JPS61192290A - オリゴおよびポリデオキシリボヌクレオチドの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、クローニングベクター中においてデオキシリ
ボヌクレオシド５′−トリホスフェートの存在下で、一
本鎖ＤＮＡ断片の相補鎖を酵素的に合成することによる
オリゴデオキシリがヌクレオチドおよびポリデオキシリ
ボヌクレオチドの製法に関する。

本発明の合成に使用するベクターおよびアダプターも本
発明の範囲内に含まれる。

〔従来の技術および発明が解決しようとする問題点〕

過去２０年間の有機化学における基本的な研究に関する
限り、特別なヌクレオチド配列を含むオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドの化学合成が顕著な役割を演じてきた（
　Ｋｈｏｒａｎａ　ＨＧ、　１９７９Ｓｃｉｅｎｃｅ　
２０３　、６１４　：　　イタクラにおよびＲｌｇｇｓ
　ＡＤ　、　１９８０　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９　、１
４０１）。

基礎的な研究における重要性に加えて、それらの化合物
は最近、急速に発展している遺伝子工学の分野の生物工
学的用途において不可欠なものになってきた。合成りＮ
Ａ断片の多方面の用途が、試験管内ＤＮＡ組換えに対し
て新しい期待を切り開いた。可能性のある用途としては
、例えば、各種リンキング領域の使用例えば制限リンカ
−およびアダプター、成る遺伝子の同定または単離用の
ハイブリッド形成プローブ、クローン化遺伝子の部位特
異性試験管内ミュータジェネシス （ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　）に適したオリゴデオキシ
リがヌクレオチド等が含まれる。転写および翻訳の調整
において重要な役割を演じるＤＮＡ領域の合成は、形質
発現の点で非常に重要なものである。ＤＮＡ合成の中で
最も多くのことが要求される用途の１つは、成る遺伝子
（これは、与えられた微生物中の成るタンノ々り質の最
適生成用に設計された人工遺伝子または天然遺伝子のど
ちらであってもよい）の化学的全合成である。この用途
が特に重要と々る場合は、成る遺伝子を天然源から単離
するのが困難である場合、あるいは、それによってコー
ド化された情報が、形質発現用に選んだ生物中の所望の
ものと別異の生成物をもたらす場合である。

従って、過去２〜３年間において、ＤＮＡ化学合成技術
の迅速化および簡易化の多くの試みが行われてきたこと
は警ろくに値いしない。これらの試みの主要な目的は、
最適保穫基の選択、共役反応の速度および収量の増加、
精製を必要としない合成中間生成物の利用、ならびに最
終生成物の精製の有効な技術であった。最適保握基の適
用および適当に選択した固体支持体上の共役反応の実施
は、半自動および全自動ＤＮＡシンセサイザーの製造の
可能性を切り開いた。

前記の方法が迅速で有効であるとしても、それらは一般
に、使用する装置に依存して、せいぜｈ約１００個のヌ
クレオチドまでを含む一本鎖ＤＮＡ断片の調製にのみ適
している。更に、この方法で得られるオリゴマーのグロ
セッシング用に開発された物理化学的分離および精製技
術（例えば、ダル電気泳動およびクロマトグラフィー例
えばＨＰＬＣ）は、必ずしも常に生物学的に一様で均質
な最終生成物をもたらすとは限らない。

化学的方法における前記の制限および欠点を解決するだ
めに、化学的方法と酵素的方法との組合せ使用、および
それらとクローニング技術との組合せが提案された。こ
の方法の実質的な簡易化は、合成すべきＤＮＡ断片の一
本鎖だけを化学的に調製し、相補鎖を部分的にまたは全
体的に酵素法によって製造することによって行われる。

この方法は所望のＤＮＡ断片の合成に時間を短縮しない
だけでなく、経済的にもかなり高価なものとなる。なぜ
なら、酵素合成の前駆体であるデオキシクポヌクレオシ
ド５′−トリホスフェートが、化学合成の出発材料より
も４桁〜５桁少ない量で必要となるからである。

化学−酵素の組合せ法の１つは、以下の発見を基礎とし
ている。すなわち、大腸菌（Ｅ　、　ｃｏｉｌ）ＤＮＡ
ポリメラーゼエ（フレノウポリメラーゼ）の大きな断片
は、４種全部のデオキシリ？ヌクレオシド５′−トリホ
スフェートの存在下において部分的二重鎖ＤＮＡ領域を
完全な二重鎖ＤＮＡ領域に変えることができ、従って長
いＤＮＡ鎖は鋳型として作用し、短かいＤＮＡ鎖はプラ
イマーとして作用し、そしてこの過程は５′＋３′方向
に鋳型の長さまで行われる（　Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｔ、
　　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　ＥＦおよびＳａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ
　、　　ｌ　９８２　Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　、　Ｎ、Ｙ、　。

１１３−１１６頁）。この発見を利用して、イタクラ等
（Ｒｏｓｓｉ　ＪＪ　％Ｋｉｅｒｚｅｋ　Ｒ％Ｈｕａｎ
ｇ　Ｔ　。

Ｗａｌｋｅｒ　ＰＡおよびイタクラに、１９８２゜Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５７　、９２２６　）は
２種の比較的長い（３９〜４３マー）オリゴヌクレオチ
ドを化学的に調製した。これは、それらの３′末端にお
いて９〜１０塩基対長の相術領域を含んでいた。

７２塩基対を含む二重鎖断片は、２種の一本鎖オリゴヌ
クレオチドをアニーリングし、そして４種全部のデオキ
シリ？ヌクレオシド５′−トリホスフェートの存在下で
フレノウポリメラーゼによシフイル−イン反応を実施す
ることによって調製された。

同様の操作がＮａｒａｎｇの実験室において（５ｃａｒ
ｐｕｌｌａ　Ｒ８，Ｎａｒａｎｇ　ＳＡおよびＷｕ　Ｒ
。

１９８２　、　Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍｉａｔｒｙ
　１２１　、３５６）、ヒトインシュリンＡ鎖をコード
する人工遺伝子の合成の際に適用された。大きな差異は
、二重鎖のフィル−インに逆転写酵素を使用した点であ
った。

前記の全ての方法で得られる二重鎖ＤＮＡ断片は、続い
てベクター中でクローン化する。各々が別の特異性をも
ち、しかも各々が与えられたベクターを１回だけ開裂す
る２種の制限エンドヌクレアーゼによってクローニング
ベクターを開裂することが好ましいので、クローン化す
べきＤＮＡ領域に、適当な末端部分が提供される。これ
は、二重鎖ＤＮＡの２つの端部に２種の異なる制限リン
カ−を添加すること、および続いて２種の相当する制限
酵素で消化してクローニングに適した２種の付着端部を
得ることによ、って達成することができる（５ｅａｒｐ
ｕｌｌａ　Ｒ８、Ｎａｒａｎｇ　ＳＡおよびＷｕ　Ｒ。

１９８２　、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　　１２１．３５６）。

５ｅａｒｐｕｌｌａ等は配向化挿入に適した７５塩基対
ＤＮＡ断片を得た。より長いＤＮＡ断片を調製しクロー
ン化すべき場合には、以下のような二重鎖ＤＮＡ断片２
本を調製するのが、より簡単でより経済的である。すな
わち、その１本はその５′−末端で制限酵素の一方に相
当する開裂部位を含み、そして他方はその３′−末端で
他方の制限酸素に相当する開裂部位を含んでいる（　Ｒ
ｏａｓｔ　ＪＪ　。

Ｋ１５ｒｚｅｋ　Ｒ、Ｈｕａｎｇ　Ｔ　　、Ｗａｌｋｅ
ｒ　ＰＡおよびイタクラに、　　１９８２　、　Ｊ　、
　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５７゜９２２６　）。次に
、２つのＤＮＡ断片を、相当する制限酵素でそれぞれ開
裂する。これらと適当に開裂シタクローニングベクター
との組合せ、三重連結の実施および適当な大腸菌株への
形質転換により、所望どおりに互いに連結するＤＮＡ断
片２個をクローニングベクターが含有する組換え体が得
られる。

