KR100925343B1 - 제조가 용이한 중합효소연쇄반응 산물 클로닝 전용의 벡터및 이것의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응 산물의 직접 클로닝에 이용될 수 있는, 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 비상보적 단일 염기 돌출을 형성하는 제한효소에 의한 제조공정에 기반하여 생산되며 클로닝 여부를 청백 콜로니 선별법을 통하여 확인하게끔 설계된 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용의 벡터, 및 이의 제조에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 클로닝 여부를 청백 콜로니 선별법을 통하여 확인하게끔 설계된 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터를, 기존 제조공정에 비하여 공정의 효율성이 획기적으로 개선된 제조공정으로 제조할 수 있다.

중합효소연쇄반응, 클로닝, 벡터, 청백 콜로니 선별법, 제조

Description

제조가 용이한 중합효소연쇄반응 산물 클로닝 전용의 벡터 및 이것의 제조방법{Polymerase Chain Reaction Product-Cloning Vector Suitable to Its Easy Production And Method For Producing The Same}

본 발명은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 산물(product)의 클로닝(cloning) 전용 벡터(vector)에 관한 것으로, 상세하게는, 비상보적 단일 염기 돌출(overhang)을 형성하는 제한효소(restriction enzyme)에 의한 제조공정에 기반하여 생산되며 클로닝 여부를 청백 콜로니 선별법(blue/white colony selection)을 통하여 확인하게끔 설계된 PCR 산물의 클로닝 전용의 벡터와 이의 제조 방법에 관한 것이다.

통상 분자생물학 관련 실험에서는 유전자 취급의 편의성을 도모하고 장기 보관을 위해 벡터라고 하는 유전자 운반체를 이용한다. 이 벡터는 기본적으로 환형(circular)의 이중가닥 DNA(double stranded DNA; dsDNA)이고, 그 구성 요소와 사용 용도에 따라 클로닝벡터(cloning vector), 전사벡터(transcription vector), 번역벡터(translation vector) 등 다양한 종류가 존재한다.

어떤 유전자를 벡터에 삽입시키는 것을 클로닝이라 하며, 클로닝을 위해 사용되어지는 방법 또한 매우 다양하게 개발되었다. 가장 일반적인 방법은 제한효소와 리가아제(ligase)라는 효소 조합을 이용하여, DNA를 자르고 정제한 후 이들 DNA 단편 끼리를 연결시키는 방법이다.

이 방법에서 제한효소는 DNA를 실험자가 원하는 위치에서 자르는 역할을 하고, 리가아제는 잘려진 DNA 단편(fragment) 말단 간의 연결을 매개한다. 이 제한효소와 리가아제를 이용하는 방법에서는, 우선 선택된 제한효소를 이용하여 벡터에 삽입할 DNA의 필요 부분을 잘라 DNA 단편을 제조한다. 또 벡터도 앞서 사용된 것과 동일한 제한효소를 이용하여 절단함으로써 DNA의 삽입 자리(cloning site)를 가진 벡터 단편을 만든다(가끔은 DNA 단편 제조에 사용되는 제한효소와 벡터 단편 제조에 사용되는 제한효소가 서로 다를 경우도 있으나, 이는 일반적인 경우라 할 수는 없다). 이렇게 DNA를 제한효소로 처리하여 자를 때, 이 제한효소가 자르는 DNA의 특정부분을 제한효소 인식서열(recognition sequence)이라고 한다. 이 제한효소 인식서열은 제한효소 인식부위(recognition site)라고도 불리고, 경우에 따라서는 제한효소 작용부위(catalytic site; cleavage site)와도 유사한 의미로 사용된다. 이 제한효소 인식서열은 제한효소마다 제각기 다르다. 따라서 제한효소는 실험자가 자신의 실험에 맞게 선택하여 사용해야 한다. 제한효소 처리에 의해서 잘려진 DNA는 점착성 말단(sticky-end)이나 평활말단(blunt-end) 중 한 가지 형태의 말단을 가진 다.

삽입될 DNA 단편 제조를 위한 제한효소 처리의 경우, 해당 DNA를 제한효소로 처리하면 클로닝에 필요한 부분, 즉 벡터에 삽입될 DNA 단편 부분이 생긴다. 이를 제한효소 처리 반응액으로부터 정제하여 사용한다. 벡터 단편 제조를 위한 제한효소 처리의 경우에서도, 유사하게 제한효소로 벡터를 처리하면, 삽입될 DNA를 받아들일 삽입자리를 가진 벡터의 잘려진 부분 (선형화된 구조임)인 벡터 단편이 생긴다. 이 벡터 단편도 제한효소 처리 반응액으로부터 정제하여 사용한다. 이러한 제한효소 처리 반응액으로부터 벡터 단편을 포함한 DNA 단편의 분리 정제는 상용화되어 있는 유전자 정제용 키트 제품을 이용하여 쉽게 실시할 수 있고, 또한 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자(“당업자”)가 용이하게 실시할 수 있으므로 이에 대한 자세한 설명은 생략한다.

이 분리 정제된 DNA 단편과 분리 정제된 벡터 단편을 서로 연결하기 위해서는, 리가아제 반응용 완충용액(buffer)에 이 둘을 적당한 몰비(mole ratio)로 첨가하고, 여기에 리가아제를 첨가한 후 리가아제 반응(DNA 단편끼리의 연결반응임)을 실시한다. 이렇게 하면 DNA 단편의 말단과 선형화(linearized)된 벡터 단편의 말단이 서로 연결되어 환형의 플라스미드가 형성된다. 이로써 클로닝이 완성된다. 여기서 플라스미드라 지칭하는 것은 환형의 이중가닥 DNA이다.

통상 이렇게 준비된 클로닝 산물(cloning product)만을 리가아제 반응액으로부터 분리 정제하여 다음 단계의 실험에 사용하는 것은 어렵고도 비효율적이다. 또한, 분리 정제했다 하더라도 대부분 다음 단계 실험에 사용하기에는 그 양이 비교 적 적다. 이런 이유로 인하여 대부분의 경우 대장균(Escherichia coli)을 이용한 형질전환법(transformation)을 통하여 충분한 양의 클로닝 산물을 얻는다. 이러한 형질전환은, 열-자극(heat-shock)에 의존한 방식이 가장 일반적이다. 이 외에 전기장을 이용하는 방법도 있으나 플라스미드와 같이 비교적 크기가 작은 것을 이용하여 대장균을 형질전환시킬 때에는 열-자극을 이용하는 방법으로도 충분하다. 이 열-자극에 의존한 형질전환 방법은 통상 다음과 같이 실시된다. 염화칼슘으로 처리된 100 ㎕정도의 세포막이 느슨해진 대장균액 (통상 이를 competent cell이라 함)에 리가아제에 의해 연결반응(ligation)을 실시한 반응액 10 ㎕정도를 첨가한다. 이를 30분 정도 얼음 속에 방치하여 클로닝 산물이 대장균의 표면에 붙게 만든다. 30분이 경과한 후 이를 42℃로 맞추어진 항온 장치로 즉시 옮긴다. 그리고는 1분 정도 방치한다. 이것이 바로 열-자극에 해당한다. 이 때 클로닝 산물이 대장균 속으로 들어간다. 열-자극 후 이를 꺼내어 즉시 얼음 속으로 옮긴다. 이를 얼음 속에서 1분간 방치한다. 이 추가적 1분의 방치 후, 이를 꺼내어 적당한 배양배지(culture medium) 800㎕ 내외를 첨가해 준다. 형질전환 과정에서는 흔하게 LB배지(트립톤, 10 g/L; 효모 추출물, 5 g/L; 염화나트륨, 10 g/L)를 사용한다. 배지 첨가 후, 37℃ 배양기에서 1시간 정도 배양한다. 이 배양 기간 동안 칼슘처리로 손상되었던 대장균의 세포막이 회복된다. 1시간 배양 후 이를 적당한 항생제가 들어 있는 평판배지에 도말(spreading)하고 이를 배양기에서 적당한 크기의 콜로니가 생길 때까지 계속 배양한다. 여기서 콜로니는 하나의 대장균으로부터 계속 증식하여 생긴 다수의 대장균으로 형성된 집합체를 지칭한다. 충분한 크기의 콜로니가 생성되면 형질 전환체(transformant)가 얻어진 것이고 이 형질전환체를 액체배지(통상 LB 배지)로 옮겨 추가 배양한다. 이 배양 세포로부터 충분한 양의 플라스미드를 얻을 수 있다.

이러한 제한효소와 리가아제를 사용하는 전통적인 클로닝 방법을 일부 변형한 다양한 방법이 클로닝의 편리성과 효율성을 높이기 위해 개발되었다. 그 중 본 발명과 관련 있는 기술로는 PCR 산물을 벡터에 삽입할 DNA로 이용하여 클로닝하는 방법이 있다.

