CN110382694A - α-淀粉酶变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及亲本α‑淀粉酶的变体，当与亲本α‑淀粉酶相比时，该亲本α‑淀粉酶的变体具有改进的洗涤性能。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸，包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生本发明的变体的方法。

Description

α-淀粉酶变体
序列表的引用
本申请包含处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及α-淀粉酶的变体、编码这些变体的多核苷酸和产生这些变体的方法。
背景技术
α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)由一组酶构成，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。
α-淀粉酶在工业上用于若干种已知应用的用途具有悠久历史，这些应用如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，例如在高果糖糖浆的制备中或用作从淀粉生产乙醇的一部分。α-淀粉酶的这些应用和其他应用是已知的并且利用了衍生自微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。
属于首先被使用的细菌α-淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α-淀粉酶，还称作Termamyl，该Termamyl已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。碱性淀粉酶(如AA560)形成已经发现用于洗涤剂中的一个特定组的α-淀粉酶。这些已知的细菌淀粉酶中许多已经经修饰以改善它们在特定应用中的功能性。
芽孢杆菌属淀粉酶，如Termamyl、AA560(WO 2000/060060)和SP707(由Tsukamoto等人,1988,Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学和生物物理研究通讯]151:25-31描述)形成已经发现用于洗涤剂中的一个特定组的α-淀粉酶。已经对这些淀粉酶进行修饰以改进其在洗涤剂中的稳定性。例如WO 96/23873披露了缺失SP707(WO 96/23873的SEQ ID NO:7)的氨基酸181+182或氨基酸183+184以改进此淀粉酶的稳定性。WO 96/23873进一步披露了通过用例如亮氨酸取代M202来修饰SP707淀粉酶以使该分子对氧化保持稳定。因而，修饰淀粉酶来改进某些特性是已知的。
出于环境原因，在洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中降低温度已经日益重要。然而，大多数酶(包括淀粉酶)具有在低温洗涤中通常所用的温度以上的最适温度。α-淀粉酶是用于洗涤剂组合物中的关键酶并且对于衣物洗涤或餐具洗涤期间去除淀粉污渍，其用途已经变得日益重要。因此，重要的是找到如下α-淀粉酶变体，它们在温度降低时保留其洗涤性能、污渍去除作用和/或活性。然而，尽管当前洗涤剂酶组合物的效率，仍然存在着难以完全去除的许多污渍。这些问题因低(例如，冷水)洗涤温度的增加使用和较短的洗涤周期而加剧。因而，需要获得这样的淀粉分解酶，这些酶可以在低温下发挥功能并同时保留或增加其他所希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、稳定性和/或洗涤性能。
因此，本发明的一个目的是提供可在低温如在5℃-40℃用于洗涤、餐具洗涤和/或清洁过程中的α-淀粉酶变体。本发明的另一个目的是提供与亲本α-淀粉酶相比或与SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7或8中任一项的α-淀粉酶相比在低温具有改进的洗涤性能的α-淀粉酶变体。
发明内容
本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，其中该变体包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，(ii)该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)该变体具有α-淀粉酶活性。
本发明还涉及编码根据本发明的变体的多核苷酸、包含编码根据本发明的变体的多核苷酸的核酸构建体、包含编码根据本发明的变体的多核苷酸的表达载体、和包含编码根据本发明的变体的多核苷酸的宿主细胞。
本发明还涉及产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：(a)在适合于该变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)回收该变体。
本发明进一步涉及获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的109、7、1、391、280、284、320和323的一个或多个位置处，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中向亲本α-淀粉酶引入修饰，其中各修饰独立地为取代或缺失，且该变体具有α-淀粉酶活性；以及回收该变体。
具体实施方式
本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，其中该变体包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的109、7、1、391、280、284、320和323的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，(ii)该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)该变体具有α-淀粉酶活性。
在一方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，其中该变体包含(i)在对应于选自下组的位置的一个或多个位置处的修饰，该组由以下组成：SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391，以及任选地在对应于选自下组的位置的一个或多个位置中的修饰，该组由以下组成：SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476，(ii)该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)该变体具有α-淀粉酶活性。
定义
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
术语“α-淀粉酶”(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，这些酶催化淀粉以及其他直链和支链1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。出于本发明的目的，根据实例部分中所述的程序确定α-淀粉酶活性。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。
如本文使用的，术语‘氨基酸’包括标准二十种遗传编码的氨基酸及其相应的处于“d”型(与天然“l”型进行对比)的立体异构体、ω-氨基酸、其他天然存在的氨基酸、非常规氨基酸(例如α,α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸等)和化学衍生的氨基酸。可以通过与功能性侧基团反应来实现一个或多个氨基酸的化学衍生物。此类衍生的分子包括例如，其中游离氨基基团已被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基基团、羧基苯氧基基团、叔丁氧基羰基基团、氯乙酰基基团或甲酰基基团的那些分子。游离羧基基团可被衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯和酰肼。游离羟基基团可被衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。作为化学衍生物还包括那些含有二十种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如：4-羟脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸并且鸟氨酸取代赖氨酸。只要维持必要的活性，衍生物也包括含有一个或多个添加或缺失的肽。其他包括的修饰是酰胺化、氨基末端酰化(例如乙酰化或巯基乙酸酰胺化)、末端羧基酰胺化(例如用氨或甲胺)、和类似的末端修饰。
当明确列举氨基酸，如‘丙氨酸’或‘Ala’或‘A’时，除非另有明确说明，否则该术语是指l-丙氨酸和d-丙氨酸两者。其他非常规氨基酸也可以是本发明多肽的适合组分，只要所需功能特性由多肽保留即可。对于所示的肽，适当时，每个编码的氨基酸残基由单字母代号表示，对应于常规氨基酸的普通名称。在一个实施例中，本发明的多肽包含L-氨基酸或由其组成。
术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。这类控制序列包括但不限于前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、和转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
术语“增强的洗涤性能”或“改进的洗涤性能”意指与SEQ ID NO:1的亲本α淀粉酶相比，本发明的多肽在洗涤过程(例如衣物洗涤或餐具洗涤)中提供清洗效果(例如去除污渍)的能力是改进的。可以使用本领域已知的方法来确定洗涤性能，如使用自动机械应力测定(AMSA)。本领域技术人员会理解，仅在一些或者可能所有的洗涤条件下，例如在20℃或更高(如在40℃)的洗涤温度,可以实现增强的洗涤性能。
本文使用的术语“酶去垢力益处”是指可将一种酶添加至洗涤剂中与不具有该酶的同一洗涤剂相比的有利作用。可能由酶提供的重要去垢力益处是污渍去除伴随在洗涤和/或清洁之后无可见污垢或几乎无可见污垢、预防或减少在洗涤过程中释放的污垢再沉积(一种又称作抗再沉积的作用)、完全或部分地恢复纺织品的白度(一种又称作增白的作用)，其中这些纺织品最初是白色的，但是在反复使用和洗涤后获得淡灰或淡黄色外观。不直接与污垢的催化污渍去除或其再沉积的预防相关的纺织品护理益处对于酶去垢力益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是防止或减少染料从一织物转移至另一织物或同一织物的另一部分(也被称作染料转移抑制或抗返染的效果)，从织物表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的球或绒毛(也被称作抗起球的效果)，改善织物柔软性，织物的颜色澄清以及去除陷在织物或服装的纤维中的微粒状污垢。酶法漂白是一种另外的酶去垢力益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(如过氧化氢或其他过氧化物)的形成。
术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，该分子包括编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。
术语“片段”意指具有在SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有α-淀粉酶活性。在一方面，片段含有SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的至少200个连续的氨基酸残基，例如SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7或8的至少300个连续的氨基酸残基、或至少350个连续的氨基酸残基、或至少400个连续的氨基酸残基、或至少450个连续的氨基酸残基。
术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
如本文使用的，术语“强度值”是指洗涤性能测量值。洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用于测量洗涤性能，其中更高的强度值与更高的洗涤性能相关。用专业平板扫描仪(Kodak iQsmart，柯达(Kodak))进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。为了从扫描的图像中提取光强度的值，将来自图像的24-位像素值转化为红色、绿色以及蓝色(RGB)的值。通过将RGB值作为向量进行加和并且然后取所得向量的长度来计算强度值(Int)：
术语“δ强度”或“δ强度值”在本文定义为测试材料的强度测量结果，该测试材料是例如小块布样CS-28(测试材料BV中心(Center For Testmaterials BV)，邮政信箱120，3133KT弗拉尔丁恩，荷兰)或硬表面。将该小块布样与作为背景的在相同条件下洗涤的该小块布样的一部分一起测量。δ强度是用淀粉酶洗涤的测试材料的强度值减去未用淀粉酶洗涤的测试材料的强度值。
如本文使用的，术语“改善的特性”是指与亲本相比有所改善的、与变体相关的特征。此类改善的特性包括但不限于洗涤性能、热活性、热稳定性、和存储条件下的稳定性和化学稳定性。改善的特性可以是本文定义和描述的那些中的任何一种，如稳定性。
术语“改进的洗涤性能”在本文中定义为显示本发明的淀粉酶的洗涤性能相对于SEQ ID NO:2或1的淀粉酶的洗涤性能的改变，这种改变可以(例如)被视为增加的污渍去除。根据实例1确定改进的洗涤性能。在实例1中所列的一种或多种条件中，在模式洗涤剂A中在20℃，其中该α-淀粉酶变体浓度是0.2mg/L；或在模式洗涤剂A中在40℃，其中该α-淀粉酶变体浓度是0.05mg/L；或在模式洗涤剂J中在20℃，其中该α-淀粉酶变体浓度是0.2mg/L；或在模式洗涤剂J中在30℃，其中该α-淀粉酶变体浓度是0.05mg/L；或在模式洗涤剂K中在20℃，其中该α-淀粉酶变体浓度是0.2mg/L，如果改善因子(IF)高于1.0，优选高于1.05，则洗涤性能被改善。实例部分中描述了这些洗涤条件。
术语“洗涤性能”包括通常清洁例如硬表面清洁，如在餐具洗涤中，但还包括在纺织品如衣物上的洗涤性能，并且还包括工业清洁和机构清洁。可以通过比较如在本文的定义中描述的δ强度来测量改进的洗涤性能。
术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。在一方面，本发明涉及分离的α-淀粉酶变体。
分离的多核苷酸：术语“分离的多核苷酸”意指通过人工修饰的多核苷酸。在一方面，如通过琼脂糖电泳所确定的，该分离的多核苷酸是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、至少90％纯的、以及至少95％纯的。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或其任何组合。
分离的变体：术语“分离的变体”意指通过人工修饰的变体。在一方面，如通过SDS-PAGE所确定的，该变体是至少1％纯的，例如至少5％纯的、至少10％纯的、至少20％纯的、至少40％纯的、至少60％纯的、至少80％纯的、以及至少90％纯的。
低温：“低温”是5℃-40℃，优选5℃-35℃，优选5℃-30℃，更优选5℃-25℃，更优选5℃-20℃，最优选5℃-15℃，并且特别是5℃-10℃的温度。在优选的实施例中，“低温”是10℃-35℃，优选10℃-30℃、或10℃-25℃、或10℃-20℃、或10℃-15℃的温度。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰，例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有α-淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。
在本发明多肽的上下文中，术语“突变”意指在参考氨基酸序列(即SEQ ID NO:1)内的一个或多个氨基酸通过用不同的氨基酸取代或通过缺失而改变。此外，突变可以对应于在参考氨基酸序列内一个或多个额外的氨基酸的插入。
