CN105324482A

CN105324482A - 具有淀粉酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸

Info

Publication number: CN105324482A
Application number: CN201480034508.1A
Authority: CN
Inventors: I.达马格; T.霍夫; A.芒奇
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2013-06-21
Filing date: 2014-06-23
Publication date: 2016-02-10
Also published as: EP3011021A1; WO2014202782A1; US20170121643A1

Abstract

本发明涉及具有α-淀粉酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。

Description

具有淀粉酶活性的多肽以及对其进行编码的多核苷酸

对序列表的引用

本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。

发明背景

发明领域

本发明涉及具有淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。

相关技术说明

本发明提供了具有淀粉酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。

α-淀粉酶多年来一直用于衣物洗涤，其中熟知的是α-淀粉酶在去除含淀粉污渍中具有有益的效果。

WO95/26397披露了在30℃-60℃范围内的温度下测量时具有良好洗涤性能的碱性芽孢杆菌淀粉酶。

WO00/60060和WO00/60058披露了具有良好洗涤性能的另外的细菌α-淀粉酶。

在最近几年一直存在降低衣物洗涤温度以便减少能量消耗的需求。降低衣物洗涤温度常常意味着洗涤剂组合物和酶的性能被降低，并且因此在低温获得较低的洗涤性能。因此希望发现在低温具有良好洗涤性能的新的α-淀粉酶。因此，本发明的一个目的是提供在低温(低于30℃)例如像在15℃具有良好洗涤性能的α-淀粉酶。

发明概述

本发明涉及具有α-淀粉酶活性并且在标准洗涤剂A中测量时具有至少0.50的15/30比率的多肽。

本发明还涉及选自下组的具有α-淀粉酶活性的多肽，该组由以下各项组成：

(a)与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；

(b)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中-高严格条件下与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列或(ii)其全长互补体杂交；

(c)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少85％的序列一致性；

(d)SEQIDNO:2的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；

(e)与SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；

(f)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中-高严格条件下与(i)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列或(ii)其全长互补体杂交；

(g)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有至少85％的序列一致性；

(h)SEQIDNO:6的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入；

(i)与SEQIDNO:11的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；

(j)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在中-高严格条件下与(i)SEQIDNO:10的成熟多肽编码序列或(ii)其全长互补体杂交；

(k)由以下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQIDNO:10的成熟多肽编码序列具有至少85％的序列一致性；

(l)SEQIDNO:11的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及

(m)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)或(l)的多肽的片段，该片段具有α-淀粉酶活性。

本发明还涉及包括所述多肽的组合物，特别是涉及洗涤剂组合物；涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载体；包括这些多核苷酸的重组宿主细胞；以及产生这些多肽的方法。

本发明还涉及洗涤纺织品(特别是在低温下)的方法。

定义

α-淀粉酶活性：术语“α-淀粉酶活性”意指α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(E.C.3.2.1.1)的活性，其构成一组催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解的酶。出于本发明的目的，根据实例部分中所述的程序测定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的多肽具有SEQIDNO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。在另一方面，本发明的多肽具有SEQIDNO:6的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的多肽具有SEQIDNO:11的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％的α-淀粉酶活性。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。

编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。

片段：术语“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，数个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，片段包含至少340个氨基酸残基(例如，SEQIDNO:2的氨基酸50至389)、至少360个氨基酸残基(例如，SEQIDNO:2的氨基酸40至399)、或至少380个氨基酸残基(例如，SEQIDNO:2的氨基酸30至409)。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括：(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其天然相关联的一种或多种或所有天然存在的成分中去除的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于在自然界中发现的那种物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关联的其他组分增加该物质的量(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多个拷贝；以及比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)而修饰的任何物质。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸24至428。在另一方面，SEQIDNO:6的成熟多肽是氨基酸1-409。在另一方面，SEQIDNO:11的成熟多肽是氨基酸1-409。本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO:1的核苷酸70至1284。SEQIDNO:1的核苷酸1至69编码信号肽。在另一方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO:5的核苷酸67至1293。SEQIDNO:5的核苷酸1至66编码信号肽。在本发明的又另一方面，成熟多肽编码序列是SEQIDNO:10的核苷酸67至1293。SEQIDNO:10的核苷酸1至67编码信号肽。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。

序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman(尼德尔曼)和Wunsch(翁施)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的残基×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸×100)/(比对长度-比对中的空位总数)

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在45℃下洗涤三次，每次15分钟。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2XSSC、0.2％SDS，在55℃下洗涤三次，每次15分钟。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2xSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用1XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.5XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

非常高严格条件：术语“高严格条件”是指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5XSSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.3XSSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5’端和/或3’端缺少的多核苷酸；其中该子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。在一方面，子序列包含至少1020个核苷酸(例如，SEQIDNO:1的核苷酸148至1167)，至少1080个核苷酸(例如，SEQIDNO:1的核苷酸118至1197)，或至少1140个核苷酸(例如，SEQIDNO:1的核苷酸88至1227)。

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包括改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指占据一个位置的氨基酸替换不同的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。

酶洗涤益处：在此将术语“酶洗涤益处”定义为将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的同一洗涤剂相比的有利效果。可以由酶提供的重要的洗涤益处是在洗涤和/或清洁之后没有或有非常少的可见污垢的污渍去除，预防或减少在洗涤过程中释放的污垢的再沉积(一种也被称作抗再沉积的效果)，完全或部分恢复纺织品的白度(一种也被称作增白的效果)，这些纺织品初始是白色的但是在重复使用和洗涤后获得浅灰色或浅黄色的外观。不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。

纺织品护理益处：不直接与污垢的催化去污或其再沉积的预防相关的“纺织品护理益处”对于酶洗涤益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一纺织品转移至另一纺织品或同一纺织品的另一部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的效果)，改善纺织品柔软性，纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶洗涤益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(例如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。

餐具洗涤组合物：术语“餐具洗涤组合物”是指用于清洁硬表面的所有形式的组合物。本发明不局限于任何具体类型的餐具洗涤组合物或任何具体洗涤剂。

纺织品：术语“纺织品”意指包括纱线、纱线中间体、纤维、非机织物材料、天然材料、合成材料、以及任何其他纺织品材料的任何纺织品材料，这些材料制造的织物和由这些织物制成的产品(例如服装和其他物品)。该纺织品或织物可以处于针织品、机织物、牛仔布、非机织物、毡、纱线、以及毛巾布的形式。这些纺织品可以是纤维素基的，如天然纤维素，包括棉布、亚麻/亚麻布、黄麻、苎麻、剑麻或椰壳纤维或者人造纤维素(例如，来源于木浆)，包括纤维胶/人造丝、苎麻、醋酸纤维素纤维(三胞)、莱赛尔纤维(lyocell)或其共混物。纺织品或织物也可以不基于纤维素，如天然聚酰胺，包括羊毛、驼毛、羊绒、马海毛、兔毛和蚕丝或合成聚合物如尼龙、芳族聚酰胺、聚酯、丙烯酸、聚丙烯和氨纶/弹性纤维(spandex/elastane)、或其共混物其以及基于纤维素和不基于纤维素的纤维的共混物。混合物的实例是棉花和/或人造丝/粘胶与一种或多种伴随材料(companionmaterial)的混合物，伴随材料如羊毛、合成纤维(例如、聚酰胺纤维、丙烯酸纤维、聚酯纤维、聚乙烯醇纤维、聚氯乙烯纤维、聚氨酯纤维、聚脲纤维、芳酰胺纤维)、和/或含有纤维素的纤维(例如、人造丝/粘胶、苎麻、亚麻、亚麻、黄麻、醋酸纤维素纤维、溶解性纤维(lyocell))。织物可以是常规的可洗涤衣物，例如玷污的家居衣物。当使用术语织物或服装时，旨在也包括广义术语纺织品。

硬表面清洁：在此将术语“硬表面清洁”定义为清洁硬表面，其中硬表面可以包括地板、桌子、墙壁、屋顶等，连同硬物体的表面，例如汽车(汽车洗涤)和餐具(餐具洗涤)。餐具洗涤包括但不限于，清洁盘子、杯子、玻璃杯、碗、用餐工具(例如匙、刀、叉)、上菜用具、陶瓷、塑料、金属、瓷器、玻璃及丙烯酸酯。

改进的洗涤性能：在此将术语“改进的洗涤性能”定义为酶或酶的共混物例如通过增加的污渍去除展示出α-淀粉酶的洗涤性能相对于可比的现有技术α-淀粉酶(例如SEQIDNO:15的α-淀粉酶)的洗涤性能的改变。术语“洗涤性能”包括在衣物洗涤并且例如在餐具洗涤中的洗涤性能。洗涤性能的改进可以通过计算所谓的强度值(Int)来量化。还参见在此的实例5-8中的洗涤性能测试。

洗涤性能：术语“洗涤性能”被用作酶在例如洗涤或硬表面清洁过程中除去存在于有待清洁的物体上的污渍的能力。洗涤性能的改进可以通过计算所谓的强度值(Int)来量化。也参见在此的实例3中的洗涤性能测试。

强度值：洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能，其中更高的强度值与更高的洗涤性能相关。

使用专业平板扫描仪(KodakiQsmart，柯达(Kodak))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。

