CN117417922A - 一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用 - Google Patents
一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117417922A CN117417922A CN202311709002.3A CN202311709002A CN117417922A CN 117417922 A CN117417922 A CN 117417922A CN 202311709002 A CN202311709002 A CN 202311709002A CN 117417922 A CN117417922 A CN 117417922A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protease
- alkaline protease
- recombinant
- gene
- aplm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 title claims abstract description 50
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 31
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 65
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 18
- 239000010985 leather Substances 0.000 abstract description 8
- 239000004753 textile Substances 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710187199 Thermostable alkaline protease Proteins 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091005508 Acid proteases Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 101710184263 Alkaline serine protease Proteins 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 1
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- 102220470818 Histone deacetylase 8_S39A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000057 Mannan Polymers 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235342 Saccharomycetes Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N mannan Chemical class O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@H]3[C@H](O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]3O)CO)[C@@H](O)[C@H]2O)CO)[C@H](O)[C@H]1O LUEWUZLMQUOBSB-GFVSVBBRSA-N 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000029865 regulation of blood pressure Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用。通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列进行S101P，G131A，K170R突变，得到了突变体APLM。与APL相比，该突变体耐热性提升显著，在75℃高温下孵育3 min，酶活仍然维持在80%以上，而APL在75℃下3min仅能维持20%的酶活；本发明蛋白酶具有以下性质：最适pH 10.5，具有良好的热稳定性，开发前景良好，可广泛应用于食品、制革、纺织等行业。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用。
背景技术
蛋白酶是一种能够通过切割肽键实现蛋白质及肽链降解的水解酶，其发现及使用历史悠久，是全球用量最大的酶制剂之一。蛋白酶广泛分布于自然界中，几乎所有生物体内都有蛋白酶的存在。蛋白酶参与生物体内各种生理代谢过程，其在食物消化、溶血消炎、调节血压、细胞自溶及机体衰老调控方面发挥着重要作用。
目前主要根据蛋白酶最适作用pH将其分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶以及碱性蛋白酶三类。碱性蛋白酶的活性中心一般为丝氨酸，所以又称碱性丝氨酸蛋白酶。工业上应用较多的碱性蛋白酶主要来自于芽孢杆菌。碱性蛋白酶被广泛应用于洗涤、食品、纺织、制革等多个领域。在洗涤行业，碱性蛋白酶可用作洗涤用品的添加剂用于水解污渍中的蛋白质，能够起到降低清洗温度、减少漂洗次数，减少含磷化合物用量的作用；在食品行业，通过碱性蛋白酶水解的动植物蛋白用途广泛，可用于生产婴儿食品配料、功能性食物和饮品、及其他具有高营养价值的水解蛋白质食品；在纺织行业，碱性蛋白酶可用于熟丝的制备；在制革行业，碱性蛋白酶在皮革脱毛和软化工序中发挥着越来越重要的作用。
