TWI391489B - 處理纖維素材料之方法及用於彼之酶類 - Google Patents

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Description

處理纖維素材料之万法及用於彼之酶類
本發明關於自纖維素材料產製糖水解物。更精確地說，本發明關於自木質纖維素材料利用酵素轉換產製可醱酵糖。可醱酵糖可用於例如生產生質乙醇或其他用途。本發明特別針對以纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)、內切葡聚糖酶(endoglucanase)、β －葡萄糖苷酶(beta－glucosidase)及選擇性之木聚醣酶(Xylanase)處理纖維素材料之方法，並針對酶製劑及其用途。本發明進一步針對新穎之溶纖性多肽、編碼多肽之聚核苷酸，並針對包含該聚核苷酸之載體及宿主細胞。本發明更進一步針對該多肽之用途並針對製備該多肽之方法。
糖水解物可用於供微生物生產許多精細化學品或生物聚合物，諸如有機酸(例如乳酸)或乙醇或其他醇類(例如正丁醇、1,3－丙二醇或聚羥基烷酸酯(PHAs))。糖水解物亦可作為其他例如用於富集、分離及純化高價值糖類之非微生物方法或許多聚合方法之原料。糖水解物的主要用途之一係生產生質燃料。生質乙醇及/或其他化學品之生產可能發生於生物精煉之整合万法中(Wyman 2001)。
由於石化燃料之資源有限及來自石化燃料所釋放之二氧化碳量增加並導致溫室現象，這些因素已經導致使用生質能作為可再生且乾淨之能源來源之需求。自纖維素材料生產生物燃料如乙醇係一可行之替代技術。生物燃料是目前運輸業之唯一選擇，其可減少10倍之二氧化碳排放量。乙醇可用於現行之交通工具及配送系統，因此毋須昂貴之基礎設施投資。源自木質纖維素再生性原料之糖類亦可作為許多可取代石化產品之化學產品之原料。
植物中大部分之碳水化合物係以木質纖維素之形式存在，木質纖維素實質上由纖維素(cellulose)、半纖維素(hemicellulose)、果膠(pectin)及木質素(lignin)組成。在木質纖維素轉換成乙醇之過程中，木質纖維素材料首先經化學或物理前處理，以使纖維素成分更容易水解。接著纖維素成分被水解以得到可經酵母菌醱酵成為乙醇之糖類。木質素係得到之主要副產品，其可作為固體燃料。
生質乙醇之生產成本高且其能源輸出低，因此要讓該方法更經濟之研究仍在持續進行中。酵素水解被認為是將纖維素生物質轉換成可醱酵糖類中最可行之技術。然而，酵素水解在工業生產中僅有限地被利用，且特別是當利用高度木質化材料如木材或農業廢棄物時該項技術不令人滿意。酵素步驟之成本係該法之主要經濟因素之一。目前已經作出許多努力以改善纖維素材料酵素水解之效率(Badger 2002)。
US2002/0192774A1描述用於轉換固體木質纖維素生物質成為可燃燒之燃料產物之連續方法。經濕氧化或蒸氣爆炸之前處理後，該生物質被部份分離成為纖維素、半纖維素及木質素，然後利用一或多種碳水化合酶酵素(EC3.2)進行部份水解。具有纖維素酶及木聚醣酶活性之Novo Nordisk A/S公司之商品CelluclastTM 被提供以作為示範例。
US2004/0005674A1描述可直接作用在木質纖維素受質(substrate)上之新穎酵素混合物,以避免前處理過程中形成之毒性廢棄物並節省能源。該加成性酵素混合物包含纖維素酶及輔助酵素如纖維素酶、木聚醣酶、木質素酶、澱粉酶、蛋白酶、脂肪酶或葡萄糖醛酸酶或其任何組合物。考慮之纖維素酶包含內切葡聚糖酶(EG)、β －葡萄糖苷酶(BG)及纖維二糖水解酶(CBH)。該實施例說明木黴木聚醣酶及纖維素酶製劑之混合物的用途。
Kurabi等人(2005)探討以新穎及商品化之真菌纖維素酶酵素水解經蒸氣爆炸及乙醇有機溶劑前處理之花旗松。他們測試二種商品化之里氏木黴(Trichoderma reesei)纖維素酶製劑及二種由木黴屬及青黴屬之突變菌株所產製之新穎製劑。木黴屬製劑相較於其他製劑顯示顯著較佳之表現。較佳表現至少有部分被認為是因顯著較高之β －葡萄糖苷酶活性，其減輕纖維二糖水解酶及內切葡聚糖酶之產物抑制。
US2004/0053373A1關於一種將纖維素轉換成葡萄糖之万法，其藉由以包含纖維素酶及經修飾之纖維二糖水解酶I(CBHI)之酵素混合物處理經前處理之木質纖維素受質。該CBHI已藉由不活化其纖維素結合結構域(CBD)加以修飾。CBHI修飾之優點為例如高受質濃度下有較佳之回收及較高之水解率。纖維素酶選自EG、CBH及BG。較佳之CBHI得自木黴菌。
US2005/0164355A1描述於至少一種介面活性劑存在時以一或多種纖維分解酵素分解木質纖維素材料之方法。其他酵素諸如半纖維素酶、酯酶、過氧化酶、蛋白酶、漆酶(laccase)或彼等之混合物亦可以使用。介面活性劑存在相較於介面活性劑不存在時可增加木質纖維素材料之分解。纖維分解酵素可以是任何與木質纖維素分解有關之酵素包括CBH、EG及BG。
有大量文獻揭示各種纖維素酶類及半纖維素酶類。
纖維二糖水解酶類(CBHs)揭示於例如WO03/000941，其關於得自各種真菌之CBHI酶類。該案未提供酶類之生理特性，亦未提供彼等用途之任何實施態樣。Hong等人(2003b)描述產製於酵母菌之橙色嗜熱子囊菌(ThermoascUS surantiacUS)CBHI之特徵，但未描述該酶之應用。Tuohy等人(2002)描述得自埃莫森籃狀菌(Talaromyces emersonii)之3種纖維二糖水解酶。
Cel5家族之內切葡聚糖酶類(EGs fam 5)被描述於例如WO03/062409，其關於用於飼料應用之包含至少2種熱穩定性酵素之組成物。Hong等人(2003a)描述於酵母菌中產製來自橙色嗜熱子囊菌之熱穩定性β －1,4－內切葡聚醣酶，但未解釋其應用。WO01/70998關於得自籃狀菌之β －葡聚醣酶。它們亦描述得自埃莫森籃狀菌之β －葡聚醣酶，並討論食物、飼料、飲料、釀造及清潔劑應用。木質纖維素水解並未被提及。WO98/06858描述得自黑曲黴菌(AspergillUS niger)之β －1,4－內切葡聚醣酶，且討論該酶於飼料及食物上之應用。WO97/13853描述於cDNA庫中篩檢編碼酶類之DNA片段之方法。該cDNA庫為酵母菌或真菌來源，較佳者來自曲黴菌。該酶適宜地為纖維素酶。Van Petegem等人(2002)描述來自橙色嗜熱子囊菌之Cel5家族內切葡聚糖酶之三維結構。Parry等人(2002)描述來自橙色嗜熱子囊菌之Cel5家族內切葡聚糖酶之作用模式。
Cel7家族之內切葡聚糖酶類(EGs fam 7)被揭露於例如US5912157，其關於毀絲黴屬(Myceliophthora)內切葡聚糖酶及其相同物及彼等於清潔劑、紡織及紙漿上之應用。US6071735描述於鹼性條件下展現高度內切葡聚糖酶活性之纖維素酶，並討論作為清潔劑、於紙漿和造紙及紡織應用上之用途，但未提及生質乙醇。US5763254揭示分解纖維素/半纖維素且於CBD中具有保留性胺基酸殘基之酶類。
Cel45家族之內切葡聚糖酶類(EGs fam 45)被描述於例如US6001639，其關於具有內切葡聚糖酶活性且具有2個保留性胺基酸序列之酶類。於紡織、清潔劑及紙漿和造紙應用上之用途被大致討論，並提及木質纖維素材料之處理但未提供實施例。WO2004/053039係針對內切葡聚糖酶之清潔劑應用。US5958082揭露內切葡聚糖酶特別是得自太瑞斯梭孢殼黴(Thielavia terrestris)者於紡織應用上之用途。EP0495258關於包含腐質黴(Humicola)纖維素酶之清潔劑組成物。US5948672描述包含內切葡聚糖酶特別是得自腐質黴者之纖維素酶製劑及其於紡織及紙漿應用上之用途。木質纖維素水解未被提及。
小量之β －葡萄糖苷酶(BG)藉由水解由纖維二糖水解酶所產生之纖維二糖以促進生物質水解成葡萄糖。纖維二糖轉換成葡萄糖通常係主要之速率限制步驟。β －葡萄糖苷酶被揭露於例如US2005/0214920，其關於得自煙曲黴菌(AspergillUS fumigatUS)之BG。該酶已於米曲黴菌(AspergillUS oryzae)及里氏木黴中產製。該酶於分解生物質或清潔劑應用上之用途大致被討論但未舉例說明。WO02/095014描述具有纖維二糖酶活性之米曲黴菌酶。自生物質產製乙醇上之用途大致被討論但未舉例說明。WO2005/074656揭示具有源自例如橙色嗜熱子囊菌；煙曲黴菌；太瑞斯梭孢殼黴及橙色嗜熱子囊菌之促溶纖活性之多肽。WO02/26979揭示酵素處理植物物質。US6022725描述選殖及放大里氏木黴之β －葡萄糖苷酶基因，及US6103464描述用於偵測編碼絲狀真菌之β －葡萄糖苷酶之DNA的方法，但未提供應用實施例。
木聚醣酶被描述於例如FR2786784，其關於可用於例如處理動物飼料及麵包製作之熱穩定性木聚醣酶。該酶源自嗜熱性真菌，特別是嗜熱子囊菌屬。
US6117564描述具有木聚醣酶活性且得自棘孢曲黴菌(Aspergillus aculeatus)之酶類，並舉例說明該酶類於烘培上之應用。WO02/24926關於籃狀菌木聚醣酶，並提供飼料及烘培之實施例。WO01/42433揭示用於食品及飼料應用之源自埃莫森籃狀菌之熱穩定性木聚醣酶。
研究最透徹且應用最廣泛之真菌來源溶纖酶類係源自里氏木黴(紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)之無性世代)。因此大多數商業化之真菌纖維素酶亦源自里氏木黴。然而，大部分來自較不知名真菌之纖維素酶尚未被應用於具有實際重要性之方法，諸如分解纖維素材料包括木質纖維素。
對於用於分解纖維素受質(特別是木質纖維素受質)之新方法及可促進分解效率之新穎酶類及酶混合物有持續需求。亦需要可作用於高溫下之方法及酶類，如此可使用高黏稠性生物質並導致高濃度之糖及乙醇。這種方法可能可以顯著節省能源及投資成本。高溫亦可降低水解時污染之風險。本發明之目標在於符合至少部分這些需求。
 發明摘要
目前意外發現溶纖酶類且特別是得自橙色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum)或嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum)之纖維二糖水解酶對於水解纖維素材料特別有用。除了纖維二糖水解酶之外，這些真菌亦具有非常適合用於分解纖維素材料之內切葡聚糖酶、β－葡萄糖苷酶及木聚醣酶。這些酶類於廣泛溫度範圍內呈現非常有效之動力學，且雖然它們在高溫下有高度活性，但在標準水解溫度下亦非常有效。這使它們極度適合各種於慣用溫度及升高溫度下進行之纖維素受質水解方法。
本發明提供一種以纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶及β －葡萄糖苷酶處理纖維素材料之方法，其中該纖維二糖水解酶包含與SEQ ID NO：2、4、6或8或其酵素活性片段具有至少80%一致性之胺基酸序列。
本發明進一步提供一種酶製劑，其包含纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶及β －葡萄糖苷酶，其中該纖維二糖水解酶包含與SEQ ID NO：2、4、6或8或其酵素活性片段具有至少80%一致性之胺基酸序列。
本發明亦提供該酶製劑於供分解纖維素材料上之用途並同時提供該方法於自纖維素材料製備乙醇過程中之用途。
本發明亦針對一種多肽，其包含具有溶纖活性且選自下列之片段：a)包含與SEQ ID NO：4具有至少66%一致性、與SEQ ID NO：6具有79%一致性、與SEQ ID NO：12具有78%一致性、與SEQ ID NO：14具有68%一致性、與SEQ ID NO：16具有72%一致性、與SEQ ID NO：20具有68%一致性、與SEQ ID NO：22或24具有74%一致性或與SEQ ID NO：26具有78%一致性之胺基酸序列之多肽；b)包含具有溶纖活性片段之a)的變異體；及c)具有溶纖活性之a)或b)的片段。
本發明之另一個目標係一種選自下列之分離之聚核苷酸：a)SEQ ID NO：3、5、11、13、15、19、21、23或25之核苷酸序列，或編碼申請專利範圍第35項之多肽之序列；b)a)之互補股；c)包含至少20個核苷酸之a)或b)的片段；及d)因基因密碼而成為a)、b)或c)所定義之任一序列之簡併序列。
本發明另外提供一種載體(其包含作為異源性序列之該聚核苷酸)及一種包含該載體之宿主細胞。本發明亦包含具有登錄號DSM 16728、DSM 16729、DSM 17324、DSM 17323、DSM 17729、DSM 16726、DSM 16725、DSM 17325或DSM 17667之大腸桿菌(Escherichia coli)菌株。
本發明之其他目標為包含至少一種新穎多肽之酶製劑及該多肽或酶製劑於燃料、紡織、清潔劑、紙漿和造紙、食品、飼料或飲料工業上之用途。
本發明另外提供一種製備多肽之方法，該多肽包含具有溶纖活性且選自下列之片段：a)包含與SEQ ID NO：4具有至少66%一致性、與SEQ ID NO：6具有79%一致性、與SEQ ID NO：12具有78%一致性、與SEQ ID NO：14具有68%一致性、與SEQ ID NO：16具有72%一致性、與SEQ ID NO：20具有68%一致性、與SEQ ID NO：22或24具有74%一致性或與SEQ ID NO：26具有78%一致性之胺基酸序列之多肽；b)包含具有溶纖活性片段之a)的變異體；及c)具有溶纖活性之a)或b)的片段，該方法包含將編碼該多肽之載體轉殖至宿主細胞，並於可表現該多肽之條件下培養該宿主細胞，及可選擇的回收並純化所產製之多肽。
本發明進一步提供一種以至少一種可產生上述多肽之微生物的耗盡培養基處理纖維素材料之方法，其中該方法包含令纖維素材料與耗盡培養基反應以得到經水解之纖維素材料。
本發明之特定實施態樣於申請專利範圍之附屬項中提及。
本發明之其他目標、細節及優點可自下列圖式、詳細說明及實施方式中得知。
本發明之詳細說明
纖維素係高等植物之主要結構成分，其提供植物細胞高抗張強度以協助細胞抵抗機械壓力及滲透壓。纖維素係一種β －1,4－葡聚糖，其由透過β －1,4－糖苷鍵連接之葡萄糖殘基直鏈組成。纖維二糖是纖維素最小的重複單位。在細胞壁中纖維素被堆疊成不同方向之板層，其包埋於半纖維素及木質素之基質中。半纖維素係碳水化合物聚合物之異質性群組，其主要包含不同之葡聚糖、木聚糖及甘露聚糖。半纖維素由線性骨架組成，其中β －1,4－連接殘基被通常包含乙醯基、葡萄糖醛酸基、阿拉伯糖基及半乳糖基之短側鏈取代。半纖維素可以化學方式與木質素交聯。木質素是各種取代對羥苯基丙烷單位之複雜交聯聚合物，可提供強度給細胞壁以承受機械壓力，同時可保護纖維素不受酶類水解。
木質纖維素係纖維素與半纖維素與苯酚丙醇單位聚合物與木質素之組合物。其物理性質堅硬、密實且不易受影響，為生物圈中含量最豐富之生化物質。以下為含木質纖維素材料之實例：硬木及軟木屑、木漿、鋸屑及林木業廢棄物；農業生物質如榖類蒿木(cereal straw)、甜菜漿(sugar beet pulp)、玉米桿及穗軸、甘蔗渣、莖、葉、皮、殼及該類似物；廢棄物品如都市廢棄物、報紙及辦公室廢紙、研磨廢料如榖粒；專用能源作物(例如柳木、楊木、柳枝稷(switchgrass)或利甘草及該類似物)。較佳實例為玉米桿、柳枝稷、榖類蒿木、甘蔗渣及木材衍生材料。
本文所使用之「纖維素材料」關於任何包含纖維素、半纖維素及/或木質纖維素以為顯著成分之材料。「木質纖維素材料」係指任何包含木質纖維素之材料。這類材料係例如植物材料如包含軟木及硬木之木材、草本作物、農業殘餘物、紙漿及造紙殘餘物、廢紙、食物及飼料業廢棄物等。紡織纖維諸如棉、源自棉之纖維、亞麻、大麻、黃麻及人造纖維素纖維如木代爾纖維(modal)、黏膠纖維(viscose)、天絲(lyocell)係纖維素材料之特定實施例。
纖維素材料在天然中會被一些不同的微生物包括細菌及真菌分解。纖維素通常由相繼或同時作用之不同纖維素酶分解。纖維素經生物轉換成葡萄糖通常需要三種水解酶類：(1)切斷內部β －1,4－糖苷鍵之內切葡聚糖酶；(2)從纖維素聚合物鏈末端切割雙糖纖維二糖之外切型纖維二糖水解酶；(3)水解纖維二糖及其他短纖維寡糖成為葡萄糖之β －葡萄糖苷酶。換句話說，三種主要的纖維素酶類為纖維二糖水解酶(CBH)、內切葡聚糖酶(EG)及β －葡萄糖苷酶(BG)。
包含受質之更複雜纖維素之分解需要廣泛種類之各種酶類。舉例來說，木質纖維素係由半纖維素酶如木聚酶酶及甘露聚糖酶分解。半纖維素酶是一種水解半纖維素之酶。
「溶纖酶類」為具有「溶纖活性」之酶類，這表示它們能夠將纖維素受質或其衍生物水解成更小之糖類。因此溶纖酶類包含纖維素酶及半纖維素酶。本文所使用之纖維素酶包含纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶及β －葡萄糖苷酶。
里氏木黴具有著名且有效之纖維素酶系統，其包含二個CBH’s、二個主要及一些次要之EG’s及BG’s。里氏木黴CBHI(Cel7A)自纖維素鏈之還原端切割糖，並具有C端纖維素結合結構域(CBD)且可能構成60%之總分泌蛋白質。里氏木黴CBHII(Cel6A)自纖維素鏈之非還原端切割糖，並具有N端纖維素結合結構域且可能構成20%之總分泌蛋白質。內切葡聚糖酶EGI(Cel7B)及EGV(Cel45A)於C端具有CBD，EGII(Cel5A)具有N端CBD而EGIII根本沒有纖維素結合結構域。CBHI、CBHII、EGI及EGII也稱為木黴菌之「主要纖維素酶」，共構成80至90%之總分泌蛋白質。習知該項技藝者了解一種酶可能對多種受質有活性且酶活性可利用不同受質、方法及條件測定。確定不同溶纖活性被討論於例如van Tilbeurgh等人1988。
除了表現溶纖活性之催化結構域/核心之外，溶纖酶類可能包含一或多種纖維素結合結構域(CBDs)，亦稱為碳水化合物結合結構域/組件(CBD/CBM)，其可被置於催化結構域之N或C端。CBDs具有碳水化合物結合活性且媒介纖維素酶與結晶纖維素結合，但是它們對該酶對於可溶性受質之纖維素酶水解活性很少或沒有影響。這二個結構域通常經由可塑且高度糖基化之連接子區域連接。
本文使用之「纖維二糖水解酶」或「CBH」係指自葡萄糖鏈末端切割纖維素且主要產生纖維二糖之酶類。它們也稱為1,4－β －D－葡聚醣纖維二糖水解酶或纖維素－1,4－β －纖維二糖酶。它們從包含1,4－β －D－糖苷鍵之聚合物(如纖維素)之還原或非還原端水解該鍵，以釋出纖維二糖。里氏木黴曾分離出二種不同的CBHs，CBHI及CBHII。它們具有由催化結構域連接纖維素結合結構域(CBD)所組成之組件化結構。自然界中亦有缺乏CBD之纖維二糖水解酶。
「內切葡聚糖酶」或「EG」係指切斷纖維素鏈內部糖苷鍵之酶類，其分類如EC3.2.1.4中所述。它們是1,4－β －D－葡聚糖4－葡聚糖水解酶且催化葡萄糖聚合物如纖維素及其衍生物中1,4－β －D－糖苷鍵之內切水解。有些天然發生之內切葡聚糖酶具有纖維素結合結構域，有些則否。有些內切葡聚糖酶也具有木聚醣酶活性(Bailey等人，1993)。
「β －葡萄糖苷酶」或「BG」或「β G」係指分解小型可溶性寡糖包括纖維二糖成葡萄糖之酶類，其分類如EC3.2.1.21中所述。它們是β －D－葡糖苷葡萄糖水解酶，通常催化末端非還原β －D－葡萄糖殘基之水解。這些酶類識別葡萄糖之寡糖。典型受質為纖維二糖及纖維三糖。纖維二糖為纖維二糖水解酶之抑制劑，因此分解纖維二糖對於克服纖維二糖水解酶之終產物抑制而言很重要。
木聚醣酶係能識別及水解半纖維素之酶類，它們包括外切水解及內切水解酶類。它們通常具有將半纖維素分解成木糖之內切－1,4－β －木聚醣酶(EC3.2.1.8)或β －D－木醣苷酶(EC3.2.1.37)活性。與本發明有關之「木聚醣酶」或「Xyn」係特別指如EC3.2.1.8分類之水解木質纖維素受質之木糖聚合物或純化木聚糖之酶。
