JP2000069994A

JP2000069994A - 微生物検出方法および微生物検出システム

Info

Publication number: JP2000069994A
Application number: JP10243408A
Authority: JP
Inventors: 稔 ▲高▼田; Minoru Takada; Taketoshi Yamada; 岳俊山田; Noritaka Nakayama; 憲卓中山
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1998-08-28
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2000-03-07

Abstract

(57)【要約】【課題】微生物の検出検査を安価で迅速に、しかもバ
ラツキなくコロニー数を測定できる微生物検出方法およ
び微生物検出システムの提供。【解決手段】１．微生物を着色培地を用いて培養し、
フィルムスキャナーで検出することを特徴とする微生物
検出方法。２．微生物を着色培地を用いて培養し、主走
査方向と副走査方向の少なくともいずれか一方の解像度
が２，０００ｄｐｉ以上のフィルムスキャナーで撮像し
た後、得られたデータをコンピュータで処理することを
特徴とする微生物検出システム。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、食品、化粧品、医
薬品、医療用具、工業製品等の製造工程および品質管理
工程で使用される水、原料、半製品、製品等の中に存在
する微生物を迅速・正確に検出するための微生物検出方
法および微生物検出システムに関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、微生物検査は、調査対象より
微生物を採取し、寒天（アガロースゲル）および微生物
の成長に必要な成分等を含む平板培地上で培養し、目測
可能な大きさに成長したコロニーを肉眼で評価する方法
により行われてきた（以下、この方法をプレート法と呼
ぶ）。このプレート法は、操作が簡便で、簡単な培養装
置さえあれば誰でも実施出来ることから、現在、最も広
く用いられている方法である。

【０００３】しかしながらこの方法では、平板培地上で
対象の微生物によりコロニーが形成され、肉眼で観察可
能になるまでに、相当の時間を要する。例えば、大腸菌
や枯草菌のような、比較的増殖速度の速い菌の場合でも
２４〜４８時間、また、サルモネラ菌など、増殖速度の
遅い菌では、１０日以上を要する。このようにプレート
法では菌を検出するのに要す時間が長いため、検査対象
物中に、菌がどの程度存在しているのかをなるべく早く
知りたいというニーズを満たすことは、現在のところ不
可能である。

【０００４】近年、プレート法以外の微生物の検出方法
として、１）微生物をメンブレンフィルターで濾過し、蛍光性物
質を微生物の体内に取り込ませた後、レーザーを微生物
に照射し、微生物から発せられる蛍光を検出することに
より、微生物の存在を検出する方法、２）微生物から、微生物体内に存在するアデノシン三リ
ン酸（ＡＴＰ）を抽出し、これを化学的に発光させるこ
とによって、微生物の存在を検出する方法、３）乾燥培地に液体試料を散布し、１から２日後に微生
物の代謝による発色を検出する方法等が知られている。

【０００５】しかしながら、１）、２）については装置
が大掛かりであることや一検査あたりの単価が高いなど
の理由から、現時点では一般的ではなく、普及率も低
い。

【０００６】また、３）については、手軽に扱えると言
う点で普及はしているものの、迅速性と言う点に欠け
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、これ
まで微生物の検出結果が得られるのに長時間かかり、ま
たは短時間で微生物の検出結果が得られるものの、単価
が高い為に実用性の低かった微生物の検出検査を安価で
迅速に、しかもバラツキなくコロニー数を測定できる微
生物検出方法および微生物検出システムを提供すること
にある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は以下
の構成により達成される。

【０００９】１．微生物を支持体上に形成させた着色培
地を用いて培養し、フィルムスキャナーで該微生物の形
成するコロニーを検出することを特徴とする微生物検出
方法。

【００１０】２．フィルムスキャナーの光学解像度の主
走査方向と副走査方向の少なくともいずれか一方が２，
０００ｄｐｉ以上であることを特徴とする前記１に記載
の微生物検出方法。