为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：

I n t = \sqrt{r^{2} + g^{2} + b^{2}}

δ强度：在此将术语“δ强度”或“δ强度值”定义为测试材料的强度测量结果，该测试材料是例如小块布样CS-28(测试材料BV中心(CenterforTestmaterialsBV)，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩(Vlaardingen)，荷兰)或硬表面。将该小块布样与作为背景的在相同条件下洗涤的该小块布样的一部分一起测量。δ强度是用淀粉酶洗涤的测试材料的强度值减去未用淀粉酶洗涤的测试材料的强度值。

纺织品：纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰。

白度：在此将术语“白度”定义为在不同领域并且针对不同顾客具有不同含义的广义术语。白度的损失可以例如归因于灰化、黄化、或光学增亮剂/调色剂的去除。灰化和黄化可归因于污垢再沉积、身体污垢、来自例如铁和铜离子或染料转移的着色。白度可以包括来自以下列表的一个或若干问题：着色剂或染料作用；不完全污物去除(例如身体污垢、皮脂等)；再沉积(物体的灰化、黄化或其他变色)(去除的污垢与纺织品的其他部分(弄脏的或未弄脏的)再关联)；在应用过程中纺织品的化学变化；以及颜色的澄清或淡色化。

颜色澄清：在洗涤和穿着过程中，松动或破损纤维可以在织物的表面上积聚。一种后果是由于表面污染，织物的颜色看起来不太亮或不太强烈。从纺织品上除去松动或断裂的纤维将部分地恢复该纺织品的初始颜色和外观。如在此使用，术语“颜色澄清”意指纺织品的原始颜色的部分恢复。

抗起球：术语“抗起球”表示从纺织品表面去除绒球和/或预防在纺织品表面上形成绒球。

发明的详细说明

具有α-淀粉酶活性的多肽

在一个实施例中，本发明涉及与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的具有α-淀粉酶活性的多肽。在一方面，这些多肽与SEQIDNO:2的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在一个实施例中，本发明的多肽优选地包括SEQIDNO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有α-淀粉酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:2的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:2的氨基酸24至428或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及与SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的具有α-淀粉酶活性的多肽。在一方面，这些多肽与SEQIDNO:6的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在一个实施例中，本发明的多肽优选地包括SEQIDNO:6的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有α-淀粉酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:6的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:6的氨基酸1至409或由其组成。。在另一个实施例中，该多肽与SEQIDNO:9的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:9的氨基酸1至415或由其组成。

在另一个实施例中，本发明涉及与SEQIDNO:11的成熟多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性的具有α-淀粉酶活性的多肽。在一方面，这些多肽与SEQIDNO:11的成熟多肽相差多达10个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)氨基酸。

在一个实施例中，本发明的多肽优选地包括SEQIDNO:11的氨基酸序列或其等位基因变体或由其组成；或是其具有α-淀粉酶活性的片段。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:1的成熟多肽或由其组成。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:11的氨基酸1至409或由其组成。在另一个实施例中，该多肽与SEQIDNO:14的多肽具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另一方面，该多肽包括SEQIDNO:14的氨基酸1至415或由其组成。

在一个实施例中，该多肽已经得以分离。在另一个实施例中，本发明涉及一种具有α-淀粉酶活性的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件、或非常高严格条件下，与(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列、或(ii)其全长补体杂交(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆，实验室手册(MolecularCloning,ALaboratoryManual)，第二版，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约)。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有α-淀粉酶活性的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件、或非常高严格条件下，与(i)SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列、或(ii)其全长补体杂交。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有α-淀粉酶活性的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件、或非常高严格条件下，与(i)SEQIDNO:10的成熟多肽编码序列、或(ii)其全长补体杂交。

在一个实施例中，该多肽已经得以分离。

本发明的多肽适合用于清洁目的，例如用于衣物洗涤和硬表面清洁，例如餐具洗涤，包括手动餐具洗涤和自动化餐具洗涤。具体而言，本发明的多肽在低温具有高洗涤性能，并且特别有益的方面在于洗涤性能在低温和中温两种情况下均高。因此，在一个实施例中，本发明的多肽具有在15℃的洗涤性能与在30℃的洗涤性能的高比率，例如，计算为如实例5中所示的15/30比率，其中该比率是由在15℃和30℃下的δ强度来计算。因此，在一个具体实施例中，本发明涉及具有α-淀粉酶活性的多肽，其中在标准洗涤剂A中测量时该15/30比率是至少0.5，例如至少0.60、例如至少0.75，并且优选至少0.8。因此，在15℃的洗涤性能和在30℃的洗涤性能应该使用标准洗涤剂A和基于在15℃和30℃的δ强度计算的比率来确定。本发明的多肽在标准洗涤剂A中的洗涤性能可以优选地使用如下所述的AMSA测定、优选地使用0.3mg/L洗涤溶液的酶浓度来确定。

SEQIDNO:1、5和10的多核苷酸或其子序列，连同SEQIDNO:2、6和11的多肽或其片段可根据本领域熟知的方法用于设计核酸探针以鉴定和克隆来自不同属或种的株系的、编码具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA。具体而言，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的对应基因。此类探针可以明显短于完整序列，但是长度应为至少15，例如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素、或抗生物素蛋白)，以检测相应的基因。本发明涵盖此类探针。

可以针对与以上描述的探针杂交并且编码出具有α-淀粉酶活性的多肽的DNA对从这类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA库进行筛选。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术来分离。来自文库的DNA或分离的DNA可转移到并固定在硝酸纤维素或其他适合的载体材料上。为了鉴定与SEQIDNO:1、5或10中的任一个或其子序列杂交的克隆或DNA，将载体材料用于DNA印迹中。

出于本发明的目的，杂交表明多核苷酸在高到非常高严格条件下与被标记的核酸探针杂交，该探针对应于(i)SEQIDNO:1、5或10；(ii)SEQIDNO:1、5或10的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补体；或(iv)其子序列。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。

在一个方面中，该核酸探针是SEQIDNO:1的核苷酸70至1284、核苷酸270至1084、核苷酸470至880、或核苷酸550至800。在另一方面，该核酸探针是编码SEQIDNO:2的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQIDNO:1。

在另一方面，该核酸探针是SEQIDNO:5的核苷酸67至1293、核苷酸267至1093、核苷酸467至893、或核苷酸550至800。在另一方面，该核酸探针是编码SEQIDNO:6的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQIDNO:5。

在另一方面，该核酸探针是SEQIDNO:10的核苷酸67至1293、核苷酸267至1093、核苷酸467至893、或核苷酸550至800。在另一方面，该核酸探针是编码SEQIDNO:11的多肽；其成熟多肽；或其片段的多核苷酸。在另一方面，该核酸探针是SEQIDNO:10。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有α-淀粉酶活性的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外一个实施例中，该多肽已经得以分离。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有α-淀粉酶活性的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:5的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外一个实施例中，该多肽已经得以分离。

在另一个实施例中，本发明涉及一种具有α-淀粉酶活性的多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:10的成熟多肽编码序列具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外一个实施例中，该多肽已经得以分离。

在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQIDNO:2的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQIDNO:2的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQIDNO:6的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQIDNO:6的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，本发明涉及在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失、和/或插入的SEQIDNO:11的成熟多肽的变体。在一个实施例中，引入SEQIDNO:11的成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或便于通过改变净电荷或另一种功能来纯化的小延伸，如聚组氨酸段(tract)、抗原表位或结合结构域。

保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(AcademicPress)，纽约中描述。常见取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。

可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。

可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子的活性关键的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。对于活性至关重要的催化残基已经通过与已知的α-淀粉酶进行比对而鉴定为189位的天冬氨酸(D189)、214位的谷氨酸(E214)以及位置(D283)的天冬氨酸。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。

可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。

该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。

融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个裂解位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被裂解，从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。

具有α-淀粉酶活性的多肽的来源

本发明的具有α-淀粉酶活性的多肽可以从任何属的微生物获得。出于本发明的目的，如在此结合给定来源使用的术语“从……获得”应当指，由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经插入了来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。在一方面，从给定来源获得的多肽被分泌到细胞外。

该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是革兰氏阳性细菌多肽，如具有α-淀粉酶活性的芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、阿赫兰氏菌属(Ahrensia)或黄杆菌属(Tenacibaculum)多肽；或革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属或脲原体属多肽。

在一方面，该多肽是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)多肽。

在另一方面，该多肽是似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌、或马链球菌兽瘟亚种多肽。

在另一方面，该多肽是不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链丝菌、或浅青紫链霉菌多肽。

在另一方面，该多肽是一种杰奥詹森黄杆菌(Tenacibaculumgeojense)多肽。在又另一方面，该多肽是一种黄杆菌属-62066多肽。在又另一方面，该多肽是一种阿赫兰氏菌属-62069多肽。

将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectandimperfectstates)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。

这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用一种或多种探针检测到编码多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的分离的多核苷酸，如在此所述。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:AGuidetoMethodsandApplication)，学术出版社(AcademicPress)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以是克隆自黄杆菌属的菌株(例如杰奥詹森黄杆菌或者黄杆菌属-62066的菌株)或者相关生物如阿赫兰氏菌属(如阿赫兰氏菌属-62069)多肽，并且因此例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或种变体。