PCR은 DNA 중합효소를 이용하는 반응으로 주형(template) DNA의 복사본(amplicon)을 다량 생성시키는 반응이다. 이 PCR은 생물학 관련 연구 및 질병 진단 관련 임상에서 널리 이용되어지고 있는 매우 잘 알려진 기법이다. 이 PCR 산물의 클로닝 방법도 앞에서 설명한 일반적인 제한효소와 리가아제를 이용한 클로닝 방법을 통하여서도 목적한 바를 실현할 수 있다. 그러나 이를 위해서는 제한효소의 인식서열이 인위적으로 들어가게끔 증폭된 PCR 산물이 필요하다. PCR 산물 안으로의 제한효소 인식서열의 도입을 위해서는 특별히 고안된 PCR용 프라이머(primer)의 준비가 필요하다. 이러한 특별한 용도의 프라이머는, 주형에 결합하기 위한 뉴클레오티드(nucleotide) 서열 (이를 프라이밍 서열이라 함) 이외에 실험자가 선택한 제한효소의 인식서열에 해당하는 6-10개 정도의 뉴클레오티드를 부가적으로 포함하고 있어야 한다. 선택한 제한효소의 인식서열이 부가적으로 포함된 프라이머를 이용하여 만들어진 PCR 산물은 벡터 단편과 결합할 연결부위가 보통은 노출되어 있지 않아 직접 벡터 단편에 결합시킬 수는 없다. 이 때문에 해당하는 제한효소로 PCR 산 물을 자른 후에 이를 정제하여 벡터 단편에 결합시키게 된다.

그러나 상기의 방법은 클로닝 대상 DNA로 일반 DNA가 아닌 PCR 산물을 이용할 뿐이지 제한효소와 리가아제를 이용하는 전통적 클로닝 방법과 비교하여 다를 바 없다. 따라서 어떠한 특별한 효과나 편리성을 제공해 준다할 수 없다. 또한 상기 목적의 프라이머는 주형으로 사용되는 목적유전자의 염기서열에 어닐링(annealing)하는 서열 이외의 추가의 뉴클레오티드가 존재하기 때문에 이를 이용한 PCR에서는 주형유전자에 프라이머가 특이적으로 어닐링 되는 효율이 낮아지는 문제가 있다. 또한, 이러한 방법으로 제조되는 PCR 산물에서는 제한효소 인식서열이 PCR 산물의 양 말단에 위치될 수밖에 없기 때문에 제한효소를 이용한 PCR 산물의 절단 시 절단되는 효율이 낮은 단점도 있다. 통상 제한효소의 인식서열이 DNA 서열 중간부분에 위치할 때보다 DNA 서열 말단에 위치할 경우는 그 절단 효율이 떨어진다.

그래서 많은 연구자들은 PCR 산물을 이용하면서도 추가적 작업의 필요성을 없애고 또한 PCR 산물에 대한 제한효소 처리의 비효율성을 회피하기 위해 전통적 클로닝 방법에서 반드시 필요로 했던 제한효소 처리 단계를 생략할 수 있는 방법을 고안하게 되었다. 그 예로, 토포이소머라제 I(Topoisomerase I)의 작용을 이용한 PCR 산물의 클로닝 방법, 및 제한효소 처리가 필요하지 않게끔 PCR 산물의 클로닝에 적합하게 만들어진 벡터를 사용하는 직접 클로닝 방법이 있다.

본 발명과 직접적 관련이 있는 PCR 산물의 클로닝 방법은, 위의 두 예 중 제 한효소 처리 없이 PCR 산물을 직접 선형화된 벡터 단편에 클로닝 하는 후자의 방법이라 할 수 있다. 제한효소 처리 없이 PCR 산물을 직접 클로닝 하고자 할 때 사용되는 선형화된 벡터는 클로닝 하고자 하는 PCR 산물의 말단 형태에 따라 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 하나는 평활말단을 가진 PCR 산물을 직접 클로닝할 수 있도록 고안된 선형화된 벡터 단편을 사용하는 방법이고, 또 하나는 이중 가닥의 상보적 결합 사슬 중 한 가닥의 말단에만 비상보적인 단일 염기 돌출(unpaired single overhang)을 가지는 PCR 산물을 직접 클로닝할 수 있도록 고안된 선형화된 벡터 단편을 사용하는 방법이다.

PCR 산물은 두 가닥의 사슬이 서로 상보적으로 결합된 이중가닥 DNA 형태이며 선형화된 구조(linearized structure)이다. 보통 PCR 산물은 PCR 반응에 사용된 DNA 중합효소(DNA polymerase)에 따라 말단의 형태가 달라진다. 즉, 사용 DNA 중합효소에 따라 평활말단이 될 수도 있고 비상보적인 단일 염기 돌출을 가진 돌출말단이 될 수도 있다. 실험자들은 자신의 실험 목적에 따라 PCR 반응 시, 여러 가지 DNA 중합효소 중 하나를 선택할 수 있다. 이 중 호열성 효소로 PCR에 자주 이용되어지는 Taq DNA 중합효소(Taq DNA polymerase) 및 Tth DNA 중합효소(Tth DNA polymerase) 등은 주형-비의존성 첨가(template-independent addition)를 통하여 양쪽 3'-말단에 비상보적 단일 염기 돌출을 가진 독특한 PCR 산물을 생성한다. 이 비상보적 단일 염기 돌출을 구성하는 핵산 잔기(nucleotide residue)로는 단일 데옥시아데노신 모노포스페이트 잔기(single deoxyadenosine monophosphate residue; dAMP; 본 명세서에서는 편의상 이를 “A”로 표시한다), 단일 데옥시티미딘 모노포 스페이트 잔기(single deoxythymidine monophosphate residue; dTMP, 본 명세서에서는 편의상 이를 “T”로 표시한다), 단일 데옥시구아노신 모노포스페이트 잔기(single deoxyguanosine monophosphate; dGMP; 본 명세서에서는 편의상 이를 “G”로 표시한다), 단일 데옥시시티딘 모노포스페이트 잔기(single deoxycytidine monophosphate residue; dCMP; 본 명세서에서는 편의상 이를 “C”로 표시한다)의 네 가지 핵산 잔기 중 어느 것도 다 될 수 있다. 그 중 빈도가 가장 높은 것은 아데노신 잔기가 돌출되어 있는 A-돌출이다. 이러한 돌출의 결정은 PCR용 프라이머의 구성 염기의 서열에 따라 결정된다(Hu, DNA Cell Biol. 12: 763, 1993; Magnuson et al ., BioTechniques 21: 700, 1996).

평활말단이나 돌출말단 형태의 말단 구조를 가진 PCR 산물의 클로닝에는 앞서 언급했듯이 각각 특별하게 고안된 벡터 (편의상 벡터로 일컫지만 정확히는 벡터 단편임)에 의해 실현된다.

기본적으로 평활말단을 가진 PCR 산물 (또는 돌출을 가졌던 PCR 산물이었더라도 뉴클리아제(nuclease) 처리로 돌출이 제거된 경우도 이에 해당)의 클로닝은 평활말단을 가진 선형화된 벡터 단편만 있으면 가능하다. 이러한 클로닝은 개념상 비교적 단순하다할 수 있다. 통상 평활말단을 가진 선형화된 벡터 단편을 제조할 때 사용가능한 제한효소로는 EcoR V, Dra I, 또는 Hinc II 등이 있다. 이러한 평활말단을 가진 선형화된 벡터 단편과 평활말단을 가진 PCR 산물의 연결은 리가아제를 이용하여 통상의 DNA 단편끼리의 연결방법에서의 조건을 그대로 적용하면 실현된다. 이 방법에서는 벡터 단편끼리의 결합이나 벡터 단편의 분자 내 결합의 발생이 실제 클로닝보다 우세하여 결국 클로닝 효율이 상당히 떨어진다.

한편, 돌출 형태의 말단을 가진 PCR 산물의 클로닝을 위한 벡터 단편의 제작 및 이를 이용한 돌출 형태의 말단을 가진 PCR 산물의 클로닝은 개념상 다소 복잡하다고도 할 수 있다. 돌출말단을 가진 PCR 산물을 클로닝하기 위해서는 평활말단이 아닌 PCR 산물의 말단의 돌출과 짝이 맞는 (즉, 상보적 결합이 가능한 것을 의미) 돌출 형태의 말단을 미리 가진 선형화된 벡터 단편이 필요하다. 이러한 목적을 가진 선형화된 벡터 단편에서의 말단 돌출은 PCR 산물 말단의 돌출과 상보적 결합을 부여하기 위해서 서로 반대 가닥에 위치하고 있어야 한다. 이러한 돌출의 상대적 위치에 대한 이해를 돕기 위해서 벡터 단편 및 PCR 산물에서의 말단 돌출의 상대적 위치에 대한 모식도가 도 1에 제시되어 있다. PCR 산물의 말단에서 A-돌출이 가장 흔하게 발견된다. 이 때문에 벡터 말단 돌출로는 T-돌출이 가장 적합하다. 그렇지만 이를 꼭 지킬 필요는 없고 A-돌출, C-돌출, G-돌출 중 어느 것도 가능하다. 또한 벡터 양말단의 두 돌출을 서로 통일시키는 것이 일반적이지만 이것도 꼭 일치시킬 필요가 없다. 그러나 PCR 산물의 말단에서 A-돌출이 가장 흔하게 발견되기 때문에 그와 상보적인 결합을 유도하기 위하여 벡터의 두 말단을 T-돌출로 맞추는 것이 가장 바람직하다. 따라서 이하에서는 이 T-돌출을 가진 벡터 단편에 대해서 주로 설명할 것이다. 물론 이것은 대상을 하나로 통일하여 설명을 용이하게 하고자 함일 뿐이며 본 발명이 이것에만 국한되지 않음은 당연하다.