【００１１】３．着色培地が水溶性の色素で着色されて
いることを特徴とする前記１または２に記載の微生物検
出方法。

【００１２】４．前記水溶性の色素がトリアリールメタ
ン系色素であることを特徴とする前記１〜３の何れか１
項に記載の微生物検出方法。

【００１３】５．前記水溶性の色素が少なくとも一つの
酸基を有する色素であることを特徴とする前記１〜３の
何れか１項に記載の微生物検出方法。

【００１４】６．微生物を着色培地を用いて培養し、主
走査方向と副走査方向の少なくともいずれか一方の解像
度が２，０００ｄｐｉ以上のフィルムスキャナーで撮像
した後、得られたデータをコンピュータで処理し、コロ
ニー数を計測することを特徴とする微生物検出システ
ム。

【００１５】７．大腸菌または乳酸菌の培養に要する時
間が３〜７時間であることを特徴とする前記６に記載の
微生物検出システム。

【００１６】８．主走査方向と副走査方向の光学解像度
の積が、２，０００，０００ｄｐｉ²以上であることを
特徴とする前記６に記載の微生物検出システム。

【００１７】本発明者らは、これまでに行われてきたプ
レート法やそれに代わる他の微生物検出方法などを詳細
に検討することにより、（１）微生物の検出を短時間に行うためには、培養時間
を短くする必要がある（２）培養時間を短縮すると、コロニーを肉眼で観察す
る事は不可能である（３）短時間培養ではコロニーを実体として検出するこ
とは難しい（４）レーザー装置等は、装置自体が大掛かりで、現実
的ではない等の具体的課題を抽出した。

【００１８】上記課題を解決するため、鋭意検討を重ね
た結果、本発明の上記構成により、微生物の検出結果が
短時間に高精度で得られ、コストパフォーマンスの高い
微生物の検出方法及び微生物の検出システムを見いだし
た。

【００１９】以下に本発明を更に詳細に説明する。

【００２０】本発明の請求項１に示した微生物検出方法
は、適応の対象となる微生物の種類には特に制限はな
く、通常微生物の培養に用いられる培地上で増殖して、
コロニーを生じる全ての微生物に対して適用することが
出来る。検出のためには以下の操作を行う。

【００２１】まず、目的とする微生物が存在すると考え
られる試料を、該微生物の増殖に適した栄養素およびコ
ロニー着色用の色素を含む培養層が設けられた微生物検
出用プレート（一例を図１に示す）上に散布し、微生物
を増殖させる。培養が完了した後、微生物検出用プレー
トをフィルムスキャナーにセットし、撮像する。

【００２２】以下に図２の本発明の微生物検出システム
の一例を示す模式図により、本発明の検出方法を説明す
る。検出作業中には光が入り込まないように密閉された
撮像装置７に、微生物検出用プレート５を設置する設置
台（図示せず）、設置台に設置された微生物検出用プレ
ート５に光を照射するための光源３、照射した光の透過
光を電気信号に変換する固体撮像素子（ＣＣＤラインセ
ンサー）６が置かれている。また、対象によっては、フ
ィルター４を光源３と微生物検出用プレート５の間に設
置することが好ましい。撮像作業により得られた電気信
号は、電子計算機８に送られる。入力装置１０の命令に
より、得られた電気信号は変換され、コロニー数として
計測される。得られた結果は表示装置９に表示される。

【００２３】また、固体撮像素子６による撮像作業は、
微生物培養前および培養後に行う事が望ましい。これ
は、双方の画像情報を比較する事で、より正確な結果を
得ることが可能となる為である。

【００２４】しかしながら、培養前に撮像作業をするこ
とが困難な場合には、省略することも可能である。撮像
作業により得られた電気信号は、培養層の表面情報を含
んだ画像情報ファイルとして、半導体記憶装置、磁気記
録装置、光磁気記録装置などを用いて記録することが出
来る。

【００２５】本発明の検出方法で用いる微生物検出用プ
レートの一例を、図１に示す。

【００２６】図１において、水不透過性支持体１を構成
する支持体としては、水を透過しない透明度の高い樹脂
を用いることが好ましく、具体的にはポリエチレンテレ
フタレート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニルなどの樹脂が挙
げられる。培養層２には、微生物を培養するための栄養
素、検出感度を向上させるための水溶性色素および試料
の水分を吸収しゲルを形成するための成分を用いること
が好ましい。