编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最优pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQIDNO:1、5或10的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主生物体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(ProteinExpressionandPurification)2:95-107。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。

用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻译延长因子，以及NA2-tpi启动子(一种修饰的启动子，其来自曲霉属中性α-淀粉酶基因，其中未翻译的前导序列由曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其来自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列由构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代)；以及其突变型启动子、截短型启动子、以及杂合型启动子。其他启动子描述于美国专利号6,011,147中。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。

控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。

用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。

用于酵母宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用的终止子由罗马诺斯(Romanos)等人，1992，见上文描述。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。

适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。

该控制序列还可以是一个前导序列，一种对宿主细胞翻译很重要的非翻译mRNA区域。该前导子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

适用于酵母宿主细胞的前导序列从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、以及酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是一种聚腺苷酸化序列，可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的多聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.CellularBiol.)15:5983-5990中得以描述。

控制序列也可以是编码与多肽的N-端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包括在翻译阅读框架中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的一个信号肽编码序列。可替代地，编码序列5’-末端可以包括对于该编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可简单地替换天然的信号肽编码序列以便增强该多肽的分泌。然而，可以使用指导所表达多肽进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属NCIB11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)以及枯草芽孢杆菌prsA。西蒙纳(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物学评论(MicrobiologicalReviews)57:109-137描述了另外的信号肽。

用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是获得自以下项的基因的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

对于酵母宿主细胞有用的信号肽获得自以下项的基因：酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶。见上文，罗马诺斯(Romanos)等人(1992)描述了其他有用的信号肽编码序列。

该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过从该多肽原上催化裂解或自动催化裂解前肽而被转化成一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。

还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可包括任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。

载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。

细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选在曲霉属细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)bar基因。优选在木霉属细胞中使用的是adeA、adeB、amdS、hph、以及pyrG基因。

选择性标记可以是在W02010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一个方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。

对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点(originofreplication)”或“质粒复制子(plasmidreplicator)”是指使得质粒或载体可在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及的复制起点。

用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN6的组合。

在丝状真菌细胞内有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(NucleicAcidsRes.)15:9163-9175；WO00/24883)。AMA1基因的分离和包括该基因的质粒或载体的构建可根据WO00/24883披露的方法完成。

可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包括本发明的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌菌、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见，例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见，例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见，例如克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见，例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核细胞，如哺乳动物、昆虫、植物、或真菌细胞。

宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、以及接合菌门(Zygomycota)、连同卵菌门(Oomycota)和全部有丝分裂孢子真菌(如由霍克斯沃思(Hawksworth)等人在安斯沃思和拜斯比真菌词典(AinsworthandBisby’sDictionaryofTheFungi)，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CABInternational)，大学出版社(UniversityPress)，英国剑桥(Cambridge，UK)中进行定义的)。

该真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子嚢酵母(内孢霉目)、产担子酵母和属于半知菌类(芽孢纲)的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，因此出于本发明的目的，酵母应如酵母的生物学和活性(BiologyandActivitiesofYeast)(斯金纳(Skinner)、帕斯莫尔(Passmore)、以及达文波特(Davenport)编辑，应用细菌学学会讨论会系列号9(Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9)，1980)中所描述来定义。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母、或解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由霍克斯沃思等人，1995，见上文所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。

例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkanderaadusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsispannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsissubrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞(Coprinuscinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、射脉菌(Phlebiaradiata)、刺芹侧耳(Pleurotuseryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametesversicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、以及细胞壁再生的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序描述于EP238023、约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中。用于转化镰孢属物种的适合方法由马拉迪尔(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南，酶学方法(GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及哈尼恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。

产生方法

本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；并且可任选地(b)回收该多肽。在一方面，该细胞是黄杆菌属细胞。在另一方面，该细胞是杰奥詹森黄杆菌细胞。在又另一方面，它是黄杆菌属-62066细胞。在另一个实施例中，该细胞是阿赫兰氏菌属细胞，例如阿赫兰氏菌属-62069。本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，这些方法包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养一种本发明的重组宿主细胞；并且可任选地(b)回收该多肽。

这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。

可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。

可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面中，回收包括该多肽的发酵液。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(Protein纯化)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。

在一个替代性方面中，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包括本发明的多肽的一种发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。

在一个方面中，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

可以通过WO90/15861或WO2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。

酶组合物

本发明还涉及包括本发明的一种多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富含”指示该组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，以至少1.1的富集因子。

这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶，例如，α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。

洗涤剂组合物

在一个实施例中，本发明针对洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含结合一种或多种额外的清洁组合物组分的本发明的酶。另外的组分的选择在普通技术人员技术内并且包括常规成分，包括以下列出的示例性、非限制性组分。

对于纺织品护理，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污物的类型和/或程度、进行清洁时的温度以及洗涤剂产品的配制。尽管根据一种具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，一种组分可以包括另外的功能性。

本发明的酶

在本发明的一个实施例中，可以将本发明的多肽以对应于以下的量添加至一种洗涤剂组合物中：每升的洗涤液0.001-200mg的蛋白，例如0.005-100mg的蛋白，优选0.01-50mg的蛋白，更优选0.05-20mg的蛋白，甚至更优选0.1-10mg的蛋白。

可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制该组合物。

本发明的多肽还可以结合到WO97/07202中所披露的洗涤剂配制品中，通过引用将其结合在此。

表面活性剂

洗涤剂组合物可以包括一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子的和/或阳离子的和/或非离子的和/或半极性的和/或兼性离子的或其混合物。在一个具体实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子型表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。这种或这些表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％的水平存在，例如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％。基于所希望的清洁应用来选择这种或这些表面活性剂，并且这种或这些表面活性剂包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何表面活性剂。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包括按重量计从约1％至约40％，例如从约5％至约30％(包括从约5％至约15％)、或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，具体地说是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约0.2％至约40％的非离子型表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，例如从约3％至约5％、或从约8％至约12％。非离子型表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)，烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)，烷基酚乙氧基化物(APE)，壬基酚乙氧基化物(NPE)，烷基多糖苷(APG)，烷氧基化胺，脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)，脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)，乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)，丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)，多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)，或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))，连同在SPAN和TWEEN商品名下可获得的产品及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约20％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲基氧化胺、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲基氧化胺和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)氧化胺、脂肪酸链烷醇酰胺和乙氧基化的脂肪酸链烷醇酰胺及其组合。

当被包括在其中时，洗涤剂将通常包含按重量计从约1％至约20％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱、烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱及其组合。

助水溶剂

助水溶剂是一种化合物，该化合物在水性溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中的极性物质)。典型地，助水溶剂同时具有亲水的和疏水的特征(如从表面活性剂已知的所谓两亲特性)；然而助水溶剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如霍奇登(Hodgdon)和卡勒(Kaler)的综述(2007)，胶体&界面科学新见(CurrentOpinioninColloid&InterfaceScience)，12:121-128。助水溶剂并不显示一个临界浓度，高于该浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。很多助水溶剂反而示出一个连续型聚集过程，其中聚集体的大小随着浓度增加而增长。然而，很多助水溶剂改变了包含极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂和聚合物的混合物)的相行为、稳定性和胶体特性。经典地从制药、个人护理、食品跨行业至技术应用使用助水溶剂。助水溶剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过除去水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。

洗涤剂可以包含按重量计0％-5％，例如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的助水溶剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何助水溶剂。助水溶剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂和共助洗剂

洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，例如约5％至约40％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂或其混合物。在洗涤餐具洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性复合物的螯合剂。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共-助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为亚氨基二乙醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氨基三乙醇)、以及羧甲基菊粉(CMI)及其组合。

洗涤剂组合物还可以包含按重量计0-40％，例如约5％至约20％的洗涤剂共助洗剂或其混合物。洗涤剂组合物可以单独地包括一种共助洗剂，或与一种助洗剂，例如沸石助洗剂组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐，螯合剂，例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐，以及烷基-或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四-(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二丁二酸(iminodisuccinicacid)(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N’-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)及其组合和盐。其他示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO09/102854、US5977053中。

漂白系统

该洗涤剂可以包含按重量计0-50％，例如约5％至约40％的漂白系统。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何漂白系统。适合的漂白系统组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠和过硼酸钠、预制的过酸和其混合物。适合的预成型过酸包括，但不限于：过氧羧酸及盐，过碳酸及盐，过亚氨酸(perimidicacid)及盐，过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))，及其混合物。漂白系统的非限制性实例包括基于过氧化物的漂白系统，该系统可以包括例如一种与过酸形成漂白活化剂组合的无机盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是单水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐。术语漂白活化剂在此意指一种与过氧化物漂白剂(像过氧化氢)反应以形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。有待在此使用的适合漂白活化剂包括属于酯酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰)氧基]苯磺酸钠(ISONOBS)、二过氧月桂酸、4-(十二酰基氧基)苯磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS)、4-(壬酰基氧基)-苯磺酸盐(NOBS)、和/或披露于WO98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的，因为它最终降解为柠檬酸和醇。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且它是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC为洗衣添加剂提供一种良好的助洗能力。可替代地，漂白系统可以包括例如酰胺、酰亚胺或砜型的过氧酸。漂白系统还可以包括过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白系统还可以包括一种漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下各项组成：具有以下结构的有机催化剂：