在实际工业应用中，对碱性蛋白酶往往也会提出更高的要求使其能够适应不同的使用场景，目前现有的碱性蛋白酶的酶活和热稳定性往往达不到上述要求，因此开发一种耐高温碱性蛋白酶具有重要意义。
公开号为CN116904428A的专利中公开了：一种改良高温碱性蛋白酶AprThc的稳定性的方法及突变体，对碱性蛋白酶AprThc进行L362I、K211G和/或R173G突变，以提升其热稳定性和pH稳定性，对于提升蛋白酶的综合性能，降低蛋白酶的使用成本具有重要意义，为蛋白酶的性质改良提供了有效的技术方法。但其在pH稳定性方面，相对于突变前提升有限。
公开号为CN 110777136 A的专利中公开了：一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。所述碱性蛋白酶突变体的亲本蛋白酶为枯草芽孢杆菌PB92的蛋白酶，所述碱性蛋白酶突变体至少包含以下氨基酸的置换：V262I。使其能更好的适用于工业领域，特别是洗涤剂行业。使碱性蛋白酶在碱性pH条件下以及耐热性方面的酶活有所提高，为其更好的适应工业化生产奠定了基础。但其耐热性能的提升有限。
发明内容
本发明的目的是提供一种碱性蛋白酶突变体，它具有耐高温，较宽的pH稳定性等优点，相对于突变前性能更优。
具体地，本发明提供了一种耐高温碱性蛋白酶，即所述的碱性蛋白酶突变体。本发明中对其编号为耐高温碱性蛋白酶APLM，其由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列突变得到，突变位点包括S101P、G131A、K170R中的任一或多。
如本领域技术人员一般理解，所述的氨基酸取代的含义分别是第101位丝氨酸突变体为脯氨酸、第131位甘氨酸突变为丙氨酸、第170位赖氨酸突变为精氨酸。
本发明的突变前序列SEQ ID NO.1为来自地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）的碱性蛋白酶APL，该酶基因编码275个氨基酸，理论分子量为27.5 kDa。
具体地，突变后的氨基酸序列（耐高温碱性蛋白酶APLM）如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO. 1：
MAQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGSGSYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGASGSTAMKQAVDNAYARGVVVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPAKYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVGAELEVMAPGAGVYSTYPTNTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ；
SEQ ID NO.2：
MAQTVPYGIPLIKADKVQAQGFKGANVKVAVLDTGIQASHPDLNVVGGASFVAGEAYNTDGNGHGTHVAGTVAALDNTTGVLGVAPSVSLYAVKVLNSSGPGSYSGIVSGIEWATTNGMDVINMSLGGASASTAMKQAVDNAYARGVVVVAAAGNSGSSGNTNTIGYPARYDSVIAVGAVDSNSNRASFSSVGAELEVMAPGAGVYSTYPTNTYATLNGTSMASPHVAGAAALILSKHPNLSASQVRNRLSSTATYLGSSFYYGKGLINVEAAAQ。
本发明还提供了前述耐高温碱性蛋白酶的相关基因工程产物，选自：
1、表达基因（基因）
2、表达载体（重组载体）；
3、基因工程细胞（重组菌株）。
具体地：
基于前述的氨基酸序列，本发明提供编码前述的耐高温碱性蛋白酶的基因。
基于密码子简并性原则，在知晓氨基酸序列的条件下，本领域技术人员可以设计出多种基因用于表达相应耐高温碱性蛋白酶。
作为优选，所述的基因可以包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或与其具有80%以上同一性的核苷酸序列。
本发明通过基因合成方法合成了蛋白酶突变体基因APLM，DNA全序列分析结果表明，蛋白酶APLM基因APLM全长828bp。
SEQ ID NO.3：
ATGGCGCAAACTGTACCATACGGTATTCCACTCATAAAAGCCGATAAGGTGCAGGCACAAGGATTTAAAGGGGCCAATGTTAAGGTTGCAGTACTTGACACGGGTATCCAGGCAAGTCATCCGGACCTCAATGTCGTGGGCGGGGCTTCTTTCGTTGCTGGTGAGGCATATAATACCGATGGTAACGGGCATGGGACACACGTGGCGGGTACAGTCGCGGCTCTCGATAACACGACAGGGGTCTTAGGCGTTGCGCCCAGTGTATCACTATACGCGGTTAAGGTGTTGAACAGCTCGGGCccgGGATCTTATTCTGGGATTGTGAGTGGCATCGAATGGGCTACTACGAACGGAATGGATGTTATAAACATGTCGTTGGGTGGCGCCTCAgcaTCTACGGCTATGAAGCAGGCGGTAGACAACGCATACGCCCGGGGAGTTGTCGTTGTGGCTGCGGCCGGCAACTCCGGGAGCAGCGGGAATACAAATACAATTGGATACCCTGCGaggTATGATTCGGTGATCGCTGTAGGAGCCGTTGATTCTAATTCGAACAGGGCGAGTTTCTCGTCAGTCGGCGCCGAACTGGAGGTAATGGCACCCGGAGCGGGCGTATATTCCACTTACCCTACCAATACGTATGCAACCCTGAACGGTACCTCGATGGCATCCCCACACGTCGCTGGCGCTGCTGCTTTGATTTTATCCAAACATCCGAACCTTTCTGCCAGTCAGGTGCGTAATAGACTGAGCTCCACTGCTACCTATTTAGGTTCTTCATTTTATTACGGGAAAGGTCTAATAAATGTAGAGGCAGCTGCACAATGA。