【００２７】微生物の栄養素としては、例えば、ペプト
ン、リン酸水素二カリウム、ブドウ糖、乳糖、塩化ナト
リウム、塩化カリウム、酵母エキス、肉エキスなどが挙
げられる。

【００２８】また、検出感度を向上させるための色素と
しては、トリアリールメタン系色素又は少なくとも一つ
の酸基を有する色素を用いることが望ましい。

【００２９】酸基の具体例としては、水酸基、カルボキ
シル基、スルホン酸基、リン酸基、スルフィン酸基等が
挙げられる。特に好ましくはスルホン酸基である。水溶
性色素の具体例として、以下に代表的な化合物を挙げる
が、本発明はこれらに限定されるわけではなく、トリア
リールメタン系の色素または少なくとも一つの酸基を有
する色素であれば、同様の効果を奏する。

【００３０】

【化１】

【００３１】

【化２】

【００３２】

【化３】

【００３３】

【化４】

【００３４】色素は、培養中に微生物の体内に吸収蓄積
されることにより、コロニーの検出感度を向上させる働
きを持つ。特に、トリアリールメタン系色素または上記
に示したような、少なくとも一つの酸基を有する色素を
用いた場合に本発明の効果をより奏する点で好ましい。
加えて、試料の水分を吸収し、ゲルを形成するための成
分としては、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グアール
ガム、キサンタンガムまたは、これらの混合物を使用す
ることが出来る。

【００３５】これらの栄養素、色素、ゲル形成成分は、
目的とする微生物に応じていくつかを選択でき、また、
これらを組み合わせて用いることも出来る。

【００３６】本発明の微生物検出方法を実施するにあた
り、微生物が存在するサンプルが液体である場合には、
微生物検出用プレートに直接サンプルを添加する事によ
り、培養を開始する事が出来る。

【００３７】また、固体表面に存在する微生物をサンプ
ルとする場合には、微生物をその固体表面からはがす、
もしくは、湿らせた綿棒などにより拭き取った後、液体
に懸濁して、液体サンプルと同様に培養する事が可能で
ある。加えて、空気中の微生物を検査対象とする場合、
エアーサンプラーを用いて強制的に回収する方法や、培
養層を水などで適度に湿らせた後、一定時間放置する事
により落下菌を捕捉し、そのまま培養することも可能で
ある。

【００３８】培養は、目的とする微生物の増殖に好都合
な温度、湿度等の条件を設定して行う事が出来る。培養
に用いる装置は、例えば一般に用いられているような密
閉式の恒温槽やプログラム機能付きの恒温槽、炭酸ガス
濃度調整機能付きの恒温槽など、目的とする微生物が増
殖するための条件が実現できる装置であれば、どのよう
なタイプのものでも使用可能である。

【００３９】また、本発明の微生物の検出方法において
は、微生物が増殖することにより形成されるコロニーの
大きさが、肉眼で判別可能な大きさよりも小さな０．０
１ｍｍ〜０．１ｍｍに達した時点で判定可能となるた
め、培養時間は、対象となる微生物１個が５，０００〜
１０，０００個程度に増殖するまでの時間となる。実際
の培養時間は、微生物種や培養条件（環境）によって異
なるので、対象とする微生物種により適宜設定を行うこ
とが望ましい。例えば、増殖速度の速い大腸菌や乳酸菌
の場合、従来のプレート法では、肉眼でコロニーを確認
出来るまでに約２４〜４８時間を要していたのに対し、
本発明の微生物の検出方法を用いることにより３〜７時
間でコロニーの検出が可能になる。７時間以上培養した
後に検出操作を行うことも可能ではあるが、菌数が多い
場合には、長時間の培養によりコロニーとコロニーが接
触したり、接着したりするため、正確なコロニーの数を
計測することが出来なくなる。その為に、適度にコロニ
ーが成長した時点での計測が望ましい。

【００４０】培養具上で形成された微生物のコロニーに
光を照射し、透過光を電気信号に変換後、得られた画像
情報からコロニーを検出する方法としては、公知の方法
が用いられる。