前記の従来公知の方法の欠点は以下のとおりである。

（１）化学的に合成したＤＮＡ断片は、各々、それらの
３′−末端において（９〜１０ヌクレオチドの）アニー
リングに必要なオーバーラツプ領域、および制限部位お
よびその制限部位における有効な開裂に必要な更に２〜
４個のヌクレオチド部分を（各合成りＮＡ断片用の更に
８〜１０ヌクレオチドと共に）含むべきである。最終生
成物から見れば、これらの部分の合成は余分なものと考
えることができる。

（２）一本鎖オリゴヌクレオチドおよびフィル−インし
た二重鎖ＤＮＡ断片は両者ともに、クローニング前に精
製すべきである。

〔問題点を解決するだめの手段〕

本発明は、化学的に合成した一本鎖ＤＮＡ断片の相補鎖
を完全に酵素的に調製する新規の方法であって、前記の
欠点を除去した方法に関する。

本発明方法においては、化学的に合成した一本鎖オリゴ
デオキシリがヌクレオチドを、適当に切断したクローニ
ングベクターに直接または適当なアダプターによって連
結する。こうして変形したベクターは、ポリメラーゼに
よって触媒されるフィル−イン反応においてプライマー
・鋳型系として作用し、従って、ベクターに連結した一
本鎖領域は鋳型として働き、そしてアダプターとのみ連
結するかまだは連結していないベクター鎖はプライマー
として働く。従って、相補鎖が完全に酵素的に合成され
る。そして、全プロセスがベクターに連結するので、得
られる二重鎖領域の直接クローニングが可能になる。従
って、本発明は、デオキシリボヌクレオシド５′−トリ
ホスフェートの存在下における一本鎖ＤＮＡ断片の相補
鎖の酵素的合成によるオリゴおよびポリデオキシリボヌ
クレオチドの製法であって、前記の酵素的工程をクロー
ニングベクター中で実施する方法に関する。

本発明方法の好ましい変形の１つにおいては、２つの独
特な制限部位をもつベクターを２つの相当する制限酵素
で開裂し、それぞれ５′−突出末端および３′−突出末
端を得る。化学的に合成しだ一本鎖ＤＮＡ断片であって
、５′−ホスフェート基と開裂ベクターの３′−突出末
端に相補的な３′−末端配列とをもつ断片を、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼによってベクターに直接に連結する〔第１図
参照：嬉１図においてｄＮＴＰは４種全部のデオキシＩ
Ｊ　ｇヌクレオシド５′−トリホスフェートの当モル混
合物である工なお、前記合成一本鎖ＤＮＡ断片の５′−
末端配列は、開裂ベクターの５′−突出末端と相補的で
はかいものとする。前記の連結後においては、直線状４
クターはその両端に５′−突出領域を含んでいる。すな
わち、その一方は開裂によってもたらされたものであり
、他方は３１−突出末端と合成一本鎖ＤＮＡ断片との連
結によってもたらされたものである。

次に、各５７−突出末端を、４ｆｌＪ全部の５７−トリ
ホスフェートの存在下で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノウボリメラーゼ）の大型断片によってフィル−
インする。合成一本鎖ＤＮＡ断片の相補鎖がクローニン
グベクター内で酵素的に合成され、従ってベクターの非
連結鎖はプライマーとして働くものと考えることができ
る。

両末端をフィル−インした（プラント末端）直線状の変
形ベクターをＴ　４　ＤＮＡ　ＩＪガーゼによって環化
する。

続いて、前記の工程によって得た連結混合物によって、
適当に処理したバクテリア細胞（大腸菌）を形質転換す
る。

次に、所望の組換え体を、二重選択によって選択する。

選択マーカーの一方はクローニングベクターの存在に基
づく性質（例えば、ファージベクターの場合のプラーク
形成まだはプラスミドベクターの場合の抗生物質抵抗性
コロニーの形成）であり、他の選択マーカーは、クロー
ン化すべきＤＮＡ配列の導入により、得られた組換え体
中に起きる表現型の性質（例えば、プラーク形成の変形
または抗生物質抵抗性の欠如）である。クローン化すべ
き放射性同位体で標識した一本鎖ＤＮＡ断片がハイブリ
ッド形成プローブとして働く場合には、もう１つの選択
の可能性は、コロニーまだはプラークハイブリッド形成
法である。

合成りＮＡ断片およびその相補鎖の両者を高い確率で含
有する選択されたコロニを、部分的または全体的ＤＮＡ
シークエンシングによって同定する。

多数の組換え体のスクリーニングを同時に行うために、
ジデオキシ鎖末端法を有利に使用することができる（　
Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ　、　Ｎ１ｃｋｌｅｎ　ＳおよびＣｏ
ｕｌａｏｎ　ＡＲ、１９７７、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７４
，５４６３）。

選択したコロニーから公知の方法によって組換え体ベク
ターを単離する（例えば、ＢｉｒｎｂｏｌｍＨＣおよび
Ｄｏｌｙ　Ｊ　、　１９７９　、　ＮｕｅｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ　Ｒａｇ、　７　、１５１３　：　Ｍｅｓｓｉｎ
ｇ　Ｊ。

Ｃｒｅａ　ＲおよびＳｅｅｂｕｒｇ　ＰＨ、１９８１。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ＋ｓ、　９　、３０
９参照）。出発酵素によ）、得られたベクターからクロ
ーン化二重鎖ＤＮＡ領域を開裂することができる。但し
、そのＤＮＡ領域の配列は、その挿入が境界制限部位（
５′−末端の成る与えられたヌクレオチドおよび３′−
末端の５ヌクレオチドの配列）を修復するものであるこ
とが条件となる。その後の使用に依存して、これらの酵
素を同時にもしくは適当な順序で連続的に使用すること
ができ、またはこれらの酵素を他の酵素工程と組合せて
（例えばＳ１ヌクレアーゼまだはクレノウボリメラーゼ
およびデオキシヌクレオシド５′−トリホスフェ−））
、使用した酵素に相当する末端をもつ部分二重鎖、全二
重鎖または（細分離後の）一本鎖ＤＮＡ断片を得ること
ができる〔第２図参照〕。

本発明の好ましい変法の１つにおいては、前記のクロー
ニング法を多数のオリゴデオキシリ？ヌクレオチドと共
にサイクル的に繰返し、その際に個々のオリゴデオキシ
リ？ヌクレオチドはクローニングベクター内部において
相互に結合する。本発明のこの変法は２種の別々の方法
で実施することができる。

最初のクローン化オリゴデオキシリ？ヌクレオチドを部
分二重鎌形で分離し、第２の一本鎖オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドと組合せ、そして元のクローニングベクタ
ーかまたは第２のクローニング用に有まりなものとして
選んだ別のベクターのいずれかの内で再びクローン化す
る（Ａルート）。

あるいは、最初のクローン化オリゴデオキシリ？ヌクレ
オチドを組換え体ベクター中に残すことができ、次にこ
れを開裂し、こうして第２のオリゴデオキシリ？ヌクレ
オチドのベクターへの連結、ベクター内部への第１のオ
リゴデオキシリがヌクレオチドへのリンキングおよび２
個の連結オリゴデオキシリ？ヌクレオチドのクローニン
グが可能になる（Ｂルート）。

以下余白 Ａルート 最初のクローン化オリゴデオキシリゾヌクレオチドをク
ローニングベクターから開裂によって分離（第２図：　
Ｐａｔ　Ｉ　＋’　ｓｉヌクレアーゼまたはフレノウポ
リメラーゼ士デオキシヌクレオシド５′−トリホスフェ
ート、続いてＢａｍ　ＨＩ工程）した場合には、その第
２の一水銀オリゴデオキシリ？ヌクレオチドへのリンキ
ングおよび第２のクローニングハ、元のクローニングベ
クター内または予想される組換え体の選択用に適当な別
のクローニングベクター内のいずれかにおいて実施する
ことができる〔第３ａ図および第３ｂ図〕。新しい３′
−突出末端をもたらすベクター（例えば、第３ｂ図のＰ
ｓｔ　Ｉの代りの５ｓｔｌ）を使用することは必ずしも
必要ではない点に注意されたい。これが必要とされるこ
とがあるのは、２回のサイクルの後に得られる中間ＤＮ
Ａ断片の３′−末端においてＣヌクレオチドの代りにＣ
ヌクレオチドの存在を、遺伝子コードの他の融通性のあ
る使用が認めない場合において、長いＤＮＡ断片例えば
人工遺伝子の合成の際だけである（第２サイクルの第３
ａ図および第３ｂ図参照）。第２図によるこの中間体の
分離は、第２サイクルで使用するベクターに依存して、
３′−末端においてＣヌクレオチドまたはＣヌクレオチ
ドをもつ部分デュプレックスをもたらす（第３ａ図およ
び第３ｂ図によると、３′−末端においてＢａｍＨＩ−
ＰｓｔＩベクターはＣをもたらし、Ｂａｍ　ＨＩ　−Ｓ
ｓｔ　ｒベクターはＧをもたらす）。