除此之外，纖維素酶可根據它們的主要序列分類為各種糖苷水解酶家族，由家族一些成員之三維結構分析得到證實(Henrissat 1991,Henrissat and Bairoch 1993,1996)。某些糖苷水解酶為多官能性酶類，其包含屬於不同糖苷水解酶家族之催化結構域。家族3由β －葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)組成，諸如本文所述之Ta BG_81、At BG_101及Ct BG_76。家族5(過去稱為celA)主要由內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)組成,諸如本文所述之Ta EG_28。家族7(過去稱為纖維素酶家族celC)包含內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)及纖維二糖水解酶(EC3.2.1.91)，諸如本文所述之Ct EG_54、Ta CBH、At CBH_A、At CBH_C及Ct CBH。家族10(過去稱為celF)主要由木聚醣酶(EC3.2.1.8)組成,諸如本文所述之Ta XYN_30及At XYN_60。家族45(過去稱為celK)包含內切葡聚糖酶(EC3.2.1.4),諸如本文所述之At EG_40及At EG_40_like。
用於水解纖維素材料之溶纖酶類可得自橙色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌。「可得自」係指它們可以從該菌種得到，但是不排除從其他來源得到之可能性。換句話說，它們可能源自任何有機體包括植物。較佳者係源自微生物例如細菌或真菌。該細菌可能例如選自芽胞桿菌屬(BacillUS)、固氮螺菌屬(Azospirillum)及鏈黴菌屬(Streptomyces)。更適宜之該酶源自真菌(包括絲狀真菌及酵母菌)，例如選自嗜熱子囊菌屬、枝頂孢菌屬、毛殼菌屬、黃毛殼菌屬(Achaetomium)、梭孢殼菌屬(Thielavia)、曲黴菌屬、葡萄孢屬(Botrytis)、金孢子菌屬(Chrysosporium)、金錢菌屬(Collybia)、層孔菌屬(Fomes)、鐮孢屬(FUSarium)、腐質黴屬(Humicola)、肉座菌屬(Hypocrea)、香菇屬(LentinUS)、馬蘭諾菌屬(MelanocarpUS)、毀絲黴屬、麥瑞菌屬(Myriococcum)、脈孢菌屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、毛平革菌屬(Phanerochaete)、射脈菌屬(Phlebia)、側耳屬(PleurotUS)、柄孢殼屬(Podospora)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、西塔利菌屬(Scytalidium)、密孔菌屬(PycnoporUS)、栓菌屬(Trametes)及木黴菌屬。
根據本發明之較佳實施態樣，酶類可得自保存為CBS 116239之橙色嗜熱子囊菌菌株ALKO4242、目前被歸類為嗜熱枝頂孢菌之保存為CBS 116240之菌株ALKO4245或保存為CBS 730.95之嗜熱毛殼菌菌株ALKO4265。
該纖維二糖水解酶適宜地包含與SEQ ID NO：2、4、6或8或其酵素活性片段具有至少80%一致性之胺基酸序列。
這些CBHs相較於里氏木黴CBH具有較佳之纖維素抑制常數，且當以不同纖維素受質測試時它們顯示改善之水解結果。SEQ ID NO：2及4不包含CBD。若將纖維素結合結構域(CBD)與本身不具有CBD之CBH連接時，則可獲得特別促進之水解結果。該CBD可得自例如木黴菌屬或毛殼菌屬，且較佳者係經連接子與CBH連接。該所形成之包含經連接子與CBD連接之CBH核心區之融合蛋白可能包含與SEQ ID NO：28或30具有至少80%一致性之胺基酸序列。包含SEQ ID NO：27或29序列之聚核苷酸編碼該融合蛋白。
該內切葡聚糖酶可能包含與SEQ ID NO：10、12、14或16或其酵素活性片段具有至少80%一致性之胺基酸序列。這些內切葡聚糖酶具有良好之熱穩定性。
該β－葡萄糖苷酶可能包含與SEQ ID NO：22、24或26或其酵素活性片段具有至少80%一致性之胺基酸序列。這些β－葡萄糖苷酶對於葡萄糖抑制具有良好抗性，其可有效地避免纖維素材料被酶類水解時之終產物抑制。該β－葡萄糖苷酶可能也被用於製備槐糖(sophorose)，此係一種用於里氏木黴培養中之纖維素酶誘導物。
木聚醣酶可能包含與SEQ ID NO：18或20或其酵素活性片段具有至少80%一致性之胺基酸序列。
「一致性」一詞在此係指二個互相比較之胺基酸序列從由對應基因所編碼之第一個胺基酸至最後一個胺基酸間之整體一致性。全長序列之一致性係利用EMBOSS(歐洲分子生物學開放軟體套件；Rice等人,2000)程式組(3.0.0版)中之尼德曼－王氏(Needleman－Wunsch)整體排列演算法測量，參數設定如下：EMBLOSUM62，間隔罰分10.0，延長罰分0.5。該演算法如尼德曼－王氏(1970)所描述。熟習該項技術者了解利用尼德曼－王氏演算法所得到之結果僅在排比序列之對應結構域時才可互相比較。因此例如包含CBD之纖維素酶序列或缺乏該些元件序列之信號序列無法互相比較。
根據本發明之實施態樣，使用與SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26或至少其酵素活性片段具有至少80、85、90、95或99%一致性之溶纖多肽。
「酵素活性片段」一詞係指定義序列中具有溶纖活性之任何片段。換句話說，酵素活性片段可能是該定義序列之成熟蛋白質部分或可能只是成熟蛋白質部分之片段，唯其仍具有纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶、β －葡萄糖苷酶或木聚醣酶活性。
較佳之溶纖酶類係重組酶類，其可以一般已知之方式產製。分離包含該酶基因之聚核苷酸片段，將該基因插入表現載體中之強啟動子下，該載體被轉移至適當宿主細胞內且令該宿主細胞於誘導該酶產製之條件下培養。於不同宿主系統中利用重組技術產製蛋白質之方法係該領域所熟知(Sambrook et al.,1989；Coen,2001；Gellissen,2005)。較佳之該酶類係被產製成為分泌至培養基之胞外酶類，如此可方便酶之回收及分離。生產宿主之耗盡培養基可如此被利用，或自其中移出該宿主細胞，及/或濃縮、過濾或分餾該耗盡培養基。該耗盡培養基亦可能被乾燥。
本發明中分離之多肽可能僅代表細胞及細胞殘渣已被移除之包含該多肽之培養基。該多肽之分離可方便地藉由例如添加陰離子及/或陽離子聚合物至耗盡培養基以促進細胞、細胞殘渣及一些具有不欲副作用之酶類沉積。接著該培養基利用無機過濾劑及濾器過濾，以移除形成之沉澱物。之後該濾液利用半透膜進一步處理以移除鹽類、糖類及代謝產物。
根據本發明之實施態樣，該異源性聚核苷酸包含類似於登錄號DSM 16723、DSM 16728、DSM 16729、DSM 16727、DSM 17326、DSM 17324、DSM 17323、DSM 17729、DSM 16724、DSM 16726、DSM 16725、DSM 17325或DSM 17667之微生物所包含之基因的基因。
該生產宿主可以是任何可表現該溶纖酶之有機體。較佳之該宿主係微生物細胞，更佳者係真菌。最適宜之該宿主係絲狀真菌。該重組宿主適宜地被修飾以表現及分泌溶纖酶類，以為其主要活性或主要活性之一。這可藉由刪除主要同源分泌基因例如木黴菌之四個主要纖維素酶及藉由將異源性基因打入(targeting)已經修飾以確保高表現及生產濃度之基因座中達成。用於生產溶纖酶類之較佳宿主特別是來自木黴菌屬或曲黴菌屬之菌株。
根據本發明水解纖維素材料所需之酶類可能以酵素有效量被同時例如以酶混合物之形式或相繼添加，或作為同步糖化及醱酵(SSF)之部分。任何包含與SEQ ID NO：2、4、6或8或其酵素活性片段具有至少80%一致性之胺基酸序列之纖維二糖水解酶之組合物可以與內切葡聚糖酶及β －葡萄糖苷酶之任何組合物一起使用。如果該纖維素材料包含半纖維素，將額外使用半纖維素酶特別是木聚醣酶以供分解。內切葡聚糖酶、β －葡萄糖苷酶及木聚醣酶可能選自本文所描述者，但不限於這些酶類。它們也可以是例如商品化之酶製劑。除了纖維素酶及選擇性之半纖維素酶之外，還可以使用一或多種其他酶類，例如蛋白酶、澱粉酶、漆酶、脂肪酶、果膠酶、酯酶及/或過氧化酶。其他酶處理可能在纖維素酶處理之前、之中或之後進行。
「酶製劑」一詞係指包含至少一種所欲酶類之組成物。該製劑可能包含至少為部分純化且分離形式之酶類，甚至實質上由所欲之酶或酶類組成。或者該製劑可能為包含一或多種溶纖酶類之耗盡培養基或濾液。除溶纖活性之外，該製劑可能包含添加物，諸如媒介物、穩定劑、緩衝劑、保存劑、介面活性劑及/或培養液成分。較佳之添加劑為該些慣用於供特定應用之酶製劑中者。該酶製劑可能以液體、粉末或顆粒之形式存在。該酶製劑較佳為耗盡培養基。「耗盡培養基」係指包含所生產之酶類之宿主培養基。該宿主細胞於生產後適宜地與該培養基分離。
根據本發明之實施態樣，該酶製劑包含CBH、EG及BG之混合物，選擇性地加上木聚醣酶及/或其他酶類。該CBH包含與SEQ ID NO：2、4、6或8或其酵素活性片段具有至少80%一致性之胺基酸序列，且其可能得自橙色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌，然而EG、BG及木聚醣酶可能來自任何來源包括來自該有機物。可能存在於該製劑之其他酶類為例如蛋白酶、澱粉酶、漆酶、脂肪酶、果膠酶、酯酶及/或過氧化酶。
不同之酶混合物及組合物可能被用來配合不同的處理條件。舉例來說，如果分解過程係在高溫下進行，則選擇熱穩定性酶類。家族7之CBH與家族45之內切葡聚糖酶之組合物(選擇性地加上家族3之BG及/或家族10之木聚醣酶)於45℃及較高溫度下均具有良好之水解表現。
里氏木黴之溶纖酶類於水解時係慣用於約40至50℃之溫度範圍內，且於同步糖化及醱酵時為30至40℃。可得自橙色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌或嗜熱毛殼菌之CBH、EG、BG及Xyn在這些溫度下也有效，但除此之外它們大部分在介於50至75℃之溫度下亦非常有效(或甚至高達80至85℃)，諸如介於55至70℃，例如介於60至65℃。對於短暫培養時間而言，酶混合物在甚至高達85℃仍有作用，至於完全水解通常使用較低溫度。
以CBH、EG、BG及Xyn處理纖維素材料之方法特別適用於自木質纖維素材料產製可醱酵糖類。該可醱酵糖類接著利用酵母菌進行醱酵成為乙醇並且被作為燃料使用。它們亦可作為供產製化工過程例如所謂生物精煉中之各種化學物質或架構區塊之中間物或原料。木質纖維素材料在酶類水解之前可能先經過前處理以破壞纖維素受質之纖維結構，並使纖維素成分更容易接觸溶纖酶類。目前的前處理包括機械性、化學性或熱處理方法及其組合物。該材料可能例如經蒸氣爆炸或酸水解之前處理。
一些新穎之溶纖多肽可見於橙色嗜熱子囊菌、嗜熱枝頂孢菌及嗜熱毛殼菌。該新穎之多肽可能包含具有溶纖活性且選自多肽群組之片段，該多肽包含與SEQ ID NO：4具有至少66%(較佳為70%或75%)一致性、與SEQ ID NO：6具有79%一致性、與SEQ ID NO：12具有78%一致性、與SEQ ID NO：14具有68%(較佳為70%或75%)一致性、與SEQ ID NO：16具有72%(較佳為75%)一致性、與SEQ ID NO：20具有68%(較佳為70%或75%)一致性、與SEQ ID NO：22或24具有74%一致性或與SEQ ID NO：26具有78%一致性之胺基酸序列。
該新穎多肽可能亦為該多肽之變異體。「變異體」可能是同株、同種或同屬中天然發生之例如等位(allelic)變異多肽，或可能為突變產生之多肽。其可能包含胺基酸取代、刪除或導入，但仍與上述定義之酶類具有實質上類似之功能，也就是包含具有溶纖活性之片段。
該溶纖多肽通常以包含信號序列之不成熟多肽於細胞中產製，該信號序列於蛋白質分泌時被切割。它們的N端及/或C端亦可能於分泌時被進一步處理以得到成熟、具有酶類活性之蛋白質。因此「包含具有溶纖活性之片段」之多肽係指該多肽可能為不成熟或成熟形式，較佳者為成熟形式也就是經過處理。
該新穎多肽可能進一步為上述「多肽或變異體之片段」。該片段可能是上述蛋白質之成熟形式，或其可能只是該成熟蛋白質之酶類活性部分。根據本發明之實施態樣，該多肽具有與SEQ ID NO：4、6、12、14、16、20、22、24或26或其溶纖活性片段具有至少80、85、90、95或99%一致性之胺基酸序列。該多肽亦可能為其具有纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶、木聚醣酶或β －葡萄糖苷酶活性之變異體或片段。根據本發明之另一實施態樣，該多肽實質上由SEQ ID NO：4、6、12、14、16、20、22、24或26序列之溶纖活性片段組成。
該新穎聚核苷酸可能包含SEQ ID NO：3、5、11、13、15、19、21、23或25之核苷酸序列或編碼上述新穎多肽之序列，包括其互補股。本文所使用之聚核苷酸係指RNA及DNA，且其可能為單股或雙股。該聚核苷酸可能亦為包含至少20個核苷酸(例如至少25、30或40個核苷酸)之該聚核苷酸之片段。根據本發明之實施態樣，其長度至少為100、200或300個核苷酸。另外該聚核苷酸可能因基因密碼而成為上述定義之任一序列之簡併序列。這表示不同的密碼子可能編碼相同之胺基酸。
根據本發明之實施態樣，該聚核苷酸「包含於」SEQ ID NO：3、5、11、13、15、19、21、23或25中，這表示該序列具有至少上述序列之部分。根據本發明之其他實施態樣，該聚核苷酸包含類似於登錄號DSM 16728、DSM 16729、DSM 17324、DSM 17323、DSM 17729、DSM 16726、DSM 16725、DSM 17325或DSM 17667之微生物所包含之基因的基因。
該新穎蛋白質/多肽可能以上述万法製備。該新穎聚核苷酸被導入於載體中，其可表現由異源性序列編碼之多肽，且該載體被導入可表現該多肽之宿主細胞中。該宿主細胞較佳為源自木黴菌屬或曲黴菌屬。
編碼該新穎多肽之異源性基因被導入具有登錄號DSM 16728、DSM 16729、DSM 17324、DSM 17323、DSM 17729、DSM 16726、DSM 16725、DSM 17325或DSM 17667之大腸桿菌菌株之質體。
該新穎酶類可能為酶製劑之成分。該酶製劑可能包含一或多種新穎多肽，且其可能以例如耗盡培養基、粉末、顆粒或液體之形式存在。根據本發明之實施態樣，其包含纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶、β －葡萄糖苷酶及可選擇的木聚醣酶活性及/或其他酶活性。其可能進一步包含任何慣用之添加劑。
該新穎酶類可被用於任何與溶纖酶類有關之用途，諸如於燃料、紡纖、清潔劑、紙漿和造紙、食品、飼料或飲料工業上，及特別是用於水解纖維素材料以供產製包含乙醇之生物燃料。在紙漿和造紙工業上，它們可被用於修飾纖維素材料例如處理牛皮紙漿、機械紙漿或回收紙。
本發明由下列非限制性之實施例說明。然而應了解的是，上述說明及實施方式中提及之實施態樣僅供說明之用，且在本發明之範圍內各種改變及修飾皆有可能。
 實施例1. 篩選表現溶纖活性之菌株並培養菌株以供
純化測試約25株來自羅爾(Roal Oy)菌種保存之真菌菌株之溶纖活性包括β －葡萄糖苷酶。經過初步篩選，選出6株以供進一步試驗，包括橙色嗜熱子囊菌ALKO4239及ALKO4242、嗜熱枝頂孢菌ALKO4245、嗜熱籃狀菌ALKO4246及嗜熱毛殼菌ALKO4261及ALKO4265。
菌株ALKO4239、ALKO4242及ALKO4246於搖瓶中以42℃培養7天，其培養基為3XB，包含下列成分(克/升)：Solka Floc纖維素粉18、酒糟18、燕麥－斯佩爾特小麥木聚糖9、碳酸鈣2、豆粉4.5、磷酸氫二銨4.5、小麥麩皮3.0、磷酸二氫鉀1.5、水合硫酸鎂1.5、氯化鈉0.5、硝酸鉀0.9、刺槐豆膠9.0、微量元素溶液#1 0.5、微量元素溶液#2 0.5及Struktol(Stow，OH，USA)消泡劑0.5毫升；pH值調整至6.5。微量元素溶液#1含下列成分(克/升)：硫酸錳1.6、七水硫酸鋅3.45及六水氯化鈷2.0；微量元素溶液#2含下列成分(克/升)：七水硫酸鐵5.0及二滴濃縮硫酸。
菌株ALKO4261於搖瓶中以1XB培養基培養，其具有3XB培養基(上述)各成分之1/3，但碳酸鈣、氯化鈉及微量元素之濃度相同。該菌株於45℃下培養7天。
菌株ALKO4265於搖瓶中以下列培養基(克/升)培養：Solka Floc纖維素粉40、PharmamediaTM (Traders Protein,Memphis,TN,USA)10、玉米漿粉5、硫酸銨5及磷酸二氫鉀15；pH值調整至6.5。該菌株於45℃下培養7天。
培養後之細胞及其他固體經離心收集且回收上清液。以搖瓶進行培養者，分別添加蛋白酶抑制劑PMSF(苯甲基磺醯氟)及抑胃肽至1毫莫耳及10微克/毫升。若非立即使用，將該製劑分裝儲存於－20℃下。
要預測該酶類之熱活性，添加100微克牛血清白蛋白(BSA)/毫升以作為穩定劑，於50、60、65、70及75℃下對該搖瓶培養基進行1小時之測試。初步測試於50及65℃下以二種不同之pH值(4.8/5.0或6.0)進行，以確認哪一個pH值較適合熱活性測試。
所有搖瓶上清液進行下列活性之測定：類纖維二糖水解酶I活性(「CBHI」)及類內切葡聚糖酶I活性(「EGI」)：此二者於50毫莫耳之醋酸鈉緩衝液中測量，以0.5毫莫耳之MUL(4－甲基繖形基－β－D－乳糖苷糖(4－methylumbelliferyl－β －D－lactoside))作為受質。添加葡萄糖(100毫莫耳)以抑制任何干擾性β －葡萄糖苷酶活性。於370奈米處測定釋出之4－甲基繖形基。藉由測量纖維二糖(5毫莫耳)存在及不存在時之活性以區分「CBHI」及「EGI」活性。未被纖維二糖抑制之活性代表「EGI」活性及其餘MUL活性代表「CBHI」活性(van Tilbeurgh et al,1988)。該檢測係於pH5.0或6.0進行(見下述)。
內切葡聚糖酶(CMCase)活性：此係實質上如Bailey and Nevalainen 1981；Haakana et al.2004所述以2%(重量/體積)之羧甲基纖維素(CMC)作為受質於50毫莫耳檸檬酸鹽緩衝液中測定。還原糖類以DNS試劑測定。該測定於pH4.8或6.0進行(見下述)。
β －葡萄糖苷酶(BGU)活性此係如Bailey and Nevalainen 1981所述以4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷(4－nitrophenyl－β －D－glucopyranoside)(1毫莫耳)於50毫莫耳檸檬酸鹽緩衝液中測定。於400奈米處測定釋出之4－硝苯酚。該測定於pH4.8或6.0進行(見下述)。
酶類之相對活性如圖1所示。該相對活性之表示係以60℃之活性設定為100%(圖1)。所有菌株皆產生於高溫下(65至75℃)具有高活性之酶類。
在蛋白質純化方面，ALKO4242亦於2公升之生物反應器中(Braun BiostatB,Braun,Melsungen,Germany)以下列培養基(克/升)培養：Solka Floc纖維素粉40、豆粉10、硝酸銨5、磷酸二氫鉀5、七水硫酸鎂0.5、二水氯化鈣0.05、微量元素溶液#1 0.5、微量元素溶液#2 0.5。通氣量為1vvm，以Struktol消泡劑控制泡沫，攪拌200至800rpm及溫度為47℃。培養二批菌株，一批之pH值為4.7±0.2(氨氣/硫酸)，另一批之初期pH為4.5。培養時間為7天。培養後之細胞及其他固體經離心移除。
菌株ALKO4245於2公升之生物反應器中(Braun BiostatB,Braun,Melsungen,Germany)以下列培養基(克/升)培養：Solka Floc纖維素粉40、玉米漿粉15、酒糟5、燕麥－斯佩爾特小麥木聚糖3、刺槐豆膠3、硫酸銨5及磷酸二氫鉀5。pH值之範圍為5.2±0.2(氨氣/硫酸)，通氣量1vvm，以300至600rpm攪拌，以Struktol消泡劑控制泡沫及溫度為42℃。培養時間為4天。培養後之細胞及其他固體經離心移除。
