来の皮革片にコラゲナーゼ産生微生物(Vibrio hollisae 1706B(NITE P-776)株)を作用させる分解処理を行った後に、ホモジナイザーで粉砕し、粉砕後の試料から核酸を抽出することを特徴とするサンプル核酸の調製方法。
【選択図】なし
Description
1)天然皮革製品からサンプル核酸を調製する方法において、天然皮革製品由来の皮革片にコラゲナーゼ産生微生物を作用させる分解処理を行った後に、核酸を抽出することを特徴とするサンプル核酸の調製方法。
2)コラゲナーゼ産生微生物がビブリオ属細菌である上記1)の方法。
3)ビブリオ属細菌が、Vibrio hollisae 1706B株(NITE P-776)である上記2)の方法。
4)コラゲナーゼ産生微生物による分解処理が、15〜55℃で2時間以上培養する上記1)〜3)のいずれかの方法。
5)皮革片を有機酸に浸漬し、所望により中和処理した後、コラゲナーゼ産生微生物を作用させる上記1)〜4)のいずれかの方法。
6)天然皮革製品が、クロム鞣し又はタンニン鞣し皮革製品である上記1)〜5)のいずれかの方法。
7)有機酸、コラゲナーゼ産生微生物及び核酸抽出溶液を含有する上記1)〜6)のいずれかの方法を行うためのキット。
通常、脱クロム処理には、硫酸、シュウ酸等が用いられるが、核酸増幅反応への影響を考慮すると、コハク酸、マレイン酸、クエン酸、酢酸、ギ酸等の有機酸を用い、皮革片をこれに一定時間浸漬するのが好ましい(実施例2参照)。
中和処理は、例えば、皮革片に、リン酸緩衝液(pH7.0)、ホウ酸緩衝液(pH7.0)等の中和溶液を添加し、ボルテックスミキサー等で撹拌し、遠心分離により皮革片を沈澱させ溶液を除去する処理を数回繰り返す方法が挙げられる。
ここで、コラゲナーゼ産生微生物は、コラゲナーゼを産生する微生物であればいずれでもよいが、例えばクロストリジウム(Clostridium)属、ビブリオ(Vibrio)属、バチルス(Bacillus)属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する細菌が挙げられる。
より具体的には、例えば、Clostridium histolyticum、Clostridium perfringens、Vibrio alginolyticus、Vibrio hollisae、Bacillus licheniformis、Streptomyces sp.等が挙げられ、好適には、2009年6月29日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(郵便番号292−0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に、NITE P-776として寄託されたVibrio hollisae 1706B、Vibrio alginolyticum等が挙げられる。
尚、培養液を調製するための培地としては、例えば、ゼラチン培地(組成:ゼラチン2.0g、ペプトン5.0g、酵母抽出物1.0g、リン酸二水素カリウム0.5g、リン酸水素二カリウム0.2g、硫酸マグネシウム7水和物0.2g、塩化ナトリウム5.0g、蒸留水1000mL、pH7.0) 等が挙げられる。
微生物培養液は、例えば10〜50mg皮革片に対して、浴比1:10〜1:100となるように、使用するのが好ましい。
また、核酸抽出液からの核酸の単離・精製は、公知のフェノール/クロロホルム法、エタノール沈殿を用いた方法により行うことができる。
(1)クロム鞣し天然牛革製品を刃物で7カ所裁断し、更に細切して、5%濃度のクエン酸溶液に浸漬し、60℃で12時間以上静置した後、遠心分離し、皮革片とクエン酸溶液とに分離した。
上清のクエン酸溶液を除去して、リン酸バッファー溶液と置換した。ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離により皮革片を沈澱させた。前記リン酸バッファーによる溶液置換を2回以上行い、皮革片を中性化した。
L字型試験管にVibrio hollisae 1706B(NITE P-776)株とゼラチン液体培地(組成:ゼラチン2.0g、ペプトン5.0g、酵母抽出物1.0g、リン酸二水素カリウム0.5g、リン酸水素二カリウム0.2g、硫酸マグネシウム7水和物0.2g、塩化ナトリウム5.0g、蒸留水1000mL、pH7.0)を添加した。この試験管を30℃で6時間振蕩培養した。白濁が目視で確認できたところで皮革分解用に供した。
得られたDNA抽出液200μLをエタノール沈澱により10μLに濃縮し、このDNA溶液を鋳型として用い、PCR反応に供した。
プライマーは、ウシのミトコンドリアDNA、シトクロムb領域のcDNA配列情報に基づき、以下のとおり設計した。
Forward側:5’-TCT CCT CTG TTA CCC ATA TCT GCC GAG ACG-3’(配列番号1)
Reverse側:5’-TTT GTG CCG ATG TAT GGG ATT GCT GAT AAG-3’(配列番号2)