Ａルートの欠点は、最初のクローン化オリゴデオキシリ
ゾヌクレオチドを組換え体ベクターから分離しく第２図
）、それを元のクローニングベクター（第３ａ図）また
は別のクローニングベクター（第３ｂ図）によって第２
のオリゴデオキシリゾヌクレオチドに結合させる点であ
る。こうした３重連結およびその後の工程は、第１のま
たは第２のオリゴデオキシリゾヌクレオチドのいずれか
を欠いた組換え体をもたらすことがある。

Ｂルートにはこうした欠点がない。

Ｂルート 第１のクローン化オリゴデオキシリゾヌクレオチドが組
換えベクターの部分を残す場合には、第１のクローン化
オリゴデオキシリゾヌクレオチドと第２（ｉ３等）のオ
リゴデオキシリゾヌクレオチドとのリンキングおよび同
じベクター内でのそのクローニングは２種類の別々の方
法で実施することができる。

Ｂ１ルート 第１の方法においては、特別のベクターを組立てて使用
する。そのベクターは３′−突出末端を与える多数の開
裂部位を近接して含んでおり、その各部位はベクター内
に１回だけ存在し、そして好ましくはクローニングに続
く酵素工程が合成りＮＡ断片の付着部位において制限部
位のヌクレオチド１個または２個だけを残すように配置
されている。

しかしながら、これは強い限定ではない。なぜなら、こ
れらのヌクレオチドは化学的に合成されたＤＮＡ断片の
長さを適当に選ぶことにより、そして遺伝子コードの退
化を利用することにより所望のＤＮＡ中に導入すること
ができる。

第４図（ここで、Ｎは４種のデオキシリゾヌクレオチド
の任意のものを表わし、Ｎ残基の数はｎ≧１であるもの
とする）は、４個の近接して位置する独特な制限部位を
含むベクターから出発する、Ｂ１ルートの使用を説明す
るものである。４個の部位の１個は５′−突出末端をも
たらしく　ＢａｍＨＩ）、他の３個は３′〜突出末端を
もたらす（Ｋｐｎ■、Ｓｓｔ　Ｉ、Ｐｉｔ　Ｉ　）。サ
イクル適用（ＢａｍＨＩ。

Ｋｐｎ　Ｉ開裂等）の第１工程は本質的に第１図で説明
したとおりに実施し、ＢａｍＨＩ部位とＫｐｎ　Ｉ部位
との間に第１のオリゴデオキシリデヌクレオチＰを含む
組換え体を生成する。第２の工程においては、組換え体
を最初に酵素Ｋｐｎ　ＩおよびＳｓｔ　Ｉで開裂し、得
られる直線状ベクターを精製する。

３′−末端にＳｓｔ　Ｉ部位に相補的な配列を含む次の
オリゴデオキシリゾヌクレオチドをベクターのＳｓｔ　
Ｉ部位に連結する。次に、４種全部のデオキシヌクレオ
シド５′−トリホスフェートの存在下で、連結一本領領
域をクレノウＩリメラーゼでフィル−インする。一方、
Ｋｐｎ　Ｉ開裂から誘導される非連結３′−突出末端を
クレノウＩリメラーゼの３′→５′エクソヌクレアーゼ
活性によって取り除く（Ｍａｎｉａｔｌｓ　Ｔ　＊　Ｆ
ｒ１ｔｓｃｈ　ＥＦおよびＳａｍｂｒｏｏｋＪ　＋　１
９８２　＋　Ｋｏｌｅｃｕｌａｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、
　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　Ｎ、Ｙ、、　１１３〜１１６頁）。得られた
直線状ベクターをＴ４ＤＮＡ　　ＩＪが一ゼで再環化（
プラント末端連結）し、ＢａｍＨＩ部位とＫｐｎ　Ｉ部
位との間に第１のオリゴｒオキシリ？ヌクレオチドを含
みそして元のベクターのＫｐｎ　Ｉ部位とＳｓｔ　Ｉ部
位との間に第２のオリテデオキシリ？ヌクレオチドを含
む変形ベクターを生成する。

従って、前記の２つのオリゴデオキシリ？ヌクレオチド
は相互に連結し、ヌクレオチド（Ｇ）１個だけが、最初
の連結に働（Ｋｐｎ　Ｉ部位から残る。

第３の工程においては、前記のベクターを最初ＫＳｓｔ
ＩおよびＰｓｔ　Ｉで開裂し、精製した後で、３′−末
端にＰｓｔ　Ｉ開裂に特徴的な配列を含む第３の一本鎖
オリゴデオキシリがヌクレオチドヲＰｓｔＩ部位に連結
する。第２工程に関連して説明した酵素反応の後で、３
種全部の中間連結オリゴデオキシリがヌクレオチドを含
むベクターを得る。得られるＤＮＡ領域においては、Ｋ
ｐｎＩ部位からのヌクレオチド（Ｇ）１個だけとＳａｔ
　Ｉ部位からの別のヌクレオチド（Ｇ）が存在し、この
領域は元のベクター中に存在する２個の外側開裂部位（
Ｂａｍ　ＨＩ、Ｐｓｔ　Ｉ　）に取囲まれている。従っ
て、意図するその後の用途に依存して、前記の連絡しク
ローン化したＤＮＡ領域を前記の酵素によって切断する
ことができ、そして例えば第２図に示すように処理する
ことができる。

Ｂ２ルート Ｂ１ルートに従う場合には、サイクルの最大数は、各種
の特異的開裂部位の数によって明らかに制限され、この
数はベクターを理想的に製造したとしても有限である。

従って、合成サイクルを無限に繰返すことのできるクロ
ーニング系を開発することが望ましい。

本発明者は、前記の点を合成アダプターの使用によって
達成できることを見出した。すなわちその合成アダプタ
ーは、クローン化すべき合成りＮＡ断片と連結すること
ができ、そして得られる連結体とクローニングベクター
とをリンキングすることができ、更に前記アダプターは
各クローニング工程の後で同じ方法により、組換え体か
ら常に完全に取り除くことができるものであるっ前記の
要件は、両末端部にそれぞれ３′−突出末端と５′−突
出末端とを含む部分的二重鎖ＤＮＡ断片によって満足さ
れる。アダプターの５′−突出末端は、適当な制限酵素
で開裂した直線状ベクターの末端と相補的であり、そし
てアダゲタ−の３′−突出末端は、認識配列が直線状ベ
クター中に存在しない制限酵素に特徴的である。アダプ
ターの二重鎖領域の長さは広い範囲内で変化することが
でき、好ましくは８〜１０塩基対を含む。この長さは、
満足に安定なデュプレックスをもたらす。更に、アダプ
ターの二重鎖領域の長さを考慮した場合、使用するベク
ターと連絡する選択性質が変らないで残るように注意す
る必要がある。例えば、アダプターが、選択工程の際に
浴融（ｆｕｓｉｏｎ　）タンｚ４り質をコードするＤＮ
Ａ領域の１部分となる場合には、選択の基礎となる酵素
活性が影響を受けないことが必要である（アダプターの
導入が読みフレーム中のシフトの原因とならない）。同
時に、アダプターは読みフレーム中に末端トリジレット
を含んでいないことが必要である。

Ｂ２ルートで使用すべきベクターは、異なる特異性をも
つ２種の独特の制限部位を含んでいる。

その一方は、クローン化すべき一水銀オリコゞデオキシ
リがヌクレオチドおよびアダプターから形成される連結
体の５７−突出末端と相補的な５′−突出末端をもたら
す。他方の制限部位は、第１図に示したとおり、クロー
ン化すべき一本鎖領域のフィル−インと同時にフィル−
インされる５′−突出末端をもたらす。