在酶純化方面，ALKO4261於10公升之生物反應器中(Braun BiostatED,Braun,Melsungen,Germany)以下列培養基(克/升)培養：Solka Floc纖維素粉30、酒糟10、燕麥－斯佩爾特小麥木聚糖5、碳酸鈣2、豆粉10、小麥麩皮3.0、硫酸銨5、磷酸二氫鉀5、七水硫酸鎂0.5、氯化鈉0.5、硝酸鉀0.3、微量元素溶液#1 0.5及微量元素溶液#2 0.5。pH值之範圍為5.2±0.2(氨氣/硫酸)，通氣量1vvm，以200至600rpm攪拌，以Struktol消泡劑控制泡沫及溫度為42℃。培養時間為5天。第二批以類似條件培養，除了Solka Floc添加至40克/升及酒糟加至15克/升。上清液經離心回收，且通過Seitz－K150及EK濾紙過濾(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH,Bad Kreuznach,Germany)。之後上清液利用Pellicon微細超過濾系統(濾紙額定分子量限制10kDa；Millipore,Billerica,MA,USA)濃縮約10倍。
在酶純化方面，ALKO4265亦於10公升之生物反應器中(Braun BiostatED,Braun,Melsungen,Germany)以與上述相同之培養基培養，除了磷酸二氫鉀添加至2.5克/升。pH值之範圍為5.3±0.3(氨氣/磷酸)，通氣量0.6vvm，以500rpm攪拌，以Struktol消泡劑控制泡沫及溫度為43℃。培養時間為7天。上清液經離心回收，且通過Seitz－K150及EK濾紙過濾(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH,Bad Kreuznach,Germany)。之後上清液利用Pellicon微細超過濾系統(濾紙額定分子量限制10kDa；Millipore,Billerica,MA,USA)濃縮約20倍。
實施例2.純化及特徵化來自嗜熱枝頂孢菌ALKO4245及嗜熱毛殼菌ALKO4265之纖維二糖水解酶
嗜熱枝頂孢菌ALKO4245及嗜熱毛殼菌ALKO4265以實施例1所述之方式培養。主要之纖維二糖水解酶利用對胺苯基1－硫基－β －纖維二糖苷－基底親和性管柱純化，以Tomme et al.,1988所述之方式製備。
培養上清液先緩衝調配成50毫莫耳之醋酸鈉緩衝液pH5.0，其中含1毫莫耳δ －葡萄糖酸內酯及0.1莫耳葡萄糖以防止β －葡萄糖苷酶存在時造成配基水解。纖維二糖水解酶以0.1莫耳乳糖沖提且最後利用AKTA系統之Superdex 200HR 10/30管柱(Amersham Pharmacia Biotech)以凝膠過濾層析法純化。凝膠過濾法中所使用之緩衝液為50毫莫耳磷酸鈉pH7.0，其包含0.15莫耳氯化鈉。
純化之纖維二糖水解酶以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，且根據分子量標準物(低分子量校正組，AmerSham Biosciences)評估二個蛋白質之分子量均約為70kDa。純化之枝頂孢菌及毛殼菌纖維二糖水解酶遵照Henrissat等人之分類計畫(1998)(Henrissat,1991；Henrissat and Bairoch,1993)分別被命名為At Cel7A及Ct Cel7A。
該製劑之特定活性係利用4－甲基繖形基－β －D－乳糖苷糖(MUL)、4－甲基繖形基－β －D－纖維二糖苷糖(MUG2)或4－甲基繖形基－β －D－纖維三糖苷糖(MUG3)作為受質於0.05莫耳檸檬酸鈉緩衝液pH5中於50℃作用10分鐘以決定。內切葡聚糖酶及木聚醣酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)及樺木葡萄木糖(glucuronoxylan)(Bailey et al.,1992)作為受質以標準程序(根據IUPAC，1987)測試。根據以1%受質及0.25微莫耳酶劑量於50℃、pH5.0進行24小時反應所形成之還原糖，計算對Avicel之特定活性。根據Lowry et al.,1951所述測量純化酶製劑之蛋白質含量。欲特徵化水解之終產物，以高效液相層析(Dionex)分析如上述於24小時水解試驗釋出之可溶性糖類。里氏木黴經純化之纖維二糖水解酶I(CBHI/Cel7A)被當作參考物。
該純化酶類及里氏木黴CBHI/Cel7A之特定活性列於表1。純化之At Cel7A及Ct Cel7A纖維二糖水解酶對於小型合成性受質相較於里氏木黴CBHI/Cel7A具有較高之特定活性。本文所揭示之酶類對Avicel明顯具有較高之特定活性。純化酶製劑對木聚糖及CMC之低活性可能是因為蛋白質本身之性質，或至少部分是因為殘餘少量之污染酶類。所有純化酶類水解纖維素之主要終產物為纖維二糖，其為纖維二糖水解酶之典型產物。
純化之纖維二糖水解酶之熱穩定性係於不同溫度下測定。該反應利用4－甲基繖形基－β －D－乳糖苷糖作為受質，於0.1% BSA存在時於pH5.0下進行60分鐘。嗜熱毛殼菌ALKO4265 CBH/Cel7A及嗜熱枝頂孢菌ALKO4245 CBH/Cel7A分別於65及60℃時穩定。里氏木黴參考酶(CBHI/Cel7A)在到達55℃時維持100%活性。
實施例3.純化及特徵化來自嗜熱枝頂孢菌ALKO4245之內切葡聚糖酶
嗜熱枝頂孢菌ALKO4245以實施例1所述之方式培養。培養上清液於70℃下培養24小時，之後以超過濾濃縮。純內切葡聚糖酶藉由疏水交互作用及陽離子交換層析法然後以凝膠過濾連續純化得到。經純化收集到之餾份之內切葡聚糖酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)作為受質測定(IUPAC法1987)。利用牛血清白蛋白作為標準物以BioRad Assay Kit(Bio－Rad Laboratories)測量蛋白質含量。
濃縮培養上清液被置於以含1莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀緩衝液pH6.0平衡之HiPrep 16/10丁基FF疏水性管柱。結合蛋白質以從上述緩衝液至5毫莫耳磷酸鉀pH6.0之線性梯度沖提。收集餾份並以上述方式測定內切葡聚糖酶活性。內切葡聚糖酶活性於120至15mS/cm之廣泛電導區域內沖提。
組合餾份被置於以8毫莫耳醋酸鈉pH4.5平衡之HiTrap SP XL陽離子交換管柱。結合蛋白質以平衡緩衝液中0至0.25莫耳氯化鈉之線性梯度沖提。具有內切葡聚糖酶活性之蛋白質在3至7mS/cm之電導區被沖提。重複陽離子交換層析法且以冷凍乾燥濃縮該蛋白質沖提物。
溶解樣品被裝入以含0.15莫耳氯化鈉之20毫莫耳磷酸鈉緩衝液pH7.0平衡之Superdex 75 HR10/30凝膠過濾管柱。主要蛋白質餾份自管柱中被沖提出來，滯留體積為13.3毫升。以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳判斷該蛋白質沖提物為純物質，且經評估其分子量為40kDa。該名為At EG_40之純化蛋白質於50℃下之特定活性被測定為450nkat/mg(IUPAC法1987，使用CMC為受質)。
純化之內切葡聚糖酶之熱穩定性係於不同溫度下測定。該反應利用羧甲基纖維素作為受質，於0.1毫克/毫升BSA存在時於pH5.0下進行60分鐘。嗜熱枝頂孢菌EG_40/Cel45A於80℃時穩定。里氏木黴參考酶EGI(Cel7B)及EGII(Cel5A)分別於高達60及65℃時維持100%活性。
實施例4. 純化來自嗜熱毛殼菌ALKO4261之內切葡聚糖酶
嗜熱毛殼菌ALKO4261以實施例1所述之方式培養。純內切葡聚糖酶藉由疏水交互作用及陽離子交換層析法加上之後的凝膠過濾連續純化得到。於純化時收集之餾份之內切葡聚糖酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)作為受質決定(IUPAC法1987)。
培養上清液中添加硫酸銨以達到與20毫莫耳磷酸鉀pH6.0相同之電導性，其含有1莫耳硫酸銨。該樣品被置於以含1莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀pH6.0平衡之HiPrep 16/10苯基FF疏水性管柱。以20至0毫莫耳磷酸鉀pH6.0之線性梯度及之後以5毫莫耳磷酸鉀pH6.0及水進行沖提。結合蛋白質以0至6莫耳尿素線性梯度沖提。收集餾份並以上述方式測定內切葡聚糖酶活性。含內切葡聚糖酶活性之蛋白質於尿素梯度剛開始時被沖提。
這些餾份通過10DG管柱(Bio－Rad)被組合、平衡成為16毫莫耳Tris－HCl pH7.5溶液(I＝1.4mS/cm)，且置於以20毫莫耳Tris－HCl pH7.5溶液平衡之HiTrap DEAE FF陰離子交換管柱。結合蛋白質以平衡緩衝液中0至1莫耳氯化鈉之線性梯度沖提。收集餾份並如上述分析內切葡聚糖酶活性。該蛋白質於10至20mS/cm之範圍被沖提。
該檢體利用10DG管柱(Bio－Rad)平衡至15毫莫耳醋酸鈉且被裝入以20毫莫耳醋酸鈉pH4.5平衡之HiTrap SP XL陽離子交換管柱。蛋白質以0至0.4莫耳醋酸鈉pH4.5之線性梯度沖提。內切葡聚糖酶活性在1至10mS/cm之範圍被沖提。收集檢體經冷凍乾燥。
該檢體被溶解於水中且裝入以含0.15莫耳氯化鈉之20毫莫耳磷酸鈉pH6.0平衡之Superdex 75 HR10/30凝膠過濾管柱。收集餾份且組合該些具有內切葡聚糖酶活性之餾份。以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳判斷該蛋白質沖提物為純物質，且根據分子量標準物(預染SDS－PAGE標準物,Broad Range,Bio－Rad)評估其分子量為54kDa。該名為Ct EG_54之純化蛋白質之等電點以PhastSystem(Pharmacia)測定約為5.5。
實施例5. 純化來自橙色嗜熱子囊菌ALKO4242之內切葡聚糖酶
橙色嗜熱子囊菌ALKO4242以實施例1所述之方式培養。純內切葡聚糖酶藉由疏水交互作用及陰離子交換層析法加上之後的凝膠過濾連續純化得到。於純化時收集之餾份之內切葡聚糖酶活性利用羧甲基纖維素(CMC)作為受質決定(IUPAC法1987)。蛋白質含量利用牛血清白蛋白作為標準物以BioRad Assay Kit(Bio－Rad Laboratories)測量。
培養上清液被置於以含0.7莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀緩衝液pH6.0平衡之HiPrep 16/10丁基疏水性管柱。結合蛋白質以0.2莫耳硫酸銨(等電點＝39mS/cm)沖提。具有內切葡聚糖酶活性之餾份被組合及以超過濾方式濃縮。
該檢體於10DG管柱(Bio－Rad)中脫鹽並被置於以15毫莫耳Tris－HCL pH7.0平衡之HiTrap DEAE FF陰離子交換管柱。結合蛋白質於平衡緩衝液中以0至0.4莫耳氯化鈉之線性梯度沖提。具有內切葡聚糖酶活性之蛋白質在15至21mS/cm之電導區被沖提。收集到之餾份如上述組合及濃縮。
檢體被裝入以含0.05莫耳氯化鈉之50毫莫耳醋酸鈉緩衝液pH5.0平衡之Sephacryl S－100 HR26/60凝膠過濾管柱。自管柱沖提具有內切葡聚糖酶活性之蛋白質餾份，該管柱具有對應分子量16kDa之滯留體積。收集到之餾份被組合、濃縮且重複凝膠過濾。以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳判斷該蛋白質沖提物為純物質，且評估其分子量為28kDa。該名為Ta EG_28之純化蛋白質之等電點以IEF膠體(PhastSystem,Pharmacia)測定約為3.5。Ta EG_28於50℃下之特定活性被測定為4290nkat/mg(IUPAC法1987，使用CMC為受質)。
實施例6.純化及特徵化來自嗜熱枝頂孢菌ALKO4245之β －葡萄糖苷酶
嗜熱枝頂孢菌ALKO4245以實施例1所述之方式培養。純β －葡萄糖苷酶藉由疏水交互作用及陰離子交換層析法然後以凝膠過濾連續純化得到。經純化收集到之餾份之β －葡萄糖苷酶活性利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質測定(Bailey and Linko,1990)。蛋白質含量利用牛血清白蛋白作為標準物以BioRad Assay Kit(Bio－Rad Laboratories)測量。
該培養上清液被置於以含1莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀緩衝液pH6.0平衡之HiPrep 16/10苯基Sepharose FF疏水性管柱。結合蛋白質於137至16mS/cm電導區以從平衡緩衝液至5毫莫耳磷酸鉀之線性梯度沖提。收集之餾份被組合並經高過濾濃縮。
該檢體於10DG管柱(Bio－Rad)中脫鹽並被置於以10毫莫耳磷酸鉀pH7.0平衡之HiTrap DEAE FF陰離子交換管柱。結合蛋白質於1.5至12mS/cm電導區以從平衡緩衝液至含0.25莫耳氯化鈉之相同緩衝液之線性梯度沖提。如上述重複陰離子交換層析，除了所使用的是4毫莫耳磷酸鉀緩衝液pH7.2。蛋白質在6至9mS/cm之電導區被沖提。具有β －葡萄糖苷酶活性之餾份被收集、組合及濃縮。
來自陰離子交換層析之活性物質被置於以含0.15莫耳氯化鈉之20毫莫耳磷酸鈉pH6.5平衡之Sephacryl S－300 HR 26/60管柱。具有β －葡萄糖苷酶活性之蛋白質以對應分子量243kDa之滯留體積被沖提。該蛋白質以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳判斷為純物質，且其分子量被評估為101kDa。該名為Atβ G_101之純化蛋白質之等電點以IEF膠體(PhastSystem,Pharmacia)測定為5.6至4.9之範圍內。Atβ G_101於50℃下之特定活性被測定為1100nkat/mg(利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質，Bailey and Linko,1990)。
純化之β －葡萄糖苷酶之熱穩定性係於不同溫度下測定。該反應利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質，於0.1毫克/毫升BSA存在時於pH5.0下進行60分鐘。嗜熱枝頂孢菌β G_101於70℃時穩定。曲黴菌參考酶(Novozym 188)於高達60℃時維持100%活性。
實施例7. 純化來自嗜熱毛殼菌ALKO4261之β －葡萄糖苷酶
嗜熱毛殼菌ALKO4261以實施例1所述之方式培養。純β －葡萄糖苷酶藉由疏水交互作用、陰離子及陽離子交換層析法然後以凝膠過濾連續純化得到。於純化時收集到之餾份之β －葡萄糖苷酶活性利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質測定(Bailey and Linko,1990)。
該培養上清液被置於以含0.8莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀pH6.0平衡之HiPrep 16/10苯基Sepharose FF疏水性管柱。以從平衡緩衝液至3毫莫耳磷酸鉀pH6.0之線性梯度進行沖提，隨後以水及6莫耳尿素沖提。第一次具有β －葡萄糖苷酶活性之餾份於80至30mS/cm電導區被沖提。第二次β －葡萄糖苷酶活性以6莫耳尿素沖提。以尿素沖提之活性餾份被集合並以經10毫莫耳Tris－HCl pH7.0平衡之10DG管柱(Bio－Rad)脫鹽。
經脫鹽後，該檢體被置於以15毫莫耳Tris－HCl pH7.0平衡之HiTrap DEAE FF陰離子交換管柱。蛋白質不與管柱結合但於檢體裝填時被洗出。此未與管柱結合之餾份於經7毫莫耳醋酸鈉pH4.5平衡之10DG管柱(Bio－Rad)中脫鹽。
來自陰離子交換層析之檢體被置於以10毫莫耳醋酸鈉pH4.5平衡之HiTrap SP FF陽離子交換管柱。結合蛋白質以從10毫莫耳至400毫莫耳醋酸鈉pH4.5之線性梯度沖提。收集於電導區6.5至12mS/cm被沖出之具有β －葡萄糖苷酶活性之餾份，以經7毫莫耳醋酸鈉pH4.5平衡之10DG管柱(Bio－Rad)脫鹽並冷凍乾燥。
經凍乾之檢體以100微升之水稀釋並被裝入以含0.15莫耳氯化鈉之20毫莫耳磷酸鈉pH4.5平衡之Superdex 75 HF10/30凝膠過濾管柱。該β －葡萄糖苷酶活性係於13.64毫升之滯留體積被沖出。收集到之餾份被組合、冷凍乾燥並溶解於水。以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳判斷該蛋白質為純物質，且評估其分子量為76kDa。該蛋白質被命名為Ctβ G_76。
實施例8.純化及特徵化來自橙色嗜熱子囊菌ALKO4242之β －葡萄糖苷酶
橙色嗜熱子囊菌ALKO4242以實施例1所述之方式培養。純β －葡萄糖苷酶藉由疏水交互作用、陰離子及陽離子交換層析法加上之後的凝膠過濾連續純化得到。於純化時收集到之餾份之β －葡萄糖苷酶活性利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質測定(Bailey and Linko,1990)。蛋白質含量利用牛血清白蛋白作為標準物以BioRad Assay Kit(Bio－Rad Laboratories)測量。
該培養上清液被置於以含0.7莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀pH6.0平衡之HiPrep 16/10苯基Sepharose FF疏水性管柱。結合蛋白質以從0.2莫耳硫酸銨至5毫莫耳磷酸鉀pH6.0之線性梯度沖提。β －葡萄糖苷酶活性係於電導區28.0至1.1mS/cm之梯度被沖出。餾份被組合並以超過濾濃縮。
該檢體於10DG管柱(Bio－Rad)中脫鹽並被置於以20毫莫耳Tris－HCl pH7.0平衡之HiTrap DEAE FF陰離子交換管柱。該酶於平衡緩衝液中以0至0.2莫耳氯化鈉之線性梯度沖提且以含0.4莫耳氯化鈉之20毫莫耳Tris－HCl延遲沖提。於約10至30mS/cm電導區沖出之檢體以超過濾濃縮並以10DG管柱(Bio－Rad)脫鹽。
該檢體被置於以9毫莫耳醋酸鈉pH4.5平衡之HiTrap SP XL陽離子交換管柱。該酶以10至400毫莫耳醋酸鈉之線性梯度沖提並利用400毫莫耳醋酸鈉pH4.5延遲沖提。具有β －葡萄糖苷酶活性之蛋白質在5.0至11.3mS/cm電導區之線性梯度被廣泛沖提。
來自陽離子交換層析之活性物質被置於以含0.15莫耳氯化鈉之20毫莫耳磷酸鈉pH7.0平衡之Sephacryl S－300 HR 26/60管柱。具有β －葡萄糖苷酶活性之蛋白質以對應分子量294kDa之滯留體積被沖提。所收集之餾份被組合、凍乾並溶解於水。該蛋白質以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳分析為純物質且其分子量被評估為81kDa，表示最可能的是該蛋白質之單體形式。利用3至9等電點之凝膠進行等電聚焦(IEF)。經銀染色後，除了對應等電點4.55之狹窄帶以外等電點5.85以上之廣泛區域被染色。被命名為Taβ G_81之純化蛋白質於50℃下之特定活性利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質測定為600nkat/mg(Bailey and Linko，1990)。
純化之β －葡萄糖苷酶之熱穩定性係於不同溫度下測定。該反應利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質，於0.1毫克/毫升BSA存在時於pH5.0下進行60分鐘。橙色嗜熱子囊菌β G_81於75℃時穩定。曲黴菌參考酶(Novozym 188)於高達60℃時維持100%活性。
實施例9.純化來自嗜熱枝頂孢菌ALKO4245之木聚醣酶