돌출말단을 가진 선형화된 벡터 단편을 제조하는 방법은 크게 두 가지로 나 눌 수 있다. 두 가지 경우 모두 환형의 초기벡터(최초 벡터 제작에 필요한 출발 재료 벡터를 의미하며 본 명세서에서는 이를 “초기벡터”로 지칭한다. 일종의 벡터 단편 제조의 모체가 되는 벡터이다)를 재료로 하여 제조가 시작된다. 첫 번째 방법에서는 평활말단을 생성할 수 있는 제한효소를 이용하는 방법이다. 이 방법에서는 평활말단을 생성할 수 있는 제한효소를 사용하여 환형의 초기벡터를 먼저 절단한다. 이 후 평활말단을 가진 선형화된 벡터 단편이 생성되면 이것을 잘 정제한 후 이어지는 별도의 단계에서 선형화된 벡터 단편의 평활말단에 돌출을 추가로 부가(addition)시킨다. 돌출 부가 후 이를 정제하여 사용한다. 이 방법에서 이용될 수 있는 평활말단을 생성하는 제한효소로는 EcoR V, Dra I, 및 Hinc II 등이 있다. 이 방법에서 추가의 돌출을 형성할 때는 Mg2+의 과량 조건 하에서 Taq DNA 중합효소를 사용하거나 (Marchunk, D. et al ., Nucleic Acid Res. 19: 1154. 1991), 또는 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 이용한다(Holton, T.A. et al ., Nucleic Acid Res. 19: 1156, 1991). 그러나 이 두 방법에서는 이들 효소의 활성에 의존하여 벡터 단편 말단의 돌출이 부가되는 효율이 결정된다. 따라서 돌출이 부가되지 않은 불완전한 벡터 단편이 남아있을 가능성이 상당히 높아, 효소 반응 용액 안에는 불완전한 벡터 단편이 상당 정도 포함되어 있을 수 있다. 이러한 돌출이 부가되지 못한 불완전한 벡터 단편은 리가아제 반응에서 자가결합(self-ligation)을 형성할 수 있으며 실질적인 클로닝에는 이용되어 지지 않는다. 따라서 클로닝 효율을 저하시킨다.

두 번째 방법은 제한효소 처리로 잘려지고 남는 초기벡터의 선형화된 부분 자체가 어떠한 추가적 처리 없이도 돌출말단이 형성되게 하는 제한효소를 이용하여 돌출말단을 가진 선형화된 벡터 단편을 제조하는 방법이다(Yoshikazu, I. et al ., Gene 130: 152, 1993; David A.M., et al ., Bio/Technology 9: 65, 1991). 이 때 이용될 수 있는 제한효소의 예로 Ahd I, BciV I, Bfi I, Bfu I, Bmr I, BspOV I, Dri I, Eam1105 I, EclHK I, Hph I, Mbo I, Mnl I, Ncu I, NruG I, Taa I, Tsp4C I, Xcm I 등이 있다. 즉, 돌출말단을 벡터 말단에 직접 생성시킬 수 있는 제한효소 인식서열을 1-2 군데 갖고 있는 벡터를 해당 제한효소로 처리하여 비상보적 단일 염기 형태의 돌출말단을 가진 벡터 단편을 얻는 방법이다. 물론 바람직하지는 않지만 제한효소 인식서열을 벡터 내 여러 군데에 가지고 있어도 가능은 하다. 이럴 경우 유효한 제한효소 인식서열은 여러 개의 제한효소 인식서열 중 벡터에서 잘려나가는 DNA 조각을 기준으로 제일 바깥쪽에 위치한 인식서열이다.

이렇게 준비된 돌출말단을 가진 선형화된 벡터 단편과 역시 돌출말단을 가진 PCR 산물의 클로닝은 앞서 상술한 바와 같이 리가아제 반응용 완충용액에 이 두 가지 단편과 리가아제를 첨가한 후 통상의 리가아제 연결반응을 통하여 실현할 수 있다. 리가아제 반응 후 클로닝 산물의 다량 확보를 위해서는 역시 얻어진 플라스미드를 이용하여 대장균을 형질전환 시키는 방법을 이용한다. 그런데 이때 사용하는 리가아제 연결반응액에는 제대로 클로닝된 플라스미드를 포함하여 대장균 형질전환 단계에서 유효한 또 다른 플라스미드가 존재할 수 있다. 아주 적게 포함되어 있는 것이 일반적이기는 하지만, 돌출말단을 가진 선형화된 벡터 단편의 제작을 위하여 처음에 재료로 사용되어진 초기벡터나 불완전하게 절단된 초기벡터가 다시 원래대 로 회복된 것(즉, 두 군데 제한효소 인식서열 중 한 군데에서만 절단이 되었다가 리가아제 반응에서 다시 초기벡터로 바뀐 것)이 있을 수 있다. 이는 물론 제한효소처리 후의 철저한 분리 정제를 통하여 이론적으로는 완전히 제거될 수도 있지만 실제에서는 이의 완전한 제거가 그렇게 용이하지 않아 일부 포함되는 것이 일반적이다. 통상의 경우, 돌출말단을 가진 선형화된 벡터 단편을 제조하기 위하여 제한효소로 초기벡터를 절단하였을 때 유리되는 유전자 단편이 너무 작다. 따라서 아가로즈 젤을 이용한 전기영동 상에서 불완전하게 절단된 것과 완전하게 절단된 것의 이동거리 차가 작은 문제점이 발생된다. 이러한 경우, 완전하게 절단된 벡터 단편만을 젤-추출법(gel-extraction)을 이용하여 순수 분리하고자 해도 불완전하게 절단된 벡터 단편이나 잘려지지 않은 초기벡터가 섞여 분리되게 된다. 따라서 이에 대한 대책이 필요하다.

통상 실시되는 형질전환에서는 항생제(antibiotics)가 포함된 선택배지(selection medium)를 사용하므로 이 항생제에 대한 내성이 없는, 즉 항생제 내성 유전자를 가진 플라스미드가 없는 대장균은 이 선택배지에서 자랄 수 없다. 이에 따라 형질전환되지 않은 대장균은 근본적으로 선택에서 배제된다. 비록 이렇게 형질전환되지 않은 대장균은 선택배지에서 항생제에 의해서 일차적으로 제거되어 선별 대상에서 배제될 수 있지만, 앞의 불완전하게 절단된 벡터 단편이 재환형화(recirculation)된 것, 초기벡터 자체, 및 클로닝 산물에 의해 형질전환된 형질전환체는 항생제 내성 유전자를 가진 플라스미드를 모두 갖게 되어 결국 항생제를 포함한 선택배지에서 자랄 수 있다. 결국 항생제에 근거한 이들 간의 선별은 불가능하다.

그래서 제대로 클로닝된 산물에 의한 형질전환체만을 구별하기 위해 널리 채택되는 방법이 청백 콜로니 선별법이다. 청백 콜로니 선별법은 형질전환된 대장균의 콜로니가 청색이나 백색을 나타내게 인위적으로 처리하여, 이 처리 결과에 따라 제대로 클로닝된 산물인 플라스미드를 가진 콜로니와 그렇지 않은 콜로니를 구별하는 방법이다. 청백 콜로니 선별법에 사용되어지는 대장균은 청백 콜로니 선별법에 적합하도록 특수하게 조작되어 있어야 하며 이는 당업자에게는 일반적인 내용이므로 이에 대한 설명은 생략한다. 이 청백 콜로니 선별법에 사용되어지는 대장균은 어떠한 플라스미드도 갖고 있지 않을 경우나 갖고 있더라도 알파-펩타이드가 발현되지 않을 경우는 청백 콜로니 선별법에서 백색 콜로니로 나타난다. 그러나 어떠한 플라스미드도 갖고 있지 않은 대장균은 항생제 내성 유전자도 없어 항생제 포함 선택배지에서 자랄 수 없으므로 이는 염려할 필요가 없다. 보통은 클로닝이 일어나지 않은 불완전하게 절단된 벡터 단편의 재환형화된 것이나 초기벡터에 의한 형질전환체는 청색 콜로니가 되게 하고 클로닝 산물에 의한 형질전환체는 백색 콜로니가 되게 한다. 즉, 클로닝이 일어나지 않으면 알파-펩타이드 유전자가 제대로 발현되어 청색 콜로니가 생성되고, 클로닝이 일어나면 알파-펩타이드 유전자가 제대로 발현되지 않아 백색 콜로니로 나타난다.

