FI115972B

FI115972B - Stabiloidut entsyymit ja detergenttikoostumukset

Info

Publication number: FI115972B
Application number: FI934811A
Authority: FI
Inventors: Allan Svendsen; Sven Branner; Nina Eriksen; Der Osten Claus Von; Lisbeth Hedegaard; Maarten Robert Egmond; Eric Casteleijn
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1991-05-01
Filing date: 1993-10-29
Publication date: 2005-08-31
Also published as: WO1992019729A1; ATE168130T1; DE69226182D1; KR100258460B1; DE69226182T2; FI934811A0; JP4050654B2; JP2003289891A; EP0583339A1; JPH06506832A; JP3471797B2; ES2121014T3; US5858757A; DK0583339T3; FI934811A; EP0583339B1

Description

115972

Stabiloidut entsyymit ja detergenttikoostunnukset - Stabi-liserade enzymer och detergentföreningar Tämä keksintö koskee uusia stabiloitua subtilisiinejä, 5 nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat uusia stabiloituja subtilisiinejä ja isäntäorganismeja, joissa on nukleotidi-sekvenssit, jotka koodaavat uusia stabiloituja subtilisii-neja.

10 Proteaasit tai (vaihtovuoroisesti) peptidaasit ovat entsyymejä, jotka pilkkovat amidisidokset proteiinisubstraa-teissa. Bacillus-lajien bakteerit erittävät kahta solun-ulkoista proteaasilajia, neutraalia tai metalloproteaasia ja alkaalista proteaasia, joka on toiminnallisesti serii-15 niendopeptidaasi, johon viitataan subtilisiininä.

Seriiniproteaasi on entsyymi, joka katalysoi peptidisi-dosten hydrolyysiä ja jossa on olennainen seriinijäännös aktiivisessa kohdassa [White, Handler ja Smith (1973); 20 Principles of Biochemistry; 5. toimitus, McGraw-Hill Book

Company, NY, 271-272],

Bakteerin seriiniproteaasien molekyylipainot ovat alueel-la 20 000-45 000. Ne hydrolysoivat yksinkertaisia termi-, . 25 naalisia estereitä ja ovat samankaltaisia aktiivisuudessa ‘ ; kuin eukaryoottinen kymotrypsiini, myös seriiniproteaasi.

tarkemmin, alkaalinen proteaasi, käsittäen alaryhmän, * ·* heijastaa korkeata pH-optimia joillekin seriini-proteaa- V : seille, pH 9,0-11,0 [katsausta varten katso Priest; 30 Bacteriological Rev., 41 711-753 (1977)].

Suhteessa tähän keksintöön on subtilisiini seriiniproteaasi, jota tuottavat gram-positiiviset bakteerit tai ho-];; meet. Erään toisen määrityksen mukaisesti subtilisiini on 35 seriiniproteaasi, missä aminohappo jäännösten suhteellinen ;· järjestys katalyyttisessä triadissa on Asp-His-Ser (ase- mat 32, 64 ja 221). Lukuisia subtilisiinejä on tunnistet- 2 115972 tu ja aminohapposekvenssit lukuisista subtilisiineistä on määritetty. Näihin kuuluvat muun muassa 6 subtilisiiniä Bacillus-kannasta. nimittäin substilisiini 168, subtili-siini BPN', subtilisiini Carlsberg, subtilisiini DY, sub-5 tilisiini amylosakkaritikus ja mesenterikopeptidaasi [Ku- rihara et ai. (1972); J. Biol. Chem.; 247 5629-5631;

Wells et ai. (1983); Nucleic Acids Res.; 11 7911-7925; Stahl ja Ferrari (1984); J. Bacteriol.; 159 811-819; Jacobs et al., (1985); Nucl. Acids Res.; 13 8913-8926; Ned-10 kov et al., (1985); Biol. Chem. Hoppe-Seyler; 366 421- 430;Svendsen et al. (1985); FEBS LETTRES; 196 228-232] yksi subtilisiini aktinomyketaaleista, termitaasi Thermo-actinomyces vulgaris [Meloun et al. (1985); FEBS LETTERS; 1983 195-200] ja yksi homesubtilisiini, proteinaasi K 15 Tritirachium album [Jany ja Mayer (1985); Biol. Chem.

Hoppe-Seyler; 366 584-492].

Proteaaseilla, kuten substilisiinit, on paljon hyötyä teollisuudessa, erityisesti detergenttiformulaatioissa, 20 sillä ne ovat hyödyllisiä poistettaessa proteiinipitoisia tahroja.

Entsyymit ovat pallomaisia proteiineja ja melko tiiviitä ·;··. johtuen melkoisesta pitkän polypeptidiketjun laskostumi- .•25 sen määrästä. Polypeptidiketju sisältää olennaisesti ,y. "selkärangan" ja sen "sivuryhmät". Koska peptidisidos on levymäinen, ovat vain pyörimiset Ca -N-akselin ja Ce-C'-!!'' akselin ympäri sallitut. Pyöriminen peptidin selkärangan

Ca-N-sidoksen ympäri on merkitty vääntökulmalla φ (phi), '•*30 pyörimistä, pyörimistä Ca-C'-sidoksen ympäri merkitään φ (psi) [katso esim. Creighton, T.E. (1984), Proteins; W.H.

t » · ; .* Freeman and Company, New York]. Näiden kulmien kiertymi- V : sen arvojen valinta tehdään antamalla +180° maksimiarvo . ·. (joka on identtinen -180°:n kanssa) maksimaalisesti jat- '35 ketulle ketjulle. Täysin jatketussa polypeptidiketjussa N-, C„- ja C'-atomit ovat kaikki "trans" toisiinsa.

V ‘ "Cis"-konfiguraatiossa kulmille φ ja φ annetaan arvo 0°.

1 » * I * 3 115972

Pyöriminen tästä asemasta sidosten ympäri siten, että atomit nähtynä kiertyneen sidoksen takaa liikkuvat "vastapäivään", ovat merkitykseltään negatiivisia arvoja, "myötäpäivään" annetaan positiiviset arvot. Täten vääntö-5 kulmien arvot ovat alueella -180° - +180°.

Koska Ca-atomit ovat ketjun saranaliitos, tulevat sivu-ryhmät (R-ryhmät), jotka ovat liittyneet Ca-atomien kanssa, äärettömän tärkeiksi suhteessa molekyylin konformaa-10 tioon.

Termi "konformaatio" kuvaa polypeptidiketjujen sekundääristen ja tertiääristen rakenteiden liittymistä proteiinin kokonaisrakenteen muovaukseen. Proteiinin oikealla 15 konformaatiolla on merkitys proteiinin spesifiseen raken teeseen ja myötävaikuttaa suuresti entsyymien ja niiden stabiilisuuden ainutlaatuisiin ominaisuuksiin (s.o. aktiivisuus ja spesifisyys).

20 Polypeptidien aminohapot voidaan jakaa neljään yleiseen ryhmään; ei polaariset, varauksettomat polaariset ja negatiivisesti tai positiivisesti varautuneet polaariset aminohapot. Proteiinimolekyyli upotettuna sen vesipitoi-seen ympäristöön, jossa se normaalisti on, on taipuvainen ;'2j5 laittamaan esille maksimaalisen määrän sen polaarisia si- V. vuryhmiä ympäröivään ympäristöön, kun taas suurin osa sen « i ei-polaarisista sivuryhmistä on suuntautunut sisäänpäin. m", Sivuryhmien suuntautuminen tällä tavoin johtaa proteiini- i « ‘y konformaation stabilointiin.

k » · ’30

Proteiinit esiintyvät täten dynaamisessa tasapainossa i ·' laskostetun ja järjestyneen ja laskostumattoman ja epä- V · järjestyksessä olevan tilan välillä. Tämä tasapaino hei- . ·. jastaa osittain lyhyen välin vuorovaikutuksia polypepti- a » i ,3¾ diketjun eri segmenttien joukossa, millä on taipumusta stabiloida proteiinien kokonaisrakenne. Termodynaamiset i i t 1 voimat ovat taipuvaisia edistämään ei-laskostuneen mole-

I - I

4 115972 kyylin satunnaistumista.

Tapa manipuloida stabiloituneita proteiineja, on vähentää laskostumattomuuden ulottuvuutta vähentämällä polypepti-5 diselkärangan joustavuutta ja samanaikaisesti vähentämäl lä laskostumattoman ketjun entropiaa. Tähän mennessä on tehty vain muutamia yrityksiä toteuttaa tämä periaatteiden selitys uusien stabiloitujen entsyymien kehityksessä.

10 [Suzuki, Y. (1989); Proc. Japan Acad.; 65 sarja B] antaa yleisen periaatteen lisätä proteiinin lämpöstabiilisuut-ta. Tässä artikkelissa Suzuki esittää, että pallomaisen proteiinin lämpöstabiilisuutta voidaan lisätä kumulatiivisesti suuressa määrin lisäämällä proliinin esiintymistä 15 β-käänteiden toisella sivulla ilman merkittäviä muutoksia sekundäärisissä ja tertiäärisissä rakenteissa yhtä hyvin kuin entsyymien katalyyttisessä toiminnassa. Periaate perustuu erilaisiin tosiasioihin ja havaintoihin, muun muassa tosiasia, että proliinijäännökset osoittavat suurta 20 taipumusta esiintyä etuoikeutetusti β-käänteiden toisella sivulla [Levitt, M (1978); Biochemistry; 17 4277-4285; ja Chou, P.Y. & Fasman, G.D (1977); J. Mol. Biol. 115 135-175]. Periaate rajoittuu proliinin insertioon B-kääntei-den toiselle sivulle proteiineissa, muita sivuja ei mai- .,25 nita.

. , Kansainvälinen patenttijulkaisu WO 89/01520 (Cetus Corpo- ration, USA) tarjoaa menetelmän lisätä proteiinin stabii-lisuutta vähentämällä konfigurationaalista entropiaa pur- t · * 1 10 kamalla proteiinin laskostumisen. Menetelmää käytetään • · » V : Streptomyces rubiqinosus ksyloosi-isomeraasiin ja siihen sisältyy aminohapon substituutio proliinilla tai glysii-nin korvaaminen alaniinilla ennustettaviin kohtiin.

t I · .35 Kansainvälinen patenttijulkaisu W0 89/09819 (Genex Corpo- '···' ration, USA) tarjoaa menetelmän yhdistää mutaatiot subti- * * lisiinien stabiloimiseksi. Julkaisu luettelee joukon ami- 5 nohappomutaaatioita, joiden on havaittu olevan termisesti stabiloivia mutaatioita. Luetteloon kuuluu seriinin substituutio proliinilla subtilisiinien asemaan 188 (BPN1 numerointi) . * 5 Kansainvälinen patenttijulkaisu W0 87/05050 (Genex Corpo ration, USA) kuvaa menetelmän mutageneesiä ja seulontaa varten. Tällä menetelmällä viedään yksi tai useampi mutaatio käsittelemällä mutagenisoivilla aineilla ja menetelmään kuuluu sen jälkeinen tuotteiden, joilla on muut-10 tuneet ominaisuudet, seulonta. Satunnaisen mutageneesin seurauksena saadaan subtilisiini, jolla on proliini asemassa 188 (BPN' numerointi). Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on kuvattu oheisissa patenttivaatimuksissa.