嗜熱枝頂孢菌ALKO4245以實施例1所述之方式培養。培養上清液於70℃下培養24小時，之後以超過濾濃縮。純木聚醣酶藉由疏水交互作用及陽離子交換層析法然後以凝膠過濾連續純化得到。木聚醣酶活性利用樺木木聚糖作為受質測定(IUPAC法1987)。利用牛血清白蛋白作為標準物以BioRad Protein Assay Kit(Bio－Rad Laboratories)分析蛋白質。
濃縮培養上清液被置於以含1莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀緩衝液pH6.0平衡之HiPrep 16/10丁基FF疏水性管柱。結合蛋白質以從上述緩衝液至5毫莫耳磷酸鉀pH6.0之線性梯度沖提。蛋白質餾份於120至15mS/cm之廣泛電導區域內沖提。
來自疏水性管柱之檢體被置於以8毫莫耳醋酸鈉pH4.5平衡之HiTrap SP XL陽離子交換管柱。該蛋白質不與管柱結合但係於檢體裝填淋洗時被沖出。此沖提物經超過濾濃縮。如上述重複進行疏水性層析。收集未結合之蛋白質並冷凍乾燥。
該溶解檢體被裝入以含0.15莫耳氯化鈉之20毫莫耳磷酸鈉緩衝液pH7.0平衡之Superdex 75 HR10/30凝膠過濾管柱。以11.2毫升滯留體積自管柱被沖出之蛋白質經SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳判斷為純物質。該純化蛋白質之分子量根據分子量標準物(預染SDS－PAGE標準物,Broad Range,Bio－Rad)評估為60kDa。該名為At XYN_60之蛋白質於50℃下之特定活性被測定為1800nkat/mg(IUPAC法1987，利用樺木木聚糖作為受質)。相對活性於60及70℃下相較於50℃分別增加約1.2倍及1.65倍(10分鐘，pH5.0)。對MUG2(4－甲基繖形基－β －D－纖維二糖苷糖)、MUL(4－甲基繖形基－β －D－乳糖苷糖)及MUG3(4－甲基繖形基－β －D－纖維三糖苷糖)之特定活性分別為54、33及78nkat/mg(50℃，pH5.0，10分鐘)。此結果與家族10木聚醣酶亦顯示對芳基吡喃葡糖苷之活性之事實一致(Biely et al.1997)。
實施例10.純化來自橙色嗜熱子囊菌ALKO4242之木聚醣酶
橙色嗜熱子囊菌ALKO4242以實施例1所述之方式培養。純木聚醣酶藉由疏水交互作用、陰離子及陽離子交換層析法然後以凝膠過濾連續純化得到。木聚醣酶活性利用樺木木聚糖作為受質測定(IUPAC法1987)。利用牛血清白蛋白作為標準物以BioRad Protein Assay Kit(Bio－Rad Laboratories)分析蛋白質。
培養上清液被置於以含0.7莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀緩衝液pH6.0平衡之HiPrep 16/10苯基Sepharose FF疏水性管柱。結合蛋白質以二步驟沖提法沖提。先將鹽濃度降低至0.2莫耳硫酸銨，然後以從含0.2莫耳硫酸銨之20毫莫耳磷酸鉀pH6.0至5毫莫耳磷酸鉀pH6.0之線性梯度進行沖提。該蛋白質以0.2莫耳硫酸銨沖提(等電點＝39mS/cm)。
該檢體於10DG管柱(Bio－Rad)中脫鹽並被置於以15毫莫耳Tris－HCL pH7.0平衡之HiTrap DEAE FF陰離子交換管柱。蛋白質不與陰離子交換管柱結合但於淋洗時被沖出。該檢體之電導性藉加水調整至對應20毫莫耳醋酸鈉pH4.5之電導性，且藉超過濾於濃縮時將pH調整至4.5。
該檢體被置於以20毫莫耳醋酸鈉pH4.5平衡之HiTrap SP XL陽離子交換管柱。結合蛋白質以從該平衡緩衝液至含1莫耳氯化鈉之相同緩衝液之線性梯度沖提。該酶於1至7mS/cm之電導區被沖提。該檢體經冷凍乾燥且之後溶解於水。
凍乾檢體被溶解於水且置於以含0.15莫耳氯化鈉之20毫莫耳磷酸鈉pH7.0平衡之Superdex 75 HR 10/30凝膠過濾管柱。該蛋白質以對應分子量26kDa之滯留體積自管柱中被沖提。該蛋白質以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳分析為純物質。該純蛋白質之分子量根據分子量標準物(預染SDS－PAGE標準物,Broad Range,Bio－Rad)評估為30kDa。該名為Ta XYN_30之純化蛋白質之等電點以PhastSystem(Pharmacia)測定約為6.8。Ta XYN_30於50℃下之特定活性被測定為4800nkat/mg(IUPAC法1987，利用樺木木聚糖作為受質)。
實施例11. 內含胺基酸定序
內含肽係利用Q－TOF1(Micromass)儀器以電灑游離結合串聯質譜技術(ESI－MS/MS)定序。蛋白質首先被烷基化且經消化成為胰蛋白肽。所產生之胜肽在置入Q－TOF1儀器之前經過脫鹽且部分以納米液相層析技術(逆相)分離。嗜熱毛殼菌與嗜熱枝頂孢菌纖維二糖水解酶之內含肽序列顯示於表2。毛殼菌CBH之胜肽係於該對應cbh基因被選殖後得到。自枝頂孢菌CBH所測定之胜肽未被利用於選殖該對應基因。
I/L＝具有相同分子量且無法以ESI－MS/MS分析區別之白胺酸及異白胺酸Q/K＝麩醯胺酸及離胺酸之分子量僅差0.036Da且無法以ESI－MS/MS分析區別
嗜熱枝頂孢菌ALKO4245、嗜熱毛殼菌ALKO4261及橙色嗜熱子囊菌ALKO4242之純化內切葡聚糖酶、β －葡萄糖苷酶及木聚醣酶之內含肽序列列於表3、表4及表5。
(a I/L＝具有相同分子量且無法以ESI－MS/MS分析區別之白胺酸及異白胺酸，Q/K＝麩醯胺酸及離胺酸之分子量僅差0.036Da且無法以ESI－MS/MS分析區別
(a I/L＝具有相同分子量且無法以ESI－MS/MS分析區別之白胺酸及異白胺酸
實施例12. 建構橙色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌之基因體庫
嗜熱毛殼菌ALKO4265及嗜熱枝頂孢菌ALKO4245之基因體庫係根據廠商說明構築於Lambda DASHII載體(Stratagene,USA)。根據Raeder and Broda(1985)之方法分離之染色體DNAs經Sau3A部分消化。該經消化之DNAs被分級且該所選大小之片段(約5至23kb)被去磷酸化且與BamHI消化之lambda載體臂連接。該連接混合物依製造商說明(Stratagene,USA)使用Gigapack III Gold包裝提取物包裝。嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌基因體庫之滴度分別為3.6×106 及3.7×105 pfu/ml及其放大基因庫分別為6.5×1010 及4.2×108 pfu/ml。
根據廠商說明，使用Lambda FIXII/Xho I部分補齊載體套組(Stratagene,USA)來構建橙色嗜熱子囊菌ALKO4242及嗜熱毛殼菌ALKO4261之基因體庫。根據Raeder and Broda(1985)之方法分離之染色體DNAs經Sau3A部分消化。該經消化之DNAs被分級且該所選大小之片段(約6至23kb)被補齊且與XhoI消化之lambda FIXII載體臂連接。該連接混合物依製造商說明(Stratagene,USA)使用GigapackIII Gold包裝提取物包裝。橙色嗜熱子囊菌ALKO4242及嗜熱毛殼菌ALKO4261基因體庫之滴度分別為0.2×106 及0.3×106 pfu/ml及其放大基因庫分別為1.8×109 及3.8×109 pfu/ml。
實施例13. 自橙色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌中選殖纖維二糖水解酶(cbh/cel7)基因
利用標準分子生物學技術進行DNA(質體、DNA片段)分離及酶處理、大腸桿菌轉型等。所使用之基本方法係描述於標準分子生物學手冊例如Sambrook et al.(1989)及Sambrook and RUSsell(2001)。
用於篩選依實施例12所述建構之基因體庫之探針經PCR放大，該PCR反應使用橙色嗜熱子囊菌ALKO4242、嗜熱毛殼菌ALKO4265及嗜熱枝頂孢菌ALKO4245基因體DNAs作為模板。根據公開核苷酸序列(WO03/000941，Hong et al.,2003b)設計一些於PCR反應中測試之引子。該PCR反應混合物包含50毫莫耳Tris－HCl pH9.0、15毫莫耳硫酸銨、0.1% Triton X－100、1.5毫莫耳氯化鎂、0.2毫莫耳dNTPs、5微莫耳之各引子及1單位Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)及約0.5至1微克之基因體DNA。PCR反應之條件如下：95℃初次變性5分鐘，後續進行30次95℃變性1分鐘，嗜熱子囊菌ALKO4242及毛殼菌ALKO4265模板於62℃(±8℃梯度)黏合1分鐘或枝頂孢菌ALKO4245模板於58℃(±6℃梯度)黏合1分鐘，72℃延長2分鐘及72℃最後延長10分鐘。
預期大小(自公開cbh序列計算)之DNA產物得自所有使用之基因體模板。預期大小之DNA片段自最特定之PCR反應分離且該些片段被選殖導入pCRBlunt－TOPO載體(Invitrogen,USA)。該插入物之特徵藉由定序及與經數種限制酶類消化之基因體DNAs進行南方墨點雜交決定。被選用來作為篩選橙色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌基因體庫之探針之PCR片段如表6所示。
自所有這些探針推導出之胺基酸序列與糖基水解酶家族7(Henrissat,1991；Henrissat and Bairoch,1993)之一些公開CBH序列具有同源性(NCBI美國國家生物科技資訊中心之BLAST程式,2.2.9版；Altschul et al.,1990)。
來自表6之質體之插入物根據廠商說明(Roche,Germany)以地高辛(digoxigenin)標示，且以標記探針片段篩選放大基因體庫(2×105 至3×105 菌斑)。濾紙雜交溫度為68℃且該濾紙在室溫下以2xSSC－0.1% SDS清洗5分鐘2次，之後於68℃下以0.1xSSC－0.1% SDS加上所使用之同源探針清洗15分鐘2次。各次雜交中得到一些陽性菌斑。在篩選枝頂孢菌ALKO4245基因體庫時，一些陽性菌斑與考慮中之探針強烈雜交但除此之外有一些菌斑與探針之雜交較弱。這表示其他纖維二糖水解酶基因可能存在該基因體中，因而導致交叉反應。4至5個強烈雜交菌斑自嗜熱子囊菌ALKO4242及毛殼菌ALKO4265基因體庫篩選被純化。在嗜熱枝頂孢菌ALKO4245的例子中，6個純化菌斑中有4個與使用之探針微弱雜交。噬菌體DNAs被分離並以南方墨點雜交特徵化。該選出與探針雜交之限制片段被次選殖導入pBluescript II KS＋載體且該選殖株之相關區域被定序。
總共選殖4個cbh/cel7基因；1個來自橙色嗜熱子囊菌ALKO4242，1個來自嗜熱毛殼菌ALKO4265及2個來自嗜熱枝頂孢菌ALKO4245(早期這二個被編號為At_cbh_C及At_cbh_A，後來分別被命名為At cel7A及At cel7B)。表7摘列有關用於篩選基因之探針、自其中分離基因之噬菌體選殖株、包含啟動子及終止子區域之全長基因之選擇限制片段、質體名稱及帶有這些質體之大腸桿菌菌株之DSM儲存編號之資訊。
有關基因及該推導蛋白質序列(SEQ ID NO：1至8)之相關資訊分別摘列於表8及9。
嗜熱毛殼菌ALKO4265及嗜熱枝頂孢菌ALKO4245之純化CBH蛋白質之胜肽序列(表2)可見於含Ct cel7A及At cel7A基因之選殖株之推導胺基酸序列。因此，結論是編碼嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌之純化CBH/Cel7蛋白質之基因係被選殖。
(a包含終止密碼子(b不包含終止密碼子
(a預測信號序列係利用SignalP V3.0程式(Nielsen et al.,1997；Bendtsen et al.,2004)進行；NN值利用神經元網路得到及HMM值利用隱馬爾可夫模型得到。(b纖維素結合結構域(CBD)，顯示C端CBD區域之胺基酸(M1(Met#1)包含在編號中)(c不包含預測信號序列。該預測於ExPASy伺服器利用Compute pI/MW工具進行(Gasteiger et al.,2003)。(d N－X－S/T序列數量。
橙色嗜熱子囊菌Cel7A及嗜熱枝頂孢菌Cel7A之推導胺基酸序列(不含CBD之核心)彼此之同源性最高(以尼德曼－王氏整體排列演算法EMBOSS 3.0.0 Needle分析,參數設定為Matrix EBLOSUM62，間隔罰分10.0及延長罰分0.5；Needleman and Wunsch,1970)。此外，推導之嗜熱枝頂孢菌Cel7A與推導之嗜熱毛殼菌Cel7A具有較低之一致性。嗜熱枝頂孢菌Cel7B與本發明之CBH/Cel7序列有最大差異。
推導之毛殼菌Cel7A序列與WO03/000941中所述之嗜熱毛殼菌、嗜熱西塔利菌(Scytalidium thermophilum)及澳洲梭孢殼黴(Thielavia australiensis)CBHI多肽具有最高一致性(以尼德曼－王氏整體排列演算法EMBOSS Needle分析，見上述)。同樣的，推導之橙色嗜熱子囊菌Cel7A序列與橙色嗜熱子囊菌公開之CBHI具有高度一致性(WO03/000941，Hong et al.,2003B)。嗜熱枝頂孢菌Cel7B與先前公開序列具有顯著較低之一致性，其與來自水稻(Oryza sativa)之CBHI多肽更密切相關。與推導之嗜熱枝頂孢菌Cel7A序列同源性最高的是黑耳(Exidia glandulosa)及嗜熱枝頂孢菌CBHI聚核苷酸(WO03/000941)。排列顯示該選殖之橙色嗜熱子囊菌ALKO4242、嗜熱毛殼菌ALKO4265及嗜熱枝頂孢菌ALKO4245序列編碼與糖基水解酶家族7之多肽具有高度同源性之CBH蛋白質，因此這些序列被命名為Cel7A或Cel7B(Henrissat et al.1998)。
表10顯示橙色嗜熱子囊菌ALKO4242、嗜熱毛殼菌ALKO4265及嗜熱枝頂孢菌ALKO4245梭孢殼黴cbh/cel7基因推導之胺基酸序列互相比較及進一步與資料庫中之序列比較。
實施例14. 於里氏木黴產製重組CBH/Cel7蛋白質
建構表現質體以生產來自橙色嗜熱子囊菌(Ta Cel7A)、嗜熱毛殼菌(Ct Cel7A)及嗜熱枝頂孢菌(At Cel7A，At Cel7B；早期這些蛋白質之暫時編號分別為At_CBH_C及At_CBH_A)之重組CBH/Cel7。建構之表現質體列於表11。包括其本身信號序列之重組cbh/cel7基因以PCR被與里氏木黴cbh1(cel7A)啟動子完全融合。轉錄終止由里氏木黴cel7A終止子確認且如Paloheimo et al.(2003)所述利用構巢曲黴(A.nidulans)amdS標記基因以篩選轉化子。線性表現盒(expression cassettes)(圖2)於EcoRI消化後自載體骨架分離且被轉化導入里氏木黴A96及A98原生質體(二菌株皆將編碼4種主要纖維素酶CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B及EGII/Cel5A之基因刪除)。轉化以Penttila et al.(1987)所述之方式進行，加上如Karhunen et al.(1993)所述以乙醯胺為唯一氮源篩選之修飾。轉化子於篩選盤上在產孢於PD上之前透過單一分生孢子被純化。
(a用於里氏木黴轉化之表現盒利用E coRI消化以自載體骨架中分離。(b自基因體cbh1/cel7A終止子區域在終止密碼子之後的核苷酸數量。括弧中顯示位於3’端用於剪切基因體基因片段之限制位點。
轉化子產製之CBH/Cel7係由搖瓶培養之培養上清液分析(50毫升)。轉化子係於以5%磷酸二氫鉀緩衝之複合乳糖基底纖維素酶誘導培養基(Joutsjoki et al.1993)於28℃下培養7天。纖維二糖水解酶活性根據van Tilbeurgh et al.(1988)利用4－甲基繖形基－β －D－乳糖苷糖(MUL)為受質測定。選擇轉化子之基因型係利用南方墨點法確認，其中一些基因體消化物被包含且各別之表現盒被用來作為探針。Ta Cel7A、Ct Cel7A、At Cel7A及At Cel7B蛋白質之異源性表現以SDS－PAGE分析，之後以考馬斯染色。結果發現包含結合表現盒之At Cel7B轉化子在SDS－PAGE中並無法偵測到纖維二糖水解酶活性或異源性蛋白質，這表示於木黴中利用上述實驗設計所產製之At Cel7B在偵測濃度以下。
重組CBH/Cel7酶製劑以pH理想值及熱穩定性特徵化。得自橙色嗜熱子囊菌、嗜熱毛殼菌及嗜熱枝頂孢菌之重組CBH/Cel7蛋白質之pH理想值係利用4－甲基繖形基－β －D－乳糖苷糖(MUL)作為受質於pH 3.0至8.0之範圍內於通用馬氏(Mcllvaine)緩衝液中測定(圖3A)。Ct Cel7A及At Cel7A酶類之pH理想值為5.5，再往上活性開始逐漸下降。重組粗Ta Cel7A之pH理想值為5.0(圖3A)。重組Cel7酶類之熱穩定性藉由測量MUL於通用馬氏緩衝液中以理想pH下作用1小時之活性決定。如結果所示，Ta Cel7A及Ct Cel7A於70℃下保持60%以上之活性，然而At Cel7A於較高溫度下(≧65℃)明顯較不穩定(圖3B)。
選擇之CBH/Cel7轉化子以28℃培養於實驗室生物反應器中之上述培養基達3至4天，pH控制於4.4±0.2(氨氣/磷酸)以獲得用於應用測試之物質。離心回收上清液並以Seitz－K 150及EK過濾器(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH,Bad Kreuznach,Germany)過濾。
實施例15. 於里氏木黴產製重組橙色嗜熱子囊菌Cel7A＋CBD融合蛋白質
將橙色嗜熱子囊菌Cel7A(AF478686，Hong et al.,2003b；SEQ ID NO：1)與連接子及里氏木黴CBHI/Cel7A(AR088330,Srisodsuk et al.1993)之CBD(＝Tr CBD)融合，隨後以FI20055205/US11/119526(2005年4月29日提出)所述之方法於里氏木黴中產製融合蛋白(SEQ ID NO：28對應SEQ ID NO：27之核酸)。此外，橙色嗜熱子囊菌Cel7A與連接子及嗜熱毛殼菌Cel7A(SEQ ID NO：7)之CBD(Ct CBD)融合。為此，以PCR利用下列引子合成連接子及嗜熱毛殼菌Cel7A之CBD之編碼序列：5’－TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTCGACCGTCCCTGGCCTTGAC－3’(前置序列)及5’－TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTCCAGCAAATCAGGGAACTG－3’(反置序列)。
PCR反應混合物包含1xDyNAzymeTM EXT反應緩衝液(Finnzymes,Finland)、15毫莫耳鎂離子、0.2毫莫耳dNTPs、2微莫耳之各引子、0.6單位之DyNAzymeTM EXT DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)及約75納克/30微升包含嗜熱毛殼菌全長cel7A基因之模板DNA。PCR反應條件如下：98℃初次變性2分鐘，後續進行30次98℃變性30秒，於68℃(±4℃梯度)黏合30秒，72℃延長30秒及72℃最後延長10分鐘。PCR反應中之特定DNA片段係於64至68.5℃之黏合溫度範圍內得到。嗜熱毛殼菌之合成CBD片段被連接到橙色嗜熱子囊菌Cel7A基因之後，在結構域之間形成GPIGST之接合點。在質體中之PCR放大片段經定序確認(SEQ ID NO：29)。該建構之融合Cel7A基因與里氏木黴cbh1(Cel7A)啟動子完全融合。轉錄終止由里氏木黴Cel7A終止子確認且如Paloheimo et al.(2003)所述利用構巢曲黴amdS標記基因以篩選轉化子。