이 청백 콜로니 선별법은 알파-펩타이드의 작용에 기반하므로 청백 콜로니 선별법이 적용 가능한 플라스미드는 알파-펩타이드를 코딩(coding)한 유전자를 포 함하고 있어야 한다. 물론 이 알파-펩타이드의 발현에 필요한 요소 (해당 프로모터 등)에 관련된 서열도 플라스미드에 당연히 포함되어 있어야 한다. 알파-펩타이드는 베타-갈락토시데이즈의 N-말단 부분이고, 이 알파-펩타이드를 코딩한 유전자 서열이 서열번호 1로 제시되어 있다. 알파-펩타이드는 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 β-D-갈락토피라노시드(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galatopyranoside; X-Gal)라는 물질을 청색을 나타내는 물질로 전환시키는 효소이다. 청백 콜로니 선별법을 실현하기 위해서는 알파-펩타이드가 형질전환에 사용된 플라스미드로부터 발현될 수 있어야 한다. 이러한 목적으로 발현 유도체인 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)가 또한 배지에 첨가되어야 한다.

이상의 이유로 청백 콜로니 선별법을 위해서는 형질전환에 이용되는 플라스미드에 알파-펩타이드의 유전자 서열이 반드시 포함되어 있어야 하며, 통상 이 알파-펩타이드 서열은 클로닝용 벡터 부분에 포함되어 있다. 참고로 이 알파-펩타이드의 유전자 서열은 일부의 변경이 가능하다. 이러한 이유로 많은 상용 클로닝 벡터에서는 이 알파-펩타이드의 유전자를 일부 변경하여 클로닝 부위를 알파-펩타이드의 유전자 내에 삽입시키기도 한다. 이러한 알파-펩타이드의 변경은 무한정 가능한 것은 아니고 실험적으로 조사되어져야만 하며, 이미 허용 가능한 변경의 예가 많이 알려져 있어 이에 준하여 당분야에서는 다양한 변형 서열이 이용되어 지고 있다. 이에 관련된 자료는 당업자라면 쉽게 구할 수 있으므로 본 명세서에서는 이에 대한 상세한 설명은 생략한다.

클로닝이 되지 않은 불완전하게 절단된 벡터 단편이 재환형화된 것과 초기벡터에 의한 형질전환체가 청백 콜로니 선별법에서 청색을 나타내기 위해서는 클로닝이 되지 않은 이들 벡터로부터 알파-펩타이드가 제대로 발현되어야 한다. 이를 위해 가장 우선적으로 필요한 조건은 초기벡터에서 그 해당 알파-펩타이드의 유전자 서열의 뉴클레오티드 수가 3의 배수 개로 구성되어 리딩-프레임(reading-frame)이 바뀌지 않으면서 번역(translation) 되어야 한다. 물론 알파-펩타이드의 일부 서열이 변형되었다 하더라도 이 3의 배수 개의 규칙은 지켜져야 한다. 이에 더하여, 클로닝된 플라스미드에 의한 형질전환체가 백색을 나타내기 위해서는 클로닝으로 벡터에 삽입되는 유전자 부분이 알파-펩타이드의 유전자 안쪽 부분으로 삽입되어야 한다. 즉 클로닝이 알파-펩타이드의 전체적 기능을 파괴하여야 한다. 통상 큰 크기의 유전자가 알파-펩타이드의 유전자 사이에 삽입되면 알파-펩타이드의 기능은 상실된다. 상기 형태로 구현되는 청백 콜로니 선별법은 클로닝 산물을 가진 콜로니를 구별해 내기 위한 방법으로 널리 행하여지고 있다.

그런데 앞서 언급했듯이, PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 제조할 때 초기벡터 및 불완전하게 절단된 벡터 단편과 제대로 절단된 벡터 단편의 분리가 어렵다. 그래서 보통은 섞여있게 된다. 엄밀히 말하자면, 초기벡터에 의한 형질전환체 및 불완전하게 절단된 벡터 단편이 재환형화된 것에 의한 형질전환체와 클로닝 산물에 의한 형질전환체가 청백 콜로니 선별법으로 구분될 수 있기 때문에 이것들의 혼재 자체는 큰 혼란을 야기 시키는 문제가 아닐 수 있다. 그러나 실제로 문제는 제한효소의 비효율성으로 인하여 동량의 초기벡터로부터 얻을 수 있는 클로닝에 유효한 벡터 단편의 양이 적어지는 제조공정의 비효율성에서 비롯된다. 또한, 이렇게 초기벡터나 불완전하게 절단된 벡터 단편이 섞여있는 벡터 단편을 사용하여 클로닝을 수행한다면 실제 클로닝에 참여할 수 있는 유효 벡터 단편이 적으므로 당연히 클로닝 효율이 떨어질 것이다. 절단되지 않거나 불완전하게 절단된 초기벡터로부터 제대로 절단된 벡터 단편만을 분리 회수하는 것이 현실적으로 어렵다면, 벡터 단편 제조 시 제한효소의 효율을 최대화 시켜 상기에 기술한 문제를 최소화 시켜야 할 것이다. 통상 제한효소 인식서열 간의 거리가 가까우면 제한효소의 작용이 방해받아 불완전하게 절단되는 경향이 커진다. 이러한 문제는 근본적으로 벡터 단편 제조공정에 이용되는 제한효소의 인식서열의 사이가 너무 가깝기 때문에 발생한 것이므로 이 제한효소 인식서열 간의 거리를 늘림으로 개선시킬 수 있다. 이 제한효소 인식서열 간의 거리를 증가시키는 것은 인식서열 사이에 추가의 유전자를 삽입함으로써 간단히 실현될 수 있다. 그러나 추가 유전자 삽입은 비록 벡터 단편 제조공정에서의 제한효소 효율을 높이고 또한 제한효소 처리 후 얻어지는 산물의 크기 차이로 인하여 용이한 분리 회수 방법을 제공하기는 하지만, 이런 추가의 유전자 삽입은 청백 콜로니 선별법에서 반드시 필요한 알파-펩타이드의 기능을 망가뜨린다. 알파-펩타이드 서열 사이에 유전자 삽입이 일어난 클로닝 산물에 의한 형질전환체가 청백 콜로니 선별법에서 백색 콜로니로 나타나는 것과 같은 이치이다. 즉 제조공정의 개선을 위하여 추가의 유전자 삽입은, 클로닝 산물에 의한 형질전환체와 초기벡터에 의한 형질전환체가 모두 청백 콜로니 선별법에서 백색 콜로니가 되기 때문에 콜 로니 색에 의한 선별을 불가능하게 만든다.

본 발명자들은 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터의 제조 공정에 있어, 돌출 형성 및 벡터의 선형화를 위해 실시되는 제한효소 처리 단계에서 흔히 발생하던 불완전한 절단 및 벡터 단편 분리의 곤란성에 관련된 문제를 해결하면서도, 설령 불완전하게 절단된 벡터 단편이 재환형화 된 것 및 초기벡터에 의한 형질전환체가 발생하더라도 청백 콜로니 선별법에서 청색을 나타내게 하여 쉽게 구별할 수 있게 하는 방법을 고안하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 이러한 종래기술의 문제점과 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 즉, 본 발명은 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터의 제조 공정에 있어, 돌출 형성 및 벡터의 선형화를 위해 실시되는 제한효소 처리 단계에서 흔히 발생하던 불완전한 절단 및 벡터 단편 분리의 곤란성에 관련된 문제를 해결하면서도, 만약 오염된 초기벡터에 의한 형질전환체나 불완전하게 절단된 벡터 단편이 재환형화 된 것에 의한 형질전환체가 발생하더라도 청백 콜로니 선별법에서 청색을 나타내게 하여 쉽게 구별할 수 있게 하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된, 청백 콜로니 선별법을 가능하게 해주는 비상보적 단일 염기 돌출말단을 가진 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 제공하는 것도 목적으로 한다.

본 발명은 기존 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편의 제조 공정에서, 돌출 형성 및 벡터의 선형화를 위해 실시되는 제한효소 처리 단계에서 흔히 발생하던 불완전한 절단 및 벡터 단편 분리의 곤란성에 관련된 문제를 해결하면서도 오염된 초기벡터에 의한 형질전환체나 불완전하게 절단된 벡터 단편이 재환형화 된 것에 의한 형질전환체가 청백 콜로니 선별법에서 청색으로 나타나게 하여 쉽게 구별할 수 있게 하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은

PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편의 제조에 있어, 재료로 사용되는 초기벡터에 비상보적 단일 염기 형태의 돌출말단을 생성시키고자 이용하는 제한효소의 절단 효율 제고와 절단된 산물의 분리의 용이성을 제고하고, 만약 이의 오염이 발생하더라도 오염된 초기벡터에 의한 형질전환체나 불완전하게 절단된 벡터 단편이 재환형화 된 것에 의한 형질전환체가 청백 콜로니 선별법에서 청색 콜로니로 나타나게 하기 위하여,

1) 서열번호 1로 표시되는 알파-펩타이드의 전체 유전자 서열 및 이의 발현에 필요한 프로모터 서열을 초기벡터에 배치시키고,

2) 1)의 알파-펩타이드 유전자 서열 내에, 비상보적 단일 염기 돌출 형태의 말단을 형성하기 위한 제한효소 인식서열을 2 내지 5 군데 위치시키며,

3) 2)의 비상보적 단일 염기 돌출 형태의 말단을 형성하기 위한 제한효소의 두 인식서열 사이에, 또 하나의 알파-펩타이드 유전자 서열 및 이의 발현에 필요한 프로모터 서열을 배치하여, 최종적으로 벡터 내에 두 개의 알파-펩타이드 서열이 존재하도록 설계하는 것을 특징으로 하는, 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터 제조방법을 제공한다.

