JPH08501447A - 突然変異ズブチリシン様セリンプロテアーゼ - Google Patents
突然変異ズブチリシン様セリンプロテアーゼInfo
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- JPH08501447A JPH08501447A JP6507790A JP50779094A JPH08501447A JP H08501447 A JPH08501447 A JP H08501447A JP 6507790 A JP6507790 A JP 6507790A JP 50779094 A JP50779094 A JP 50779094A JP H08501447 A JPH08501447 A JP H08501447A
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Abstract
(57)【要約】
野生型の構造遺伝子の突然変異及びその突然変異構造遺伝子の産生株における発現によって産生されるズブチリシン様セリンプロテアーゼでは、酵素の温度安定性が増大している。これは、BPN’系で数えてプロテアーゼの194位にグルタミン酸残基を導入し、要すればプロリンを188位に導入することによって、達成される。
Description
【発明の詳細な説明】
突然変異ズブチリシン様セリンプロテアーゼ
本発明は、改変されたアミノ酸配列を有する新規な酵素を導くズブチリシンプ
ロテアーゼの構造遺伝子の突然変異に関する。
ズブチリシンプロテアーゼは天然にて広範に存在し、多くの工業的利用、例え
ば洗剤用酵素として広く使用されている。これらの利用の多くでは、酵素の安定
性が改善されていることが望ましく、これは具体的に利用する際に要求される。
これに関連する考察の概要はJ.A.Wells及びD.A.Estellに提示されている[TIBS
(Trends in Biochemical Sciences),13,291頁(1988)参照]。ズブチリシン
様セリンプロテアーゼの実質的にすべての知られている配列及び構造を引用して
いる別の考察記事はR.R.Siezenによって開示された[Protein Engineering,4巻
,(7),719頁-737頁(1991)]。高温度における不可逆的な不活化に抵抗するプ
ロテアーゼの安定性は、洗浄剤中に使用する場合に特に重要である。しかし、J.
A.Wellsらによる上記の考察記事に示されているように、熱安定性を改善するた
めに採用される工程に対し、信頼の置ける理論展開を行うことはできていない。
WellSらは、ジスルフィド架橋の導入を記載しているが、これは問題を解決しな
いと強調されている。従って、熱安定性の改善を行うためには、当業者は実験に
大きく依存している。
国際特許出願WO 87/5050は、クローン化ズブチリシン突然変異遺伝
子を特許請求しており、これは比較的高い温度において対応する野生型よりも活
性が良好なズブチリシンプロテアーゼをコードしていると言われる。この引用国
際出願は突然変異のために幾つかの提案をしている。即ち、特に218位におい
て、アスパラギンを別のアミノ酸と置き換えることが記載されている。また、1
88位においてセリンをプロリンと置き換えることが提案されている。しかし、
この国際出願には、プロリン置換又はここに記載されている多くの別の手法のい
ずれによって、このセリンが熱安定性増大の成功に実際上寄与できたのかを示す
記載は存在しない。従って、S188P突然変異は、この引用国際出願を経由し
た欧州特許(EP260299)ではもはや特許請求されていない。
国際特許出願WO 89/6270もまた、個々のアミノ酸の置換によってズ
ブチリシンプロテアーゼの性質を改善させることが提案されている。この特許出
願では、およそ275個の総アミノ酸を含有するその分子のおよそ60個のアミ
ノ酸に対する変更が提案されている。1つの提案によれば、194位に改変を付
与する。この引用出願に記載されている提案に加え、ズブチリシンプロテアーゼ
の個々のアミノ酸を改変するための別の提案が次の出願に記載されている:EP
130 756、EP 246 678、EP 247 667、及びEP
251 446。