Ｂ２ルートは第５図に模式的に示される。出発ベクター
は、異なる特異性をもつ５′−突出末端をもたらす２個
の制限酵素（Ｂａｍ　ＨＩおよびＨｌｎｄ　ｎ［）によ
って開裂する。一方、一本鎖オリゴデオキシリ？ヌクレ
オチドは、Ｐｓｔ　Ｉ末端とＨｉｎｄｌｌｌ末端とをも
つ合成アダシタ−のＰｓｔＩ部位に連結する。

アダプター分予め自己連結がＨＩｎｄ１１１部位での連
結の際に行われることもあるので、反応混合物をＨｉｎ
ｄｌｆｆ酵素で処理し、一本鎖オリゴデオキシリポヌク
レオチドーアダプタ一連結体を単離し、続いてＢａｍ　
ＨＩ　−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ゛開裂化ベクターのＨ４ｎｄ
ｌ１１部位に連結する。次に、得られたベクターの一本
鎖領域をフィル−インし、ベクターを環化する。

コンピテント大腸菌細胞−＼の形質転換および選択の後
で、組換え体ベクターを単離する。得られたベクターを
Ｐｓｔ　Ｉ部位およびＨｉｎｄｌｌｒ部位で開裂し、直
線化ベクターをアダプター分子から分離する。第２サイ
クルにおいては、アダプターに連結した第２オリゴデオ
キシリ？ヌクレオチドをベクターのＨ１ｎｄｌ１１部位
に連結する。一本鎖５′−突出末端のフィル−インと、
Ｐａｔ　Ｉ開裂から得られる３′−突出末端の除去は、
第４図に示すように、４種全部のｒオキシリボヌクレオ
シド５’−トＩＪホスフェートの存在下でクレノウ？リ
メラーゼを使用して同時に実施する。プラント末端連結
、形質転換、選択および単離の後で得られるベクターは
、アダプターによって導入された２個のオリゴデオキシ
リゾヌクレオチドを含んでおり、従って、Ｐｓｔ　Ｉ部
位に由来し、連結部位に残留するヌクレオチド（Ｃ）１
個のみが存在する。その後、全体の操作を所望により何
回でもサイクルで縁返すことができる。得られるＤＮＡ
領域は各サイクルの後でＢａｍＨＩおよびＰｓｔ　Ｉ　
２重消化によって切断することができ、そして目的とす
る用途に依存して、第２図に示したように更に処理する
ことができる。

以下余白 組換え体のスクリーニング 予定の組換え体のスクリーニングはすべてのクローニン
グ法での避けることのできない工程であシ、所望のａ換
え体を出発ベクターからおよび他の組換え体から容易に
区別できることが本質的な要件である。スクリーニング
およびその後のヌクレオチドシーフェンシングのために
、本発明者のＭ　１３　ｍｐ　ファージベクター　（Ｍ
＠ｓｓｉｎｇ　Ｊ等。

１９８１　、　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ、
、　９．３０９”。

Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ等、１９８２　、　Ｇｏｎｅ　１９
．２６９　；およびＮｏｒｒ　ａｎｄａｒ　Ｊ等、　１
９８３．Ｇｏｎｅ　２６゜１０１）を使用した。これは
文献に公知であり、広く使用されている。これらのベク
ターは、ファージの発生に重要ではない領域内に大腸菌
から誘導されるラクトースオペロンの部分すなわチオペ
レータ、プロモータおよびβ−がラクトシダーゼアミノ
末端部（ｍｐ７の場合はアミノ酸１−１４５ならびにｍ
ｐ８、ｍｐ９、ｍｐ　１０　、　ｍｐ　１１およびその
誘導体の場合にはアミノ酸１−５９）をコートスるＤＮ
Ａ領域を含んでいる。これはいわゆるβ−がラクトシダ
ーゼのα−断片であシ、その合成はＩＰＴＧ　（イソゾ
ロビル−β−Ｄ−がラクトピラノシド）によって誘発さ
れる。α−断片それ自体は酵素的に不活性であるが、生
体内でβ−がラクトシダーゼのω−断片を補って活性酵
素にすることができる（ω−断片は野生型酵素のアミノ
酸１１−４１が欠けているので、酵素的に不活性である
）。

大腸菌宿主株には完全な染色体β−がラクトシダーゼ遺
伝子（Δｔａｅ）が欠如しているが、エピソーム（その
エビソームの部分がω−１１−をコードしている）を含
んでいる。この菌株をＩＰＴＧの存在下で前記Ｍ１３フ
ァージ誘導体で感染すると、α−断片とω−断片とが相
互に補い合って官能性のβ−がラクトシダーゼが得られ
る。酵素活性はラクトース・アナログ、Ｘ−ガル（５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−ガラクトシ
ド）によって検出し、それからはβ−ガラクトシダーゼ
の作用によシ青色の化合物が得られる。従って、Ｍ　１
３　ｍｐファージ誘導体は宿主細胞の欠陥酵素を補って
青色シラ・−りをもたらす。

Ｍ　１３　ｍｐファージによってコードされたα−断片
の補足活性は、アミン末端隣接領域の構造によって影１
１Ｉｌｌを受けない。従って、３０−５０　ｂｐＤＮＡ
領域を、各種のＭ　１−３　ｍｐベクター中へ、一般に
α−ペゾチドの４番〜６番のアミノ酸の部位で挿入した
。これらのＤＮＡ領域は、ファージＤＮＡ中には見出さ
れない一連の制限部位（ポリクローニング領域）を含ん
でいる。ポリクローニング領域の設計の際には、α−断
片の読みフレームがシフトされないで、しかも前記領域
が相中に終結コドンを含まない場合が一般に採用される
。

外来ＤＮＡ領域がポリクローニング部位に押入されると
２つの可能性がある。α−断片の読みフレームが挿入Ｄ
ＮＡ領域によってシフトせず、外来ＤＮＡが相中に終結
コドンを含まない場合には、青色グラークが高い確率で
形成される。読みフレームがシフトするかまたは相中に
終結コドンが存在する場合には、白色ゾラークが形成さ
れる。ＤＮＡ鎖（我々の場合には一本鎖）の長さを予め
設計した烏合にり：、クローニングによって得られる組
換え体がクローニングベクターと比較して色の変化をも
たらすか否かを予想することができる。出発ベクターと
組換え体とが同じ色をもたらす場合には、組換え体をラ
ンダム法で選択することができる。この選択は、色の変
化（例えば、前記の青から白）があると非常に容易であ
る。しかしながら、この色変化があっても、所望の組換
え体の信頼できる選択は保証されない。なぜなら、汚染
する非特異的ヌクレアーゼが酵素工程の際に存在するこ
とが１１）、これが副反応の原因となって同じ色変化を
もたらすことがあるからである。白から青への色変化は
、非常に信頼できる選択を提供する。

この場合、ポリクローニング部位を含むベクターを製造
するが、これは読みフレームをシフトし、従って活性α
−断片を合成することができない。

α−断片の読みフレームと修復するＤＮＡ領域をポリク
ローニング部位に挿入する場合には、青色の組換え体を
予想することができる。非特異的酵素性副反応は白色（
青色でない）ｆラージをもたらす可能性が高いゆで、こ
の選択は最も信頼できるものと認められる。

前記の選択方法は組換え体のスクリーニングに非常に有
用であるが、それらのいずれも完全に満足できるもので
はない。従って、組換え体の同定を更に分子レベルで実
施する。予想の色をもつ適当な多数の組換え体から一本
鎖ＤＮＡを単離し、そして例えば各々の予想の組換え体
ファージ用の普遍的プライマーによってソデオキシシー
クエンシングのＣ−反応にかける。出発ベクターに相当
するファージＤＮＡ　’ｉ対照として使用する。ＤＮＡ
断片を挿入する場合には、出発ベクターのＣ−／母ター
ン特性をシーフェンシングダル上で上方にシフトし、そ
してそのシフトの程度から挿入ＤＮＡ断片の長ささえ推
定することができる。次に、所望の長さの組換え体を、
４種全部の反応を使用して、ジデオキシ法による核酸シ
ーフェンシングによって同定する（　Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ
等、１９７７　、　ＰＮＡＳ　Ｕ８Ａ７４．５４６３）
。