본 발명의 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터 제조방법은 하기 실시예 1과 실시예 2에 상세하게 설명되어 있다.

참고로 본 발명에 따른 초기벡터는 바깥쪽 알파-펩타이드 서열 안에 또 하나의 알파-펩타이드 서열이 삽입되어 있고, 이로 인하여 바깥쪽 알파-펩타이드 서열은 두 부분으로 나누어지게 된다. 이는 도 2에 모식적으로 제시되어 있다. 그리고, 이렇게 구성된 서열은 서열번호 4로 표시된다.

이점을 제외하고는 본 발명에서 개시된 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편도 기존의 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터들과 같이 다음의 특징을 가진다.

PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편은 두 가닥의 염기 사슬이 결합되어 있는 선형의 DNA 구조이며 따라서 양 말단을 갖는다. 또 이 양 말단은 한 가닥에만 하나의 비상보적인 단일 염기 돌출을 가지며 그 비상보적인 단일 염기 돌출은 서로 다른 가닥에 존재한다. 그리고 돌출을 형성하는 제한효소의 인식서열이 알파-펩타이드의 유전자 서열 내에 존재하기 때문에 돌출 형태를 가진 말단은 알파-펩타이드 유전자 서열 중 일부가 잘라나가면서 생성되게 된다. 물론 안쪽의 알파-펩타이드는 완전히 제거된다. 앞서 설명했듯이 알파-펩타이드의 유전자 서열은 제한적이기는 하지만 일부 변형이 가능한데, 변형된 형태가 어떤 것이든 간에 그로 인하여 알파-펩타이드 고유의 성질이 바뀌지 않기만 한다면 본 발명은 알파-펩타이드 서열의 변형에 영향을 받지 않으면서 목적한 효과를 나타낼 수 있다.

앞서 설명했듯이 돌출 형태의 말단을 가진 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편은 일반적으로 두 가지 방법을 통하여 준비될 수 있다. 두 경우 모두, 환형의 초기벡터에서 시작된다. 첫 번째는 초기벡터에 평활말단을 생성시키며 절단할 수 있 는 제한효소로 일차적으로 처리하여 절단한 다음, 선형 형태로 절단된 초기벡터의 단편을 잘 분리한 후 양 끝의 평활말단에 돌출을 생성시킬 수 있는 효소를 이용하여 이차적으로 돌출을 만들어 결과적으로 돌출 형태의 양 말단을 가진 벡터 단편을 제조하는 방법이다. 두 번째 방법은 제한효소 처리로 잘려진 자리 자체가 돌출 형태의 말단을 가지게끔 하는 방법이다.

첫 번째 방법처럼 초기벡터를 사용하여 평활말단에 돌출을 부가시키는 방법으로 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터를 제조하는 경우는, 하나의 제한효소로 인식서열 한곳만을 절단하기 때문에 본 발명에서 개시하는 것처럼 초기벡터에 두 개의 알파-펩타이드 서열을 배치시키는 방식을 적용하는 것이 무의미하다.

그러나 두 번째 방법처럼 비상보적인 단일 염기 돌출을 형성할 수 있는 제한효소를 사용하여 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편의 제조 경우에는 본 발명이 매우 유효하다. 지금까지 많은 연구자들이 제한효소 작용을 원활하게 하고 분리 정제의 용이성을 도모하기 위해서는 제한효소의 두 인식서열 사이에 추가의 서열도입이 필요함을 인지하였으나, 이러한 서열의 추가 도입이 청백 콜로니 선별법에서 반드시 필요한 알파-펩타이드의 기능을 상실시키기 때문에 실제로 적용하질 못하고 있었다. 본 발명자들은 이러한 문제를 중합효소연쇄반응 산물 클로닝 전용 벡터 제조의 모체가 되는 초기벡터에 삽입된 바깥쪽 알파-펩타이드 서열 안에 또 하나의 알파-펩타이드 서열을 삽입함으로써 해결하였다.

상기와 같은 특징을 갖는 제조방법에 있어 중합효소연쇄반응 산물 클로닝 전용 벡터 제조에 필요한 초기벡터는 바람직하게는 도 4의 구조를 갖는 것을 특징으 로 한다.

본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명에서 개시된 방법을 따라 제조된 PCR 증폭 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 이용한 경우가 기존 방법에 비하여 상대적으로 좀더 효율적인 클로닝을 제공해 줄 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 벡터 단편의 제조 효율을 높이기 위해 초기벡터의 돌출말단을 형성시키기 위해 선택되어진 제한효소 인식서열 사이에 긴 유전자를 삽입했음에도 불구하고 초기벡터에 의한 형질전환체가 청백 콜로니 선별법에서 청색으로 나타나게 하여, 클로닝 산물을 포함하지 않았음에도 청백 콜로니 선별법에서 백색의 콜로니로 나타나는 문제를 없애준다. 이는 백색 콜로니 중 클로닝 산물을 가진 콜로니의 분율이 그대로 유지되는 사실로부터 확인할 수 있다.

이에 따라 본 발명에 따라 제조된 PCR 증폭 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 사용한다면 클로닝의 효율성을 개선할 수 있으며, 또한 여전히 청백 콜로니 선별법에서 백색 콜로니만을 선별하면 클로닝 산물을 가진 유효 콜로니를 얻을 수 있다.

본 발명은 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터의 효율적 제조 공정을 제공한다. 본 발명에서 개시하는 것처럼 초기벡터에 두 개의 알파-펩타이드 서열을 배치시키면, 안쪽에 배치된 알파-펩타이드 서열로 인하여 비상보적인 단일 염기 돌출 형성을 위해 사용되는 제한효소의 두 인식서열 사이의 거리가 멀어져 제한효소의 작용이 개 선된다. 그리고 부수적으로 제한효소 처리로 생성되는 벡터 단편의 크기가 초기벡터나 불완전하게 절단된 벡터 단편의 크기에서 크게 바뀌게 되기 때문에 분리 정제가 훨씬 용이해 진다. 또한 본 발명에 따른 초기벡터에 의한 형질전환체나 불완전하게 절단된 후 다시 환형의 플라스미드로 된 것에 의한 형질전환체는 안쪽에 배치된 알파-펩타이드 서열로 인하여 청백 콜로니 선별법에서 항상 청색으로 나타나게 되어 이것들의 오염을 걱정할 필요가 없게 된다. 따라서 본 발명은 새로운 유전자의 기능 규명 관련 연구 및 기존 유전자의 응용 연구에 필요한 클로닝에 효과적으로 사용될 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

초기벡터의 준비는 실시예 1에 상세히 설명되어 있고, 실시예 1에서 준비된 초기벡터와 잘려진 자리에 돌출이 형성되는 제한효소를 이용한 비상보적인 단일 염기 돌출 형태의 말단을 가진 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편의 제조는 실시예 2에 상세히 설명되어 있다. 실시예 2에서는 잘려진 자리에 비상보적인 단일 염기 돌출이 형성되는 제한효소로 Xcm I을 사용했는데 본 발명은 이에 국한되지 않으며 이를 대신하여 앞서 설명한 비상보적인 단일 염기 돌출이 형성되는 여러 가지 제한효 소를 하나 또는 하나 이상 조합하여 사용하여도 본 발명을 구현할 수 있다. 또, 실시예 2에서 제조된 비상보적인 단일 염기 돌출 형태의 말단을 가진 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 이용한 클로닝 및 형질전환은 실시예 3에 상세히 설명되어 있다. 실시예 3에는 본 발명에서 개시한 방법에서 벗어나도록 의도적으로 제조된 초기벡터로부터 제조된 벡터 단편과 본 발명을 따른 초기벡터로부터 제조된 벡터 단편을 이용하였다. 이하에서는, 클로닝 대상 유전자로 클로람페니콜 아세틸코에이 트란스퍼라제(Chloramphenicol acetyl CoA transferase; CAT)의 유전자를 사용했으나 이는 단지 응용 가능한 유전자의 한 실례로서 제시된 것에 불과하며, 본 발명이 CAT 유전자에만 한정되는 것은 아니고 PCR로 증폭이 가능한 모든 유전자가 대상이 될 수 있다. 또한 실시예에서는 한 가지 형태의 알파-펩타이드의 유전자 서열에 대해서만 제시하고 있지만, 이는 다양한 유전자 서열이 가능한 알파-펩타이드의 유전자 서열을 대표하는 것으로 본 발명은 이에 한정하지 않고 알파-펩타이드의 고유 기능이 유지된 모든 알파-펩타이드의 유전자 서열의 변형도 대상으로 한다.