【００４１】例えば、得られた電気信号のうち、微生物
のコロニーを検出するための予め決められた特定の波長
の色を識別し、所定の閾値で各画素ごとに２値化を行
う。そして、必要なら標識部分を強調して、画像を表示
する。特定の波長の色及び所定の閾値は微生物を着色す
る色素によって決まる色や着色の度合いで決めればよ
い。

【００４２】また、得られた２値画像から菌のコロニー
数を数えるためにラベリング処理をおこなっても良い。
例えば画像を走査し、番号が割り当てられていない、値
が１の画素（１−画素）を見つけ、新たな番号を割り当
てる。次にこの画像の８近傍にある１−画素に同じ番号
をつける。さらにそれらの８近傍にある１−画素にも同
じ番号を付ける。この処理を繰り返して、８近傍内に新
しく番号を付ける画素がなくなったら、１つの連結成分
全てつまり１つのコロニーに同じ番号が付けられたこと
になる。再び走査を続け、番号のついていない１−画素
を見つけたら、新しい番号をつけ、上と同じ処理を施
す。こうして全てのコロニーに順次番号を付すことによ
りその数を検出する。

【００４３】また、本発明の微生物の検出方法におい
て、培養後および培養前の画像情報を比較し、培養後の
情報から培養前の情報を減ずることにより、培養中に生
じる微生物由来でないノイズを取り除く事が可能とな
る。このノイズとは、培養作業中前後に操作の過程で意
図せず付いてしまった傷や汚れ等、微生物に由来しない
培養層上の像を意味する。

【００４４】本発明の請求項６に示した微生物検出シス
テムにおいて、図２の撮像装置７は、微生物検出用プレ
ートの設置台に、５〜１０枚程度の微生物検出用プレー
トが設置可能である。設置された微生物検出用プレート
は一枚毎に読み取り作業が行なわれ、一枚の読み取りが
終了すると自動的に次の微生物検出用プレートを搬送
し、該微生物検出用プレートの撮像を行うことが可能で
ある。

【００４５】微生物検出用プレート５上で微生物の生体
活動による発色反応を行う場合には、光源３と微生物検
出用プレート５の間に、ある特定波長の光だけを透過す
るフィルター４を設置することにより、発色反応をより
効果的に検出することが可能となる。フィルター４によ
る色相の変化は、画像処理段階で元の色相に戻すことも
可能であり、実際の画像に近い色調を得ることが可能で
ある。

【００４６】本発明の微生物検出システムで用いるＣＣ
Ｄラインセンサーの光学解像度は、２，０００ｄｐｉ以
上でなければならない。これ以下の解像度では、微小な
コロニーの検出が困難になり、感度が得られないためで
ある。光学解像度は、縦方向、横方向ともに２，０００
ｄｐｉ以上であることが望ましいが、どちらか一方が
２，０００ｄｐｉ以上であれば、他方は１，０００ｄｐ
ｉ程度でもコロニーの検出は可能である。この場合、縦
横の解像度の積は最低でも２，０００，０００ｄｐｉ²
以上であることが必要である。縦方向、横方向ともに
２，４００ｄｐｉ以上であれば更に望ましい。

【００４７】従来の肉眼による観察やＣＣＤカメラを使
ったコロニーカウンターを用いる方法では、コロニーの
直径が０．５ｍｍ〜１ｍｍ程度に成長するまで培養しな
ければ、コロニー数を計測することは困難であったが、
本発明においては、ＣＣＤラインセンサーを使用し、培
地面に対し縦もしくは横方向に２，０００ｄｐｉ以上の
光学解像度で撮像することにより、得られる画像の解像
度を飛躍的に向上させることが可能になった。

【００４８】ＣＣＤラインセンサーは、現時点において
も解像度の高い製品が安価に手に入れられる。また、そ
れだけでなく、技術的にも日々進歩しているため、今後
更に解像度を上げることが出来るようになると期待され
る。加えて、微生物を特徴的に染色する色素を用いるこ
とにより、肉眼ではコロニーを確認できない程度の培養
時間でも、目的とする微生物のコロニーを検出すること
が可能になった。