線性表現盒於NotI消化後自載體骨架分離且被轉化導入里氏木黴A96原生質體。轉化以PenttiIa et al.(1987)所述之方式進行,加上如Karhunen et al.(1993)所述以乙醯胺為唯一氮源篩選之修飾。轉化子於篩選盤上在產孢於PD上之前透過單一分生孢子被純化。
橙色嗜熱子囊菌Cel7A＋CBD(SEQ ID NO：28及30)產製之轉化子由搖瓶培養(50毫升)之培養上清液分析。轉化子係於以5%磷酸二氫鉀pH5.5緩衝之複合纖維素酶誘導培養基(Joutsjoki et al.1993)培養7天。纖維二糖水解酶活性根據van Tilbeurgh et al.(1988)利用4－甲基繖形基－β －D－乳糖苷糖(MUL)為受質測定。選擇轉化子之基因型係利用南方墨點法確認，其中一些基因體消化物被包含且表現盒被用來作為探針。SDS－PAGE分析顯示重組橙色嗜熱子囊菌Cel7A＋CBD酶類於里氏木黴中被生產成為穩定融合蛋白。
生產Ta Cel7A＋Tr CBD融合蛋白(SEQ ID NO：28)之選擇轉化子亦以28℃被培養於2公升實驗室生物反應器中之上述培養基達3至4天，pH控制於4.4±0.2(氨氣/磷酸)以獲得用於應用測試之物質。離心回收上清液並以Seitz－K 150及EK過濾器(Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH,Bad Kreuznach,Germany)過濾。
實施例16. 比較純化重組纖維二糖水解酶之米氏常數(Michaelis－Menten)及纖維二糖抑制常數
測定於里氏木黴中異源性產製之纖維二糖水解酶(實施例14及15)之米氏常數及纖維二糖抑制常數。該酶類以實施例2所述之方式純化。純化酶類之蛋白質濃度係以它們在280nm波長處之吸光性利用理論分子消光係數測量，其自胺基酸序列計算得到(Gill and von Hippel,1989)。
Tr CBHI/Cel7A、Ta CBH/Cel7A、At CBH/Cel7A及Ct CBH/Cel7A之動力學常數(Km及kcat值)及纖維二糖抑制常數(Ki)係利用CNPLac(2－氯－4－硝基苯基－β －D－乳糖苷糖)作為受質於室溫下(22℃)在50毫莫耳磷酸鈉緩衝液pH5.7中測量。在測量抑制常數(Ki)万面，在5種抑制劑濃度範圍(0至100微莫耳或0至400微莫耳)(其與Ki值有關)存在的情況下使用8種不同受質濃度(31至4000微莫耳)。所有試驗均在微量滴定盤上進行且總反應體積為200微升。初速率在各種情況下利用Varioscan(Thermolabsystems)微量低定盤讀取儀，透過405nm之測量值，藉由連續監測氯－硝苯酚陰離子(CNP，2－氯－4－硝苯酚)之釋放測量。結果由CNP標準曲線(從0至100微莫耳)計算。所使用之酶濃度為：Tr CBHI/Cel7A 2.46μM,Ta CBH/Cel7A 1.58μM,Ct CBH/Cel7A 0.79μM及At CBH/Cel7A 3μM。Km及kcat常數係利用Origin程式,自套用米氏方程式計算。使用林－柏氏(Lineweaver－Burk)作圖法、再作圖(LWB斜率對[Glc2；纖維二糖〕)及漢氏(Hanes)作圖法區別競爭型及混合型抑制及決定抑制常數(Ki)。
動力學測量之結果顯示於表12及13。如表中所示，Ct CBH/Cel7A明顯具有較高之CNPLac轉換數(kcat)，同時專一性常數(kcat/Km)相較於里氏木黴之CBHI/Cel7A為高。纖維二糖(Glc2)係所有測量之纖維素酶之競爭型抑制劑，且Tr CBHI/Cel7A(作為對照組)被纖維二糖抑制之作用最強(也就是Ki值最低)。At CBH/Cel7A之抑制常數較Tr CBHI/Cel7A高出7倍以上。這些結果顯示所有三種新穎之纖維二糖水解酶均能更有效的作用於纖維二糖水解，因為其纖維二糖抑制作用相較於里氏木黴Cel7A纖維二糖水解酶I為低。
實施例17. 以重組纖維二糖水解酶水解結晶纖維素(Avicel)
純化之重組纖維二糖水解酶Ct Cel7A、Ta Cel7A、Ta Cel7A＋Tr CBD、TaCel7A＋Ct CBD、At Cel7A以及Ct Cel7A之核心版(如下)於二種溫度下(45及70℃)以等莫耳之量測試水解結晶纖維素之作用；純化之里氏木黴Tr Cel7A及其核心版(如下)被用來比較。結晶纖維素(Ph101，Avicel；Fluka,Bucsh,Switzerland)水解試驗於1.5毫升試管規模50毫莫耳醋酸鈉pH5.0中進行。Avicel及酶溶液(1.4微莫耳)於45℃或70℃下搖晃，且該反應混合物之最後體積為325微升。監測水解24小時並於6個不同時間點採集樣品且加入含9倍體積94%乙醇及1倍體積1莫耳甘胺酸(pH11)之163微升停止試劑以停止反應。該溶液通過Millex GV13 0.22微米過濾單位(Millipore,Billerica,MA,USA)過濾。在上清液中所形成之可溶性還原糖利用纖維二糖標準曲線(50至1600微莫耳纖維二糖)，以對羥基苯甲酸肼(PA－HBAH)方法(Lever,1972)測定。將新鮮調配之0.1莫耳PAHBAH(Sigma－Aldrich,St.Louis,MO,USA)於0.5莫耳氫氧化鈉(100微升)溶液加入150微升之過濾檢體並煮沸10分鐘，之後令該溶液於冰上冷卻。測量該檢體於405nm之吸光度。
天然形式具有CBD之纖維二糖水解酶之核心版依下列方式製備：Ct Cel7A及Tr Cel7A經溶蛋白消化作用以移除纖維素結合結構域。以木瓜蛋白酶(木瓜乳膠，14單位/毫克，Sigma)消化天然纖維二糖水解酶係於反應混合物中以37℃進行24小時，該反應混合物由10毫莫耳L－半胱胺酸及2毫莫耳EDTA於50毫莫耳醋酸鈉緩衝液(pH5.0)加上木瓜蛋白酶組成(測試二種木瓜蛋白酶濃度：反應混合物中Cel7A總量之1/5或1/10之木瓜蛋白酶)。所形成之核心蛋白如上述以DEAE Sepharose FF(Pharmacia,Uppsala,Sweden)陰離子交換管柱純化。該產物以SDS－PAGE分析。
於45及70℃下之水解結果分別如圖4及5所示。該結果清楚地顯示，所有纖維二糖水解酶相較於最新之纖維二糖水解酶里氏木黴Cel7A在二種溫度下皆表現更快更完全之水解。在70℃下，來自橙色嗜熱子囊菌ALKO4242及嗜熱毛殼菌ALKO4265之熱穩定性纖維二糖水解酶優於里氏木黴Cel7A，嗜熱子囊菌Cel7A核心與里氏木黴Cel7A之CBD連接者(Ta Cel7A＋Tr CBD)亦然。令人意外的是，本研究分離及選殖之纖維二糖水解酶具有CBD時，其相較於使用同樣酶濃度之最新纖維二糖水解酶里氏木黴Cel7A(CBHI)於慣用之水解溫度45℃下，具有較佳之結晶纖維素水解速率及產物形成。這些結果亦與酶製劑(At Cel7A及Ct Cel7A)相同，該些酶製劑係純化自原始宿主且於Avicel水解測試(50℃，24小時)(實施例2，表1)。
實施例18.選殖嗜熱枝頂孢菌ALKO4245、嗜熱毛殼菌ALKO4261及橙色嗜熱子囊菌ALKO4242之內切葡聚糖酶基因
如實施例13所述使用標準分子生物學技術。枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌基因體庫之建構已於實施例12中描述。
源自枝頂孢菌及毛殼菌純化內切葡聚糖酶之胜肽分別與一些糖基水解酶家族45之內切葡聚糖酶具有同源性，例如白馬蘭諾菌(Melanocarpus albomyces)Cel45A內切葡聚糖酶(AJ515703)及特異腐質黴(Humicola insolens)內切葡聚糖酶(A 35275)。源自嗜熱子囊菌內切葡聚糖酶之胜肽與公開之橙色嗜熱子囊菌EGl內切葡聚糖酶序列(AF487830)具有幾乎100%之一致性。為了放大用於篩選枝頂孢菌及毛殼菌基因體庫之探針，根據胜肽序列設計簡併引子。蛋白質序列中胜肽之順序及引子之對應正向或反向特性係由與公開之同源性內切葡聚糖酶之比較推導而來。引子序列及該對應胜肽列於表14。由於嗜熱子囊菌胜肽與公開序列幾乎具有100%一致性，該內切葡聚糖酶基因直接從該基因體DNA以PCR放大。
(a用於設計引子序列之胜肽之胺基酸(b N＝A、C、G或T；R＝A或G；Y＝C或T(c非源自純化之枝頂孢菌EG_40蛋白質但源自與EG_40同源之白馬蘭諾菌Cel45A序列(AJ515703)之胜肽(d於寡核苷酸5’端加入HindIII限制位點(e於寡核苷酸5’端加入EcoRI限制位點
利用基因體DNA為模板，以前置(TAYTGGGAYTGYTGYAARCC)及反置(RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA)引子放大供篩選基因體庫之嗜熱枝頂孢菌cel45A基因專一性探針。PCR反應混合物包含50毫莫耳Tris－HCl pH9.0、15毫莫耳硫酸銨、0.1% Triton X－100、1.5毫莫耳氯化鎂、0.1毫莫耳dNTPs、0.5微莫耳之各引子、1單位Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)及約0.5微克之枝頂孢菌基因體DNA。PCR反應之條件如下：95℃初次變性5分鐘，後續進行30次95℃變性1分鐘，於50至60℃黏合1分鐘，72℃延長2分鐘及72℃最後延長10分鐘。在放大嗜熱毛殼菌cel7B基因(編碼Ct EG_54)專一性探針方面，使用前置引子(GGAATTCGAYCARACNGARCARTA)及反置引子(GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT)。PCR反應混合物包含10毫莫耳Tris－HCl pH8.8、50毫莫耳氯化鉀、0.1% Triton X－100、1.5毫莫耳氯化鎂、0.2毫莫耳dNTPs、250皮莫耳之各引子、2單位Dynazyme II DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)及約2微克之毛殼菌基因體DNA。PCR反應之條件如上述，除了黏合係於45至50℃進行。
自枝頂孢菌之PCR反應得到二個PCR產物。自洋菜膠體分離約0.6及0.8kb大小之DNA片段且被選殖導入pCR4－TOPOTA載體(Invitrogen,USA)以分別形成質體pALK1710及pALK1711。該DNA產物之特徵藉由定序及與經過數種限制酶類消化之基因體枝頂孢菌DNA進行南方墨點雜交決定。以二個片段在嚴格清洗條件下得到之雜交模式顯示，自枝頂孢菌基因體庫可篩選出二個假定之內切葡聚糖酶基因。這二個PCR產物所推導出之胺基酸序列與糖基水解酶家族45之一些公開內切葡聚糖酶序列具有同源性(BLAST程式,美國國家生物科技資訊中心；Altschul et al.,1990)。
自毛殼菌PCR反應得到一個預期大小(推測自同源之特異腐質黴內切葡聚糖酶序列A35275)之PCR產物。此約0.7kb之DNA片段被選殖導入pCR4－TOPOTA載體(Invitrogen,USA)以形成質體pALK2005並依上述方法分析。此PCR產物所推導出之胺基酸序列與糖基水解酶家族7之一些公開纖維素酶序列具有同源性(NCBI美國國家生物科技資訊中心之BLAST程式，2.2.9版；Altschul et al.,1990)。
來自質體pALK1710、pALK1711及pALK2005之插入物以限制酶消化分離,並根據廠商說明(Roche,Germany)以地高辛標示。約1至2×105 個來自放大枝頂孢菌或毛殼菌基因體庫之菌斑被篩選出來。雜交溫度為68℃且該濾紙在室溫下以2xSSC－0.1% SDS清洗5分鐘2次，之後於68℃下以0.1xSSC－0.1% SDS清洗15分鐘2次。一些陽性菌斑被選出，其中自每次篩選純化5至6個強烈雜交菌斑。噬菌體DNAs被分離並以南方墨點雜交法分析。與探針雜交之限制片段被次選殖導入pBluescript II KS＋載體(Stratagene,USA)且該相關部分被定序。在所有情況下，該次選殖之噬菌體片段包含感興趣之全長基因。表15摘列有關用於篩選內切葡聚糖酶基因之探針、自其中分離基因之噬菌體選殖株、包含啟動子及終止子區域之全長基因之選擇限制片段、包含次選殖噬菌體片段之質體名稱及帶有這些質體之大腸桿菌菌株於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH菌株保存中心(DSM)儲存編號之資訊。
橙色嗜熱子囊菌cel5A基因(編碼EG_28)(SEQ ID NO：9)以PCR反應直接從分離之基因體DNA放大。用於放大之前置(ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTCGGCTCTCTCGTGCTC)及反置(AACTGAGGCATAGAAACTGACGTCATATT)引子係根據公開之橙色嗜熱子囊菌egl基因(AF487830)設計。該PCR反應混合物包含1xPhUSion HF緩衝液、0.3毫莫耳dNTPs、0.5微莫耳之各引子、2單位PhUSion TM DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)及約0.25微克之嗜熱子囊菌基因體DNA。PCR反應之條件如下：95℃初次變性5分鐘，後續進行25次95℃變性30秒，於57至67℃黏合30秒，72℃延長2.5分鐘及72℃最後延長5分鐘。該包含完整基因(從啟動至終止密碼子)之1.3kb放大產物被選殖為SacII－PstI片段以導入pBluescript II KS＋載體。二個獨立選殖株被定序且一個選殖株被選擇並命名為pALK1926。包含pALK1926之大腸桿菌菌株於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH菌株保存中心(DSM)之儲存編號為DSM17326。
該基因及推導蛋白質序列(SEQ ID NO：9至16)之相關資訊分別摘列於表16及17。純化之枝頂孢菌EG_40(基因At c el45A)、毛殼菌EG_54(基因Ct cel7B)及嗜熱子囊菌EG_28(基因Ta cel5A)內切葡聚糖酶之胜肽序列可見於該選殖基因之對應推導胺基酸序列，這表示適當基因被選殖。
(a包含終止密碼子(b不包含終止密碼子
(a信號序列之預測係利用SignalP V3.0程式進行(Nielsen et al.,1997；Bendtsen et al.,2004)；NN值利用神經元網路得到及HMM值利用隱馬爾可夫模型得到。(b蛋白質中纖維素結合結構域之存在性，顯示C端CBD之胺基酸(根據全長多肽編號)。(c不包含預測信號序列。該預測於ExPASy伺服器利用Compute pI/MW工具進行(Gasteiger et al.,2003)。(d利用NetNGlyc 1.0程式預測假定之N糖基化位點N－X－S/T(Gupta et al.,2004)。(e依據Hong et al.,2003a。
枝頂孢菌EG_40(At Cel45A)及EG_40_like(At Cel45B)、毛殼菌EG_54(Ct Cel7B)及嗜熱子囊菌EG_28(Ta Cel5A)內切葡聚糖酶之推導蛋白質序列與糖基水解酶家族45(枝頂孢菌)、家族7(毛殼菌)及家族5(嗜熱子囊菌)之纖維素酶具有同源性，因此確認這些被分離之基因係這些基因家族之成員。與枝頂孢菌內切葡聚糖酶EG_40/Cel45A及EG_40_like/Cel45B具有最近同源性的分別是太瑞斯梭孢殼黴(CQ827970,77.3%一致性)及嗜熱毀絲黴(Myceliophthora thermophila)(AR094305，66.9%一致性)之內切葡聚糖酶(表18)。二個自枝頂孢菌家族45分離之內切葡聚糖酶互相僅具有53.7%之一致性。在這些酶類中，只有EG_40/Cel45A包含纖維素結合結構域(CBD)。
與毛殼菌EG_54/Cel7B內切葡聚糖酶之預測蛋白質序列具有最近同源性的是白馬蘭諾菌Cel7A纖維素酶序列(AJ515704)。這二個蛋白質序列之間之一致性為70.6%。
分離之橙色嗜熱子囊菌內切葡聚糖酶之蛋白質序列與公開之橙色嗜熱子囊菌EGI之序列(AF487830，表18)完全相同。其與埃莫森籃狀菌之β －葡聚糖酶序列(AX254752，71.1%一致性)有最近之同源性。
實施例19. 於里氏木黴產製重組之內切葡聚糖酶
建構表現質體以如實施例14所述之方法生產重組枝頂孢菌EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG_28/Cel5A蛋白質。線性表現盒(表19)以限制酶消化後自載體骨架分離、轉化導入里氏木黴A96且依實施例14所述純化轉化子。
(a用於里氏木黴轉化之表現盒係利用EcoRI或NotI消化以自載體骨架中分離。(b顯示包含在表現盒中之選殖基因之終止密碼子後的核苷酸數量。括弧中顯示位於基因之3’區域用來建構表現盒之限制位點。
轉化子產製之內切葡聚糖酶係由搖瓶培養之培養上清液分析(50毫升)。轉化子如實施例14所述之方式培養且重組蛋白質之酶活性實質上如Bailey and Nevalainen 1981；Haakana et al.2004所述，於50毫莫耳檸檬酸鹽緩衝液pH4.8中測量50℃下培養上清液中還原糖類自羧甲基纖維素(2%(重量/體積)CMC)之釋出。重組蛋白質之產製亦以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳自培養上清液分析。枝頂孢菌EG_40專一性多株抗體於兔中產製(芬蘭赫爾辛基大學)。EG_40之表現利用ProBlot西方墨點AP系統(Promega)以抗EG_40抗體進行西方墨點法分析。選擇轉化子之基因型係利用表現盒作為探針以南方墨點法分析。
異源性產製之內切葡聚糖酶之pH理想值利用羧甲基纖維素作為受質，於pH 4.0至8.0之範圍內於通用馬氏緩衝液中測定。如圖6A所示，枝頂孢菌EG_40/Cel45A蛋白質之pH範圍最廣泛(4.5至6.0)，最理想係於pH5.5。其他異源性產製之內切葡聚糖酶如枝頂孢菌EG_40_like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG－28/Cel5A之理想pH值分別為pH5.0至5.5及6.0。這些內切葡聚糖酶酶活性之理想溫度如上述於50至85℃之溫度範圍內測定。枝頂孢菌EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG_28/Cel5A之最高活性作用溫度分別被測定為75、60及75℃(圖6B)。
選擇之轉化子如實施例14所述，於2公升實驗室生物反應器中培養4天(28℃，pH4.2)，以獲得用於應用測試之物質。
實施例20. 選殖嗜熱枝頂孢菌ALKO4245、嗜熱毛殼菌ALKO4261及橙色嗜熱子囊菌ALKO4242之β－葡萄糖苷酶基因
如實施例13所述使用標準分子生物學技術。枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌基因體庫之建構已於實施例12中描述。
源自枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌純化β －葡萄糖苷酶之胜肽分別與一些糖基水解酶家族3之β －葡萄糖苷酶具有同源性，例如溶纖枝頂孢菌(Acremonium cellulolyticus)(BD168028)、綠木黴(Trichoderma viride)(AY368687)及埃莫森籃狀菌(AY072918)之β －葡萄糖苷酶。為了放大用於篩選枝頂孢菌、毛殼菌或嗜熱子囊菌基因體庫之探針，根據胜肽序列設計簡併引子。蛋白質序列中胜肽之順序及引子之對應正向或反向特性係由與公開之同源性β －葡萄糖苷酶之比較推導而來。引子序列及該對應胜肽列於表20。
(a用於設計引子序列之胜肽之胺基酸(b為了降低簡併性，一些密碼子之選擇係根據真菌喜好。N＝A、C、G或T；R＝A或G；S＝C或G；Y＝C或T(c非源自純化之枝頂孢菌β G_101蛋白質但源自與β G_101具有同源性之溶纖枝頂孢菌β －葡萄糖苷酶序列(BD 168028)之胜肽