Tämän keksinnön tarkoitus on tarjota uusia proteaaseja, 15 joilla on parantunut stabiilisuus.

Tämä keksintö tarjoaa uusia stabiloituneita proteaaseja, joissa luonnossa esiintyvä aminohappojäännös (muu kuin proliini) on substituoitu proliinijäännöksellä yhdessä tai useammassa asemassa, missä asemassa (asemissa) diedrikulmat 20 φ (phi) ja ijj(psi) muodostavat suureet välille [-90°< cp <- , 40°C ja -180°< ψ <180°] , edullisesti välillä [-90°< φ <-40° ; / ja 120°< ψ <180°] tai [-90°< φ <-40° ja -50°< ψ <10], ja mi- * * · '’·* (t)kä asema (t) ei (vät) sijaitse alueilla, missä proteaasin on karakterisoitu omistavan cc-helikaalisen tai β-levyraken- : ,· 2 5 teen.

• * ·

Toisessa näkökohdassa keksintö koskee nukleotidisekvensse-: t-< jä, jotka koodaavat proteaaseja. Muissa näkökohdissa kek- sintö koskeee ekspressiovektoria, jossa on nukleotidisek- » » venssi, joka koodaa proteaasia ja isäntäorganismia, jossa 30 on tämä ekspressiovektori.

’ Subtilisiini t .Tämän keksinnön yhteydessä subtilisiini on kuvattu se-riiniproteaasiksi, jota gram-positiiviset bakteerit tai β 115972 homeet tuottavat. Erään toisen määrityksen mukaisesti subtilisiini on seriini-proteassi, missä aminohappojäännösten suhteellinen järjestys katalyyttisessä triadissa on Asp-His-Ser (asemat 32, 64 ja 221, BPN' numerointi).

5

Aminohapot

Aminohappojen lyhenteinä käytetään seuraavia symboleja: A = Ala = Alaniini C = Cys = Kysteiini 10 D = Asp = Aspartiinihappo E = Glu = Glutamiinihappo F = Phe = Fenyylialaniini G = Gly = Glysiini H = His = Histidiini 15 I = Ile = Isoleusiini K = Lys = Lysiini L = Leu = Leusiini M = Met = Metioniini N = Asn = Aspargiini 20 P = Pro = Proliini Q = Gin = Glutamiini R = Arg = Arginiini S = Ser = Seriini T = Thr = Treoniini ..25 V = Vai = Väliini ____. W = Trp = Tryptofaani Y = Tyr = Tyrosiini ' ; B = Asx = Asp (D) tai Asn (N) ·;·· Z = Glx = Glu (E) tai Gin (Q) : 3.0 V · X = mielivaltainen aminohappo * = deleetio tai puuttuva aminohappo

Proteaas imuunnokset .3.5 Tämän keksinnön stabiloitunut proteaasi on proteaasimuun- '··, nos tai mutatoitunut proteaasi. Proteaasimuunnoksella tai mutatoidulla proteaasilla tarkoitetaan proteaasia, joka » » * • « 7 115972 ' saadaan muuttamalla DNA-nukleotidisekvenssiä kantageenis-sä tai sen johdannaisissa. Proteaasimuunnosta tai muta-toitua proteaasia voidaan ekspressoida tai tuottaa, kun DNA-nukleotidisekvenssi, joka koodaa proteaasia, inser-5 toidaan sopivaan vektoriin sopivassa isäntäorganismissa.

Isäntäorganismi ei välttämättä ole identtinen organismin kanssa, mistä kantageeni periytyy.

Aminohapponumerointi 10 Tämän keksinnön yhteydessä käytetään spesifistä numeroin tia aminohappojäännöksen asemista subtilisiineissä. Asettamalla suoraan riviin erilaisten subtilisiinien aminohapposekvenssit yhdessä subtilisiini BPN':n kanssa, on mahdollista määrätä numero aminohappojäännösasemalle mis-15 sä tahansa substilisiinissä vastaavan aminohappoaseman mumerolle substilisiini BPN':ssä ("BPN' numerointi”, katso esim. kansainväliset patenttijulkaisut nro. W0 89/06-279 ja W0 91/00345).

20 Kuvattaessa erilaisia proteaasimuunnoksia, joita tuote taan tai otetaan mahdollisena lukuun keksinnön mukaisesti, sovelletettiin seuraavia nimistöjä viitteen helpottamiseksi : [Alkuperäinen aminohappo; asema; substituoitu aminohappo] 25 Tämän mukaisesti alaniinin substituutiota proliinilla * 1 asemaan 195, merkitään:

\V A225P

: '30 Aspartaatin deleetio asemaan 36 merkitään: D361 ja inser- tio sellaiseen asemaan merkitään: 36D aspartaatin inser-tio asemaan 36.

Moninkertaiset mutaatiot on erotettu plussilla, s.o.:

'.135 A194P+G195E

·...’ edustaen mutaatioita asemissa 194 ja 195 substituoimalla alaniini proliinilla ja glysiini glutamaatilla, vastaa- s 115972 vasti.

Jos substituutio tehdään mutaatiolla esim. subtilisiini 309:ssä, tuotetta merkitään esim. "subtilisiini 309/G19-5 5E".

Kaikki tässä yhteydessä mainitut asemat viittaavat edellä kuvattuihin BPN'-nmeroihin.

10 Proteolyvttinen aktiivisuus Tämän keksinnön yhteydessä proteolyyttinen aktiivisuus ilmaistaan kilo NOVO proteaasi yksikkönä (KNPU). Aktiivisuus määritetään suhteessa entsyymistandardiin (SAVINA-SE™) ja määritys perustuu dimetyylikaseiini- (DMC) liuok-15 sen pilkkomiseen proteolyyttisellä entsyymillä standardi- olosuhteissa, s.o. 50°C, pH 8,3, 9 min reaktioaika, 3 min mittausaika. Vihkonen AF 220/1 on saatavilla pyydettäessä Novo Nordisk A/S, Tanska, mikä vihkonen on täten liitetty tähän viitteeksi.

20

Pesutaoahtuma

Entsyymin kykyyn katalysoida erilaisten luonnossa esiintyvien substraattien, joita on pestävien kohteiden päällä, hajoamista esim. pesun aikana, viitataan usein sen ..25 pesukykynä, peseytyvyytenä, detergenssinä tai pesutehona.

Läpi tämän sovellutuksen termiä pesuteho käytetään sisäl-• ._ tämään tämä ominaisuus.

Tätä keksintöä valaistaan lisää viittaamalla oheisiin i « » • 3Ö piirroksiin, joissa:

Kuvio 1 (sivut 1/20-15/20) osoittaa synteettisen geenin •rakentamisen; .ϋ5 Kuvio 2 osoittaa (sivut 16/20-20/20) subtilisiini 309 varianttien jäännösaktiivisuuden verrattuna villityypin entsyymiin nestemäisessä detergentissä varastoinnin jäi- 1 » » 9 115972 keen.

Tämä keksintö tarjoaa uusia stabiloituja proteaaseja, joissa luonnossa esiintyvä aminohappojäännös (muu kuin 5 proliini) on substituoitu proliinijäännöksellä yhdessä tai useammassa asemassa, missä asemassa (asemissa) died-rikulmat φ (phi) ja ψ (psi) muodostavat suureet välille [-90°< φ <-40°C ja -180°< ψ <180°], edullisesti välillä [-90°< φ <-40° ja 120°< ψ <180°] tai [-90°< φ <-40° ja -50°< 10 ψ <10], ja mi(t)kä asema(t) ei(vät) sijaitse alueilla, missä proteaasin on karakterisoitu omistavan a-helikaali-sen tai β-levyrakenteen.

Tämän keksinnön yhteydessä keksinnön stabiloitunut prote-15 aasi on proteaasimuunnos tai mutatoitu proteaasi ollen toiminnallisesti vastaava tai jolla on rakenteellisesti samankaltaisia piirteitä kuin luonnollisesti esiintyvällä proteaasilla ja missä proteaasissa luonnossa esiintyvä aminohappojäännös (muu kuin proliini) on substituoitu 20 proliinijäännöksellä yhdessä tai useammassa asemassa, missä asemassa (asemissa) diedrikulmat φ (phi) ja ψ (psi) muodostavat suureet välille [-90°< φ <-40°C ja -180°< ψ <180°], edullisesti välillä [-90°< φ <-40° ja 120°< φ <180°] tai [-90°< φ <-40° ja -50°< ψ <10], ja mi(t)kä ase-,.25 ma(t) ei(vät) sijaitse alueilla, missä proteaasin on ka- rakterisoitu omistavan α-helikaalisen tai B-levyraken-. . teen.

Lisäksi tämän keksinnön yhteydessä stabiloitu proteaasi * * * : 30 on proteaasi, jolla on parantunut stabiilisuus, esim.

V ’ suhteessa lämpöstabiilisuuteen, varastointistabiilisuu- teen, jne. verrattuna kantaentsyymiin.

Proteiinien sekundäärisen rakenteen kuvaus ,35 Keksinnön stabilotuja proteaaseja voidaan saada tekemällä I · kyseessä olevalle proteaasille sekundäärisen rakenteen analyysi, tunnistamalla jäännökset proteaasissa, joilla 10 115972 on diedrikulmat 0 (phi) ja i|i(psi), jotka rajoittuvat välille [-90°< φ <-40°C ja -180°< ψ <180°], edullisesti välillä [-90°< 0 <-40° ja 120°< ψ <180°] tai [-90°< 0 <-40° ja -50°< ψ <10], jättäen pois jäännökset, jotka sijaitse-5 vat alueilla, joissa proteaasi karakterisoidaan sillä, että sillä on α-helikaalinsen tai β-levyrakenne, jos pro-liinijäännös ei jo ole tunnistetu(i)ssa asemassa (asemissa) , luonnostaan esiintyvän aminohappojäännöksen substituutio proliinijäännöksellä tunnistettuun (tunnistettui-10 hin) kohtaan (kohtiin), edullisesti kohdistetulla muta- geneesillä, jota sovelletaan geenille, joka koodaa kyseessä olevaa proteaasia, ja geeniekspressio insertoimal-la geeni, joka kodaa stabiloitua proteaasia sopivassa isäntäorganismissa, jonka jälkeen viljellään mainittua 15 isäntäorganismia sopivassa ravintoalustassa ja saadaan haluttu entsyymi.

Valmistaminen sisältää kyseessä olevan proteaasin sekundäärisen rakenteen analyysin tekemisen. Sellaisen analyy-20 sin suorittamiseksi täytyy proteaasin atomirakenne sel ventää. Atomirakenne voidaan määrittää röntgensädedifrak-tiotekniikoilla. Esim. Hendrickson on kuvannut röntgensä-dedifraktiotekniikoita [Hendrickson, W.A. (1978); X-ray diffraction; teoksessa Protein Engineering (Toim.: Oxen-...25 der, D.L. ja Fox, C.F.) luku 1; Alan R. Liss, Inc.] ja

Creighton, T.E.; supra, luku 6].