术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”是同义的。
术语“可操作地连接”意指如下的构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列引导该编码序列的表达。
术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指进行变化以产生本发明的酶变体的α-淀粉酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体。例如，亲本可为SEQ ID NO:1的α-淀粉酶(称为SP722)。可替代地，它也可以意指SEQ ID NO:2的α-淀粉酶。亲本α-淀粉酶可为任何合适的α-淀粉酶，如本文作为SEQ ID NO:3、4、5、6、7和8所列的那些。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人，2000，TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的。使用的参数可以是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
可替代地，所使用的参数可以是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用-nobrief选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
淀粉去除过程：表述“淀粉去除过程”涉及任何一种过程，通过该过程淀粉被去除(或被转化)，如在从纺织品去除淀粉的洗涤过程，例如纺织品清洁如衣物洗涤中。淀粉去除过程还可为硬表面清洁(如餐具洗涤)或其可为一般的清洁过程(如工业或机构清洁)。该表述还包括其他淀粉去除过程或淀粉转化、乙醇生产、淀粉液化、纺织品退浆、纸和纸浆生产、啤酒制造和一般的洗涤剂。
基本上纯的多核苷酸：术语“基本上纯的多核苷酸”意指不含其他外部或不想要的核苷酸并且处在适用于基因程化多肽生产系统内的形式的多核苷酸制剂。因而，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％和至多0.5％与该基本上纯的多核苷酸天然或重组相关的其他多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可以包括天然存在的5’-和3’-非翻译区，如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90％纯的，例如至少92％纯的、至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、以及至少99.5％纯的。本发明的多核苷酸优选地处于基本上纯的形式。
基本上纯的变体：术语“基本上纯的变体”意指含有按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、和至多0.5％与该基本上纯的变体天然或重组相关的其他多肽物质的制剂。优选地，该变体按存在于制剂中的总多肽物质的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的变体优选地处于基本上纯的形式。例如，这可通过经由熟知的重组方法或经由经典的纯化方法制备变体来完成。
术语“子序列”意指具有从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的一个或多个(例如，若干个)核苷酸的多核苷酸；其中该子序列编码具有α-淀粉酶活性的片段。
纺织品：纺织品样品CS-28(棉花上的大米淀粉)获得自试验材料BV中心，邮政信箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰。
被定义为不直接与污垢的催化污渍去除或其再沉积的预防相关的、如本文使用的术语“纺织品护理益处”对于酶去垢力益处而言也是重要的。此类纺织品护理益处的实例是预防或减少染料从一个纺织品转移至另一个纺织品或同一纺织品的另一个部分(一种也被称作染料转移抑制或抗返染的作用)，从纺织品表面去除突出或断裂的纤维以减少起球倾向或去除已经存在的绒球或绒毛(一种也被称作抗起球的作用)，改善纺织品柔软性，使纺织品的颜色澄清以及去除陷在纺织品的纤维中的微粒状污垢。酶漂白是一种另外的酶去垢力益处，其中通常将催化活性用于催化漂白组分(如过氧化氢或其他过氧化物或其他漂白种类)的形成。
术语“变体”意指相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8的“亲本”α-淀粉酶，在一个或多个(例如，若干个)位置包含突变(即，取代、插入、和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指添加一个氨基酸邻近且紧接着占据某一位置的氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的α-淀粉酶活性。
术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的α-淀粉酶。
变体命名惯例
具有α-淀粉酶活性的本发明的多肽对应于源自芽孢杆菌属的α-淀粉酶的变体，如SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7和8中所示的。
SEQ ID NO:1
HHNGTNGTMMQYFEWHLPNDGNHWNRLRDDASNLRNRGITAIWIPPAWKGTSQNDVGYGAYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTRSQLESAIHALKNNGVQVYGDVVMNHKGGADATENVLAVEVNPNNRNQEISGDYTIEAWTKFDFPGRGNTYSDFKWRWYHFDGVDWDQSRQFQNRIYKFRGDGKAWDWEVDSENGNYDYLMYADVDMDHPEVVNELRRWGEWYTNTLNLDGFRIDAVKHIKYSFTRDWLTHVRNATGKEMFAVAEFWKNDLGALENYLNKTNWNHSVFDVPLHYNLYNASNSGGNYDMAKLLNGTVVQKHPMHAVTFVDNHDSQPGESLESFVQEWFKPLAYALILTREQGYPSVFYGDYYGIPTHSVPAMKAKIDPILEARQNFAYGTQHDYFDHHNIIGWTREGNTTHPNSGLATIMSDGPGGEKWMYVGQNKAGQVWHDITGNKPGTVTINADGWANFSVNGGSVSIWVKR
出于本发明的目的，使用在SEQ ID NO:1中披露的多肽来确定另一种α-淀粉酶多肽中的相应氨基酸残基。然而，本领域技术人员会认识到，也可以使用SEQ ID NO:2的序列来确定另一种α-淀粉酶多肽中的相应氨基酸残基。将另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQID NO:1中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件包，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的Needle程序中所实施的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)确定与SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基相对应的氨基酸位置编号。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其相应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797),MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离使得传统的基于序列的比较不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,ProteinEngineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的α-淀粉酶变体中，调整以下所述的命名法以方便引用。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的例如苏氨酸用丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置181处的甘氨酸的缺失指定为“Ser181*”或“S181*”。多个缺失通过加号(“+”)分开，例如，“Ser181*+Thr182*”或“S181*+T182*”。
插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸。因此，将在位置195处的例如甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的插入被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入的氨基酸#1、插入的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所插入的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
多个修饰。包含多个修饰的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同修饰。在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：
“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
亲本α-淀粉酶
该亲本α-淀粉酶可为一种与SEQ ID NO:1中所示的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1的多肽的等位基因变体。
该亲本α-淀粉酶还可为与SEQ ID NO:2中所示的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:2的多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:2的多肽的等位基因变体。
该亲本α-淀粉酶还可为与SEQ ID NO:3中所示的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:3的多肽的等位基因变体。
该亲本α-淀粉酶还可为与SEQ ID NO:4中所示的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:4的多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:4的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:4的多肽的等位基因变体。
该亲本α-淀粉酶还可为与SEQ ID NO:5中所示的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:5的多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:5的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:5的多肽的等位基因变体。
该亲本α-淀粉酶还可为与SEQ ID NO:6中所示的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:6的多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:6的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:6的多肽的等位基因变体。
该亲本α-淀粉酶还可为与SEQ ID NO:7中所示的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:7的多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:7的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:7的多肽的等位基因变体。
该亲本α-淀粉酶还可为与SEQ ID NO:8中所示的多肽具有至少80％序列同一性的多肽。
在一方面，亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:8的多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％，例如至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性，并且具有α-淀粉酶活性。在一方面，亲本α-淀粉酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:8的多肽相差不超过十个氨基酸，例如相差五个氨基酸、相差四个氨基酸、相差三个氨基酸、相差两个氨基酸以及相差一个氨基酸。
亲本α-淀粉酶优选包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成。在另一个实施例中，亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:8的多肽的等位基因变体。
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的氨基酸序列或其片段可被用于设计核酸探针，以根据本领域熟知的方法从不同属或种的菌株鉴定并克隆编码亲本的DNA。具体而言，根据标准的DNA印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和分离其中相应的基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少14，如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针的长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由这类其他生物制备的基因组DNA或cDNA文库。可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、或其他分离技术分离来自这类其他生物的基因组或其他DNA。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在用于DNA印迹中的硝化纤维素或其他适合的载体材料上。
出于本发明的目的，杂交指示多核苷酸在低至非常高严格条件下，与被标记的核苷酸探针杂交，该核苷酸探针对应于编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或其子序列的多核苷酸。可以使用例如X-射线片或本领域已知的任何其他检测手段来检测该探针所杂交的分子。
在一方面，该核酸探针是编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8的多肽或其片段的多核苷酸。
对于长度为至少100个核苷酸的长探针而言，非常低至非常高严格条件定义为最佳地按照标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA中，以及对于非常低和低严格度在25％甲酰胺中，对于中和中-高严格度在35％甲酰胺中，或对于高和非常高严格度在50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS在45℃(非常低严格度)、50℃(低严格度)、55℃(中严格度)、60℃(中-高严格度)、65℃(高严格度)、或70℃(非常高严格度)洗涤三次，每次持续15分钟。