利用枝頂孢菌、毛殼菌或嗜熱子囊菌基因體DNA為模板，以表20所列之引子組合物放大供篩選建構基因體庫之探針。PCR反應混合物包含50毫莫耳Tris－HCl pH9.0、15毫莫耳硫酸銨、0.1% Triton X－100、1.5毫莫耳氯化鎂、0.1至0.2毫莫耳dNTPs、0.25微莫耳之各引子、1單位Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)及約0.5微克之基因體DNA。PCR反應之條件如下：95℃初次變性5分鐘，後續進行30次95℃變性1分鐘，於40℃(枝頂孢菌DNA為模板)、50℃(以毛殼菌DNA為模板)或63℃(以嗜熱子囊菌DNA為模板)黏合1分鐘，72℃延長2至3分鐘及72℃最後延長5至10分鐘。
自洋菜膠體分離預期大小(從同源性β －葡萄糖苷酶序列BD168028、AY072918及AY368687推測)之特定PCR產物。約1.8kb(枝頂孢菌)、1.5kb(毛殼菌)及1.52kb(嗜熱子囊菌)大小之DNA片段被選殖導入pCR4－TOPOTA載體(Invitrogen,USA)以分別形成質體pALK1924、pALK1935及pALK1713。該DNA產物之特徵藉由定序及與經過數種限制酶類消化之基因體DNA進行南方墨點雜交決定。以嚴格清洗條件下得到之雜交模式顯示，自枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌基因體庫可分離出一個假定之β －葡萄糖苷酶基因。所有三個PCR產物所推導出之胺基酸序列與糖基水解酶家族3之一些公開β －葡萄糖苷酶序列具有同源性(BLAST程式,美國國家生物科技資訊中心；Altschul et al.,1990)。
來自質體pALK1713、pALK1924及pALK1935之插入物以限制酶消化分離,並根據廠商說明(Roche,Germany)以地高辛標示。約1至2×105 個來自放大枝頂孢菌、毛殼菌或嗜熱子囊菌基因體庫之菌斑如實施例18所述被篩選出來。一些陽性菌斑被選出，其中自每次篩選純化5至6個強烈雜交菌斑。噬菌體DNAs被分離並以南方墨點雜交法分析。與探針雜交之限制片段被次選殖導入pBluescript II KS＋載體(Stratagene,USA)且該相關部分被定序。在所有情況下，該次選殖之噬菌體片段包含感興趣之全長基因。表21摘列有關用於篩選β －葡萄糖苷酶基因之探針、自其中分離基因之噬菌體選殖株、包含啟動子及終止子區域之全長基因之選擇限制片段、包含次選殖噬菌體片段之質體名稱及帶有這些質體之大腸桿菌菌株於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH菌株保存中心(DSM)儲存編號之資訊。
該基因及推導蛋白質序列(SEQ ID NO：21至26)之相關資訊分別摘列於表22及23。純化之枝頂孢菌β G_101(At Cel3A)、毛殼菌β G_76(Ct Cel3A)及嗜熱子囊菌β G_81(Ta Cel3A)蛋白質之胜肽序列可見於該選殖基因之對應推導胺基酸序列，這表示適當基因被選殖。
(a包含終止密碼子(b不包含終止密碼子
(a信號序列之預測係利用SignalP V3.0程式進行(Nielsen et al.,1997；Bendtsen et al.,2004)；NN值利用神經元網路得到及HMM值利用隱馬爾可夫模型得到。(b蛋白質中纖維素結合結構域之存在性。(c不包含預測信號序列。該預測於ExPASy伺服器利用Compute pI/MW工具進行(Gasteiger et al.,2003)。(d利用NetNGlyc 1.0程式預測推測之N糖基化位點N－X－S/T(Gupta et al.,2004)。
枝頂孢菌βG_101/Cel3A、毛殼菌βG_76/Cel3A及嗜熱子囊菌βG_81/Cel3Aβ－葡萄糖苷酶之推導蛋白質序列與糖基水解酶家族3之酶類具有同源性，因此確認這些被分離之基因屬於此基因家族。與枝頂孢菌、毛殼菌及嗜熱子囊菌β －葡萄糖苷酶最相近之對應物分別為該些於稻瘟病菌(β －葡萄糖苷酶，AY849670)、粗糙脈孢菌(假設性，XM_324308)及埃莫森籃狀菌(β －葡萄糖苷酶，AY072918)中者(表24)。最高之序列一致性(73.2%)發現於嗜熱毛殼菌β G_76/Cel3A與粗糙脈孢菌之假設性蛋白質之間，這表示新穎之酶類基因被選殖。
實施例21. 於里氏木黴產製重組之β －葡萄糖苷酶
建構表現質體以如實施例14所述之方法生產重組枝頂孢菌βG_101/Cel3A、毛殼菌βG_76/Cel3A及嗜熱子囊菌βG_81/Cel3A蛋白質。線性表現盒(表25)以限制酶消化後自載體骨架分離、轉化導入里氏木黴A96或A33(二菌株皆將編碼4種主要纖維素酶CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B及EGII/Cel5A之基因刪除)且依實施例14所述純化轉化子。
(a用於里氏木黴轉化之表現盒係利用EcoRI或NotI消化以自載體骨架中分離。(b顯示包含在表現盒中之選殖基因之終止密碼子後的核苷酸數量。括弧中顯示位於基因之3’區域用來建構表現盒之限制位點。
轉化子產製之內切葡聚糖酶係由搖瓶培養之培養上清液分析(50毫升)。轉化子如實施例14所述之方式培養且重組蛋白質之酶活性依Bailey and Nevalainen 1981所述，利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷受質於培養上清液中測量。重組蛋白質之產製亦以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳自培養上清液分析。此外，嗜熱子囊菌β G_81之表現如實施例19所述以抗β G_81抗體經西方墨點法確認。選擇轉化子之基因型係利用表現盒作為探針以南万墨點法分析。
異源性產製之β －葡萄糖苷酶之pH理想值利用4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質，於pH3.0至8.0之範圍內於通用馬氏緩衝液中測定。枝頂孢菌β G_101、毛殼菌β G_76及嗜熱子囊菌β G_81之pH理想值分別為pH4.5、5.5及4.5(圖7A)。這些β －葡萄糖苷酶酶活性之理想溫度如上述於50至85℃之溫度範圍內測定。枝頂孢菌βG_101/Cel3A、毛殼菌βG_76/Cel3A及嗜熱子囊菌βG_81/Cel3A之最高活性作用溫度分別被測定為70、65及75℃(圖7B)。
選擇之轉化子如實施例14所述，於2公升實驗室生物反應器中培養4天(28℃，pH4.2)，以獲得用於應用測試之物質。
實施例22. 選殖嗜熱枝頂孢菌ALKO4245及橙色嗜熱子囊菌ALKO4242之木聚醣酶基因
如實施例13所述使用標準分子生物學技術。枝頂孢菌基因體庫之建構已於實施例12中描述。
源自枝頂孢菌純化木聚醣酶之胜肽與糖基水解酶家族10之木聚醣酶具有同源性，例如灰腐質黴XYNI(AB001030)。源自嗜熱子囊菌木聚醣酶之所有胜肽與公開之橙色嗜熱子囊菌XYNA序列(AJ132635)完全一致，因此證實該純化之蛋白質係相同之酶。因此嗜熱子囊菌木聚醣酶基因係利用PCR自基因體DNA放大。
為了放大用於自基因體庫篩選枝頂孢菌木聚醣酶基因之探針，根據胜肽序列設計簡併引子(實施例11，表5)。蛋白質序列中胜肽之順序及引子之對應正向或反向特性係由與同源性特異腐質黴XYNI序列(AB001030)之比較推導而來。正向引子序列(GAYGGYGAYGCSACYTAYATG)係根據胜肽3(胺基酸2至8)且反向引子(YTTYTGRTCRTAYTCSAGRTTRTA)係根據胜肽1(胺基酸4至11)。
預期大小之PCR產物(推測自同源性特異腐質黴XYNI序列AB001030)自該反應得到。此約0.7kb大小之DNA片段被選殖導入pCR4－TOPOTA載體(Invitrogen,USA)以形成質體p A L K 1714且經定序將其特徵化。該PCR產物之推導胺基酸序列與糖基水解酶家族10之一些公開木聚醣酶序列具有同源性(BLAST程式,美國國家生物科技資訊中心；Altschul et al.,1990)。
來自質體pALK1714之插入物以限制酶消化分離，並根據廠商說明(Roche,Germany)以地高辛標示。約1至2×105 個來自放大枝頂孢菌基因體庫之菌斑如實施例18所述被篩選出來。一些陽性菌斑被選出，其中有5個強烈雜交菌斑被純化。噬菌體DNAs被分離並以南方墨點雜交法分析。與探針雜交之0.3kb XbaI限制片段被次選殖導入pBluescript II KS＋載體(Stratagene,USA)以形成質體pALK1725。pALK1725之相關部分被定序並發現其包含嗜熱枝頂孢菌全長xyn10A基因(SEQ ID NO：19)。包含pALK1725之大腸桿菌菌株於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH菌株保存中心之儲存編號為DSM16726。
橙色嗜熱子囊菌xyn10A基因(SEQ ID NO：17)利用PCR反應直接自分離之基因體DNA放大。用於放大該基因之前置(TTATACCGCGGGAAGCCATGGTTCGACCAACGATCCTAC)及反置(TTATAGGATCCACCGGTCTATACTCACTGCTGCAGGTCCTG)引子係根據公開之橙色嗜熱子囊菌xynA基因(AJ132635)設計。PCR反應混合物包含50毫莫耳Tris－HCl pH9.0、15毫莫耳硫酸銨、0.1% Triton X－100、1.5毫莫耳氯化鎂、0.3毫莫耳dNTPs、1微莫耳之各引子、1單位Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes,Finland)及約0.5微克之嗜熱子囊菌基因體DNA。PCR反應之條件如下：95℃初次變性5分鐘，後續進行30次95℃變性1分鐘，於60至66℃黏合1分鐘，72℃延長3分鐘及72℃最後延長10分鐘。該包含完整基因(從啟動至終止密碼子)之1.9kb放大產物被選殖為SacII－BamHI片段以導入pBluescript II KS＋載體。三個獨立選殖株被定序且一個選殖株被選擇並命名為pALK1715。包含pALK1715之大腸桿菌菌株於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH菌株保存中心之儲存編號為DSM16724。
該基因及推導蛋白質序列(SEQ ID NO：17至20)之相關資訊分別摘列於表26及27。純化之枝頂孢菌XYN_60及嗜熱子囊菌XYN_30蛋白質之胜肽序列可見於該選殖基因(分別為At xyn10A及Ta xyn10A)之對應推導胺基酸序列，這表示適當基因被選殖。
(a包含終止密碼子(b不包含終止密碼子
(a信號序列之預測係利用SignalP V3.0程式進行(Nielsen et al.,1997；Bendtsen et al.,2004)；NN值利用神經元網路得到及HMM值利用隱馬爾可夫模型得到。(b碳水化合物結合結構域CBD之存在性，顯示C端CBD之胺基酸(根據全長多肽編號)。(c不包含預測信號序列。該預測於ExPASy伺服器利用Compute pI/MW工具進行(Gasteiger et al.,2003)。(d利用NetNGlyc 1.0程式預測假定之N糖基化位點N－X－S/T(Gupta et al.,2004)。(e根據Lo Leggio et al.,1999
枝頂孢菌及嗜熱子囊菌木聚醣酶之推導蛋白質序列與糖基水解酶家族10之一些酶類具有同源性，這表示該對應基因係家族10木聚醣酶之成員。與枝頂孢菌XYN_60/Xyn10A最相近之對應物係灰腐質黴XYLI(AB001030)，其顯示與XYN_60具有67.1%一致性(表28)。該分離之橙色嗜熱子囊菌XYN_30/Xyn10A木聚醣酶之預測蛋白質序列與公開之橙色嗜熱子囊菌XYNA(P23360，表28)之序列完全相同。最相近之同源性被發現於黑曲黴菌之木聚醣酶序列(A62445，69.7%一致性)。
實施例23. 於里氏木黴產製重組之木聚醣酶
建構表現質體以如實施例14所述之方法生產重組枝頂孢菌XYN_60/Xyn10A及嗜熱子囊菌XYN_30/Xyn10A蛋白質。線性表現盒(表29)以限制酶消化後自載體骨架分離、轉化導入里氏木黴A96且依實施例14所述純化轉化子。
(a用於里氏木黴轉化之表現盒係利用E coRI消化以自載體骨架中分離。(b顯示包含在表現盒中之選殖基因之終止密碼子後的核苷酸數量。括弧中顯示位於基因之3’區域用來建構表現盒之限制位點。
轉化子產製之木聚醣酶係由搖瓶培養之培養上清液分析(50毫升)。轉化子如實施例14所述之方式培養且重組蛋白質之酶活性依Bailey and Poutanen 1989所述，於50毫莫耳檸檬酸鹽緩衝液pH5.3中測量50℃下培養上清液中還原糖類自樺木木聚糖(1%重量/體積)之釋出。重組蛋白質之產製亦以SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳自培養上清液分析。此外，二種木聚醣酶之表現如實施例19所述以抗XYN_30或抗XYN_60抗體經西方墨點法確認。選擇轉化子之基因型係利用表現盒作為探針以南方墨點法分析。
嗜熱子囊菌XYN_30/Xyn10A係於里氏木黴中產製，且該異源性產製之蛋白質之pH理想值利用樺木木聚糖作為受質，於pH 3.0至8.0之範圍內於通用馬氏緩衝液中測定(圖8A)。該理想pH值測定為pH4.5。XYN_30之理想作用溫度經測定為75℃(圖8B)。
選擇之轉化子如實施例14所述，於2公升實驗室生物反應器中培養4天(28℃，pH4.2)，以獲得用於應用測試之物質。
實施例24.重組纖維二糖水解酶於水解之表現
純化之重組纖維二糖水解酶之表現係於加入純化里氏木黴酶類之水解試驗中評估。令純化酶類之對照混合物作用於數種經前處理之受質以進行水解。依實施例14及15所述之方式取得包含不同選殖CBH/Cel7酶類之里氏木黴培養過濾物，且利用實施例2所述之親和層析法純化CBH酶類。此外，純里氏木黴纖維素酶(依Suurnakki et al.,2000所述純化)被用於酶混合物中。試驗中所使用之纖維二糖水解酶為：橙色嗜熱子囊菌ALKO4242 CBH(Ta Cel7A)橙色嗜熱子囊菌ALKO4242 CBH(Ta Cel7A)，其經基因工程連接里氏木黴之CBD(Ta Cel7A＋Tr CBD)橙色嗜熱子囊菌ALKO4242 CBH(Ta Cel7A)，其經基因工程連接嗜熱毛殼菌之CBD(Ta Cel7A＋Ct CBD)嗜熱枝頂孢菌ALKO4245 CBH(At Cel7A)嗜熱毛殼菌ALKO4265 CBH(Ct Cel7A)
各種接受測試之CBH/Cel7(劑量14.5毫克/克受質乾物質)與里氏木黴之EGII/Cel5A(3.6毫克/克)或包含里氏木黴EGI/Cel7B(1.8毫克/克)、EGII/Cel5A(1.8毫克/克)、木聚醣酶pI 9(Tenkanen et al.1992)(5000nkat/克)及乙醯木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase)(AXE)(Sundberg and Poutanen,1991)(250nkat/克)之混合物一起使用。所有混合物均額外添加來自商業酶製劑Novozym188之β－葡萄糖苷酶(176nkat/克乾重)。包含酶混合物及懸浮於0.05莫耳醋酸鈉之10毫克(乾物質)/毫升受質之三份重複試管於45℃下以磁攪拌混合培養達48小時。同時準備含不活化酶類及對應受質之參考檢體。
水解產物之釋出係以葡萄糖為標準之DNS法測定還原糖含量(表30)。
下列受質於試驗中使用：結晶纖維素(Avicel)
經清洗蒸氣前處理之雲杉纖維(以3%重量/重量二氧化硫浸滲20分鐘，之後於215℃下以蒸氣前處理5分鐘)，乾物質25.9%(SPRUCE)。
經清洗濕氧化玉米桿纖維(WOCS)經清洗蒸氣前處理柳木纖維(於210℃下前處理14分鐘)，乾物質23.0%(WILLOW)。
在表30中，不同之纖維二糖水解酶根據相同之蛋白質水解劑量加以比較。結果顯示在纖維素受質(Avicel及雲杉纖維)方面，具有基因工程連接之CBD之橙色嗜熱子囊菌之Cel7A相較於里氏木黴CBHI/Cel7A顯示明顯較高之水解作用。無CBD之橙色嗜熱子囊菌Cel7A對這些受質之作用效率較低。嗜熱枝頂孢菌及嗜熱毛殼菌纖維二糖水解酶對一些受質之表現相較於里氏木黴CBHI/Cel7A之表現亦較佳。
當受質包含顯著量之半纖維素(柳木及玉米桿)時，CBHI/Cel7A酶類明顯需要額外之半纖維素酶及內切葡聚糖酶才能有效水解。若額外之半纖維素酶不存在時，具有基因工程連接之CBD之橙色嗜熱子囊菌Cel7A再次呈現明顯最高之水解活性。若加上最重要之半纖維素分解酶類(木聚醣酶、乙醯木聚糖酯酶及EGI)，具有基因工程連接之CBD之橙色嗜熱子囊菌Cel7A同樣呈現最高水解活性。嗜熱枝頂孢菌Cel7A較里氏木黴酶更有效且嗜熱毛殼菌Cel7A產生之水解產物與里氏木黴CBHI/Cel7A之效果相同。里氏木黴之纖維素結合結構域相較於嗜熱毛殼菌之CBD在橙色嗜熱子囊菌Cel7A之水解表現上似乎有較佳效率，即使該差異相當小。
我們可以做出以下結論，當木黴菌酶類混合物中之CBHI/Cel7A被本發明所產製之纖維二糖水解酶取代，就具有基因連接之CBD之橙色嗜熱子囊菌Cel7A而言，其以此實驗設計所測定之水解活性被明顯改善，就嗜熱枝頂孢菌Cel7A及嗜熱毛殼菌Cel7A而言亦得到改善。同時考慮到本發明所產製之纖維二糖水解酶具有較佳之熱穩定性，結果顯示在45℃以上之較高溫度下使用本發明產製之纖維二糖水解酶可明顯改善纖維素酶酶混合物之表現。
實施例25. 重組內切葡聚糖酶於水解之表現
在加入純化CBH/Cel7及CBH/Cel6酶類之水解試驗中，比較包含內切葡聚糖酶之製劑對數種經前處理受質之作用。依實施例19所述之方式取得包含不同選殖內切葡聚糖酶酶類之里氏木黴培養過濾物。利用熱處理(60℃，2小時，pH5)自混合物中移除不耐熱蛋白質以富集該酶類，且上清液被使用於水解試驗。此外，純里氏木黴纖維素酶(依Suurnakki et al.,2000所述純化)被用於酶混合物中。試驗中所使用之內切葡聚糖酶為：嗜熱枝頂孢菌ALKO4245內切葡聚糖酶At EG_40/Cel45A(ALKO4245 EG_40)嗜熱枝頂孢菌ALKO4245內切葡聚糖酶At EG_40_like/Cel45B(ALKO4245 EG_40_like)橙色嗜熱子囊菌ALKO4242內切葡聚糖酶Ta EG_28/Cel5A(ALKO4242 EG_28)
下列受質於試驗中使用：經清洗蒸氣前處理之雲杉纖維(以3%二氧化硫浸滲20分鐘，之後於215℃下以蒸氣前處理5分鐘)，乾物質25.9%(SPRUCE)。
蒸氣爆炸玉米桿纖維(於210℃下以蒸氣前處理5分鐘)，乾物質31.0%(SECS)
接受測試之內切葡聚糖酶(劑量840nkat/克乾物質，根據IUPAC，1987之內切葡聚糖酶對HEC之活性)與里氏木黴之纖維二糖水解酶(CBHI/Cel7A，8.1毫克/克乾物質及CBHII/Cel6A，2.0毫克/克乾物質)或與具有基因連接之里氏木黴CBD之橙色嗜熱子囊菌Cel7A(10.1毫克/克乾物質)一起使用。里氏木黴之純化(Suurnakki et al.,2000)EGI(Cel7B)及EGII(Cel5A)亦被包含於試驗中以供比較。所有混合物均額外添加來自Novozym 188之β －葡萄糖苷酶(為了使β －葡萄糖苷酶總劑量達560nkat/克乾重，使用相對高劑量以補償不同EG製劑背景活性之差異)。三份重複試管於45℃下混合培養達48小時，並準備含不活化酶類及對應受質之參考檢體。水解產物之釋出係以葡萄糖為標準之DNS法測定還原糖含量(表31)。
在表31中，不同之內切葡聚糖酶根據相同之水解活性劑量加以比較。這有利於試驗中所使用對受質(羥乙基纖維素)專一性活性較低之酶類，且低估對羥乙基纖維素具有高專一性活性酶類之效率。在任何情況下，結果顯示嗜熱枝頂孢菌內切葡聚糖酶在混合物之二種纖維二糖水解酶的影響下仍具有非常好的水解表現。嗜熱枝頂孢菌內切葡聚糖酶之表現與里氏木黴EGI/Cel7B類似，其對於含半纖維素之玉米桿受質為非常有效之酶，因為具有強烈木聚醣酶之副活性。橙色嗜熱子囊菌內切葡聚糖酶Cel5A(ALKO4242 EG_28)相較於里氏木黴酶類顯示較低之水解活性。