’; Subtilisiini 309;n kiderakenne on dedusoitu [katso Bet- ;·; zel, B., Klupsch, S., Papendorf, G., Hastrup, S., Bran- ‘ 3:0 ner, S. ja Wilson, K.S. (1992); J. Mol. Biol. 223 427- V * 445] ja rinnasteiset on tallennettu ja ovat saatavilla

Brookhaven Protein Data Bank [Bernstein et ai. (1977); J. Mol. Biol. 112 535-542].

.',35 Kun atomirakenne on määritetty, on mahdollista laskea ’**, diedrikulmat atomikoordinaatoista. Lisäksi on mahdollista osoittaa sekundäärirakenteen elementit. Sekundääriraken- I » u 115972 teen elementit kuvataan vetysidosten perusteella. Koope-ratiivinen sekundäärirakenne tunnistetaan elementaarisena vetysidosmallien "käännös" ja "silta" toistumina. Toistuvat käännökset ovat "heliksejä", toistuvat sillat ovat 5 "tikapuita", yhdistävät tikkaat ovat "levyjä".

Sekundäärirakenteen elementtien analyysi vaatii tietokoneella lasketun rakennesiirtojen ja geometristen piirteiden, jotka on uutettu atomikoordinaatoista, laatimisen.

10 Tavanomaisen menetelmän selvittää proteiinin sekundääri- rakennetta perustuen sen atomikoordinaattoihin, ovat kuvanneet Kabsch ja Sander [Kabsch, W. ja Sander, C. (198-3); Biopolymers, 22 2577-2637]. Tässä artikkelissa tarjotaan algoritmi rakennepiirteiden ulosvetämiseksi atomi-15 koordinaateista hahmontunnistusmenetelmällä. Ensimmäisek si H-sidokset tunnistetaan perustuen sähköstaattisiin vuorovaikutuksiin H-sidosryhmäparien välillä. Seuraavaksi H-sidoksen hahmoja käytetään kuvaamaan sekundäärisen rakenteen elementtejä, kuten käännökset (T), taipumat (S), 20 sillat (B), heliksit (G,H,I), β-tikkaat (E) ja B-levyt (E).

Tietokoneohjelma DSSP (Define Secondary Structure of Proteins), joka mahdollistaa Kabsch & Sander tiedostot ja 25 kirjoitettuna standardi PASCALina, on saatavilla Protein f i t t [ Data Bank, Chemistry Dept., Brookhaven National Labo- ’ ' ratory, Upton, N.Y. 11973.

» I · * 1 .Sen jälkeen kun diedrikulmat φ (phi) ja ψ (psi) aminoha-| ’3» poille on lasketut, perustuen atomirakenteeseen kiteisis- : * * *; sä proteaaseissa, on mahdollista valita asema(t), jo(i)s- sa on diedrikulmat phi ja psi, jotka ovat suotuisat subs-tituoitaviksi proliinijäännöksellä. Proliinijäännösten alifaattinen sivuketju on sitoutunut kovalenttisesti pep-.35 tidiryhmän typpiatomiin. Saatu syklinen 5-jäseninen ren- gas määrää sen mukaisesti jäykän rajoituksen kiertymisel-: le peptidin selkärangan N-Ce-sidoksen ympäri ja samanai- • · 115972 12 kaisesti estää vetysidoksen muodostumisen selkärangan N-atomiin. Näiden rakennesyiden takia proliinit eivät y-leensä ole kompatiibeleitä α-heliksi ja β-levy sekundääristen konformaatioiden kanssa. Johtuen samasta pyörimis-5 rajoituksesta C«-N-sidoksen ympäri ja johtuen vaatimuk sesta, että naapuriaminohappoja ketjussa ei häiritä, di-edrikulmien phi ja psi (ja erityisesti phi) suuruudet rajoittuvat polypeptidien proliinijäännösten rajoitettuihin väleihin. Polypeptidien proliinijäännösten diedrikulmat 10 ovat melkein ainoastaan väleillä [-90°< φ <-40°C ja -180°<φ <180°] , edullisesti välillä [-90°< φ <-40° ja 120°< ψ <180°] tai [ —90°< φ <-40° ja -50°< ψ <10 ]. Tässä yhteydessä tarkoitetaan sekä cis- että trans-proliinijäännöksiä.

15

Proliinijäännös voi olla jo yhdessä tai useammassa asemassa, jotka osoitettiin edellä kuvatulla menetelmällä.

Muuten menetelmään sisältyy luonnollisesti esiintyvän aminohappojäännöksen substituutio proliinijäännöksellä.

20

Substituutio proliiniin jokaisessa ennustetussa asemassa ei aina kuitenkaan voi aikaansaada proteaasin parantunutta lämpöstabiilisuutta. Joissakin asemissa, joita menetelmä on paljastanut, voi luonnollisesti esiintyvän ami-v25 nohappojäännöksen substituutio proliiniin aiheuttaa des- tabiloinnin johtuen tekijöistä, joita ei voida ennustaa, « t ·/, kuten olennaisen joustavuuden katoaminen, H-sidos-mahdol- t · · I lisuuksien katoaminen, ei ennustettavissa oleva steerinen • 1 · estyminen, jne. Sellaisia "kriittisiä kohtia" ei aina • · 1 • 510 nähdä etukäteen.

* i » t I t » 1 k

On odotettavissa, että stabiloivat (tai destabiloivat) i ’/ yksittäisten substituutioiden vaikutukset ovat additiivi- . : : siä, katso esim. Wells, J.A. [Biochemistry (1990) 29 (37) .^35 8510-8517] ja taulukko 4 alla.

» »

Jos substilisiinille, joka on erilainen kuin subtilisiini I > · ' 1 i3 115972 309, tehdään tämä menetelmä (vaikka kaksi subtilisiiniä saattaa näyttää hyvin paljon samankaltaisilta), ei välttämättä menetelmästä ole tuloksena samaa asemien lukumäärää, eikä erityisesti identtisiä asemia. On todennäköistä 5 että jotkut asemat saattavat olla identtisiä ja on toden näköistä että lukuisat asemat ovat samaa suuruusluokkaa, mutta sitä ei voi nähdä etukäteen.

10 Näyttää kuitenkin todennäköiseltä, että stabiloivilla proliinisubstituutioilla, jotka johtuvat edellä kuvatusta menetelmästä, sovelletettuna mihin tahansa spesifiseen proteaasiin, saattaa olla myös stabiloivaa vaikutusta mihin tahansa muuhun proteaasiin, riippumatta edellä ku-15 vatun menetelmän, jota sovelletettiin sellaiseen proteaa siin, tuloksesta.

Kun menetelmää suoritetaan subtilisiini 309 molekyylille (katso kansainvälinen patenttihakemus nro. PCT/DK88/000-20 02), voidaan saada sarja tietoja kuten taulukoissa 1 ja 2 on luetteloitu. Taulukko 1 kuvaa asemien sarjan - joka suhteessa phi- ja psi-kulmiin - täyttää erään ehdon ja taulukko 2 kuvaa asemien lisäsarjan, joka täyttää toisen ehdon.

...25 • »

Taulukko 1 * *

Subtilisiini 309:n ehdotetut proliinimutantit perustuen ! phi- ja psi-kulmiin.

i i f « k ♦ » : 30 Tunnusmerkki -90° < phi < -40° ja 120°< psi < 180° tai !.' ‘ -90° < phi < -40° ja 50°< psi < 10°.

Ei kumpikaan osa alfa-heliksi- tai * * ; ’ ! beta-levyrakenteesta.

. : BPN' phi- psi- Amino- Rakenne Mutantti & ..135 numerot kulma kulma happo huomautukset • _________ ____ . . ... ______ _____...

»1*1 5 -59 148 P Pro jo subt.

i · t 14 115572 309:ssä

11 -80 -IV T

19 -85 1 R Τ 24 -57 132 S Τ

5 33 -79 10 Τ S

37 -89 145 S

38 -58 146 Τ 40 -60 -27 Ρ Τ Pro jo subt.

10 309:ssä 52 -59 131 P T Pro jo subt.

309:ssä 55 -71 22 P Pro jo subt.

309:ssä 15

57 -90 167 S S

59 -60 151 Q

74 -57 141 A

75 -67 148 L

20 83 -81 173 G

84 -72 -35 V S

86 -59 -12 P T Pro jo subt.

309:ssä

....25 88 -68 152 A

97 -73 174 G

. . 98 -57 -32 A T

99 -67 -12 S T

: *30 119 -70 149 M

* 129 -68 -24 P S Pro jo subt.

309:ssä

130 -85 126 S S

131 -63 156 P Pro jo subt.

.',.35 309:ssä

145 -88 10 R T

15 1 15972

147 -86 134 V

153 -74 -20 S

156 -82 -11 S S

158 -70 159 A

5

163 -66 166 S

169 -52 -33 A T

170 -66 -21 R T

171 -67 141 Y S

10 172 -52 -43 A T

173 -79 IN T

182 -63 -16 Q T

186 -65 133 R B

15 187 -65 151 A

188 -64 -27 S T

189 -77 -17 F T

191 -69 151 Q

20 194 -56 130 A T

210 -53 155 P T Pro jo subt.

309:ssä 239 -58 25 P T Pro jo subt.

309:ssä '.'•25

:··: 241 -79 149 W

242 -86 178 S

254 -71 165 A S

·*’,·, 256 -59 136 S

,.'.30 259 -48 131 S

265 -69 -20 S T

: ·’ 267 -79 127 L B

V : 268 -58 141 V

;' * "35 _

Lieventämällä rajoitusta psi-kulmaan suhteessa taulukossa ; 1 esitettyyn kriteeriin, ehdotetaan neljää lisämutanttia, 16 1 1ΓΓ7? katso taulukko 2. ^

Taulukko 2

Subtilisiini 309:n ehdotetut proliinimutantit perustuen 5 phi- ja psi-kulmiin.

Lievennetty tunnusmerkki: -90° < phi < -40° ja —180°< psi < 180.

Ei kumpikaan osa alfa-heliksi- tai 10 beta-1evyrakenteesta.

BPN/ phi- psi- Amino- Rakenne Mutantti & numerot kulma kulma happo huomautukset

76 -89 102 N S

15 125 -90 67 S

160 -83 27 G S

255 -89 111 T B

20 Edulliset stabiloidut proteaasit

Keksinnön proteaasi on edullisesti stabiloitu subtili-lisiiniproteaasi. Yksityiskohtasemmassa näkökohdassa keksinnön edullinen proteaasi on subtilisiini, jossa saatu stabiloitu subtilisiini on mikä tahansa subtilisiini, jo-'•*'25 ka koostuu substituutiosta proliinijäännökseen yhdessä ·;··: tai useammassa taulukoissa 1 ja 2 lutteloiduissa asemissa (BPN7 numerot) tai tämän kanssa analogisiin asemiin.