对于长度为约15个核苷酸至约70个核苷酸的短探针而言，严格条件定义为最佳地遵循标准DNA印迹程序，在比使用根据Bolton和McCarthy(1962,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]48:1390)的计算所算出的Tm低约5℃至约10℃，在每ml 0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl(pH 7.6)、6mM EDTA、0.5％NP-40、1X登哈特氏溶液(Denhardt’ssolution)、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mM ATP、以及0.2mg的酵母RNA中预杂交和杂交12至24小时。将载体材料最终在比所计算的Tm低5℃至10℃，在6X SCC加0.1％SDS中洗涤一次(持续15分钟)并且使用6X SSC洗涤两次(每次15分钟)。
该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如文本与一种给定的来源相连使用的术语“从……中获得”意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或者由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的细胞产生的。在一方面，该亲本是胞外分泌的。
亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，该亲本可以是革兰氏阳性细菌多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)α-淀粉酶，或者革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、或脲原体属(Ureaplasma)α-淀粉酶。
在一方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌α-淀粉酶。
在另一方面，该亲本是似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)α-淀粉酶。
在另一方面，该亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)α-淀粉酶。
在另一方面，该亲本是芽孢杆菌属物种α-淀粉酶，例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的α-淀粉酶。
应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，这些培养物保藏中心如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以使用上述探针，从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物鉴定并获得该亲本或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品而得到编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。
该亲本可以是杂合多肽，其中一个多肽的一部分融合在另一个多肽的一部分的N-末端或C-末端处。
该亲本还可为一种融合多肽或可切割的融合多肽，其中一个多肽融合在另一个多肽的N-末端或C-末端处。通过将编码一个多肽的多核苷酸融合至编码另一个多肽的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在阅读框中，并且使所述融合的多肽的表达在相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。还可使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合物(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[药物发现世界]4:35-48。
变体的制备
本发明涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，该方法包括(a)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中向亲本α-淀粉酶引入修饰，其中各修饰独立地为取代或缺失，且所述变体具有α-淀粉酶活性；以及(b)回收所述变体。
在一方面，本发明涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，该方法包括(a)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处，以及任选地在对应于SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中向亲本α-淀粉酶引入修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，其中各修饰独立地为取代或缺失，且所述变体具有α-淀粉酶活性；以及(b)回收所述变体。
在一个实施例中，该修饰是取代。在一个实施例中，该修饰是缺失。
在另一个实施例中，本发明涉及用于获得具有α-淀粉酶活性的变体的方法，该方法包括(a)在一个或多个位置处向亲本α-淀粉酶引入取代，其中该取代选自：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的多肽的H1A、G7A、G109A、N280S、W284H、K320A、M323N和E391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，以及(b)回收该变体。
在一个实施例中，该方法还包括在一个或多个位置中向亲本α-淀粉酶引入缺失，其中该缺失选自：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的多肽的H1*、R181*、G182*、D183*和G184*，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，并且回收该变体。
在一个实施例中，该方法还包括在一个或多个位置中向亲本α-淀粉酶引入取代，其中该取代选自：SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7或8的多肽的W140Y、N195F、V206Y、Y243F、E260G、G304R和G476K，以及回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备这些变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中在一个或多个限定位点处创建一个或多个(若干个)突变的技术。
通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以在体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变在体外进行定点诱变，该盒式诱变涉及由限制性酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并随后将包含突变的寡核苷酸连接在该多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16)。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行相关的筛选程序可以进行单或多氨基酸取代、缺失和/或插入并对其进行测试，这些相关的筛选程序如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625中披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人,1986,Gene[基因]46:145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
变体
本发明还提供了亲本α-淀粉酶的变体，这些变体包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，(ii)该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，和(iii)该变体具有α-淀粉酶活性。由此，提供了与亲本α-淀粉酶相比或与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8的α-淀粉酶相比在低温下具有改进的洗涤性能的变体。
在实施例中，变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，本发明涉及亲本α-淀粉酶的分离的变体，这些变体包含(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，(ii)该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，和(iii)该变体具有α-淀粉酶活性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:3的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:4的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:5的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:7的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，变体与SEQ ID NO:8的成熟多肽具有至少80％，如至少85％、至少90％、至少95％，如至少96％、至少97％、至少98％、和至少99％，但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，在本发明的变体中的修饰的数目是1至20个，例如1至10个和1至5个，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。
在一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰(如取代)，以及任选地在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的两个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及任选地在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的三个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及任选地在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的四个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及任选地在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的五个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及任选地在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的六个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及任选地在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的七个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及任选地在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的八个位置处的修饰(如取代)，以及任选地在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰(如取代)，以及在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的两个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的三个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的四个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的五个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的六个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的七个或更多个位置处的修饰(如取代)，以及在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在另一个实施例中，该变体包含在对应于位置109、1、7、280、284、320、323和391的八个位置处的修饰(如取代)，以及在对应于位置140、181、182、183、184、195、203、243、260、304和476的一个或多个位置处的修饰，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在优选的实施例中，该变体在选自下组的一个、两个、三个、四个或五个位置中包含修饰，该组由以下组成：1、7、109、280和391。
在一个实施例中，该变体在选自下组的两个、三个、四个或五个位置中包含至少一个缺失和至少一个取代，该组由以下组成：1、7、109、280和391。
在一个实施例中，该变体在选自7、109、280和391的一个、两个、三个或四个位置处包含取代。
在一个实施例中，该变体在选自下组位置的位置中包含修饰，该组由以下组成：X1+X7；X1+X109；X1+X280；X1+X284；X1+X320；X1+X323；X1+X391；X109+X280；X109+X284；X109+X320；X109+X323；X109+X391；X7+X109；X7+X280；X7+X284；X7+X320；X7+X323；X7+X391；X280+X284；X280+X320；X280+X323；X280+X391；X284+X320；X284+X323；X284+X391；X320+X323；X320+X391；和X323+X391，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该变体在选自下组位置的位置中包含修饰，该组由以下组成：X109+X7+X1；X109+X7+X391；X109+X7+X280；X109+X7+X284；X109+X7+X320；X109+X7+X323；X109+X1+X391；X109+X1+X280；X109+X1+X284；X109+X1+X320；X109+X1+X323；X109+X391+X280；X109+X391+X284；X109+X391+X320；X109+X391+X323；X109+X280+X284；X109+X280+X320；X109+X280+X323；X109+X284+X320；X109+X284+X323；X109+X320+X323；X7+X1+X391；X7+X1+X280；X7+X1+X284；X7+X1+X320；X7+X1+X323；X7+X391+X280；X7+X391+X284；X7+X391+X320；X7+X391+X323；X7+X280+X284；X7+X280+X320；X7+X280+X323；X7+X284+X320；X7+X284+X323；X7+X320+X323；X1+X391+X280；X1+X391+X284；X1+X391+X320；X1+X391+X323；X1+X280+X284；X1+X280+X320；X1+X280+X323；X1+X284+X320；X1+X284+X323；X1+X320+X323；X391+X280+X284；X391+X280+X320；X391+X280+X323；X391+X284+X320；X391+X284+X323；X391+X320+X323；X280+X284+X320；X280+X284+X323；X280+X320+X323；和X284+X320+X323，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该变体在选自下组位置的位置中包含修饰，该组由以下组成：X109+X7+X1+X391；X109+X7+X1+X280；X109+X7+X1+X284；