これらの先行技術のバックグラウンドに反して本発明の解決すべき課題は、ズ
ブチリシンプロテアーゼのアミノ酸配列を、熱安定性が増大するように改変する
方法の発見にある。
従って、本発明は、野生型株の構造遺伝子を突然変異させ、産生株内にてその
突然変異させた構造遺伝子を発現させることによって調製されるズブチリシン様
セリンプロテアーゼであって、グルタミン酸残基がプロテアーゼの194位(B
PN’−カウンティングによる.以下同じ)に存在し、またプロリン残基が18
8位に存在してもよいことを特徴とする該プロテアーゼ、に関する。
本発明に従って突然変異させるプロテアーゼ内での置換すべき位置の番号付け
は常に、BPN’−プロテアーゼに基づいている。他のズブチリシン型のセリン
プロテアーゼについて番号付けを行うには、当業者は、最大の一致が得られるよ
うにこのプロテアーゼのアミノ酸配列をBPN’−プロテアーゼの番号付け配列
下に置くべきである。こうするには、単一アミノ酸又は幾つかのアミノ酸の削除
又は挿入が個々のケースで必要となる場合があるであろう。番号付けの形態は先
に引用したWO 89/6279に記載されている。
本発明の突然変異プロテアーゼは多くのズブチリシン様セリンプロテアーゼか
ら、例えば最初に引用した考察記事に記載されている酵素から又は既に突然変異
された酵素からでさえも、調製することができる。共通するズブチリシン様セリ
ンプロテアーゼは例えば、ズブチリシンBPN’−、ズブチリシン・カールスベ
ルグ(subtilisin Carlsberg)であり、又はバシラス・レンタス(Bacillus len
tus)由来のズブチリシンでさえもある。突然変異された新規な酵素を産生する
クローンはその酵素自体からは調製されず、その構造遺伝子が突然変異を受け、
それを産生株に再挿入することによって構造遺伝子をコードする酵素から調製さ
れることは、当業者にとって明らかである。
特に好ましい本発明の態様は、194位にアラニンアミノ酸を担持するプロテ
アーゼ(すべての位置はBPN’−カウンティングに対応する)から始まる。本
発明では、次にこのアミノ酸をグルタミン酸で置き換える。本発明の別の態様は
、194位にアラニンアミノ酸を、188位にセリンアミノ酸を担持しているプ
ロテアーゼから始まり、これら2つのアミノ酸をそれぞれA194E及びS18
8P突然変異する。このタイプの突然変異に適当な出発物質は例えば、ズブチリ
シン・カールスベルグ型のプロテアーゼ及びその変異体である。これらの変異体
のうち、N158S及びS161N突然変異(BPN’−カウンティング)を有
するズブチリシン・カールスベルグ変異体が特に好ましい。このようなプロテア
ーゼの構造遺伝子は欧州特許出願EP 214 435に記載されている。
本発明の別の好ましい態様はバシラス・レンタス由来のプロテアーゼから始ま
る。WO 89/6279に記載されているプロテアーゼに加え、WO 91/
02792のFig.29に記載されているプロテアーゼも特に適している。WO
91/02792に使用されているカウンティング系において182位のアミ
ノ酸セリンは、BPN’−カウンティング系では188セリンに相当する。この
違いは、本明細書に記載しているタンパク質がBPN’に関連する幾つかの欠失
を含有していることに因る。
特に好ましい本発明の態様の1つでは、ズブチリシンBPN’−カウンティン
グ系による以下のアミノ酸配列を有するプロテアーゼ突然変異体を調製する:1
88P−189F−190S−191S−192V−193G−194E−19
5E−196L−197E−198V−199M。特に好ましい本発明の態様で
は、この配列をWO 91/02792に記載されているプロテアーゼの18
1位及び194位間に挿入する。
本発明の新規なプロテアーゼ突然変異体は安定性が改善されている。即ち、自
己タンパク質分解性の分解の半減期が広い温度範囲にて長くなっており、従って
熱安定性及び保存時の安定性の両者が増大している。半減期の増大は非生理学的
条件下、即ち例えば錯化剤の存在下でも達成される。本発明のプロテアーゼは多
くの方法によって調製することができる。無作為インビトロ突然変異誘発(RI
M)及び指向性突然変異誘発の方法が好ましい。この方法により調製される改変