Yksityiskohtasemmassa näkökohdassa keksinnön edullinen •.-30 proteaasi on subtilisiini, jossa luonnollisesti esiintyvä aminohappo (muu kuin proliini) on substituoitu proliini-jäännöksellä yhteen tai useampaan asemaan: 38, 57, 98, 172, 188, 194, 242 ja 259 (BPN' mumerot). Vielä edulli-v · sissa suoritusmuodoissa on subtilisiinissä lisäksi yksi ;‘"35 tai useampi seuraavista substituutioista: 27R, 36D, 76D, .!!!: 97N, 98R, 104Y, 120D, 128G, 195E, 206C, 218S, 235L, 235R, 237R, 251E ja 263F (BPN7 numerot).

i 17 11E972

Vielä eräässä yksityiskohtasemmassa näkökohdassa keksinnön edullinen proteaasi on stabiloitu subtilisiini 309, stabiloitu subtilisiini 147, stabiloitu subtilisiini BPN' 5 tai stabiloitu subtilisiini Carlsberg. Subtilisiini 309 ja subtilisiini 147 ovat Bacillus lentus muunnoksia ja kuvattu US patentissa nro. 3 723 250 ja kansainvälisessä patenttihakemuksessa PCT/DK 88/00002, Wells et ai. ovat kuvanneet subtilisiini BPN':n [Nucleic Acids Res. (1983) 10 11 7911-7925]; Smith et ai. ovat kuvanneet subtilisiini

Carlsbergin [Smith, E.L.; DeLange, R.J.; Evans, W.H.;

Landon, W.; Markland, F.S. (1968); Subtilisin Carlsberg V. The complete sequence: comparison with subtilisin BPN'; Evolutionary relationships.; J. Biol. Chem. 243 (9) 15 2184-2191) ja Jacobs et al. [Nucl. Acids Res. (1985) 13 8913-8926].

Eräässä toisessa yksityiskohtaisessa näkökohdassa keksinnön proteaasi on stabiloitu subtilisiini 309, johon on 20 viety yksi tai useampi seuraavista substituutioista: T38P, S57P, A98P, S188P, A172P, A194P, S242P ja S259P (BPN' numerot). Vielä edullisissä suoritusmuodoissa tässä subtilisiinissä on lisäksi yksi tai useampi seuraavista substituutioista: K27R, *36D, N76D, G97N, A98R, V104Y, "•‘^5 H120D, S128G, G195E, Q206C, N218S, K235L, K235R, K237R, ·:··: K251E ja Y263F (BPN' numerot).

Vielä eräässä toisessa edullisessa suoritusmuodossa kek-sinnön proteaasi on stabiloitu subtilisiini 309, johon on •;30 viety yksi tai useampi seuraavista substituutioista: T38P, S57P, A98P, A172P, A194P, S242P ja S259P (BPN' nu-,, . merot). Edelleen edullisessa suoritusmuodossa tässä sub- • tilisiinissa on lisäksi yksi tai useampi seuraavista sub- ' stituutioista: K27R, *36D, N76D, G97N, A98R, V104Y, H120-

:"3>5 D, S128G, G195E, Q206C, N218S, K235L, K235R, K237R, K251E

ja Y263F (BPN' numerot).

1β 115972

Keksinnön edullisimmat proteaasit ovat: subtilisiini 309/ K27R+*36D+G97N+A98R+A194P+K235R+K237R+K251E+Y263F, subtilisiini 309/K27R+*36D+G97N+A194P+K235R+K237R+K251E+Y263F, subtilisiini 309/K27R+*36D+G97N+A194P+K235R+K237R+Y263F, 5 subtilisiini 309/*36D+N76D+H120D+A194P+G195E+K235L, sub tilisiini 309/*36D+G97N+V104Y+H120D+A194P+G195E, subtilisiini 309/*36D+G97N+V104Y+H120D+A194P+G195E+K235L, subtilisiini 309/*36D+G97N+H120D+A194P+G195E, subtilisiini 309/*36D+G97N+H120D+A194P+G195E+K23 5L, subtilisiini 309/ 10 *36D+V104Y+H120D+A194P+G195E, subtilisiini 309/*36D+V10- 4Y+H120D+A194P+G195E+K235L, subtilisiini 309/*36D+H120D+ A194P+G195E, subtilisiini 309/*36D+H120D+A194P+G195E+K23-5L ja subtilisiini 309/A194P (BPN' numerot).

15 Proliinistabilisaation vaikutus

Puhdistettujen muunnelmien, jotka saatiin tämän keksinnön mukaisesti, on testattu pesevän vähintään yhtä hyvin verrattuna villityypin subtilisiiniin (subtilisiini 309), katso esimerkin 5 kokeelliset tiedot. Tämän kokeen tulos 20 nähdään taulukossa 3, alla ja kuviossa 7.

Varastointistabiilisuus heijastaa yleensä lämpöstabiili-suutta, s.o. parantunut lämpöstabiilisuus vastaa parantunutta varastointistabiilisuutta. Puhdistettujen muun-”'25 noksien lämpöstabiilisuuden parantuminen on testattu dif- ·:··: ferentiaalipyyhkäisykalorimetri- (DSC) menetelmällä, kat- so esimerkistä 3 kokeelliset tiedot. Näiden testien tu-lokset nähdään taulukossa 3, alla. Varastointistabiili-suus on testattu MiniStorage testillä, katso esimerkki 4, * t ’.30 kokeelliset tiedot ja varastointistabiilisuustestin tu- » · · ' lokset nähdään kuviossa 2.

115972

Taulukko 3

Stabilisaatio suhteessa subtilisiini 309:ään 5 Muunnos Suhteellinen stabilisaatio Δ DSC (°C)

S24P -2,0°C

10 T38P -0,1°C

S57P 0,7°C

A98P 0,1°C

A99P -0,2°C

A172P 0,1°C

15 Q182P -2,5°C

S188P 1,5°C

A194P 2,6°C

S242P 1,4°

S256P -2,1°C

20 S259P 0,6°C

Taulukosta 3 ilmenee, että 3:11a rakennetuista muunnoksista on merkittävästi parantunut lämpöstabiilisuus ja ...25 2:11a muunnoksista on hieman parantunut lämpöstabiili- suus, neljällä muunnoksella ei ole merkittävää muutosta . . lämpöstabiilisuudessa ja 3:11a muunnoksella on merkittä- ; västi alentunut lämpöstabiilisuus verrattuna villityypin entsyymiin.

•3° ‘ Nämä tulokset osoittavat, että vaikka on selvä peruste stabilisaatiolle viemällä proliinijäännökset proteiiniin > ’ : Phi-Psi-käsitteen avulla, joka on kuvattu tässä yksityis- ’·: kohtaisessa selvityksessä, ei johtopäätöstä yksittäisten .!.35 muunnoksien stabiloivasta vaikutuksesta ole ennustetta- vissa.

20 ιμγ;ο72

Kun muunnos, jolla on parantunut lämpöstabiilisuus, kuitenkin saadaan, pidetään yksittäisten mutaatioiden stabiloivaa vaikutusta yleensä additiivisena. Tämä on osoitettu taulukossa 4 alla, missä subtilisiini 309 muunnoksien 5 termiset denaturointilämpötilat, mitattuna differentiaa- lipyyhkäisykalorimetrilla (DSC), suhteessa villityypin entsyymikin esitetään.

Täten stabiloidut proteaasimuunnokset, joissa on edelleen 10 stabiloivaan proliinijäännökseen (jäännöksiin) insertoi- tuneena, yksi tai useampi lisää stabiloiva mutaatio, kuten tässä yksityiskohtaisessa spesifikaatiossa on kuvattu, kuuluvat tämän keksinnön piiriin.

15 Taulukko 4

Additiivinen stabiloiva vaikutus subtilisiini 309 muunnoksiin

Luvut sulkeissa merkitsevät Δ DSC lämpötilojen summaa 20 muunnoksille, jotka testattiin yksittäin.

Muunnokset Δ DSC

(°C) '"*25 G195E 0,1 ·:·: H120D 0,2 ;Y: K235L 0,0 *36D 4,0 ’\*\ N76D 4,3 •; *3 0 A194P 2,6 G97N -0,3 V104Y 2,3 : G195E H120D K235L 0,3 (0,3) V : G195E H120D K235L *36D 4,0 (4,3) ’"35 G195E H120D K235L *36D A194P 7,0 (6,9) G195E H120D K235L *36D N76D 7,0 (8,6) G195E H120D K235L *36D N76D A194P 10,4(11,2)

* · I

21 11ES72 G195E H120D *36D A194P G97N 7,4 (6,6) G195E H120D *36D A194P G97N V104Y 8,2 (8,2) G195E H120D K235L *36D A194P G97N 6,9 (6,6) G195E H120D K235L *36D A194P G97N V104Y 8,0 (8,9) 5 __

Menetelmä tuottaa mutaatioita proteaaseia koodaavissa geeneissä

Monet menetelmät, joilla viedään geeneihin mutaatioita, 10 ovat tunnettuja. Sen jälkeen kun on lyhyesti keskusteltu subtilisiinigeenien kloonauksesta, keskustellaan menetelmistä, joilla luodaan mutaatioita spesifisiin kohtiin subtilisiinigeenissä.

15 Subtilisiiniaeenin kloonaus

Geeni, joka koodaa subtilisiiniä, voidaan kloonata miltä tahansa gram-positiiviselta bakteerilta tai homeelta erilaisin tunnetuin menetelmin. Ensimmäiseksi täytyy rakentaa DNA:n genominen ja/tai cDNa-kirjasto käyttämällä kro-20 mosomaalista DNArta tai lähetti RNArta organismista, joka tuottaa tutkittavaa subtilisiiniä. Sitten, jos subtili-siinin aminohapposekvenssi tunnetaan, voidaan syntetisoida homologisia oligonukleotidikoettimia, leimataan ja käytetään tunnistamaan subtilisiiniä koodaavat kloonit "**^5 bakteeri-DNA:n genomisesta kirjastosta tai home cDNA-kir- jastosta. Vaihtoehtoisesti leimattu oligonukleotidikoe-tin, jossa on sekvenssejä, jotka ovat homologisia toisen ··· bakteeri- tai homekannan subtilisiinin kanssa, voitaisiin käyttää koettimena tunnistamaan subtilisiiniä koodaavat * · .:-30 kloonit, käyttämällä hybridisaatio- ja pesuolosuhteita, joilla on alhainen ehdottomuus.

Vielä erääseen menetelmään tunnistaa subtilisiiniä tuot-

I · I

’ tavat kloonit sisälsivät genomisen DNA-fragmentti en in- :“3;5 sertoimisen ekspressiovektoriin, kuten plasmidi, trans- I « · formoimalla proteaasi-negatiivisia bakteereita saaadulla genomisella DNA-kirjastolla ja sitten maljäämällä trans- > * » j « 22 115972 formoidut bakteerit agarille, jossa on substraattia sub-tilisiinille, kuten skim-milk. Ne bakteerit, joissa on subtilisiiniä sisältävä plasmidi, tuottavat pesäkkeitä, joita ympäröi kirkas agarikehä johtuen eritetyn subtili-5 siinin skim-milkin hajottamisesta.