ファージＤＮＡの単離とＣ−）ラック分析は多数（１日
当シ５０〜６０）の組換え体で同時に実施することがで
き、一方、シーフェンシングは１２〜２０個の組換え体
に同時に適当することができる。前記のスクリーニング
およびヌクレオチド配列分析はＭ　１３　ｍｐ　ベクタ
ーの場合に使用することができるだけでなく、同様の性
質をもつプラスミドベクターのスクリーニングおよび分
析にも使用することができる。例えば、ｐＵＣｆラスミ
ド（Ｖｉｅｌｒａ　Ｊ等＋　１９８２　＋　Ｇｅｎｅ、
　１９＋　２５９）およびその誘導体を同様に使用する
ことができる。この場合、ゾラークではなく、抗生物質
抵抗性（アムビシリン抵抗性）コロニーを得て、前記の
色反応に基づいて選択する。ＤＮＡは組換え体から二重
鎖の形でのみ単離することができ、ジデオキシ法による
これらの配列分析は前記の場合よりも多少信頼性が低く
なる。しかし々から、所望によシ、配列分析は両ＤＮＡ
鎖に関し、２つの反対方向に向かう普遍的プライマーに
よって実施することができ、従って、ヌクレオチド配列
に基づく最終同定は、この場合にも、完全に信頼するこ
とができる。一方、ｐＵＣプラスミドは、それらが長い
外来ＤＮＡ断片をもっていても、Ｍ１３ｍｐベクターよ
り安定である点で有利である。それらの二重鎖構造によ
シ、クローン化すべきオリゴデオキシリボヌクレオチド
の放射性ラベルをもつハイブリッド形成を、ｐＵＣベク
ターによる最初のスクリーニング工程として使用するこ
ともできる。

本発明方法の主要な長所は以下のとおりである。

（１）二重鎖ＤＮＡ断片の一本鎖だけを化学的に調製す
ればよく、相補鎖は酵素的に合成する。最終生成物に関
する限り、余分でしかない合成作業としては、クローン
化すべきオリゴデオキシリボヌクレオチドの短い３′−
末端配列（通常５ヌクレオチド）が含まれるだけである
。この３′−末端配列は与えられた制限部位に特徴的で
あるので、それを大量に調製することができ、しかもこ
のコンセンサス配列の小ナリコートを出発材料として使
用して特異的配列をもつオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドを得る。

（２）　　クローニングサイクル中に４ヌクレオチドが
除去されるので、５ヌクレオチド長のコンセンサス配列
は最終生成物中に残らない。３′−末端コンセンサス配
列のヌクレオチド１個だけが、合成りＮＡ断片の付着部
位に残る。この単独ヌクレオチドは、各断片のヌクレオ
チド配列および最終ＤＮＡ分子の断片化のプランニング
が考慮されている場合には、最終配列の一体部分を形成
することができる。この点で、例えば、４１　ｂｐ二重
鎖１）ＮＡ領領域８２ヌクレオチド）を得るには、４５
ヌクレオチド長のオリゴデオキシリボヌクレオチドの合
成で充分である。

（３）調製すべきＤＮＡの２本の鎖のどちらをより有利
に化学的に合成することができるかを、予め計画に立て
ることができる。ピリミジンに富んだ配列の方がプリン
に富んだ配列よりも容易に合成される。本発明方法では
化学合成のターグットとしてピリミジンに富ム仙域の選
択を可能にし、ゾリンに富んだ領域は酵素合成する。

（４）酵素反応の順序は、半合成りＮＡ断片をクローニ
ングベクター内の適当な配向に相互に付着するものであ
る。断片を連結した後では、クローニングに使用した制
限部位の特性を残す配列は存在しない。

（５）一本領オリゴデオキシリがヌクレオチドをベクタ
ー内に１度挿入してクローン化すると、サイクル実施の
別の可能性として、キロ塩基のオーダーのオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを更に挿入したクローン化ＤＮＡ断
片の長さの伸長ができる。

サイクルの数は使用する計画に依存する。出発ベクター
が、３′−突出末端をもたらす近接して位置する多数の
独特の制限部位を含む場合（Ｂｌルート、第４図）には
、サイクル数はその部位の数によって決する。アダプタ
ーを使用する場合（Ｂ２ルート、第５図）には、サイク
ル数は原理的には無限である。

（６）一本領オリゴデオキシリボヌクレオチドを精製し
て均一にする必要がない。事実、クローニングが最終的
な完全に信頼することのできる精製方法である。なぜな
ら、単独分子のベクターへの連結およびクローニングに
よって得られる組換え体は完全に均一な断片をもたらす
。物理化学的方法では相互に分離することができない不
均質なオリゴデオキシリボヌクレオチド集団の構成員を
、前記の方法によって純粋な形で単離することができる
。

（７）組換え体のスクリーニングおよびそれらの分析は
比較的簡単である。表現型の性質（例えばクロニーまた
はプラークの色）に基づく宿主ベクター系の適当な選択
は、予想される組換え体の確率の高い同定に適している
。更に、核酸シーエンシング（ジデオキシ法）により、
得られた組換え体の最終的で信頼性の高い同定が可能に
なる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、
これらは本発明を限定するものではない。

また、これらは５つの一本領合成オリゴデオキシリ？ヌ
クレオチドすなわち、 ＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡ　　　
　　ａ　　２２７−１ＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＡＡＣＣＡ
ＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣ
ＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＴＴＧＴＡ
ｃ’ｒ’ｒｃ’ｒＡ’Ｉ’ｃＴＧＣＴ’Ｃ’ｒＣＴＧＣ
ＡＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴＡ
ＡＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡ３５マー、 を各種のＭ　１３　ｍｐ　ベクターに連結し、それぞれ
の相補鎖を酵素的に合成し、そして二重鎖ＤＮＡ断片を
クローニングすることに関する。最初の４種のオリゴア
オキシリ？ヌクレオチドは、適当に開裂したベクターの
Ｐｓｔ　１部位に直接連結した。一方、５番目のオリゴ
デオキシリ？ヌクレオチドはアダプターを使用して連結
し、クローン化した（Ｂ２ルート）。

５′３′ ｐＧＣ（”、ＧＧＧＧＧＡ ＧＡＣ！ＧＴＣＧＣＣＣＣＣＣＴＴＣＧＡｐ　　　　　
Ｐｓｔｌ／ロ１ｎｄｌｌアダプター３′５′ −ＩＪオリゴデオキシリゾヌクレオチドの化学合成は、
モノマーおよび（または）二量体ビルディングブロック
から出発して、ホスフェートトリエステル固体相法の最
も有効な変法によって実施した（　Ｅｆ　１ｍｏｖ　Ｖ
Ａ等、１９８２　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ
、　１０．６６７５および５ｐｒｏａｔ　ＢＳ等、１９
８３゜Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２４
　、５７７１）。

出発ベクターとしては、Ｍ　１３　ｍｐ８　（Ｍｅｓｓ
ｉｎｇＪ等、１９，８２　、　Ｇｅｎｅ　、ＩＬ２６９
）、Ｍ　１３ｍｐｌＯ（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　Ｊ等、　
１９８３．　ａｅｎｅ、　２６．１０１　）およびＭ　
１３　ｍｐＷ３２４　（元のＤＮＡ　Ｔｆｆｒ片よシも
短かいＤＮＡ断片をＢａｍ’Ｈ）部位とＰｓｔ）部位と
の間に挿入することによってＭ１３ｍｐ８から我々の研
究室で製造した：生成物は白色ゾラークをもたらす）を
使用した。レシピエンド大腸菌株はＪＭ１０１　（Ｆ’
ｔｒａＤ３６　１ａｃｌｑ　１ｍｃＺΔＭ　１５　　ｐ
ｒｏＡＢ＋／Δ　（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ　）　５ｕｐＥ
　ｔｈｌ　）　（Ｍｅｓａｉｎｇ　Ｊ等、　１９８１゜
Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．３０９　
）であった。公知の化学構造をもつ出発ベクターの中で
、Ｍｌ　３ｍｐ　８複製型ＤＮＡ　（Ｃａｔ−Ａ　２７
−１５２８−０１　）およびＭ１３ｍｐｌＯ複製型ＤＮ
Ａ　（Ｃａｔ、Ａ　２７１５３７−０１　）ｉＰｈａｒ
ｍａｃｌａ　Ｐ−ｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｌｃａｌｇから
購入した。

