JP2010063370A - 微生物汚染検出用キット、微生物汚染検出方法、及び汚染源判別方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】超純水の微生物汚染の検出に用いられるキットであって、超純水に存在し、微生物汚染の原因菌となる微生物に特異的な塩基配列と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブを有する微生物汚染検出用キット、超純水の微生物汚染を、前記微生物汚染検出用キットを用いて検出することを特徴とする微生物汚染検出方法、及び、内部に超純水を含む装置の微生物汚染において、前記微生物汚染検出用キットを用いて微生物を検出することにより、汚染源が超純水であるか否かを判別することを特徴とする汚染源判別方法。
【選択図】なし
Description
また、本発明は、超純水の微生物汚染の検出に用いられるキットであって、配列番号1の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号1の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号2の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号2の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号3の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号3の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号4の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号4の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号5の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号5の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、配列番号6の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号6の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、を有することを特徴とする微生物汚染検出用キットを提供するものである。
また、本発明は、超純水の微生物汚染を、前記記載の微生物汚染検出用キットを用いて検出することを特徴とする微生物汚染検出方法を提供するものである。
また、本発明は、蛍光in situ ハイブリダイゼーション法を用いて微生物を検出することを特徴とする前記いずれか記載の微生物汚染検出方法を提供するものである。
また、本発明は、内部に超純水を含む装置の微生物汚染において、前記記載の微生物汚染検出用キットを用いて微生物を検出することにより、汚染源が超純水であるか否かを判別することを特徴とする汚染源判別方法を提供するものである。
また、本発明は、蛍光in situ ハイブリダイゼーション法を用いて微生物を検出することを特徴とする前記記載の汚染源判別方法を提供するものである。
また、本発明は、前記装置が、バイオリアクター、超純水製造装置、及び半導体洗浄装置からなる群より選択されるものであることを特徴とする前記いずれか記載の汚染源判別方法を提供するものである。
また、本発明の微生物汚染検出用キットを用いて、内部に超純水を含む装置から採取されたサンプルを調べることにより、該装置の微生物汚染の汚染源が超純水であるか否かを、迅速かつ高い確率で判別することができる。
これに対して、本発明の発明者らによって見出されたように、汚染された超純水由来の微生物は、系統的に明確に分類し得る。すなわち、各系統に属する微生物を検出し得るプローブを用いて、汚染原因菌を検出することにより、汚染原因菌の種類を明確に特定することを要することなく、超純水が微生物により汚染されているか否か、及び、超純水が汚染源であるか否かを判別することができる。
1.汚染原因菌の採取
汚染原因菌の種類は、サンプルが採取される装置の設置場所や、サンプルを採取する季節等により変動する可能性が考えられる。そこで、発明者らは、設置場所の異なる5台の超純水装置(A〜E)から超純水を2Lずつサンプリングした。超純水装置A〜Eからサンプリングしたサンプルを、それぞれサンプルA〜Eとした。サンプリング時期は夏〜秋とした。その他、参考として、1台の超純水装置からRO水をサンプリングし、これをサンプルFとした。
サンプリングした超純水A〜Fを、直径47mm、孔径0.22μmのメンブレンフィルターを用いて濾過し、微生物を捕集した。捕集された微生物の検出は、一枚のフィルターに対して、直接フィルター上の微生物のDNAを抽出して検出する直接抽出法と、フィルター上の微生物を培養した後DNAを抽出して検出する培養法との2種類の手法で行った。具体的には、直接抽出法として、微生物を捕集したフィルターの3/4を、界面活性剤を添加して溶菌させ、クロロホルム処理により、タンパク質を変性し除去した後、エタノールを添加することにより、DNAを沈殿させて回収した。一方、培養法として、微生物を捕集したフィルターの残りの1/4を寒天培地に置き、25〜35℃で培養し、形成したコロニーを色又は形態の種類ごとに採取した後、直接抽出法と同様にしてDNAを回収した。
得られたDNAを鋳型とし、PCR(Polymerase Chain Reaction)を用いて、16S rDNA遺伝子の塩基配列を有するPCR産物を得た。なお、該PCRに用いるプライマーは、通常、微生物の16S rDNA遺伝子の塩基配列をPCR増幅するために用いられているプライマーを使用した。
シークエンス解析で得られた塩基配列情報を用いて系統解析を行った。この結果得られた系統樹を図1〜3に示す。また、図2は図1の系統樹中のA以下につながる系統樹であり、図3は図2の系統樹中のB以下につながる系統樹である。図中、A1〜A8、B1〜7、C1〜C18、D、E1〜E6、及びFは、表1記載の微生物をそれぞれ表している。
したがって、あるクラスターに属する微生物に特異的な遺伝子配列、すなわち、該クラスターに属する微生物であれば共通して有しているが、該クラスターに属さない微生物は有していない、という特徴を有する遺伝子配列を認識し得る塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであれば、該クラスターに属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブとして用いることができる。
このような各クラスターに属する微生物に特異的な遺伝子配列は、国際塩基配列データベースを用いて、常法により決定することができる。したがって、各クラスターに属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブは、常法により設計し合成することができる。なお、クラスターによっては、公知のポリヌクレオチドプローブを、該クラスターに属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブとして用いることができる場合がある。例えば、クラスター1〜3はいずれもβ−プロテオバクテリアに属する微生物である。このため、クラスター1〜3に属する微生物を検出し得るポリヌクレオチドプローブ(以下、W−8プローブという。)として、既知のβ−プロテオバクテリア検出用プローブを用いることができる。