Kohdistettujen mutaatioiden luominen subtilisiinicreeniin Kun subtilisiinigeeni on kerran kloonattu ja halutut mu-tageneesikohdat tunnistettu, mutaatiot voidaan viedä 10 käyttämällä synteettisiä oligonukleotidejä. Näissä oli- gonukleotideissä on nukleotidisekvenssit, jotka renusta-vat haluttuja mutaatiokohtia, mutanttinukleotidit inser-toidaan oligonukleotidisynteesin aikana. Edullisessa menetelmässä luodaan vektoriin, jossa on subtilisiinigeeni, 15 yksijuosteinen DNA-aukko, joka on siltana subtilisiini- geeniin. Sitten synteettinen nukleotidi, jossa on haluttu mutaatio, hybridisoidaan yksijuosteisen DNA:n homologiseen osaan. Jäljelle jäänyt aukko täytetään sitten DNA polymeraasi Irllä (Klenow fragmentti) ja rakenne ligoi-20 daan käyttämällä T4-ligaasia. Tämän esimerkin spesifinen menetelmä on kuvattu [Morinaga et ai. (1984); Biotechnology, 2 646-639]. Morinaga et ai. mukaan geenissä oleva fragmentti poistetaan käyttämällä restriktioendonukleaa-sia. Vektori/geeni, jossa nyt on aukko, denaturoidaan "•’2·5 sitten ja hybridisoidaan vektori/geeni in, joka sen sijaan :·*: että siinä on aukko, on pilkottu toisella restriktioen- :V: donukleaasilla kohdasta, joka on aukkoon sisältyvän alu- 4 · een ulkopuolella. Sitten on saatavilla yksijuosteinen geenin alue hybridisaatioon mutatoitujen oligonukelotidi-= ;·30 en kanssa, jäljelle jäänyt aukko täytetty DNA polymeraasi * 4 · I:n Klenow fragmentilla, insertiot ligoitu T4-ligaasilla ,, , ja yhden replikaatiokierron jälkeen on tuotettu kaksi- juosteinen plamsidi, jossa on haluttu mutaatio. Morinaga ’ menetelmä poistaa uusien restriktiokohtien rakentamisen ”3;5 lisämanipuloinnin ja helpottaa siksi mutaatioiden tuotta- mistä moninaisiin kohtiin. US patentti nro. 4 760 025,

Esteli et ai., jätetty 26. kesäkuuta 1988, kykenee vie- 23 1 15972 mään oligonukelotidit, joissa on moninaisia mutaatioita, suorittamalla vähäisiä kasetin muunnoksia, kuitenkin jopa suurempi määrä mutaatioita voidaan viedä yhdellä kertaa Morinaga menetelmällä, koska monia eri pituisia oligonuk-5 leotidejä voidaan viedä.

Subtilisiinimuunnoksien ekspressio

Keksinnön mukaisesti voidaan ekspressoida mutatoitua sub-tilisiinigeeniä, joka on tuotettu edellä kuvatuilla mene-10 telmillä, esimerkissä 1 kuvatulla menetelmällä tai millä tahansa vaihtoehtoisilla tunnetuilla menetelmillä, ent-syymimuodossa käyttämällä ekspressiovektoria. Ekspressio-vektori kuuluu yleisesti määritykseen kloonausvektori, koska ekspressiovektorissa on tavallisesti tyypillisen 15 kloonausvektorin komponentit, nimittäin elementti, joka saallii vektorin itsenäisen replikaation mikro-organismissa riippumatta mikro-organismin genomista, ja yksi tai useampi fenotyyppisiä markkereita selektiotarkoituksiin. Ekspressiovektorissa on kontrollisekvenssit, jotka koo-20 daavat promoottoria, operaattoria, ribosomin sitomiskoh- taa, translaation inhibiitiosignaalia ja mahdollisesti repeessorigeeniä tai erilaisia aktivaattorigeenejä.

Jotta sallitaan ekspressoidun proteiinin eritys, voidaan • ”25 nukleotidit, jotka koodaavat "signaalisekvenssiä", inser- ·:··: toida ennen geenin koodaussekvenssiä. Ekspressiota varten kontrollisekvenssien ohjauksen alaisena, liitetään kohde- * » geeni, jota on tarkoitus käsitellä keksinnön mukaisesti, » > < · *,·, toteuttamiskelpoisesti kontrollisekvensseihin oikeaan lu- ,30 kuraamiin. Promoottorisekvensseihin, jotka voidaan liit tää plasmdivektoreihin ja jotka kannattavat mutatoidun subtilisiinigeenin transkriptiota, kuuluu mutta ei rajoi-; tu prokaryoottiseen β-laktamaasipromoottoriin [Villa-Ka- ’ maroff, et ai. (1978); Proc. Natl. Äcad. Sei. U.S.A.; 75 "35 3727-3731] ja tae promoottori [DeBoer, et ai. (1983);

Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.; 80 21-25]. Lisäviitteitä • * ; voidaan löytää myös Scientific American (1980); 242 74- 24 1 15972 94, "Useful proteins from recombinant bacteria".

Erään suoritusmuodon mukaisesti B. subtilis transformoidaan ekspressiovektorilla, jossa on mutatoitu DNA. Jos 5 ekspression on tapahduttava erittävässä mikro-organismis sa, kuten M· subtilis. signaalisekvenssi saattaa seurata translaation aloitussignaalia ja olla kiinnostuksen kohteena olevan DNA-sekvenssin edellä. Signaalisekvenssi toimii kuljettamaan ekspressiotuotteen soluseinälle, mis-10 sä se pilkotaan tuotteesta erityksen jälkeen. Termi "kontrollisekvenssit", kuten edellä kuvattiin, on tarkoitus sisältää signaalisekvenssin, kun se on läsnä.

Mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan tämän kek-15 sinnön stabiloituja entsyymejä, voidaan viljellä tavano maisin fermentaatiomenetelmin ravintoalustassa, jossa on sidottavaa hiiltä ja typpeä yhdessä muiden olennaisten ravinteiden kanssa, alustan ollessa tehty tunnettujen periaatteiden mukaisesti.

20

Nukleotidisekvenssit ia mikro-oraanismit Tämä keksintö koskee myös DNA-nukleotidisekvenssejä, jotka koodaavat keksinnön stabiloitua proteaasia, ja eks-pressiovektoria, jossa on DNA-nukleotidisekvenssi, joka ...25 koodaa stabiloitua proteaasia.

» » « · i .- Stabiloitua proteaasia voidaan ekspressoida ja tuottaa, ' kun DNA nukleotidisekvenssi, joka koodaa tätä proteaasia, « i · on insertoitu sopivaan ekspressiovektoriin sopivassa i- 3*0 säntäorganismissa. Isäntäorganismi ei välttämättä ole # * * V * identtinen organismin kanssa, mistä kantageeni on peräi sin. Mutatoitujen geenien, vektoreiden ja mutantti ja » » <· • ' : transformoitujen mikro-organismien rakentaminen voidaan ; i : suorittaa millä tahansa sopivalla tunnetulla rekombinant- ,’.35 ti-DNA-tekniikalla.

» » J f

! I M

Keksintö koskee myös isäntäorganismeja, joissa on eks- 25 115972 pressionvektori, jossa on DNA nukleotidisekvenssi, joka koodaa stabiloitua entsyymiä.

Deteraenttikoostumukset 5 Tähän keksintöön kuuluu myös keksinnön stabiloitujen ent syymien käyttö puhdistus- ja detergenttikoostumuksissa ja sellaisissa koostumuksissa on stabiloituja proteaaseja.

Sellaisissa koostumuksissa on mikä tahansa tai useampaa 10 keksinnön proteaasia yksin tai yhdistelmänä minkä tahansa tavanomaisen komponentin kanssa, joita on sellaisissa koostumuksissa, jotka ovat tuttuja ammatimiehelle.

Sellaisiin komponentteihin sisältyy tehoaineita, kuten 15 fosfaatti- tai zeoliittitehoaineet, surfaktantit, kuten anioni-, kationi-, ei-ioni- tai kahtaisionityyppiset surfaktantit, polymeerit, kuten akryyli- tai vastaavat polymeerit, valkaisuainesysteemit, kuten perboraatti- tai aminoa sisältävät valkaisuaineen prekursorit tai akti-20 vaattorit, rakenteentekijät, kuten silikaattirakenteen- tekijät, alkalia tai happoa säätämään pH:ta, kostuttavia aineita ja/tai neutraaleja epäorgaanisia suoloja.

Keksinnön detergenttikoostumukset voidaan formuloida mi-' ‘2-5 hin tahansa sopivaan muotoon, kuten jauheet, nesteet, :·*: jne.

> * < i · ... Entsyymejä voidaan käyttää tunnettuina standardimäärinä ;v, detergenttikoostumuksissa. Määrät voivat vaihdella hyvin ’ ψ ;30 laajasti, esim. noin 0,0002-0,01, esim. noin 0,005-0,05, * » <

Anson yksikköä/g detergenttikoostumusta. Ilmaistuna vaihtoehtoisina yksikköinä voidaan proteaasi liittää koostu-: ·' muksiin määrinä, jotka ovat kokoa noin 0,1-100 GU/mg (e- s t » ' ‘ sim. 1-50, etenkin 5-20 GU/mg) detergenttiformulaatiota < '3j5 tai mikä tahansa määrä laajalla alueella keskittyen noin 0,01-4, esim. 0,1-0,4 KNPU/g detergenttiformulaatio.

» * t » 26 110972 KNPU on määritetty aikaisemmin. GU on glysiiniyksikkö, määritetty proteolyyttiseksi entsyymiaktiivisuudeksi, joka standardiolosuhteissa 15 min inkubaation aikana 40 °C:ssa N-asetyylikaseiini substraattina, tuottaa määrän 5 NH2-ryhmää, joka vastaa 1 μπιοί glysiiniä.

Voi olla sopivaa esimerkiksi käyttää näitä entsyymejä määränä, joka on noin 0,25 mg entsyymiproteiinia/1 pesunestettä, vastaten entsyymiaktiivisuutta, joka on ker-10 taluokkaa 0,08 KNPU/1. Vastaavat deteregnttiformulaatiot voivat sisältää entsyymejä esimerkiksi määränä, joka on kertaluokkaa 0,1-0,4 KNPU/g.

Detergenttikoostumuskissa saattaa olla myös muita entsyy-15 mejä.

Esimerkiksi lipaasia voidaan tavallisesti lisätä lipo-lyyttisen entsyymin rakeisen koostumuksen muodossa (vaihtoehtoisesti liuos tai liete) kantajamateriaalin kanssa 20 (esim. kuten EP patenttijulkaisussa nro. 258 068 (Novo

Nordisk A/S) ja Lipolase™ ja muita Novo Nordisk A/S ent-syymikoostumuksia).

Lisätyn lipaasin määrä voidaan valita laajoissa rajoissa, 25 esimerkiski 50-30 000 LU/g/g surfaktanttisysteemiä tai ·:··. detergenttikoostumusta, esim. usein vähintään 100 LU/g, erittäin tavallisesti vähintään 500 LU/g, joskus edulli-sesti yli 1000, yli 2000 LU/g tai yli 4000 LU/g tai enem-' ! män, täten hyvin usein alueella 50-4000 LU/g ja mahdolli- :/30 sesti alueella 200-1000 LU/g. Tässä yksityiskohtaisessa

/ esityksessä lipaasiyksiköt määritetään kuten ne ovat EP

• I » ’·* - patenttijulkaisussa nro. 258 068.