X109+X7+X1+X320；X109+X7+X1+X323；X109+X7+X391+X280；X109+X7+X391+X284；X109+X7+X391+X320；X109+X7+X391+X323；X109+X7+X280+X284；X109+X7+X280+X320；X109+X7+X280+X323；X109+X7+X284+X320；X109+X7+X284+X323；X109+X7+X320+X323；X109+X1+X391+X280；X109+X1+X391+X284；X109+X1+X391+X320；X109+X1+X391+X323；X109+X1+X280+X284；X109+X1+X280+X320；X109+X1+X280+X323；X109+X1+X284+X320；X109+X1+X284+X323；X109+X1+X320+X323；X109+X391+X280+X284；X109+X391+X280+X320；X109+X391+X280+X323；X109+X391+X284+X320；X109+X391+X284+X323；X109+X391+X320+X323；X109+X280+X284+X320；X109+X280+X284+X323；X109+X280+X320+X323；X109+X284+X320+X323；X7+X1+X391+X280；X7+X1+X391+X284；X7+X1+X391+X320；X7+X1+X391+X323；X7+X1+X280+X284；X7+X1+X280+X320；X7+X1+X280+X323；X7+X1+X284+X320；X7+X1+X284+X323；X7+X1+X320+X323；X7+X391+X280+X284；X7+X391+X280+X320；X7+X391+X280+X323；X7+X391+X284+X320；X7+X391+X284+X323；X7+X391+X320+X323；X7+X280+X284+X320；X7+X280+X284+X323；X7+X280+X320+X323；X7+X284+X320+X323；X1+X391+X280+X284；X1+X391+X280+X320；X1+X391+X280+X323；X1+X391+X284+X320；X1+X391+X284+X323；X1+X391+X320+X323；X1+X280+X284+X320；X1+X280+X284+X323；X1+X280+X320+X323；X1+X284+X320+X323；X391+X280+X284+X320；X391+X280+X284+X323；X391+X280+X320+X323；X391+X284+X320+X323；和X280+X284+X320+X323，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该变体包含选自下组的一个或多个修饰，该组由以下组成：X1*、X1A、X7A、X7K、X7E、X7N、X7Q、X7L、X7D、X109A、X109S、X140Y、X181*、X182*、X183*、X184*、X195F、X206Y、X243F、X260G、X280S、X284H、X284R、X284F、X304R、X320A、X320M、X320T、X320V、X320S、X323N、X323R、X323S、X323K、X391A、X391V和X476K，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个具体的实施例中，该变体包含选自下组的修饰，该组由以下组成：X1*+X1A；X1*+X7A；X1*+X109A；X1*+X280S；X1*+X284H；X1*+X320A；X1*+X323N；X1*+X391A；X1A+X7A；X1A+X109A；X1A+X280S；X1A+X284H；X1A+X320A；X1A+X323N；X1A+X391A；X7A+X109A；X7A+X280S；X7A+X284H；X7A+X320A；X7A+X323N；X7A+X391A；X109A+X280S；X109A+X284H；X109A+X320A；X109A+X323N；X109A+X391A；X280S+X284H；X280S+X320A；X280S+X323N；X280S+X391A；X284H+X320A；X284H+X323N；X284H+X391A；X320A+X323N；X320A+X391A；和X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个实施例中，该变体包含选自下组的修饰，该组由以下组成：X1*+X7A+X109A；X1*+X7A+X280S；X1*+X7A+X284H；X1*+X7A+X320A；X1*+X7A+X323N；X1*+X7A+X391A；X1*+X109A+X280S；X1*+X109A+X284H；X1*+X109A+X320A；X1*+X109A+X323N；X1*+X109A+X391A；X1*+X280S+X284H；X1*+X280S+X320A；X1*+X280S+X323N；X1*+X280S+X391A；X1*+X284H+X320A；X1*+X284H+X323N；X1*+X284H+X391A；X1*+X320A+X323N；X1*+X320A+X391A；X1*+X323N+X391A；X1A+X7A+X109A；X1A+X7A+X280S；X1A+X7A+X284H；X1A+X7A+X320A；X1A+X7A+X323N；X1A+X7A+X391A；X1A+X109A+X280S；X1A+X109A+X284H；X1A+X109A+X320A；X1A+X109A+X323N；X1A+X109A+X391A；X1A+X280S+X284H；X1A+X280S+X320A；X1A+X280S+X323N；X1A+X280S+X391A；X1A+X284H+X320A；X1A+X284H+X323N；X1A+X284H+X391A；X1A+X320A+X323N；X1A+X320A+X391A；X1A+X323N+X391A；X7A+X109A+X280S；X7A+X109A+X284H；X7A+X109A+X320A；X7A+X109A+X323N；X7A+X109A+X391A；X7A+X280S+X284H；X7A+X280S+X320A；X7A+X280S+X323N；X7A+X280S+X391A；X7A+X284H+X320A；X7A+X284H+X323N；X7A+X284H+X391A；X7A+X320A+X323N；X7A+X320A+X391A；X7A+X323N+X391A；X109A+X280S+X284H；X109A+X280S+X320A；X109A+X280S+X323N；X109A+X280S+X391A；X109A+X284H+X320A；X109A+X284H+X323N；X109A+X284H+X391A；X109A+X320A+X323N；X109A+X320A+X391A；X109A+X323N+X391A；X280S+X284H+X320A；X280S+X284H+X323N；X280S+X284H+X391A；X280S+X320A+X323N；X280S+X320A+X391A；X280S+X323N+X391A；X284H+X320A+X323N；X284H+X320A+X391A；X284H+X323N+X391A；和X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
在一个优选的实施例中，该变体在对应于选自下组的位置的位置中包含修饰，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的淀粉酶中的任一个具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID NO:1中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID NO:2中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
在一个优选的实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G7K+G109A+N280S+E391A；H1*+G7E+G109A+N280S+E391A；H1*+G7N+G109A+N280S+E391A；H1*+G7Q+G109A+N280S+E391A；H1*+G7L+G109A+N280S+E391A；H1*+G7D+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+E391A；H1*+G109A+N280S+K320M+E391A；H1*+G109A+N280S+K320T+E391A；H1*+G109A+N280S+K320V+E391A；H1*+G109A+N280S+M323R+E391A；H1*+G109A+N280S+K320S+E391A；H1*+G109A+N280S+E391V；H1*+G109A+W284R+E391A；H1*+G109A+W284F+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A；H1*+G109A+N280S+W284F+E391A；H1*+G109A+N280S+M323N+E391A；H1*+G109A+N280S+M323K+E391A；H1*+G109S+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+K320A+M323N+E391A；G7A+W284H+K320A+M323N；G7A+K320A+M323N；K320A；G7A+K320A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+N280S+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+M323S+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+M323S+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+W284F+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+W284R+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A；H1*+G7A+G109A+W284R+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID NO:3中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID NO:4中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:5中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID NO:5中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:6中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID NO:6中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID NO:7中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，该变体在对应于SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
X1*+X109A+X280S+X391A；X1*+X7K+X109A+X280S+X391A；X1*+X7E+X109A+X280S+X391A；X1*+X7N+X109A+X280S+X391A；X1*+X7Q+X109A+X280S+X391A；X1*+X7L+X109A+X280S+X391A；X1*+X7D+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X109A+X280S+X320M+X391A；X1*+X109A+X280S+X320T+X391A；X1*+X109A+X280S+X320V+X391A；X1*+X109A+X280S+X323R+X391A；X1*+X109A+X280S+X320S+X391A；X1*+X109A+X280S+X391V；X1*+X109A+X284R+X391A；X1*+X109A+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X109A+X280S+X323K+X391A；X1*+X109S+X280S+X391A；X1*+X109A+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X320A+X323N+X391A；X7A+X284H+X320A+X323N；X7A+X320A+X323N；X320A；X7A+X320A；X1*+X7A+X109A+X280S+X391A；X1*+X109A+X280S+X284H+X391A；X1*+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X323N+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284F+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X284R+X391A；X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323S+X391A；X1*+X7A+X109A+X284R+X391A；和X1*+X7A+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且该变体与SEQ ID NO:8中所示的淀粉酶具有至少80％的序列同一性。
优选的是根据本发明的变体在选自下组的一个、两个、三个、四个或五个位置处包含修饰：X1*、X1A、X7A、X109A、X280S和X391A。在更优选的实施例中，在一个、两个、三个、四个或五个位置处的修饰选自X1*、X7A、X109A、X280S和X391A。
在一方面，本发明涉及在对应于如下的位置中包含修饰的变体：
X1*+X109A+X280S+X391A、X1*+X109A+X284H+X391A、X1*+X109A+X280S+X320A+X323N+X391A、X1*+X7A+X109A+X280S+X391A、和X1*+X7A+X109A+X280S+X284H+X323N+X391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:1的变体，该变体在对应于如下的位置中包含修饰：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，