(iii)及其混合物；其中每个R¹独立地是包含从9至24个碳的支链烷基基团或包含从11至24个碳的直链烷基基团，优选地，每个R¹独立地是包含从9至18个碳的支链烷基基团或包含从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地，每个R¹独立地选自下组，该组由以下各项组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正-十二烷基、正-十四烷基、正-十六烷基、正-十八烷基、异-壬基、异-癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。其他示例性漂白系统描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259以及WO2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌。

聚合物

洗涤剂可以包含按重量计0-10％，例如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。聚合物可以作为如以上提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污物释放、染料转移抑制、油污清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的以上提到的特性和/或多于一种的以下提到的基序(motif)。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，例如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水改性CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。也考虑了以上提到的聚合物的盐。

织物调色剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包括织物调色剂，例如染料或色素，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与一种洗液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗液包括所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，因为它们吸收至少一部分可见光光谱，所以织物调色剂改变表面的色彩。适合的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(ColourIndex)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如描述于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226中(将其通过引用结合在此)。洗涤剂组合物优选包括从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。组合物可以包括从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO2007/087257和WO2007/087243中。

(另外的)酶

洗涤剂添加剂连同洗涤剂组合物可以包括一种或多种另外的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般而言，一种或多种所选酶的性质应与选定的洗涤剂相容(即，最适pH，与其他酶和非酶成分的相容性，等等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。

纤维素酶：适合的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757以及WO89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。

特别适合的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP0495257、EP0531372、WO96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，例如在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307以及PCT/DK98/00299中描述的那些。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM、和Carezyme^TM(诺维信公司(NovozymesA/S))、Clazinase^TM、和PuradaxHA^TM(杰能科国际有限公司(GenencorInternationalInc.))、以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(KaoCorporation))。

蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选微生物来源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例为胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)以及在WO89/06270和WO94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。

有用的蛋白酶的实例为在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116、以及WO98/34946中描述的变体，尤其是在一个或多个以下位置中具有取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。

优选的可商购蛋白酶包括Alcalase^TM、Savinase^TM、Primase^TM、Duralase^TM、Esperase^TM、和Kannase^TM(诺维信公司(NovozymesA/S))、Maxatase^TM、Maxacal^TM、Maxapem^TM、Properase^TM、Purafect^TM、PurafectOxP^TM、FN2^TM、和FN3^TM(杰能科国际公司(GenencorInternationalInc.))。

脂肪酶和角质酶：适合的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热真菌属的脂肪酶，例如如描述于EP258068和EP305216中的来自疏绵状嗜热丝孢菌(早先命名为疏棉状腐质霉)；来自腐质霉属的角质酶，例如特异腐质霉(WO96/13580)；来自假单胞菌属的菌株的脂肪酶(这些中的一些现在改名为伯克霍尔氏菌属)，例如产碱假单胞菌或类产碱假单胞菌(EP218272)、洋葱假单胞菌(EP331376)、假单胞菌属菌株SD705(WO95/06720&WO96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO96/12012)；GDSL-型链霉菌属脂肪酶(WO10/065455)；来自稻瘟病菌的角质酶(WO10/107560)；来自门多萨假单胞菌的角质酶(US5,389,536)；来自褐色嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)的脂肪酶(WO11/084412)；嗜热脂肪土芽孢杆菌脂肪酶(WO11/084417)；来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶(WO11/084599)；以及来自灰色链霉菌(WO11/150157)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶(WO12/137147)。

其他实例是脂肪酶变体，例如描述于EP407225、WO92/05249、WO94/01541、WO94/25578、WO95/14783、WO95/30744、WO95/35381、WO95/22615、WO96/00292、WO97/04079、WO97/07202、WO00/34450、WO00/60063、WO01/92502、WO07/87508以及WO09/109500中的那些。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candidaantarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶(WO10/111143)、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)的酰基转移酶(WO05/56782)、来自CE7家族的过水解酶(WO09/67279)以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(HuntsmanTextileEffectsPteLtd)的商业产品GentlePowerBleach中所用的S54V变体)(WO10/100028)。

淀粉酶：可以与本发明的酶一起使用的适合的淀粉酶可以是α-淀粉酶或葡糖淀粉酶并且可以具有细菌或真菌起源。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如获得自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如GB1,296,839中更详细描述的地衣芽孢杆菌具体株系的α-淀粉酶。

适合的淀粉酶包括具有WO95/10603中的SEQIDNO:3的淀粉酶或其与SEQIDNO:3具有90％序列一致性的变体。优选的变体描述于WO94/02597、WO94/18314、WO97/43424以及WO99/019467的SEQIDNO:4中，例如在一个或多个以下位置中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408以及444。

不同的适合的淀粉酶包括具有WO02/010355中的SEQIDNO:6的淀粉酶或其与SEQIDNO:6具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:6的优选变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他适合的淀粉酶是包括示于WO2006/066594的SEQIDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO2006/066594的SEQIDNO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列一致性的变体。这一杂合α-淀粉酶的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209以及Q264。包括示于WO2006/066594的SEQIDNO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQIDNO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

适合的另外的淀粉酶是具有WO99/019467中的SEQIDNO:6的淀粉酶或其与SEQIDNO:6具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:6的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216以及K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO96/023873的SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的那些或其与SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:7的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304以及476。更优选的变体是在位置181和182或位置183和184中具有缺失的那些。SEQIDNO:1、SEQIDNO:2或SEQIDNO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304以及476中的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO08/153815中的SEQIDNO:2、WO01/66712中的SEQIDNO:10的淀粉酶或其与WO08/153815的SEQIDNO:2具有90％序列一致性或与WO01/66712中的SEQIDNO:10具有90％序列一致性的变体。WO01/66712中的SEQIDNO:10的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211以及264。

另外的适合的淀粉酶是具有WO09/061380中的SEQIDNO:2的淀粉酶或其与SEQIDNO:2具有90％序列一致性的变体。SEQIDNO:2的优选变体是在以下位置中的一个或多个中具有C末端的截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444以及G475。SEQIDNO:2的更优选变体是在一个或多个以下位置中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K和/或位置R180和/或S181或T182和/或G183的缺失。SEQIDNO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的并且任选地进一步在位置243处包括取代和/或在位置180和/或位置181处包括缺失。

其他适合的淀粉酶是具有WO01/66712中的SEQIDNO:12的α-淀粉酶或与SEQIDNO:12具有至少90％序列一致性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO01/66712中的SEQIDNO:12的以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K及R458K的变体，以及另外在选自下组的一个或多个位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345以及A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

其他实例是例如描述于WO2011/098531、WO2013/001078及WO2013/001087中的那些淀粉酶变体。

可商购的淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、LiquozymeX和BAN^TM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM、和Powerase(来自杰能科国际有限公司)。

过氧化物酶/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属，例如来自灰盖鬼伞的过氧化物酶，以及其变体，如在WO93/24618、WO95/10602、以及WO98/15257中描述的那些。

可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(诺维信公司)。

该一种或多种洗涤剂酶可以通过添加包括一种或多种酶的独立添加剂，或通过添加包括所有这些酶的组合添加剂而被包括于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立添加剂或组合添加剂，可以被配制为，例如颗粒、液体、浆料等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，尤其是非尘颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆体。

无尘颗粒可以例如如在US4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例为具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产物(聚乙二醇，PEG)；具有从16至50个环氧乙烷单元的乙氧化壬基苯酚；乙氧化脂肪醇，其中该醇含有12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯以及甘油三酯。适用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP238,216中披露的方法制备。

辅料

还可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何洗涤剂组分。其他任选的洗涤剂组分包括防腐剂、防缩剂、抗污物再沉积剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、腐蚀抑制剂、崩解剂(disintegrant)/崩解试剂(disintegrationagent)、染料、酶稳定剂(包括硼酸、硼酸盐、CMC和/或多元醇如丙二醇)、织物整理剂(包括粘土)、填充剂/加工助剂、荧光增白剂/光学增亮剂、增泡剂、泡沫(泡)调节剂、香料、污物助悬剂、软化剂、抑泡剂、晦暗抑制剂以及芯吸剂，单独或组合使用。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤剂中使用的任何成分。此类成分的选择完全在普通技术人员的技术内。

分散剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。具体地说，粉状洗涤剂可以包括分散剂。适合的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包括至少两个羧基，这两个羧基被不超过两个碳原子彼此分开。适合的分散剂例如描述于粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列，第71卷中，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker)。

染料转移抑制剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。适合的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当存在于主题组合物中时，染料转移抑制剂可以按组合物重量计的以下水平存在：从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％。

荧光增白剂-本发明的洗涤剂组合物还将优选地包含另外的组分,这些组分可以给正清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。其中增亮剂优选以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用适合用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。二氨基芪-磺酸衍生物类型的荧光增白剂的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-GeigyAG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选荧光增白剂，是可商购的ParawhiteKX，由派拉蒙矿物与化学(ParamountMineralsandChemicals)，孟买，印度供应。适合用于在本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-烷氨基香豆素。