Lipolyyttinen entsyymi voidaan valita suuresta määrästä : 35 lipaaseja. Erityisesti, lipaasit, jotka on kuvattu esi- merkiksi seuraavissa patenttiselityksissä: EP patenttijulkaisut nrot. 214 761 (Novo Nordisk A/S), 258 068 ja I · » · 27 11 CC 72 etenkin lipaasit, joilla on immunologista ristiinreagoi-mista antiseerumien kanssa, jotka on nostettu Thermomyces lanuginosus ATCC 22070 lipaasia vastaan, EP patenttijulkaisut nrot. 205 208 ja 206 390 ja etenkin lipaasit, 5 joilla on immunologista ristiinreagoimista antiseerumien kanssa, jotka on nostettu Chromobacter viscosum var lipo-lyticum NRRL B-3673 lipaasia vastaan, tai Alcaligenes PL-679, ATCC 31371 ja FERM-P 3783 lipaasia vastaan, myös lipaasit, joita on kuvattu selityksissä WO 87/00859 (Gist-10 Brocades) ja EP patenttijulkaisu nro. 204 284 (Sapporo

Breweries). Erityisen sopivia ovat esimerkiksi seuraavat kaupallisesti saatavilla olevat lipaaasivalmisteet: Lipo-lase Novo Nordisk A/S, Amanolipaasit CE, P, B, AP, M-AP, AML ja CES ja Meito lipaasit MY-30, OF ja PL, myös Este-15 rase MM, Lipozym, SP225, SP285, Saiken lipaasi, Enzeco lipaasi, Toyo Jozo lipaasi ja Diosynth lipaasi (tavaramerkkejä) .

Amylaasia voidaan esimerkiksi käyttää milloin halutaan, 20 määränä alueella noin 1 - noin 100 MU (maltoosiyksikkö)/g detergenttikoostumusta (tai 0,014-1,4, esim. 0,07-0,7 KNU/g (Novo yksikköä). Sellulaasia voidaan esimerkiksi käyttää milloin halutaan, määränä alueella noin 0,3 -noin 35 CEVU yksikkö/g detergenttikoostumusta.

25 ""· Tavallisia detergenttiainesosia, joita voi olla läsnä tavallisina määrinä tämän keksinnön detergenttikoostumuk-:Y: sissa, ovat seuraavat: koostumukset voivat olla tehostet- • j. tuja tai ei-tehostettuja ja ne voivat olla nolla-P-tyyp- I M t /30 piä (s.o. eivät sisällä yhtään fosforia sisältävää teho- ·;·, ainetta). Täten koostumuksessa voi olla aggregaatti, esi merkiksi 1-50 %, esim. vähintään noin 5 % ja usein noin ,, . 35-40 paino-%:iin asti, yhtä tai useampaa orgaanista ja/ • · tai epäorgaanista tehoainetta. Tyypillisiin esimerkkeihin ‘35 tehoaineista kuuluvat ne, jotka jo edellä mainittiin ja leveämmin niihin kuuluu aikaiimetalliorto-, pyro- ja tri-polyfosfaatteja, aikaiimetallikarbonaatteja, joko yksin 28 115972 tai seoksena kalsiitin, alkalimetallisitraattien, alkali-metallinitriloasetaattien, karboksimetyylioksisukkinaat-tien, zeoliittien, polyasetaalikarboksylaattien kanssa ja niin edelleen.

5

Lisäksi detergenttikoostumuksessa voi olla 1-35 % valkaisuainetta tai valkaisun prekursoria tai systeemi, jossa on valkaisuainetta ja/tai prekursoria sen aktivaatto-rin kanssa. Edelleen mahdollisia ainesosia ovat vaahdon-10 vahvistajat, vaahdonestoaineet, ruosteenestoaineet, likaa suspendoivia aineita, sekvestrausaineet, maan uudelleen saostumista estävät aineet, hajusteet, värit, entsyymien stabiloivat aineet ja niin edelleen.

15 Koostumuksia voidaan käyttää tekstiilimateriaalien, eten kin, mutta ilman rajoitusta, puuvillan ja polyesteripoh-jaisten tekstiilien ja niiden seosten pesemiseen. Esimerkiksi pesuprosessit, jotka suoritetaan noin 60-65°C lämpötiloissa tai alempana, esim. noin 30-35°C tai alempana, 20 ovat erityisen sopivia. Voi olla hyvin sopivaa käyttää koostumuksia määränä, joka on riittävä antamaan esim. noin 0,4-0,8 g/1 surfaktanttia pesunesteessä, vaikka on tietenkin mahdollista käyttää alempia tai korkeampia kon-sentraatioita, jos halutaan. Ilman rajoitusta voidaan 25 esimerkiksi esittää, että käyttömäärä noin 1-10 g/1, ·;··. esim. noin 3-6 g/1 detergenttiformulaatiota on sopiva käytettäväksi tapauksessa, kun formulaatiot ovat olennai-sesti kuin esimerkeissä.

# ! .130 Joissakin hyödyllisissä suoritusmuodoissa detergentti- * · 'koostumukset voidaan formuloida seuraavista:

Detergentti I: ,: 35 Keksinnön suoritusmuodon mukainen detergenttijauhe, jossa .···. on zeoliittitehoainetta, formuloidaan sisältävän: * · ·»»· ( · 1 I t 1 Λ Ec 79 29 ί Ιο / / t

Aktiivinen kokonaisdetergentti noin 16 %, anioninen de-tergentti noin 9 %, ei-ioninen detergentti noin 6 %, zeo-liittia sisältävää tehoaineitta noin 20 %, akryyli- tai vastaava polymeeri noin 3,5 %, perboraatti valkaisupre-5 kursori noin 6-18 %, aminoa sisältävä valkaisun aktivaat- tori noin 2 %, silikaatti tai muu rakenteentekijä noin 3,5 %, vaihtoehtoisesti noin 2,5 %:iin, entsyymiä noin 8 (vaihtoehtoisesti noin 15) glysiiniyksikköä/mg, alkalin kanssa säätämään haluttu pH käyttöön ja neutraali epäor-10 gaaninen suola ja entsyymejä (noin 0,5 % jokaista entsyy miä) .

Anioninen detergentti on natriumdodekyylibentseenisul-fonaatin, vaihtoehtoisesti natrium lineaarinen alkyyli-15 bentseenisulfonaatin, 6 % ja primäärisen alkyylisulfaa- tin, 3%, seos. Ei-ioninen detergentti on noin C13-C15 etoksilaatti, primäärinen alkoholi, jossa on 7 etoksi-laattijäännöstä/mol. Zeoliittitehoaine on tyyppi A zeo-liitti. Polymeeri on polyakryylihappo. Perboraatti val-20 kaisuaineprekursori on natriumtetraboraattitetrahydraatti tai monohydraatti. Aktivaattori on tetra-asetyylietylee-nidiamiini. Rakenteentekijä on natriumsilikaatti. Neutraali epäorgaaninen suola on natriumsulfaatti.

25 Dteraentti II:

Keksinnön suoritusmuodon mukainen vesipitoinen detergent-tineste formuloidaan sisältämään: :130 16 % dodekyylibentseenisulfonihappo, C12-C15 lineaarinen alkoholi kondensoitu 7 mol/mol etyleenioksidin kanssa, 7 %, 2 % monoetanoliamiini, 6,5 % sitruunahappo, 6 % nat- ,, , riumksyleenisulfonaatti, noin 4,1 % natriumhydroksidi,

;t ; 0,5 % proteaasi, hivenäineita ja vettä 100 %:iin asti. pH

'•55 säädetään arvoon 9-10.

• 1 ·

Muissa hyödyllisissä suoritusmuodoissa detergenttikoostu- * t I » » » 2 2 » · 30 115 9 7 2 mukset voidaan formuloida kuten esim. kansainvälisissä patenttijulkaisuissa nrot. WO 91/00334, WO 91/00335 ja kansainvälisessä patenttihakemuksessa nro. PCT/DK91/00-399.

5

Keksintöä valaistaan lisää seuraavissa esimerkeissä, joita ei ole tarkoitettu millään tavoin rajoittamaan patenttivaatimusten keksinnön ulottuvuutta.

10 Esimerkki 1

Valmistusesimerkki

Seuraavassa esimerkissä, joka osoittaa tällä hetkellä edullisen menetelmän rakentaa ja ekspressoida geenejä 15 koodaamaan villityypin ja muunnoksen proteaasientsyymejä tämän keksinnön suoritusmuotojen mukaisesti, viitataan seuraaviin materiaaleihin: B. subtilis 309 ja 147 ovat Bacillus lentus muunnoksia, 20 tallennettu NCIBihen ja niille on annettu tallennusnume- rot NCIB 10147 ja NCIB 10309 ja kuvattu US patentissa nro. 3 723 250, joka on liitetty tähän viitteeksi.

E. coli MC 1000 (M.J. Casadaban ja S.N. Cohen (1980); J.

25 Mol. Biol.; 138 179-207) tehtiin r-, m+ tavanomaisella '·"· menetelmällä ja on myös kuvattu US patenttihakemuksessa sarjanro. 039 298. 1 j. Tehtiin vektori, joka soveltuu synteettiselle geenille, ;-30 joka koodaa subtilisiini 309:ää ja sen mutantteja. Se oli *;·_ olennaisesti pUCIO plasmidi [C. Yanish-Perron ja J. Messing (1985); Gene; 33 103-119], jossa moninkertainen kloonauskohta on korvattu linkkerillä, jossa on restrik-• ·’ tiokohdat käytetty erottamaan 5 alafragmenttia, jotka '•35 muodostavat geenin. Uusi linkkeri insertoitiin Eco Rl -

Hindin pilkottuun pUC19:ään täten tuhoten nämä kohdat.

31 115972 (RI)KpnIPstIEcoRIHind3CalISphIBam (H3) 5'- AATTGGTACCCTGCAGGAATTCAAGCTTATCGATGGCATGCGGATCC-3' 3'-CCATGGGACGTCCTTAAGTTCGAATAGCTACCGTACGCCTAGGTCGA-5' 5 Rakennettiin synteettinen geeni, joka koodaa subtilisiini 309:n valmista osaa, kuten nähdään seuraavasta kuvauksesta ja kaaviona annettuna kuviossa 1 mukana olevissa piirroksissa (sivut 1/7-7/7). Synteettisen geenin rakenne on tiivistettynä sivuilla 1/7-4/7, mikä myös osoittaa frag-10 mentit, joita käytettiin rakentamiseen. Jokainen alafrag- mentti tehtiin 6-12 oligonukleotidistä. Nukleotidit syntetisoitiin automaattisessa DNA-syntetisoijassa käyttämällä fosforamidiittikemiaa kontrolloidulla lasikannat-timella [S.L. Beaucage ja M.H. Carruthers (1981); Tetra-15 hedron Letters; 22 1859-1869]. Pisteet oligonukleotidien 5'-päissä kuvioissa ovat tarkoitetut osoittamaan että, nämä oligonukleotidit on fosforyloitu. Duplekseja (osoitettu sivuilla 1/7-4/7) muodostettiin vastaavista oligo-nukleotidipareista kuumentamalla 5 min 90°C:ssa, jonka 20 jälkeen jäähdytettiin huoneenlämpötilaan yli 75 min jak son ajan. Dupleksit sekoitettiin ja käsiteltiin T4 DNA-ligaasilla.