我們可以做出以下結論，來自嗜熱枝頂孢菌之內切葡聚糖酶相較於對應之木黴酶類在此實驗設計所測定之水解效率上表現相同或更好。同時考慮到本發明所描述之內切葡聚糖酶之熱穩定性，結果顯示在45℃以上之較高溫度下使用本發明所述之內切葡聚糖酶可改善纖維素酶酶混合物之表現。
實施例26. 於高溫下水解經蒸氣前處理之雲杉
令乾物質含量25.9%之經清洗蒸氣爆炸雲杉纖維(以3%重量/重量二氧化硫浸滲20分鐘，之後於215℃下以蒸氣前處理5分鐘)以10毫克/毫升之濃度懸浮於5毫升之0.05莫耳醋酸鈉緩衝液中。此受質利用不同酶混合物於試管中以不同調整溫度之水浴磁攪拌水解達72小時。於各採樣點中，取出三份重複水解中之試管，煮沸10分鐘以終止酶水解，將其離心，分析上清液中水解反應之產物。僅包含受質之空白組(僅加入緩衝液以取代酶類)亦以對應條件培養。
利用下列成分準備嗜熱性纖維素酶之混合物：嗜熱性CBH/Cel7製劑，其包含具有以基因連接之里氏木黴CBHI/Cel7A之CBD之橙色嗜熱子囊菌ALKO4242 Cel7A。該蛋白質製劑以實施例15所述之方式產製並根據實施例2純化，形成純化之Ta Cel7A＋Tr CBD製劑，其蛋白質含量為5.6毫克/毫升。
嗜熱性內切葡聚糖酶製劑，其包含嗜熱枝頂孢菌ALKO4245內切葡聚糖酶At EG_40/Cel45A。該蛋白質如實施例19所述於里氏木黴中產製。為了富集該嗜熱性成分，該耗盡培養基經熱處理(60℃下2小時)。所得到之製劑包含4.9毫克/毫升之蛋白質及422nkat/毫升之內切葡聚糖酶活性(根據IUPAC，1987)。
依實施例21所述製備嗜熱性β －葡萄糖苷酶製劑，其包含橙色嗜熱子囊菌ALKO4242β －葡萄糖苷酶Taβ G_81/Cel3A。為了富集該嗜熱性成分，該醱酵液經熱處理(65℃下2小時)。所得到之製劑包含4.3毫克/毫升之蛋白質及6270nkat/毫升之β －葡萄糖苷酶活性(根據Bailey and Linko，1990)。
這些酶製劑以下列方式組合(每10毫升之混合物)：CBH/Cel7製劑4.51毫升，內切葡聚糖酶製劑5.19毫升及β －葡萄糖苷酶製劑0.29毫升。此混合物被當作嗜熱性酶類之「混合物1」使用。
為了比較及參考之用，組合下列成分(每10毫升)以建構商用里氏木黴酶類之最新混合物：8.05毫升之Celluclast 1,5L FG(來自Novozymes A/S)及1.95毫升之Novozym 188(來自Novozymes A/S)，此被稱為「里氏木黴酶類」。
酶類使用之劑量根據混合物之濾紙活性單位(FPU)決定：「混合物1」於每1克乾物質之雲杉受質使用5.5FPU之劑量，及「里氏木黴酶類」於每1克乾物質之雲杉受質使用5.8FPU。
於水解後24、48及72小時收集檢體並經上述万式處理。利用以葡萄糖為標準之還原糖測定法(Bernfeld，1955)定量水解產物。水解產物之量於圖9以還原糖表示。
結果清楚地顯示本發明所述之酶類相較於最新里氏木黴酶類於55及60℃下對雲杉受質有較佳之表現。根據HPLC分析，自每10毫克乾雲杉受質最高可產生5.67毫克之糖類。由於酶劑量相對較低，最終糖產量明顯較低。對熱穩定性酶類而言，在55℃及60℃下以還原糖分析之糖產量理論值分別為66%及57%。對最新里氏木黴酶類而言，在55℃及60℃下分別只有31%及11%。
實施例27. 於高溫下水解經蒸氣前處理之玉米桿
令乾物質45.3%之蒸氣爆炸玉米桿纖維(於195℃下處理5分鐘)以10毫克/毫升之濃度懸浮於5毫升之0.05莫耳醋酸鈉緩衝液中。其處理及測量方式如實施例26所述。
利用下列成分準備本發明所述之嗜熱性纖維素酶之混合物：嗜熱性CBH製劑，其包含具有以基因連接之里氏木黴CBHI/Cel7A之CBD之橙色嗜熱子囊菌ALKO4242 Cel7A(Ta Cel7A＋Tr CBD，實施例15)。該製劑之蛋白質含量為31毫克/毫升。
包含嗜熱枝頂孢菌ALKO4245內切葡聚糖酶At EG_40/Cel45A之嗜熱性內切葡聚糖酶製劑以實施例19所述之方式產製。該濃縮之酶製劑包含2057 nkat/毫升之內切葡聚糖酶活性(根據IUPAC，1987)。
依實施例21所述製備包含橙色嗜熱子囊菌ALKO4242β －葡萄糖苷酶Taβ G_81/Cel3A之嗜熱性β －葡萄糖苷酶製劑，其具有11500 nkat/毫升之β －葡萄糖苷酶活性(根據Bailey and Linko，1990)。
嗜熱性木聚醣酶產物，其包含源自彎曲野野村菌(Nonomuraea flexuosa)DSM43186之AM24木聚醣酶。該產物利用如WO2005/100557所述之已經以表現盒p A LK 1502轉化之重組里氏木黴菌株產製。該固體產物溶解於水以形成10%溶液並得到具有208000 nkat/毫升木聚醣酶活性之酶製劑(依Bailey et al.,1992測定)。
這些酶製劑以下列方式組合(每10毫升之混合物)：CBH/Cel7製劑7.79毫升，內切葡聚糖酶製劑0.96毫升，β －葡萄糖苷酶製劑1.14毫升及木聚醣酶製劑0.31毫升。此混合物被當作嗜熱性酶類之「混合物2」使用。
為了比較及參考之用，組合下列成分(每10毫升)以建構商用里氏木黴酶類之最新混合物：8.05毫升之Celluclast 1,5L FG(來自Novozymes A/S)及1.95毫升之Novozym 188(來自Novozymes A/S)，此被稱為「里氏木黴酶類」。
於水解後24、48及72小時收集檢體並經上述方式處理。利用以葡萄糖為標準之還原糖測定法(Bernfeld,1955)定量水解產物。將含酶類檢體之結果減去受質空白組結果，且以還原糖表示之水解產物濃度如圖10所示。
結果清楚地顯示本發明所述之酶類相較於最新木黴酶類有較佳之表現。在45℃下，嗜熱性酶類之混合物相較於里氏木黴酶類顯示更有效率之水解：水解速度更快，同時得到更高之糖產量。根據HPLC分析，自每10毫克乾受質最高可產生5.73毫克之糖類(包括於使用之未清洗受質中之游離可溶性糖類)。因此，混合物2酶類之水解在48小時內幾乎作用完全。在55℃及57.5℃下，本發明所述之嗜熱性酶類相較於最新木黴酶類亦顯示明顯較佳之水解表現。
實施例28. 於高溫下利用熱穩定性木聚醣酶混合物水解經前處理之玉米桿
重複實施例27所述之方法，除了木聚醣酶產物XT 02026A3以包含於里氏木黴所產製之橙色嗜熱子囊菌ALKO4242木聚醣酶Ta XYN_30/Xyn10A之嗜熱性木聚醣酶製劑取代。如實施例23所述產製之醱酵液具有132000 nkat/毫升之木聚醣酶活性(依Bailey et al.,1992測定)。
這些酶製劑以下列方式組合(每10毫升之混合物)：CBH/Cel7製劑7.64毫升，內切葡聚糖酶製劑0.96毫升、β －葡萄糖苷酶製劑1.15毫升及木聚醣酶製劑0.25毫升。此混合物被當作嗜熱性酶類之「混合物3」使用。
為了比較及參考之用，組合下列成分(每10毫升)以建構商用里氏木黴酶類之最新混合物：8.05毫升之Celluclast 1,5L FG(來自Novozymes A/S)及1.95毫升之Novozym 188(來自Novozymes A/S)，此被稱為「里氏木黴酶類」。
於水解後24、48及72小時收集檢體並經上述方式處理。利用以葡萄糖為標準之還原糖測定法(Bernfeld,1955)定量水解產物。將含酶類檢體之結果減去受質空白組結果，且以還原糖表示之水解產物濃度如圖11所示。
結果清楚地顯示本發明所述之酶類混合物相較於最新木黴酶類有較佳之表現。在45℃下，嗜熱性酶類之混合物相較於里氏木黴酶類顯示更有效率之水解。在55℃及60℃下，本發明所述之嗜熱性酶類相較於最新木黴酶類清楚地顯示較佳之水解表現。新穎之酶混合物於60℃之表現與最新酶類於45℃之表現相同。
實施例29.於高溫下利用熱穩定性木聚醣酶混合物水解經前處理之雲杉
重複實施例28所述之万法，以清洗蒸氣爆炸雲杉纖維(以3%重量/重量二氧化硫浸滲20分鐘，之後於215℃下以蒸氣前處理5分鐘，乾物質含量為25.9%)為受質，水解溫度為45、55及60℃。
於水解後24、48及72小時收集檢體並經上述方式處理。利用以葡萄糖為標準之還原糖測定法(Bernfeld,1955)定量水解產物。將含酶類檢體之結果減去受質空白組結果，且以還原糖表示之水解產物濃度如圖12所示。
結果清楚地顯示本發明所述之酶類混合物相較於最新木黴酶類在所有測試溫度下具有較佳之表現。在45℃下，嗜熱性酶類之混合物相較於里氏木黴酶類顯示更有效率之水解，這明顯是因為在長期水解時具有較佳穩定性。本發明所述之酶類混合物在55℃之效率仍與45℃相同，然而最新混合物在此溫度下無法有效的作用於受質。本發明所述之嗜熱性酶類於60℃下呈現降低之水解作用，然而其表現幾乎與最新酶類於45℃之表現相同。
實施例30. 測定來自嗜熱枝頂孢菌ALKO4245、嗜熱毛殼菌ALKO4261及橙色嗜熱子囊菌ALKO4242之β －葡萄糖苷酶之葡萄糖抑制
由嗜熱枝頂孢菌ALKO4245、嗜熱毛殼菌ALKO4261及橙色嗜熱子囊菌ALKO4242菌株所產製之培養過濾液如實施例1中所述。這些製劑之β－葡萄糖苷酶活性(依Bailey and Linko,1990測量)分別為21.4、5.6及18.6 nkat/毫升。為了比較之用，本試驗亦包含商業酶類Celluclast 1,5L(β－葡萄糖苷酶534 nkat/毫升)及Novozym 188(β－葡萄糖苷酶5840 nkat/毫升)。
為了評估不同β －葡萄糖苷酶對葡萄糖抑制之敏感性，在不同濃度之葡萄糖存在下進行標準活性測定法。於β －葡萄糖苷酶活性測定之受質(對硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷)溶液中添加葡萄糖，令測試混合物中之葡萄糖濃度調整為0至0.5莫耳。除此葡萄糖添加之外，該測試使用標準方法進行(Bailey and Linko,1990)。不同葡萄糖濃度存在時之活性以不含葡萄糖之活性的百分比表示於圖13。
結果顯示來自嗜熱毛殼菌及橙色嗜熱子囊菌之β －葡萄糖苷酶受到葡萄糖抑制之影響相較於商用酶類中之β －葡萄糖苷酶為小：Novozym 188中之曲黴菌源性β－葡萄糖苷酶或Celluclast 1,5L中之木黴源性β－葡萄糖苷酶。嗜熱枝頂孢菌酶顯示與Celluclast之里氏木黴酶相同之作用。嗜熱毛殼菌酶明顯較不受高葡萄糖濃度之影響。因此這些結果顯示考慮到葡萄糖之抑制，在含高葡萄糖濃度之工業條件下使用新穎之β －葡萄糖苷酶(特別是來自嗜熱枝頂孢菌ALKO4242及嗜熱毛殼菌ALKO4261菌株)進行水解具有明顯之好處。
實施例31. 酶混合物於高溫下之濾紙活性
酶製劑之濾紙活性係根據IUPAC(1987)方法測定，除了酶反應於50至70℃之溫度下進行。計算之濾紙活性單位係根據試驗條件下於1小時內水解4%濾紙受質所需之酶含量。FPU活性被視為可代表酶製劑之總纖維素酶活性。
該酶混合物為依實施例27所述製備之混合物2、依實施例28所述製備之混合物3及混合物4。混合物4之製備如下述組合實施例27之酶製劑(每10毫升之混合物)：CBH/Cel7製劑7.84毫升，內切葡聚糖酶製劑0.99毫升及β －葡萄糖苷酶製劑1.17毫升。
作為參照用之酶混合物(代表最新混合物)為：依實施例26所述之「里氏木黴酶類」製備之「里氏木黴酶類A」。
「里氏木黴酶類B」之建構係組合(每10毫升)8.05毫升之Econase CE(AB Enzymes OY,Rajamaki,Finland之商用里氏木黴纖維素酶製劑)及1.95毫升之Novozym 188(來自Novozymes A/S)。
酶製劑於不同溫度下所測定之濾紙活性以標準(IUPAC，1987)條件(50℃)測得活性之百分比表示於圖14。
結果清楚顯示本發明之混合物相較於來自木黴及曲黴酶類之最新混合物在高溫下(60至70℃)具有較高之整體纖維素酶活性。
實施例32. 利用新穎之β －葡萄糖苷酶製備槐糖
高濃度之澱粉水解物混合物(Nutriose 74/968,Roquette)經依實施例21產製之橙色嗜熱子囊菌β G_81/Cel3A富集酶製劑處理，以產生包含顯著量之纖維素酶誘導物(槐糖)之糖混合物以克服葡萄糖阻遏。
Taβ G_81/Cel3A富集酶製劑被加入70%(重量/重量)Nutriose溶液中，使最終濃度成為1克總蛋白/升。該混合物之容器置於65℃之水浴中恆速攪拌培養3天，且被用來作為二種不同木黴菌株(A47及Rut－C30)之搖瓶培養基之碳來源。酶處理之作用係以7天搖瓶培養期間所形成之內切葡聚糖酶之活性測量。而參照培養於相同條件下以未經處理之Nutriose為碳來源進行。測試菌株於經Ta βG－81/Cel3A前處理之Nutriose培養基進行之搖瓶培養得到增加超過二倍之活性。結果顯示於圖15。
(1) the Centralbureau Voor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, the Nether－lands(2) the Centralbureau Voor Schimmelcultures at Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, The Nether－lands(3) Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ),Mascheroder Weg 1b,D－38124 Braunschweig,Germany(4) 〔在目前儲存期間結束後，檢體將於同意下被儲存以使菌株於本專利可行使時間過後可被取得。〕
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圖1纖維素酶及β －葡萄糖苷酶活性於6種測試真菌菌株上清液中之溫度依賴性。各溫度下之測試培養時間為60分鐘，測試pH值為5.0(MUL活性)或4.8(CMCase或BGU)。於60℃所測得之活性被當作100%之相對活性。A)橙色嗜熱子囊菌ALKO4239,B)橙色嗜熱子囊菌ALKO4242,C)嗜熱枝頂孢菌ALKO4245,D)嗜熱籃狀菌(Talaromyces thermophilus)ALKO4246,E)嗜熱毛殼菌ALKO4261,F)嗜熱毛殼菌ALKO4265。
圖2用於轉化里氏木黴原生質體以產生重組真菌蛋白質之表現盒之圖示。該重組基因係由里氏木黴c b h 1(Cel7A)啟動子(cbh1 prom)控制且藉由使用里氏木黴cbh1終止序列(cbh1 term)來確定轉錄終止。包含amdS基因作為轉化標記。
圖3 A)測定得自橙色嗜熱子囊菌ALKO4242、嗜熱毛殼菌ALKO4265及嗜熱枝頂孢菌ALKO4245之重組CBH/Cel7蛋白質製劑在50℃下作用於4－甲基繖形基－β －D－乳糖苷糖(MUL)達10分鐘之最佳pH值。結果以三次測量值之平均值(±標準差)表示。B)測量得自橙色嗜熱子囊菌ALKO4242、嗜熱毛殼菌ALKO4265及嗜熱枝頂孢菌ALKO4245之重組CBH/Cel7蛋白質製劑在最佳pH下作用於4－甲基繖形基－β －D－乳糖苷糖(MUL)達60分鐘之熱穩定性。結果以三次測量值之平均值(±標準差)表示。二個反應皆包含BSA(100微克/毫升)以作為穩定劑。
圖4以純化之重組纖維二糖水解酶於45℃下水解結晶纖維素(Avicel)。受質濃度1%(重量/體積)，pH5.0，酵素濃度1.4微莫耳。A)具有CBD之纖維二糖水解酶，B)不具CBD之纖維二糖水解酶(核心)。
圖5以純化之重組纖維二糖水解酶於70℃下水解結晶纖維素(Avicel)。受質濃度1%(重量/體積)，pH5.0，酵素濃度1.4微莫耳。A)具有CBD之纖維二糖水解酶，B)不具CBD之纖維二糖水解酶(核心)。
圖6A)於50℃下以CMC為受質進行達10分鐘之反應，以測定異源產製之枝頂孢菌EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG_28/Cel5A活性之pH依賴性。B)分別於pH5.5、4.8及6.0測量枝頂孢菌EG_40/Cel45A、EG_40_like/Cel45B及嗜熱子囊菌EG_28/Cel5A之最佳溫度。除了EG_28/Cel5A反應達10分鐘，該包含CMC作為受質之反應達60分鐘。添加BSA(100微克/毫升)以作為穩定劑。
圖7A)於50℃下以4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷為受質進行達10分鐘之反應，以測定異源產製之枝頂孢菌BG_101/Cel3A、毛殼菌BG_76/Cel3A及嗜熱子囊菌BG_81/Cel3A活性之pH依賴性。B)分別於pH4.5、5.5及4.5測量枝頂孢菌β G_101/Cel3A、毛殼菌β G_76/Cel3A及嗜熱子囊菌β G_81/Cel3A之最佳溫度。該包含4－硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷作為受質之反應進行達60分鐘，並添加BSA(100微克/毫升)以作為穩定劑。
圖8A)於50℃下以樺木木聚糖(birch xylan)為受質進行達10分鐘之反應，以測定異源產製之嗜熱子囊菌XYN_30/Xyn10A木聚醣酶活性之pH依賴性。B)於pH5.3進行達60分鐘之反應中測量XYN_30/Xyn10A之最佳溫度，並添加BSA(100微克/毫升)以作為穩定劑。
圖9於55及60℃下以嗜熱性酶類之混合物(混合物1)及里氏木黴酶類水解經清洗蒸氣爆炸之雲杉纖維(10毫克/毫升)。酶劑量以濾紙單位(FPU)/克之受質乾物質之劑量給予，FPU於50℃、pH5下測定。於pH5下攪拌水解達72小時。結果以三次測量值之平均值(±標準差)表示。
圖10 於45、55及57.5℃下以嗜熱性酶類之混合物(混合物2)及里氏木黴酶類水解經蒸氣爆炸之玉米桿(10毫克/毫升)。「混合物2」之酶劑量為5FPU/克之受質乾物質，及里氏木黴酶類之酶劑量為5FPU/克之Celluclast乾物質添加100 nkat/克之Novozym 188乾物質(濾紙活性於50℃、pH5下測定)。於pH5下伴隨攪拌進行水解達72小時。結果以三次測量值之平均值(±標準差)表示。該受質包含可溶性還原糖(約0.7毫克/毫升)。此背景糖含量自水解所形成之還原糖中減去。
圖11 於45、55及60℃下以包含得自橙色嗜熱子囊菌之新穎嗜熱性木聚醣酶之嗜熱性酶類混合物(混合物3)及里氏木黴酶類水解經蒸氣爆炸之玉米桿(10毫克/毫升)。「混合物3」之酶劑量為5FPU/克之受質乾物質，及里氏木黴酶類之酶劑量為5FPU/克之Celluclast乾物質添加100 nkat/克之Novozym 188乾物質(濾紙活性於50℃、pH5下測定)。於pH5下伴隨攪拌進行水解達72小時。結果以三次測量值之平均值(±標準差)表示。該受質包含可溶性還原糖(約0.7毫克/毫升)。此背景糖含量自水解所形成之還原糖中減去。
圖12 於45、55及60℃下以包含得自橙色嗜熱子囊菌之新穎嗜熱性木聚醣酶XYN_30/Xyn10A之嗜熱性酶類混合物(混合物3)及里氏木黴酶類水解經蒸氣爆炸之雲杉纖維(10毫克/毫升)。「混合物3」之酶劑量為5FPU/克之受質乾物質，及里氏木黴酶類之酶劑量為5FPU/克之Celluclast乾物質添加100 nkat/克之Novozym 188乾物質(濾紙活性於50℃、pH5下測定)。於pH5下伴隨攪拌進行水解達72小時。結果以三次測量值之平均值(±標準差)表示。
圖13 葡萄糖對於不同β －葡萄糖苷酶製劑活性之影響。以對硝基苯基－β －D－吡喃葡糖苷(p－nitrophenyl－β －D－glucopyranoside)為受質之標準測試於測試混合物中含葡萄糖時進行。該活性以葡萄糖不存在時所得到之活性的百分比表示。
圖14 從50至70℃之溫度下酶混合物之FPU活性，以標準條件下(50℃，1小時)之活性之百分比表示。
圖15 二種不同里氏木黴菌株之相對纖維素酶活性，該菌株生長於含未處理Nutriose(N0)或經BG_81/Cel3A前處理之Nutriose(NBG81)以作為碳來源之培養基中。