适合的荧光增白剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

污物释放聚合物-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种污物释放聚合物，这些污物释放聚合物帮助从织物，例如棉或聚酯基织物上除去污垢，特别是从聚酯基织物上除去疏水污垢。污物释放聚合物可以例如是非离子型或阴离子型对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、聚酯聚酰胺，参见例如粉状洗涤剂，表面活性剂科学系列第71卷第7章，马塞尔·德克尔公司(MarcelDekker，Inc.)。另一种类型的污物释放聚合物是包括一个核心结构和连接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包括聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构，如WO2009/087523中详细描述的(将其通过引用而特此结合)。此外，随机接枝共聚物是适合的污物释放聚合物。适合的接枝共聚物更详细地描述于WO2007/138054、WO2006/108856和WO2006/113314中(将其通过引用而特此结合)。其他污物释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，例如改性纤维素衍生物，例如EP1867808或WO2003/040279中描述的那些(将二者都通过引用而特此结合)。适合的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。适合的纤维素聚合物包括阴离子改性的纤维素、非离子改性的纤维素、阳离子改性的纤维素、兼性离子改性的纤维素及其混合物。适合的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

抗再沉积剂-本发明的洗涤剂组合物还可以包括一种或多种抗再沉积剂，例如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚环氧乙烷和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸与马来酸的共聚物以及乙氧基化聚乙亚胺。以上在污物释放聚合物下描述的纤维素基聚合物还可以用作抗再沉积剂。

其他适合的辅料包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填充剂、泡沫调节剂、助水溶剂、香料、色素、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。

洗涤剂产品的配制品

本发明的洗涤剂组合物可以处于任何常规形式，例如条、均匀的片剂、具有两个或更多个层的片剂、具有一个或多个室的袋、规则的或压缩的粉、颗粒、膏、凝胶、或规则的、压缩的或浓缩的液体。

洗涤剂配制品形式：层(相同或不同的相)、袋、对比用于机器配量单位的形式。

袋可以被配置为单个或多个的室。它可以具有适合容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由封装内体积的水溶性膜制成。可以将所述内体积分为袋的室。优选的膜是形成膜或片的聚合材料，优选是聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及,羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，在膜中的聚合物(例如PVA)的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，该共混组合物包括可水解降解并且水可溶的聚合物共混物，例如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSolLLC公司销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。这些袋可以包括固体衣物清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在组成上可以与包括固体的室不同。参考文献：(US2009/0011970A1)。

可以由水可溶的袋中或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分物理地彼此分开。由此可以避免组分之间的负面的存储相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

这些形式的定义/特征：

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地包含按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以包含从0％-30％的有机溶剂。

液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

洗衣皂条

本发明的酶可以被添加至洗衣皂条中并且用于手洗洗衣、织物和/或纺织品。术语洗衣皂条包括洗衣条、皂条、组合条(combobar)、合成洗涤剂条以及洗涤剂条。条的类型通常区别在于它们包含的表面活性剂的类型，并且术语洗衣皂条包括包含来自脂肪酸的肥皂和/或合成皂的那些。洗衣皂条具有在室温下为固体而非液体、凝胶或粉末的物理形式。术语固体被定义为不随着时间显著变化的物理形式，即如果将一固体物体(例如洗衣皂条)放置于一个容器内部，该固体物体不发生改变来填充它被放置于其中的容器。条典型地是处于条形的固体但是可以处于其他固体形状，例如圆形或卵形。

洗衣皂条可以包含一种或多种另外的酶，蛋白酶抑制剂例如肽醛类(或次硫酸盐加合物或半缩醛加合物)，硼酸，硼酸盐，硼砂和/或苯基硼酸衍生物例如4-甲酰基苯基硼酸，一种或多种肥皂或合成表面活性剂，多元醇例如甘油，pH控制化合物例如脂肪酸、柠檬酸、乙酸和/或甲酸，和/或一价阳离子和有机阴离子的盐，其中该一价阳离子可以是例如Na⁺、K⁺或NH₄ ⁺并且该有机阴离子可以是例如甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或乳酸盐，这样使得一价阳离子和有机阴离子的盐可以是例如甲酸钠。

洗衣皂条还可以包含络合剂像EDTA和HEDP，香料和/或不同类型的填充剂，表面活性剂例如阴离子型合成表面活性剂，助洗剂，聚合的污物释放剂，洗涤剂螯合剂，稳定剂，填充剂，染料，着色剂，染料转移抑制剂，烷氧基化的聚碳酸酯，抑泡剂，结构剂，粘合剂，浸出剂，漂白活化剂，粘土去污剂，抗再沉积剂，聚合分散剂，增白剂，织物柔软剂，香料和/或本领域已知的其他化合物。

洗衣皂条可以在常规的洗衣皂条制造设备中进行加工，例如但不限制于：混合器、压条机例如双级真空压条机、挤出机、切割机、标识压模机(logo-stamper)、冷却隧道以及包装机。本发明不局限于通过任何单一方法制备洗衣皂条。可以在过程的不同阶段向肥皂中添加本发明的预混料。例如，可以制备包含肥皂、酶、任选地一种或多种另外的酶、蛋白酶抑制剂以及一价阳离子和有机阴离子的盐的预混料并且然后将该混合物压条。可以同时添加作为例如处于液态的蛋白酶抑制剂的酶以及任选的另外的酶。除了混合步骤和压条步骤以外，该工艺还可以进一步包括研磨、挤出、切割、压模、冷却和/或包装的步骤。

颗粒洗涤剂配制品

如描述于WO09/092699、EP1705241、EP1382668、WO07/001262、US6472364、WO04/074419或WO09/102854中的，可以配制颗粒洗涤剂。其他有用的洗涤剂配制品描述于以下各项中：WO09/124162、WO09/124163、WO09/117340、WO09/117341、WO09/117342、WO09/072069、WO09/063355、WO09/132870、WO09/121757、WO09/112296、WO09/112298、WO09/103822、WO09/087033、WO09/050026、WO09/047125、WO09/047126、WO09/047127、WO09/047128、WO09/021784、WO09/010375、WO09/000605、WO09/122125、WO09/095645、WO09/040544、WO09/040545、WO09/024780、WO09/004295、WO09/004294、WO09/121725、WO09/115391、WO09/115392、WO09/074398、WO09/074403、WO09/068501、WO09/065770、WO09/021813、WO09/030632以及WO09/015951。

WO2011025615、WO2011016958、WO2011005803、WO2011005623、WO2011005730、WO2011005844、WO2011005904、WO2011005630、WO2011005830、WO2011005912、WO2011005905、WO2011005910、WO2011005813、WO2010135238、WO2010120863、WO2010108002、WO2010111365、WO2010108000、WO2010107635、WO2010090915、WO2010033976、WO2010033746、WO2010033747、WO2010033897、WO2010033979、WO2010030540、WO2010030541、WO2010030539、WO2010024467、WO2010024469、WO2010024470、WO2010025161、WO2010014395、WO2010044905、

WO2010145887、WO2010142503、WO2010122051、WO2010102861、WO2010099997、WO2010084039、WO2010076292、WO2010069742、WO2010069718、WO2010069957、WO2010057784、WO2010054986、WO2010018043、WO2010003783、WO2010003792、

WO2011023716、WO2010142539、WO2010118959、WO2010115813、WO2010105942、WO2010105961、WO2010105962、WO2010094356、WO2010084203、WO2010078979、WO2010072456、WO2010069905、WO2010076165、WO2010072603、WO2010066486、WO2010066631、WO2010066632、WO2010063689、WO2010060821、WO2010049187、WO2010031607、WO2010000636。

用途

本发明针对用于使用具有α-淀粉酶活性的多肽或其组合物在清洁过程例如包括自动化餐具洗涤的衣物或硬表面清洁中的方法。

对于清洁而言重要的污物和污渍由许多不同物质构成，并且已经开发全都具有不同底物特异性的一系列不同的酶用于在涉及衣物和硬表面清洁(例如餐具洗涤)两者中使用。认为这些酶提供酶洗涤益处，因为与不具有酶的同一过程相比，它们在其应用的清洁过程中特异性地改善污渍去除。本领域已知的去污酶包括以下酶，例如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶。

在一个方面中，本发明涉及本发明的α-淀粉酶在洗涤剂组合物中用于在清洁硬表面中使用(例如餐具洗涤)，或在洗衣中或用于去污的用途。在一个另外的方面中，本发明证明了在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用如餐具洗涤或洗衣中在低温下使用本发明的α淀粉酶具有改进的洗涤性能。

在一个另外的方面中，本发明证明了在低温洗涤下(例如在15℃下)在洗涤剂组合物中使用本发明的α-淀粉酶具有改进的洗涤性能。

本发明的另一个方面是在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中使用包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性剂以及任选地一种或多种选自以下清单的洗涤剂组分的洗涤剂组合物，该清单包括助水溶剂、助洗剂和共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂和辅料或其任何混合物。

一个另外的方面是在洗涤剂组合物或洗涤剂应用中使用包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性剂以及一种或多种选自下组的另外的酶的洗涤剂组合物，该组包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶或其任何混合物。