構造遺伝子は既知の発現系による通常の方法によって発現、調製することができ
る(例えば、産生株での発現ではWO 91/02792、及び上記の出願WO
89/06279、EP260 299、EP130 756、EP 246
678、EP 247 667、及びEP 251 446)。
本発明の突然変異体がプロテアーゼ安定性の増大を示すのは、洗浄剤中に使用
する場合だけにとどまらない:本発明の突然変異体は、反応媒質を付加的に冷却
することが不要な精製段階にて工業的に調製することができる。
実施例実施例1 1.無作為インビトロ突然変異誘発
欧州特許出願EP 214 435の構造遺伝子及びそこに言及されている発
現ベクターpC51を出発物質として使用した。まず始めは、pC51の遺伝子
配列の597位におけるTアフターG変換(T after G exchange)によるアミノ
酸変換を生じさせない指向性突然変異誘発によって、制限部位Nar1を含有させ
、この配列を入手した。この新しいプラスミドをpAS1と呼ぶ。597位はB
PN’−カウンティングによれば200位のアミノ酸アラニンに相当する。pA
S1をNar1及びPst1で制限切断すれば、その分子の弱いカルシウム結合部位
をコードするズブチリシン配列のその部分を含有する142bp長の遺伝子断片
が得られる。この2本鎖遺伝子断片は合成オリゴヌクレオチドからインビトロに
おいて作製するが、これは遺伝子カセットとして知られている。
より安定であるS188P、A194Eプロテアーゼにおける突然変異オリゴ
ヌクレオチドIIIの領域内の遺伝子配列を示す。常法に従い、ヌクレオチド配列
は、遺伝子の5’−3’方向で示す。元の野生型ヌクレオチドは観察された各変
換のヌクレオチド配列の上に示す。オリゴヌクレオチドの合成には、Doped(=
不純物含有)ホスホルアミディット溶液(phosphoramidit solutions)を使用し
た。より安定なプロテアーゼは上方の鎖のオリゴヌクレオチドIIIの分子に戻る
(第1図)。第1図はオリゴヌクレオチドに分割される合成カセットを示してい
る。突然変異誘発性オリゴヌクレオチドIIIには印を付けている。アミノ酸配列
を一文字コードで示し、選択された位置を番号付けしている。オリゴヌクレオチ
ドIIIの外側の突然変異部位では、元の野生型ヌクレオチドを変換の上下に示し
た。
オリゴヌクレオチド分子IIIを合成する際、4つすべてのホスホルアミディッ
ト溶液は不純物として他の3つのホスホルアミディットを含有している。溶液中
のホスホルアミディット不純物の濃度は野生型ヌクレオチド濃度の2%であった
。この不純物は、合成分子1個当たりに平均1から2のヌクレオチド交換を、オ
リゴヌクレオチドIII配列の任意の位置に挿入するのに適している。他のオリゴ
ヌクレオチド(I、II、IV、V、VI)はすべて、野生型配列を用いて大量に合成
した。指向性ヌクレオチド交換を幾つかの位置に挿入し、それによりアミノ酸配
列は改変させないが、適当な制限部位が挿入されるようにした。カセットを複製
した後では、この制限部位は以下のクローニング工程にてレポーター部位として
役立つ。第1図にて実際に合成した配列の上下に野生型配列のヌクレオチドを示
す。カセット断片の上下の鎖を、野生型配列を有するオリゴヌクレオチドから作
製し、得られた突然変異オリゴヌクレオチドとその鎖とをハイブリダイズした。
80pmoles/オリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションに使用した。生成し
た合成断片
をPst1及びNar1で切断し、マルチマーをモノマーに変換した。遊離のオリゴ
ヌクレオチドをゲル溶離により合成カセット断片から取り出した。溶出したカセ
ット断片0.05μgをPst1、Nar1、Sma1切断し脱リン酸化し精製したp
UC19ベクターにクローンした。大腸菌SL−1を全連結産物で形質転換し、
4つの250ml培養液中にて形質転換体を増幅した。上方の突然変異鎖の複製
産物が50%であり、下方の野生型鎖の複製産物が50%であるプラスミドを、
その増幅大腸菌培養物から調製した。プラスミド調製物40μgをXho1、Pst
1及びNar1で切断し、ゲル電気泳動によって突然変異増幅カセット断片を分取