各種のＭ　１３　ｍｐ　誘導体の調製については以下の
実施例および添付図面に説明がある。

Ｍ　１３ｍ　ｐＨ８０１例１　　　第７図Ｍ１３ｍｐＷ
３２４　　　例２　　　第８図Ｍ１３ｍｐＢ３３３　　
　例２　　　第９図Ｍ　１３ｍ　ｐ　ＨＩ　Ｂ　１　　
　例３　　　第１０図Ｍ１３ｍ　ｐ　ＨＩ　Ａ　＋　　
　例４　　　第１１図Ｍ１３ｍｐＨＩＡ　　　　例５　
　　第１２図Ｍ１３ｍｐベクターの代シに、同様の選択
性をもつ他のポリリンカーベクター例えばｐＵＣ誘導体
またはｐ　ＥＭＢ　Ｌ誘導体（ＤｅｎｔｅＬ等、１９８
３゜Ｎｕｅｌｅｌｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｇ、　１１．　
１６４５　）を使用することもできる。

以下の実施例で使用する酵素のソースは以下のとおりで
ある。

制限エンドヌクレアーゼはＮｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｌ
ｏＬａｂｓ　（ＮＥＢ）により、Ｔ４ＤＮＡリガーゼは
Ｃａｍｂｒｌｄｇｅ　Ｂｊｏｔｅａｈｎｌｃａｌ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　（ＣＢＬ）により、ＤＮＡポリメラ
ーゼ大断片（フレノウポリメラーゼ）はＣＢＬまたはＢ
ｏｅｈｒｌｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｌｍによって製造さ
れているものであった。酵素反応は、特に断らない限り
、製造業者によって与えられたガイドラインに従って実
施した。

複製型はＭ１３ｍｐ誘導体から単離した（　Ｂｉｒｎｂ
ｏｉｍ　ＨＣ等、１９７９　、　Ｎｕｃｌｅｌａ　Ａｃ
１ｄｓＲｅａ、、　７．１５１３）。２種の異なる制限
酵素で開裂した後、ベクターから得られる大断片をアガ
ロースによって（Ｍａｎｌａｔｌｓ　Ｔ等、１９８２゜
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｌｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｎ−
Ｙ−、１６４−１７０頁）または酢酸アンモニウムとの
沈殿によって精製した。

酢酸アンモニウムとの沈殿は以下のようにして実施した
。

制限消化後に、ＤＮＡ約１μｇを含む反応混合物を６５
℃で１０分間熱処理にかけ、水で１００μｔにし、室温
においてフェノール１００μｌで抽出した。水性相に、
３Ｍ酢酸ナトリウム溶１（ｐＨ５，２）１０μｌおよび
エチルアルコール２５０μノを加え、急速冷凍（液体空
気、５分間）した後で、混合物を遠心分離（１２，００
Ｏｒｐｍ、５分間）した。沈殿物を水１００μ！および
７．５Ｍ酢酸アンモニウム５０μｌ中に溶かし、続いて
エチルアルコール２００μｌを前記溶液中に加え、−７
０℃に１５分間冷却し、そして前記と同様に遠心分離し
た。次に、溶解および沈殿の工程を繰返した。

続いて、沈殿物を冷エチルアルコール１　ｍｌで洗い、
乾かし、そして殺菌水中に浴かした。

２種の適当な制限酵素で開裂した後、精製したベクター
（２０〜５０　ｎ、９）を、Ｔ４ＤＮＡりが−ゼ０．２
単位の存在下で１５℃において１２〜２０時間、反応混
合物（５０ｍＭ　）リス−ＨＣｔ、　ＰＨ７，５。

１０ｍＭＭｇＣｔ２１１θｍＭジチオトレイトール。

１幌ＡＴＰ　）　１０μ！中で５′−ホスホリル化−木
調オリゴデオキシリボヌクレオチドとＰｇ　ｔ　Ｉ／Ｈ
ｉｎｄ［［アダゲタ−との連結によって得た付加物と連
結するかまたは５′−ホスホリル化一本領オリゴデオキ
シヌクレオチドと連結した。反応混合物を５分間６５℃
に保ち、簡単に遠心分離（１０〜３０秒間、１２、ＯＯ
Ｏｒｐｍ　）　ｌ、、ｄＡＴＰ　　、　　ｄＣＴＰ　、
　　ｄＧＴＰおよびＴＴＰ　を各々１ｍＭ濃度で含むデ
オキシリ？ヌクレオシド５′−トリホスフェート混合物
（１ｍＭｄＮＴＰ混合物）１μｌおよびフレノウポリメ
ラーゼ（０，５単位／μ７）１μｌを加えた。混合物を
１０分間室温下に放置し、５分間６５℃に加窒した。

簡単な遠心分離の後、殺菌水４．５μｌと１０　ｍＭＡ
ＴＰ１μｌと１００　ｍＭジチオトレイトール１μｌと
緩衝液（５ｏ　ｏ　ｍＭ　）リス−ＨＣ４，ＰＩ−１７
，５、１００ｍＭ　ＭｇＣ４２）　１μｌとを加えた。

混合物を１５℃に冷却し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位
／μり０．５μｌを加えた。１５℃で１２〜２４時間イ
ンキュベーションした後、反応混合物によってＪＭ１０
１大腸菌細胞を形質転換した（　Ｄａｇｅｒｔ　Ｍ等、
１９７９、Ｇｅｎｅ、６．２３またはＨａｎｇ　ｈａｎ
　ＤＪ＋１９８３　、　Ｊ、ＭｏＬ、　Ｂｌｏｔ、、　
１６６、５５７　）。

形質転換された細胞懸濁液を、Ｘ−がルおよびＩ　ＰＴ
Ｇの存在下でトッノアガ−３ｍｌを使用して４５℃でＴ
Ｙｆレート上に注いだ（ＷｌｎｔｅｒＧ等、１９８０　
、　Ｎｕｃｌａｌｃ　Ａｃ１ｄｓ＋　　Ｒａｍ、、　　
８．１９６５）。

前記プレートを３７℃において８〜１６時間インキュベ
ーションした。所望の色のプラーク（８〜６０プラーク
）から一本鎖ＤＮＡを調製し、ＴトラックまたはＣトラ
ック分析を各ファージＤＮＡについて実施した（　Ｓａ
ｎｇａｒＦ等、１９８１　、Ｊ、ＭｏＬ。

旧ｏＬ、、１４３，１６１　）。この方法で、所望のＤ
ＮＡ断片を含む組換え体を選択し、これらの組換え体の
ヌクレオチド配列をジデオキシ法によって決定した（　
Ｓａｎｇａｒ　Ｆ等、　１９７７　、　ＰＮＡＳ　ＵＳ
Ａ７４．５４６３　）。所望の配列を含むクローンの１
つから、更に工程を行って、二重鎖複製型を調製した。

ターへの連結 ５−　　Ｐ−ホ、’、７エートＡＧＣＴＴＧＣＣＣＣＣ
ＣＧＣＴＧＣＡＧ１５　ｐ　モルオヨＵ　５’−３２Ｐ
　−Ｊｚスフｇ？’ｈ　ＧＣＧＧＧＧ　−ＧＧＣＡ　１
５　ｐモルを水１０μ！　中に浴かし、３０分間６０℃
に保った。次に、５−　　Ｐ−ホスフェート３５７−（
水浴液５μｌ中）５０Ｐモルを加え、溶液を３０分間３
７℃に保ち、凍結乾燥した（第６図）。

凍結乾燥残渣を緩衝液（５０ｍＭ　）　ＩＪスーＨＣ１
゜ｐ”　７．５　＋　１０　ｒｎＮＩ　Ｍｇｅｔ、、　
、１０　ｍＭジチオトレイトール、１　ｍＭＡＴＰ　）
　２０　ｔｉｌｌ中に溶かし、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２
単位／μ７）０．２５μｌを加え、１５℃において２４
時間、連結全実施した。エチルアルコール５０μｌによ
る沈殿および乾燥の後で、沈殿物をＨｌｎｄｌｌ［緩衝
液２０μｌ中に浴かし、Ｈｌｎｄｌｌ［酵素２０単位と
共に、３７℃で２時間放置した。その反応混合物から、
１０％非変性ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動（
４００Ｖ。

６〜８時間、室温）およびラジオオートグラフィーによ
って選んだバンドからの溶離によってＰｓ　ｔ　Ｉ／　
Ｈｉ　ｎｄ　ｌ［アダプターに連結した３５マーが得ら
れた（　Ｅｄｇｅ　ＭＤ等、１９８１　、　Ｎａｔｕｒ
ａ。