<110> Roa1 <120> 處理纖維素材料之方法及用於彼之酶類<130> 2051999 <160> 30 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 3192 <212> DNA <213> 橙色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus) <220> <221> CDS <222> (1514)..(2122) <223> <220> <221> Intron <222> (2123)..(2187) <223> <220> <221> CDS <222> (2188)..(2949) <223> <400> 1 <210> 2 <211> 457 <212> PRT <213> 橙色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus) <400> 2 <210> 3 <211> 3055 <212> DNA <213> 嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum) <220> <221> CDS <222> (972)..(1595) <223> <220> <221> Intron <222> (1596)..(1729) <223> <220> <221> CDS <222> (1730)..(2290) <223> <220> <221> Intron <222> (2291)..(2412) <223> <220> <221> CDS <222> (2413)..(2540) <223> <220> <221> Intron <222> (2541)..(2627) <223> <220> <221> CDS <222> (2628)..(2691) <223> <400> 3 <210> 4 <211> 459 <212> PRT <213> 嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum) <400> 4 <210> 5 <211> 3401 <212> DNA <213>嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum) <220> <221> CDS <222> (891)..(1299) <223> <220> <221> Intron <222> (1300)..(1387) <223> <220> <221> CDS <222> 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N＝未鑑定<220> <221> CDS <222> (768)..(2042) <223> <400> 15 <210> 16 <211> 425 <212> PRT <213> 嗜熱毛殼菌<220> <221> misc_feature <222> (2786)..(2786) <223> N＝未鑑定<400> 16 <210> 17 <211> 1943 <212> DNA <213> 橙色嗜熱子囊菌<220> <221> CDS <222> (13)..(256) <223> <220> <221> Intron <222> (257)..(329) <223> <220> <221> CDS <222> (330)..(370) <223> <220> <221> Intron <222> (371)..(444) <223> <220> <221> CDS <222> (445)..(493) <223> <220> <221> Intron <222> (494)..(561) <223> <220> <221> CDS <222> (562)..(683) <223> <220> <221> Intron <222> (684)..(786) <223> <220> <221> CDS <222> (787)..(932) <223> <220> <221> Intron <222> (933)..(1001) <223> <220> <221> CDS <222> (1002)..(1090) <223> <220> <221> Intron <222> (1091)..(1155) <223> <220> <221> CDS <222> (1156)..(1174) <223> <220> <221> Intron <222> (1175)..(1267) <223> <220> <221> CDS <222> (1268)..(1295) <223> <220> <221> Intron <222> (1296)..(1361) <223> <220> <221> CDS <222> (1362)..(1451) <223> <220> <221> Intron <222> (1452)..(1551) <223> <220> <221> CDS <222> (1552)..(1617) <223> <220> <221> Intron <222> (1618)..(1829) <223> <220> <221> CDS <222> (1830)..(1922) <223> <400> 17 <210> 18 <211> 329 <212> PRT <213> 橙色嗜熱子囊菌<400> 18 <210> 19 <211> 2955 <212> DNA <213> 嗜熱枝頂孢菌<220> <221> CDS <222> (1335)..(1671) <223> <220> <221> Intron <222> (1672)..(1806) <223> <220> <221> CDS <222> (1807)..(2032) <223> <220> <221> Intron <222> (2033)..(2117) <223> <220> <221> CDS <222> (2118)..(2802) <223> <400> 19 <210> 20 <211> 416 <212> PRT <213> 嗜熱枝頂孢菌<400> 20 <210> 21 <211> 5092 <212> DNA <213> 橙色嗜熱子囊菌<220> <221> CDS <222> (669)..(728) <223> <220> <221> Intron <222> (729)..(872) <223> <220> <221> CDS <222> (873)..(1015) <223> <220> <221> Intron <222> (1016)..(1082) <223> <220> <221> CDS <222> (1083)..(1127) <223> <220> <221> Intron <222> (1128)..(1183) <223> <220> <221> CDS <222> (1184)..(1236) <223> <220> <221> Intron <222> (1237)..(1300) <223> <220> <221> CDS <222> (1301)..(1717) <223> <220> <221> Intron <222> (1718)..(1776) <223> <220> <221> CDS <222> (1777)..(2489) <223> <220> <221> Intron <222> (2490)..(2599) <223> <220> <221> CDS <222> (2600)..(3469) <223> <220> <221> Intron <222>( 3470)..(3531) <223> <220> <221> CDS <222> (3532)..(3759) <223> <400> 21 <210> 22 <211> 843 <212> PRT <213> 橙色嗜熱子囊菌<400> 22 <210> 23 <211> 3510 <212> DNA <213> 嗜熱枝頂孢菌<220> <221> CDS <222> (391)..(447) <223> <220> <221> Intron <222> (448)..(539) <223> <220> <221> CDS <222> (540)..(685) <223> <220> <221> Intron <222> (686)..(759) <223> <220> <221> CDS <222> (760)..(1148) <223> <220> <221> Intron <222> (1149)..(1217) <223> <220> <221> CDS <222> (1218)..(3208) <223> <400> 23 <210> 24 <211> 861 <212> PRT <213> 嗜熱枝頂孢菌<400> 24 <210> 25 <211> 3392 <212> DNA <213> 嗜熱毛殼菌<220> <221> CDS <222> (608)..(2405) <223> <220> <221> Intron <222> (2406)..(2457) <223> <220> <221> CDS <222> (2458)..(2861) <223> <400> 25 <210> 26 <211> 734 <212> PRT <213> 嗜熱毛殼菌<400> 26 <210> 27 <211> 1631 <212> DNA <213> 橙色嗜熱子囊菌<220> <221> Intron <222> (610)..(674) <223> <220> <221> CDS <222> (675)..(1628) <223> <220> <221> CDS <222> (1)..(609) <223> <400> 27 <210> 28 <211> 521 <212> PRT <213> 橙色嗜熱子囊菌<400> 28 <210> 29 <211> 1734 <212> DNA <213> 橙色嗜熱子囊菌<220> <221> Intron <222> (610)..(674) <223> <220> <221> CDS <222> (1726)..(1731) <223> <220> <221> CDS <222> (675)..(1661) <223> <220> <221> CDS <222> (1)..(609) <223> <220> <221> Intron <222> (1662)..(1725) <223> <400> 29 <210> 30 <211> 534 <212> PRT <213> 橙色嗜熱子囊菌 <400> 30

Claims (37)

  1. 一種使用纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase；CBH)、內切葡聚糖酶(endoglucanase；EG)及β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase；BG)處理纖維素材料之方法，其中該CBH包含SEQ ID NO：4或6之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該CBH可得自嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum )。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該CBH可得自嗜熱枝頂孢菌BCRC 930093。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該EG包含SEQ ID NO：10、12、14或16之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段，且該BG包含SEQ ID NO：22、24或26之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該EG可得自橙色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus )、嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum )或嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum )。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該EG可得自橙色嗜熱子囊菌BCRC 930094、嗜熱枝頂孢菌BCRC 930093或嗜熱毛殼菌BCRC 930095。
  7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該BG可得自 橙色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus )、嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum )或嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum )。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該BG可得自橙色嗜熱子囊菌BCRC 930094、嗜熱枝頂孢菌BCRC 930093或嗜熱毛殼菌BCRC 930095。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中使用重組酶。
  10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該重組酶係由里氏木黴(Trichoderma reesei )產製。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該纖維素材料係木質纖維素(lignocellulosic)材料。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其包含使用木聚糖酶(xylanase)處理木質纖維素材料，該木聚糖酶具有SEQ ID NO：18或20之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段。
  13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該木聚糖酶可得自橙色嗜熱子囊菌或嗜熱枝頂孢菌。
  14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該木聚糖酶可得自橙色嗜熱子囊菌BCRC 930094或嗜熱枝頂孢菌BCRC 930093。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之方法，其中該等酶係同時或依序加入至纖維素材料。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該纖維素材料選自玉米桿(corn stover)、柳枝稷(switchgrass)、榖類蒿 木(cereal straw)、甘蔗渣(sugarcane bagasse)或木材衍生材料。
  17. 一種酶製劑，其包含纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase；CBH)、內切葡聚糖酶(endoglucanase；EG)及β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase；BG)，其中該CBH包含SEQ ID NO：4或6之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段。
  18. 如申請專利範圍第17項之酶製劑，其中該CBH可得自嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum )。
  19. 如申請專利範圍第18項之酶製劑，其中該CBH可得自嗜熱枝頂孢菌BCRC 930093。
  20. 如申請專利範圍第17項之酶製劑，其中該EG包含SEQ ID NO：10、12、14或16之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段，且該BG包含SEQ ID NO：22、24或26之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段。
  21. 如申請專利範圍第20項之酶製劑，其中該EG可得自橙色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus )、嗜熱枝頂孢菌(Acremonium thermophilum )或嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum )。
  22. 如申請專利範圍第21項之酶製劑，其中該EG可得自橙色嗜熱子囊菌BCRC 930094、嗜熱枝頂孢菌BCRC 930093或嗜熱毛殼菌BCRC 930095。
  23. 如申請專利範圍第20項之酶製劑，其中該BG可得自橙色嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus )、嗜熱枝 頂孢菌(Acremonium thermophilum )或嗜熱毛殼菌(Chaetomium thermophilum )。
  24. 如申請專利範圍第23項之酶製劑，其中該BG可得自橙色嗜熱子囊菌BCRC 930094、嗜熱枝頂孢菌BCRC 930093或嗜熱毛殼菌BCRC 930095。
  25. 如申請專利範圍第17項之酶製劑，其中使用重組酶。
  26. 如申請專利範圍第25項之酶製劑，其中該重組酶係由里氏木黴(Trichoderma reesei )產製。
  27. 如申請專利範圍第17項之酶製劑，其進一步包含木聚糖酶(xylanase)，該木聚糖酶具有SEQ ID NO：18或20之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段。
  28. 如申請專利範圍第27項之酶製劑，其中該木聚糖酶可得自橙色嗜熱子囊菌或嗜熱枝頂孢菌。
  29. 如申請專利範圍第28項之酶製劑，其中該木聚糖酶可得自橙色嗜熱子囊菌BCRC 930094或嗜熱枝頂孢菌BCRC 930093。
  30. 如申請專利範圍第17項之酶製劑，其係呈耗盡培養基、粉末、顆粒或液體之形式。
  31. 一種如申請專利範圍第17至30項中任一項之酶製劑於降解纖維素材料之用途。
  32. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該纖維素材料選自玉米桿(corn stover)、柳枝稷(switchgrass)、榖類蒿木(cereal straw)、甘蔗渣(sugarcane bagasse)或木材衍生 材料。
  33. 一種經分離之多核苷酸，其包含選自SEQ ID NO：3或5之核苷酸序列。
  34. 一種載體，其包含作為異源性序列之如申請專利範圍第33項之多核苷酸。
  35. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第34項之載體。
  36. 如申請專利範圍第35項之宿主細胞，其係里氏木黴(Trichoderma reesei )菌株。
  37. 一種纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase；CBH)，其包含SEQ ID NO：4或6之胺基酸序列或彼之酶催化活性片段。
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