Eristettiin 5 alafragmenttia 2 % agaroosigeelissä ja in-25 sertoitiin pSX191:een. Sekvenssi varmistettiin didesok-

·:··. sinukleotidisekvenssoinnilla. Eristettiin fragmentit A-E

ja ligoitiin yhteen pSX191:n kanssa, joka oli pilkottu Kpnl-BamHI: 11a. Ligaatioseoksia käytettiin transformoimaan kompetentti E. coli MC1000 r-,m+ selektoimalla am- '.Λθ pisilliiniresistenssiä. 850 bp Kpnl-BamHI-fragmenttia, i · joka muodostaa osan subtilisiini 309-geenistä, ja joka *** koodaa entsyymin valmista osaa, käytettiin sitten korvaa maan villityypin geeni pSX212:ssa antamaan synnyn pSX222: » * » ; V Ile, mikä sitten transformoitiin kompetenttiin B. subti- :,35 lis SHa273:een. Sen jälkeen kun transformoitua kantaa oli ,···. fermentoitu ja entsyymi puhdistettu, osoitettiin että tuote oli erottumaton villityypin tuotteesta.

t » * t > ► 32 1159 72

Proteaasimuunnokset, jotka on johdettu synteettisestä geenistä, tehdään käyttämällä oligonukleotidejä, joilla on muuttunut sekvenssi kohdassa (kohdissa), mihin mutaa-5 tio halutaan (esim. sekvensseillä, kuten alla on annettu) ja sekoittamalla ne loppujen oligonukleotidien kanssa, jotka ovat sopivia synteettiselle geenille. Muunnosgeenin kokoaminen suoritetaan muunnosmateriaaleilla tavalla, joka on muuten vastaava kuin edellä kuvattu. Lisätietoa 10 synteettisistä geeneistä on yleisesti saatavilla, Agarval et ai (1970); Nature; 227 27-34.

Kpnl-kohta vietiin subtilisiini 309 synteettisen geenin, joka koodaa entsyymin valmista osaa, alkuun. Käytettyä 15 menetelmää kutsutaan oligonukleotidi kohdistettu kaksois- juosteaukon korjausmutageneesiksi ja sen on kuvannut Wlo-dek Mandecki (1986); Proc. Natl. Acad. Sei. USA; 83 7177-7181. pSX172 aukaistaan Ncolrllä subtilisiini 309 geenin valmiin osan alusta ja sekoitetaan oligonukleotidin NOR 20 789:n kanssa (sekvenssi nähdään kuviossa 1 (7/7), kuu mennettiin 100°C:een, jäähdytettiin 0°C:een ja transformoitiin E. coliin. Uudellen transformoinnin jälkeen re-kombinantit voidaan seuloa pesäkehybridisaatiolla käyttä- . mällä 32-P-leimattua NOR 789:ää. Rekombinanteilla, jotka 25 osottautuivat positiivisiksi seulomisen aikana, oli Kpnl- kohta vietynä suoraan NcoI:n eteen vaihtamalla kaksi e-mästä vaihtamatta aminohapposekvenssiä. pSX172 on kuvattu ; EP patenttijulkaisusssa nro. 405 901. Siten luotu Kpnl- :· kohta insertoidaan pSXl20:een 400 bp Pvul-Nhel-fragment-

•30 tiin, jolloin muodostuu pSX212. pSX120 on myös kuvattu EP

patentti julkaisusssa nro. 405 901.

Synteettinen geeni insertoidaan Kpnl:n ja BamHI:n väliin * pSX212:ssa, jolloin syntyy pSX222.

i * · ••35

Esimerkkejä mutaatioista ja vastaavista oligonukleoti-disekvensseistä ovat seuraavat: » ♦ i i » » « * » * * 33 1 15972 A194P (fragmentti D3) 5'- AACAACCGCGCTAGCTTTTCACAGTATGGCCCAGGC - 3'

I 11 I ί 11 III!M I III IIII il 1*111 I I

1 11 i 1111 1 M I i 1) I i I i 11 I f I Mill 3' - GCGCGATCGAAAAGTGTCATACCGGGTCCGGAACTG - 5' 5 A172P (fragmentti D2) 5' - CGCTATCCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGATCAAAAC - 3' I 11111 11 11 I I 11 11 II I 1111 111111 11 11 11 I n I n M n ί in n n ί Hiiliini n li n 3' - GGCTTGCGTTACCGTCAGCCTCGATGACTAGTTTTGTTGTTG- 5' 10 S57P (fragmentti Bl) 57 - AGCTTTGTACCAGGGGAACCGCCGACTCAAGATGGG - 3' I 1111 I 11 I i 111 11 11111111111111 111 M 1111 111 M 11 11! 11111 m 11111 111 3' - AACATGGTCCCCTTGGCGGCTGAGTTCTACCCTTACCC - 5' 15 Nämä oligonukleotidit yhdistettiin loppujen synteettisen geenin, jota ei muutettu, oligonukleotidien kanssa.

Esimerkki 2 20 Puhdistusesimerkki Tämä menetelmä koskee subtilisiini 147 entsyymin, subti-lisiini 309 entsyymin tai niiden mutanttien 10 1 mittakaavan fermentaation puhdistusta.

25 ·'*· Noin 8 1 fermentaatiolientä sentrifugoitiin 5000 rpm 35 '!"! min 1 1 astioissa. Supernatantit säädettiin pH:hon 6,5 :Y: käyttämällä 10 % etikkahappoa ja suodatettiin Seitz Supra *·> S100 suodatinlevyillä.

t t * i ,'30 i » » ·

Suodokset väkevöitiin noin 400 ml:aan käyttämällä Amicon * t i CH2A UF-yksikköä, joka oli varustettu Amicon S1Y10 UF ,, , patruunalla. UF konsentraatti sentrifugoitiin ja suoda- ' tettiin ennen absorptiota huoneenlämpötilassa basitrasii- •3$ ni affiniteettipylväässä pH:ssa 7. Proteaasi eluoitiin basitrasiinipylväästä huoneenlämpötilassa käyttämällä 25 % 2-propanolia ja 1 M natriumkloridia puskuriliuoksessa t iti j > * * * 115972 34 0,01 dimetyyliglutaraatin, 0,1 M boorihapon ja 0,002 M kalsiumkloridin kanssa säädettynä pH:hon 7.

Fraktiot, joissa oli proteaasiaktiivisuutta basitrasii-5 nipuhdistusvaiheesta, yhdistettiin ja käytettiin 750 ml

Sephadex G25 pylvääseen (5 cm halk.), joka oli tasa

Fraktiot, joissa oli proteaasiaktiivisuutta basitrasii-nipuhdistusvaiheesta, yhdistettiin ja käytettiin 750 ml 10 Sephadex G25 pylvääseen (5 cm halk.)/ joka oli tasapaino tettu puskurilla, jossa oli 0,01 dimetyyliglutaraattia, 0,2 M boorihappoa ja 0,002 m kalsiumkloridia säädettynä pH:hon 6,5.

15 Fraktiot, joissa oli proteolyyttistä aktiivisuutta Sepha dex G25-pylväästä, yhdistettiin ja käytettiin 150 ml CM Sepharose CL 6B kationinvaihtopylvääseen (5 cm halk.), joka oli tasapainotettu puskurilla, jossa oli 0,01 M di-metyyliglutaraattia, 0,2 M boorihappoa ja 0,002 M kal-20 siumkloridia säädettynä pH:hon 6,5.

Proteaasi eluoitiin käyttämällä lineaarista 0-0,1 M nat-riumkloridigradienttia 2 l:ssa samaa puskuria (0-0,2 M natriumkloridi sub 147 tapauksessa).

...25 i> >; Lopullisessa puhdistusvaiheessa proteaasi, jossa oli .. fraktiot CM Sepharose-pylväästä, yhdistettiin ja väkevöi- ‘ ; tiin Amicon ultrasuodatinkammiossa, jossa oli GR81PP-mem- braani (Danish Sugar Factories Inc.:Itä).

: 3Ό v : Esimerkki 3

Differentiaalipyyhkäisykalorimetri • «

Puhdistetuille proteaasimuunnoksille tehtiin lämpöanalyy- .'.35 si differentiaalipyyhkäisykalorimetrillä (DSC).

• »

Laite oli Setaram mikro DSC laite yhdistettynä HP86 tie- I t I I t · „ 115972 35 tokoneeseen materiaalin keräystä ja analyysiä varten. Se-taram-ohjelmistoa käytettiin.

Entsyymi laimennettiin edullisesti 2 mg/ml pitoisuuteen-5 nestemäisessä tehoainedetergentissä (pH 8,5), jolla oli seuraava koostumus: AE1 (C12_14) ; EO 6 15 % LAS2 (C12) 10 % 10 Kookosrasvahappo 9 %

Oleiinihappo (C18) l %

Trietanoliamiini (pKA 7,9) 9 %

Glyseroli 10,5 %

Etanoli 1,5 % 15 Natriumsitraatti 8 %

CaCl; 2H20 0,1 %

NaOH 1 %

Vesi 34,9 % 20 *) Alkoholietoksilaatti 2) Lineaarinen alkyylibentseenisulfonaatti Lämmitysnopeus oli 0,5°C/min 25°C:sta 90°C:een.

:25 Subtilisiini 309 muunnoksien stabilointi suhteessa villi- ·:*·· tyypin entsyymiin mitattuna tällä menetelmällä, esitetään ·.·. taulukossa 3, edellä.

Esimerkki 4 .30 Varastointistabiilisuus

Keksinnön entsyymien varastointistabiilisuus määritettiin ja verrattiin subtilisiini 309 (villityyppi) varastointi-· tistabiilisuuteen. Stabiilisuustesti suoritetaan miniva- .‘3·5 rastointitestinä. Jokaisessa putkessa käytettiin 100 μΐ ....: näytettä.

115972 36

Entsyymiannokset olivat 0,25 mg entsyymiä/g detergenttiä. Tässä testissä käytettiin nestemäistä detergenttikoostu-musta, katso detergentti II, supra.

5 Putkia inkuboitiin 35°C:ssa 3, 7, 14 ja 21 d, vastaavasti ja jäännösaktiviisuus määritettiin.

Jäännösaktiviisuusmääritysmenetelmä perustui dimetyyli-kaseiinin (DMC) liuoksen pilkkomiseen proteolyyttisillä 10 entsyymeillä. Primääriset aminoryhmät, jotka muodostuivat tässä prosessissa, reagoivat trinitrobentseenisulfoniha-pon kanssa (TNBS) muodostaen värillisen kompleksin. Reaktiota seurataan in situ, jotta muutos absorbanssissa/ai-kayksikkö voidaan laskea.

15

Koska detergentissä saattaisi olla yhdisteitä, joilla on primäärisiä aminoryhmiä, on välttämätöntä tutkia tämä ja tehdä korjaus detergentin tehoon. Korjaus tehdään mittaamalla puhtaan detergentin sokea arvo ja vähentämällä tämä 20 arvo arvosta, joka mitattiin kuten edellä kuvattiin.

Aktiivisuus määritetään suhteessa näytteeseen, joka jäädytetään välittömästi valmsitamisen jälkeen ja pidetään -10°C lämpötilassa analyysiin asti. Tämän näytteen aktii-...25 visuus asetetaan 100 %:iin. Vastaavien näytteiden aktii- ii>>; visuus varastointitestistä määritetään suhteessa 100 % . . näytteeseen.