本发明所述的重组载体用于表达前述的耐高温碱性蛋白酶，或者表述为包括前述的基因。
所述的重组载体的载体骨架可以由本领域技术人员根据实施需要进行选择，可以是本领域已公开或未公开的任何具有表达能力的载体，包括但不限于真核载体和原核载体。优选为ppIC9K-APLM，将本发明的蛋白酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的蛋白酶基因插入到质粒pPIC9K上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9K-APLM。
本发明所述的基因工程细胞用于表达前述的耐高温碱性蛋白酶，或者表述为包括前述的基因或重组载体。
所述的基因工程细胞的基础细胞可以是本领域已公开或未公开的任何具有表达能力的细胞类型，包括但不限于真核细胞或原核细胞。
根据实施需要，所述的基因工程细胞本领域技术人员可以选择为重组菌株。所述重组菌株的基础菌株可以是大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌；优选为为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，进一步优选为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115。
在一些实施例中，所述的重组菌株优选为重组菌株GS115/APLM，其含义为表达APLM基因的毕赤酵母GS115菌株。
基于前述的基因工程产物，本发明提供了前述的耐高温碱性蛋白酶的制备方法。
根据本领域技术人员一般理解，所述的制备方法中可以包括通过基因工程进行表达。通常可以包括以下步骤：
1)构建表达前述的耐高温碱性蛋白酶的重组载体，转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组蛋白酶表达；
3)回收并纯化得耐高温碱性蛋白酶APLM。
优选地，将所述的重组载体为重组酵母表达质粒，所述的宿主细胞（重组菌株的基础菌株）为毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/APLM。
本发明还前述的耐高温碱性蛋白酶在蛋白质及肽链降解中的应用。
具体地，可以用于洗涤、食品制备或制革。
相应地，本发明保护包括前述的耐高温碱性蛋白酶的酶制剂。
本发明的有益效果：
本发明的蛋白酶突变体APLM具有良好的热稳定性，并在常温下具有较宽的pH稳定性。本发明的蛋白酶突变体，其最适pH值为10.5，在pH8.0-11.5范围内具有较高的催化活性（剩余酶活>60%）；最适温度为60℃，在20℃仍具有30%左右的酶活力；75℃处理后仍有80%活力。
本发明首先解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在洗涤、食品、制革等行业中应用的耐高温碱性蛋白酶。本发明的耐高温碱性蛋白酶所具备的特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本耐高温碱性蛋白酶可应用于洗涤行业，加速对蛋白污渍如牛奶、血液、肉汁等的水解作用，从而节省洗涤时间和洗涤用水量，提高清洗效率，另一方面，加酶洗涤剂的使用改良了传统洗涤剂配方，减少了磷等对环境有害的化学物质以及漂白剂等的添加量，不仅可以保护人体免受洗涤剂的伤害，还可以增加环保效益。在食品行业的应用上，耐高温碱性蛋白酶还可应用与奶酪的制作、肉类的软化、面包发酵以及生物活性肽的制备等，不仅可以改善食品的风味，还能够提高营养价值，降低视频的杂菌污染从而延长食品的保质期。此外，在制革行业的应用上，耐高温碱性蛋白酶在脱毛时可有效地分解角蛋白和弹性蛋白，从而提升皮革质量；软化过程可以提高皮革的延展性和韧性，应用潜力巨大。
附图说明
图1重组蛋白酶突变体的最适pH。
图2重组蛋白酶突变体的pH稳定性。
图3重组蛋白酶突变体的最适温度。
图4重组蛋白酶突变体的热稳定性。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
试验材料和试剂
1、菌株及载体：以下实施例中蛋白酶突变体基因APLM由北京睿博兴科生物技术有限公司合成获得，毕赤酵母表达载体pPIC9K及菌株GS115购自于Invitrogen公司。
2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。甘露聚糖购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。
3、培养基：
（1）酵母培养基YPD：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%葡萄糖，2%琼脂，pH7.0。
（2）大肠杆菌培养基LB：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl，pH7.0。
（3）BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB，0.00004% Biotin，1%甘油(V/V) 。
（4）BMMY培养基：除以0.5%甲醇代替甘油，其余成分均与BMGY相同，pH4.0。
说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
实施例1 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）蛋白酶突变体编码基因APLM的合成