在另一方面，本发明涉及一种洗衣方法，该方法可用于家用洗衣以及工业洗衣。此外，本发明涉及一种用于洗涤纺织品(例如织物、服装(garment)、衣服(cloth)等)的方法，其中该方法包括用一种洗涤溶液处理该纺织品，该洗涤溶液包含一种洗涤剂组合物以及一种本发明的α-淀粉酶。可以使用家用或工业洗衣机进行洗衣或可以使用一种洗涤剂组合物手动地进行洗衣，该洗涤剂组合物包含本发明的葡糖淀粉酶。

在另一方面，本发明涉及一种餐具洗涤方法，该方法可用于家用餐具洗涤以及工业餐具洗涤。此外，本发明涉及一种用于洗涤硬表面(例如，用餐工具，如刀、叉、匙；陶器，如盘子、玻璃杯、碗；以及平底锅)的方法，其中该方法包括用一种洗涤溶液处理该硬表面，该洗涤溶液包含一种洗涤剂组合物以及一种本发明的α-淀粉酶。可以例如使用家用或工业洗碗机洗涤硬表面或使用一种洗涤剂组合物手动地洗涤硬表面，该洗涤剂组合物包含本发明的α-淀粉酶、任选地连同一种或多种选自下组的另外的酶，该组包括：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶、或其任何混合物。

在一个另外的方面，本发明涉及一种用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面与在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中的包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性剂以及任选地一种或多种选自以下清单的洗涤剂组分的组合物接触，该清单包括助水溶剂、助洗剂和共助洗剂、漂白系统、聚合物、织物调色剂和辅料或其任何混合物。一个另外的方面是一种用于从表面去除污渍的方法，该方法包括使该表面与在洗涤剂组合物中和在洗涤剂应用中包括本发明的α-淀粉酶连同一种或多种表面活性剂、一种或多种选自下组的另外的酶的组合物接触，该组包括蛋白酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧酶、过氧化氢酶、甘露聚糖酶或其任何混合物。

可以因此将本发明的多肽添加至洗涤剂组合物中并且变成洗涤剂组合物的组分。

本发明的洗涤剂组合物可以配制为(例如)手洗或机洗洗衣洗涤剂组合物，包括适用于预处理有污迹的织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗添加的织物软化剂组合物，或配制为用于一般家用硬表面清洁操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗餐具洗涤操作。

在一个特定的方面中，本发明提供了一种洗涤剂添加剂，该添加剂包括如在此描述的本发明的多肽。

下文中给出本发明的组合物的优选用途的实例。可以基于本领域已知的方法来确定组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。

实例

菌株

Tenacibaculumgeojense，分离自美国的一个公共沙滩。

Tenacibaculumsp-62066和阿赫兰氏菌属-62069是分离自来自丹麦的泥土样品。

培养基和溶液

LB板，包含6μg/l氯霉素和AZCL直链淀粉(麦格酶公司(Megazyme)，威克洛(Wicklow)，爱尔兰(Ireland))。

用于测量α-淀粉酶的方法

用于确定α-淀粉酶活性的pNP-G7测定法

可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。为4,6-亚乙基(G₇)-对硝基苯基(G₁)-α,D-麦芽庚糖苷的缩写的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶如α-淀粉酶裂解的嵌段寡糖。裂解之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放自由PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。

试剂：

来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mMHEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH7.0)。

α-葡糖苷酶试剂含有52.4mMHEPES、87mMNaCl、12.6mMMgCl₂、

0.075mMCaCl₂、>4kU/L的α-葡糖苷酶。

通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mLG7-pNP底物混合，产生底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。

稀释缓冲液：50mMMOPS，0.05％(w/v)TritonX100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)n(n＝9-10)))，1mMCaCl2，pH8.0。

程序：

将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来执行测定。将溶液混合并且在室温预孵育1分钟并且在OD405nm在5分钟范围内每20秒测量吸收。

在一组给定条件下，时间相关吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比例。淀粉酶样品应稀释至其中斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。

使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能

为了评定α-淀粉酶在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA测试，可以检査大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织品小块布样对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈振动从而使测试溶液与纺织品接触并以规则、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。

洗涤性能总体描述

制备一种测试溶液，该测试溶液包含水(6°dH)、0.79g/l洗涤剂(例如，如下文描述的标准洗涤剂J)和处于浓度0、0.3或0.6mg酶蛋白/L的本发明的酶。添加具有淀粉污渍的织物(来自试验材料BV中心(邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)的CS-28)，并且将它们在15℃或30℃洗涤20分钟。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。AMSA洗涤性能实验在以下详细说明的实验条件下实施：

表A：实验条件

表B：标准洗涤剂J

化合物	化合物的含量(％w/w)	活性组分％(％w/w)
			LAS	5.15	5.00
AS	5.00	4.50
			AEOS	14.18	10.00
可可脂肪酸	1.00	1.00
			AEO	5.00	5.00
MEA	0.30	0.30
			MPG	3.00	3.00
乙醇	1.50	1.35
			DTPA(为Na5盐)	0.25	0.10
柠檬酸钠	4.00	4.00
			甲酸钠	1.00	1.00
氢氧化钠	0.66	0.66
			H₂O，离子交换	58.95	58.95

通过将CaCl₂、MgCl₂、以及NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO₃ ^-＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至6°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

表C：实验条件

洗涤剂	标准洗涤剂A(参见表D)
		洗涤剂剂量	3.33g/L
测试溶液体积	160μL
		pH	按原来的情况
洗涤时间	20分钟
		温度	15℃或30℃
水硬度	15°dH
		测试中的酶浓度	0.3mg/L或0.6mg/L
测试材料	CS-28(大米淀粉棉)

表D：标准洗涤剂A

化合物	化合物的含量(％w/w)	活性组分％(％w/w)
			LAS	12.00	11.60
AEOS，SLES	17.63	4.90
			大豆脂肪酸	2.75	2.48
可可脂肪酸	2.75	2.80
			AEO	11.00	11.00
氢氧化钠	1.75	1.80
			乙醇/丙-2-醇	3.00	2.70/0.30
MPG	6.00	6.00
			甘油	1.71	1.70
TEA	3.33	3.30
			甲酸钠	1.00	1.00
柠檬酸钠	2.00	2.00
			DTMPA	0.48	0.20
PCA	0.46	0.18
			苯氧基乙醇	0.50	0.50
H₂O，离子交换	33.64	33.64

通过将CaCl₂、MgCl₂、和NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO₃ ^-＝4:1:7.5)添加至测试系统中，将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

表E：实验条件

洗涤剂	标准洗涤剂X(参见表F)
		洗涤剂剂量	1.75g/L
测试溶液体积	160μL
		pH	按原来的情况
洗涤时间	20分钟
		温度	15℃或30℃
水硬度	12°dH
		测试中的酶浓度	0.3mg/L或0.6mg/L
测试材料	CS-28(大米淀粉棉)

表F：标准洗涤剂X

*将标准洗涤剂X混合，不含AEO。在洗涤之前，将AEO分开地添加。

通过将CaCl₂、MgCl₂、以及NaHCO₃(Ca²⁺:Mg²⁺:HCO₃ ^-＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

表G：实验条件

洗涤剂	标准洗涤剂T(参见表H)
		洗涤剂剂量	5.33g/L
测试溶液体积	160μL
		pH	按原来的情况
洗涤时间	20分钟
		温度	15℃或30℃
水硬度	15°dH
		测试中的酶浓度	0.3mg/L或0.6mg/L
测试材料	CS-28(大米淀粉棉)

表H：标准洗涤剂T

化合物	化合物的含量(％w/w)	活性组分％(％w/w)
			LAS，钠盐	11.00	10.00
AS/AEOS，钠盐	2.00	1.80
			肥皂，钠盐	2.00	2.00
AEO*	3.00	3.00
			碳酸钠	15.15	14.90
硅酸钠	3.00	2.50
			沸石A	18.75	15.00
HEDP-Na₄	0.15	0.13
			柠檬酸钠	2.00	2.00
AA/MA共聚物，钠盐	1.65	1.50
			CMC	2.50	1.60
SRP	0.50	0.50
			硫酸钠	36.30	35.80
硅酮	2.00	2.00

*将标准洗涤剂T混合，不含AEO。在洗涤之前，将AEO分开地添加。

洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能。

使用专业平板扫描仪(KodakiQsmart，柯达(Kodak))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。为了从扫描的图像中提取光强度值，将来自图像的24-位像素值转化为红、绿以及蓝(RGB)的值。通过将RGB值作为向量相加在一起并然后考虑所得向量的长度可以计算强度值(Int)：

I n t = \sqrt{r^{2} + g^{2} + b^{2}}

纺织品：

纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自试验材料BV中心，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰。

实例1：SEQIDNO:2-杰奥詹森黄杆菌的α-淀粉酶的克隆和制备

α-淀粉酶编码基因的鉴定

为了克隆α-淀粉酶基因，对杰奥詹森黄杆菌的基因组DNA进行测序。通过QIAampDNA血液迷你试剂盒(QIAampDNABloodMiniKit)(凯杰公司(Qiagen)，希尔登，德国)分离杰奥詹森黄杆菌的染色体DNA。将五ug的染色体DNA送至FASTERISSA，瑞士进行基因组测序。