尚、公知の肉種鑑別用プライマー(「日本食品科学工学会誌 46(3)」、(1999年)、松永孝光、柴田清弘、山田順一、新村裕著、(社)日本食品科学工学会発行、187頁〜194頁)を使用することも可能であった(図4参照)。
Ex Taq を、サーマルサイクラーは、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラーを使用し、上記条件で実施した。
ただし、上記PCR反応でDNA増幅が確認できなかった時は、上記PCR産物を鋳型にし、98℃ 2分間 1サイクル、98℃ 15秒間、68℃ 15秒間、72℃ 45秒間 35サイクル、72℃ 2分間 1サイクルの条件で2次PCRを行った。
PCR反応終了後、得られたPCR産物(289bp)を8%のアクリルアミドゲル又は2%のアガロースゲルを用いた電気泳動により分析した。電気泳動条件は、アクリルアミドゲル使用時は20mA、60分間、アガロースゲル使用時は100V、40分間とした。分子量マーカーとして、Promega社製pGEM DNA マーカーを同時に電気泳動にかけた。電気泳動後、常套法によりバンドの位置を観察した。結果を図1Aに示す。
また、(1)〜(3)と同様の方法で試料を調製し、上記の肉種鑑別用プライマーを用いて、PCR反応(98℃ 2分間 1サイクル、98℃ 10秒間 35サイクル、62℃ 15秒間、72℃ 1分間、72℃ 3分間 1サイクル)を行った場合のPCR産物の電気泳動パターンを図4に示す。
(1)実施例1(1)で調製した中性化済み皮革片それぞれ50mgを、2.0mLエッペンドルフチューブに入れ、これにDNA抽出液(400mM Tris-HCl pH8.0、60mM EDTA、 1% SDS、 0.1% PEG-400、 5mM DTT)を1mL投入した。溶出してくる染料を除去するために、室温で数回上下転倒攪拌した後、12000rpm, 5分間遠心分離し、上清を500μl捨てた。この操作は、染料の溶出がなくなるまで行った。
Proteinase Kを投入し、50℃で12時間インキュベートした。続いてコラゲナーゼ(Clostridium histolyticum由来、生化学工業製使用)10ユニットを投入し、37℃で12時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。
再度コラゲナーゼ10ユニットを投入し、12時間インキュベートした後、試料を12,000rpm、5分間遠心分離し、上清を除去した。
(2)沈澱した試料をホモジナイザーで粉砕し、粉砕後の試料から、実施例1と同様にして、DNAを抽出し、PCR反応に供し、PCR産物を確認した。結果を図1Bに示す。
(1)クロム鞣し天然牛革製品を刃物で裁断し、細切せずにそのまま、5%濃度の有機酸溶液(コハク酸、マレイン酸、クエン酸、ギ酸)に浸漬し、60℃で12時間以上静置した後、遠心分離し、皮革片と有機酸溶液とに分離した。
上清の有機酸溶液を除去して、リン酸バッファー溶液と置換した。ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離により皮革片を沈澱させた。前記リン酸バッファーによる溶液置換を2回以上行い、皮革片を中性化した。
(1)性質の異なる2層からなる再生牛革製品を各層(上層と下層)に分け、それぞれの層から裁断して2つの皮革片を得た。当該皮革片を細切せずにそのまま、それぞれ5%濃度のクエン酸溶液に浸漬し、60℃で12時間以上静置した後、遠心分離し、皮革片とクエン酸溶液とに分離した。
上清のクエン酸溶液を除去して、リン酸バッファー溶液と置換した。ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離により皮革片を沈澱させた。前記リン酸バッファーによる溶液置換を2回以上行い、皮革片を中性化した。
Claims (7)
- 天然皮革製品からサンプル核酸を調製する方法において、天然皮革製品由来の皮革片にコラゲナーゼ産生微生物を作用させる分解処理を行った後に、核酸を抽出することを特徴とするサンプル核酸の調製方法。
- コラゲナーゼ産生微生物がビブリオ属細菌である請求項1記載の方法。
- ビブリオ属細菌が、Vibrio hollisae 1706B株(NITE P-776)である請求項2記載の方法。
- コラゲナーゼ産生微生物による分解処理が、15〜55℃で2時間以上培養する請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 皮革片を有機酸に浸漬し、所望により中和処理した後、コラゲナーゼ産生微生物を作用させる請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 天然皮革製品が、クロム鞣し又はタンニン鞣し皮革製品である請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 有機酸、コラゲナーゼ産生微生物及び核酸抽出溶液を含有する請求項1〜6のいずれか1項記載の方法を行うためのキット。
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