其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:1具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:2的变体，该变体在对应于如下的位置中包含修饰：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:2具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:3的变体，该变体在对应于如下的位置中包含修饰：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:3具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:4的变体，该变体在对应于如下的位置中包含修饰：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:4具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:5的变体，该变体在对应于如下的位置中包含修饰：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:5具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:6的变体，该变体在对应于如下的位置中包含修饰：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:6具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:7的变体，该变体在对应于如下的位置中包含修饰：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:7具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明涉及SEQ ID NO:8的变体，该变体在对应于如下的位置中包含修饰：H1*+G109A+N280S+E391A；H1*+G109A+W284H+E391A；H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；和H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+M323N+E391A，其中根据SEQ ID NO:1进行编号，且其中该变体与SEQ ID NO:8具有至少80％的序列同一性。
在一个实施例中，本发明的变体在选自下组的一个或多个位置中进一步包含修饰：140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476。在具体的实施例中，本发明的变体包含选自下组的一个或多个另外的修饰：W140Y/F、R181*、G182*、D183*、G184*、N195F/Y、I206Y/F、Y243F、E260A/D/C/Q/L/M/F/P/S/W/V/G/H/I/K/N/R/T/Y、G304R/K/E/Q和G476E/Q/R/K。在一个优选的实施例中，根据本发明的变体在选自下组的两个、三个或四个位置处进一步包含取代，该组由以下组成：G304R、W140YF、E260GHIKNPRTY和G476EQRK。在更优选的实施例中，在两个、三个或四个位置处的取代选自下组，该组由以下组成：G304R、W140Y、E260G和G476K。
在一个实例中，本发明的变体包括对应于如下的修饰
H1*+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+N280S+G304R+E391A+G476K、
H1*+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+W284H+G304R+E391A+G476K、
H1*+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+N280S+G304R+K320A+M323N+E391A+G476K、
H1*+G7A+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+N280S+G304R+E391A+G476K、和
H1*+G7A+G109A+W140Y+D183*+G184*+N195F+I206Y+Y243F+E260G+N280S+W284H+G304R+M323N+E391A+G476K，
其中根据SEQ ID NO:1进行编号，该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8具有至少80％的序列同一性，且为SEQ ID NO:1的变体。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定亲本中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得的突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。α-淀粉酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBSLett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与和亲本相关的多肽的同一性分析推断必需氨基酸的身份。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体中的任一种的分离的多核苷酸。因此，本发明涉及编码如下变体的分离的多核苷酸，该变体在对应于以下位置的一个或多个位置处包含修饰：SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中包含修饰，其中该变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少85％、至少90％，如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，且其中该变体具有α-淀粉酶活性。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个(若干个)控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。因此，本发明涉及核酸构建体，该核酸构建体包含编码如下变体的多核苷酸，该变体在对应于如下位置的一个或多个位置处包含修饰：SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391，以及任选地在对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中包含修饰，其中该多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，该控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与控制序列相容的条件下的表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供一种变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是一个启动子序列，即由一个宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的一种序列。启动子序列包含介导变体表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何核酸序列，包括突变体、截短的及杂合启动子，并且可以是从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下各项中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、大肠杆菌lac操纵子、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)、以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。另外的启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94中的“Useful proteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989，见上文中。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中的转录的合适启动子的实例是从以下各项的基因获得的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢Daria(Fusariumvenenatum Daria)(WO 00/56900)、镶片镰孢Quinn(Fusarium venenatumQuinn)(WO 00/56900)、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(修饰的启动子，其包括编码曲霉中的中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列已被来自编码曲霉中的丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列替代；非限制性实例包括修饰的启动子，其包括编码黑曲霉中的中性α-淀粉酶的基因，其中未翻译的前导序列已被来自编码构巢曲霉或米曲霉中的丙糖磷酸异构酶的基因的未翻译的前导序列替代)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。
在酵母宿主中，从以下酶的基因获得有用的启动子：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。Romanos等人,1992,Yeast[酵母]8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用的启动子。
控制序列也可以是被宿主细胞识别以终止转录的合适转录终止子序列。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的优选的终止子从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其他有用的终止子由Romanos等人,1992，见上文描述。
调控序列还可以是合适的前导序列，其为对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导子序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何前导序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下酶的基因获得：酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α因子、和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含信号肽编码区，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码该变体的编码区的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可包含对编码序列而言为外来的信号肽编码区。当编码序列天然地不包含信号肽编码区时，外源信号肽编码区可能是需要的。可替代地，外源信号肽编码区可简单地替换天然信号肽编码区以增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)、和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。进一步的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。
从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他有用的信号肽编码序列由Romanos等人,1992，见上文描述。
该控制序列还可以是编码位于变体的N-末端处的前肽的前肽编码区。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码区可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(Myceliophthora thermophila laccase)(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶(Rhizomucor miehei aspartic proteinase)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)α-因子。
在变体的N-末端处信号肽区和前肽区都存在的情况下，前肽区被定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽区被定位成紧邻前肽区的N-末端。
也可能令人希望的是添加调控序列，该调控序列允许相对于宿主细胞的生长而调节变体的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，本发明涉及包含编码如下变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组载体，该变体在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处包含修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中包含修饰。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包含一个或多个(若干个)合宜的限制性位点以允许在这样的位点插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选包含一个或多个(若干个)允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标记的实例是来自地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，载体可以包含另外的核苷酸序列，用于通过同源重组指导在一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处整合入宿主细胞的基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制因子”意指使得质粒或载体能够在体内复制的核苷酸序列。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)以获得基本上纯的变体。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个(若干个)控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。因此，本发明涉及重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含编码如下变体的多核苷酸，该变体在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处包含修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中包含修饰，其中该多核苷酸与指导如下变体的产生的一个或多个控制序列可操作地连接，该变体在对应于SEQ IDNO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处包含修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中包含修饰。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
例如，可以通过如下方法实现将DNA引入芽孢杆菌属细胞中：原生质体转化(参见例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、使用感受态细胞(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或接合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。例如通过原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)可以实现将DNA引入到大肠杆菌细胞中。例如可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见，例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见，例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。例如通过电穿孔(参见，例如Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或通过接合(参见，例如Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)可以实现将DNA引入到假单胞菌属细胞中。例如，将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-2070)、电穿孔(参见例如，Buckley等人,1999,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或接合(参见例如，Clewell,1981,Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域中已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
该宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
真菌细胞可以通过以下过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和Yelton等人,1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474中描述。用于转化镰孢属物种的适合方法在Malardier等人,1989,Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787中描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编辑,Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology[酵母遗传学与分子生物学指南],Methods in Enzymology[酶学方法],第194卷,第182-187页,Academic Press,Inc.[学术出版社有限公司],纽约；Ito等人,1983,J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。因此，本发明涉及产生变体的方法，该方法包括(a)在适于表达该变体的条件下培养包含表达载体或编码如下变体的多核苷酸的宿主细胞，该变体在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处包含修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中包含修饰；以及(b)回收该变体。
在一方面，本发明涉及获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括向亲本α-淀粉酶在对应于选自下组的位置的一个或多个位置处的修饰，该组由以下组成：SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的109、7、1、391、280、284、320和323，以及任选地在对应于选自下组的位置的一个或多个位置中的修饰，该组由以下组成：SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476，其中各修饰独立地为取代或缺失，且该变体具有α-淀粉酶活性；以及回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在一种适合的培养基中并在允许该多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养该细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
可以使用本领域已知的对这些变体特异的方法检测这些变体。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。
可以通过本领域已知的方法回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收该变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，J.-C.Janson和Lars Ryden编,纽约VCH出版社(VCH Publishers),1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
组合物
本发明还涉及包含本发明的变体的组合物。因此，本发明涉及包含如下变体的组合物，该变体在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处包含修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中包含修饰。优选地，这些组合物富含这样一种变体。术语“富含”意指组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，富集因子为1.1。
该组合物可以包含变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。一种或多种另外的酶可以通过例如属于以下属的微生物产生：芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌；或曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，例如杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，例如特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，例如哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉；或本文所述的任何其他宿主细胞。
可以根据本领域已知的方法来制备组合物，并且这些组合物可以处于液体或干组合物的形式。例如，组合物可以呈颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将变体稳定化。
根据本发明，上述α-淀粉酶变体可典型地为清洁组合物(如洗涤剂组合物，例如衣物洗涤剂组合物或餐具洗涤洗涤剂组合物)中的组分。特别优选的是液体衣物洗涤剂组合物。
此类清洁组合物包含清洁/洗涤剂辅助剂，优选地是组分的混合物。典型地，清洁辅助剂将以0.001wt％至99.9wt％，更典型地0.01wt％至80wt％的清洁辅助剂的量存在于组合物中。
在另一个优选的方面，组合物包含一种或多种表面活性剂，该一种或多种表面活性剂可为非离子的(包括半极性)和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的和/或两性的和/或半极性非离子的表面活性剂，和/或其混合物。表面活性剂典型地以组合物的按重量计0.1％至60％或0.5wt％至50wt％或1wt％至40wt％的水平存在。
用途
本发明还涉及用于使用α-淀粉酶变体的方法。本发明的α-淀粉酶变体可用于洗涤剂组合物、衣物洗涤、餐具洗涤和/或低温清洁过程。
使用方法
本发明还涉及用于清洁和/或处理部位(尤其是表面)或织物的方法。在一方面，披露了这样一种方法，该方法包括任选地洗涤和/或冲洗所述表面或织物，使所述表面或织物与本说明书中披露的任何消费品接触，然后任选地洗涤和/或冲洗所述表面或织物的步骤。
如本文使用的，洗涤包括但不限于擦洗和机械搅拌。对此类表面或织物进行干燥可以通过在家庭或工业环境中采用的通用手段中的任一种来完成。在存在或不存在电磁辐射(包括日光、红外线、紫外线和微波照射)的情况下，此类手段包括但不限于在环境温度或升高的温度下在5与0.01大气压之间的压力下的鼓风干燥或静止空气干燥。在一方面，所述干燥可通过采用熨斗在高于环境的温度完成，其中，例如，所述织物可与所述熨斗直接接触相对短的或甚至延长的时间段，并且其中可施加超过由于重力另外通常存在的压力。在另一方面，所述干燥可以通过采用干燥器在高于环境的温度完成。用于干燥织物的设备是已知的，并且通常被称为干衣机。除了衣物之外，此类家用电器还用于干燥许多其他物品，这些物品包括毛巾、床单、枕套、尿布等，并且此类设备已经在世界上许多国家中被接受为标准便利，基本上取代了用于织物干燥的晾衣绳的使用。今天使用的大多数干燥器使用加热的空气，随着织物在干燥器内翻滚，加热的空气经过和/或穿过织物。例如，空气可通过电子方式、经由气体火焰、或甚至用微波照射加热。这样的空气可以从约15℃加热到约400℃、从约25℃加热到约200℃、从约35℃加热到约100℃、或甚至从约40℃加热到约85℃，并用于干燥器中以干燥表面和/或织物。如本领域技术人员会理解的，本发明的清洁组合物理想地适用于衣物洗涤应用。因此，本发明包括用于洗涤织物的方法。该方法包括使待洗涤的织物与所述清洁衣物洗涤溶液接触，该清洁衣物洗涤溶液包含申请人的清洁组合物、清洁添加剂或其混合物的至少一种实施例。织物可以包括能够在常规消费者或公共机构使用条件下被洗涤的大多数任何织物。该溶液优选具有从约8至约10.5的pH。可以在溶液中以从约500ppm至约15,000ppm的浓度使用组合物。水温范围典型地是从约5℃至约90℃。水与织物比率典型地是从约1:1至约30:1。
下面是例示的洗涤剂组合物。
表1：设计用于手洗或顶装式衣物洗涤机的粒状衣物洗涤剂组合物的实例。每种粒状衣物洗涤剂组合物编号为1至6，以区分不同的组合物。
*本方面的淀粉酶显示为每100g洗涤剂中活性酶的mg数。
表2：设计用于前装式自动衣物洗涤机的颗粒衣物洗涤剂组合物的其他实例(下表2中编号7至12)。
*本方面的淀粉酶显示为每100g洗涤剂中活性酶的mg数。
表3：重垢液体衣物洗涤剂组合物的实例(编号13至18)
1随机接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，该聚环氧乙烷共聚物具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是约40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。
2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化物基团。
3两亲性烷氧基化的油脂清洁聚合物是聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有24个乙氧基化物基团且每个-NH具有16个丙氧基化物基团
*本方面的淀粉酶显示为每100g洗涤剂中活性酶的mg数。
表4：重垢液体衣物洗涤剂组合物的实例(编号19至21)
*本方面的淀粉酶显示为每100g洗涤剂中活性酶的mg数。
**基于总清洁和/或处理组合物重量，总共不多于7％的水。
用于组合物实例1-21的原材料和注释
直链烷基苯磺酸盐，具有平均脂族碳链长度C11-C18
C12-18二甲基羟乙基氯化铵
AE3S是C12-15烷基乙氧基(3)硫酸盐
AE7是C12-15醇乙氧基化物，平均乙氧基化度为7
AE9是C12-16醇乙氧基化物，平均乙氧基化度为9
HSAS是中链支化的(mid-branched)伯烷基硫酸盐，其碳链长度为约16-17，如US6,020,303和US 6,060,443中所披露的
聚丙烯酸酯MW 4500由BASF提供
羧甲基纤维素是由斯比凯可公司(CP Kelco，阿纳姆，荷兰)提供的V
CHEC是阳离子改性的羟乙基纤维素聚合物。
膦酸盐螯合剂是例如二乙烯四胺五乙酸(DTPA)羟基乙烷二膦酸盐(HEDP)
CellucleanTM、和均为诺维信公司(Novozymes，鲍斯韦，丹麦)的产品。
Purafect是杰能科国际公司(Genencor International，帕洛阿尔托，加利福尼亚州，美国)的产品。
荧光增亮剂1是AMS，荧光增亮剂2是CBS-X，直接紫9是Violet BN-Z，NOBS是壬酰氧基苯磺酸钠
TAED是四乙酰乙二胺
S-ACMC是与C.I.缀合的羧甲基纤维素反应蓝(Reactive Blue)19产品名称AZO-CM-CELLULOSE
污物释放剂是PF
丙烯酸/马来酸共聚物的分子量为70,000，且丙烯酸酯:马来酸盐的比例为70:30
EDDS是(S,S)-乙二胺-N，N’-二琥珀酸钠盐。泡沫抑制剂聚结物由道康宁公司(DowCorning，米德兰，密歇根州，美国)提供。
HSAS是中链支化的烷基硫酸盐
Violet CT由美国南卡罗来纳州斯帕坦堡的美利肯公司(Milliken)提供
1随机接枝共聚物是聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，该聚环氧乙烷共聚物具有聚环氧乙烷主链和多个聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量为约6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是约40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。
2聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化物基团。
3两亲性烷氧基化的聚合物是聚乙烯亚胺(MW 600)，其由如下聚合物制备，该聚合物衍生化为每-NH具有24个乙氧基化物基团和每-NH具有16个丙氧基化物基团。
淀粉酶4是本文a)至k)中的任一种(mg活性蛋白)。
表5：单位剂量衣物洗涤剂组合物的实例(编号22至26)。此类单位剂量配制品可包含一个或多个隔室。
*本方面的淀粉酶显示为每100g洗涤剂中活性酶的mg数。
1聚乙烯亚胺(MW＝600)，每个-NH具有20个乙氧基化物基团。
表6：多隔室单位剂量组合物的实例(编号27)。下面提供了本发明的多隔室单位剂量衣物洗涤剂配制品。在这些实例中，单位剂量具有三个隔室，但是可以制造具有两个、四个或五个隔室的类似组合物。用于包封隔室的薄膜是聚乙烯醇。
表7：多隔室配制品(编号为组合物1或2并具有隔室名称[A、B或C])。
*本方面的淀粉酶显示为每100g洗涤剂中活性酶的mg数。
本文披露的尺寸和值不应理解为严格限于所记载的精确数值。相反，除非另有说明，否则每个这样的尺寸旨在意指所记载的值和围绕该值的功能等同的范围两者。例如，披露为“40mm”的尺寸旨在意指“约40mm”。
实例
用于确定α-淀粉酶活性的pNP-G7测定
可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽七糖苷的缩写的G7-pNP是可以被内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解的底物以释放游离PNP分子，该分子具有黄颜色并且因而可以通过可见分光光度法在λ＝405nm(400nm至420nm)测量。包含G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由Roche/Hitachi制造(目录号11876473)。
试剂：
来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0。
α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、>4kU/L的α-葡糖苷酶。
通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-pNP底物混合，制成底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。
稀释缓冲液：50mM MOPS，0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))，1mM CaCl2，pH 8.0。
程序：
将待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释酶样品转移至96孔微量滴定板并且添加80μl底物工作溶液来进行测定。将溶液混合并且在室温预孵化1分钟并且在OD 405nm在5分钟内每20秒测量吸收。
在给定的一组条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至其中斜率为0.4吸光度单位/分钟以下的水平。
用于衣物洗涤的自动机械应力测定(AMSA)
为了评估在衣物洗涤中的洗涤性能，使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA，可以检査大量小体积的酶-洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的槽和盖子，盖子针对所有槽开口强力挤压衣物洗涤样品(待洗涤的纺织品)。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈摇动以使测试溶液与纺织品接触并以规则的、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“Special method embodiments”[特殊方法实施例]段落。