【００４９】

【実施例】以下に実施例を示し本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の実施態様はこれらに限定されるもの
ではない。

【００５０】実施例１水不透過性支持体として厚さ０．１ｍｍのポリエチレン
テレフタレート（以下ＰＥＴと略）を用いた。ＰＥＴ上
にペプトン、乳糖、酵母エキス、ゼラチン、寒天および
クリスタルバイオレットの混合水溶液を塗布し、１００
℃で乾燥することにより、培養層を形成し、これを微生
物検出用プレートとして用いた。

【００５１】菌株としては大腸菌を使用した。試料溶液
中の大腸菌数が１，０００、２，０００、４，０００個
／ｍｌとなるように希釈し、大腸菌の希釈系列を作製し
た。この試料液を、上記で作製した微生物検出用プレー
ト上に０．１ｍｌ散布し、湿度を一定に保つように調節
した３７℃の培養器中で５時間培養した。

【００５２】培養終了後、微生物検出用プレートを取り
出して微生物検出装置にセットし、フィルムスキャナー
の光学解像度を２，４００ｄｐｉにして微生物検出具の
撮像を行った。得られた画像を元に、電子計算機上でコ
ロニー数を計測した。その結果を実施例２および比較例
１の結果と共に表１に示した。

【００５３】実施例２水不透過性支持体には厚さ０．１ｍｍのポリエチレンフ
ィルム（以下ＰＥＴフィルムという）を用いた。ＰＥＴ
上にペプトン、乳糖、酵母エキス、ゼラチン、寒天およ
びＤ−１の混合水溶液を塗布し、１００℃で乾燥するこ
とにより、培養層を形成し、これを微生物検出具として
用いた。

【００５４】実施例１で作製した大腸菌の試料液を、上
記で作製した微生物検出用プレート上に０．１ｍｌ散布
し、湿度を一定に保つように調節した３７℃の培養器中
で６時間培養した。

【００５５】培養終了後、微生物検出用プレートを取り
出して微生物検出装置にセットし、フィルムスキャナー
の光学解像度を２，４００ｄｐｉにして微生物検出用プ
レートの撮像を行った。得られた画像を元に、電子計算
機上でコロニー数を計測した。その結果を実施例１およ
び比較例１の結果と共に表１に示した。

【００５６】比較例１従来の微生物コロニー検出法であるプレート法を用い、
実施例１にて作製した大腸菌の希釈系列にて菌数の検証
を行った。

【００５７】ペトリ皿に準備した標準寒天培地上に、大
腸菌の希釈系列液を０．５ｍｌを混釈して比較用の試料
を作製した。この試料を３７℃の培養器中で４８時間培
養し、発生したコロニー数を計測した。その結果を実施
例１、２の結果と共に表１に示した。

【００５８】

【表１】

【００５９】表１から明らかなように、本発明の微生物
検出方法は、従来のプレート法に較べ、培養時間を従来
の１／５〜１／１０程度に短縮させ、しかも正確にコロ
ニー数を計測できることがわかる。

【００６０】実施例３水不透過性支持体として厚さ０．１ｍｍのＰＥＴを用い
た。ＰＥＴ上にペプトン、乳糖、酵母エキス、ゼラチ
ン、寒天およびクリスタルバイオレットの混合水溶液を
塗布し、１００℃で乾燥することにより、培養層を形成
し、これを微生物検出用プレートとして用いた。

【００６１】実施例１で作製した大腸菌の試料液を、上
記で作製した微生物検出用プレート上に０．１ｍｌ散布
し、湿度を一定に保つように調節した３７℃の培養器中
で培養した。

【００６２】培養開始から３、４、５、６、７、８時間
経過した時点で微生物検出用プレートを取り出して微生
物検出装置にセットし、フィルムスキャナーの光学解像
度を２，４００ｄｐｉにして微生物検出用プレートの撮
像を行った。得られた画像を元に、電子計算機上でコロ
ニー数を計測した。その結果を比較例２の結果と共に表
２に示した。