した。この処理により野生型断片を切断したため、溶出液中には野生型断片がも
はや存在していない。溶出した突然変異カセット断片0.08μgを発現ベクタ
ーpAS1(1.7μg)にクローンし、それを0.25μg/バッチ試料の枯
草菌(バシラス・ズブチリス(Bacillus substilis))株EB104に形質転換
した。この株はゲノム及びアルカリプロテアーゼを欠いている。これはプラスミ
ドコード化酵素変異体のみを発現する[Doiら(1986),Trends in Biotechnolo
gy 4,232-235頁]。この方法では、バッチ1つ当たり全体で25,000のクロ
ーンが調製された。これにより生成された突然変異バンクをRIM2と呼ぶ。
安定化されたプロテアーゼ変異体を熱安定性の増大、即ち自己タンパク質分解
安定性の増大について及び構造安定性の増大について、温度勾配ゲル電気泳動に
よって試験し、この突然変異バンクをスクリーニングした。WO 89/062
79、24頁に記載の方法も適用可能である。
配列決定を容易に行うため、安定化されたプロテアーゼ変異体遺伝子のPst1
−Nar1断片を大腸菌ベクターpUC19にクローンした。熱安定性が増大して
いるプロテアーゼを発現するクローン14個がこの突然変異バンクから選択され
た。
RIM2バンクのバシラスクローンから配列決定すべきプラスミド2μgを典
型的には調製し、Pst1及びNar1で切断した。再クローンするカセット断片を
切断した。カセット断片0.006μgを大腸菌ベクターpUC19(0.05
5μg)中で連結し、得られた連結物を大腸菌XL−1に形質転換した。形質転
換体を増幅し、培養物4ml由来のクローンのプラスミドを調製した。これらの
プラスミドを通常の配列決定反応に使用し、全Pst1−Nar1カセットを配列決
定した。A194E及びS188P交換が観察された。実施例1は、A194E
、S188Pクローンのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示している。A1
94E交換は熱安定性の増大に依然として寄与している。実施例2
関連するズブチリシン遺伝子の対応する位置に安定化のためのグルタメート残
基を挿入し、そして請求項3に従ってその配列を挿入するためには、指向性突然
変異の種々の方法が利用可能である。高い効率を得るために好ましい方法は、We
llsら,Gene 34,315-323(1985)に記載されている実施例1に類似のカセット突
然変異誘発方法である。突然変異すべき遺伝子断片であってその末端にクローニ
ングに適した制限部位を有しているものを合成オリゴヌクレオチドからインビト
ロにて作製する。指向性突然変異誘発を行う場合、必要なヌクレオチド交換をオ
リゴヌクレオチド合成の際に挿入する。上方の鎖を形成するオリゴヌクレオチド
に交換を組み入れる毎に、下方の鎖にも対応する相補的な交換を挿入し、2本鎖
断片を形成させるハイブリダイゼーション後にミス対合が生じないようにする。
同じ制限酵素で切断した標的ベクターのターミナル制限部位に合成カセットを
クローンした。切断した標的ベクターを、切断した野生型遺伝子断片からゲル溶
離により分離した。弱いカルシウム結合部位の全領域を変換する実施例1のPst
I−Nar1カセットを指向性突然変異誘発に使用すれば、配列:188P−18
9F−190S−191S−192V−193G−194E−195E−196
L−197E−198V−199Mを国際特許出願WO 91/02792のプ
ロテアーゼの遺伝子内に挿入することができる。次の交換を行わなければならな
い:Q191S、Y192V、G195E、D197E、I198V、V199
M。同時に、安定化するための交換A194E及びS188P交換を挿入する。
この突然変異誘発は指向性であるので、合成Pst1−Nar1断片はバシラスベク
ターに直接に(即ち、無作為突然変異に必要な大腸菌での増幅を行うことなく)
クローンし、突然変異を挿入し、適当なバシラス発現株に形質転換することがで
きる。プロテアーゼ突然変異体の熱安定性の測定 1.方法
垂直温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)を適用した。この方法は、試料の分画