α-淀粉酶基因是通过在公共蛋白质数据库中进行同源性搜索发现的，这是本领域技术人员已知的一种技术。预测的编码序列示出于SEQIDNO:1中，并且编码的α-淀粉酶示出于SEQIDNO:2中。发现α-淀粉酶与最接近的来自琼脂水解海水菌(Aquimarineagarilytica)的公共蛋白质序列具有79.5％的序列一致性。琼脂水解海水菌α-淀粉酶的酶特性至今不是已知的，杰奥詹森黄杆菌的酶特性披露于本申请中。

α-淀粉酶基因的克隆和表达

如描述于WO99/43835(通过引用而特此结合)中，通过SOEPCR融合将来自地衣芽孢杆菌的碱性α-淀粉酶(amyL)的信号肽与编码该α-淀粉酶的DNA在框内融合，并且替换天然分泌信号基因。为扩增编码DNA，使用杰奥詹森黄杆菌的基因组DNA作为模板并使用寡聚物正向引物和反向引物以便通过PCR扩增基因。

正向引物：TGCCTCATTCTGCAGCCGCGCAAGACGAAGATGTACTATTTCA(SEQIDNO:3)

反向引物：TCATTAGTGGTGATGGTGATGATGTTGTGTCCAAACAGCATAAT(SEQIDNO:4)

将衍生的PCR产物与表达盒元件融合。通过三联启动子系统进行控制来表达来自杰奥詹森黄杆菌的α-淀粉酶基因，该启动子系统由包含稳定化序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)启动子和苏云金芽孢杆菌cryIIIA启动子组成。表达盒已经描述于WO99/43835中。此外，该表达盒包含一个终止子(term)序列和一种用于编码氯霉素乙酰转移酶(cam)的基因，该氯霉素乙酰转移酶被用作枯草芽孢杆菌的选择性标记(如描述于帝德里奇森(Diderichsen)等人，1993，质粒(Plasmid)30:312-315中)。

将上述完整表达盒转化进枯草芽孢杆菌中，并且将该表达盒通过同源重组到果胶裂解酶基因座中而整合进枯草芽孢杆菌染色体中(WO99/43835)。

通过DNA测序分析氯霉素抗性转化株，以验证该构建体的正确的DNA序列。翻译的蛋白质序列对应于SEQIDNO:2。

将转化体铺板于包含6μg/l氯霉素和汽巴克隆(cibacron)染色的支链淀粉的LB板上，两个重复。将这些板在37℃下孵育过夜。在孵育之后，透明区出现在表达活性α-淀粉酶的转化体周围。选择两个α-淀粉酶表达克隆用于进一步的表征。

将一个具有确认的基因序列的克隆接种到包含2ml液体培养基的深孔微量滴定板中，并且在300rpm在26℃进行摇动。在第3天，通过离心收获培养物，将200μl的上清液收集用于SDS-凝胶电泳。

将用于SDS凝胶电泳的样品与180μlNovex三甲基甘氨酸(Tricine)SDS样品缓冲液2x(英杰公司，目录号LC1676)和20μlNuPage样品还原剂(英杰公司，目录号NP0009)进行混合，并且根据产商说明书将每个的10μl加载于8％-16％无染色剂Tris-HClprecase标准凝胶(StainfreeTris-HClprecaseCriteriongel)(伯乐公司(Biorad))上并在1xTris/甘氨酸SDS缓冲液中运行。使用成像仪连同用于凝胶染色的蓝染色剂(BlueStain)使凝胶可视化。结果示出预期大小的清晰的重组蛋白质条带。

如描述于实例3中的，对酶进行纯化。

实例2：SEQIDNO:9和14的α-淀粉酶的克隆和制备-SEQIDNO:9-黄杆菌属-62066的α-淀粉酶

α-淀粉酶编码基因的鉴定

为了克隆α-淀粉酶基因，对黄杆菌属-62066的基因组DNA进行测序。通过QIAampDNA血液迷你试剂盒(QIAampDNABloodMiniKit)(凯杰公司(Qiagen)，希尔登，德国)分离黄杆菌属-62066的染色体DNA。将五ug的染色体DNA送至FASTERISSA，瑞士进行基因组测序。

α-淀粉酶基因是通过在公共蛋白质数据库中进行同源性研究发现的，这是本领域技术人员已知的一种技术。编码序列示出于SEQIDNO:5中，并且α-淀粉酶示出于SEQIDNO:6中。发现α-淀粉酶与最接近的来自琼脂水解海水菌(Aquimarinaagarilytica)的公共蛋白质序列具有80％的序列一致性。

α-淀粉酶基因的克隆和表达

基于被鉴定为SEQIDNO:5的核苷酸序列，由基因技术(GeneArt)(基因技术生物公司(GENEARTAGBioPark)，约瑟夫-恩格特大街(Josef-Engert-Str.)11号，93053，雷根斯堡，德国)合成具有SEQIDNO:7的经密码子优化的合成基因。如在WO12/025577中所述，使用ClaI和MluI限制酶切位点将该合成基因亚克隆进芽孢杆菌属表达载体中。用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA，SEQIDNO:7的核苷酸1-81)代替天然的分泌信号来表达该α-淀粉酶。该淀粉酶被表达为具有C-末端His-标签(HHHHHH)以便于纯化。表达的DNA序列列出于SEQIDNO:7中，并且编码的蛋白列出于SEQIDNO:8中，并且表达的成熟蛋白序列列出于SEQIDNO:9中。将表达质粒转化到枯草芽孢杆菌中。将表达盒通过同源重组进果胶裂解酶基因座中来整合。在补充有6μg/ml氯霉素的LB板上选择转化体。选择包含整合的表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆，并且在旋转摇床上在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyerflask)中进行培养，每个锥形瓶包含100ml基于酵母提取物的培养基。将该克隆在26℃下培养3天。收获包含上清液的酶并如实施例4中所述的将该酶进行纯化。

SEQIDNO:14-阿赫兰氏菌属-62069的α-淀粉酶

α-淀粉酶编码基因的鉴定

为了克隆α-淀粉酶基因，对阿赫兰氏菌属-62069的基因组DNA进行测序。通过QIAampDNA血液迷你试剂盒(QIAampDNABloodMiniKit)(凯杰公司(Qiagen)，希尔登，德国)分离阿赫兰氏菌属-62069的染色体DNA。将五ug的染色体DNA送至FASTERISSA，瑞士进行基因组测序。

α-淀粉酶基因是通过在公共蛋白质数据库中进行同源性研究发现的，这是本领域技术人员已知的一种技术。编码序列示于SEQIDNO:10中。发现α-淀粉酶与最接近的来自琼脂水解海水菌(Aquimarinaagarilytica)的公共蛋白质序列具有79.7％的序列一致性。

α-淀粉酶基因的克隆和表达

基于被鉴定为SEQIDNO:10的核苷酸序列，由基因技术(GeneArt)(基因技术生物公司(GENEARTAGBioPark)，约瑟夫-恩格特大街(Josef-Engert-Str.)11号，93053，雷根斯堡，德国)合成具有SEQIDNO:12的经密码子优化的合成基因。如在WO12/025577中所述，使用ClaI和MluI限制酶切位点将该合成基因亚克隆进芽孢杆菌属表达载体中。用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA)代替天然的分泌信号来表达该α-淀粉酶。该淀粉酶被表达为具有C-末端His-标签(HHHHHH)以便于纯化。表达的DNA序列列出于SEQIDNO:12中，并且编码的蛋白列出于SEQIDNO:13中，并且表达的成熟蛋白序列列出于SEQIDNO:14中。将表达质粒转化到枯草芽孢杆菌中。将表达盒通过同源重组进果胶裂解酶基因座中来整合。在补充有6μg/ml氯霉素的LB板上选择转化体。选择包含整合的表达构建体的重组枯草芽孢杆菌克隆，并且在旋转摇床上在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyerflask)中进行培养，每个锥形瓶包含100ml基于酵母提取物的培养基。将该克隆在26℃下培养3天。收获包含上清液的酶并如实施例4中所述的将该酶进行纯化。

实例3：SEQIDNO:2的α-淀粉酶的纯化

选择分离的表达克隆并且在旋转式摇床上在500mL带挡板的锥形瓶中培养，每个锥形瓶包含100mlCal18培养基。将该克隆在26℃培养3天，随后收集上清液用于α-淀粉酶的纯化。

将来自如实例1中所述制备的在摇床锥形瓶中生长的所选择克隆的800ml上清液用于α-淀粉酶的纯化。将上清液通过0.45μl滤器并随后通过EKS滤器在加压部件(pressurizednut)上进行过滤。