실시예 1: 돌출 형태의 말단을 가진 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편의 제조를 위한 초기벡터의 준비

PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 제조하기 위해 필요한 재료인 초기벡터는 기본적으로 일반적인 벡터에 포함되는 요소를 유사하게 포함하고 있어야 한다. 이러한 요소의 예로, 항생제 내성 유전자, 복제 기원(replication origin)을 들 수 있다. 또 본 발명을 실현하기 위해서는 이런 일반적인 요소 외에 청백 콜로니 선별 법을 위한 알파-펩타이드의 발현을 위해 알파-펩타이드의 유전정보를 가진 유전자 서열과 이의 발현을 담당할 프로모터(promoter) 서열이 포함되어 있어야 한다. 그리고 돌출 형태의 말단을 형성하는 제한효소의 인식서열이 최소 두 군데 이상 존재해야 한다. 이때 채택되는 돌출 형태의 말단을 형성하는 제한효소는 상호간 일치시켜도 되고 또한 서로 달리 조합해도 된다. 서로 제한효소가 다를 경우 제한효소 인식서열은 당연히 서로 다를 것인데, 보통 제한효소는 그것의 인식서열을 구성하는 전체 구성서열이 정해져 있으며 이것에서 벗어난 예외가 허용되지 않는 경우가 많지만, 어떤 제한효소의 경우에는 전체 인식서열 중 일부는 변경이 불가하지만 그 나머지 서열에서는 변경이 허용되는 경우도 종종 있다. 따라서 만약 동일한 제한효소를 사용할 경우에도 이 제한효소 인식 서열은 상호 같게 해도 되고 허용되는 범위 안에서 서로 달리 해도 상관없다. 또한, 이 돌출이 형성된 말단을 만들 수 있는 제한효소의 인식서열은 알파-펩타이드 유전자 서열의 안에 위치하는 것이 바람직하다. 통상 알파-펩타이드 유전자는 그 해당 서열의 앞부분 서열에서의 일부 변경이 허용되며 이를 이용하여 여러 가지 제한효소의 인식서열을 위치시키는 것이 일반적으로 알려져 있다. 돌출 형태의 말단을 형성하는 제한효소의 인식서열을 알파-펩타이드의 유전자 서열 안에 위치시킬 때, 통상 벡터들에서 널리 채택되는 다중 클로닝 부위(multi-cloning site; MCS)의 역할을 하는 부위를 만들어 주기 위해 추가의 제한효소 인식서열도 함께 위치시킬 수 있다. 이때는 이들 추가로 삽입되는 제한효소의 인식서열을 돌출 형태의 말단을 형성하는 제한효소의 인식서열 바깥쪽, 즉 제한효소 처리로 잘려나가는 부위가 아닌 곳에 배치시켜야 다중 클로닝 부위의 역할 을 할 수 있다.

본 발명을 따르면, 이에 더하여 초기벡터에 도입된 알파-펩타이드의 유전자 서열 안에 배치되어 있는, 돌출 형태의 말단을 갖게 하기 위해 선택되어진 제한효소의 두 인식서열 사이에 또 하나의 알파-펩타이드 서열 및 이의 발현에 관련된 서열로 구성된 추가의 서열을 삽입시켜야 한다. 본 발명에 개시한 방법을 따르지 않고 설계 제작된 초기벡터와 본 발명을 따른 초기벡터의 예가 개략적으로 도 3과 도 4에 제시되어 있다. 도 3에 표시된 벡터는 돌출 형태의 말단을 갖게 하기 위해 선택되어진 제한효소의 두 인식서열 사이에 통상의 경우와 유사하게 짧은 서열(본 경우에는 GCGGCCGC임)이 삽입된 경우이고, 도 4에 표시된 벡터는 돌출 형태의 말단을 갖게 하기 위해 선택되어진 제한효소의 두 인식서열 사이에 알파-펩타이드의 서열을 포함한 다소 긴 서열(서열번호 2)이 삽입된 경우에 해당한다. 본 실시예에서 돌출 형태의 말단을 갖게 하기 위해 선택되어진 제한효소는 Xcm I이다. 앞서 설명했듯이 Xcm I 외의 다른 제한효소나 몇 가지 제한효소의 조합을 이용할 수도 있다. 이에 대한 응용은 당업자에게는 매우 일반적이므로 특별히 설명하지는 않겠다. Xcm I의 인식서열과 절단 위치는 도 5에 모식적으로 제시되어 있다. 본 실시예에서는 총 2종의 초기벡터를 제작했다. 제한효소 인식서열 사이에 짧은 서열(GCGGCCGC)이 삽입된 것 (초기벡터1)과 제한효소 인식서열 사이에 또 하나의 알파-펩타이드의 서열을 포함한 다소 긴 서열이 삽입된 것 (초기벡터2)이 바로 그것들이다. 본 발명을 따르지 않은 초기벡터1은 본 발명의 효과를 조사하기 위해 준비된 것이다. 초기벡터1에서의 알파-펩타이드 부분의 유전자 서열은 서열번호 3으로, 초기벡터2에서의 알파-펩타이드 부분의 유전자 서열은 서열번호 4로 제시되어 있다. 이에 대한 이해를 돕기 위해 이것들의 모식도를 도 6 (초기벡터1의 경우)과 도 7 (초기벡터2의 경우)에 제시하였다. 본 실시예에서의 알파-펩타이드 유전자 서열은 채택 가능한 여러 알파-펩타이드의 유전자서열 중 선택된 모델 서열일 뿐이다. 초기벡터를 Xcm I 으로 처리하면 초기벡터로부터 알파-펩타이드의 유전자 서열 중 일부가 제거되면서 비상보적인 단일 염기 돌출말단을 가진 벡터 단편이 형성된다. 두 개의 알파-펩타이드 서열이 있는 경우에는 안쪽의 알파-펩타이드 서열은 이 단계에서 완전히 제거된다. 어떤 경우든 이 남겨진 벡터 단편에서 알파-펩타이드의 유전자 서열은 벡터 단편의 양끝의 두 부분에 나누어져 위치하게 된다. 실시예에서 설계 제조된 초기벡터들은 앞에서 설명한 바대로 형질전환법 및 통상의 플라스미드 추출법을 통하여 다량 확보하였다.

실시예 2: 돌출말단을 형성시키며 DNA 를 자를 수 있는 제한효소로 초기벡터를 처리하여 돌출 형태의 양 말단을 가진 선형의 벡터 단편 제조

돌출 형태의 말단을 가진 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 제조하기 위해서, 실시예 1에서 얻어진 초기벡터들을 Xcm I으로 처리하였다. Xcm I 반응은 37℃에서 16 시간 동안 실시하였고, Xcm I 반응은 100 ㎕ 규모로 다음의 조건으로 실시하였지만, 이 규모 및 조건은 실험자에 따라 얼마든지 변경하여 실시할 수 있다. 그러나 통상 제한효소의 판매자가 권하는 방법에 따라 진행하는 것이 가장 편리하다. 제한효소 반응액은 1× 제한효소 완충액(restriction enzyme buffer; New England Biolabs; 10 mM 트리스-염산(Tris-HCl)(pH7.5), 10 mM 염화마그네슘(MgCl2), 1 mM 디띠오뜨레이톨(dithiothreitol; DTT), 50 mM 염화나트륨(NaCl)), 20 ㎍의 초기벡터, 50 유니트의 Xcm I(New England Biolabs), 0.01%의 소 혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA)으로 구성된다. 상기 Xcm I 반응에서는 가능한 완벽하게 초기벡터를 잘라주는 것이 바람직하다. Xcm I 반응에 첨가된 초기벡터의 양이 너무 많거나 Xcm I 양이 너무 적어도 불완전하게 초기벡터가 절단될 수 있다. 완벽하게 초기벡터를 절단해 주기 위해서는 사용하는 초기벡터 양과 Xcm I의 양의 상대적 비를 잘 정하는 것이 중요하다. 본 발명자들이 확인한 바에 따르면, 초기벡터는 0.2 ㎍/㎕의 농도로, Xcm I은 0.5 U/㎕ 이상의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 그러나 이로부터 약간의 벗어남은 Xcm I 반응에 큰 영향을 미치지 않는다. 대략 초기벡터 1 ㎍ 당 Xcm I을 2.5 유니트 이상을 넣어주면 별다른 문제없이 돌출 형태의 말단을 가진 선형의 벡터 단편을 얻을 수 있다. 또한, BSA의 첨가는 Xcm I의 효율을 다소 증가시킨다. 그러나 이것도 반드시 따를 필요는 없다. Xcm I 처리로 생성된 선형의 벡터 단편은 일반적인 젤-용출법(gel-elution)으로 회수하였다. 젤-용출법이란, 제한효소 반응물을 아가로즈 젤을 이용하여 전기영동한 다음, 특정 크기의 DNA만이 존재하는 젤 부분을 일차적으로 잘라낸 다음 이로부터 DNA를 회수하는 방법이다. 이때 사용할 수 있는 젤-용출용 제품이 다양하게 상용화되어 있으며 이를 이용한 DNA 회수는 당업자에게는 매우 일반적인 방법이므로 특별히 설명하지 않겠다. 이 선형화된 벡터 단편의 회수에는 젤-용출법 외에 크로마토그라피법 및 알코올 침전법 등을 대체하여 사용할 수도 있다.