方向が垂直である恒温平板(thermostatic plate)によって温度勾配をゲルに適
用することを特徴としている。厚さ0.8mmの10%ポリアクリルアミドゲル
(20cm×20cm)をゲルボンド・フィルム(Gelbond film)上でポリマー
化し、テフロン被覆アルミニウムの恒温平板に適用する。次いで、その平板の片
面を冷却し、他方の面を、冷却可能な水サーモスタット[Julabo]によって加熱
し、平板の全幅にわたって一次温度勾配を作製する。温度勾配が垂直になってい
る13cm長、0.3cm幅の適用ポケットに試料を導入した。最初は均一な温
度25℃で90分の後、温度勾配を適用した(コーナー温度は適用に応じて選択
するが、80℃は越えない)。A194E交換によって安定性を示すTGGEの
コーナー温度は50℃及び70℃である。温度勾配を適用し、350V及び限定
電流強度110mAで30分間、分画を起こす。次いで、温度誘発分子コンホメ
ーションに応じて、ゲルから試料を各時点で取り出す。0.025M KOH/
酢酸、pH5.0を標準ゲル及び電極緩衝液として使用した。さらに、0.1m
M CaCl2をゲル及び電極緩衝液中に使用した。
2つの適用ポケット(約7cmの距離で離れている)を垂直TGGEにて、2つ
の試料(例えば、野生型及び変異型)を直接比較するのに使用した。活性及び銀
着色による電気泳動の後にプロテアーゼのコンホメーションが確認された。銀着
色はBlumら(1987)に従って行い、活性着色は、0.2μg/mlα−ナフチル・
アセテート、0.5μg/mlファストーレッド及び0.1Mリン酸カリウム緩衝
液、pH7.5中にてゲルを振盪させて行った。天然プロテアーゼのコンホメー
ションのエステル分解活性は赤色の沈殿物として視覚化される。活性な試料は、
加熱下の分子の再折りたたみの際に起こる自己タンパク質分解反応の結果として
、変
性されたコンホメーションを示さない。自己タンパク質分解温度までは、ゲル内
には天然及び活性なコンホメーションしか検出することができない。1mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオライド中でインキュベートすることによりプロテア
ーゼを阻害した後では、天然のコンホメーションから変性コンホメーションまで
の構造遷移状態が確認できるのみである。恒温平板にPt100精密レジスター
を適用し、温度勾配の動向を再測定した。
既述の方法により、EP 214 435のズブチリシン・カールスベルグ変
異体を酵素のS188P突然変異と、並びに酵素のS188P及びA194E突
然変異と比較した。これら2つの突然変異体は指向性突然変異誘発又は無作為イ
ンビトロ突然変異誘発によって調製することができる。一般に知られている方法
によって構造遺伝子を発現ベクターにクローンし、プロテアーゼ不含の一般に利
用できる株にて発現させた。クローンしたプロテアーゼ不含株の培養物を使用し
、発酵24時間後に、培養上清20mlを回収し、遠心した。温度勾配ゲル電気泳
動のため、セントリコン−10濾過チューブ(Centricon-10 filtration tubes
)[製造元:アミコン(Amicon)]によりプロテアーゼ当たり培養上清(全8ml
)を300μlにまで遠心し、次いで0.1mM CaCl2溶液と混合し、セン
トリコン−10チューブで200μlにまで再遠心した。この最後の工程は試料
の塩内容物を減少させるために必須の透析工程であり、減少させるのは、その時
にだけ試料をゲル電気泳動にかけることができるからである。透析試料は数時間
だけ安定であるので、透析工程は、電気泳動の直前に行う。透析試料300μl
を電極緩衝液(上述)300μlで希釈し、TGGEによって分析した。
温度勾配ゲル電気泳動により以下の結果が得られた:
天然コンホメーションの自己タンパク質分解的分解の確立は、ズブチリシン・
カールスベルグ野生型(変異体N158S、 S161N)及びS188P突然
変異のみを含有するプロテアーゼについては同じ温度(60.5℃)で始まり、
他方S188P、A194E突然変異の分解温度はこれよりも1.5℃高かった
。