将pH调节至8.0，并且将上清液加载于70ml装有CuSO₄的螯合琼脂糖柱上。将柱使用0％至100％的超过5个柱体积的缓冲液A：50mMTris-HCl、0.1mMCaCl₂(pH)和缓冲液B：50mMMES、0.5M咪唑、0.1mMCaCl₂(pH7.0)的梯度进行洗脱，同时收集10ml级分。流速为10ml/min。将级分17-23基于色谱图进行合并，并且通过透析将缓冲液交换进50mMMES、0.1mMCaCl₂(pH7.0)中。随后，将合并物加载在30mlSp-琼脂糖柱上，将柱使用0至100％的超过5个柱体积的缓冲液A：50mMMES、0.1mMCaCl₂(pH7.0)和缓冲液B：50mMMES、0.1mMCaCl₂、1MNaCl(pH7.0)的梯度进行洗脱，同时收集10ml级分，并且流速为10ml/min。将每个级分的样品如上所述在SDS凝胶上运行，并且将具有预期大小的清晰条带的级分7-9合并并且储存以用于酶的进一步分析。

将纯化的酶的α-淀粉酶活性使用上述方法进行确定，并且发现纯化的酶是有活性的。

实例4：SEQIDNO9和14的α-淀粉酶的纯化

将上清液的pH调节至pH8，通过0.2μM滤器进行过滤，并且将上清液施加于5mlHisTrap^TMexcel柱上。在加载之前，该柱已经在5个柱体积(CV)的50mMTris/HCl(pH8)中平衡好。为了去除未结合的材料，将该柱用8CV的50mMTris/HCl(pH8)进行洗涤，靶标的洗脱是用50mMHEPES(pH7)+10mM咪唑获得。将洗脱的蛋白在HiPrep^TM26/10脱盐柱上进行脱盐，该脱盐柱使用了3CV的50mMHEPES(pH7)+100mMNaCl得以平衡。也将此缓冲液用于靶标的洗脱，并且流速是10ml/min。选择相关级分，并且基于色谱图和SDS-PAGE分析进行合并。

实例5：SEQIDNO:2的成熟α-淀粉酶(SEQIDNO:2的氨基酸24至428)(0.3mgEP/L)的洗涤性能

将如在实例2和3中制备和纯化的本发明的SEQIDNO:2的氨基酸24至428的α-淀粉酶在如上所述的AMSA测试中进行测试。该测试是使用测试布样CS-28棉花上的大米淀粉(TEX353-5)进行的，该布样是由测试材料BV中心，邮箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰提供。将该酶在四种不同的洗涤剂组合物中进行测试：标准洗涤剂A、标准洗涤剂T、标准洗涤剂J和标准洗涤剂X，并且在15℃和30℃两者下进行。

将本发明的酶的洗涤性能与另一种披露于WO00/60060中的野生型α-淀粉酶AA560(在此为SEQIDNO:15)的性能进行比较，该野生型α-淀粉酶AA560已经成为一些洗涤剂α-淀粉酶的基础，参见例如WO01/66712和WO06/02643。

将该酶以0.3mg酶蛋白/l洗涤溶液给予，并且结果计算为4个测定值的平均值。获得以下结果：

结果显示本发明的酶在所有测试的洗涤剂组合物中并且在测试的两种温度下提供了显著的洗涤性能。接着，在所有测试条件下，本发明的酶的性能等同于或优于现有技术野生型酶AA560。

另外，与现有技术野生型AA560相比，本发明的酶在低温下具有显著更好的洗涤性能，这是通过在15℃的洗涤性能反映的。

最后，本发明的酶在15℃和30℃两者下均具有高性能。这可以通过观察在15℃和30℃下的Δ强度(测量的强度-单独使用洗涤剂时的强度)看出：

在此清楚的是，相比于现有技术α-淀粉酶AA560(其中在15℃下的性能是在30℃下的性能的大约一半或更少)，本发明的酶在15℃和30℃下具有近似相同的洗涤性能。

实例6：相比于商业洗涤剂α-淀粉酶Stainzyme^TM(0.3mgEP/L)的洗涤性能

如实例5中描述的进行洗涤性能的测试，但相比较的是商业洗涤剂α-淀粉酶Stainzyme^TM

结果显示，相比于商业α-淀粉酶Stainzyme，本发明的酶(SEQIDNO:2的氨基酸24至428)提供了在所有测试的洗涤剂组合物中在15℃下显著改进的洗涤性能。

在30℃，结果示出Stainzyme比SEQIDNO:2的成熟α-淀粉酶(氨基酸24至428)具有更好的洗涤性能。

实例7：本发明的淀粉酶(0.3mgEP/L)在标准洗涤剂A中的洗涤性能。

将如在实例2、3和4中制备和纯化的SEQIDNO:2、SEQIDNO:9和SEQIDNO:14的α-淀粉酶的洗涤性能(氨基酸24至428)在如上所述的AMSA测试中进行测试。该测试是使用测试布样CS-28棉花上的大米淀粉(TEX353-5)进行的，该布样是由测试材料BV中心，邮箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰提供。在15℃和30℃两者下将酶在标准洗涤剂A中进行测试。

结果显示，相比于SEQIDNO:15的现有技术淀粉酶，SEQIDNO:2和9的酶提供了在15℃和30℃下在标准洗涤剂A中改进的洗涤性能。SEQIDNO:14的α-淀粉酶在15℃是同等的(onpar)。现有技术的淀粉酶的15/30比率是0.36，并且对于本发明的三种酶是0.55、0.5和0.63。

实例8：本发明的淀粉酶(0.6mgEP/L)的洗涤性能。

将如在实例2、3和4中制备和纯化的SEQIDNO:2、SEQIDNO:9和SEQIDNO:14的α-淀粉酶的洗涤性能(氨基酸24至428)在如上所述的AMSA测试中进行测试。该测试是使用测试布样CS-28棉花上的大米淀粉(TEX353-5)进行的，该布样是由测试材料BV中心，邮箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰提供。将该酶在四种不同的洗涤剂组合物中进行测试：标准洗涤剂A、标准洗涤剂T、标准洗涤剂J和标准洗涤剂X，并且在15℃和30℃两者下进行。

将该酶以0.6mg酶蛋白/L洗涤溶液给予，并且结果计算为4个测定值的平均值。获得以下结果：

此实验的结果示出本发明的酶提供了在15℃下在标准洗涤剂A、X和T中显著改进的洗涤性能。这可以通过观察在15℃下的Δ强度(测量的强度-单独使用洗涤剂时的强度)看出。

还清楚的是本发明的酶的15/30比率显著高于现有技术淀粉酶的15/30比率。相应地，对于SEQIDNO:2(氨基酸24至428)、SEQIDNO:9和14的酶而言，在标准洗涤剂A中的15/30比率分别为0.55、0.5和0.63，而现有技术α-淀粉酶AA560的15/30比率仅为0.36。

Claims

1.一种具有α-淀粉酶活性并且在标准洗涤剂A中测量时具有以下15/30比率的多肽：至少0.50、优选至少0.6、优选至少0.7、优选至少0.8、优选至少0.9、优选至少1.0。

2.一种具有α-淀粉酶活性的多肽，该多肽选自下组，该组由以下各项组成：

(a)与SEQIDNO:2的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；

(e)与SEQIDNO:6的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；

(i)与SEQIDNO:11的成熟多肽具有至少85％序列一致性的多肽；

3.如权利要求2所述的多肽，该多肽在标准洗涤剂A中测量时具有至少0.50、优选至少0.6、优选至少0.7、优选至少0.8、优选至少0.9或优选至少1.0的15/30比率。

4.如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽与SEQIDNO:2、6或11的成熟多肽中的任一个具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

5.如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽是由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格或非常高严格条件下与SEQIDNO:1、5或10的成熟多肽编码序列的任一个或其全长互补体杂交。

6.如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽是由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQIDNO:1、5和10的任一个的成熟多肽编码序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列一致性。

7.如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽是分离的。

8.如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包括或其组成为SEQIDNO:2、6或11或者SEQIDNO:2、6或11的成熟多肽。

9.如权利要求8所述的多肽，其中SEQIDNO:2的成熟多肽是SEQIDNO:2的氨基酸24至428，SEQIDNO:6的成熟多肽是氨基酸1至409，并且SEQIDNO:11的成熟多肽是氨基酸1至409。

10.如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽是SEQIDNO:2、6或11的成熟多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失和/或插入。

11.如权利要求8所述的多肽，该多肽是SEQIDNO:2的成熟多肽的变体。

12.一种包括如权利要求1-11中任一项所述的多肽的组合物。

13.如权利要求12所述的组合物，该组合物是包含至少一种表面活性剂的洗涤剂组合物。

14.如权利要求12或13中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括至少一种选自以下项的另外的酶：蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶、和/或过氧化物酶。

15.如权利要求12-14中任一项所述的组合物的用途，用于衣物洗涤或者用于例如自动化餐具洗涤或手动餐具洗涤的硬表面清洁。

16.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码如权利要求1-11中任一项所述的多肽。

17.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求16所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主内的产生的一个或多个控制序列。

18.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括如权利要求16所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。

19.一种产生如权利要求1-11中任一项所述的多肽的方法，该方法包括：在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽。

20.如权利要求19所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

21.一种产生具有α-淀粉酶活性的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如权利要求18所述的宿主细胞。

22.如权利要求21所述的方法，该方法进一步包括回收该多肽。

23.一种包括如权利要求1-11中任一项所述的多肽的全培养液配制品或细胞培养组合物。