그런데 상기의 결과는 본 발명에서 개시한 방법을 따라 설계 제작된 초기벡터2에 해당하는 것이다. 본 발명에서 개시한 바를 의도적으로 따르지 않으면서 설계 제작된, 통상의 방법을 대표하는 초기벡터1의 경우에는 제한효소의 두 인식서열 사이가 너무 가까워서 제한효소에 의한 절단 효율이 낮아 완전한 절단이 어려울 뿐 아니라 완전히 절단된 것과 불완전하게 절단된 것을 아가로스 젤 전기영동으로 구별조차 하기 어려워 유효한 벡터 단편만을 분리 회수하는 것도 불가능 하였다. 제한효소 인식서열 간의 가까운 거리로 인하여 제한효소의 절단 효율이 저하되고 있음을 동량의 초기벡터1과 초기벡터2에 대하여 준비된 벡터 단편을 이용한 형질전환의 결과로부터 간접적으로 확인할 수 있었다.

이를 상세히 설명하면, 동량의 초기벡터를 이용한 제한효소 처리액을 이용하여 리가아제 연결반응 없이 바로 형질전환을 실시하였다. 형질전환은 통상의 방법에 따라 DH5α를 형질전환시켰으며, 형질전환 후, 항생제가 포함된 평판배지에 형질전환된 대장균을 도말하였다. 모든 과정의 조건은 초기벡터1과 초기벡터2에 동일하게 적용 해 주었다. 그 결과는 다음과 같다. 다음의 결과는 3회의 평균값이고 각 실험에서의 편차는 10% 미만이었다.

	초기벡터1의 제한효소 처리액을 이용한 경우 (본 발명을 따르지 않은 경우)	초기벡터2의 제한효소 처리액을 이용한 경우 (본 발명을 따른 경우)
생성된 콜로니 수	252	33

상기 결과에 의하면, 초기벡터1의 경우는 콜로니가 많이 생성되는 반면에, 초기벡터2의 경우는 초기벡터1의 경우에 비하여 상당히 감소된 수의 콜로니가 생겼다. 이는 초기벡터2를 이용한 제한효소 반응액에는 제한효소에 의해 잘려지지 않은 원래 상태의 초기벡터가 초기벡터1을 사용한 경우에 비하여 상당히 적게 포함되어 있음을 나타낸다. 이 결과는 돌출말단 형성을 위해 선택되어진 제한효소의 두 인식서열 사이에 또 하나의 알파-펩타이드 서열을 포함한 추가의 유전자 삽입이 제한효소 작용의 증진 및 제한효소 처리 산물의 분리에 효과적임을 보여 준다 할 수 있다.

실시예 3: 돌출 형태의 말단을 가진 PCR 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 이용한 실제 클로닝 및 형질전환

실시예 2에서 준비된 비상보적 단일 염기 돌출 형태의 말단을 가진 벡터 단편을 이용한 클로닝 및 형질전환을 다음과 같이 실시하였다. 먼저, CAT 유전자를 모델유전자로 하여 클로닝할 PCR 산물을 준비하였다. CAT의 유전자 서열을 가지고 있는 플라스미드인 pK7-CAT(Kim, D.M. et al ., Eur. J. Biochem. 239, 881, 1996)를 주형으로 하여 DNA 합성법으로 제조한 프라이머 (서열번호 5:　5‘-ATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACA-3') 와 (서열번호 6: 5‘-TTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAG-3')를 사용한 PCR로 CAT 유전자의 증폭 산물을 얻었다. 이때 사용한 PCR 반응액의 조성은 다음과 같다. 즉, 50 ㎕ 반응액당, 5 ㎕의 10×PCR용 완충액 (인트론바이오테크놀로지), 5 ㎕의 25 mM 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 혼합물, 10 pmol의 상기의 각 프라이머, 2.5 유니트의 Taq DNA 중합효소, 그리고 10 ng의 주형을 사용하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분, 52℃에서 45초 및 72℃에서 1분간의 순환(cycle)을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응을 지속시켰다. CAT 유전자의 PCR 산물은 전기영동을 실시한 후 앞에서 설명한 젤-용출법으로 회수하였다. 물론 이 PCR 산물은 페놀 추출과 에탄올 침전을 통하여 정제할 수도 있고, 또 통상 제품으로 판매되고 있는 PCR 산물 정제 전용 키트를 사용하여 정제할 수도 있다. 그러나 젤-용출법을 통하여 정제하면 정확한 크기를 가진 PCR 산물만의 회수가 가능하여, 여러 가지 이유로 잘못되게 증폭된 PCR 산물의 오염을 상당히 감소시킬 수 있는 장점이 있다. 실시예 2에서 준비된 PCR 산물의 클로닝 전용 선형화된 벡터 단편과 앞에서처럼 준비된 CAT의 PCR 산물을 리가아제를 이용하여 연결시켰다. 본 비교 실험에서 사용된 PCR 산물의 클로닝 전용의 선형화된 벡터 단편은 본 발명의 개시 방법을 따라 준비된 것 (초기벡터2로부터 제조된 벡터 단편)과 본 발명에서 개시한 방법을 따르지 않고 준비된 것 (초기벡터1로부터 제조된 벡터 단편; 즉, 대조 벡터 단편) 두 가지였고 이 벡터 단편들도 역시 젤-용출법을 통하여 정제한 것을 사용하였다.

리가아제 반응에 사용한 완충액으로는 인트론바이오테크놀로지의 리가아제 반응용 완충액(30 mM 트리스-염산(pH7.5), 0.1 mM ATP, 10 mM 염화마그네슘, 10 mM 디띠오뜨레이톨)을 사용했으며 16℃에서 밤새도록 반응시켜 CAT의 PCR 산물을 벡터 단편과 연결시켰다. 그 후 리가아제 반응액을 직접 이용하여 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환 후, 항생제가 포함된 평판배지에 미리 IPTG와 X-Gal을 도포한 다음 여기에 형질전환된 대장균은 도말하였다. 이를 배양기에서 한밤 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 이후 콜로니의 색깔을 관찰하여 백색을 나타내는 콜로니만을 선별하였다. 선별된 콜로니는 다시 적당한 항생제가 포함된 액체 배지에 접종하여 추가로 진탕배양(shaking incubation)을 실시한 후, 이 배양 세포로부터 PCR 산물이 도입된 클로닝 산물인 해당 플라스미드를 통상의 플라스미드 추출법을 통하여 다량 확보하였다.

이렇게 백색 콜로니의 배양 세포로부터 추출된 플라스미드가 제대로 클로닝된 플라스미드인가를 알아보기 위해 PCR에 기반한 조사와 제한효소 반응에 기반한 조사를 병행하여 실시했다. PCR에 기반한 조사를 위해 사용한 PCR 조건은 앞에서 CAT의 PCR 산물을 준비할 때 사용한 PCR 방법과 동일하였다. PCR 반응 후, 반응액 중 1 ㎕를 취하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후, 통상의 방법으로 DNA 를 염색하고 자외선 조사로 DNA를 관찰하여 PCR 산물이 생겼는가를 조사하였다. PCR 증폭 산물이 생겼으면 클로닝이 제대로 된 것이고 생기지 않았으면 클로닝이 제대로 되지 않은 것으로 판정하였다. 또 추출된 플라스미드를 적절한 제한효소로 처리하여 유리되는 절편의 크기를 확인하여 클로닝 여부를 판정하였다. 이때 사용하기에 적합한 제한효소는 클로닝된 유전자의 바깥쪽, 즉 Xcm I 인식서열의 바깥에 위치한 제한효소들 중에서 양쪽에서 하나씩 선정하였다. 그 결과 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다.