洗涤性能总体描述
制备测试溶液，该测试溶液包含水(10°dH)、洗涤剂(例如，如下文描述的5.1g/L欧洲液体洗涤剂)和例如处于浓度0、0.8和/或1.2mg酶蛋白/L的本发明的酶。添加用淀粉污染的织物(例如，来自测试材料BV中心(邮政信箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)的CS-28)并在20℃洗涤20分钟。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量污染的织物的光强度值或反射率值作为洗涤性能的量度。将具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白以获得δ反射值。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。
AMSA洗涤性能实验在以下详明的实验条件下进行：
表8：AMSA实验条件
淀粉酶稀释缓冲液：将淀粉酶稀释于超纯水(MilliQ水)中，该超纯水具有低浓度钙(0.1mM)(以使淀粉酶在储存期间稳定)和0.01％Triton X-100(以降低酶蛋白吸附于容器和移液器的风险)。
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3 -＝3:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至10°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。
将洗涤性能测量为所洗涤纺织品颜色的亮度。也可以将亮度表示为当用白光照射样品时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用来衡量洗涤性能。
颜色测量使用专业平台式扫描仪(Kodak iQsmart,Kodak,Midtager 29,DK-2605Denmark)来进行，该扫描仪用于获取经洗涤的纺织品的图像。
为了从扫描的图像中提取光强度的值，将来自图像的24-位像素值转化为红色、绿色以及蓝色(RGB)的值。通过将RGB值作为向量进行加和并且然后取所得向量的长度来计算强度值(Int)：
不同变体的AMSA衣物洗涤测试的结果在表1和2中显示。在结果中，指标是100。亲本α-淀粉酶的性能结果分配的值为100，并将变体的结果与此值进行比较。
TOM洗涤性能
通过添加CaCl2、MgCl2和NAHCO3将水硬度调节至下述强度。如下所述，在桶中制备具有所希望的量的洗涤剂、温度和水硬度的洗涤溶液。在磁力搅拌过程中将洗涤剂溶解10分钟(洗涤溶液在制备后30分钟至60分钟内使用)。
在Terg-O-toMeter中，根据表2中的下述设置来设定水浴中的温度和转速(rpm)。当根据设置(公差是+/-0.5℃)调节温度时，将洗涤溶液根据下文描述的量添加至TOM烧杯。
在烧杯中以200rpm进行搅拌。将2个手工制作大米淀粉布样(HMCS-28)、2个手工制作木薯淀粉布样(HM CS-29)和压载物添加至每个烧杯中并且根据下文所述的时间进行洗涤。将布样在冷自来水中漂洗5分钟并置于洗涤包中且在洗衣机(AEGLAVAMAT86820)中以“STIVN”程序漂洗。将布样在干燥橱中的滤纸之间分选并干燥，而不加热过夜。
纺织品样品HM CS-28(棉花上的大米淀粉，5x 5cm，淀粉施加于直径为2.5cm的圆圈中)和HM CS-29(棉花上的木薯淀粉，5x5cm，淀粉施加于直径为2.5cm的圆圈中)获得自测试材料BV中心，邮政信箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰。
将白色针织棉用作压载物并从沃里克伊奎斯特公司(Warwick Equest Ltd)(55单元，康塞特商业园(Consett Business Park)，康塞特，达勒姆郡，DH8 6BN，英国)获得。
表9：实验条件
洗涤剂和测验材料如下：
将洗涤性能测量为所洗涤的纺织品的颜色的亮度，以反射值(REM)表示。使用Macbeth 7000Color Eye分光光度计进行反射测量。测量每个干燥的布样。由于存在来自背景的干扰风险，在测量反射期间将布样置于2层织物的顶部。在460nm处测量反射。不包括UV滤光片。计算布样的反射的平均结果。
不同变体的洗涤性能作为改进因子(IF)显示于表5中并如下所示计算：
IF＝REM变体 –REM 空白
REM参考酶–REM空白
实例1
使用自动机械应力测定的α-淀粉酶的洗涤性能
为了评定α-淀粉酶在洗涤剂基础组合物中的洗涤性能，可以使用自动机械应力测定(AMSA)进行洗涤实验。使用AMSA测试，可以检查大量小体积酶洗涤剂溶液的洗涤性能。AMSA板具有许多用于测试溶液的缝和盖子，盖子将待洗涤的纺织品小块布样对所有缝开口强力挤压。在洗涤时间期间，板、测试溶液、纺织品和盖子剧烈摇动以使测试溶液与纺织品接触并以规则的、周期性摆动方式施加机械应力。关于进一步描述，参见WO 02/42740，尤其是第23-24页的“具体方法实施例”段落。
洗涤性能总体描述
制备测试溶液，该测试溶液包含水(6°dH或15°dH)、0.79g/L洗涤剂(例如，如下文描述的模式洗涤剂J)和处于浓度0或0.2mg酶蛋白/L的本发明的酶。添加用淀粉污染的织物(来自测试材料中心BV的CS-28，邮箱120，3133KT，弗拉尔丁恩，荷兰)并且将它们在20℃和40℃洗涤10分钟，或可替代地在20℃和30℃洗涤10分钟，如在实例中详细说明的那样。在流动自来水下彻底漂洗并且在黑暗中干燥之后，随后测量带有污渍的织物的光强度值作为洗涤性能的量度。具有0mg酶蛋白/L的测试用作空白并且对应于来自洗涤剂的贡献。优选地，在洗涤步骤期间施加机械作用，例如以将洗涤溶液与织物一起振摇、转动或搅拌的形式施加。AMSA洗涤性能实验可以在以下详细说明的实验条件下实施：
表A：实验条件
表B：模式洗涤剂J
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝2:1:4.5)添加至测试系统中将水硬度调节至6°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。
表C：实验条件
洗涤剂 液体模式洗涤剂A(参见表D)
洗涤剂剂量 3.33g/L
测试溶液体积 160微升
pH 按原样
洗涤时间 10分钟
温度 20℃或40℃
水硬度 15°dH
测试中的酶浓度 0.2mg酶蛋白/L，0.05mg酶蛋白/L
测试材料 CS-28(大米淀粉棉花)
表D：模式洗涤剂A
通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中，将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来
水沖洗并干燥。
表E：实验条件
表F：洗涤剂K(如下表11中所述)
通过将CaCl2、MgCl2、和NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)添加至测试系统中，将水硬度调节至15°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来
水沖洗并干燥。
洗涤性能可以被测量为亮度，表达为当用白光照亮时从样品反射的光的强度。当样品受到污染时，反射光的强度低于干净样品的反射光的强度。因此，反射光的强度可以用来衡量洗涤性能。
使用专业平板扫描仪(EPSON Expression 10000XL,EPSON)进行颜色测量，该扫描仪用于捕获所洗涤纺织品的图像。
为了从扫描图像中提取光强度的值，将来自图像的48→24位彩色像素值转化为红色、绿色和蓝色(RGB)的值。通过将RGB值作为向量进行加和并且然后取所得向量的长度来计算强度值(Int)：
根据本发明的变体的洗涤性能在下表中显示。表3显示从评估在不同浓度(0.05mg酶/L洗涤剂和0.2mg酶/L洗涤剂)和在不同温度(20℃和40℃)在模式洗涤剂A(表D)和J(表B)中的洗涤性能的实验获得的结果。表4显示从评估在不同浓度(0.05mg酶/L洗涤剂和0.2mg酶/L洗涤剂)和在不同温度(20℃和40℃)在洗涤剂K(表F)中的洗涤性能的实验获得的结果。
实例2-α-淀粉酶在液体洗涤剂K中在TOM中的洗涤性能
测试的变体和对应的亲本α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)的洗涤性能如上所述对于TOM规模洗涤被测试。使用的洗涤剂为洗涤剂K。结果作为(变体的性能减去空白的性能)除以(亲本的性能减去空白的性能)给出。
表12：TOM规模中的洗涤性能
表13：TOM规模中的洗涤性能
表14：全规模洗涤机器测试中的洗涤性能
本文描述和要求保护的本发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> α-淀粉酶变体
<130> 14045-WO-PCT
<160> 8
<170> PatentIn 版本3.5
<210> 1
<211> 485
<212> PRT
<213> 盐敏芽孢杆菌（Bacillus halmapalus）
<400> 1
His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His
1 5 10 15
Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
20 25 30
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65 70 75 80
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Ala Thr Glu Asn Val Leu Ala Val Glu Val Asn Pro Asn Asn Arg Asn
115 120 125
Gln Glu Ile Ser Gly Asp Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp
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Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Tyr
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His Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Phe Gln Asn Arg
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Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Asp Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp
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Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Val Asp Met
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Asp His Pro Glu Val Val Asn Glu Leu Arg Arg Trp Gly Glu Trp Tyr
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Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His
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Ile Lys Tyr Ser Phe Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Ala
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Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val
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His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro
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Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala
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Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr
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Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Ser Val Pro Ala Met Lys Ala
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Lys Ile Asp Pro Ile Leu Glu Ala Arg Gln Asn Phe Ala Tyr Gly Thr
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Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asn Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu
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Gly Pro Gly Gly Glu Lys Trp Met Tyr Val Gly Gln Asn Lys Ala Gly
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Gln Val Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Lys Pro Gly Thr Val Thr Ile
450 455 460
Asn Ala Asp Gly Trp Ala Asn Phe Ser Val Asn Gly Gly Ser Val Ser
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Ile Trp Val Lys Arg
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<212> PRT
<213> 盐敏芽孢杆菌
<400> 2
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Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ser
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Asn Leu Arg Asn Arg Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Trp
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<213> 芽孢杆菌属物种
<400> 3
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Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser
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<211> 485
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属物种
<400> 4
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Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Asn Ser Asp Ala Ser