【００６３】比較例２水不透過性支持体として厚さ０．１ｍｍＰＥＴを用い
た。ＰＥＴ上にペプトン、乳糖、酵母エキス、ゼラチン
および寒天の混合水溶液を塗布し、１００℃で乾燥する
ことにより、培地層を形成し、これを微生物検出具とし
て用いた。

【００６４】実施例１で作製した大腸菌の試料液を、上
記で作製した微生物検出用プレート上に０．１ｍｌ散布
し、湿度を一定に保つように調節した３７℃の培養器中
で培養した。

【００６５】培養開始から３、４、５、６、７、８時間
経過した時点で微生物検出用プレートを取り出して微生
物検出装置にセットし、フィルムスキャナーの光学解像
度を２，４００ｄｐｉにして微生物検出用プレートの撮
像を行った。得られた画像を元に、電子計算機上でコロ
ニー数を計測した。その結果を実施例３の結果と共に表
２に示した。

【００６６】

【表２】

【００６７】表２から明らかなように、色素を加えるこ
とにより、加えなかった場合よりも素早く対象となる微
生物のコロニーを検出できるようになることがわかる。

【００６８】また、長時間培養した場合には、コロニー
同志がくっつき、正確な数が測定できなくなり、培養時
間は３〜７時間が適していた。

【００６９】実施例４フィルムスキャナの光学解像度を縦方向、横方向ともに
５００ｄｐｉ、１，０００ｄｐｉ、１，５００ｄｐｉ、
２，０００ｄｐｉ、２，５００ｄｐｉにセットして、微
小なコロニーが撮像できる解像度の限界を調査した。コ
ロニーのサンプルとしては、実施例１で５時間培養した
後の微生物検出プレートを用いた。その結果を表３に示
した。

【００７０】

【表３】

【００７１】表３から明らかなように、縦方向、横方向
のいずれかが１，０００ｄｐｉ以上であり、縦横の光学
解像度の積が２，０００，０００ｄｐｉ²以上であれ
ば、５時間培養後のコロニーを検出することが可能であ
ることが分かった。

【００７２】

【発明の効果】実施例で実証した如く、本発明による微
生物検出方法および微生物検出システムは微生物の検出
検査を安価で迅速に、しかもバラツキなくコロニー数を
測定でき優れた効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の微生物検出用プレートの一例を示す断
面図である。

【図２】本発明の微生物検出システムの一例を示す模式
図である。

【符号の説明】

１水不透過性支持体２培養層３光源４フィルター５微生物検出用プレート６固体撮像素子７撮像装置８電子計算機９表示装置１０入力装置

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4B029 AA07 BB02 FA09 4B063 QA01 QQ06 QR66 QR69 QR90 QS39 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物を支持体上に形成させた着色培地
を用いて培養し、フィルムスキャナーで該微生物の形成
するコロニーを検出することを特徴とする微生物検出方
法。
【請求項２】フィルムスキャナーの光学解像度の主走
査方向と副走査方向の少なくともいずれか一方が２，０
００ｄｐｉ以上であることを特徴とする請求項１に記載
の微生物検出方法。
【請求項３】着色培地が水溶性の色素で着色されてい
ることを特徴とする請求項１または２に記載の微生物検
出方法。
【請求項４】前記水溶性の色素がトリアリールメタン
系色素であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１
項に記載の微生物検出方法。
【請求項５】前記水溶性の色素が少なくとも一つの酸
基を有する色素であることを特徴とする請求項１〜３の
何れか１項に記載の微生物検出方法。
【請求項６】微生物を着色培地を用いて培養し、主走
査方向と副走査方向の少なくともいずれか一方の解像度
が２，０００ｄｐｉ以上のフィルムスキャナーで撮像し
た後、得られたデータをコンピュータで処理し、コロニ
ー数を計測することを特徴とする微生物検出システム。
【請求項７】大腸菌または乳酸菌の培養に要する時間
が３〜７時間であることを特徴とする請求項６に記載の
微生物検出システム。
【請求項８】主走査方向と副走査方向の光学解像度の
積が、２，０００，０００ｄｐｉ²以上であることを特
徴とする請求項６に記載の微生物検出システム。