２９２．７５６　）。

例１ ２２７−ＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣ
ＡのクローニングＭ　１３　ｍ　ｐ　８複製型をＢａｍ
Ｔ（ｌおよびｐｓｔｌ酵累で開裂し、０．５％アガロー
スゲル上での分離および電気溶出の後で、得られた大断
片（約２５ｎＪ）を５′−ホスホリル化２２マー（２゜
５ｐモル）ト連結した。この工程は、一般的なりローニ
ング方法と同様に実施した。選択は青色のバックグラン
ド中の白色プラークについて行った。ランダムな方法で
、得られた白色グラークの１３個を選択し、一本鋳ファ
ージＤＮＡの調製に使用した。Ｔ−）ラック分析によれ
ば、選択した組換え体１３個のうち９個が導入２２マー
のシフト特性を示すことが分かった。これらの９個を核
酸シーフェンシングにかけた。そのうちの７個がＢａｍ
Ｈ１部位とＰｓｔ［部位との間に２２７−の配列を含ん
でいることが分かった。そのベクターの１つ（Ｍ　１３
　ｍｐＷ８０１）の製法を第７図に示す。Ｍ　１３ｍｐ
Ｗ８０１の特徴は、それがファージとしてＸ−ガルおよ
びＩＰＴＧの存在下でＪＭ１０１背景上に白色プラーク
を与えることであり、そしてその複製型が３′−突出末
端金もたらす３つの隣接制限酵素（Ｋｐｎ　Ｉ　、　５
ｓｔｆおよびＰｓｔｌ）の認識配列を含んでいることで
ある。

従って、それを、第４図と同様に、前記の３つの制限部
位およびＥｃｏＲＩの使用を通じて、Ｂ１ルートを経由
するサイクル・クローニングの出発ベクターとして適用
することができる。

例２ ２０マー、２１マーおよび２２マーオリゴデオキシリ？
ヌクレオチドのクローニングおよび２１７−を含む組換
え体の選択 本例は、クローニング方法を利用して、不均質なオリゴ
デオキシリゾヌクレオチド混合物（ここでは、２０マー
と２１７−と２２マーとの混合物）から所望の成分（こ
こでは２１マー）を選択することがどのようにして可能
になるかを示すものである。前記の混合物は式Ｃ（Ｔ）
　（Ｔ）ＴＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧ−ＣＴＣＣＴＧＣＡ　
（ここで、オリゴデオキシリボヌクレオチドＣＴＴＧＧ
ＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡ　、　ＣＴＴＴＧＧＴ
ＡＣＣ−ＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡおよびＣＴＴＴＴＧＧ
ＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＣＴＧＣＡはほぼ当モル比で存在
するものとする）で表わすことができる。

Ｍ１３ｍｐ８誘導体のＭ１３ｍｐＷ３２４　を出発ベク
ターとして使用した。このベクターにおいては、Ｂａｍ
ＨＩ部位およびＰｓｔ）部位は、Ｍ１３ｍｐ８における
部位とは異なる距離に位置している。Ｍ１３ｍｐＷ３２
４由来のファージは、ＪＭＩ０１大腸菌背景上に白色の
グラークをもたらし′ｆｃ（第８図）。

Ｍ１３ｍｐＷ３２４複製型金、ＢａｍＨｌおよびＰｓｔ
ｌ酵素で開裂し、大断片を酢酸アンモニウムとの沈殿に
よって単離した。一般的方法で説明したとおシ、２０マ
ーと２１マーと２２マー（各１０ｐモル）のオリゴデオ
キシリゾヌクレオチド混合物の５′−ホスホリル化型と
前記の大断片約５　Ｏｎ、９と全混合し、前記のクロー
ニング工程を行なった。

形質転換後に、２１マ一成分を導入した場合にだけ予想
される青色ゾラークに関して選択を行った。

青色プラーク３５体のうちの８体をランダムに単離し、
これらから一本領ファージＤＮＡを単離し、Ｃ−）ラッ
ク分析にかけた。組換え体８体のうちの２体が、２１マ
ー導入の場合に予想されるＣ−トラックを与えた。シー
フェンシングによれば、その組換え体はどちらもＢａｍ
Ｈ１部位とＰｓｔ　１部位との間に２１マーに相当する
配列を含むことが分かった。この組換え体の一方をＭ１
３ｍｐＢ３３３と命名した。他の６個の青色プラークは
、欠失組換え体に由来するものであった。この欠失組換
え体はポリメラーゼによるＢａｍＨ１部位のフィル−イ
ン、タレノウＩリメラーゼの３′、５′エクソヌクレア
ーゼ活性の結果としてのＰｓｔ　■部位の非連結化３′
−突出末端の開裂およびその後の連結によって形成され
る。α−ペプチド誘導体のこの組換え体コードはα−相
補化ができる（第９図）。

得られたＭ１３ｍｐＢ３３３の特徴は、それがファージ
型においてＪＭ１０１背景（Ｘ−ガルおよびＩＰＴＧの
存在下）上に青色プラークを与える一方、その複製型が
、３′−突出末端をもたらす３つの隣接制限酵素（Ｋｐ
ｎ（ａ５ｓｔｌおよびｐａｔ’Ｉ）の認識配列を含んで
いる点である。従って、前記例１に記載シたＭ　１３　
ｍｐＷ８０１ベクターと同様に、前記の複製型により、
ＢａｍＨｌとＫｐｎ　ｆとＳｓｔ［とＰｓｔ　ｌの部位
を使用してＢ１ルートを介してすイクルクローニングを
可能にする。しかしながら、別の色選択で行う。

す、下余白 例３ ３９マーＣＡＴＧＴＴＴＧＴＴＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴ
ＧＴＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡＣＣＴ−ＧＣＡのクローニン
グ Ｍ１３ｍｐＷ３２４複製型を、　ＢａｍＨＩおよびＰａ
ｔ　１酵素で開裂し、大断片を酢酸アンモニウムとの沈
殿によって精製した。一般的方法で説明した工程により
５′−ホスホリル化３９７−５０ｐモルト前記の大断片
約４０　ｎｇとを反応させた。ＪＭ１０１大腸菌株中に
形質転換した後で、白色背景中の青色プラークに関して
選択を行った。青色プラーク２０体から一重鎖ファージ
ＤＮＡを単離した。Ｃ−トラック分析によれば組え体１
９体が３９マー導入を示した。前記の組換え体７体のシ
ーフェンシングによれば、５体が３９７−に相当する配
列を含むことが分かった。ヒトインシュリンのＢ鎖をコ
ードした人工遺伝子のセグメントを含む前記の組換え体
をＭ１３ｍｐＨＩＢ１と命名した（第１０図）。

例４ ４５マーＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧ
ＴＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡＴＣＴＧＣ−ＴＣＴＣＴＧＣλ
のクローニング Ｍ１３ｍｐｌＯ複製型を、ＢａｍＨＩおよびＰａｔ　Ｉ
酵素で開裂し、大断片を酢酸アンモニウムとの沈殿によ
って精製した。一般的方法で説明したとおり、２０マー
と２１マーと２２７−（各１０ｐモル）のオリゴデオキ
シリ？ヌクレオチド混合物の５′−ホスホリル化４５７
−１０ｐモルと前記の開裂化ベクター約２５　ｎｇとを
反応させた（第１１図）。

反応混合物をＪＭ１０１大腸菌株中に形質転換した。出
発ベクターも青色プラークを生成するので、青色プラー
クをランダムに選択した。青色プラーク５１体から一重
鎖ファージＤＮＡを単離した。Ｃ−トラック分析におい
ては、検査クローン５１体のうちの２４体が導入４５７
−のシフト特性を示し、２０体が出発Ｍｌ　３ｍｐ　１
０であることを示し、そして７体が例２と同様にして得
られた欠失誘導体であった。組換え体２４体のうちの１
４体についてシーフェンシングを行い、これら１４クロ
ーンのうちの８クローンが４５マーに相当する配列を含
んでいた。ヒトインシュリンのＡ鎖をコードした人工遺
伝子の部分を含む前記のクローンの１個をＭ１３ｍｐＨ
ＩＡ１と命名した。