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<211> 485
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<213> 芽孢杆菌属物种
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<213> 芽孢杆菌属物种
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225 230 235 240
Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met
245 250 255
Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn
260 265 270
Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu
275 280 285
His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met
290 295 300
Arg Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu
325 330 335
Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu
340 345 350
Thr Arg Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly
355 360 365
Thr Lys Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile
370 375 380
Glu Pro Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp
405 410 415
Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
420 425 430
Gly Gly Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr
435 440 445
Trp His Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser
450 455 460
Glu Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr
465 470 475 480
Val Gln Arg
<210> 8
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp
1 5 10 15
Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp
20 25 30
Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser
35 40 45
Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu
50 55 60
Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu
65 70 75 80
Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr
85 90 95
Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp
100 105 110
Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser
115 120 125
Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Arg
130 135 140
Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly
145 150 155 160
Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln
165 170 175
Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp
180 185 190
Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala
195 200 205
Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp
210 215 220
Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg
225 230 235 240
Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr
245 250 255
Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu
260 265 270
Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr
275 280 285
Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys
290 295 300
Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr
305 310 315 320
Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr
325 330 335
Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg
340 345 350
Glu Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys
355 360 365
Gly Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro
370 375 380
Ile Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr
385 390 395 400
Phe Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser
405 410 415
Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly
420 425 430
Ala Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His
435 440 445
Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly
450 455 460
Trp Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln
465 470 475 480
Arg

Claims (21)

1.一种亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体包含
(i)在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处的修饰，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中的修饰，
(ii)所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且
(iii)所述变体具有α-淀粉酶活性。
2.根据权利要求1所述的变体，其中该修饰是缺失或取代。
3.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的至少一个位置中包含修饰。
4.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、140、181、182、183、184、195、206、243、260、280、284、304、320、323、391和476的至少一个位置中包含修饰。
5.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述一个或多个修饰是取代。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的变体，其中所述一个或多个修饰中的至少一个是缺失。
7.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体包含选自下组的至少两个位置中的修饰，该组由以下组成：1、109和391。
8.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述一个或多个修饰选自下组，该组由以下组成：X1*、X1A、X7A、X7K、X7E、X7N、X7Q、X7L、X7D、X109A、X109S、X140Y、X181*、X182*、X183*、X184*、X195F、X206Y、X243F、X260G、X280S、X284H、X284R、X284F、X304R、X320A、X320M、X320T、X320V、X320S、X323N、X323R、X323S、X323K、X391A、X391V和X476K。
9.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体具有改进的性能，如改进的洗涤性能。
10.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体与该亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列同一性。
11.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中修饰的数目为1至30，例如1至20，例如1至10和1至5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。
12.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在选自下组位置的位置中包含修饰，该组由以下组成：X1+X7；X1+X109；X1+X280；X1+X284；X1+X320；X1+X323；X1+X391；X109+X280；X109+X284；X109+X320；X109+X323；X109+X391；X7+X109；X7+X280；X7+X284；X7+X320；X7+X323；X7+X391；X280+X284；X280+X320；X280+X323；X280+X391；X284+X320；X284+X323；X284+X391；X320+X323；X320+X391；和X323+X391，其中根据SEQ ID NO:1进行编号。
13.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体在对应于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修饰，这些修饰选自下组，该组由以下组成：
H1*+G109A+N280S+E391A；
H1*+G7K+G109A+N280S+E391A；
H1*+G7E+G109A+N280S+E391A；
H1*+G7N+G109A+N280S+E391A；
H1*+G7Q+G109A+N280S+E391A；
H1*+G7L+G109A+N280S+E391A；
H1*+G7D+G109A+N280S+E391A；
H1*+G109A+N280S+K320A+E391A；
H1*+G109A+N280S+K320M+E391A；
H1*+G109A+N280S+K320T+E391A；
H1*+G109A+N280S+K320V+E391A；
H1*+G109A+N280S+M323R+E391A；
H1*+G109A+N280S+K320S+E391A；
H1*+G109A+N280S+E391V；
H1*+G109A+W284R+E391A；
H1*+G109A+W284F+E391A；
H1*+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A；
H1*+G109A+N280S+W284F+E391A；
H1*+G109A+N280S+M323N+E391A；
H1*+G109A+N280S+M323K+E391A；
H1*+G109S+N280S+E391A；
H1*+G109A+W284H+E391A；
H1*+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A；
H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；
H1*+G7A+G109A+N280S+W284H+K320A+M323N+E391A；
G7A+W284H+K320A+M323N；
G7A+K320A+M323N；
K320A；
G7A+K320A；
H1*+G7A+G109A+N280S+E391A；
H1*+G109A+N280S+W284H+E391A；
H1*+G109A+N280S+M323S+E391A；
H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+E391A；
H1*+G7A+G109A+N280S+M323S+E391A；
H1*+G7A+G109A+N280S+M323N+E391A；
H1*+G7A+G109A+N280S+W284F+E391A；
H1*+G7A+G109A+N280S+W284R+E391A；
H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323S+E391A；
H1*+G7A+G109A+W284R+E391A；和
H1*+G7A+G109A+N280S+K320A+M323N+E391A。
14.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本α-淀粉酶选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7和8中所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1和2中所示的氨基酸序列中的任一项具有至少90％，如至少92％、如至少95％、如至少97％、如至少98％、如至少99％或100％的序列同一性的任何α-淀粉酶。
15.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本α-淀粉酶包含SEQ ID NO:1和2中所示的氨基酸序列或由其组成。
16.一种多核苷酸，该多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项所述的变体。
17.一种核酸构建体，该核酸构建体包含根据权利要求16所述的多核苷酸。
18.一种表达载体，该表达载体包含根据权利要求16所述的多核苷酸。
19.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求16所述的多核苷酸。
20.一种产生α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：
a.在适合于表达所述变体的条件下培养根据权利要求19所述的宿主细胞；和
b.回收所述变体。
21.一种用于获得α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一个或多个位置处，以及任选地在对应于SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一个或多个位置中向亲本α-淀粉酶引入修饰，其中各修饰独立地为取代或缺失，且所述变体具有α-淀粉酶活性；以及回收所述变体。
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