本发明以来自于地衣芽孢杆菌的蛋白酶apl基因作为参考，对其序列进行如下突变（S101P，G131A，K170R），并在突变后序列的5’端与3’端分别加入EcoRI和NotI限制酶切位点，将序列发送至北京睿博兴科生物技术有公司进行人工合成基因。人工合成的蛋白酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2 蛋白酶突变体基因APLM的克隆
合成好的基因载体以穿刺菌的形式保存，于超净台中用无菌牙签挑取穿刺菌，并置于含Amp（工作浓度：100μg/mL）抗生素的LB摇管中，37℃，220rpm过夜培养，次日按康为世纪质粒提取试剂盒PurePlasmid Mini Kit（CW0500）说明书步骤进行实验提取含有突变体基因的载体。
根据蛋白酶突变体基因序列，设计并合成了如下引物：
P1:CCGGAATTCCGGATGGCGCAAACTGTACCATACG（SEQ ID NO.4）；
P2:TAGCGGCCGCATATTTTCATTGTGCAGCTGCCTCTACA（SEQ ID NO.5）。
以提取后的载体为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5 min；然后94℃变性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1 min，30个循环后72℃保温10 min。得到一约856bp片段，将该片段回收后与pMD19载体相连送北京睿博兴科生物技术有限公司测序，预测蛋白分子量为27.5kDa。
根据测序得到的核苷酸序列，通过DNAMan软件将得到的核苷酸序列与apl序列进行比对，确认S101P，G131A，K170R三处位置的突变无误。
实施例3 重组蛋白酶的制备
将表达载体pPIC9K进行双酶切(EcoR I+NotI)，同时将编码蛋白酶突变体的基因APLM双酶切(EcoR I+NotI)，酶切出编码成熟蛋白酶的基因片段与表达载体pPIC9K连接，获得含有蛋白酶基因APLM的重组质粒pPIC9K- APLM并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/APLM。
取含有重组质粒的GS115菌株与对照菌株（即表达未突变蛋白酶的菌株GS115/ apl），接种于300 mL BMGY培养液中，30℃ 200 rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于150 mL BMMY培养基重悬，30℃ 200 rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清，测定蛋白酶的活力。
实施例4 重组蛋白酶APLM的活性分析
具体方法如下：在pH10.5，40℃条件下，11 mL的反应体系包括1mL适当的稀释酶液，1mL底物，反应10 min，加入2 mL 三氯乙酸终止反应，40℃水浴静置10 min，离心。取上清液加入碳酸钠溶液5 mL，随后加入1 mL福林试剂，于680nm波长处测定吸光值，具体酶活测定方法参照DB22/T 1819-2013饲料用酶制剂中酸性蛋白酶活力的测定-分光光度法。蛋白酶活性单位定义：1g固体酶粉或1mL液体酶在一定温度和pH条件下，1 min水解酪蛋白产生1ug酪氨酸为1个酶活单位。重组蛋白酶的表达量为190 U/mL，对照组蛋白酶表达量为160U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组蛋白酶在毕赤酵母中得到了表达。
实施例5 重组蛋白酶APLM的性质测定
将重组蛋白酶APLM与未突变蛋白酶APL进行酶学性质测定及比较。同时，另外加入突变体重组蛋白酶APLM1进行酶学性质对比，APLM1序列为在SEQ ID NO.1基础上进行了S39A，G146Y，H238Q突变，具体APLM1突变体及APLM1重组酶制备方法可参照上述实施例。
1、重组蛋白酶APLM的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
将对照组蛋白酶APL与重组表达的蛋白酶APLM在不同的pH条件下进行酶促反应分别测定最适pH。将适当稀释的酶液在不同的pH（3.5-12.5）条件下进行酶促反应测定其最适反应pH。所使用缓冲液为pH 3.5-8.0的柠檬酸—磷酸氢二钠系列缓冲液及pH 8.0-12.5的0.1M甘氨酸-氢氧化钠缓冲液。蛋白酶APLM在不同pH的缓冲体系，40℃下测定的pH适性结果（图1）表明，重组蛋白酶APLM的最适pH值为10.5，在pH 8.0-11.5范围内，该酶能够维持60%以上的酶活力。
将酶液在不同pH值的缓冲液中37℃处理60 min，测定酶活以研究酶的pH稳定性。结果（图2）表明重组蛋白酶APLM在pH 4.5-11.5之间均很稳定，在此pH范围内处理60 min仍能维持80%以上的酶活，说明此酶具有较好的pH稳定性，较对照组蛋白酶APL及蛋白酶APLM1相比，重组蛋白酶APLM的pH稳定性有所提升。
2、重组蛋白酶APLM的最适温度及热稳定性测定方法如下：
蛋白酶的最适温度的测定为在pH 10.5条件下，分别测定不同温度（20-80℃）下的重组蛋白酶APLM与对照组蛋白酶APL及蛋白酶APLM1的酶促反应活性，重组蛋白酶APLM的最适反应温度为60℃（图3）。
耐温性测定为蛋白酶在不同温度下处理3 min，再在40℃下进行酶活性测定。耐温性实验表明：重组蛋白酶APLM在75℃下处理3 min，剩余酶活仍在80%以上（图4），而对照组蛋白酶APL与蛋白酶APLM1在75℃处理3 min即失去大部分酶活，表明重组蛋白酶APLM的热稳定性较对照组及APLM1突变体相比提高显著。
Claims (10)
1.一种耐高温碱性蛋白酶，其特征在于，为耐高温碱性蛋白酶APLM，其由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列突变得到，突变位点包括S101P、G131A、K170R中的任一或多。
2.编码权利要求1所述的耐高温碱性蛋白酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.3具有80%以上同一性的核苷酸序列。