I I • · ·

Reaktio-olosuhteet olivat: 115972 37

Kaikki aktiivisuudet määritettiin rinnakkaisina.

Lehtinen, AF 285/1 (tai myöhemmät toimitukset), jotka kuvaavat tätä analyyttistä menetelmää, ovat saatavilla 5 pyydettäessä Novo Nordisk A/S, Tanska, mikä lehtinen on täten liitetty tähän viitteeksi.

Varastointistabiilisuustestin tulos nähdään kuviossa 2. Yleisesti, lämpöstabiilisuus, kuten määritetty DSC:llä, 10 ja varastointistabiilisuus korreloi hyvin.

Esimerkki 5 Pesuteho 15 Pesutehotestit suoritettiin ruohonmehulla liattuun puu villaan mallipesussa 20°C:ssa, isotermisesti 10 min.

Käytettiin detergenttinä 5 g/1 jauhedetergenttiä, katso detergentti I, supra. pH säädettiin 10,2:ksi lisäämällä 20 NaOH/HCl:a. Vesi, jota käytettiin, oli noin 9°dH (saksa lainen kovuus) taulukossa 5 esitettyihin testeihin. Taulukossa 6 esitettyihin testeihin käytettiin 6°dH vettä. Tekstiili/pesunestesuhde oli 6 g tekstiiliä/1 pesunestettä.

".25 ·;··· Testit suoritettiin entsyymipitoisuuksissa: 0, 0,025, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0 ja 2,0 mg entsyymiproteiinia/1. Jo-kaiselle entsyymille suoritettiin kaksi riippumatonta j·". testisarjaa. Tulokset, jotka nähdään taulukoissa 5-6, .30 ovat näiden testien keskiarvoja.

Pesun jälkeen kangas huuhdeltiin juoksevan hanaveden alla • ja kuivattiin ilmassa. Proteaasin teho määritettiin muut- · tantalla (AR) remissiota (% R) 460 nm:ssä mitattuna Data- .'J5 color Elrephometer 2000:11a, AR:n ollessa remissio pesun jälkeen, kun proteaasia oli lisätty, miinus remissio pesun jälkeen, kun proteaasia ei lisätty.

» * * 33 115972

Tulokset pesutehotesteistä on esitetty taulukoissa 5-6. Havaittiin että kaikki muunnokset, paitsi subtilisiini 309/S256P, olivat ainakin vastaavia kuin subtilisiini 309 (villityyppi).

5

Taulukko 5

Differentiaali remissio, delta R

Entsyymiannos mg entsyymiä/1 detergenttiä 10 Muunnos 0,025 0,05 0,1 0,5 1,0 2,0 S57P 2,4 4,4 7,4 16,8 20,0 22,1 A172P 2,4 4,4 7,5 16,9 20,1 22,3 S188P 2,2 4,8 7,5 16,9 20,9 21,7 15 A194P 2,5 5,3 7,6 17,5 20,5 20,8

Subt309 3,2 4,6 6,9 16,1 20,4 20,7 S259P 1,7 2,5 3,9 6,7 7,2 7,0

Subt309 0,8 2,2 3,6 5,8 6,5 6,6 20 _

Taulukko 6

Differentiaali remissio, delta R

,,25 Entsyymiannos mg entsyymiä/1 detergenttiä

Muunnos 0,025 0,05 0,1 0,5 1,0 2,0 ‘•'f T38P 1,9 3,7 7,0 14,7 16,9 16,7 S99P 1,8 3,1 5,4 15,4 16,4 16,9 ! 30 S256P 0,7 1,5 3,0 9,7 15,2 16,8

Subt309 1,9 3,9 6,9 14,5 16,2 17,1 ,35

Claims

39 1 15972

1. Stabiloitu subtilisiini, jossa luonnossa esiintyvä aminohappo (muu kuin proliini) on substituoitu proliini- 5 jäännöksellä yhteen tai useampaan asemaan: 57, 98, 172, 194 ja 259 (BPN' numerot).

2. Patentkrav . 1. Stabiliserat subtilisin, i vilket en naturligt före- , kommande aminosyra (annan än prolin) har substituerats med en prolinrest vid en eller flera av positionerna: '·*· 25 57, 98, 172, 194 och 259 (BPN' -nummer) . * * · » • ’.· 2. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 1, vilket I/· : dessutom innefattar en eller flera av följande substitu- tioner: I 30 27R, 36D, 38P, 76D, 97N, 98R, 104Y, 120D, 128G, 188P, 195E, 206C, 218S, 235L, 235R, 237R, 242P, 251E och 263F • » (BPN’-nummer).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen stabiloitu subtilisiini, jossa vielä on yksi tai useampi seuraavista substi- 10 tuutioista: 27R, 36D, 38P, 76D, 97N, 98R, 104Y, 120D, 128G, 188P, 195E, 206C, 218S, 235L, 235R, 237R, 242P, 251E ja 263F (BPN1 numerot).

3. Stabiliserat subtilisin enligt nägot av patentkraven ·’· 35 1 eller 2, vilket är ett stabiliserat subtilisin 309, ett stabiliserat subtilisin 147, ett stabiliserat subtilisin BPN1 eller ett stabiliserat subtilisin Carlsberg. 42 1 15 9 7 2

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen stabiloitu sub-15 tilisiini, joka on stabiloitu subtilisiini 309, stabiloitu subtilisiini 147, stabiloitu subtilisiini BPN' tai stabiloitu subtilisiini Carlsberg.

4. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 3, vilket är ett subtilisin 309 i vilket en eller flera av följande substitutioner har introducerats: T38P, S57P, A98P,

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen stabiloitu subtilisii-20 ni, joka on subtilisiini 309, johon on viety yksi tai useampi seuraavista substituutioista: T38P, S57P, A98P, A172P, S188P, A194P, S242P ja S259P (BPN' numerot). * * · * · • ’ 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen stabiloitu subtilisii- 25 ni, jossa vielä on yksi tai useampi seuraavista substi- tuutioista: K27R, *36D, N76D, G97N, A98R, V104Y, H120D, ; V S128G, G195E, Q206C, N218S, K235L, K235R, K237R, K251E ja Y263F (BPN'-numerot) . | 30 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii- .···. ni, joka on subtilisiini 309/K27R + *36D + G97N + A98R + » · A194P + K235R + K237R + K251E + Y263F (BPN'-numerot) .

5. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 4, vilket dessutom innefattar en eller flera av följande substitu-tioner:

5 A172P, S188P, A194P, S242P och S259P (BPN'-nummer).

6. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket 15 är subtilisin 309/K27R + *36D + G97N + A98R + A194P + K235R + K237R + K251E + Y263F (BPN' -nummer).

7. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket är subtilisin 309/K27R + *36D + G97N + A194P + K235R +

20 K237R + K251E + Y263F (BPN-nummer).

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii-35 ni, joka on subtilisiini 309/K27R + *36D + G97N + A194P + !·'. K235R + K237R + K251E + Y263F (BPN'-numerot) . 1Ί 5972

8. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket är subtilisin 309/K27R + *36D + G97N + A194P + K235R + ’ ’ K237R + Y263F (BPN'-nummer). •V.: 2 5

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii-ni, joka on subtilisiini 309/K27R + *36D + G97N + A194P + K235R + K237R + Y263F (BPN'-numerot).

9. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket ; V är subtilisin 309/*36D + N76D + H120D + A194P + G195E + ::: K235L (BPN'-nummer). : 30 10. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket ,**\ är subtilisin 309/*36D + G97N + V104Y + H120D + A194P + • G195E (BPN'-nummer).

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii ni, joka on subtilisiini 309/*36D + N76D + H120D + A194P + G195E + K235L (BPN'-numerot).

10 K27R, *36D, N76D, G97N, A98R, V104Y, H120D, S128G, G195E, Q206C, N218S, K235L, K235R, K237R, K251E och Y263F (BPN'-nuramer) .

10. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii- 10 ni, joka on subtilisiini 309/*36D + G97N + V104Y + H120D + A194P + G195E (BPN'-numerot).

11. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket .:. 35 är subtilisin 309/*36D + G97N + V104Y + H120D + A194P + G195E + K235L (BPN'-nummer) . 115972

11. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisiini, joka on subtilisiini 309/*36D + G97N + V104Y + H120D +

12. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket är subtilisin 309/*36D + G97N + H120D + A194P + G195E (BPN' -nummer) .

12. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisiini, joka on subtilisiini 309/*36D + G97N + H120D + A194P + G195E (BPN1-numerot). 20

13. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket är subtilisin 309/*36D + G97N + H120D + A194P + G195E + K235L (BPN'-nummer).

13. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii-. ni, joka on subtilisiini 309/*36D + G97N + H120D + A194P + I G195E + K235L (BPN'-numerot). i t «

14. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket 10 är subtilisin 309/*36D + V104Y + H120D + A194P + G195E (BPN'-nummer).

14. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii- ni, joka on subtilisiini 309/*36D + V104Y + H120D + • *.· A194P + G195E (BPN'-numerot) . * · · «

15 K235L (BPN'-nummer).

15. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket är subtilisin 309/*36D + V104Y + H120D + A194P + G195E +

15. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii- I 30 ni, joka on subtilisiini 309/*36D + V104Y + H120D + ,···, A194P + G195E + K235L (BPN'-numerot) . • » t

15 A194P + G195E + K235L (BPN1-numerot).

16. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket är subtilisin 309/*36D + H120D + A194P + G195E (BPN1 -nummer). 20

16. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii- ·,,,· ni, joka on subtilisiini 309/*36D + H120D + A194P + G195E 35 (BPN'-numerot). IIRO??

41. I w > / L·

17. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket . är subtilisin 309/*36D + H120D + A194P + G195E + K235L (BPN’-nummer).

17. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii-ni, joka on subtilisiini 309/*36D + H120D + A194P + G195E + K235L (BPN'-numerot) .

18. Patenttivaatimuksen 5 mukainen stabiloitu subtilisii ni, joka on subtilisiini 309/A194P (BPN'-numerot).

19. Nukleotidisekvenssi, joka koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-18 mukaista stabiloitua subtilisii- 10 niä.

20. Ekspressiovektori, jossa on nukleotidisekvenssi, joka koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-18 mukaista stabiloitua subtilisiiniä. 15

21. Isäntäorganismi, jossa on ekspressiovektori, jossa on nukleotidisekvenssi, joka koodaa minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-18 mukaista stabiloitua subtilisiiniä.

18. Stabiliserat subtilisin enligt patentkrav 5, vilket är subtilisin 309/A194P (BPN'-nummer) .

: : 19. Nukleotidsekvens som kodar för ett stabiliserat sub tilisin enligt nägot av patentkraven 1-18. 30 > I '·.

20. Expressionsvektor innefattande en nukleotidsekvens * * som kodar för ett stabiliserat subtilisin enligt nägot av •G patentkraven 1-18. •G 35

21. Värdorganism innehällande en expressionsvektor vil- , ken bar en nukleotidsekvens som kodar för ett stabilise rat subtilisin enligt nägot av patentkraven 1-18.