配列番号1の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有する塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであれば、配列番号1の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を認識し得るため、配列番号1の塩基配列を遺伝子配列として有するクラスター1〜3に属する微生物を検出することができるためである。特異性に優れているために、W−8プローブは、配列番号1の塩基配列と相同的又は相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブであることがより好ましい。
なお、該バイオリアクターにおいては、培地調製槽3に、培地原料供給管4を通して粉末状等の固形の培地原料が、水供給管5を通して水が、それぞれ投入され、培地が調製される。調製された培地は、培地供給管6を通って、培養槽1に投入される。一方で、空気は、空気供給管7を通って、別途培養槽1に供給される。培養槽1内において、目的の生物が培養される。培養時には、目的の生物の沈殿を防止し、培養液を均一に保つために、攪拌羽2により、培養液は攪拌される。水供給管5、培地供給管6、及び空気供給管7には、微生物除去用フィルター8がそれぞれ設置されている。
超純水由来汚染原因菌検出用プローブとして、配列番号1の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号2の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号3の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号4の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号5の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号6の塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブの計6種類を用いた。
その後、FISH法により、該フィルター上の微生物を検出した。具体的には、該フィルターを、上記6種類のプローブの混合溶液に、46℃で2時間浸した後、48℃のバッファーで洗浄した。その後、該フィルターを99%エタノールに入れて脱水した。
こうして得られた該フィルターを、蛍光顕微鏡を用いて観察した結果、微生物は検出されなかった。これにより、該バイオリアクターの微生物汚染は、超純水由来のものではないと推定された。実際に、水供給管5、培地供給管6、及び空気供給管7にそれぞれ設置された微生物除去用フィルター8を調べたところ、実際に、空気供給管7と培養槽1との配管接続部分に隙間が生じており、該配管接続部分が汚染源であり、汚染された空気由来の微生物が、該隙間から混入したことにより発生した微生物汚染であったことが特定できた。
Claims (7)
- 超純水の微生物汚染の検出に用いられるキットであって、
配列番号1の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号1の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号2の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号2の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号3の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号3の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号4の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号4の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号5の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号5の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、配列番号6の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ、及び配列番号6の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブからなる群より選択される1以上を有することを特徴とする微生物汚染検出用キット。 - 超純水の微生物汚染の検出に用いられるキットであって、
配列番号1の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号1の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、
配列番号2の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号2の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、
配列番号3の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号3の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、
配列番号4の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号4の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、
配列番号5の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号5の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、
配列番号6の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブ又は配列番号6の塩基配列中の少なくとも9塩基の連続する塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドプローブと、
を有することを特徴とする微生物汚染検出用キット。 - 超純水の微生物汚染を、請求項1又は2記載の微生物汚染検出用キットを用いて検出することを特徴とする微生物汚染検出方法。
- 蛍光in situ ハイブリダイゼーション法を用いて微生物を検出することを特徴とする請求項3記載の微生物汚染検出方法。
- 内部に超純水を含む装置の微生物汚染において、請求項1又は2記載の微生物汚染検出用キットを用いて微生物を検出することにより、汚染源が超純水であるか否かを判別することを特徴とする汚染源判別方法。
- 蛍光in situ ハイブリダイゼーション法を用いて微生物を検出することを特徴とする請求項5記載の汚染源判別方法。
- 前記装置が、バイオリアクター、超純水製造装置、及び半導体洗浄装置からなる群より選択されるものであることを特徴とする請求項5又は6記載の汚染源判別方法。
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