4.包含权利要求2-3任一项所述基因的重组载体。
5.包含权利要求2-3任一项所述基因的基因工程细胞。
6.权利要求1所述的耐高温碱性蛋白酶的制备方法，其特征在于，包括通过基因工程进行表达。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建表达权利要求1所述的耐高温碱性蛋白酶的重组载体，转化宿主细胞，得重组菌株；
2)培养重组菌株，诱导重组蛋白酶表达；
3)回收并纯化得耐高温碱性蛋白酶APLM。
8.权利要求1所述的耐高温碱性蛋白酶在蛋白质及肽链降解中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，用于洗涤、食品制备或制革。
10.包括权利要求1所述的耐高温碱性蛋白酶的酶制剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311709002.3A CN117417922B (zh) | 2023-12-13 | 2023-12-13 | 一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311709002.3A CN117417922B (zh) | 2023-12-13 | 2023-12-13 | 一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117417922A true CN117417922A (zh) | 2024-01-19 |
| CN117417922B CN117417922B (zh) | 2024-03-15 |
Family
ID=89523402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311709002.3A Active CN117417922B (zh) | 2023-12-13 | 2023-12-13 | 一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117417922B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1263765A (en) * | 1969-11-18 | 1972-02-16 | Godo Shusei Kabushika Kaisha | A method for the production of protease by cultivating bacteria |
| WO2001016285A2 (en) * | 1999-08-31 | 2001-03-08 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
| JP2004008085A (ja) * | 2002-06-06 | 2004-01-15 | Kao Corp | 変異アルカリプロテアーゼ |
| CN1711354A (zh) * | 2002-11-06 | 2005-12-21 | 诺和酶股份有限公司 | 枯草杆菌酶变体 |
| KR20090018315A (ko) * | 2007-08-17 | 2009-02-20 | 한국과학기술원 | 대장균 유래 ｐｔｓＬ 프로모터를 함유하는 재조합벡터 및이를 이용한 외래 단백질의 제조방법 |
| CA2726451A1 (en) * | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods comprising variant microbial proteases |
| CN107384897A (zh) * | 2017-08-02 | 2017-11-24 | 北京科为博生物科技有限公司 | 一种碱性蛋白酶及其基因和应用 |
| CN115851679A (zh) * | 2022-10-09 | 2023-03-28 | 天津科技大学 | 一种低温高活力碱性蛋白酶突变体及其应用 |
| CN116445461A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-07-18 | 北京科为博生物科技有限公司 | 一种热稳定性提高的酸性蛋白酶及其基因与应用 |
-
2023
- 2023-12-13 CN CN202311709002.3A patent/CN117417922B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1263765A (en) * | 1969-11-18 | 1972-02-16 | Godo Shusei Kabushika Kaisha | A method for the production of protease by cultivating bacteria |
| WO2001016285A2 (en) * | 1999-08-31 | 2001-03-08 | Novozymes A/S | Novel proteases and variants thereof |
| JP2004008085A (ja) * | 2002-06-06 | 2004-01-15 | Kao Corp | 変異アルカリプロテアーゼ |
| CN1711354A (zh) * | 2002-11-06 | 2005-12-21 | 诺和酶股份有限公司 | 枯草杆菌酶变体 |
| KR20090018315A (ko) * | 2007-08-17 | 2009-02-20 | 한국과학기술원 | 대장균 유래 ｐｔｓＬ 프로모터를 함유하는 재조합벡터 및이를 이용한 외래 단백질의 제조방법 |
| CA2726451A1 (en) * | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods comprising variant microbial proteases |