例５ ３５７−　ＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＴＧＡＧＡＡＣＴＡＣ
ＴＧＴＡＡＣＴＡＧＣＣＴＧＣＡ（７）クローニング 本例は、合成アダプターを利用した。Ｂ２ルート経由の
クローニングについて説明する。例４で得たＭ１３ｍｐ
ＨＩＡ１を出発ベクターとして使用した。

直線状Ｍ１３ｍｐＨＩＡ１ベクターおよび合成アダプタ
ーを利用して、前記のクローン化４５マーと合成３５マ
ーとを互いに結合させた。得られるベクターはヒトイン
シュリン人鎖をコードする完全な人工遺伝子を含んでい
る。

Ｍ１３ｍｐＨＩＡ１ベクターをＰｓｔｌおよびＨ１ｎｄ
ＩＩ１１ｔ！素によって開裂し、大断片を酢酸アンモニ
アとの沈殿によって精製した。ＰｓｔｌΔ刊ｎｄｌ［ｌ
アダプターに連結した３５マーと開裂化ベクター約１０
　ｎｇとを混合し、前記の一般的方法と同様に、更に反
応を実施した。反応混合物をＪＭ１０１大腸菌株に形質
転換すると白色プラークが予想される。合計４個の白色
プラークを得た。そのうちの１２個を選び、それから一
本領ファージＤＮＡを調製した。シーフェンシングによ
れば、これら組換え体のうちの５体が、例４でクローン
化した４５マーの４１ヌクレオチド長領域に連結した所
望の３５マーを含んでいることが分かった。得られたＭ
１３ｍｐＨＩＡクローン（第１２図）は。ヒトインシー
リンＡｆｉをコードすることのできるＤＮＡセグメント
を含む。

第１２図のヌクレオチド配列から取ったアミノ酸配列は
単にクローン化ＤＮＡ領域のコーディング性を示すだけ
のものであり、Ｍ　１３ｍｐＭＩ　Ａの表現が機能的な
ヒトインシュリンＡ鎖をもたらすことを示すものではな
い。しかしながら、Ｍ１３ｍｐＨＩＡベクターからコー
ディング領域を切断し、そして適当な読みフレーム中に
おいて表現ベクター中にそれを挿入することにより、ヒ
トインシュリンＡ鎖の表現は可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明方法の１態様の工程の説明図である。 第２図は、クローン化ＤＮＡ領域から各種ＤＮＡ断片を
生成する方法の説明図である。第３ａ図は、本発明方法
のＡルートの工程の説明図である。第３ｂ図は、本発明
方法のＡルートの工程の説明図である。第４図は、本発
明方法のＢ１ルートの工程の説明図である。第５図は、
本発明方法のＢ２ルートの工程の説明図である。第６図
は、本発明のアダプターへのオリゴデオキシリがヌクレ
オチドの連結の説明図である。第７図は、Ｍ１３ｍｐＷ
８０１の製法の説明図である。第８図はＭｌ　３ｍｐＷ
３２４の製法の説明図である。第９図はＭ１３ｍｐＢ３
３３の製法の説明図である。第１０図は、Ｍｌ　３ｍｐ
ＨＩ　Ｂ　＋の製法の説明図である。第１１図はＭ１３
ｍｐＨＩＡ１の製法の説明図である。第１２図はＭ１３
ｍｐＨＩＡの製法の説明図でおる。 以下余白 ＋　　　　　ｕｌ Ｃ） Ｉ　Ｉ　　　　　　　　あ ｉｌ φ素 Ｉ　Ｉ　　　　　　　　１１ Ｆｉｇｕｒｅ　５　　（ぞの２） −ＧＧＡＴＣＣ−ＣＮ　−ＣＴＧＣＡＧ−ＣＣＴＡＧＧ
−ＧＮ　　　　　　ＧＡＣＧＴＣリガーゼ ＡＡＧＣＴＴ− ＴＴＣＧＡＡ− （）Ｉｉｎｄ　ＩＩＩ） Ｐｓｔ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌアタプタ−ノ除去Ｆｉｇ
ｕｒｅ　９ Ｆｉｇｕｒｅ　　１０ ぺ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、クローニングベクター中において、デオキシリボヌ
   クレオシド５′−トリホスフェートの存在下で、一本鎖
   ＤＮＡ断片の相補鎖を酵素的に合成することによる、オ
   リゴおよびポリデオキシリボヌクレオチドの製法。 ２、適当に開裂したクローニングベクターに一本鎖ＤＮ
   Ａ断片を直接またはアダプターによって連結し、デオキ
   シリボヌクレオシド５′−トリホスフェートの存在下で
   それ自体公知の方法によって一本鎖領域をフィル−イン
   し、ベクターを再環化し、得られる変形ベクターによっ
   てバクテリア細胞を形質転換し、選択した形質転換細胞
   クローンからベクターを単離し、そして、 （ａ）所望のオリゴまたはポリデオキシリボヌクレオチ
   ドを二重鎖形に切断し、そしてその後の使用に適したリ
   ンキング端部をもつ二重鎖ＤＮＡを単離するか、または
   、 （ｂ）所望のオリゴまたはポリデオキシリボヌクレオチ
   ドを、適当なリンキング末端をもつ二重鎖形に切断し、
   これをベクターに連結すると同時に一本鎖オリゴまたは
   ポリデオキシリボヌクレオチド断片の連結を行い（ここ
   で、ベクターおよび一本鎖オリゴまたはポリデオキシリ
   ボヌクレオチドは、各々元のものと同じものであっても
   異なるものであってもよいものとする）、一本鎖ＤＮＡ
   領域をそれ自体公知の方法でフィル−インし、ベクター
   を再環化し、そしてオリゴまたはポリデオキシリボヌク
   レオチドの単離工程および所望によりその長さの伸長工
   程を１回またはそれ以上繰返すか、または、 （ｃ）最初のクローン化オリゴまたはポリデオキシリボ
   ヌクレオチドを含むベクターを、オリゴまたはポリデオ
   キシリボヌクレオチドの導入部位および近くに位置する
   別の部位で開裂することによって直線化し、元のものと
   同じであるかもしくは異なるオリゴまたはポリデオキシ
   リボヌクレオチドを直接または合成アダプターによって
   連結し、一本鎖ＤＮＡ領域をそれ自体公知の方法によっ
   てフィル−インし、そして続いてクローニング工程およ
   び所望により最初のオリゴまたはポリデオキシリボヌク
   レオチドの長さの伸長工程を１回またはそれ以上繰返す
   ことからなる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、出発ベクターとしてＭ１３ｍｐ誘導体を使用し、そ
   してバクテリアとして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０
   １株を使用する特許請求の範囲第１項または第２項記載
   の方法。 ４、使用するベクターが、３′−突出末端を与える制限
   酵素の、接近して位置する多数の認識配列を含み、その
   各配列が前記ベクター内に１回だけ存在する特許請求の
   範囲第１項または第２項記載の方法。 ５、二重鎖領域と、５′−突出末端をもたらすベクター
   の独特の開裂部位に相補的な５′−突出末端と、制限酵
   素（ここで、その認識配列は直線化ベクター中に存在せ
   ず、そして、酵素工程およびクローニング工程の実施後
   に、クローン化ＤＮＡ断片の付着部位において、得られ
   たＤＮＡ領域中に、多くとも１個または２個のヌクレオ
   チドが前記の配列から残るものとする）に特徴的な３′
   −突出末端とをもつアダプターによって一本鎖ＤＮＡ断
   片をベクターに連結する特許請求の範囲第１項または第
   ２項記載の方法。 ６、所望のオリゴまたはポリデオキシリボヌクレオチド
   を含むクローンの選択を、β−ガラクトシダーゼのα−
   ペプチド機能の破壊または回復に基づいて行う特許請求
   の範囲第１項から第５項までのいずれか１項に記載の方
   法。 ７、ベクターＭ１３ｍｐＷ８０１および Ｍ１３ｍｐＷ３２４。 ８、二重鎖領域と、５′−突出末端をもたらすベクター
   の独特の開裂部位に相補的な５′−突出末端と、制限酵
   素（ここで、その認識配列は直線化ベクター中に存在せ
   ず、そして、酵素工程およびクローニング工程の実施後
   に、クローン化ＤＮＡ断片の付着部位において、得られ
   たＤＮＡ領域中に、多くとも１個または２個のヌクレオ
   チドが前記の配列から残るものとする）に特徴的な３′
   −突出末端とをもつアダプター。