註: 絶対分解温度の検定は、既述したTGGE溶液状態についてのみ適用する
(即ち、pH5及び0.1mM塩化カルシウム)。分解温度を以下の第1表に示
す。
配列表
(1) 一般的情報
(i) 特許出願人
(A)名称:コグニス・ゲゼルシャフト・フュア・ビオー・ウント・
ウムヴェルトテヒノロギー・ミット・ベシュレンクテル・
ハフツング
(B)通り:マルバッハー・シュトラアセ114番
(C)町:デュッセルドルフ
(E)国:ドイツ連邦共和国
(F)郵便番号:40597
(ii) 発明の名称:突然変異ズブチリシン様セリンプロテアーゼ
(iii) 配列の数:3
(iv) コンピューター解読書式
(A)データ・キャリア:フロッピーデイスク
(B)コンピューター:IBM PC適合
(C)オペレーティング・システム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウエア:パテントイン・リリース#1.0,バージョン#1.
25(EPA)
(vi) 本出願のデータ:
出願番号:PCT/EP93/02492
(2) 配列番号1の情報:
(i) 配列の特徴
(A)長さ:142塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii) 配列の種類:DNS(genomic)
(iii) ハイポセチカル:No
(xi) 配列:配列番号1:
(2) 配列番号2の情報:
(i) 配列の特徴
(A) 長さ:148塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:二本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii) 配列の種類:DNS(genomic) (iii) ハイポセチカル:No
(xi) 配列:配列番号2:
(2) 配列番号3の情報:
(i) 配列の特徴
(A) 長さ:39塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:不明
(D) トポロジー:直鎖状
(ii) 配列の種類:DNS
(iii) ハイポセチカル:No
(xi) 配列:配列番号3:
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 カンカ,スザンネ
ドイツ連邦共和国デー―40589デュッセル
ドルフ、ボンナーシュトラアセ95番
(72)発明者 マオラァ,カール−ハインツ
ドイツ連邦共和国デー―40699エアクース、
デヘェンシュトラアセ5番
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.野生型株の構造遺伝子の突然変異、及びその突然変異構造遺伝子の産生株 における発現によって調製されるズブチリシン様セリンプロテアーゼであって、 BPN’−カウンティングによれば、該プロテアーゼの194位にグルタミン酸 残基が存在し、188位にプロリン残基が存在することがある該プロテアーゼ。 2.A194E突然変異を含有し、S188P突然変異も一緒に含有すること がある、請求項1に記載のセリンプロテアーゼ。 3.構造要素:188P−189F−190S−191S−192V−193 G−194E−195E−196L−197E−198V−199Mを含有する 、請求項1又は2に記載のセリンプロテアーゼ。 4.他の残基が、ズブチリシン・カールスベルグ又はズブチリシン・カールス ベルグのN158S及びS161N変異体と同一である請求項1から3までのい ずれかに記載のセリンプロテアーゼ。 5.他の残基が、アルカリ性バシラス・レンタスプロテアーゼと対応している 、請求項1から3までのいずれかに記載のセリンプロテアーゼ。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE4231726.6 | 1992-09-23 | ||
DE19924231726 DE4231726A1 (de) | 1992-09-23 | 1992-09-23 | Mutierte subtilisinartige Serinproteasen |
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