구분	조사방법	콜로니 수		백색 콜로니 중 클로닝 산물을 가진 콜로니 분율 (%)
		청색 콜로니	백색 콜로니
본발명에서 개시된 방법을 따르지 않은 경우 (초기벡터1로부터 제조된 벡터 단편 이용 경우)	PCR	273	8	100
		268	10	90
		259	11	90
	제한효소 처리	264	15	93
		271	10	90
		268	12	91
본발명에서 개시된 방법을 따른 경우 (초기벡터2로부터 제조된 벡터 단편 이용 경우)	PCR	75	300	96
		62	290	100
		88	285	96
	제한효소 처리	61	278	100
		69	302	100
		81	262	98

이상의 결과를 보면, 초기벡터1로부터 제조된 벡터 단편을 이용하는 경우는 지나치게 많이 청색 콜로니가 생성되며, 이로 인하여 전체 콜로니 중 백색 콜로니의 비율이 상대적으로 매우 낮다. 초기벡터1로부터 제조된 벡터 단편이나 초기벡터2로부터 제조된 벡터 단편을 이용하는 경우 모두, 백색 콜로니 중 클로닝 산물을 가진 콜로니의 분율에서 알 수 있듯이 백색 콜로니는 대부분 유효 클로닝을 가진 유효 콜로니이기는 하지만, 초기벡터1로부터 제조된 벡터 단편을 이용하는 경우는 클로닝 효율이 초기벡터2로부터 제조된 벡터 단편을 이용하는 경우에 비하여 상대적으로 매우 낮다고 할 수 있다. 이는 제한효소의 불완전 절단의 결과로부터 초래된 것이다.

이상의 결과로, 본 발명에 따라 제조된 PCR 증폭 산물의 클로닝 전용 벡터 단편이 제대로 작동함을 확인할 수 있었으며, 이에 더하여 본 발명에서 개시된 방법을 따라 제조된 PCR 증폭 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 이용한 경우가 기존 방법에 비하여 상대적으로 좀더 효율적인 클로닝을 제공해 줄 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 본 발명은 벡터 단편의 제조 효율을 높이기 위해 초기벡터의 돌출말단을 형성시키기 위해 선택되어진 제한효소 인식서열 사이에 긴 유전자를 삽입했음에도 불구하고 초기벡터에 의한 형질전환체가 청백 콜로니 선별법에서 청색으로 나타나게 하여, 클로닝 산물을 포함하지 않았음에도 청백 콜로니 선별법에서 백색의 콜로니로 나타나는 문제를 없애준다. 이는 백색 콜로니 중 클로닝 산물을 가진 콜로니의 분율이 그대로 유지되는 사실로부터 확인할 수 있다. 이에 따라 본 발명에 따라 제조된 PCR 증폭 산물의 클로닝 전용 벡터 단편을 사용한다면 클로닝의 효율성을 개선할 수 있으며, 또한 여전히 청백 콜로니 선별법에서 백색 콜로니만을 선별하면 클로닝 산물을 가진 유효 콜로니를 얻을 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 비상보적인 뉴클레오티드 돌출 부위를 가진 벡터 단편과 역시 비상보적인 뉴클레오티드 돌출 부위를 가진 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝을 모식적으로 보여 주는 그림이다. 도 1에서 ●와 ◆는 서로 상보적 결합이 가능한 염기쌍이다.

도 2는 본 발명의 방법에 따라 설계된 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터의 핵심 요소인 두 개의 알파-펩타이드 유전자 서열의 설계 시에 고려되어야 하는 점을 도식적으로 보여 주는 그림이다.

도 3에는 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터 제조를 위한 최초 출발 벡터 재료인 초기벡터 중 제한효소의 인식서열 사이에 짧은 서열이 삽입된 구조에 대한 개략적 모식도가 제시되어 있다.

도 4에는 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터 제조를 위한 최초 출발 벡터 재료인 초기벡터 중 제한효소의 인식서열 사이에 또 하나의 알파-펩타이드의 서열을 포함한 다소 긴 서열이 삽입된 구조에 대한 개략적 모식도가 제시되어 있다.

도 5는 제한효소 Xcm I의 인식서열 및 Xcm I에 의한 절단 형태를 보여주는 모식도인데, Xcm I의 인식 서열은 총 15개의 뉴클레오티드로 구성되며 최초의 CCA 다음의 5번째 뉴클레오티드 위치를 절단한다. 즉, Xcm I은 전체 15개의 뉴클레오티드로 구성된 인식서열 중 처음의 CCA와 끝의 TGG만 인식하며 그 사이의 뉴클레오티드는 종류는 상관없고 다만 CCA와 TGG 사이의 뉴클레오티드의 숫자만 9개로 맞으면 된다. 도 5에서의 N은 A, C, G, T의 네 가지 뉴클레오티드 중 어떤 것이어도 상관없음을 의미하며, 이 N으로 표시된 뉴클레오티드는 결합된 또 하나의 가닥의 뉴클레오티드와 상보적인 염기쌍으로 짝지어져 있어야 한다.

도 6은 비상보적인 단일 염기 돌출을 생성하는 제한효소 인식서열 사이에 짧은 서열(GCGGCCGC)이 삽입된 초기벡터 (초기벡터1)에서의 알파-펩타이드 유전자 서열의 모식도이다.

도 7은 비상보적인 단일 염기 돌출을 생성하는 제한효소 인식서열 사이에 또 하나의 알파-펩타이드의 서열을 포함한 다소 긴 서열이 삽입된 초기벡터 (초기벡터2)에서의 알파-펩타이드 유전자 서열의 모식도이다.

<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Polymerase Chain Reaction Product-Cloning Vector Suitable to its Easy Production And Method for Producing the same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 273 <212> DNA <213> alpha peptide <400> 1 atgggggatc ccaagcttct tctagaggta ccgcatgcga tatcgagctc tcccgggaat 60 tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 120 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 180 cgcccttccc aacagttgcg cagcctgatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg 240 agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tag 273 <210> 2 <211> 466 <212> DNA <213> long sequence containing alpha peptide which inserted in restriction enzyme <400> 2 gcggccgctt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 60 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 120 tacgccaagc ttgcatgcct gcagtctaga ccggaattca ctggccgtcg ttttacaacg 180 tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 240 cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 300 cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc 360 acaccggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca 420 cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtcgc ggccgc 466 <210> 3 <211> 450 <212> DNA <213> alpha peptide part sequence of vector 1 <400> 3 atgaccatga ttacgccaag ctcgaaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc 60 tccaccgcgg tggcggccgc tctagaacta gtggatcccc cgggctgcag gaattcgata 120 tcaagcttcc agagctcagt tgggcggccg cccagacgag acgtggcaag cttatcgata 180 ccgtcgacct tcaggggggg cccggtaccc aattcgccct atagtgagtc gtattacaat 240 tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 300 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 360 cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc aaattgtaag cgttaatatt 420 ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 450 <210> 4 <211> 908 <212> DNA <213> alpha peptide part sequence of vector 2(present invention) <400> 4 atgaccatga ttacgccaag ctcgaaatta accctcacta aagggaacaa aagctggagc 60 tccaccgcgg tggcggccgc tctagaacta gtggatcccc cgggctgcag gaattcgata 120 tcaagcttcc agagctcagt tgggcggccg cttagctcac tcattaggca ccccaggctt 180 tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca 240 caggaaacag ctatgaccat gattacgcca agcttgcatg cctgcagtct agaccggaat 300 tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat 360 cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat 420 cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc gcctgatgcg gtattttctc 480 cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 540 gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt 600 cgcggccgcc cagacgagac gtggcaagct tatcgatacc gtcgaccttc agggggggcc 660 cggtacccaa ttcgccctat agtgagtcgt attacaattc actggccgtc gttttacaac 720 gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt 780 tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca 840 gcctgaatgg cgaatggcaa attgtaagcg ttaatatttt gttaaaattc gcgttaaatt 900 tttgttaa 908 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> CAT primer 1 <400> 5 atggagaaaa aaatcactgg atataca 27 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> CAT primer 2 <400> 6 ttacgccccg ccctgccact catcgcag 28

Claims (5)

1. 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터 제조방법에 있어서,

   1) 서열번호 1로 표시되는 알파-펩타이드의 전체 유전자 서열 및 이의 발현에 필요한 프로모터 서열을 초기벡터에 배치시키고,

   2) 1)의 알파-펩타이드 유전자 서열 내에, 비상보적 단일 염기 돌출 형태의 말단을 형성하기 위한 제한효소 인식서열을 2 내지 5 군데 위치시키며,

   3) 2)의 비상보적 단일 염기 돌출 형태의 말단을 형성하기 위한 제한효소의 두 인식서열 사이에, 또 하나의 알파-펩타이드 유전자 서열 및 이의 발현에 필요한 프로모터 서열을 배치하여, 최종적으로 벡터 내에 두 개의 알파-펩타이드 서열이 존재하도록 설계하는 것을 특징으로 하는, 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터 제조방법.
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 바깥쪽 알파-펩타이드 서열 안에 또 하나의 알파-펩타이드 서열이 삽입되어 있고, 이로 인하여 바깥쪽 알파-펩타이드 서열은 두 부분으로 나누어지어 도 2의 구조를 갖도록 설계되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제 1 항의 제조방법에 의해 제조된 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝 전용 벡터.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 벡터는 도 4의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 초기벡터로부터 제조된 중합효소 연쇄반응 산물 클로닝 전용 벡터.

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