| CN102046783A (zh) * | 2008-06-06 | 2011-05-04 | 丹尼斯科美国公司 | 包含变体微生物蛋白酶的组合物和方法 |
| CN107384897A (zh) * | 2017-08-02 | 2017-11-24 | 北京科为博生物科技有限公司 | 一种碱性蛋白酶及其基因和应用 |
| CN115851679A (zh) * | 2022-10-09 | 2023-03-28 | 天津科技大学 | 一种低温高活力碱性蛋白酶突变体及其应用 |
| CN116445461A (zh) * | 2023-03-29 | 2023-07-18 | 北京科为博生物科技有限公司 | 一种热稳定性提高的酸性蛋白酶及其基因与应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 张弛等: "人偏肺病毒F蛋白与细胞融合机制研究进展", 《病毒学报》, vol. 34, no. 5, 31 August 2018 (2018-08-31), pages 619 - 624 * |
| 黄路;赵晓东;张琴;赵耀;丁媛;: "人偏肺病毒分离株蛋白质特性的初步探讨", 重庆医科大学学报, no. 10, 15 October 2007 (2007-10-15), pages 13 - 16 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117417922B (zh) | 2024-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11041160B2 (en) | Industrial keratinase via genetic engineering and use thereof | |
| CN107475228B (zh) | 一种底物特异性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法 | |
| RU2007124552A (ru) | Глюкоамилаза trichoderma reesei и ее гомологи | |
| CN110066777B (zh) | 一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用 | |
| CN113862233B (zh) | 提高葡萄糖氧化酶的酸稳定性的方法及突变体q241e/r499e、基因和应用 | |
| JPH01502798A (ja) | 新規なプロテアーゼ酵素 | |
| Morita et al. | Properties of a cold-active protease from psychrotrophic Flavobacterium balustinum P104 | |
| CN111944790B (zh) | 中性蛋白酶基因、中性蛋白酶及其制备方法和应用 | |
| CN109371004B (zh) | 热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和应用 | |
| CN116445461A (zh) | 一种热稳定性提高的酸性蛋白酶及其基因与应用 | |
| CN117625581A (zh) | 一种N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突变体Ea2F及其应用 | |
| CN113699138A (zh) | 碱性蛋白酶基因、杂合启动子、重组表达载体、重组表达工程菌、碱性蛋白酶及方法和应用 | |
| CN117417922B (zh) | 一种耐高温碱性蛋白酶及其基因和应用 | |
| CN112410322B (zh) | 一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体及应用 | |
| WO2006054595A1 (ja) | 新規な高アルカリプロテアーゼ及びその利用 | |
| CN103820420B (zh) | 一种高温热稳定酸性α-半乳糖苷酶Gal27A及其基因和应用 | |
| CN114350643B (zh) | 一种产氨肽酶的重组菌株及其在高效蛋白水解中的应用 | |
| CN117384891B (zh) | 一种热稳定性提高的酸性木聚糖酶及其基因与应用 | |
| CN114250211B (zh) | 一种甘露聚糖酶及其基因与应用 | |
| WO2006022947B1 (en) | Protein and nucleic acid sequence encoding a krill-derived cold adapted trypsin-like activity enzyme | |
| CN117402858B (zh) | 一种耐热性提高的β-葡萄糖苷酶突变体 | |
| CN115161304B (zh) | 米黑根毛霉脂肪酶变异体及其应用 | |
| JP2001292772A (ja) | ロドコッカス属細菌由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子およびアミダーゼ遺伝子 | |
| JP4212340B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ | |
| Wang et al. | Expression and Characterization of Surfactnt-Stable Calcium-Dependent Protease: a Potential Additive for Laundry Detergents |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |