BRPI0620287B1 - método para tratar material celulósico com celobioidrolase, endoglicanase e betaglicosidase, uso do mesmo, preparação de enzima, uso da mesma, vetor, célula hospedeira de fungo e cepa de escherichia coli, bem como método de preparação de um polipeptídeo e uso do mesmo - Google Patents

Abstract

método para tratar material celulósico, uso do mesmo, preparação de enzima, uso da mesma, polipeptídeo, uso e método de preparação do mesmo. a presente invenção refere-se à produção de hidrolases de açúcar a partir de material celulósico. o método pode ser usado, por exemplo, para produzir açúcares fermentáveis para a produção de bioetanol a partir de material lignocelulósico. são descritas as enzimas lignocelulósicas e sua produção por tecnologia recombinante, bem como os usos das enzimas e preparações de enzima.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA TRATAR MATERIAL CELULÓSICO COM CELOBIOIDROLASE, ENDOGLICANASE E BETA-GLICOSIDASE, USO DO MESMO, PREPARAÇÃO DE ENZIMA, USO DA MESMA, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA DE FUNGO E CEPA DE ESCHERICHIA COLI, BEM COMO MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO E USO DO MESMO. Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à produção de hidrolisados de açúcar de material celulósico. Mais precisamente a invenção se refere à produção de açúcares fermentados de material lignocelulósico por conversão enzimática. Os açúcares fermentados são úteis, por exemplo, na produção de bioetanol ou para outros fins. Especificamente a presente invenção se refere a um método para tratar material celulósico com celobioidrolase, endoglicanase, beta-glicosidase, e opcionalmente xilanase, e às preparações de enzimas e aos empregos das mesmas. A invenção se refere, adicionalmente, aos novos polipeptídeos celulósicos, polinucleotídeos codificando os mesmos e aos vetores e células hospedeiras contendo os polinucleotídeos. Ainda, adicionalmente, a invenção se refere aos usos dos polipeptídeos e a um método de preparação dos mesmos.

Histórico da Invenção

Os hidrolisados de açúcar podem ser usados para produção microbiana de uma variedade de substâncias químicas finas ou biopolímeros, tais como, ácidos orgânicos, por exemplo, ácido láctico ou etanol ou outros álcoois, por exemplo, n-butanol, 1,3-propanodiol ou poliidroxialcanoatos (PHAs). Os hidrolisados de açúcar podem também servir como matéria prima para outros processos não microbianos, por exemplo, para enriquecimento, isolamento e purificação de açúcares de valor alto ou vários processos de polimerização. Um dos maiores empregos dos hidrolisados de açúcar é na produção dos biocombustíveis. A produção de bioetanol e/ou outras substâncias químicas pode acontecer em um processo integrado em uma refinaria (Wyman 2001).

As fontes limitadas de combustíveis fósseis e as crescentes

Segue-se folha 1a

Petição 870170038024, de 05/06/2017, pág. 8/20

1a quantidades de CO2 liberadas dos mesmos e que causam o fenômeno de

Petição 870170038024, de 05/06/2017, pág. 9/20 fonte de energia limpa e renovável. Uma tecnologia alternativa e promissora é a produção de biocombustíveis, isto é, etanol, de materiais celulósicos. No setor de transporte, os biocombustíveis estão sendo a única opção, que podería reduzir as emissões de CO₂ em uma ordem de grandeza. O etanol po5 de ser empregado nos veículos e sistemas de distribuição existentes e assim nãô requer investimentos de infra-estrutura caros. Os açúcares derivados de matérias-primas lignocelulósicas renováveis podem também ser usados como matérias-primas para uma variedade de produtos químicos que podem substituir as substâncias químicas à base de petróleo.

A maior parte dos carboidratos em plantas está na forma de lignocelulose o que consiste essencialmente em celulose, hemicelulose, pectina e lignina. Em um processo de lignocelulose-em-etanol, o material lignocelulósico é primeiro pré-tratado tanto química quanto fisicamente, de modo a tornar a fração celulósica mais acessível à hidrólise. A fração celulósica é 15 então hidrolisada para obter açúcares que podem ser fermentados por levedura em etanol. A lignina é obtida como co-produto principal que pode ser usado como um combustível sólido.

Os custos de produção do bioetanol são altos e o rendimento de energia é baixo e existem pesquisas constantes para tornar o processo mais 20 econômico. A hidrólise enzimática é considerada a tecnologia mais promis• sora para conversão da biomassa celulósica em açúcares fermentáveis.

Conduto, a hidrólise enzimática é empregada apenas a uma quantidade limitada em escala industrial e especialmente quando se emprega material fortemente lignificado, tal como madeira ou resíduo agrícola, a tecnologia não é 25 satisfatória. O custo da etapa enzimática é um de fatores econômicos principais do processo. Foram feitos esforços para aperfeiçoar a eficácia da hidrólise enzimática do material celulósico (Badger 2002).

A patente US 2002/019 2774 A1 descreve um processo contínuo para conversão da biomassa lignocelulósica em produtos combustíveis. 30 Após pré-tratamento por oxidação a úmido ou explosão de vapor, a biomassa é parcialmente separada em celulose, hemicelulose e lignina, e é então submetida a hidrólise parcial usando uma ou mais enzimas de carboidrase (EC 3.2). Celluclast®, um produto comercial da Novo Nordisk A/S contendo atividades de celulase e xilanase é fornecido como um exemplo.

A patente US 2004/000 5674 A1 descreve novas misturas de enzima que podem ser empregadas diretamente no substrato de lignocelulo5 se, pelo que, os produtos residuais tóxicos formados durante os processos de pré-tratamento podem ser evitados, e a energia pode ser poupada. A mistura de enzima sinergística contém uma celulase e uma enzima auxiliar, tal como, celulase, xilanase, iigninase, amilase, protease, lípidase ou glicuronidase ou qualquer combinação das mesmas. A celulase é considerada como 10 incluído endoglicanase (EG), beta-glicosidase (BG) e celobioidrolase (CBH). Os exemplos ilustram o uso de uma mistura de Tríchoderma xilanase e preparações de celulase.

Kurabi e outros (2005) investigaram hidrólise enzimática de explosão de vapor e organossolve etanol-pré-tratado Douglas-fir por novas ce15 lulases de fungo comerciais. Eles testaram duas preparações dé Tríchoderma reesei celulase comerciais e duas preparações novas produzidas por cepas mutantes de Tríchoderma sp. e Penicillium sp. A preparação de Tríchoderma sp. mostrou desempenho significativamente melhor que o das outras preparações. Acredita-se que o melhor desempenho foi pelo menos 20 devido em parte a uma atividade de beta-glicosidase significativamente maior, o que alivia a inibição da produção de celobioidrolase e endoglicanase.

A Patente US 2004/005 3373 A1 refere-se a um método para conversão de celulose em glicose por tratamento de um substrato lignoceíulósico tratado com uma mistura enzimática compreendendo celulase e uma 25 celobioidrolase I modificada (CBHI). A CBHI foi modificada por inativação de seu domínio de ligação de celulose (CBD). Vantagens da modificação de CBHI são, por exemplo, melhor recuperação e taxa de hidrolase maior com alta concentração de substrato. A celulase é selecionada do grupo consistindo em EG, CBH e BG. A CBHI é obtida preferivelmente do Tríchoderma.

A Patente US 2005/016 4355 A1 descreve um método para degradar o material lignocelulósico com uma ou mais enzimas celulósicas na presença de pelo menos um agente tensoativo. Enzimas adicionais, tais co4 mo, hemicelulases, esterase, peroxidase, protease, lacase ou mistura das mesmas podem também ser usadas. A presença de agente tensoativo aumenta a degradação do material lignocelulósico em comparação à ausência do agente tensoativo. As enzimas celulósicas podem ser qualquer enzima 5 envolvida na degradação da lignocelulose incluindo CBH, EG e BG.

Existem inúmeras publicações revelando várias celulases e hemicelulases.

Celobioidrolases (CBHs) são reveladas, por exemplo, no WO 03/000 941, que refere-se às enzimas CBHI obtidas de vários fungos. Não é 10 provida qualquer propriedade fisiológica das enzimas, nem quaisquer exemplos de seus empregos. Hong e outros (2003b) caracterizam CBHI de Thermoascus aurantiacus produzidos por levedura. As aplicações da enzima não são descritas. Tuohy e outros (2002) descreve três formas de celobiohidrolases de Talaromyces emersonii.

Endoglicanases da família ce!5 (EGs fam 5) são descritas, por exemplo, no WO 03/062 409, que refere-se às composições compreendendo pelo menos duas enzimas termoestáveis para uso em aplicações de alimentação. Hong e outros (2003a) descrevem a produção de endo-β-1,4glicanase termoestáveis de T. aurantiacus em levedura. Nenhuma aplicação 20 é explicada. O WO 01/70998 refere-se às β-glicanases de Talaromyces. Elas • também descrevem β-glicanases de Talaromyces emersonii. Aplicações em alimentos, suprimentos, bebidas, cervejaria e detergentes são discutidas. A lignose da lignocelulose não é mencionada. O WO 08/06 858 descreve beta-1,4-endoglicanase de Aspergillus niger e revela aplicações da enzima 25 em alimentos e suprimentos. O WO 97/12853 revela métodos para classificação de fragmentos de DNA codificando enzimas em bibliotecas de DNAc. A biblioteca de DNAc tem origem em levedura ou fungos, preferivelmente Aspergillus. A enzima é preferivelmente uma celulase. Van Petegem e outros (2002) descrevem a estrutura tridimensional de uma endoglicanase da 30 família cel5 de Thermoascus aurantiacus. Parry e outros 92002) descrevem o modelo de ação de uma endoglicanase da família ce!5 de Thermoascus aurantiacus.

As endoglucanases da família cel7 (EGs fam 7) são reveladas, por exemplo, no US 5.912.157, que refere-se à endoglicanase de Myceliphthora e seus homólogos e aplicações da mesma em detergente, têxteis e polpas. A Patente US 6.071.735 revela celulases exibindo alta atividade de endoglicanase em condições alcalinas. Os usos como detergente, na polpa e papel e aplicações têxteis são revelados. O bioetanol não é mencionado. A Patente US 5.763.254 revela enzimas de degradação de celulose/hemicelulose e possuindo resíduos de aminoácido conservados em CBD.

Endoglicanases da família cel45 (EGs fam 45) são descritas, por exemplo, na Patente US 6.001.639, que refere-se às enzimas possuindo atividade endoglicanase e possuindo duas sequências de aminoácido conservadas. O uso em têxteis, detergentes e aplicações em polpa e papel são geralmente revelados e o tratamento de material lignocelulósico é mencionado, porém não são fornecidos exemplos. O WO 2004/053039 refere-se às aplicações detergentes das endoglucanases. A Patente US 5.958.082 descreve o uso de endoglicanase, especialmente de Thielavia terrestrís em aplicações têxteis. A Patente EP 0495258 refere-se às composições detergentes contendo Humicola celulase. A Patente US 5.948.672 descreve á preparação de celulase contendo endoglicanase, especialmente de Humicola e seu emprego em aplicações têxteis e polpa. A hidrólise da lignocelulose não é mencionada.

Uma pequena quantidade de beta-glicosidade (BG) melhora a hidrólise da biomassa para glicose por hidrólise da celobiose produzida por celobioidrolases. A conversão da celobiose em glicose é geralmente a etapa de limitação de taxa maior. As beta-glicosidades são reveladas, por exemplo, na Patente US 2005/021 4920, que refere-se ao BG de Aspergillus fumigatus. A enzima foi produzida em Aspergillus oryzae e Tríchoderma reesei. O uso da enzima na degradação dá biomassa ou aplicações detergentes é discutido de modo geral, porém não exemplificado. O WO 02/095 014 descreve uma enzima de Aspergillus oryzae possuindo atividade de celobiase. O uso na produção de etanol a partir da biomassa é discutido de modo geral, porém não exemplificado. O WO 2005/074656 revela polipeptídeos possuin do atividade de melhora celulósica derivada, por exemplo, de T. aurantiacus; A. fumigatus; T. terrestrís e Γ. aurantiacus. O WO 02/26979 revela processamento enzimático de material de planta. A Patente US 6.022.725 descreve a clonagem e àmpliação do gene de beta-glicosidade do Tríchoderma reesei e a Patente US 6.103.464 descreve um método para detectar o DNA codificando uma beta-glicosidade de um fungo filamentoso. Nenhum exemplo de aplicação é fornecido. <

As xilanases são descritas, por exemplo, no FR2786784, que refere-se a uma xilanase estável em calor, útil por exemplo, no tratamento de 10 suprimentos para animais e na fabricação de pães. A enzima é derivada de um fungo termofílico, especificamente do gênero Thermoascus.

A Patente US 6.197.564 descreve enzimas possuindo atividade xilanase e obtidas de Aspergillus aculeatus. Sua aplicação na fabricação de pães é exemplificada. O WO 02/24926 refere-se às xilanases de Talaromy15 ces. São fornecidos exemplos de alimentos e de fabricação de pães. O WO 01/42433 revelam xilanase termoestável de Talaromyces emersoníi para uso em aplicações de alimentos e suprimentos.

As enzimas celulósicas melhor investigadas e aplicadas mais amplamente de origem de fungos foram derivadas de Tríchoderma reesei (a 20 anamorfa da Hypocrea jecorína). Conseqüentemente também, a maioria das * celulases de fungos disponíveis comercialmente é derivada de Tríchoderma reesei. Contudo, a maioria das celulases de fungos menos conhecidas não foi aplicada nos processos de importância prática, tais como, na degradação do material celulósico, incluindo lignocelulose.

Existe uma necessidade contínua de novos métodos de degradação de substratos çelulósicos, especificamente substratos lignocelulósicos, e para novas enzimas e misturas de enzimas que melhoraram a eficácia da degradação. Existe também a necessidade de processos e enzimas que trabalhem em temperaturas altas, assim permitindo o emprego de maior con30 sistência da biomassa e conduzindo a concentrações maiores de açúcar e etanol. Essa abordagem podem conduzir a economia significativa nos custos de energia e investimentos. A temperatura alta também diminui o risco de contaminação durante a hidrólise. A presente invenção tem como objetivo satisfazer pelo menos partes dessas necessidades.

Breve Descrição da Invenção

Foi verificado surpreendentemente que as enzimas celulósicas e especialmente as celobioidrolases obtidas de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum são especificamente úteis na hidrólise de material celulósico. Além das celobioidrolases, esses fungos possuem endoglicanases, beta-glicosidades e xilanases que são muito apropriadas para degradação de material celulósico. As enzimas são cineticamente muito eficazes sobre uma ampla faixa de temperaturas e embora elas tenham atividade muito alta em temperaturas altas, elas também são muito eficientes em temperaturas de hidrólise padrão. Isso as torna extremamente bem apropriadas aos vários processos de hidrólise de substrato celulósico realizados em temperaturas convencionais e temperaturas elevadas.

A presente invenção provê um método para tratamento de material celulósico com celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase, pelo que a celobioidrolase compreende uma seqüência de aminoácidos possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID N®³: 2, 4, 6 ou 8 ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

A invenção provê adicionalmente, uma preparação de enzima compreendendo celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase, onde a celobioidrolase compreende uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID N®^s: 2, 4, 6 ou 8 ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

O uso da preparação de enzima para degradar material celulósico também é provido, bem como o uso do material em um processo para preparação de etanol a partir de material celulósico.

A invenção também refere-se a um polipeptídeo compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica e sendo selecionado do grupo consistindo em:

a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá cido possuindo pelo menos 66% de identidade com relação à SEQ ID N²:4, 79% de identidade com relação à SEQ ID N^s:6, 78% de identidade com relação à SEQ ID N^s: 12, 68% de identidade com relação à SEQ ID N^fi: 14, 72% de identidade com relação à SEQ ID N^fl: 16, 68% de identidade com relação à SEQ ID N^s:20, 74% de identidade com relação à SEQ ID N^s:22 ou 24, ou 78% de identidade com relação à SEQ ID N^fi:26;

b) uma variante de a) compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica; e

c) um fragmento de a) ou b) possuindo atividade celulósica.

Um objetivo adicional da invenção é um polinucleotídeo isolado selecionado do grupo consistindo em:

a) uma seqüência de nucleotídeo das SEQ ID N^a: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 ou 25, ou uma seqüência codificando um polipeptídeo da reivindicação 35;

b) um filamento complementar de a)

c) um fragmento de a) ou b) compreendendo peío menos 20 nucleotídeos; e

d) uma seqüência que se degenera como resultado do código genético em qualquer uma das seqüências conforme definido em a), b) ou c).

A invenção ainda provê, adicionalmente, um vetor, que compre• ende o polinucleotídeo como uma seqüência heteróloga, e uma célula hospedeira compreendendo o dito vetor. Cepas de Escherichia coli possuindo número de acesso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667 estão também 25 incluídas na invenção.

Outros objetivos da invenção são preparações enzimáticas compreendendo pelo menos um dos novos polipeptídeos e o uso do dito polipeptídeo ou preparação de enzima no combustível, têxtil, detergente, polpa e papel, alimentos, suprimentos ou indústria de bebidas.

Também é provido um método adicional para preparação de um polipeptídeo compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica e sendo selecionado do grupo consistindo em:

a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 66% de identidade com relação à SEQ ID N²: 4, 79% de identidade com relação à SEQ ID N²: 6, 78% de identidade com relação à SEQ ID N²: 12, 68% de identidade com relação à SEQ ID N²: 14, 72% de identidade com relação à SEQ ID N²: 16, 68% de identidade com relação à SEQ ID N²: 20, 74% de identidade com relação à SEQ ID N²:22 ou 24, ou 78% de identidade com relação à SEQ ID N²: 26;

b) uma variante de a) compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósica; e

c) um fragmento de a) ou b) possuindo atividade celulósica, o dito método compreendendo transformação de uma célula hospedeira com um vetor codificando o dito polipeptídeo, e cultivo da célula hospedeira sob condições que permitem expressão do dito polipeptídeo, e opcionalmente recuperação e purificação do polipeptídeo produzido.

Também ainda é provido um método para tratamento de material celulósico com um meio de cultivo gasto de pelo menos um microorganismo capaz de produzir um polipeptídeo conforme definido acima, onde o método compreende reação do material celulósico com o meio de cultura gasto para obter o material celulósico hidrolisado.

Concretizações específicas da invenção são estabelecidas nas reivindicações dependentes.

Outros objetivos, detalhes e vantagens da presente invenção ficarão claros dos desenhos que se seguem, descrição detalhada e exemplos. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. Dependências de temperatura das atividades de celulase e beta-giicosidase nos sobrenadantes das seis cepas de fungos testadas. O tempo de incubação no ensaio foi de 60 minutos na temperatura dada, o pH do ensaio era de 5,0 (atividade de MUL) ou 4,8 (CMCase ou BGU). A atividade obtida a 60°C é estabelecida como a atividade relativa de 100%. A) Thermoascus aurantiacus ALKO4239, B) Thermoascus aurantiacus ALKO4242, C) Acremonium thermophilum ALKO4245, D) Talaromyces thermophilus ALKO4246, E) Chaetomium thermophilum ALKO4261, F) Chaetomium thermophilum ALKO4265.

Figura 2. Ilustração esquemática dos cassetes de expressão usados na transformação dos protoplastos de Tríchoderma reesei para produção de proteínàs de fungos recombinantes. Os genes recombinantes esta5 vam sob controle do promotor (cbh1 prom) de T. reesei (cel7A) e a terminação da transcrição foi garantida por emprego da sequência terminadora T. reesei cbh1 (termo cbhl). O gene amdS foi incluído como um marcador de transformação.

Figura 3. A) pH ótimo das preparações de proteína CBH/Cel7 10 recombinantes do Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 e Acremonium thermophilum ALKO4245 determinado em 4-metilumbelíferil-p-D-lactosídeo (MUL) a 50°C, 10 minutos. Os resultados são fornecidos como média (± SD) de três medições separadas. B) Estabilidade térmica das preparações de proteína CBH/Cel7 recombinantes a 15 partir de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 e Acremonium thermophilum ALKO4245 determinada no 5metilumbeliferil-p-D-lactosídeo (MUL) em pH ótimo por 60 minutos. Os resultados são fornecidos como média (± SD) de três medições separadas. Ambas reações continha BSA (100 gg/mL) como um estabilizador.

Figura 4. Hidrólise de celulose cristalina (Avicel) por celobi• oidrolases recombinantes purificas a 45°C. Concentração do substrato 1% (peso/volume), pH 5,0, concentração de enzima 1,4 μΜ, A) Celobioidrolases abrigando um CBD, B) celobioidrolases (núcleo) sem um CBD.

Figura 5. Hidrólise de celulose cristalina (Avicel) por celobioidro25 lases recombinantes purificadas a 70°C. A concentração de substrato 1% (peso/volume), pH 5,0, concentração da enzima 1,4 μΜ. A) celobioidrolases abrigando um CBD, B) celobioidrolases (núcleo) sem um CBD.

Figura 6.A) A dependência do pH da atividade de EG-40/Cel45A de Acremonium, semelhante a EG-40/Cel45B e de EG-28/Cel5A de Ther30 moascus produzidos heterologamente foi determinada com substrato CMC em uma reação de 10 minutos a 50°C. B) A temperatura ótima de EG40/Cel45A de Acremonium, semelhante a EG-40/Cel45B e de EG-28/Cel5A de Thermoascus, foi determinada em pH 5,5, 4,8 e 6,0, respectivamente. A reação contendo CMC como substrato foi realizada por 60 minutos, exceto para EG-28/Cel5A por 10 min. BSA (100 gg/mL) foi adicionado como um estabilizador.

Figura 7.A) A dependência do pH da atividade de BG-101/Cel3A de Acremonium, BG-76/Cel3A de Chaetomium produzidos heterologamente e de BG-81/Cel3A de Thermoascus produzidos heterologamente foi determinada com substrato de 4-nitrofenil-p-D-glicopiranosídeo em uma reação de 10 minutos a 50°C. B) A temperatura ótima de pG-101/Cel3A de Acremonium, pG-76/Ce!3A Chaetomium, e pG-81/Cel3A de Thermoascus foi determinada em pH de 4,5, 5,5 e 4,5, respectivamente. A reação contendo 4nitrofenil^-D-glicopiranosídeo como substrato foi realizada por 60 min, BSA (100 gg/mL) foi adicionado como um estabilizador.

Figura 8.A) A dependência de pH da atividade da xilanase de XYN-30/Xyn10A de Thermoascus produzido heterologamente foi determinada com substrato de xilana de bétula em uma reação de 10 minutos a 50°C. B) A temperatura ótima de XYN-30/Xyn10A foi determinada em pH 5,3 em uma reação de 60 minutos, BSA (100 gg/mL) foi adicionado como um estabilizador.

Figura 9. Hidrólise de fibra de spruce explodida em vapor (10 mg/mL) com uma mistura de enzimas termofílicas (MISTURA 1) e enzimas de T reesei a 55 e 60°C. A dosagem da enzima é fornecida por FPU/ga de matéria seca do substrato, FPU ensaiada a 50°C, pH 5. A hidrólise foi realizada por 72 horas em pH 5, com mistura. Os resultados são fornecidos como uma média (±SD) de três medições separadas.

Figura 10. Hidrólise de palha de milho explodido em vapor (10 mg/mL) com uma mistura de enzimas termofílicas (MISTURA 2) e enzimas de T reesei a 45, 55 e 57,5°C. A dosagem da mistura foi para MISTURA 2 de 5 FPU/g de matéria seca do substrato e para enzimas de T reesei de 5 FPU/g de matéria seca Celluclast suplementada com 100 nkat/g de matéria seca Novozym 188 (a atividade do papel filtro foi ensaiada a 50°C, pH 5). A hidrólise foi realizada por 72 horas em pH 5, com mistura. Os resultados são &

fornecidos como a média (±SD) de três medições separadas. O substrato continha açúcares de redução solúveis (cerca de 0,7 mg/mL). Esse teor do açúcar de base foi subtraído dos açúcares de redução formados durante a hidrólise.

Figura 11. Hidrólise de palha de milho explodido em vapor (10 mg/mL) com uma mistura de enzimas termofílicas contendo uma nova xilanase termofílica de Thermoascus aurantiacus (MISTURA 3) e enzimas de T. reesei a 45, 55 e 60°C. A dosagem da enzima foi para MISTURA 3 de 5 FPU/g de matéria seca do substrato e para enzimas de T. reesei de 5 FPU/g de matéria seca Celluclast suplementada com 100 nkat/g de matéria seca Novozym 188 (a atividade do papel filtro foi ensaiada a 50°C, pH 5). A hidrólise foi realizada por 72 horas em pH 5, com mistura. Os resultados são fornecidos como a média (±SD) de três medições separadas. O substrato continha açúcares de redução solúveis (cerca de 0,7 mg/mL). Esse teor do açú15 car de base foi subtraído dos açúcares de redução formados durante a hidrólise.

Figura 12. Hidrólise de fibra de espruce explodida em vapor (10 mg/mL) com uma mistura de enzimas termofílicas contendo uma nova xilanase termofílica XYN-30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus (MISTURA 3) e enzimas de T. reesei a 45, 55 e 60°C. A dosagem da enzima para a MIS• TURA 3 foi de 5 FPU/g de matéria seca de substrato e para as enzimas de

T reesei de 5 FPU/g de matéria seca Celluclast suplementada com 100 nkat/g de matéria seca Novozym 188 (a atividade do pape! filtro foi ensaiada a 50°C, pH 5). A hidrólise foi realizada por 72 horas em pH 5, com mistura.

Os resultados são fornecidos como a média (±SD) de três medições separadas.

Figura 13. O efeito da glicose na atividade das diferentes preparações de β-glicosidase. O ensaio padrão usando p-nitrofenil^-Dglicopiranosídeo como substrato foi realizado na presença de glicose na mis30 tura de ensaio. A atividade é apresentada como porcentagem da atividade obtida sem glicose.

Figura 14. Atividades de FPU das misturas de enzima em tem13 peraturas de 50°C a 70°C, apresentadas como uma porcentagem da atividade sob condições padrão (50°C, T hora).

Figura 15. A atividade de celulase relativa de duas cepas diferentes de T. reesei crescidas em meio contendo Nutriose não tratada (NO) ou Nu5 triose pré-tratada com BG-81/Cel3A (NBG81) como uma fonte de carbono.

Descrição Detalhada da Invenção

A celulose é o maior componente estrutural das plantas superiores. Ela provê as células da planta com resistência à tensão ajudando as mesmas a resistirem ao estresse mecânico e pressão osmótica. A celulase é 10 um composto β-Ί ,4-glicano de cadeias lineares de resíduos de glicose unidos por ligações β-1,4-glicosídicas. A celobiose é a menor unidade de repetição da celulose. Nas paredes das células, a celulose é embalada em folhas orientadas de vários modos, que são envolvidas em uma matriz de hemicelulose e lignina. A hemicelulose é um grupo heterogêneo de polímeros de 15 carboidrato contendo principalmente glicanos, xilanos e mananos diferentes.

A hemicelulose consiste em uma estrutura linear com resíduos ligados em β1 ,4 substituídos por cadeias laterais curtas geralmente contendo acetila, glicuronila, arabinosila e galactosila. A hemicelulose pode ser ligada quimicamente à lignina. A lignina é um polímero reticulado e complexo de unidades 20 de p-hidroxifenilpropano substituído de várias formas que provê resistência à parede da célula de modo a suportar o estresse mecânico e também proteger a celulose da hidrólise enzimática.

A lignocelulose é uma combinação de celulose e hemicelulose e polímeros de unidades de propanol e lignina. Ela é fisicamente dura, densa e 25 inacessível e o material bioquímico mais abundante na biosfera. Os materiais contendo lignocelulose são por exemplo: lascas de madeira dura e madeira macia, polpa de madeira, serragem e lixo florestal e industrial de madeira; biomassa agrícola como palhas de cereais, polpa de beterraba, palha de milho e cobs, bagaço da cana de açúcar, caules, folhas, cálices, cascas e 30 semelhantes; produtos residuais, tais como, lixo sólido municipal, jornais e lixo produzido por escritórios, resíduo industrial e por exemplo de grãos; colheitas de energia dedicada (por exemplo, salgueiro, choupo, gramínea do

tipo switchgrass nativa da América do Norte, alpiste, e semelhantes). Exemplos preferidos são palha de milho, gramínea do tipo switchgrass nativa da América do Norte, palha de cereais, bagaço da cana-de-açúcar e materiais derivados de madeira.

Material celulósico conforme usado aqui, refere-se a qualquer material compreendendo celulose, hemicelulose e/ou lignocelulose como um componente significativo. Material lignocelulósico significa qualquer material compreendendo lignocelulose. Tais materiais são, por exemplo, materiais de planta tais como, madeira incluindo madeira dura e madeira macia, plan10 tas herbáceas, resíduos agrícolas, resíduos de polpa e madeira, papel residual, resíduos, da indústria alimentícia e de suprimentos, etc. As fibras têxteis, tais como, algodão, fibras derivadas de algodão, linho, cânhamo, juta e as fibras celulósicas fabricadas pelo homem como, modal, viscose, liocel são exemplos específicos de materiais celulósicos.

O material celulósico é degradado na natureza por vários organismos incluindo bactérias e fungos. A celulose é tipicamente degradada por diferentes celulases agindo seqüencial ou simultaneamente. A conversão biológica em glicose geralmente requer três tipos de enzimas hidrolíticas: (1) Endoglicanases que cortam as ligações internas beta-1,4-glicosídicas; (2) 20 Exocelobioidrolases que cortam a celobiose de dissacarídeo da extremidade • da cadeia de polímero de celulose; (3) Beta-1,4-glicosidases que hidrolisam a celobiose e outros celo-oligossacarídeos curtos em glicose. Em outras palavras, os três maiores grupos de celulases são celobioidrolases (CBH), endoglicanases (EG) e beta-glicosidases (BG).

A degradação dos substratos contendo celulose mais complexos requer uma ampla faixa de várias enzimas. Por exemplo, a lignocelulose é degrada por hemicelulases, como xilanases e mananases. A hemicelulase é uma enzima que hidrolisa a hemicelulose.

Enzimas celulósicas são enzimas possuindo atividade celuló30 sica que significa que elas são capazes de hidrolisar substratos celulósicos ou derivados dos mesmos em sacarídeos menores. As enzimas celulósicas assim incluem ambas celulases e hemicelulases. As celulases conforme empregado aqui incluem celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase.

T. reesei possui um sistema de celulase eficaz e bem conhecido contendo dois CBH's, dois principais e vários EG's e BG's menores. CBHI de T. reesei (Cel7A) corta o açúcar da extremidade de redução da cadeia dé 5 celulose, possui um domínio de ligação de celulose C-terminal (CBD) e pode construir até 60% da proteína secretada total. CBHII de T. reesei (Cel6A) corta o açúcar da extremidade de não redução da cadeia de celulose, possui um domínio de ligação de celulose N-terminal e pode constituir até 20% da proteína secretada total. Endoglicanases EGI (Cel7B) e EGV (Cel45A) pos10 suem um CBD ém seu C-terminal, EGII (Cel5A) possui um N-terminal CBD e EGIll (Cel12A) não possui um domínio de ligação de celulose. CBHI, CBHII, EGI e EGII são denominados celulases principais de Tríchoderma compreendendo em conjunto 8-90% das proteínas secretadas totais. Um versado na técnica tem conhecimento de que uma enzima pode ser ativa em vários 15 substratos e as atividades enzimáticas podem ser medidas usarido diferentes substratos, métodos e condições. A identificação das diferentes atividades celulósicas é revelada, por exemplo, em van Tilberugh e outros, 1988.

Além de um domínio/núcleo catalítico expressando atividade celulósica, as enzimas celulósicas podem compreender um ou mais domínios 20 de ligação de celulose (CBDs), também denominados domínios/módulos de ligação de carboidrato (CBD/CBM), que pode estar localizado tanto no Nquanto C-terminal do domínio catalítico. CBDs possuem atividade de ligação de carboidrato e eles mediam a ligação da celulase à celulose cristalina, porém possuem pouco ou nenhum efeito sobre a atividade hidrolítica de celu25 lase da enzima nos substratos solúveis. Esses dois domínios são tipicamente conectados através de uma região ligante altamente glicosilada e flexível.

Celobioidrolase ou CBH conforme usado aqui, refere-se às enzimas que clivam celulose a partir da extremidade da cadeia de glicose e produzem principalmente celobiose. Elas também são denominadas 1,430 beta-D-glicano celobioidrolases ou 1,4-beta-celobiosidases de celulose. Elas hidrolisam as ligações 1,4-beta-D-glicosídicas das extremidades de redução ou não redução de um polímero contendo as ligações, tais como, celulose,

pelo que a celobiose é liberada. Duas BCHs diferentes foram isoladas do Trl· choderma reesei, CBHI e CBHII. Elas possuem uma estrutura molecular consistindo em um domínio catalítico ligado a um domínio de ligação de celulose (CBD). Existem também celobioidrolases na natureza que não possuem CBD.

Endoglicanase ou EG refere-se às enzimas que cortam as ligações glicosídicas internas da cadeia de celulose. Elas são classificadas como EC 3.2.1.4. Elas são 1,4-beta-D-glican 4-glicanoidrolases e catalisam a endoidrólise das ligações 1,4-beta-D-glicosídicas nos polímeros de glicose, tais como, celulose e derivados dos mesmos. Algumas endoglicanases ocor10 rendo naturalmente possuem um domínio de ligação de celulose, enquanto outras não. Algumas endoglicanases possuem também atividade de xilase (Bailey e outros, 1993).

Beta-glicosidase ou BG ou PG refere-se às enzimas que degradam pequenos oligossacarídeos solúveis incluindo celobiose em glico15 se. Elas são classificadas como EC 3.2.1.21. Elas são beta-D-glicosídeo glicoidrolases que catalisam tipicamente a hidrólise de resíduos de beta-Dglicose de não redução terminal. Essas enzimas reconhecem oligossacarídeos de glicose. Substratos típicos são celobiose e celotriose. A celobiose é um inibidor das celobioidrolases, pelo que, a degradação da celobiose é im20 portante para superar a inibição do produto final das celobioidrolases.

• As xilanases são enzimas que são capazes de reconhecer e hidrolisar a hemicelulose. Elas incluem ambas enzimas exoidrolíticas e endoidrolíticas. Tipicamente, elas possuem atividade endo-1,4-beta-xilanase (EC 3.2.1.8) ou beta-D-xilosidase (EC 3.2.1.37) que rompe a helicelulose em xi25 lose. Xilanase¹¹ ou Xin'¹ em conexão com a presente invenção refere-se especialmente a uma enzima classificada como EC 3.2.1.8 hidrolisando polímeros de xilose do substrato lignocelulósico ou xilana purificada.

Além disso, as celulases podem ser classificadas em várias famílias de glicosil hidrolase de acordo com sua seqüência primária, sustenta30 da por análise da estrutura tridimensional de alguns elementos da família (Henrissat 1991, Henrissat e Bairoch 1993, 1996). Algumas glicosil hidrolases são enzimas multifuncionais que contêm domínios catalíticos que per17 tencem à diferentes famílias de glicosil hidrolase. A família 3 consiste em beta-glicosidases (EC 3.2.1.21) tais como Ta BG-81, At BG-101 e ct BG-76 descritas aqui. A família 5 (anteriormente conhecida como celA) consiste principalmente em endoglicanases (EC 3.2.1.4) tais como Ta EG-28 descrita 5 aqui. A família 7 (anteriormente família celulase celC) contém endoglicanases (EC 3.2.1.4) e celobioidrolases (EC 3.2.1.91) tais como, Gt EG-54, Ta CBH, At CBH-A, At CBH-C e ct CBH descritas aqui. A família 10 (anteriormente celF) consiste principalmente nas xilanases (EC 3.2.1.8) tais como Ta XYN-30 e At XYN-60 descritas aqui. A família 45 (anteriormente celK) con10 tém endoglicanases (EC 3.2.1.4) tais como At EG-40 e At semelhante a EG40 descritas aqui.

As enzimas celulósicas úteis para hidrólise do material celulósico são obtidas de Thermoascus aurantiacus, Acremoníum thermophilum ou Chaetomium thermophilum. 'Obtidas de significa que elas podem ser obti15 das das ditas espécies, porém isso não exclui a possibilidade e que elas sejam obtidas de outras fontes. Em outras palavras, elas podem se originar de qualquer organismo incluindo plantas. Preferivelmente, elas se originam de microorganismos, por exemplo, bactérias ou fungos. A bactéria pode ser, por exemplo, de um gênero selecionado dentre Bacillus, Azospiríllum e Strep20 tomyces. Mais preferivelmente a enzima se origina de fungos (incluindo fungos filamentosos e leveduras), por exemplo de um gênero selecionado do grupo consistindo em Thermoascus, Acremoníum, Chaetomium, Achaetomium, Thielavia, Aspergillus, Botrytis, Chrysosporium, Collybia, Fo-mes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melanocarpus, Myceliophthora, Myrio25 coccum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes e Trichoderma.

De acordo com uma concretização preferida da invenção as enzimas podem ser obtidas da cepa Thermoascus aurantiacus ALKO4242 de30 positada como CBS 116239, cepa ALKO4245 depositada como CBS 116240 presentemente classificada como Acremoníum thermophilum, ou cepa Chaetomium thermophilum ALKO4265 depositada como CBS 730.95.

A celobioidrolase compreende, preferivelmente, uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID N²®: 2, 4, 6 ou 8 ou um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

Celobioidrolase	Gene	obtida de	CB D	Ácido nucléico, SEQ ID Ns:	Aminoácido, SEQ ID Ns:
Ta CBH	Ta ce!7A	T. aurantiacus		1	2
AtCBH A	At cel/7B	A. thermophílum		3	4
AtCBH.C	At cei/7A	A. thermophílum	+	5	6
Ct CBH	Ct cel7A	C. thermophílum	+	7	8

Essas CBHs possuem uma constante de inibição de celulose vantajosa em comparação aquela da ÇBH de Tríchoderma reesei e elas mostram resultados de hidrólise aperfeiçoados quando se testa vários substratos celulósicos. As SEQ ID N²®: 2 e 4 não compreendem uma CBH. Os resultados de hidrólise especificamente melhorados podem ser obtidos quando um domínio de ligação de celulose (CBH) é anexado a uma CBH que não possui CBD propriamente. O CBD pode ser obtido de um Tríchoderma ou espécies Chaetomium, e é preferivelmente anexado à CBH através de um ligante. A proteína de fusão resultante contendo uma região de núcleo de CBH anexada a um CBD através de um ligante pode compreender uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID N²®: 28 ou 30. Os polinucleotídeos compreendendo uma seqüência da SEQ ID N²: 27 ou 29 codificam tais proteínas de fusão.

A endoglicanase pode compreender uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N²:10,

12, 14 ou 16 ou um fragmento enzimaticamente ativo da mesma. Essas endoglicanases possuem boa estabilidade térmica. ______________________

Endoglicanase	Gene	Obtida de	CB D	Ácido nucléico, SEQ ID N2:	Aminoácido, SEQ ID N2:
Ta EG 28	Ta ce!5A	T. aurantiacus		9	10
AtEG 40	At cel/45A	A. thermophílum	+	11	12
semelhante a EG 40	At cel/45B	A. thermophílum		13	14
Ct EG„54	Ct ce!7B	C. thermophílum	+	15	16

A beta-glicosidase pode compreender uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N^e: 22, 24 ou 26, ou um fragmento enzimaticamente ativo da mesma. Essas beta-glicosidases possuem boa resistência com relação à inibição de glicose que é vantajosa para evitar inibição do produto final durante hidrólise enzimática do material celulósico. As beta-glicosidases podem também ser usadas na preparação da soforose, um indutor de celulase empregado no cultivo de T. reesei.

Beta-glicosidase	Gene	Obtida de	Ácido nucléico, SEQ ID Na:	Aminoácido, SEQ ID Ns:
Ta BG 81	Ta ce/3A	T. aurantiacus	21	22
AtBG 101	At ce/3A	A. thermophilum	23	24
Ct BG 76	Ct ce/3A	C. thermophilum	25	26

A xilanase pode compreender uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação à SEQ ID N^s: 18 ou 20, ou um fragmento enzimaticamente ativo da mesma.

Xilanase	Gene	Obtida de	CBD	Ácido nucíéico, SEQ ID N2:	Aminoácido, SEQ ID N2:
Xyn 30	Ta xyn10A	T. aurantiacus	+	17	18
Xyn 60	AtxynlOA	A. thermophilum		19	20

O termo identidade significa a identidade global entre duas seqüências de aminoácido comparadas uma com a outra a partir do primeiro aminoácido codificado pelo gene correspondente até o último aminoácido. A identidade das seqüências de comprimento pleno é medida por emprego do programa de alinhamento global Needleman-Wunsch da EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice e outros, 2000) pacote de programas, versão 3.0.0, com os seguintes parâmetros: EMBLOSUM62, penalidade de intervalo 10.0, penalidade estendida 0,5. O algoritmo é descrito em Needleman and Wunsch (1970). O versado na técnica está ciente do fato de que, quando se utiliza o algoritmo Needleman-Wunsch, os resultados são comparáveis apenas quando do alinhamento dos domínios correspondentes da seqüência. Conseqüentemente, a comparação, por exemplo, de séqüên cias de celulase incluindo CBD ou seqüências de sinal com sequências que não contêm aqueles elementos não pode ser realizada.

De acordo com uma concretização da invenção é empregado um polipeptídeo celulósico possuindo pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de 5 identidade com relação às SEQ ID N²⁸: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ou 26 ou pelo menos com relação aos seus fragmentos enzimaticamente ativos.

O termo fragmento enzimaticamente ativo significa qualquer fragmento de uma seqüencia definida que possui atividade celulósica. Em 10 outras palavras, um fragmento enzimaticamente ativo pode ser a parte da proteína madura da seqüência definida ou pode ser apenas um fragmento da parte da proteína madura, contanto que ele ainda tenha atividade de celobioidrolase, endoglicanase, beta-glicosidase ou xilanase.

As enzimas celulósicas são preferivelmente enzimas recombi15 nantes, que podem ser produzidas de maneira geralmente conhecida. Um fragmento de polinucleotídeo compreendendo o gene da enzima é isolado, o gene é inserido sob um promotor forte em um vetor de expressão, o vetor é transferido para células hospedeiras apropriadas e as células hospedeiras são cultivadas sob condições que provocam a produção da enzima. Os mé20 todos para produção de proteína por tecnologia recombinante em diferentes * sistemas de hospedeiro são bem conhecidos na arte (Sambrook e outros, 1989; Coen, 2001; Gellissen, 2005). Preferivelmente, as enzimas são produzidas como enzimas extracelulares que são secretadas no meio de cultura, a partir do qual elas podem ser facilmente recuperadas e isoladas. O meio de 25 cultura gasto do hospedeiro de produção pode ser empregado como tal, ou as células hospedeiras podem ser removidas do mesmo, e/ou ele pode ser concentrado, filtrado ou fracionado. Ele também pode ser seco.

Polipeptídeo isolado no presente contexto pode significar simplesmente que as células e fragmentos de células foram removidos do meio 30 de cultura contendo o polipeptídeo. Convenientemente, os polipeptídeos são isolados, por exemplo, por adição de polímeros aniônicos e/ou catiônicos ao meio de cultura gasto para melhorar a precipitação das células, fragmentos de células e algumas enzimas que possuem atividades colaterais indesejadas. O meio é então filtrado usando um agente de filtração inorgânico e um filtro para remover os precipitados formados. Após isso, o filtrado é adicionalmente processado usando uma membrana semipermeável para remover o excesso de sais, açúcares e produtos metabólicos.

De acordo com uma concretização da invenção, o polipeptídeo heterólogo compreende um gene semelhante aquele incluído em um microorganismo possuindo número de acesso DSM 16723, DSM 16728, DSM 16729, DSM 16727, DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

O hospedeiro de produção pode ser qualquer organismo capaz de expressar a enzima celulósica. Preferivelmente, o hospedeiro é uma célula microbiana, mais preferivelmente um fungo. Mais preferivelmente, o hospedeiro é um fungo filamentoso. Preferivelmente, o hospedeiro recombinante é modificado para expressar e secretar enzimas celulósicas como suas atividade principal ou uma de suas atividades principais. Isso pode ser realizado por deleção dos genes secretados homólogos principais, por exemplo, as quatro celulases principais de Tríchoderma e por alvejamento dos genes heterólogos para um local que tenha sido modificado para garantir níveis de produção e expressão altos. Os hospedeiros preferidos para produção de enzimas celulósicas são especificamente cepas do gênero Tríchoderma ou Aspergillus.

As enzimas necessárias para a hidrólise do material celulósico de acordo com a invenção podem ser adicionadas em uma quantidade enzimaticamente eficaz tanto simultaneamente por exemplo, na forma de uma mistura de enzimas quanto seqüencialmente ou como parte da sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Qualquer combinação das celobioidrolases compreendendo uma seqüência de aminoácído possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID N^QS: 2, 4, 6 ou 8 ou com relação a qualquer fragmento ativo da mesma pode ser empregada em conjunto com qualquer combinação de endoglicanases e beta-glicosidases. Se o material celulósico compreender hemicelulose, hemicelulases, preferivelmente xila$ nases são adicionalmente empregadas para a degradação. As endoglicanases, beta-glicosidases e xilanases podem ser selecionadas daquelas descritas aqui, porém não estão limitadas às mesmas. Elas também podem ser preparações dè enzima comercialmente disponíveis. Além das celuloses e hemicelulases opcionais, uma ou mais outras enzimas podem ser empregadas, por exemplo, proteases, amilases, lacases, lipases, pectinases, esterases e/ou peroxidases. Outro tratamento da enzima pode ser realizado antes, durante ou após o tratamento da celulase.

O termo preparação de enzima refere-se a uma composição compreendendo pelo menos uma das enzimas desejadas. A preparação pode conter as enzimas na forma parcialmente purificada e isolada. Ela pode consistir essencialmente em uma enzima ou enzimas desejadas. Alternativamente, a preparação pode ser um meio de cultura gasto ou filtrado contendo uma ou mais enzimas celulósicas. Além da atividade celulósica, a pre15 paração pode conter aditivos, tais como, mediadores, estabilizadores, tampões, conservantes, agentes tensoativos e/ou componentes de meio de cultura. Os aditivos preferidos são aqueles que são geralmente usados nas preparações de enzima destinadas a uma aplicação específica. A preparação da enzima pode ser na forma de líquido, pó ou granulado. Preferivel20 mente, a preparação da enzima é o meio de cultura gasto. Meio de cultura * gasto refere-se ao meio de cultura do hospedeiro compreendendo as enzimas produzidas. Preferivelmente, as células hospedeiras são separadas do meio após a produção.

De acordo com uma concretização da invenção a preparação da enzima compreende uma mistura de CBH, EG e BG, opcionalmente em conjunto com xilanase e/ou outras enzimas. A CBH compreende uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80% de identidade com relação às SEQ ID N²®: 2, 4, 6 ou 8 ou com relação a um fragmento enzimaticamente ativo da mesma, e pode ser obtida de Thermoascus aurantiacus, Acremoni30 um thermophilum, ou Chaetomium thermophilum, considerando-se que EG, BG e xilanase podem ser de qualquer origem incluindo de outros organismos. Outras enzimas que podem estar presentes na preparação são, por $ exemplo, proteases, amilases, lacases, lipases, pectinases, esterases e/ou peroxidases.

Diferentes misturas de enzima e combinações podem ser usadas para se adequarem à diferentes condições de processo. Por exemplo, se o processo de degradação for realizado em uma temperatura alta, as enzimas termoestáveis serão escolhidas. Uma combinação de uma CBH da família 7 com uma endoglicanase da família 45, opcionalmente em combinação com uma BG da família 3 e/ou uma xilanase da família 10 possui excelente desempenho de hidrólise ambas a 45°C e em temperaturas elevadas.

Enzimas celulósicas de Tríchoderma reesei são convenientemente empregadas em temperaturas na faixa de cerca de 40-50°C na hidrólise e a 30-40°C em SFF. CBH, EG, BG e Xin obtidas de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum são eficazes nessas temperaturas também, porém além disso, a maioria delas também funciona muito bem em temperaturas entre 50°C e 75°C, ou mesmo até 80°C e 85°C, tais como entre 55°C e 70°C, por exemplo entre 60°C e 65°C. Para tempos de incubação curtos, misturas de enzima são funcionais até mesmo a 85°C, para hidrólise completa temperaturas mais baixas são normalmente empregadas.

O método para tratar material celulósico com CBH, EG, BG e

Xin é especialmente apropriado para produção de açúcares fermentados de material lignocelulósico. Os açúcares fermentados podem então ser fermentados por levedura em etanol e usados como combustível. Eles também podem ser usados como intermediários ou matérias-primas para a produção de várias substâncias químicas ou blocos de construção para os processos da indústria química, por exemplo, na assim chamada biorrefinaria. O material lignocelulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise enzimática, para fragmentar a estrutura da fibra dos substratos celulósicos e tornar a fração de celulose mais acessível às enzimas celulósicas. Os pré-tratamentos cor30 rentes incluem processos mecânicos, químicos ou térmicos e combinações dos mesmos. O material pode ser tratado, por exemplo, por explosão de vapor ou hidrólise de ácido.

Μ $

Vários polipeptídeos celulósicos foram encontrados em Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, e Chaetomium thermophiium. Os novos polipeptpídeos podem compreender um fragmento possuindo atividade celulósíca e serem selecionados do grupo consistindo em um poli5 peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 66%, preferivelmente 70% ou 75% de identidade com relação à SEQ ID N²: 4, 79% de identidade com relação à SEQ ID N²: 6, 78% de identidade com relação à SEQ ID N²: 12, 68%, preferivelmente 70% ou 75% de identidade em relação à SEQ ID N^s: 14, 72%, preferivelmente 75% de identidade em relação à SEQ ID N²:16, 68%, preferivelmente 70% ou 75% de identidade em relação à SEQ ID N^Q: 20, 74% de identidade com relação à SEQ ID N²: 22 ou 24, ou 78% de identidade com relação à SEQ ID N²:26.

Os novos polipeptídeos também podem ser variantes dos ditos polipeptídeos. Uma variante pode ser um polipeptídeo que ocorre natural15 mente, por exemplo, como uma variante alélica dentro da mesma cepa, espécie ou gênero, ou pode ter sido gerada por mutagênese. Ela pode compreender substituições, deleções ou inserções de aminoácido, porém ainda funciona de modo substancialmente semelhante às enzimas definidas acima, isto é, ela compreende um fragmento possuindo atividade celulósíca.

Os polipeptídeos celulósicos são geralmente produzidos na cé* lula como polipeptídeos imaturos compreendendo uma seqüência de sinal que é cliváda durante a secreção da proteína. Eles também podem ser adicionalmente processados durante secreção, na extremidade N-terminal e/ou C-terminal para fornecer uma proteína madura, enzimaticamente ativa. Um polipeptídeo compreendendo um fragmento possuindo atividade celulósíca significa que o polipeptídeo pode estar tanto na forma imatura quanto madura, preferivelmente está na forma madura, isto é, quando o processamento já aconteceu.

Os novos polipeptídeos podem ser, adicionalmente, um frag30 mento dos polipeptídeos ou variantes mencionados acima. O fragmento pode ser a forma madura das proteínas mencionadas acima ou pode ser apenas uma parte enzimaticamente ativa da proteína madura. De acordo com uma concretização da invenção, o polipeptídeo possui uma seqüência de aminoácido possuindo pelo menos 80, 85, 90, 95 ou 99% de identidade com relação às SEQ ID N^eS: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 ou 26 ou com relação a um fragmento celulosicamente ativo da mesma. Pode também ser uma variante do mesmo, ou um fragmento do mesmo possuindo atividade de celobioidrolase, endoglicanase, xilanase ou beta-glicosidade. De acordo com outra concretização da invenção, o polipeptídeo consiste essencialmente em um fragmento celulosicamente ativo de uma seqüência das SEQ ID N^2S: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 ou 26.

Os novos polinucleotídeos podem compreender uma seqüência de nucleotídeo das SEQ ID N²³: 3, 5, 11,13, 15,19, 21, 23 ou 25, ou uma seqüência codificando um novo polipeptídeo conforme definido acima, incluindo filamentos complementares do mesmo. Os polinucleotídeos conforme usados aqui referem-se a ambos RNA e DNA podendo ser de filamento simples ou duplo. O polinucleotídeo pode também ser um fragmento dos polinucleotídeos compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 25, 30 ou 40 nucleotídeos. De acordo com uma concretização da invenção ele possui pelo menos 100, 200 ou 300 nucleotídeos de comprimento. Adicionalmente, os polinucleotídeos podem ser degenerados como resultado do código genético em qualquer uma das sequências conforme definido acima. Isso significa que códons diferentes podem codificar o mesmo aminoácido.

De acordo com uma concretização da invenção o polinucleotídeo é compreendido'¹ das SEQ ID N^2S: 3, 5, 11, 13, 15, 19, 21, 23 ou 25, o que significa que a seqüência possui pelo menos parte da seqüência mencionada. De acordo com outra concretização da invenção, o polinucleotídeo compreende um gene semelhante ao incluído em um microorganismo possuindo número de acesso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

As novas proteínas/polipeptídeos podem ser preparados conforme descrito acima. Os novos polinucleotídeos podem ser inseridos em um vetor, que é capaz de expressar o polipeptídeo codificado pela seqüência heteróloga, e o vetor pode ser inserido na célula hospedeira de expressão & do dito polipeptídeo. A célula hospedeira é preferivelmente do gênero Trichoderma ou Aspergillus.

O gene heterólogo codificando os novos polipeptídeos foi introduzido em um plasmídeo em uma cepa Escheríchia coli possuindo número de acesso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.

As novas enzimas podem ser componentes de uma preparação de enzima. A preparação de enzima pode compreender um ou mais dos novos polipeptídeos e pode estar, por exemplo, na forma de meio de cultura 10 gasto, pó, grânulos ou líquido. De acordo com uma concretização da invenção a mesma compreende atividade de celobioidrolase, endoglicanase, beta-glicosidade e opcionalmente atividade de xilanase e/ou outras atividades de enzima. A mesma pode compreender, adicionalmente, quaisquer aditivos convencionais.

As novas enzimas podem ser aplicadas em qualquer processo envolvendo enzimas celulósicas, tais como, em combustível, têxteis, detergente, polpa e papel, alimentos, indústria de suprimentos ou bebidas, e especialmente na hidrólise de material celulósico para a produção de biocombustível compreendendo etanol. Na indústria de polpa e papel, elas podem ser usadas para modificar a fibra celulósica, por exemplo, no tratamento da * polpa kraft, tratamento mecânico da polpa ou papel reciclado.

A invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.

Deve ser entendido, contudo, que as concretizações fornecidas na descrição anterior e nos exemplos são para fins ilustrativos e que várias alterações e 25 modificações são possíveis dentro do escopo da invenção.

Exemplos

Exemplo 1. Classificação de cepas expressando atividade celulósica e seu cultivo para purificação

Cerca de 25 cepas de fungos da Roal Oy Culture Collection fo30 ram testadas quanto a atividade celulósica incluindo beta-glicosidases. Após classificação preliminar seis cepas foram escolhidas para estudos adicionais. Elas eram Thermoascus aurantiacus ALKO4239 e ALKO4242, Acremonium

thermophilum ALKO4245, Talaromyces thermophilus ALKO4246 e Chaetomium thermophilum ALKO4261 e ALKO4265.

As cepas ALKO4239, ALKO4242 e ALKO4246 foram cultivadas em frascos de agitação a 42°C por 7 dias no meio 3 x B, que contém g/litro: Celulose Solka Floe 18, grão 18 gasto do destilador, xilana 9 de aveia e espelta, CaCO₃2, carne de soja 4,5, (NH₄)HPO₄ 4,5, farelo de trigo 3,0, KH₂PO₄ 1,5, MgSO₄ H₂O 1,5, NaCI 0,5, KNO₃ 0,9, goma de alfarroba 9,0, solução de elemento de traço #1 0,5, solução de elemento de traço #2 0,5 e Struktol (Stow, OH, USA) antiespumante 0,5 mL; o pH foi ajustado para 6,5. Solução de elemento de traço #1 possui g/litro: MnSO₄ 1,6, ZnSO₄-7H₂O 3,45 e CoCI₂.6H₂O 2,0; solução de elemento de traço #2 possui g/litro: FeSO₄.7H₂O 5,0 com duas gotas de H₂SO₄ concentrado.

A cepa ALKO4261 foi cultivada em frascos de agitação no meio 1 x B, que possui um terço de cada um dos constituintes do meio 3 x B (acima, exceto que possui as mesmas concentrações de CaCO₃, NáCI e os elementos de traço. A cepa foi cultivada a 45°C por 7 dias.

A cepa ALKO4265 foi cultivada em frascos de agitação no meio que se segue, g/L: celulose Solka Floe 40, Pharmamedia™ (Traders Protein, Memphis, TN, USA) 10, pó impregnado com milho 5, (NH₄)₂SO4 5 e KH₂PO₄ 15; o pH foi ajustado para 6,5. A cepa foi cultivada a 45°C por 7 dias.

Após o cultivo, as células e outros sólidos foram coletados por centrifugação e o sobrenadante foi recuperado. Para os cultivos de frasco com agitação, os inibidores de protease PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila) e pepstatina A foram adicionados a 1 mM e 10 gg/mL, respectivamente. Se não forem usadas imedíatamente, as preparações serão armazenadas em alíquotas a -20°C.

Para a estimativa da atividade térmica das enzimas, foram realizados ensaios de preparações de cultivo em frasco de agitação a 50°C, 60°C, 65°C, 70°C e 75°C por 1 hora, na presença de 100 gg albumina de soro bovino (BSA)/mL como um estabilizador. Ensaios preliminares foram realizados a 50°C e 65°C em dois valores de pH diferentes (4,8/5,0 ou 6,0) de modo a tornar claro qual pH seria mais apropriado ao ensaio de atividade térmica.

<2/R5

Todos os sobrenadantes do frasco de agitação foram ensaiados quanto às seguintes atividades:

Atividade semelhante à Celobioidrolase I ('CBHI') e atividade semelhante à éndoglicanase I (ΈΘΓ):

Essas foram medidas em um tampão de acetato de Nas 40 mM com 0,5 mM de MUL (4-metilumbeliferil-beta-D-lactosídeo) como o substrato. Glicose (100 mM) foi adicionada para inibir qualquer interferência na atividade da beta-glicosidase. 4-metilumbeliferi!a liberada foi medida a 370 nm. a atividades dá 'CBHI¹ e da ΈΘΓ foram distinguidas por medição da atividade na presença e ausência de celobiose (5 mM). A atividade que não é inibida pela celobiose representa a atividade da ΈΘΙ' e o restante da atividade de MUL representa a atividade da 'CHBI' (van Tilbeurgh e outros, 1988). O ensaio foi realizado em pH 5,0 ou 6,0 (vide a seguir).

A atividade da endoglicanase (CMCase):

Essa foi ensaiada com 2% (peso/volume) de carboximeticelulose (CMC) como o substrato em 50 mM e tampão citrato essencialmente conforme descrito por Bailey e Nevalainen 1981; Haakana e outros. 2004. Os açúcares de redução foram medidos com o reagente de DNS. O ensaio foi realizado em pH 4,8 ou 6,0 (vide a seguir).

Atividade da beta-glicosidase (BGU):

* Essa foi ensaiada com 4-nitrofenil-p-D-glicopiranosídeo (1 mM) em 50 mM de tampão citrato conforme descrito por Bailey e Nevalainen 1981. O 4-nitrofeno! liberado foi medido a 400 nm. O ensaio foi realizado em pH de 4,8 ou 6,0 (vide a seguir).

As atividades relativas das enzimas são apresentadas na figura

1. As atividades relativas foram apresentadas por ajuste da atividade a 60°C como 100% (figura 1). Todas as cepas produziram enzimas que possuíam alta atividade em temperaturas altas (65°C-75°C).

Para purificações da proteína, a ALKO4242 também se desen30 volveu em um bioreator de 2 litros (Braun Biostat^(R) B, Braun, Melsungen, Alemanha) no meio que se segue, g/litro: celulose Solka Floc 40, carne de soja 10, NH4NO3 5, KH2PO4 5, MgSO₄.7H₂O 0,5, CaCI₂-2H₂O 0,05, solução de elemento de traço #1 0,5, solução de elemento de traço #2 0,5. A aeração foi de 1 wm, controle do antiespumante com Struktol, agitação a 200800 rpm e temperatura a 47°C. Duas bateladas foram operadas, uma em pH 4,7 ± 0,2 (NH3/H2SO4) e a outra com pH inicial de 4,5. O tempo de cultivo foi de 7 dias. Após o cultivo as células e outros sólidos foram removidos por centrifugação.

A cepa ALKO4245 foi desenvolvida em bioreator de 2 litros (Braun Biostat^(R) B, Braun, Meisungen, Alemanha) no meio que se segue, g/litro: celulose Solka Floe 40, pó impregnado com milho 15, grão 5 gasto do destilador, xilaná 3 de aveia e espelta, goma de alfarroba 3, (NH^SCU e KH2PO4. A faixa do pH foi de 5,2+0,2 (NH3/H2SO4), aeração 1 wm, agitação 300-600 rpm, controle antiespuma com Struktol e a temperatura a 42°C. O tempo de cultivo foi de 4 dias. Após 0 cultivo as células e outros sólidos foram removidos por centrifugação.

Para purificação da enzima, ALKO4261 foi desenvolvida em um bioreator de 10 litros (Braun Biostat^(R) ED, Braun, Meisungen, Alemanha) no meio que se segue, g/litro: celulose Solka Floe 30, grão 10 gasto no destilador, xilana 5 de aveia e espelta, CaCO₃ 2, carne de soja 10, farelo de trigo 3,0, (NH₄)₂SO₄ 5, KH2PO4 5, MgSO₄-7H₂O 0,5, NaCI 0,5, KNO₃ 0.3, solução de elemento de traço #1 0,5 e solução de elemento de traço #2 0,5. A faixa de pH era de 5,2 ± 0,2 (NH3/H2SO4), aeração de 1 wm, agitação de 200-600 rpm, controle de antiespumante com Struktol e a temperatura de 42°C. O tempo de cultivo foi de 5 diás. Uma segunda batelada foi desenvolvida sob condições semelhantes, exceto que Solka Floe foi adicionada a 40 g/L e o grão gasto a 15 g/L. Os sobrenadantes foram recuperados por centrifugação e filtração através de filtros Seitz- K 150 and EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemanha). O último sobrenadante foi concentrado cerca de dez vezes usando 0 sistema de ultrafiltração Pellicon mini (filtro NMWL 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).

Para purificação da enzima, ALKO4265 também se desenvolveu em um bioreator de 10 litros (Braun Biostat^(R) ED, Braun, Meisungen, Alemanha) no mesmo meio como acima, exceto que KH₂PO₄ foi adicionado a

2,5 g/L. A faixa de pH era de 5,3 ± 0,3 (NH3/H2SO4), aeração de 0,6 wm, agitação de 500 rpm, controle de antiespumante com Struktol e a temperatura de 43°C. O tempo de cultivo foi de 7 dias. Os sobrenadantes foram recuperados por céntrifugação e filtração através de filtros Seitz-K 150 and EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemanha). O último sobrenadante foi concentrado cerca de vinte vezes usando o sistema de ultrafiltração Pellicon miní (filtro NMWL 10 kDa; Millipore, Billerica, MA, USA).

Exemplo 2. Purificação e caracterização de celobioidrolases a partir de Acremonium thermophilum ALKO4245 e Chaetomium thermophilum 10 ALKO4265

Acremonium thermophilum ALKO4245 e Chaetomium thermophilum ALKO4265 se desenvolveram conforme descrito no Exemplo 1. As celobioidrolases principais foram purificadas empregando a coluna de afinidade com base em p-aminobenzil 1-tio-p-celobiosídeo, preparada conforme 15 descrito por Tomme e outros, 1988.

Os sobrenadantes de cultura foram primeiro tamponados em 50 mM de tampão de acetato de sódio, pH 5,0, contendo 1 mM de δgliconolactona e 0,1 M de glicose a fim de retardar a hidrólise do ligante na presença de β-glicosidases. As celobioidrolases foram eluídas com 0,1 M de 20 lactose e finalmente purificadas por filtração com cromatografia de gel em• pregando colunas Superdex 200 HR 10/30 no sistema AKTA (Amersham Pharmacia Biotech). O tampão empregado na filtração com gel era fosfato de sódio 50 mM, pH 7_y0, contendo cloreto de sódio 0,15 M.

Celobioidrolases purificadas foram analisadas por SDS25 eletroforese de gel poliacrilamida e a massa molecular de ambas as proteínas foi determinada como sendo de aproximadamente 70 kDa, avaliada com base no padrão de massa molecular (Low molecular weight calibration kit, Amersham Biosciences). As celobioidrolases Acremonium e Chaetomium foram denominadas como At Cel7A e Ct Cel7A, respectivamente, seguindo30 se o esquema em Henrissat e outros. (1998) (Henrissat, 1991; Henrissat e Bairoch, 1993).

A atividade específica das preparações foi determinada empre gando 4- metilumbeliferil-p-D-lactosídeo (MUL), 4-metilumbeliferil-p-Dcelobiosídeo (MUG2) ou 4-metilumbeliferil-p-D-celotriosídeo (MUG3) como o substrato (van Tilbeurgh e outros, 1988) em 0,05 M tampão de citrato de sódio pH 5 a 50°C por 10 min. As atividades da endoglicanase e xilanase fo5 ram determinadas por procedimentos padrão (de acordo com IUPAÇ, 1987) empregando carboximetil celulose (CMC) e glicuronoxilana de bétula (Bailey e outros, 1992) como o substratos. A atividade específica contra Avicel foi calculada com base nos açúcares de redução formados em uma reação de 24 horas a 50°C, pH 5,0, com substrato a 1% e dosagem de enzima de 0,25 10 μΜ. O teor da proteína das preparações de enzima purificadas foi medido de acordo com Lowry e outros, 1951. De modo a caracterizar os produtos finais de hidrólise, açúcares solúveis liberados em experimento de hidrólise de 24 horas, conforme descrito acima, foram analisados por HPLC (Dionex). Celobioidrolase I purificada (CBHI/Cel7A) do Tríchoderma reesei foi empregada 15 como uma referência.

As atividades específicas das enzimas purificadas e aquela de T.reesei CBHI/Cel7A são apresentadas na Tabela 1. As celobioidrolases At Cel7A e Ct Cel7A possuem atividades específicas maiores contra substratos sintéticos pequenos, quando comparadas à T.reesei CBHI/Cel7A. A ativida20 de específica contra Avicel foi claramente maior com as enzimas reveladas aqui. Atividades baixas das preparações da enzima purificada contra xilana e CMC podem tanto ser devidas às proteínas propriamente, quanto pelo menos parcialmente às quantidades menores restantes das enzimas de contaminação. O produto final principal de hidrólise da celulose por todas enzimas 25 purificadas foi celobiose que é típica das celobioidrolases.

Tabela 1. Atividades específicas (nkat/mg) das celobioidrolases purificadas e a enzima de referência de Ύ.reesei (50°C, pH 5,0, 24 horas).

Substrato	A. thermophilum ALKO4245 Cal7A	C. thermophilum ALKO4265 Ce!7A	T. reesei Cel7A
Xilana	11,3	6,7	1,3
CMC	26,2	5,5	1,0
MUG2	9,2	18,9	4,3
MUG3	1.3	1,5	0,9
MUL	21,5	54,0	21,9
Avicel	1,8	1,4	0,6

A estabilidade térmica das celobioidrolases purificadas foi determinada em temperaturas diferentes. A reação foi realizada na presença 5 de 0,1% BSA em pH 5,0 por 60 minutos empregando 4-metilumbeliferil-p-Dlactosídeo como o substrato. CBH/Cel7A de C. thermophilum ALKO4265 e CBH/Cel7A de A. thermophilum ALKO4245 foram estáveis até 65°C e 60°C, respectivamente. A enzima de referência T. reesei (CBHI/Cel7A) reteve 100% da atividade até 55°C.

Exemplo 3. Purificação e caracterização de uma endoglicanase a partir de Acremonium thermophilum ALKO4245

Acremonium thermophilum ALKO4245 foi desenvolvida confor» . · me descrito no Exemplo 1. O sobrenadante da cultura foi incubado a 70°C por 24 horas, após o que foi concentrado por ultrafiltração. A endoglicanase pura foi obtida por purificação sequencial com interação hidrófoba e cromatografia de troca de cátion seguido por filtração com gel. A atividade de endoglicanase das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando carboximetil celulose (CMC) como o substrato (procedimento do IUPAC 1987). O teor da proteína foi medido por Kit de Ensaio BioRad (Bio20 Rad Laboratories) empregando albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante de cultura concentrado foi aplicado a uma coluna de interação hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl FF, equilibrada com 20 mM de tampão fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1 M (NH₄)₂SO₄. As proteínas ligadas foram eluídas com o gradiente linear a partir do tampão acima para 5 mM de fosfato de potássio, pH 6,0. As frações foram coletadas e a atividade de endoglicanase foi determinada conforme descrito acima. A atividade de endoglicanase foi eluída em uma área de condutividade ampla de 120 a 15 mS/cm.

Frações combinadas foram aplicadas a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP XL equilibrada com um gradiente linear de 0 a 0,25 M NaCI no tampão de equilíbrio. A atividade de endoglicanase contendo proteína foi eluída na área de condutividade de 3-7 mS/cm. Cromatografia de troca de cátion foi repetida e o eluato de proteína foi concentrado por liofilização.

A amostra dissolvida foi carregada em uma coluna de filtração de gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada com 20 mM de tampão fosfato de sódio pH 7,0, contendo 0,15 M de NaCI. A fração da proteína principal foi eluída da coluna com o volume de retenção de 13,3 mL. O eluato da proteína foi tido como sendo puro por SDS-eletroforese de gel de poliacrilamida e 15 o peso molecular foi avaliado como sendo de 40 kDa. A atividade específica da proteína purificada, denominada como At EG-40, a 50°C foi determinada como sendo de 450 nkat/mg (procedimento do IUPAC 1987, empregando CMC como o substrato).

A estabilidade térmica da endoglicanase purificada foi determi20 nada em temperaturas diferentes. A reação foi realizada na presença de 0,1 mg/mL BSA em pH 5,0 por 60 minutos empregando carboximetil celulose como o substrato. EG-40/Cel45A de A thermophilum foi estável até 80°C. As enzimas de referência de EGI (Cel7B) e EGIl (Cel5A) T. reesei mantiveram 100% de atividade até 60°C e 65°C, respectivamente.

Exemplo 4. Purificação de uma endoglicanase a partir Chaetomíum thermophilum ALKO4261

Chaetomíum thermophilum ALKO4261 foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 1. A endoglicanase pura foi obtida por purificação sequencial com interação hidrófoba e cromatografia de troca de cátion se30 guido por filtração com gel. A atividade de endoglicanase das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando carboximetil celulose (CMC) como o substrato (procedimento do IUPAC 1987).

Ο*

Sulfato de amônio foi adicionado ao sobrenadante da cultura para alcançar a mesma condutividade como 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1 M (NH₄)2SO₄. A amostra foi aplicada a uma coluna de interação hidrófobà HiPrep 16/10 Phenyl FF equilibrada com 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1M (NH₄)₂SO₄. A eluição foi realizada com um gradiente linear de 20 a 0 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, seguido por 5 mM de fosfato de potássio, pH 6,0 e água. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 6 M de uréia. As frações foram coletadas e a atividade da endoglicanase foi analisada conforme descrito acima. A pro10 teína contendo atividade de endoglicanase foi eluída no começo do gradiente de uréia.

As frações foram combinadas, equilibradas para 16 mM Tris-HCI pH 7,5 (I = 1,4 mS/cm) por coluna 10DG (Bio-Rad) e aplicadas a uma coluna de troca de ânion HiTrap DEAE FF com 20 mM Tris-HCI, pH 7,5. As proteí15 nas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 1 M NaCI no tampão de equilíbrio. As frações foram coletadas e analisas quanto a atividade de endoglicanase conforme descrito acima. A proteína foi eluída na faixa de 10-20 mS/cm.

A amostra foi equilibrada para 15 mM acetato de sódio, pH 4,5 por coluna 10DG (Bio-Rad) e aplicada a uma coluna de troca de cátion Hi• Trap SP XL equilibrada com 20 mM de acetato de sódio, pH 4,5. As proteínas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 0,4 M de acetato de sódio, pH 4,5. A atividade da endoglicanase foi avaliada na faixa de 1-10 mS/cm. A amostra coletada foi liofilizada.

A amostra foi dissolvida em água e aplicada a uma coluna de filtração de gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada com fosfato e sódio 20 mM pH 6,0, contendo 0,15 M de NaCI. As frações foram coletadas e aquelas contendo atividade de endoglicanase foi combinadas. O eluído da proteína foi tido como sendo puro por SDS-eletroforese de gel poliacrilamida e a massa molecular foi avaliada com base no padrão de massa molecular (padrão SDS-PAGE pré-colorido, Faixa Ampla, Bio-Rad) como sendo de 54 kDa. O pi da proteína purificada, denominada como Ct EG-54 foi determina35 do com PhastSystem (Pharmacia) como sendo de cerca de 5,5.

Exemplo 5. Purificação de uma endoglicanase a partir de Thermoascus aurantiacus ALKO4242

Thermoascus aurantiacus ALKO4242 foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 1. A endoglicanase pura foi obtida por purificação seqüencial com interação hidrófoba e cromatografia de troca de ânion seguido por filtração com gel. A atividade de endoglicanase das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando carboximetil celulose (CMC) como o substrato (procedimento do IUPAC 1987). O teor da proteína foi medido pelo Kit de Ensaio BioRad (Bio-Rad Laboratories) empregando albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de interação hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl equilibrada com 20 mM de tampão fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,7 M (NH^SCU. As proteínas ligadas foram eluídas com 0,2 M (NH₄)2SO4 (I = 39 mS/cm). As frações contendo atividade de endoglicanase foram combinadas e concentradas por ultrafiltração.

A amostra foi dessalinizada em colunas 10DG (Bio-Rad) e aplicada a uma coluna de troca de ânion HíTrap DEAE FF equilibrada com 15 mM Tris- HCL, pH 7,0. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 0 a 0,4 M NaCI no tampão de equilíbrio. A proteína contendo atividade de endoglicanase foi eluída na área de condutividade de 15-21 mS/cm. Frações coletadas foram combinadas e concentradas como acima.

A amostra foi aplicada a uma coluna de filtração de gel Sephacryl S-100 HR 26/60, equilibrada com 50 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0, contendo 0,05 M de NaCI. A fração de proteína contendo atividade de endoglicanase foi eluída da coluna com um volume de retenção correspondendo a um peso molecular de 16 kDa. As frações coletadas foram combinadas, concentradas e a filtração do gel foi repetida. O eluído da proteína foi julgado como sendo puro por SDS-eletroforese de gel de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 28 kDa. O pl da proteína purificada, denominada como Ta EG-28, foi determinado em um gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) como sendo de cerca de 3,5. A atividade especí

303 fica de Ta EG-28 a 50°C foi determinada como sendo de 4290 nkat/mg (procedimento do IUPAC 1987, empregando CMC como o substrato).

Exemplo 6. Purificação e caracterização de uma β-glicosidase a partir de Acremoniüm thermophilum ALKO4245

Acremoniüm thermophilum ALKO4245 foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 1. A β-glicosidase pura foi obtida por purificação seqüencial com interação hidrófoba e cromatografia de troca de ânion seguido por fiitração com gel. A atividade da β-glicosidase das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando 4-nitrofenil^-D10 glucopiranosídeo como o substrato (Bailey and Linko, 1990). O teor da proteína foi medido pelo Kit de Ensaio BioRad (Bio-Rad Laboratories) empregando albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de interação hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF, equilibrada com 20 mM 15 de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1 M (NH₄)₂SO₄. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear do tampão de equilíbrio para 5 mM de fosfato de potássio na área de condutividade 137-16 mS/cm. As frações coletadas foram combinadas e concentradas por ultrafiltração.

A amostra foi dessalinizada em colunas 10DG (Bio-Rad) e apli20 cada a uma coluna de troca de ânion de HiTrap DEAE FF equilibrada com ¹ 10 mM de fosfato de potássio pH 7,0. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear a partir do tampão de equilíbrio para ao mesmo tampão contendo 0,25 M de NaCI na área de condutividade de 1,5-12 mS/cm. Cromatografia de troca de ânion foi repetida como acima, exceto que 4 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,2, foram usados. As proteínas foram eluídas na área de condutividade de 6-9 mS/cm. As frações contendo atividade de β-glicosidase foram coletadas, combinadas e concentradas.

O material ativo da cromatografia de troca de ânion foi aplicado a uma coluna Sephacryl S-300 HR 26/60 equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 6,5 contendo 0,15 M de NaCI. A proteína com atividade de βglicosidase foi eluída com um volume de retenção correspondendo a um pe30^ &

so molecular de 243 kDa. A proteína foi considerada pura por SDSeletroforese de gel de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 101 kDa. O pl da proteína purificada, denominada como At βΘ101, foi determinado em um gel IEF (PhastSystem, Pharmacia) como estan5 do na área de 5,6-4,9. A atividade específica de At βΘ-1Ο1 a 50°C foi determinada como sendo de 1.100 nkat/mg (empregando 4-nitrofenil-p-Dglicopiranosídeo como o substrato, Bailey and Linko, 1990).

A estabilidade térmica da β-glicosidase purificada foi determinada em temperaturas diferentes. A reação foi realizada na presença de 0,1 mg/mL BSA em pH 5,0 por 60 minutos, empregando 4-nitrofenil^-Dglicopiranosídeo como o substrato. βΘ-101 de A. thermophílum foi estável até 70°C. A enzima de referência Aspergillus (Novozym 188) manteve í00% de atividade até 60°C.

Exemplo 7. Purificação de uma β-glicosidase a partir de Chaetomium thermophilum ALKO4261

Chaetomium thermophilum ALKO4261 foi desenvolvido conforme descrito no Exemplo 1. A β-glicosidase pura foi obtida por purificação sequencial com interação hidrófoba, cromatografía de troca de ânion e de cátion seguido por filtração com gel. A atividade da β-glicosidade das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando 4-nitrofenil^-Dglicopiranosídeo como o substrato (Bailey and Linko, 1990).

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de interação HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada com 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,8 M (NH^SO^ A eluição foi realizada com um gradiente linear do tampão de equilíbrio para 3 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, seguido por eluição com água e 6 M de uréia. As primeiras frações com atividade β-glicosidase foram eluídas na área de condutividade de 80-30 mS/cm. A segunda atividade da β-glicosidase foi avaliada com 6M uréia. As frações ativadas eluídas por uréia foram agrupadas e dessaliniza30 das em colunas 10DG (Bio-Rad) equilibradas com 10 mM de Tris-HCI em pH

7,0.

Após dessalinização, a amostra foi aplicada a uma coluna de $

troca de ânion HiTrap DEAE FF equilibrada com 15 mM de Tris-HCI, pH 7,0.

A proteína não se ligou à coluna, porém foi eluída durante a alimentação da amostra. Essa fração de fluxo atravessante foi dessalinizada em colunas de 10DG (Bio-Rad) equilibradas com 7 mM de acetato de Na, pH 4,5.

A amostra da cromatografia de troca de ânion foi aplicada a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP FF equilibrada com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,5. As proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear de 10 mM a 400 mM de acetato de sódio, pH 4,5. As frações com atividade de β-glicosidase eluindo na área de condutividade de 6,5-12 mS/cm foram coletadas, dessalinizadas em colunas 10DG (Bio-Rad) equilibradas com 7 mM de acetato de sódio, pH 4,5 e secas por congelamento.

A amostra liofilisada foi diluída a 100 gL de água e aplicada a uma coluna de filtração de gel Superdex 75 HF10/30 equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 4,5, contendo 0,15 M de NaCI. A atividade da β15 glicosidase foi eluída em um volume de retenção de 13,64 mL. Frações coletadas foram combinadas, liofilisadas e dissolvidas em água. A proteína foi considerada pura por SDS-eletroforese de gel de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 76 kDa. A proteína foi denominada como Ct βΘ-76.

Exemplo 8. Purificação e caracterização de uma β-glicosidase a partir * de Thermoascus aurantiacus ALKO4242

Thermoascus aurantiacus ALKO4242 foi desenvolvido conforme descrito no Exemplo .1. A β-glicosidase pura foi obtida por purificação sequencial com interação hidrófoba, cromatografia de troca de cátion e ânion seguido por filtração com gel. A atividade da β-glicosidase das frações coletadas durante purificação foi determinada empregando 4-nitrofenil^-Dglicopiranosídeo como o substrato (Bailey and Linko, 1990). O teor da proteína foi medido pelo Kit de Ensaio BioRad (Bio-Rad Laboratories) empregando albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de interação HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada com 20 mM fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,7 M (NH₄)₂SO₄. As proteínas ligadas foram elu39

idas com um gradiente linear de 0,2 M (NH₄)₂SO₄ a 5 mM fosfato de potássio, pH 6,0. A atividade da β-glicosidase foi eluída durante o gradiente na área de condutividade de 28,0-1,1 mS/cm. Asa frações foram combinadas e concentradas por ultrafiltração.

A amostra foi dessalinizada em colunas de 10DG (Bio-Rad) e aplicada a uma coluna de troca de ânion HiTrap DEAE FF equilibrada com 20 mM de Tris-HCI pH 7,0. A enzima foi eluída com um gradiente linear de 0 a 0,2 M NaCI no tampão de equilíbrio e com eluição retardada por 20 mM de Tris-HCI contendo 0,4 M NaCI. A amostra eluindo na área de condutividade de cerca de 10-30 mS/cm foi concentrada por ultrafiltração e dessalinizada por coluna de 10DG (Bio-Rad).

A amostra foi aplicada a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP XL equilibrada com 9 mM de acetato de sódio, pH 4.5. A enzima foi eluída com um gradiente linear de 10 mM a 400 mM de NaAc e por eluição retardada empregando 400 mM de NaAc pH 4,5. As proteínas com atividade de β-glicosidase foram eluídas amplamente durante o gradiente linear na área de condutividade de 5,0-11,3 mS/cm.

O material ativo da cromatografia de troca de cátion foi aplicado a uma coluna Sephacryl S-300 HR 26/60 equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, pH 7,0, contendo 0,15M de NaCI. A proteína com atividade de βglicosidase foi eluída com um volume de retenção correspondendo a um peso molecular de 294 kDa. As frações coletadas foram combinadas, liofilisadas e dissolvidas em água. A proteína foi considerada pura por SDSeletroforese de gel de poliacrilamida e o peso molecular foi avaliado como sendo de 81 kDa representando mais provavelmente a forma monomérica da proteína. O focalização isoelétrica (IEF) foi realizada usando um gel 3-9 pl. Após coloração com prata, uma área ampla acima de pl 5,85 foi colorida além de uma faixa estreita correspondendo a pl 4,55. A atividade específica da proteína purificada denominada como Ta ββ-81 a 50°C foi determinada como sendo de 600 nkat/mg empregando 4-nitrofenil^-D-glicopiranosídeo como o substrato (Bailey and Linko, 1990).

A estabilidade térmica da β-glicosidase purificada foi determina40

da em temperaturas diferentes. A reação foi realizada na presença de 0,1 mg/mL BSA em pH 5,0 por 60 minutos, empregando 4-nitrofenil-p-Dglicopiranosídeo como o substrato. T. aurantiacus ββ-81 foi estável até 75°C. A enzima de referência Aspergillus (Novozym 188) manteve 100% de 5 atividade até 60°C.

Exemplo 9. Purificação de uma xilanase a partir de Acremonium thermophilum ALKO4245

Acremonium thermophilum ALKO4245 foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 1. O sobrenadante da cultura foi incubado a 70°C por 24 10 horas, após o que, foi concentrado por ultrafiltração. A xilanase pura foi obtida por purificação sequencial com interação hidrófoba e cromatografia de troca de cátion seguido por filtração com gel. A atividade da xilanase foi determinada empregando uma xilana de bétula como o substrato (procedimento do IUPAC 1987). A proteína foi ensaiada por Kit de Ensaio BioRad Protein (Bio-Rad 15 Laboratories) empregando albumina de soro bovino, como padrão.

O sobrenadante concentrado da cultura foi aplicado a uma coluna de interação hidrófoba HiPrep 16/10 Butyl FF equilibrada com 20 mM de tampão fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 1M (NH₄)₂SO4. As proteínas ligadas foram avaliadas com gradiente linear a partir do tampão acima para 20 fosfato de potássio 5mM, pH 6,0. A fração de proteína foi eluída em uma * área de condutividade ampla de 120 a 15 mS/cm.

A amostra da coluna de interação hidrófoba foi aplicada a uma coluna de troca de cátion HiTrap SP XL equilibrada com 8 mM de acetato de sódio, pH 4,5. A proteína não se ligou a essa coluna, mas foi eluída no fluxo 25 atravessante durante a alimentação da amostra. Esse eluído foi concentrado por ultrafiltração. A cromatografia hidrófoba foi repetida conforme descrito acima. As proteínas não ligadas foram coletadas e secas por congelamento.

A amostra dissolvida foi carregada em uma coluna de filtração de gel Superdex 75 HR10/30 equilibrada com 20 mM de tampão de fosfato 30 de sódio, pH 7,0, contendo 0,15 M NaCI. A proteína eluída da coluna com o volume de retenção de 11,2 ml_ foi julgada como sendo pura por SDSeletroforese de gel de poliacrilamida. A massa molecular da proteína purifi41

cada foi avaliada com base no padrão da massa molecular (padrão SDSPAGE pré-colorido, Faixa Ampla, Bio-Rad) como sendo de 60kDa. A atividade específica da proteína, denominada como At XYN-60, a 50°C foi determinada como sendo de 1.800 nkat/mg (procedimento do IU-PAC 1987, empre5 gando xilana de bétula como o substrato). A atividade relativa foi aumentada em cerca de 1,2 vezes a 60°C e 1,65 vezes a 70°C (10 minutos, pH 5,0) quando comparada a 50°C. As atividade específicas contra MUG2 (4metilumbeliferil-p-D-celobiosídeo), MUL (4-metilumbeliferil-p-D-lactosídeo) e MUG3 (4-metil-umbeliferil-p-D-celotriosídeo) foram de 54, 33 e 78 nkal/mg 10 (50°C, pH 5,0 10 minutos), respectivamente. Isso está de acordo com o fato de que a família de 10-xilanases também mostra atividade contra os aril glicopiranosídeos (Biely e outros, 1997).

Exemplo 10. Purificação de uma xilanase a partir de Thermoascus aurantiacus ALKO4242

Thermoascus aurantiacus ALKO4242 foi desenvolvida conforme descrito no Exemplo 1. A xilanase pura foi obtida por purificação sequencial com interação hidrófoba, cromatografia de troca de ânion e cátion seguido por filtração com gel. A atividade da xilanase foi determinada empregando xilana de bétula como o substrato (procedimento do IUPAC 1987). A proteí20 na foi ensaiada por kit de ensaio de Proteína de BioRad (Bio-Rad Laboratories) empregando albumina de soro bovino como padrão.

O sobrenadante da cultura foi aplicado a uma coluna de interação hidrófoba HiPrep 16/10 Phenyl Sepharose FF equilibrada com 20 mM de tampão de fosfato de potássio pH 6,0, contendo 0,7 M (Nl-UfeSO* As proteí25 nas ligadas foram eluídas com um protocolo de eluição de duas etapas. A eluição foi realizada por queda da concentração de sal primeiro a 0,2 M (NH₄)₂SO₄ e após isso, foi fornecido um gradiente linear de 20 mM de fosfato de potássio, pH 6,0, contendo 0,2 M (NH₄)₂SO₄a 5 mM de fosfato de potássio, pH 6,0. A proteína foi eluída com 0,2 M (NH₄)₂SO4 (I » 39 mS/cm).

A amostra foi dessalinizada em colunas 10DG (Bio-Rad) e aplicada a uma coluna de troca de ânion HiTrap DEAE FF equilibrada com 15 mM de Tris-HCI, pH 7,0. A proteína não se ligou à coluna de troca de ânion, porém foi eluída no fluxo atravessante. A condutividade da amostra foi ajustada para corresponder àquela do acetato de sódio 20 mM, pH 4,5 por adição de água e o pH foi ajustado para 4,5 durante a concentração por ultrafiltração.

A amostra foi aplicada a uma coluna de troca de cátion HiTrap

SP XL equilibrada com 20 mM de acetato de sódio, pH 4,5. As proteínas de ligação foram eluídas com gradiente linear a partir do tampão de equilíbrio para o mesmo tampão contendo ΊΜ NaCI. A enzima foi eluída na área de condutividade de 1-7 mS/cm. A amostra foi liofilisada e após isso dissolvida 10 em água.

A amostra liofilisada foi dissolvida em água e aplicada a uma coluna de filtração de gel Superdex 75 HR 10/30 equilibrada com 20 mM de fosfato e sódio pH 7,0, contendo 0,15 M de NaCI. A proteína foi eluída da coluna com um volume de retenção correspondendo a um peso molecular 15 de 26 kDa. A proteína foi julgada como sendo pura por SDS-eletroforese de gel poliacrilamida. A massa molecular da proteína pura era de 30 kDa conforme avaliada com base no padrão de massa molecular (padrão SDSPAGE pré-colorido, Faixa Ampla, Bio-Rad). O pi da proteína purificada, denominada como Ta XYN-30 foi determinado com PhastSystem (Pharmacia) 20 como sendo de cerca de 6,8. A atividade específica de TA XYN-30 a 50°C * foi determinada como sendo de 4.800 nkat/mg (procedimento do IUPAC

1987, usando xilana de bétula como substrato).

Exemplo 11. Seqüenciamento interno do aminoácido

Os peptídeos internos foram seqüenciados por ionização de ele25 troaspersão combinada à espectrometria de massa em série (ESI-MS/MS) empregando instrumento Q-TOF1 (Micromass). A proteína foi primeiro alquilada e digerida em peptídeos trípticos. Os peptídeos gerados foram dessalinizados e parcial mente separados por nanocromatografia de líquidos (fase reversa) antes da aplicação ao instrumento Q-TOF1. As seqüências de pep30 tídeo internas para celobioidrolases de Chaetomium thermophilum e Acremonium thermophilum são mostradas na Tabela 2. Os peptídeos da Chaetomium CBH foram obtidos após o gene cbh correspondente ser clonado. Os <310 &

peptídeos determinados de Acromonium CBH não foram utilizados na clonagem do gene correspondente.

Tabela 2. Sequências de peptídeo interno determinadas a partir de Chaetomium thermophilum ALKO4265 CBH (1-C-4-C) e Acremonium thermophilum 5 ALKO4245 CBH (1-A-4-A). ___________________________

Peptídeo	Seqüência
Peptídeo 1 C	TPSTNDANAGFGR
Peptídeo 2 C	VAFSNTDDFNR
Peptídeo 3 C	FSNTDDFNRK
Peptídeo 4„C	P G N S L/I T Q E Y C D A Q/K K
Peptídeo 1 A	V T 0 F I/L T G
Peptídeo 2 A	MGDTSFYGPG
Peptídeo 3„A	CDPDGCDFN
Peptídeo 4 A	S G N S L/I T T D F

l/L = leucina e isoleucina possuem a mesma massa molecular e não podem ser distinguidas na análise de ESI-MS/MS.

Q/K = a massa molecular de glutamina e lisina difere apenas em 0,036 ka e não pode ser distinguida na análise de ESI-MS/MS.

As seqüências de peptídeo interno da endoglucanase purificada, β-glicosidases e xilanases de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 e Thermoascus aurantiacus ALKO4242 são listadas nas Tabelas 2, 4 e 5.

Tabela 3: Seqüências de peptídeo interno determinadas a partir das endògli15 canases de EG-40 de Acremonium thermophilum ALKO4245, EG-54 de Chaetomium thermophilum ALKO4261 e EG-28 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242

Proteína	Peptídeo	Seqüência(a
At EG 40	Peptídeo 1	QSCSSFPAPLKPGCQWR
	Peptídeo 2	YA. LTFNSGPVAGK
	Peptídeo 3	VQCPSELTSR
	Peptídeo 4	nqpvfscsadwqr
	Peptídeo 5	YWDCCKPSCGWPGK

3// &

Proteína	Peptídeo	Seqüência(a
	Peptídeo 6	P T F T
Ct EG 54	Peptídeo 1	EPEPEVTYYV
	Peptídeo 2	YY1LDQTEQY
	Peptídeo 3	RYCACMDLWEANSR
	Peptídeo 4	PGNTPEVHP Q/K
	Peptídeo 5	S I/L A P Η P C N Q/K
	Peptídeo 6	Q Q ϊ E M F R
	Peptídeo 7	ALNDDFCR
	Peptídeo 8	W G N P P P R
Ta EG„28	Peptídeo 1	I/L TSATQWLR
	Peptídeo 2	G C A I/L SATCVSST I/L G Q E R
	Peptídeo 3	P F Μ Μ E R
	Peptídeo 4	QYAVVDPHNYGR

(a l/L = leucina e isoleucina possuem a mesma massa molecular e não podem ser distingüidas na análise de ESI-MS/MS.

Q/K = a massa molecular de glutamina e lisina difere apenas em 0,036 ka e não pode ser distinguida na análise de ESI-MS/MS.

Tabela 4: Sequências de peptídeo interno determinadas a partir das betaglicosidases de βΘ-101 de Acremonium thermophilum ALKO4245, βΘ-76 de Chaetomium thermophilum ALKO4261 e βΘ-81 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242

Proteína	Peptídeo	Seqüência(a
At BG„101	Peptídeo 1	SPFTWGPTR
	Peptídeo 2	VVVGDDAGNPC
	Peptídeo 3	AFVSOLTLLEK
	Peptídeo 4	G T D V L/I Y T P N N K
	Peptídeo 5	QPNPAGPNACVL/IR
Ct BG 76	Peptídeo 1	EGLFIDYR
	Peptídeo 2	PGOSGTATFR
	Peptídeo 3	ETMSSNVDDR
	Peptídeo 4	IALVGSAAVV

Proteína	Peptídeo	Seqüência(a
	Peptídeo 5	MWLCENDR
	Peptídeo 6	YPQLCLQDGPLGIR
	Peptídeo 7	ELNGQNSGYPSI
Ta BG„81	Peptídeo 1	T P F T W G K
	Peptídeo 2	LCLQDS LPGVR
	Peptídeo 3	GVDVQLGPVAGVAPR
	Peptídeo 4	V N L T L E
	Peptídeo 5	PTGVFGEDVVG
	Peptídeo 6	NDLPLTGYEK

(a l/L = leucina e isoleucina possuem a mesma massa molecular e não podem ser distinguidas na análise de ESI-MS/MS.

Tabela 5: Sequências de peptídeo interno determinadas a partir das xilanases de XYN-60 de Acremonium thermophilum ALKO4245 e XYN-30 de

Thermoascus aurantiacus ALKO4242_________________________________

Proteína	Peptídeo	Sequência
At XYN„60	Peptídeo 1	YNDYNLEYNQK
	Peptídeo 2	FGQVTPEN
	Peptídeo 3	VDGDATYMSYVNNK
	Peptídeo 4	KPAWTSVSSVLAAK
	Peptídeo 5	SQGDIVPRAK
x -l < » 'ω o	Peptídeo 1	VYFGVATDONR
	Peptídeo 2	NAAIIQADFGQVTPENSMK
	Peptídeo 3	GHTLVWHSQLPSWVSSITDK
	Peptídeo 4	NHITTLMTR
	Peptídeo 5	AWDvvneafnedgs lr
	Peptídeo 6	VYINDYNLDSASYPK
	Peptídeo 7	ASTTPLLFDGNFNPKPAYNA I V Q D L Q Q
	Peptídeo 8	QTVFLNVIGEDYIPIAFQTA J&

£13

Exemplo 12. Construção de bibliotecas genômicas para Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremoniüm thermophilum

As bibliotecas genômicas de Chaetomium thermophiium ALKO4265 e Acremoniüm thermophilum ALKO4245 foram obtidas para vetor

Lambda DASH^(R)II (Stratagene, USA) de acordo com as instruções do fornecedor. Os DNAs cromossômicos, isolados pelo método de Raeder e Broda (1985), foram parcialmente digeridos com Sau3A. Os DNAs digeridos foram fracionados por tamanhos e os fragmentos do tamanho escolhido (-5-23 kb) foram desfosforilados e ligados aos braços do vetor lambda digerido SamHI.

As misturas de ligação foram embaladas usando extratos de embalamento Gigapack III Gold de acordo com as instruções do fabricante (Strategene, USA). As titulações das bibliotecas genômicas de Chaetomium thermophl· lum e Acremoniüm thermophilum foram de 3,6 x 10⁶ pfu/mL e 3,7 x 10⁵ pfu/mL e aquelas das bibliotecas ampliadas foram de 6,5 x 1O¹⁰ pfu/mL e 4,2 15 x 10⁸ pfu/mL, respectivamente.

O kit de vetor Lambda FIX^(R) ll/Xho I Parcial Fill-in (Stratagene, USA) foi usado na construção das bibliotecas genômicas de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 e Chaetomium thermophilum ALKO4261 de acordo com as instruções do fornecedor. Os DNAs cromossômicos, isolados pelo 20 método de Raeder e Broda (1985), foram parcialmente digeridos com • Sau3A. Os DNAs digeridos foram fracionados por tamanhos e os fragmentos do tamanho escolhido (-6-23 kb) foram enchidos e ligados aos braços do vetor Lambda FIX II digerido Xhol. As misturas de ligação foram embaladas usando extratos de embalamento Gigapack III Gold de acordo com as ins25 truções do fabricante (Strategene, USA). As titulações das bibliotecas genômicas de ALKO4242 e Chaetomium thermophilum ALKO4261 foram de 0,2 x 10⁶ e 0,3 x 10^e pfu/mL e aquelas das bibliotecas ampliadas foram de 1,8 x 10⁹ e 3,8 x 10⁹ pfu/mL, respectivamente.

Exemplo 13. Clonagem dos genes de celobioidrolase (cbh/ce!7) a partir de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremonl· um thermophilum

Métodos de biologia molecular padrão foram empregados no δΐ^ isolamento e tratamentos da enzima do DNA (plasmídeos, fragmentos de DNA), nas transformações do E.coli, etc. Os métodos básicos empregados são descritos nos livros de bolso de biologia molecular padrão, por exemplo, Sambrook e outros (1989) e Sambrook and Russell (2001).

As sondas para classificação de bibliotecas genômicas que foram construídas conforme descrito no Exemplo 12, foram ampliadas por PCR usando os DNAs genômicos de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 e Acremonium thermophilum ALKO4245 como gabaritos nas reações. Vários iniciadores testados nas rea10 ções de PCR foram designados de acordo com a sequência de nucleotídeo publicada (WO 03/000941, Hong e outros, 2003b). As misturas de reação da PCR continham 40 mM de Tris-HCI, pH 9,0, 15 mM de (NH^SO^ 0,1% Triton de X-100,1,5 mM de MgCI₂, 0,2 mM de dNTPs, 5 μΜ de cada iniciador e unidade de DNA polimerase Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlândia) e

-0,5-1 pg de DNA genômico. As condições para as reações da PCR foram as seguintes: 5 minutos de desnaturação inicial a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, tanto 1 minuto de recombinação a 62°C (± 8°C gradiente) para gabaritos de Thermoascus ALKO4242 e Chaetomium ALKO4265 ou 1 minuto de recombinação a 58°C (± 6°C gradiente) para gabari20 to de Acremonium ALKO4245, período de 2 minutos a 72°C e um período final de 10 minutos a 72°C.

Produtos de DNA de tamanhos esperados (calculados das seqüências cbh publicadas) foram obtidos de todos os gabaritos genômicos usados. Os fragmentos de DNA de tamanhos esperados foram isolados das 25 reações de PCR mais específicas e eles foram clonados para vetor pCR^ÍR) Blunt-TOPO^(R) (Invitrogen, USA). As inserções foram caracterizadas por seqüenciamento e por realização de hibridizações Southern blot em relação aos DNAs genômicos digeridos com várias enzimas de restrição. Os fragmentos de pCR que foram escolhidos para serem empregados como sondas 30 para classificação das bibliotecas genômicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremonium thermophilum são apresentados na Tabela 6.

315

Tabela 6. Iniciadores empregados nas reações de PCR e sondas escolhidas para classificação dos genes cbhlcel7 a partir das bibliotecas genômicas de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremonium thermophilum. São’ mostrados o DNA de gabarito genômico e as denominações dos plasmídeos contendo o fragmento de sonda.

Gene	Inlciador ã frente	Inlciador reverso	DNA do gabarito	Fragmento (kb)	Plasmídeo
Tacbh	TCEL11	TCEL12	77mvwobscus ALKO4242	0,8 kb	pALK1633
CTcbh	TCEL7 cgatgccaactogcgctggac	ttcttnataatatoaacatrtc	Chaetomium ALKO4265	0,8 kb	pALK1632
Atchb	TCEL13 aocicaaccaactactecaca	TCEL4 accgtgaacttcttgctggto	Acmmontom ALKO4245	0,7 kb	pALK1634

As seqüências de aminoácido deduzidas de todas essas sondas

Ίο tinham homologia com relação às várias seqüências CBH publicadas (programa BLAST, versão 2.2.9 no NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul e outros, 1990) da família 7 da hidrolase de glicosídeo (Henrissat, 1991; Henrissat and Bairoch, 1993).

As inserções dos plasmídeos listados na Tabela 6 foram rotuladas com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha), e as bibliotecas genômicas ampliadas (placas de 2 x 10⁵ - 3 x 10⁵) foram classificadas com os fragmentos de sonda rotulados. A temperatura de hibridização para os filtros era de 68°C e os filtros foram lavados 2 x 5 minutos em temperatura ambiente usando 2 x SCC - 0,1% SDS seguido por 2x15 minutos a68°C usando 0,1 x SSC - 0,1% SDS com as sondas homólogas empregadas. Várias placas positivas foram obtidas de cada uma das hibridizações. Na classificação das bibliotecas genômicas da Acremonium ALKO4245, algumas das placas positivas estavam hibridizando fortemente em relação à sonda em questão, porém, além disso, houve uma quantidade de placas hibridizando mais fracamente em relação às sondas. Isso sugeriu que outro(s) gene(s) da celobioidrolase pode(m) estar presente(s) no genoma empregando reação cruzada. Cerca de quatro a cinco placas hibridizando fortemente foram purificadas a partir das classificações da biblioteca genômica de Thermoascus ALKO4242 e Chaetomium ALKO4265.

<%

No caso de Acremonium thermophilum ALKO4245, quatro das seis placas purificadas hibridizaram fracamente pela sonda empregada. Os DNAs do fago foram isolados e caracterizados por hibridizações Southern blot. Os fragmentos de restrição escolhidos hidridizando em relação à sonda foram subclonados no vetor pBluescript II KS+ e as regiões relevantes dos clones foram seqüenciadas.

No total, quatro genes cbhlce!7 foram clonados; um de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, um de Chaetomium thermophilum ALKO4265 e dois de Acremonium thermophilum ALKO4245 (na fase anterior do trabalho, essas tinham os códigos At-cbh-C e At-cbh-A, e foram então denominadas como At ce/7A e At ce/7B, respectivamente). A tabela 7 resume as informações com relação às sondas usadas para classificação dos genes, os clones de fago dos quais os genes foram isolados, os fragmentos de restrição escolhidos contendo os genes de comprimento pleno com suas regiões promotora e terminadora, as denominações dos plasmídeos e ós números de depósito para as cepas de E.colitransportando esses plasmídeos.

Tabela 7. Sondas empregadas para clonagem dos genes cbhlcel7, o clòne de fago e os subclones escolhidos, o número dos plasmídeos e o número

dos depós tos da cepa de E.coli correspondente
Gene	Sonda usada na classificação	Clone do fago	Fragmento subclonado em pBluescript II	Número do plasmídeo	Número do depósito de E.coli
Taoe/7A	PALK1633	F12	3,2kbXbal	PALK1635	DSM 16723
Ctce/7A	PALK1632	F36	2,3 kb Pvul - Hindlll	PALK1642	DSM 16727
AtotfTB	PALK1634	F6	3,1 kb EcoRI	PALK1646	DSM 16728
Atce/7A	PALK1634	F2	3,4kbXhol	PALK1861	DSM 16729

As informações relevantes com relação aos genes e às sequências de proteína deduzidas (SEQ ID Ν^Ω: 1-8) foram resumidos nas Tabelas 8 e 9, respectivamente.

As sequências de peptídeo das proteínas CBH purificadas da

Chaetomium thermophilum ALKO4265 e da Acremonium thermophilum ALKO4245 (Tabela 2) foram encontradas das seqüências de aminoácido dedu-

zidas dos clones contendo os genes Ct ce!7A e At ce!7A. Assim, seria concluído que foram clonados os genes codificando as proteínas CBH/Cel7 purificadas de Chaetomium thermophilum e Acremonium thermophilum.

Tabela 8. Resumo dos genes cbhlcei7 isolados de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 e Acremonium thermoph//um ALKO4245. ,

Gene Cbh	Comprimento com íntrons (bp)(a	Região de codificação (bp)(b	N®de introns	Comprimentos dos íntrons (pares de base)	Seq ID N®:
Ta Cel7A	1439	1371	1	65	1
Ctcel7A	1663	1596	1	65	7
Atce!7B	1722	1377	3	134, 122, 87	3
At cel7A	1853	1569	4	88, 53, 54,86	5

(a O códon STOP foi incluído, (b O códon STOP não foi incluído.

Tabela 9. Resumo das sequências de aminoácido deduzidas das sequências gênicas cbh/ce!7 de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALK4265 e Acremonium thermophilum ALKO4245. ss, seqüência de sinal.

Proteína CBH	N® de aas	Comprimento da seqüência de sinal NN/HMMÍ*	CBD* de C-terminal	Peso molecular (MW) previsto (Da, (ss) não incluídas/0	pl previsto (seqüência de sinal não incluída)	sítios de N-glicosilação putativa	Seq. IDN®:
Ta Ce!7A	457	17/17	Não	46873	4,44	2	2
CtCel7A	532	18/18	Sim, T497 a L532	54564	5,05	3	8
AtCel7B	459	21/21	Não	47073	4,83	2	4
AtCel7A	523	17/17	Sim, 0488 aL523	53 696	4,67	4	6

(a A previsão com relação à seqüência de sinal foi feita empregando o programa SignalP V3.0 (Nielsen e outros, 1997; Bendtsen e outros, 2004); o valor de NN foi obtido empregando redes neuronais e o valor HMM usando

2>l% modelos Markov impedidos.

(b O domínio de ligação de celulose (CBD), os aminoácidos da região CBD de C-terminal são indicados (M1 (Met #1) incluídos na numeração) (c A sequência de sinal prevista não foi incluída. A previsão foi feita empre5 gando a ferramenta pl/MW de computador em um servidor ExPASy (Gasteiger e outros, 2003).

(d O número de sequências N-X-S/T.

As sequências de aminoácido deduzidas de Cel7A de Thermoascus aurantiacus e Cel7A de Acremonium thermophilum Cel7A (núcleo, 10 sem CBD) eram mais homólogas uma com relação a outra (analisadas por alinhamento global Needleman-Wunsch, Needle EMBOSS 3.0.0, com Matriz EBLOSUM62, Penalidade de intervalo 10.0 e penalidade de extensão 0,5; Needleman and Wunsch, 1970). Além disso, Cel7A de Acremonium thermophilum deduzida tinha uma identidade inferior em relação à Cel7A de Chae15 tomium thermophilum deduzida. Cel7B de Acremonium thermophilum foi mais distinta das seqüências CBH/Cel7 da invenção.

A sequência deduzida de Chaetomium Cel7U possuía as maiores identidades (analisada por alinhamento Needleman-Wunsch global, Needle EMBOSS, vide acima) com relação aos polipeptídeos de Chaetomium 20 thermophilum, Scytalidium thermophilum e Thielavia australiensis CBHI descritas no WO 03/000941. De modo semelhante, a seqüência da Thermoascus aurantiacus Cel7A deduzida era altamente idêntica à CBHI publicada da Thermoascus aurantiacus (WO 03/000941, Hong e outros, 2003b). Acremonium thermophilum Cel7B possuía identidades significativamente inferiores 25 às seqüências publicadas anteriormente, estando mais proximamente relacionada ao polipeptídeo CBHI da Oryza sativa. As maiores homologias da seqüência de Cel7A de Acremonium thermophilum foram com relação aos polinucleotídeos da CBHI da Exidia gladulosa e Acremonium thermophilum (WO 03/000941). O alinhamento indica que as seqüências clonadas de 30 Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetomium thermophilum ALKO4265 e Acremonium thermophilum ALKO4245 codificam as proteínas da CBH possuindo alta homologia com relação aos polipeptídeos da família 7

319 da glicosídeo hidrolase, portanto, essas foram designadas como Cel7A ou Cel7B (Henrissat e outros, 1998).

A comparação das sequências de aminoácido deduzidas dos genes cbh/cel7 a partir de Thermoascus aurantiacus ALKO4242, Chaetoml· 5 um thermophilum ALKO4265 e Acremonium thermophilum ALKO4245 Thieiavia entre si mesmas e adicionalmente às seqüências encontradas nas bases de dados são mostradas na Tabela 10.

Tabela 10. Seqüências de homologia mais alta com relação à seqüências de aminoácido deduzidas dos genes cbh/cel7 a partir de Thermoascus auranti10 acus ALKO4242, Chaetomíum thermophilum ALKO4265 e Acremonium thermophilum ALKO4245. O alinhamento foi realizado empregando alinhamento global Needleman-Wunsch (EMBLOSUM62, penalidade de intervalo 10,0, penalidade de extensão 0,5). * Indica uma seqüência de aminoácido derivada de um dos genes da celobioidrolase clonados nesse trabalho. ‘Nú15 cleo' indicaalinhamentosemCBD.

Organismo, enzima e número de acesso	Identidade (%)
* Thermoascus aurantiacus Cel7A	100,0
Thermoascus aurantiacus, AY840982	99,6
Thermoascus aurantiacus, AX657575	99,1
Thermoascus aurantiacus, AF421954	97,8
Taíaromyces emersonil, AY081766	79,5
Chaetomidíum pingtungium, AiXB57623	76,4
Trichophaea saccata, AX657607	73,4
★ Acremonium thermophilum Cel7A (core)	70,6
Emeríceíla nidulans, AF420020 (core)	70,4
* Chaetomíum thermophilum Cel7A (core)	66,4

3=20

Organismo, enzima e número de acesso	Identidade (%)
* Chaetomium thermophilum Cel7A	100,0
Chaetomium thermophilum, AY861347	91,9
Chaetomium thermophilum, AX657571	91,7
Scytafídium thermophilum, AX657627	74,7
Thielavia australiensis, AX657577	74,6
Acremonium thermophilum, AX657569	72,3
Exídia glandulosa, AX657613	68,0
* Acremonium thermophilum Cel7A	66,9
* Thermoascus aurantiacus Cel7A (core)	66,4
Exidia glandulosa, AX657615	60,8
Chaetomium pingtungium, AX657623	60,7
* Acremonium thermophilum Cel7B (core)	60,2
* Acremonium thermophilum Cel7B	100,0
Oryza sattva, AK108948	66,1
Exidia glandulosa, AX657615	65,0
Acremonium thermophilum, AX657569 (core)	64,8
Thermoascus aurantiacus, AX657575	64,8
* Acremonium thermophilum Cel7A	64,6
* Thermoascus aurantiacus Cel7A	64,4
Trichophaea saccata, AX657607	63,6
* Chaetomium thermophilum Cel7A (core)	60,2
* Acremonium thermophilum Cel7A	100,0
Exldla glandulosa, AX657613	77,9
Exidla glandulosa, AX657615	77,9
Acremonium thermophilum, AX657569	77,5
Thielavia australlensls, AX657577	71,0
* Thermoascus aurantiacus Cel7A (core)	70,6
Scytalldium thermophilum, AX657627	67,5
Chaetomium thermophilum, AX657571	67,5
Chaetomium pingtungium, AX657623	67,3
* Chaetomium thermophilum Cel7A	66,9
* Acremonium thermophilum Cel7B (core)	64,6

Exemplo 14. Produção de proteínas recombinantes de CBH/Cel7 Trichoderma reesei

Plasmídeos de expressão foram construídos para produção das proteínas CBH/Cel7 recombinantes a partir de Thermoascus aurantiacus (Ta Cel7A), Chaetomium thermophilum (Ct Cel7A) e Acremonium thermophilum (At Cel7A, At Cel7B; na fase anterior do trabalho essas proteínas tinham os códigos temporários At CBH-C e At CBH-A, respectivamente). Os plasmídeos de expressão construídos são listados na Tabela 11. Os genes c5 bh/cel7 recombinantes, incluindo suas próprias seqüências de sinal foram exátamente fundidos no promotor de T. reesei cbh1 (cel7A) pela PCR. O término da transcrição foi garantido pelo terminador de T. reesei cel7A e o gene marcador A. nidulans amdS foi empregado para seleção dos transformantes conforme descrito em Paloheimo e outros. (2003). Os cassetes de 10 expressão lineares (figura 2) foram isolados das estruturas do vetor após digestão com HcoRI e foram transformados em T. reesei A96 e A98 (ambas cepas tinham os genes codificando as quatro celulases maiores CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A deletada). As transformações foram realizadas como em Penttilã e outros (1987) com ás modifica15 ções descritas em Karhunen e outros (1993), selecionando com acetamida como uma única fonte de nitrogênio. Os transformantes foram purificados nas placas de seleção através de conidia simples antes da esporulação dos mesmos em PD.

Tabela 11. Cassetes de expressão construídos para produzir proteínas de 20 CBH/Cel7 de Thermoascus aurantíacus ALKO4242 (Ta Cel7A), Chaetomium * thermophilum ALKO4265 (Ct Cel7A), e Acremonium thermophilum ALKO4245 (At Ce 17 A, At Cel7B) no Trichoderma reesei. A estrutura total dos cassetes de expressão era conforme descrito na figura 2. Os genes cbh/ce!7 clonados foram fundidos exatamente no promotor T. reesei cbh 1/çel7A.

CBH/Cel7	Plasmídeo de expressão	Tamanho do cassete de expressão	Terminador de cel7A(b
Ta Cel7A	pALK 1851	9,0 kb	245 bp (Xbal)
CtCel7A	pALK 1857	9,2 kb	240 bp (Hindlil)
AtCel7B	pALK 1860	9,4 kb	361 bp (EcoRI)
AtCel7A	pALK 1865	9,5 kb	427 bp (EcoRV)

^(a O cassete de expressão para transformação de T.reeseifoi isolado da estrutura de vetor por emprego de digestão de EcoRI.

^(b Ο número de nucleotídeos da região terminadora cbh1/ce!7A genômica após o códon STOP. O sítio de restrição na extremidade 3' usado na excisão do fragmento gênico genômico é incluído entre parênteses.

A produção de CBH/Cel7 dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes de cultura dos cultivos do frasco de agitação (50 mL). Os transformantes se desenvolveram por 7 dias a 28°C em um meio de indução de celulose à base de lactose complexo (Joutsjoki e outros, 1993) tamponado com 5% KH₂PO₄. A atividade da celobioidrolase foi ensaiada empregando substrato de 4-metilumbeliferil^-D-lactosídeo (MUL) de acordo com van Tilbeurgh e outros, 1988. Os genótipos dos transformantes escolhidos foram confirmados por emprego de Southern blots onde várias digestões genômicas foram incluídas e o respectivo cassete de expressão foi usado como uma sonda. A expressão heteróloga das proteínas Ta Cel7A, Ct Cel7A, At Cel7A e At Cel7B foi analisada por SDS-PAGE com coloração Coomassive subseqüente. A verificação de que nenhuma atividade de celobioidrolase ou produção de proteína heteróloga em SDS-PAGE seria detectada pelos tranformantes de At Cel7B contendo cassete de expressão integrado, sugere que At Cel7B é produzida abaixo dos níveis de detecção nó Trichoderma usando o projeto experimental descrito.

As preparações da enzima CBH/Cel7 recombinante foram caracterizadas em termos de pH ótimo e estabilidade térmica. O pH ótimo das proteínas CBH/Cel7 recombinantes de Thermoascus aurantiacus, Chaetomium thermophilum e Acremonium thermophilum foi determinado no tampão universal Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 3,0-8,0 empregando 4metilumbeliferil-p-D-lactosídeo (MUL) como um substrato (Fig 3A). O pH ótimo para as enzimas Ct Cel7A e At Cel7A é de 5,5, acima do que a atividade começa a cair gradualmente. O pH ótimo de Ta Cel7A bruta recombinante é de 5,0 (Figura 3A). A estabilidade térmica das enzimas Cel7 recombinantes foi determinada por medição da atividade de MUL no tampão universal Mcllvaine no pH ótimo com tempo de reação de 1 hora. Conforme mostrado dos resultados Ta Cel7A e Ct Cel7A mantiveram mais de 60% de suas atividades a 70°C, considerando-se que At Cel7A mostrou ser claramente menos estável em temperaturas maiores (è 65°C) (figura 3B).

Os tranformantes de CBH/Cel7 foram cultivados em bioreatores de laboratório a 28°C no meio indicado acima por 3-4 dias com controle do pH 4,4 ± 0,1 (NH3/H3PO4) para obter material para os testes de aplicação.

Os sobrenadantes foram recuperados por centrifugação e filtração através dos filtros Seitz-K 150 e EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuznach, Alemanha).;

Exemplo 15. Produção das proteínas de fusão recombinantes Cel7A+CBD de Thermoascus aurantiacus em T.reesel

Cel7A de Thermoascus aurantiacus (AF478686, Hong e outros,

2003b; SEQ ID N²: 1) foi fundida ao ligante e CBD da CBHI/Cel7A do Trichoderma reesei (AR088330, Srisodsuk e outros, 1993) (= Tr CBD) seguido por produção da proteína de fusão (SEQ ID N²: 28 correspondendo ao ácido nucléico da SEQ ID N²: 27) na T. reesei conforme descrito em FI20055205/US

11/119,526; depositado em 29 de abril de 2005. Além disso, Cel7A de Thermoascus aurantiacus foi fundida ao ligante e CBD de Cel7A de Chaetomium thermophilum (SEQ ID N²:7) (Ct CBD). Para essa finalidade, a seqüência de codificação do ligante e o CBD da Cel7A da Chaetomium thermophilum foram sintetizados por PCR empregando os iniciadores que se seguem:

5'-TTAAACATATGTTATCTACTCCAACATCAAGGTCGGACCCATCGGCTCGACCGTCCCTGGCCTTGAC-3' ' (seqüência a frente) e

5'-TATATGCGGCCGCAAGCTTTACCATCAAGTTACTCCAGCAAATCAGGGAACTG-3* (seqüência reversa). *

A mistura de reação da PCR continha tampão de reação 1 x

DyNAzyme® EXT (Finnzymes, Finlândia), 15 mM de Mg²⁺, 0,2 mM de dNTPs, 2 μΜ de cada iniciador, 0,6 unidades de DNA polimerase DyNAzyme® EXT (Finnzymes, Finlândia), e aproximadamente 75 ng/30 μ1_ de gabarito DNA, contendo gene de cel7A de comprimento pleno de Chaetomium thermophilum. As condições para a reação da PCR foram como se segue:

desnaturação inicial de dois minutos a 98°C, seguido por 30 ciclos de 30 segundos a 98°C, recombinação por 30 segundos a 68°C (gradiente de ± 4°C), extensão de 30 segundos a 72°C e uma extensão final a 72°C por 10 minu57 tos. O fragmento de DNA específico na região da PCR foi obtido na faixa de temperatura de recombinação de 64°C a 68,5°C. O fragmento do CBD sintetizado de Chaetomium thermophilum foi ligado após o gene de ce!7A de Thermoascus aurantiacus resultando em um ponto de junção de GPIGST 5 entre os domínios. O fragmento ampliado da PCR no plasmídeo foi confirmado por seqüenciamento (SEQ ID N^s: 29). O gene ce!7A de fusão construído foi exatamente fundido no promotor de cbh1 (ce!7A) de T. reesei. A terminação da transcrição foi garantida por ce!7A de T. reesei e o gene marcador de A.nidulans amdS foi usado para seleção dos transformantes como 10 descrito em Palõheimo e outros. (2003).

O cassete de expressão linear foi isolado da estrutura do vetor após digestão de NoA e foi reformado nos protoplastos de T. reesei A96. As transformações foram realizadas como em Penttilâ e outros (1987) com modificações descritas em Karhunen e outros (1993), selecionando com aceta15 mida como uma fonte de nitrogênio única. Os transformantes foram purificados nas placas de seleção através de conidia simples antes da esporulação os mesmos em PD,

A produção de Cel7+CBD de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID N²: 28 e 30) dos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes de 20 cultura dos cultivos do frasco de agitação (50 mL). Os transformantes se desenvolveram por 7 dias em um meio de indução de celulose à base de lactose complexo (Joutsjoki e outros, 1993) tamponado com 5% KH₂PO₄ e pH 5,5. A atividade da celobioidrolase foi ensaiada empregando substrato de 4metilumbeliferil-p-D-lactosídeo (MUL) de acordo com van Tilbeurgh e outros, 25 1988. Os genótipos dos transformantes escolhidos foram confirmados por emprego de Southern blots onde várias digestões genômicas foram incluídas e o respectivo cassete de expressão foi usado como uma sonda. A análise SDS-PAGE mostrou que as enzimas Cel7A+CBD de Thermoascus aurantiacus recombinante foram produzidas como proteínas de fusão estáveis em 30 T. reesei.

O transformante escolhido produzindo a proteína de fusão Ta Cel7A+Tr CBD (SEQ ID N²: 28) foi também cultivado em bioreator de 2 litros a 28°C no meio indicado acima por 3-4 dias com controle de pH de 4,4 ± 0,2 (NH3/H3PO4) para obtenção do material para os testes de aplicação. Os sobrenadantes foram recuperados por centrifugação e filtração através de filtros Seitz-K 150 e EK (Pall SeitzSchenk Filtersystems GmbH, Bad Kreuzna5 ch, Alemanha).

Exemplo 16. Comparação das constantes de inibição de MichaelisMenten e de Inibição de celobiose das celobloidrolases recombinantes purificadas

As constantes de inibição de Michaelis-Menten e de celobiose 10 foram determinadas das celobioidrolases produzidas heterologamente em T. reese/(Exemplos 14 e 15). As enzimas foram purificadas conforme descrito no Exemplo 2. As concentrações de proteína das enzimas purificadas foram medidas por sua absorção em 280 nm usando um coeficiente de extinção molar teórico, que foi calculado das seqüências de aminoácidô (Gill e von 15 Hippel, 1989).

As constantes cinéticas (valores Km e kcat) e constante de inibição de celobiose (Ki) para Tr CBHI/Cel7A, Ta CBH/Cel7A, At CBH/Cel7A e ct CBH/Cel7A, foram medidas empregando CNPLac (2-cloro-4-nitrofenil-p-Dlactosídeo) como 0 substrato em temperatura ambiente (22°C) em 50 mM de 20 tampão fosfato de sódio, pH 5,7. Para determinação da constante de inibição • (Ki), oito concentrações de substrato diferentes (31-4.000 μΜ) na presença de uma faixa de cinco concentrações de inibidor (0-100 μΜ ou 0-400 μΜ) que sustentavam o valor de Ki foram empregadas. Todos os experimentos foram realizados em placas de microtitulação e o volume de reação total foi 25 de 200 μ!_. As taxas iniciais foram medidas, em cada caso, por monitoramento contínuo da liberação do ânion de cloro-nitrofenolato (CNP, 2-cloro-4nitrofenolato) através de medições a 405 nm empregando leitor de placa de microtitulação Varioscan (Thermolabsystems). Os resultados foram calculados da curva padrão de CNP (de 0 a 100 μΜ). As concentrações de enzima 30 usadas foram: Tr CBHI/Cel7A 2,46 μΜ, Ta CBH/Cel7A 1,58 μΜ, Ct CBH/Cel7A 0,79 μΜ e At CBH/Cel7A 3 μΜ. As constantes Km e kcat foram calculadas do ajuste da equação de Michaelis-Menten empregando 0 pro59 grama da Origin. Gráficos Lineweaver-Burk, regráficos (inclinação LWB versus [Glc2; celobiose]) e gráficos Hanes foram empregados para distinguir entre inibição competitiva e do tipo mista e para determinar as constantes de inibição (Ki).

Os resultados das medições de cinética são mostrados na Tabela 12 e Tabela 13. Conforme pode ser visto, Ct CBH/Cel7A possui claramente o número de rotações maior (kcat) e CNPLac e também a constante de especificidade (kcat/Km) é maior se comparada à CBHI/Cel7A de T.reesei. A celobiose (Glc2) é um inibidor competitivo para todas as celulases medidas e a Tr CBHI/Cel7A (usada como um controle) possui a inibição mais forte (isto é, o valor Ki mais baixo) por celobiose. A At CBH/Cel7A possui constante de inibição superior a sete vezes em comparação àquela da Tr CBHI/Cel7A. Esses resultados indicam que todas as três celobioidrolases poderíam trabalhar melhor em hidrólise de celulose devido à inibição diminuída da celobiose quando comparada a celobioidrolase I de Cel7A da Tríchoderma reesei. Tabela 12. Comparação das constantes de inibição da celobiose de quatro GH celobioidrolases da família 7, medida em 50 mM de CNPLac em tampão fosfato de sódio, pH 5,7 a 22°C._____________________________________

Enzima	Ki (μΜ)	Tipo de inibição
Ct Cel7A	39	competitiva
Ta Cel7A	107	competitiva
AtCel7A	141	competitiva
Tr Cel7A	19	competitiva

Tabela 13. Comparação das constantes cinéticas de Michaelis-Menten de Cel7A de celobioidrolase da Chaetomíum thermophilum para CBHI/Cel7A de T. reeseimedida em CNPLac em 50 mM de tampão fosfato de sódio, pH 5,7, a 22°C._________________________________________________________

Enzima	Kcat (min'1)	Km (μΜ)	Kcat/Km (min'1 M'1)
Ct Cel7A	18,8	1960	9,5 103
TrCel7A	2,6	520	5,0103

3^

Exemplo 17. Hidrólise de celulose cristalina (Avicel) por celobioidrolases recombinantes • As celobioidrolases recombinantes purificadas Ct Cel7A, Ta

Cel7A, Ta Cel7A+Tr CBD, Ta Cel7A+ Ct CBD, At Cel7A bem como a versão de núcleo da Ct Cel7A (vide a seguir) foram testadas em quantidades equimolares em hidrólise de celulose cristalina em duas temperaturas, 45°C e 70°C; Tr Cel7A de T. reesei purificada e sua versão de núcleo (vide abaixo) foram usadas como uma comparação. Os ensaios de hidrólise da celulose cristalina (Ph 101, Avicel; Fluka, Bucsh, Suíça) foram realizados em uma 10 escala de tubo de 1,5 ml_, 50 mM de acetato de sódio, pH 5,50. Avicel foi agitado a 45°C ou a 70°C com a solução da enzima (1,4 μΜ) e o volume final da mistura de reação era de 325 μΙ_. A hidrólise foi seguida até 24 horas retirando amostras em seis pontos de tempo diferentes e parando a reação por adição de 163 μί. de reagente de parada contendo 9 vol de étanol a 94% 15 e 1 vol de 1M glicina (pH 11). A solução foi filtrada através de uma unidade de filtração Millex GV13 0,22 gm (Millipore, Billerica, MA, USA). A formação de açúcares de redução solúveis no sobrenadante foi determinada por método para-hidroxibenzóico-hidrazida ácida (PAHBAH) (Lever, 1972) empregando uma curva padrão de celobiose (50 a 1.600 μΜ de celobiose). Uma 20 solução de 0,1 M PAHBAH fabricado (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) • em 0,5 M NaOH (100 μΙ_) foi adicionada a 150 μί da amostra filtrada e fervida por 10 minutos, após o que a solução foi resfriada em gelo. A absorção das amostras a 405 nm foi medida.

As versões de núcleo das celobioidrolases abrigando um CBD em sua forma nativa foram obtidas como se segue: Ct Cel7A e Tr Cel7A foram expostas à digestão proteolítica para remover o domínio de ligação de celulose. A digestão da papaína (Papaya Latex, 14 U/mg, Sigma) pelas celobioidrolases nativas foi realizada a 37°C por 24 horas em uma mistura de reação composta de 10 mM de L-cisteína e 2 mM de EDTA em 50 mM de tampão acetato de sódio (pH 5,0) com adição de papaína (duas concentrações de papaína foram testadas: de um quinto a um décimo da quantidade de papaína da quantidade total da Cel7A na mistura de reação). A proteína de núcleo resultante foi purificada com Coluna de troca de ânion DEAE Sepharose FF (Pharmacia, Uppsala, Suécia) conforme descrito acima. O produto foi analisado em SDS-PAGE.

Os resultados da hidrólise a 45°C e 70°C são mostrados na figura 4 e figura 5, respectivamente. Os resultados mostram claramente que todas as celobioidrolases mostram hidrólise mais rápida e completa em ambas temperaturas, quando comparadas a celobioidrolase da técnica anterior de Cel7A da T. reesei. As celobioidrolases termoestáveis de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 e Chaetomium thermophilum ALKO4265 a 70°C são superiores quando comparadas à Cel7A de T. reesei, também no caso onde o núcleo de Cel7A da Thermoascus é ligado ao CBD da Cel7A da T. reesei (Ta Cel7A + Tr CBD). Foi surpreendente o fato de que as celobioidrolases isoladas e clonadas nesse trabalho serem superiores, quando abrigando um CBD, na taxa e formação de produto na hidrólise de celulose cristalina também na temperatura de hidrólise convencional de 45°C, quando comparada a celobioidrolases da técnica anterior de Cel7A da T.reesei (CBHI) na mesma concentração de enzima. Os resultados também estão de acordo com aquelas preparações de enzima (At Cel7A e ct Cel7A), que foram purificadas dos hospedeiros originais e testadas na hidrólise de Avicel (50°C, 24 horas) (Exemplo 2, Tabela 1).

Exemplo 18. Clonagem dos genes de endoglicanase da Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261, e Thermoascus aurantiacus ALKO4242

Métodos de biologia molecular padrão foram empregados conforme descrito no Exemplo 13. A construção das bibliotecas genômicas de Acremonium, Chaetomium, e Thermoascus foi descrita no Exemplo 12.

Os peptídeos derivados das endoglucanases purificadas de Acremonium e Chaetomium compartilharam homologia com várias endoglicanases da glicosil hídrolase família 45, tal como endoglicanase de Cel45A de Melanocarpus albomyces (AJ515703) e endoglicanase de Humicola insolens (A35275), respectivamente. Os peptídeos derivados da endoglicanase de Thermoascus compartilharam quase 100% de identidade com a seqüência

3S4 de endoglicanase publicada de EG1 de Thermoascus aurantiacus (AF487830). De modo a ampliar a sonda para classificação das bibliotecas genômicas de Acremonium e Chaetomium, iniciadores de degeneração foram designados com base nas sequências de peptídeo. A ordem dos peptí5 deos na seqüência da proteína e a natureza de sentido ou anti-sentido correspondente dos iniciadores foi deduzida da comparação com endoglicanases homólogas publicadas. As seqüências de iniciador e os peptídeos correspondentes são listados na Tabela 14. Devido à identidade de quase 100% dos peptídeos de Thermoascus com a seqüência publicada, o gene da endoglicanase foi ampliado por PCR diretamente do DNA genômico.

Tabela 14. Oligonucleotídeos sintetizados e usados como iniciadores da PCR para ampliar a sonda para classificação do gene de cel45A (EG-40) de Acremonium thermophilum e ce!7B (EG-54) de Chaetomium thermophilum a

partir das	bibliotecas genômicas correspondentes
Proteína	Peptídeo	Localização do iniciador	Seqüência do iniciador(b
At EG 40	Peptídeo 5	1-6	TAYTGGGAYTGYTGYAARCC
	WFQNADN(C		RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA
Ct EG 54	Peptídeo 7	3-7	GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT <d
	Peptídeo 2	5-9	GGAATTCGAYCARACNGARCARTA <·

^(a Aminoácidos do peptídeo usado para designação da seqüência do iniciador <^b N = A, C, G, ou T; R’= A ou G; Y = C ou T ^(c Peptídeo não derivado da proteína EG-40 de Acremonium, porém se origina da seqüência de Cei45A de M. albomyces (AJ515703) homóloga à EG20 40.

^(d Um sítio de restrição HindlW foi adicionado à extremidade 5' do oligonucleotídeo ^(e Um sítio de restrição EcoRI foi adicionado à extremidade 5' do oligonucleòtídeo.

A sonda específica do gene de ce/45A de Acremonium thermophilum para classificação da biblioteca genômica foi ampliada com os inicia63 dores à frente (TAYTGGGAYTGYTGYAARCC) e reversos (RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA) usando DNA genômico como um gabarito. As misturas de reação da PCR continham 50 mM de Tris-HCI, pH 9,0,15 mM (NH₄)2SO₄, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCI₂, 0,1 mM de dNTPs, 0,5 pg de cada ini5 ciador, 1 unidade de DNA polimerase Dynazyme (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 0,5 pg de DNA genômico de Acremonium. As condições para reações da PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação inicial a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, 1 minuto de recombinação a 50-60°C, 2 minutos de extensão a 72°C e uma extensão final a 10 72°C por 10 minutos. Para ampliação do gene de ce/7B de Chaetomium thermophilum (codificação para Ct EG-54) sonda específica, um iniciador à frente (GGAATTCGAYCARACNGARCARTA) e um iniciador reverso (GCAAGCTTCGRCARAARTCRTCRTT) foram usados. As misturas de reação da PCR continham 10 mM de Tris-HCI, pH 8,8, 50 mM de KCI, 0,1% de Triton 15 X-100, 1,5 mM de MgCI₂, 0,2 mM de dNTPs, 250 pmol de cada iniciador, 2 unidades de DNA polimerase Dynazyme II (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 2 pg de DNA genômico de Chaetomium. As condições para reação da PCR eram conforme descrito acima, exceto que a recombinação foi realizada a 45-50°C.

Dois produtos da PCR foram obtidos da reação da PRC de

Acremonium. Fragmentos de DNA de cerca de 0,6 kb e 0,8 kb foram isolados do gel agarose e foram clonados no vetor pCR4-TOPO® TA (Invitrògen, USA) resultando nos plasmídeos pALK1710 e pALK1711, respectivamente. Os produtos de DNA foram caracterizados por seqüenciamento e realização de hibridizações Southern blot para o DNA genômico de Acremonium digerido com várias enzimas de restrição. O padrão de hibridização obtido com os dois fragmentos em condições de lavagem estringente sugerem que dois genes de endoglicanase putatíva seriam classificados da biblioteca genômica de Acremonium. As seqüências de aminoácido deduzidas de ambos pro30 dutos da PCR tinham homologia com relação às várias seqüências de endoglicanase publicadas da glicosil hidrolase família 45 (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul e outros, 1990).

33J &

Um produto da PCR de tamanho esperado (estimado da seqüência de endoglicanase homóloga Humicola insofens, A35275) foi obtida da reação da PCR de Chaetomium, Esse fragmento de DNA de cerca de 0,7 kb foi clonado no vetor pCR4-TOPO^(R) TA (Invitrogen, USA) resultando no plasmídeo pALK2005 e analisado conforme descrito acima. A seqüência de aminoácido deduzida do produto da PCR tinha homologia com relação a todas seqüências de celulase publicadas da glicosil hidrolase família 7 (programa BLAST, versão 2.2.9 na NCBI, National Center for Biotechnology Information; Altschul e outros, 1990).

A inserção dos plasmídeos pALK1710, pALK1711 e pALK2005 foi isolada pela digestão da enzima de restrição e rotulada com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha). Cerca de 1 -2 x 10⁵ placas da biblioteca genômica ampliada de Acremonium ou Chaetomium foram classificadas. A temperatura para hibridização era dè 68°C e os filtros foram lavados 2x5 minutos em temperatura ambiente usando 2 x SSC - 0,1% SDS seguido por 2x15 minutos a 68°C usando 0,1 SSC - 0,1% SDS. Várias placas positivas foram obtidas, das quais cinco a seis placas hibridizando fortemente foram purificadas de cada classificação. DNAs do fago foram isolados e analisados por hibridização Southern blot. Fragmentos de restrição hibridizando com relação à sonda foram subclonados no vetor * pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) e as partes revelantes foram seqüenciadas. Em todos os casos, o fragmento de fago subclonado contém o gene de comprimento pleno de interesse. A tabela 15 resume as informações das sondas usadas para classificação dos genes de endoglicanase, clones de fago a partir dos quais os genes foram isolados, fragmentos de restrição escolhidos contendo os genes de comprimento pleno com suas regiões promotora e terminadora, nomes dos plasmídeos contendo o fragmento de fago subclonado e os números de depósito na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Culture Collection (DSM) para as cepas de

E.coiitransportando esses plasmídeos.

Tabela 15. Sondas usadas para clonagem do gene da endoglicanase, clones de fago e subclone escolhidos, nome do plasmídeo e número de depósito correspondente da cepa Eco//.

Gene	Biblioteca genômica	Sonda usada na classificação	Clone do fago	Fragmento subclonado	Plasmídeo	Ns de depósito de E.coli
AtceMSA	A. thermophilum ALKO4245	PALK1710	P24	5,5 kb Smal	PALK1908	DSM 17324
AtoeWSB	A fhemwphto ALKO4245	PALK1711	P41	6,0 kb Xhol	PALK1904	DSM 17323
Ctce/7B	C. thermophilum ALKO4261	pALK2005	P55	5,1 kb BamHI	PALK2010	DSM 17729

O gène ce!5A de Thermoascus aurantiacus (codificando para

EG-28) (SEQ ID N^s:9) foi ampliado diretamente do DNA genômico isolado por reação da PCR. Os iniciadores à frente (ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGAAGCTCGGCTCTCTCGTGCTC) e reverso (AACTGAGGCATAGAAACTGACGTCATATT) que foram usados para ampliação foram designados com base no gene eg1 de T. aurantiacus 10 publicado (AF487830). As misturas da PCR continham tampão 1 x Phusion

HF, 0,3 mM dNTPs, 0,5 μΜ de cada iniciador, duas unidades de DNA polimerase Phusion® DNA (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 0,25 μ9 de DNA genômico de Thermoascus, As condições para reações da PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação inicial a 95°C, seguido por 15 25 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos de recombinação a 57-67°C, minutos e meio de extensão a 72°C e uma extensão final a 72°C por 5 minutos. O produto ampliado de 1,3 kb contendo o gene exato (do códon START para STOP) foi clonado como um fragmento Sacll-Psfl no vetor pBluescript II KS+. Dois clones independentes foram seqüenciados e um clo20 ne foi selecionado e designado como pALK1926. O número de depósito da cepa E.coli contendo pALK1926 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Culture Collection é DSM 17326.

Informações relevantes dos genes e seqüências de proteína de-

duzidas (SEQ ID N^fi:9-16) são resumidas nas Tabelas 16 e 17, respectivamente. As seqüências de peptídeo das endoglicanases purificadas de EG-40 de Acremoniüm (gene At ce!45A), EG-54 de Chaetomium (gene Ct ce/7B) e EG-28 de Thermoascus (gene Ta ce/5A) foram encontradas nas seqüências de aminoácido deduzidas correspondentes dos genes clonados confirmando qué os genes apropriados foram clonados.

Tabela 16. Resumo dos genes de endoglicanase isolados de Acremoniüm

Chaetomium e Thermoascus aurantiacus.

Gene da endoglicanase	Comprimento com íntrons (bp)<a	Região de codificação (bp)*	NQ de introns	Comprimentos dos íntrons (pares de base)	Seq ID Na:
Ta Cel45A	1076	891	2	59, 123	11
Ctcel45B	1013	753	2	155, 102	13
Atcel7B	1278	1275			15
At celSA	1317	1005	5	55, 60, 59, 74, 61	9

(a O çódon STOP está incluído (b O códon STOP não está incluído

Tabela 17. Resumo das seqüências de endoglicanase deduzidas de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum e Thermoascus aurantiacus. ss, seqüência de sinal.

Proteína da endoglicanase	Nfl de aas	Comprimentò de ss NN/HMM(a	CBD01	Peso molecular (MW) previsto (Da, ss, não incluídas)(c	pl previsto (ss não incluída)	sítios de N-glicosilação putativa	Seqüência ID N°:
AtEG_40	297	21/21	Sim, K265 a L297	28625	4,79	2	12
semelhante a EG 40	251	20/20	Não	23972	6,11	2	14
Ct EG 54	425	17/17	Não	45358	5,44	1	16
Ta EG+28	335	30íe	Não	33712	4,30	1	10

^<a A previsão da seqüência de sinal foi realizada usando o programa SignalP V3.0 (Nielsen e outros, 1997; Bendtsen e outros, 2004); o valor NN foi obtido usando redes neuronais e valor HMM usando modelos Markov impedidos.

^(b São indicadas as presenças de um domínio de ligação de celulose na pro5 teína, os aminoácidos de CBD C-terminal são indicados (numeração de acordo com o polipeptídeo de comprimento pleno) ^(c A seqüência de sinal prevista não está incluída. A previsão foi feita usando a ferramenta Compute pl/MW no servidor ExPASy (Gasteiger e outros, 2003).

^(d Os sítios de N-glicosilação putativa N-X-S/T foram previstos usando o programa NetNGIyc 1.0 (Gupta e outros, 2004).

^(e De acordo com Hong e outros, 2003a

As seqüências de proteína deduzidas das endoglicanases de EG-40 (At Cel45A) de Acremonium e semelhante a EG-40 (At Cel45B), EG15 54 (Ct Cel7B) Chaetomíum e EG-28 (Ta Cel5A) Thermoascus compartilham homologia com as celulases da glicosil hidrolase família 45 (Acremonium), família 7 (Chaetomíum), e família 5 (Thermoascus), assim identificando os genes isolados como elementos dessas famílias de genes. As homologias mais próximas das endoglicanases EG-40/Cel45A de Acremonium e seme20 lhante a EG-40/Cel45B são as endoglicanases de Thielavia terrestris (CQ827970, 77,3% de identidade) e Myceíiophthora thermophila (AR094305, 66,9% de Identidade), respectivamente (Tabela 18). As duas endoglicanases isoladas de Acremonium família 45 compartilham apenas uma identidade de 53,7% uma com a outra. Dessas enzimas, apenas a EG-40/Cel45A contém 25 um domínio de ligação de celulose (CBD).

A homologia mais próxima para a seqüência da proteína prevista da endoglicanase de EG-54/Cel7B de Chaetomíum endoglicanase é encontrada na seqüência de celulase da Cel7A de Melanocarpus albomyces (AJ515704). A identidade entre essas duas seqüências de proteína é de 30 70,6%.

A seqüência de proteína da endoglicanase isolada de Thermoascus aurantiacus é completamente idêntica àquela EGI de T.aurantiacus

335 %

publicada (AF487830, Tabela 18). A homologia mais próxima foi encontrada em uma seqüêncía de β-glicanase de Talaromyces emersonii (AX254752, 71,1% de identidade).

Tabela 18. Comparação das endoglicanases deduzidas de EG-40 de Acre5 moníum thermophilum, semelhante a EG-40/Cel45B, EG-54/Cel7B de Chaetomium thermophilum e EG-28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus com suas contrapartes homólogas. O alinhamento foi realizado usando o programa Needle do pacote de programas da EMBOSS. *lndica uma endoglicanase codificada pór um gene clonado nesse trabalho.

Organismo, enzima e número de acesso	Identidade (%)
Acremonium thermophilum EGJtb	100,0
Thielavia femstris EG45, CQ827970	77,3
Melanocarpus albomyces CeHSA, AJ515703	75,3
Neurospora crassa, hypothetical XM_324477	68,9
Humlcola grisea var themoktee, EGL3, AB003107	67,5
Humloola insdens EG5, A23636	67,3
Myceliophthora thermophlla fem 45, AR094305	57,9
* Acremonium thermophilum EG_40_like	53,7
Acremonium thermophilum EG_40_llw	100,0
Myceliophthora thermophlla fem 45, AR094305	66,9
Magnaporthe grisea 70-15 hypothetical, XM_363402	61,9
Thielavia terrestris EG45, CQ827970
• Acremonium thermophilum EG_40	56,8
Melanocarpus albomyces Cet45A, AJ515703	53,7
1	52,8
Chaetomium thermophilum EG_54	100,0
Melanocarpus albomyces CeUA, AJ515704	70,6
Humlcola grisea var thermoldea EGI, D63516	68,8
Humlcola Insdens EGI, AR012244	67,7
Myceliophthora thermophlla EGI. AR071934	61,7
Fusarium oxysporum var lycopercisl EGI, AF29210	53,5
Fusarium oxvsoorum EGI. AR012243	52,6

336

Organismo, enzima e número de acesso	Identidade (%)
Thermoascus aurantiacus EG__28	100,0
Thermoascus aurantiacus EG, AX812161	100,0
Thermoascus aurantiacus EGi, AY055121	99,4
Tataromyces emersonli β-glucanase, AX254752	71,1
Talaromyces emersonli EG, AF440003	70,4
Asperglilus nlger EG, A69663	70,1
Asperglilus nlger EQ, A62441	69,9
Asperglilus nlger EG, AF331518	69,6
Asoemíllus aculeatus EGV, AF054512	68,5

Exemplo 19. Produção de endoglicanase recombinante em Tríchoderma reesei

Os plasmídeos de expressão foram construídos para produção de proteínas recombinantes de EG-40/Cel45A de Acremonium, semelhante a EG-40/Cel45B, e EG-28/Cel5A de Thermoascus conforme descrito no Exemplo 14. Cassetes de expressão linear (tabela 19) foram isolados da estrutura do vetor por digestão da enzima de restrição, transformada em T.reesei A96 e tranformantes purificados conforme descrito no Exemplo 14. Tabela 19. Cassetes de expressão construídos para produção de endoglicanases de EG-40/Cel45A de Acremonium thermophilum, semelhante a EG40/Cel45B e EG-28/Cel5A de Thermoascus aurantiacus no Tríchoderma reesei.

A estrutura esquemática dos cassetes de expressão é descrita na figura 2.

Endoglicanase	Plasmídeo de expressão	Tamanho do cassete de expressão	Terminador heterólogo
At EG 40	PALK1920	10,9 kb Notl	156 bp (Hindlll)
At EG 40 like	PALK1921	8,6 kb EcoRl	282 bp (Sspl)
Ta EG 28	PALK1930	8,6 kb Notl	nenhum

^(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da estrutura de vetor por digestão com EcoRl ou /Vol ^<b É indicado o número de nucleotídeos após o códon STOP do gene clonado que são incluídos no cassete de expressão. O sítio de restrição na região

3‘ do gene que foi usado na construção do cassete de expressão é indicado entre parênteses.

A produção da endoglicanase dos transformantes foi analisada dos sobrenadantes de cultura dos cultivos de frascos de agitação (50 mL). Os transformantes cresceram como no Exemplo 14 e a atividade da enzima da proteína recombinante foi medida a partir do sobrenadante de cultura 5 como a liberação dos açúcares de redução a partir da carboximetilcelulose (2% (peso/volume) CMC) a 50°C em 50 mM de tampão citrato, pH 4,8 essencialmente conforme descrito por Bailey and Nevalainen 1981; Haakana e outros, 2004. A produção das proteínas recombinantes foi também detectada a partir dos sobrenadantes de cultura por SDS-eletroforese de gel polia10 crilamida. Os anticorpos policlonais específicos para Acremonium EG-40 foram produzidos em coelhos (University of Helsinki, Finlândia). A expressão de EG-40 foi verificada por análise Western blot com anticorpos anti-EG-40 usando o ProtoBlot Western blot AP (Promega). Os genótipos dos transformantes escolhidos foram analisados por Southern blotting empregando o 15 cassete de expressão como uma sonda.

O pH ótimo das endoglicanases produzidas heterologamente foi determinado no tampão universal de Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 4,0-8,0 usando carboximetilcelulose como substrato. Conforme mostrado na figura 6A, a faixa mais ampla de pH (4,5-6,0) é aquela da proteína EG20 40/Cel45A de Acremonium, o pH ótimo sendo de 5,5. Os pHs ótimos para as * outras endoglicanases produzidas heterologamente são de 5,0-5,5 e 6,0 para semelhante a EG-40/Cel45B de Acremonium e EG-28/Cel5A de Thermoascus, respectivamente. A temperatura ótima para atividade enzimática dessas endoglicanases foi determinada na faixa de temperatura de 50-85°C 25 conforme descrito acima. A atividade mais alta das enzimas foi determinada como sendo a 75°C, 60/C e 75°C para EG-40/Cel45A de Acremonium, semelhante a EG-40/Cel45B e EG-28/Cel5A de Thermoascus, respectivamente (Figura 6 B).

Os transformantes escolhidos foram cultivados, conforme descri30 to no Exemplo 14, em um bioreator de 2 litros por quatro dias (28°C, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação.

532

Exemplo 20. Clonagem dos genes de beta-glicosidase de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 e Thermoascus aurantiacus ALKO4242

Métodos de biologia molecular padrão foram empregados con10 forme descrito no Exemplo 13. A construção das bibliotecas genômicas de Acremonium, Chaetomium e Thermoascus foi descrita no Exemplo 12.

Os peptídeos derivados das β-glicosidases purificadas de Acremonium, Chaetomium e Thermoascus compartilharam homologia com várias β-glicosidases da glicosil hidrolase família 3, tais como β-glicosidases de Acremonium cellülolyticus (BD168028), Trichoderma viride (AY368687) e Talaromyces emersonii (AY072918) respectivamente. De modo a ampliar a sonda para classificação das bibliotecas genômicas de Acremonium, Chaetomium ou Thermoascus iniciadores de degeneração foram designados com base nas seqüências de peptídeo. A ordem dos peptídeos na seqüência da proteína e a natureza de sentido ou anti-sentido correspondente dos iniciadores foi deduzida da comparação com β-glucosidases. As seqüências de iniciador e os peptídeos correspondentes são listados na Tabela 20.

Tabela 20. Oligonucleotídeos sintetizados e usados como iniciadores da PCR para ampliar uma sonda para classificação do gene de cel3A (βθ-101) de Acremonium thermophilum, ce!3A (βΘ-76) de Chaetomium thermophilum e cel3A (βΘ-81) de Thermoascus aurantiacus a partir das bibliotecas genômicas correspondentes '

Proteína	Peptídeo	Localização do iniciador(a	Seqüência do iniciador(b
At 0G 1O1	EKVNLTÍC		GARAARGTNAAYCTNAC
	Peptídeo 4	. 6-11	YTTRCCRTTRTTSGGRGTRTA
Ct |3G 76	Peptídeo 6	4-9	TNTGYCTNCARGAYGG
	Peptídeo 1	3-8	TCRAARTGSCGRTARTCRATRAASAG
Ta (3G 81	Peptídeo 3	1-5	AARGGYGTSGAYGTSCAR
	Peptídeo 1	2-7	YTTRCCCCASGTRÃASGG

^<a Aminoácidos do peptídeo usados para designação da seqüência do iniciador

339 ^(b Para reduzir a degeneração, alguns códons foram escolhidos de acordo com a preferência dos fungos. N = A, C, G, ou T; R = A ou G; Y = C ou T ^(c Peptídeo não derivado da proteína purificada pG-1O1 de Acremonium, porém se origina da seqüência de β-glicosidase A. cellulolyticus (BD168028) 5 homóloga à £G-101.

As sondas para classificação das bibliotecas genômicas construídas foram ampliados com as combinações de iniciador listadas (Tabela 20) usando DNA genômico de Acremonium, Chaetomium ou Thermoascus como o gabarito. As misturas de reação da PCR continham 50 mM de Tris-HCI, pH 10 9,0, 15 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM de MgCI₂, 0,1 mM de dNTPs, 0,25 gg de cada iniciador, 1 unidade de DNA polimerase Dynazyme (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 0,5 gg de DNA genômico. As condições para reações da PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação inicial a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, 1 minuto de 15 recombinação a 40°C (DNA de Acremonium como um gabarito), a 50°C (DNA de Chaetomium como um gabarito) ou 63°C (DNA de Thermoascus como um gabarito), 2-3 minutos de extensão a 72°C por 5-10 minutos.

Produtos da PCR específicos de tamanho esperado (estimado das seqüências de β-glicosidase homólogas BD168028, AY072918 e 20 AY368687) foram isolados do gel de agarose. Fragmentos de DNA de cerca • de 1,8 kb (Acremonium), 1,5 kb (Chaetomium) e 1,52 kg (Thermoascus) foram clonados no vetor .pCR4-TOPO^(R) TA (Invitrogen, USA) resultando nos plasmídeos pALK1924, pALK1935 e pALK1713, respectivamente. Os produ25 tos de DNA foram caracterizados por seqüenciamento e realização de hibridizações Southern blot em relação ao DNA genômico digerido com várias enzimas de restrição. O padrão de hibridização nas condições de lavagem estringentes sugerem que um gene de β-glicosidase putativo seria isolado da biblioteca genômica de Acremonium, Chaetomium e Thermoascus. As 30 seqüências de aminoácido deduzidas de todos os três produtos da PCR possuem homologia com relação às várias seqüências de β-glicosidase publicadas da glocosil hidrolase família 3 (programa BLAST, National Center for

Biotechnology Information; Altschul e outros, 1990).

A inserção dos plasmídeos pALK1713, pALK1924 e pALK1935 foi isolada pela digestão da enzima de restrição e rotulada com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha). Cerca de 1 -2 x 10⁵ placas da biblioteca genômica ampliada de Acremonium, Chaetomium ou Thermoascus foram classificadas, conforme descrito no Exemplo 18. Várias placas positivas foram obtidas, das quais cinco a seis placas fortemente hibridizantes foram purificadas de cada classificação. Os DNAs de fago foram isolados e analisados por hibridização Southern blot. Os fragmentos de restrição hibridizando com relação à sonda foram subclonados no vetor pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) e as partes revelantes foram sequenciadas. Em todos os casos, o fragmento de fago subclonado contém o gene de comprimento pleno de interesse. A tabela 21 resume as informações das sondas usadas para classificação dos genes de β-glicosidase, clones de fago dos quais os genes foram isolados, fragmentos de restrição escolhidos contendo os genes de comprimento pleno com suas regiões promotora e terminadora, nomes dos plasmídeos contendo o fragmento de fago subclonado e os números de depósito na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Culture Collection (DSM) para as cepas de E.colitransportando esses plasmídeos.

Tabela 21. Sondas usadas para clonagem do gene da β-glicosidase, clones de fago e subclone escolhidos, nome do plasmídeo e número de depósito correspondente da cepa E.coli. - ' -

Gene	Biblioteca genômica	Sonda usada na classificação	Clone do fago	Fragmento subclonado	Plasmídeo	N® de depósito de E.coli
Atce/34	A. tharmophiium ALKO4245	PALK1924	P44	6,0 kbHindlll	PALK1925	DSM 17325
Clce/34	C. fhermophiium ALKO4261	pALK1935	P51	7,0kbXba/	pALK2001	DSM 17667
Tace/3A	T. aurantiacus ALKO4242	PALK1713	P21	5,3 kb BamHI	pALK1723	DSM 16725

Informações relevantes dos genes e seqüências de proteína deduzidas (SEQ ID N^a:21-26) são resumidas nas Tabelas 22 e 23, respectivamente. As seqüências de peptídeo das proteínas purificadas de βθ-10 (At ce!3A) de Actemonium, βΘ-76 (Ct cel3A) de Chaetomium e βΘ-81 (Ta cel5A) de Thermoascus foram encontradas nas seqüências de aminoácido deduzidas correspondentes dos genes clonados confirmando que os genes apropriados foram clonados.

Tabela 22. Resumo dos genes de β-glicosidase isolados de Acremonium

thermophilum, Chaetomium thermophilum e Thermoascus aurantiacus.
Gene da β-glucosidase	Comprimento com íntrons (bp)<a	Região de codificação (bp)”	Número dé íntrons	Comprimentos dos íntrons (pares de base)	Seq ID N®:
At ce!3A	2821	2583	3	92, 74,69	23
Ctcel3A	2257	2202	1	52	25
Ta ce!3A	3084	2529	7	134,67, 56, 64, 59,110,62	21

^(a O códon STOP está incluído ^(b O códon STOP não está incluído

Tabela 23. Resumo das seqüências de β-glicosidase deduzidas de Acremonium thermophilum, Chaetomium thermophilum e Thermoascus aurantiacus. ss, seqüência de sinal.;

Proteína de β-glucosidase	N® de aas	Comprimento de ss 1 NN/HMM(a	CBD^	Peso molecular (MW) previsto (Da, (ss) não incluídas/0	pl previsto (seqüência de sinal não incluída)	sítios de N-glicosllação putativa	Seq. IDN®:
At βθ 101	861	19/18	Não	91434	5,46	8	24
Ct βΘ 76	734	20/20	Não	76457	6,3	2	26
Ta βΘ 81	843	19/19	Não	89924	4,95	8	22

^(a A previsão da seqüência de sinal foi realizada usando o programa SignalP V3.0 (Nielsen e outros, 1997; Bendtsen e outros, 2004); o valor NN foi obtido usando redes neuronais e valor HMM usando modelos Markov impedidos.

<^b Presença de um domínio de ligação de celulose na proteína.

^(c A seqüência de sinal prevista não está incluída. A previsão foi feita usando

Μ £ a ferramenta Compute pl/MW no servidor ExPASy (Gasteiger e outros, 2003).

^(d Os sítios de N-glicosilação putativa N-X-S/T foram previstos usando o programa NetNGIyc 1.0 (Gupta e outros, 2004).

As seqüências de proteína deduzidas das β-glicosidases de βθ101/Cel3A de Acremonium, pG-76/Cel3A de Chaetomíum e βΟ-81/ΟβΙ3Α de Thermoascus compartilham homologia com as enzimas da glicosil hidrolase família 3, assim identificando os genes isolados como elementos dessas famílias de genes. As contrapartes mais próximas das β-glicosidases de Acremonium, Chaetomíum e Thermoascus são aquelas de Magnaporthe grisea (β-glicosidase, AY849670), Neurospora crassa (hipotética, XM-324308) e Talaromyces emersonii (β-glicosidase, AY072918), respectivamente (Tabela 24). A identidade de seqüência mais alta (73,2%) encontrada foi aquela de βθ-76/ΟβΙ3Α de C. thermophilum para proteína hipotética N. crassa indicando que novos genes de enzimas foram clonados.

Tabela 24. Comparação das β-glicosidases deduzidas de βθ-101/ΟβΙ3Α de Acremonium thermophilum, pG-76/Cel3A de Chaetomíum thermophilum e βΘ-81/ΟβΙ3Α de Thermoascus aurantiacus com suas contrapartes homólogas. O alinhamento foi realizado usando o programa Needle do pacote de programas EMBOSS. * Indica uma β-glicosidase codificada por um gene clonado nesse trabalho.

Organismo, enzima e número de acesso	Identidade (%)
* Acremonium thermophilum pG_101	100,0
Magnaporthe grisea β-glucosidase, AY849670	73,1
Neurospora crassa hypothetical, XM_330871	71J
Trichoderma reesei Cel3B, AY281374	65,2
* Thermoascus aurantiacus PGJB1	62,2
Aspergillus aculeatus p-glucoskiase, D64088	59,5
Talaromyces emersonii β-glucosldase, AY072918	58,9
Aspergtilus oryzae, AX616738	58,2
Acremonium cellulolyticus β-glucosldase, BD168028	57,2
* Chaetomíum thermophilum 3G 76	40,9

343

Organismo, enzima e número de acesso	Identidade (%)
Chaetomium thermophilum pG_76	100,0
Neurospora crassa, hypothetlcal XM_324308	76,9
Magnaporíhe grísea, hypothetlcal XM.364573	70,2
Tríchoderma virídae BGI, AY368687	65,8
Acremonium cellulolyticus β-glucosidase, BD168028	41,2
* Acremonium thermophilum PG_1O1	40,9
Tríchoderma reesei Cel3B, AY281374	40,0
* Thermoascus aurantiacus BG„81	39,9
* Thermoascus aurantiacus pG_81	100,0
Talaromyces emersonii β-glucosidase, AY072918	73,2
Aspergillus oryzae, AX616738	69,5
Aspergillus aculeatus β-glucosidase, D64088	68,0
Acremonium cellulolyticus β-glucosidase, BO168028	65,7
* Acremonium thermophilum pG_101	62,2
Tríchoderma reesei Cel3B, AY281374	57,9
* Chaetomium thermophilum pG 76	39,9

Exemplo 21. Produção de beta-glicosidases recombinantes em Tríchoderma reesei

Plasmídeos de expressão foram construídos para produção das proteínas recombinantes de pG-101/Cel3A de Acremonium, pG-76/Cel3A de Chaetomium e pG-81/Ce!3A de Thermoascus conforme descrito no Exemplo 14. Cassetes de expressão linear (Tabela 25) foram isolados da estrutura do vetor por digestão dà enzima de restrição, transformados em T reesei A96 ou A33 (ambas cepa§ possuindo genes codificando as quatro maiores celulases CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A deletadas) e os transformantes purificados conforme descrito no Exemplo 14.

Tabela 25. Cassetes de expressão construídos para produção de βglicosidases de pG-101/Cel3A de Acremonium thermophilum, pG-76/Cel3A de Chaetomium thermophilum e pG-81/Ce!3A de Thermoascus aurantiacus em Tríchoderma reesei. A estrutura esquemática dos cassetes de expressão 5 é descrita na figura 2._________________. _____________________________________

β-glicosidase	Plasmídeo de expressão	Tamanho do cassete de expressão	Termiiiador heterólogo
ΑΐβΘ 101	PALK1933	10,5kb/\tof/	300 bp (Hindlll)
Ct pG 76	PALK2004	10,1 kb EcoRI	528 bp (Xbal)
Ta βΘ 81	PALK1914	10,9 kB EcoRI	452 bp (Apol)

^(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da estrutura de vetor por digestão com EcoRI ou Λ/ofl.

^(b É indicado o número de nucleotídeos após o códon STOP do gene clonado que são incluídos no cassete de expressão. O sítio de restrição na região 10 3' do gene que foi usado na construção do cassete de expressão é indicado entre parênteses.

A produção da beta-glicosidase dos transformantes foi analisada dos sobrenadantes de cultura dos cultivos de frascos de agitação (50 mL). Os transformantes cresceram como no Exemplo Mea atividade da enzima 15 da proteína recombinante usando substrato de 4-nitrofenil-p-Dglicopiranosídeo conforme descrito em Bailey e Nevalainen 1981. A produção das proteínas recombinantes foi também detectada a partir dos sobrenadantes de cultura por SDS-eletroforese de gel poliacrilamida. Além disso, a expressão de pG-81 de Thermoascus foi verificada por análise Western 20 blot com anticorpos anti-pG-81 conforme descrito no Exemplo 19. Os genótipos dos transformantes escolhidos foram analisados por Southern blottíng empregando o cassete de expressão como uma sonda.

O pH ótimo das β-glicosidases produzidas heterologamente foi determinado no tampão universal de Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 25 3,0-8,0 usando 4-nitrofenil-p-D-glicopiranosídeo como substrato. Os pHs ótimos para pG-101 de Acremonium, pG-76 de Chaetomium e βθ-81 para Thermoascus são 4,4, 5,5 e 4,5 respectivamente 9figura 7A). A temperatura ótima para atividade enzimática dessas β-glicosidases foi determinada na faixa de temperatura de 50-85°C conforme descrito acima. A atividade mais alta das enzimas foi determinada como sendo a 70°C, 65°C e 75°C para βθ101/Cel45A dé Acremonium, βθ-76/Οβ!3Α de Chaetomium e βΘ-81/ΟβΙ3Α 5 de Thermoascus, respectivamente (Figura 7B).

Os transformantes escolhidos foram cultivados, conforme descrito no Exemplo 14, em um bioreator de 2 litros por quatro dias (28°C, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação.

Exemplo 22. Clonagem dos genes de xilanase de Acremonium thermo10 philum ALK04245 e Thermoascus aurantiacus ALKO4242

Métodos de biologia molecular padrão foram empregados conforme descrito no Exemplo 13. A construção das bibliotecas genômicas de Acremonium foi descrita no Exemplo 12.

Os peptídeos derivados da xilanase de Acremoniúm comparti15 lharam homologia com várias xilanases da glicosil hidrolase família 10, tais como Humicoia grisea XYNI (AB001030). Todos os peptídeos derivados da xilanase de Thermoascus eram completamente idênticos à seqüência de Thermoascus aurantiacus XYNA publicada (AJ132635) assim identificando a proteína purificada como a mesma enzima. Em razão disso, o gene da xila20 nase de Thermoascus foi ampliado por PCR a partir do DNA genômico.

¹ De modo a ampliar a sonda para classificação do gene da xilanase de Acremonium a partir das bibliotecas genômicas, iniciadores de degeneração foram designados com base nas seqüências de peptídeo (Exemplo 11, Tabela 5). A ordem dos peptídeos na seqüência da proteína e a natu25 reza de sentido ou anti-sentido correspondente dos iniciadores foi deduzida da comparação com seqüência de Humicoia insolens XYNI (AB001030). A seqüência do iniciador de sentido (GAYGGYGAYGCSACYTAYATG) se baseia no Peptídeo 3 (aminoácidos 2-8) e iniciador de anti-sentido (YTTYTGRTCRTAYTCSAGRTTRTA) no Peptídeo 1 (aminoácidos 4-11).

Um produto da PCR de tamanho esperado (estimado da seqüência de homóloga de Humicoia insolens XYNI, AB001030) foi obtida da reação. Esse fragmento de DNA de cerca de 0,7 kb foi clonado no vetor p79

CR4-TOPO^ír) TA (Invitrogen, USA) resultando no plasmídeo pALK1714 e foi caracterizado por seqüenciamento. A sequência de aminoácido deduzida do produto da PCR tinha homologia com relação a todas seqüências de xilanase publicadas da glicosil hidrolase família 10 (programa BLAST, National Centerfor Biotechnology Information; Altschul e outros, 1990).

A inserção do plasmídeo pALK1714 foi isolada pela digestão da enzima de restrição e rotulada com digoxigenina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha). Cerca de 1-2 x 10⁵ placas da biblioteca genômica ampliada de Acremoniüm foram classificadas conforme descrito no Exemplo 18. Várias placas positiva foram obtidas, das quais cinco placas hibridizando fortemente foram purificadas. DNAs do fago foram isolados e analisados por hidridização Southern blot. Um fragmento de restrição 3,0 kb Xbal hibridizando com relação à sonda foi subclonado no vetor pBluescript II KS+ (Stratagene, USA) resultando no plasmídeo pALK1725. As partes relevantes de pALK1725 foram seqüenciadas e encontradas como contendo o gene de comprimento pleno xyn10A do Acremoniüm thermophilum (SEQ ID N®:19). O número do depósito da cepa E.coli contendo pALK1725 na

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Culture Collection (DSM) foi o DSM 16726.

O gene xyn10A de Thermoascus aurantiacus (SEQ ID N²:17) foi ampliado diretamente do DNA genômico isolado por reação da PCR. Os iniciadores à frente (TTATACCGCGGGAAGCCATGGTTCGACCAACGATCCTAC) e reverso (TTATAGGATCCACCGGTCTATACTCACTGCTGCAGGTCCTG) que foram usados na ampliação do gene foram designados com base no gene xynA de 7. aurantiacus publicado (AJ132635). As misturas da reação da PCR continham tampão 50 mM Tris-HCI, pH 9,0, 15 mM (NH₄)₂SO₄, Triton 0,1% X-100, 1,5 mM MgCI2, 0,3 mM dNTPs, 1 μΜ cada iniciador, 1 unidade de DNA polimerase PhusionTM DNA (Finnzymes, Finlândia) e aproximadamente 0,5 pg de DNA genômico de Thermoascus. As condições para reações da PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação inicial a 95°C, seguido por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, 1 minuto de recombinação a 60-66°C, 3 minutos de extensão a 72°C e uma extensão final a

72°C por 10 minutos. O produto ampliado de 1,9 kb contendo o gene exato (do códon START para STOP) foi clonado como um fragmento Sadl-BamHI no vetor pBluescript II KS+. Três clones independentes foram seqüenciados e um clone foi selecionado e designado como pALK1715. O número de depósi5 to da cepa E.coli contendo pALK1715 na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Culture Collection é DSM 16724.

Informações relevantes dos genes e seqüências de proteína deduzidas (SEQ ID N^s:17-20) são resumidas nas Tabelas 26 e Tabela 27, respectivamente. As seqüências de peptídeo das proteínas XYN-60 de Acremonium e 10 XYN-30 de Thermoascus foram encontradas nas seqüências de aminoácido deduzidas correspondentes dos genes clonados (At xynlOA e Ta xynlOA, respectivamente) confirmando que os genes apropriados foram clonados.

Tabela 26. Resumo dos genes de xilanase isolados de Acremonium thermo philum e Thermoascus aurantiacus. '

Gene da xilanase	Comprimento com íntrons (bp)<a	Região de codificação (bp)*	Número de íntrons	Comprimentos dos íntrons (pares de base)	Seq ID Na:
AtxynlOA	1471	1248	2	135,85	19
Taxy/rl 0A	1913	987	10	73, 74, 68, 103, 69, 65, 93,66,100,212	17

(a O códon STOP está incluído (bΌ códon STOP não está incluído

Tabela 27. Resumo das seqüências de xilanase deduzidas de Acremonium

thermophiium e Thermoascus aurantiacus. ss, seqüência de sinal.
Proteína da xilanase.	N° de aas	Comprimento de ss NN/HMltf8	CBD^	Peso molecular (MW) previsto (Da, (ss) não incluídas)(c	pl previsto (seqüência de sinal não incluída)	sítios de N-glicosilação putativa	Seq. IDN°:
Atxyn_60	416	' 19/19	Sím,W385a L416	42533	6,32	1-2	20
Ta xyn 30	329	2^	Não	32901	5,81	0	18

^(a A previsão da seqüência de sinal foi realizada usando o programa SignalP V3.0 (Nielsen e outros, 1997; Bendtsen e outros, 2004); o valor NN foi obtido usando redes neuronais e valor HMM usando modelos Markov impedidos.

^<b É indicada a presença de um domínio de ligação de carboidrato CBD e dos aminoácidos de CBD C-terminal (numeração de acordo com o polipeptídeo de comprimento pleno) ^{c A seqüência de sinal prevista não está incluída. A previsão foi feita usando a ferramenta Compute pl/MW no servidor ExPASy (Gasteiger e outros, 2003).

^(d Os sítios de N-glicosilação putativa N-X-S/T foram previstos usando o programa NetNGIyc 1.0 (Gupta e outros, 2004).

^<θ De acordo com Hong e outros, 1999.

As seqüências de proteína deduzidas das xilanases de Acremonium e Thermoascus compartilham homologia com várias enzimas de glicosil hidrolase da família 10, identificando os genes correspondentes como elementos das xilanases família 10. A contraparte mais próxima de XYN60/Xyn10A de Acremonium encontrada é a XYLI de Humicola grisea (AB001030) mostrando 67,1% de identidade com XYN-60 (Tabelá 28). A seqüência de proteína prevista da xilanase de XYN-3-/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus é completamente idêntica aquela de XYNA de T.aurantiacus publicada (P23360, Tabela 28). A homologia mais próxima foi encontrada em uma seqüência de xilanase de Aspergiiius niger (A62445, 69,7% de identidade).

Tabela 28. Comparação das xilanases deduzidas de XYN-60/Xyn1 OA de

Acremonium thermophilum e XYN-30/Xyn1 OA de Thermoascus aurantiacus com suas contrapartes homólogas. O alinhamento foi realizado usando o programa Needle do pacote de programas da EMBOSS. *lndica uma xilanase codificada por um gene clonado nesse trabalho.

Organismo, enzima e número de acesso	Identidade (%)
* Thermoascus aurantiacus XYN_30	100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, P23360	100,0
Thermoascus aurantiacus XynA, AF127529	99,4
Asperglilus nlger xylanase, A62445	69,7
Asperglilus aculeatus xytenase, AR137844	69,9
Asperglilus terreus fem 10 xyn, DQ087436	65,0
Asperglilus so/ae, XynXI AB040414	63,8
Penicllllum chrysogenum xylanase, AY583585	62,5
* Acremonium thermophilum XYN_60	100,0
Humicola grísea XYLI, AB001030	67,1
Magnaporthe grísea 70-15, hypothetlcal XMJ364947	63,8
Asperglilus aculeatus xylanase, AR149839	53,7
Talaromyces emersonli xylanase, ΑΧ403Θ31	51,8
Glbberalla zeae xylanase, AY575962	51,4
Magnaporthe grísea XYL5, AY144348	48,5
Talaromyces emersonli, AX172287	46,9

, Exemplo 23. Produção de xilanases recombinantes em Tríchoderma reesei

Os plasrnídeos de expressão foram construídos para produção de proteínas recombinantes de XYN-60/Xyn1 OA de Acremonium e XYN10 30/Xyn10A de Thermoascus conforme descrito no Exemplo 14. Cassetes de expressão linear (tabela 29) foram isolados da estrutura do vetor por digestão da enzima de restrição, transformada em T.reesei A96 e tranformantes purificados conforme descrito no Exemplo 14.

Tabela 29. Cassetes de expressão construídos para produção de xilanases de XYN-60/Xyn10A de Acremonium thermophilum e XYN-30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus no Trichoderma reesei. A estrutura esquemática dos cassetes de expressão é descrita na figura 2.

Xilanase	Plasmídeo de expressão	Tamanho do cassete de expressãoía	Terminador heterólogo<b
At XYN„60	PALK1912	9,0 kb	150 bp (BamH/)
Ta XYN 30	PALK1913	9,3 kb	nenhum

^(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da estrutura de vetór por digestão com EcoRI.

^(b É indicado o número de nucleotídeos após o códon STOP do gene clonado que são incluídos no cassete de expressão. O sítio de restrição na região 3' do gene que foi usado na construção do cassete de expressão é indicado entre parênteses.

A produção da xilanase dos transformantes foi analisada dos sobrenadantes de cultura dos cultivos de frascos de agitação (50 mL). Os transformantes cresceram como no Exemplo 14 e a atividade da enzima da proteí na recombinante foi medida a partir do sobrenadante de cultura como a libe ração dos açúcares de redução a partir da xilana de bétula (1% peso/volume) a 50°C em tampão de citrato a 50 mM, pH 5,3 conforme descrito por Bailey e Poutanen 1989. A produção da proteína recombinante foi também analisada do sobrenadante de cultura por SDS-eletroforese de gel poliacrilamida. Além disso, a expressão de ambas xilanases foi determinada por análise Western blot com anticorpos anti-XYN-30 ou anti-XYN-60 conforme descrito no Exemplo 19. Os genótipos dos transformantes escolhidos foram analisados por Southern blotting usando o cassete de expressão como uma sonda.

XYN-30/Xyn10A de Thermoascus foi produzida em T. reesei e o pH ótimo da proteína produzida heterologamente foi determinado no tampão universal Mcllvaine dentro de uma faixa de pH de 3,0-8,0 usando xilana de bétula como substrato (figura 8A). O pH ótimo foi determinado como sendo de 4,5. A temperatura ótima para atividade enzimática de XYN-30 foi determinada como sendo de 75°C (figura 8B).

Os transformantes escolhidos foram cultivados, conforme descrito no Exemplo 14, em um bioreator de 2 litros por quatro dias (28°C, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação.

Exemplo 24. Desempenho das celobioidrolases recombinantes na hi5 drólise

O desempenho das celobioidrolases recombinantes purificadas foi avaliado nos estudos de hidrólise com enzimas T.reesei purificadas. A hidrólise foi realizada com misturas controladas de enzimas purificadas nos vários substratos pré-tratados. Os filtrados de cultura de T.reesei contendo dife10 rentes enzimas de CBH/Cel7 clonadas foram obtidos conforme descrito nos Exemplos 14 e 15 e as enzimas de CBH foram purificadas por cromatografia de afinidade conforme descrito no Exemplo 2. Além disso, celulases de T.reesei puras (purificadas conforme descrito Suurnãkki e outros, 2000) foram empregados nas misturas de enzima. As celobioidrolases no experimento foram: 15 (Ta Cel7A) de CBH de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 (Ta Cel7A) .de CBH de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 com CBD de (Ta Cel7A +Tr CBD) de Trichoderma reesei geneticamente anexado (Ta Cel7A) de CBH de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 20 com CDB de (Ta Cel7A +Ct CBD) e de (At Cel7A) geneticamente anexados * (At Cel7A) de CBH de Acremonium thermophilum ALKO4245 (Ct Cel7A) de CBH de Chaetomíum thermophilum ALKO4265 Cada CBH/Cel7 a ser testado (dosagem de 14,5 mg/g de matéria seca de substrato) foi usado tanto em conjunto com EGII/Cel5A de T.reesei 25 (3,6 mg/g) ou com uma mistura contendo EGI/Cel7B T. reese/(1,8 mg/g),

EGII/Cel5A (1,8 mg/g), xilanase pl 9 (Tenkanen e outros, 1992) (5.000 nkat/g) e acetil xilana estearase (AXE) (Sundberg and Poutanen, 1991) (250 nkat/g). Todas misturas foram suplementadas com β-glicosidase adicional a partir de uma preparação de enzima comercial Novozym 188 (176 nkat/g d.w.). Tubos 30 em triplicata contendo a mistura de enzima e 10 mg (matéria seca)/mL de substrato suspenso em 0,05 M de acetato de sódio foram incubados na mistura por agitação magnética a 45°C por 48 horas. Amostras de referência com $

enzimas inativadas e substratos correspondentes foram também preparados.

A liberação dos produtos de hidrólise foi medida como açúcares de redução com método de DNS usando glicose como padrão (Tabela 30).

Os substratos que se seguem foram usados no experimento:

Celulose cristalina (Avicel)

Fibra de espruce pré-tratada com vapor e lavada (impregnação com 3% peso/peso de SO₂ por 20 minutos, seguido por pré-tratamento de vapor a 215°C por 5 minutos), matéria seca 25,9% (ESPRUCE).

Fibra de palha de milho oxidada, úmida e lavada (WOCS).

Fibra de salgueiro pré-tratada com vapor e lavada (prétratamento por 14 minutos a 210°C), matéria seca a 23,0% (SALGUEIRO). Tabela 30. Produtos de hidrólise com enzimas de CBH (45°C, pH 5,0). Produtos de reação após 48 horas de hidrólise como açúcares de redução (mg/mL), glicose medida como padrão. Abreviaturas: CBH = celobioidrolase;

EGI = (Cel7B) de endoglicanase I de T. reesei, EGII = (Cel5A) de endoglicanase II de T. reesei; bG = β-glicosidase (da Novozym 188); XYL= xilanase pl 9 (ΧΥΝ II) de T. reesei, AXE = açetil xilana esterase de T. reesei; nd = não realizado.

Enzimas	Substratos
CBH	Enzimas adicionais	Avicel	Espruce	WOCS	Salgueiro
Ta Cel7A	EGIl.bG	2,0	2,0	2,8	2,0
Ta Cel7A + TrCBD	EGII, bG	5,8	4,0	4,4	4,0
Ta Cel7A + CtCBD	EGII, bG	4,9	3,7	4,6	3,7
At Cel7A	EGIl.bG	5,3	3,3	4,5	3,3
Ct Cel7A	EGII, bG	6,0	2,6	3,4	2,6
Cel7A de T. reesei	EGII,bG	4,7	2,9	2,9	2,9
Ta Cel7A	EGII, EGI, XYL, AXE, bG	nd	nd	4,3	2,8
Ta Cel7A + TrCBD	EGII, EGI, XYL, AXE, bG	nd	nd	7,2	5,9
Ta Cel7A + CtCBD	EGII, EGI, XYL, AXE, bG	nd	nd	7,2	5,6
At Cel7A	EGII, EGI, XYL, AXE, bG	nd	nd	6,4	5,4
Ct Cel7A	EGII, EGI, XYL, AXE, bG	nd	nd	5,6	4,0
Cel7A de T. reesei	EGII, EGI, XYL, AXE, bG	nd	nd	6A	-ÍJ :

Na tabela 30, as celobioidrolases diferentes foram comparadas com base na mesma dosagem de proteína na hidrólise. Os resultados mostram que nos substratos celulósicos (Avicel e fibra de espruce) Cel7A de Thermoascus àurantiacus com CBD anexado geneticamente mostrou clara5 mente hidrólise superior a Treesei CBHI/Cel7A. Sem CBD, Cel7A de T.ãurantiacus foi menos eficaz nesses substratos. O desenvolvimento das celobioidrolases de Acremonium thermophilum e Chaetomium thermophilum foi também melhor em relação aquele de CBHI/Cel7A de T.reese/nos vários substratos; especificamente, Cel7A de C. thermophilum mostrou alta eficiên10 cia na celulose pura (Avicel).

No caso de substratos contendo quantidades notáveis de hemicelulose (salgueiro e palha de milho) as enzimas CBH/Cel7 precisaram claramente da adição de ambas hemicelulolases e endoglucanases para desempenhar seu papel com eficiência. Caso nenhuma hemiceluláse adicional 15 estiver presente, Cel7A de T.aurantiacus com CBD geneticamente anexado mostrou nova e claramente hidrólise mais alta. Com as enzimas de degradação de hemicelulose mais importantes (xilanase, acetil xilana esterase e EGl) Cel7A de T.aurantiacus com CBD geneticamene anexado teve novo desempenho com eficiência mais alta. Cel7A de C. thermophilum foi mais efici20 ente que enzima T. reesei e Cel7A de C. thermophilum produziu produtos de • hidrólise no mesmo nível que CBHI/Cel7A de T. reesei. O domínio de ligação dé celulose de T reesei mostrou fornecer eficiência ligeiramente melhor em relação a CBD de C.thermophilum no desempenho hidrolítico de Cel7A de T.aurantiacus, mesmo que a diferença seja pequena.

Pode ser concluído que, quando CBHI/Cel7A foi substituída na mistura de enzimas de Trichoderma pelas celobioidrolases produzidas aqui, a eficiência da hidrólise conforme julgada por essas disposições experimentais foi claramente melhorada no caso de Cel7A de T. aurantiacus com CBD geneticamente anexado e também aperfeiçoou no caso de Cel7A de A. ther30 mophilum e Cel7A de C. thermophilum. Considerando-se também a melhor estabilidade da temperatura das celobioidrolases produzidas aqui, os resultados indicam que o desempenho das misturas de enzimas de celulase em temperaturas superiores a 45°C pode ser claramente aperfeiçoado por emprego das celobioidrolases produzidas aqui.

Exemplo 25. Desempenho das endoglucanases recombinantes na hidrólise

As preparações contendo as endoglicanases foram comparadas em estudos de hidrólise misturadas com as enzimas CBH/Cel7 e CBH/Cel6 purificadas em vários substratos pré-tratados. Os filtrados de cultura de T. reesei contendo diferentes enzimas de endoglicanase clonadas foram obtidas conforme descrito no Exemplo 19. As enzimas foram enriquecidas por 10 remoção das proteínas termoestáveis das misturas por um tratamento térmico (60°C, 2 horas, pH 5) e o sobrenadante foi usado para estudos de hidrólise. Além disso, celulases de T. reesei (purificadas como descrito por Suurnãkki e outros, 2000) foram empregados nas misturas de enzima. As endoglicanases usadas no experimento eram:

At EG-40/Cel45A (ALKO4245 EG-40) de endoglicanase Acremonium thermophilum ALKO4245

Semelhante a At EG-40/Cel45B (semelhante a ALKO4245 EG40)de endoglicanase de Acremonium thermophilum ALKO4245

Endoglicanase de Ta EG-28/Cel5A (ALKO4242 EG-28) de

Thermoascus aurantiacus ALKO4242.

Os substratos que se seguem foram usados no experimento: Fibra de espruce pré-tratada em vapor e lavada (impregnação com SO₂ a 3% por 20 minutos, seguido por pré-tratamento com vapor a

215°C por 5 minutos), matéria seca a 25,9% (ESPRUCE).

Fibra de palha de milho explodida em vapor (pré-tratamento em vapor a 210°C por 5 minutos, matéria seca 31,0% (SECS).

As endoglucanases a serem estudadas (dosagem de 840 nkat/g de matéria seca, com base na atividade da endoglicanase contra HIEC de acordo com IUPAC, 1987) foram também usadas com celobioidrolases de T reesei (CBHI/Cel7A, 8,1 mg/g d.m. e cBHII/Cel6A, 2.0 mg/g d.m.) ou com Cel7A de Thermoascus aurantiacus com CBD de T. reesei geneticamente (10,1 mg/g d.m.). EGI (Cel7B) e EGII (Cel5A) de T reesei purificados

(Suurnãkki e outros, 2000) foram também incluídos nos experimentos para comparação. Todas as misturas foram suplementadas com β-glicosidase adicional da Novozym 188 (para fabricar a dosagem de β-glicosidase de 560 nkat/g d.w., a dosagem relativamente alta foi usada para compensar as dife5 renças nas atividades de base das diferentes preparações de EG). Tubos erri triplicata foram incubados em mistura a 45°C por 48 horas e amostras de referência com enzimas inativadas e substratos correspondentes foram preparadas. A liberação de produtos de hidrólise foi medida nos açúcares de redução com método DNS usando glicose como padrão (Tabela 31).

Tabela 31. Produtos de hidrólise com preparações diferentes de endoglicanase quando usadas em conjunto com celobioidrolases de T. reesei ou com Cel7A de T.aurantiacus abrigando CBD de T reesei. Produtos de reação após 48 horas de hidrólise como açúcares de redução (mg/mL), glicose medida como padrão. Abreviaturas: CBHI = (Cel7A) de celobioidrólase I de T.

reesei; CBHII = (Cel6A) de celobioidrolase II de T.reesei; EGI = (cel7B) de endoglicanase I de T. reesei; EGII = (Cel5A) de endoglicanase II de T. reeser, bG = β-glicosidase (da Novozym 188); nd = não realizado.

Enzimas CBH/Cel7 de endoglicanase	Substrato
ESPRUCE	SECS
EG não adicionado	CBHI e CBHII de T.reesei	2,4	3,2
EGI	CBHI e CBHII de T.reesei	3,5	4,6
EGII	CBHI e CBHII de T.reesei	3,8	3,5
At EG_40	CBHI e CBHII de T.reesei	4,9	4,3
Semelhante a At EG-40	CBHI e CBHII de T.reesei	4,5	4,8
Ta EG 28	CBHI e CBHII de T.reesei	3,0	3,9
EG não adicionado	Cel7A de T.aurantiacus + Tr CBD	1,8	2,1
EGI	Cel7A de T.aurantiacus + Tr CBD	nd.	4,2
EGII	Cel7A de T.aurantiacus + Tr CBD	3,2	nd.
At EG_40	Cel7A de Taurantiacus + Tr CBD	4,8	4,0
Ta EG„28	Cel7A de T.aurantiacus + Tr CBD	1,5	nd.

Na tabela 31, as celobioidrolases diferentes foram comparadas com base na mesma dosagem de atividade na hidrólise. Isso pode favorecer as enzimas com baixa atividade específica contra o substrato (hidroxietil celulose) usadas no ensaio e subestimar a eficiência das enzimas com alta atividade específica contra hidroxietil celulose. Em qualquer caso, os resultados mostram que as endoglicanases de Acremoniüm thermophilum têm desempenho muito bom na hidrólise quando tem efeito em conjunto com ambas celobioidrolases usadas na mistura. As endoglicanases de A. thermophilum apresentam desempenho semelhante à EGI/Cel7B de T.reesei que é uma enzima muito eficiente no substrato de palha de milho contendo hemicelulose, devido à sua forte atividade colateral da xilanase. Cel5A (ALKO4242 EG-28 da endoglicanase de T. aurantiacus mostrou hidrólise mais baixa em relação as enzimas de T. reesei.

Pode ser concluído que as endoglicanases de A.thermophilum têm desempenho de eficiência comparável ou melhor quando comparadas às enzimas de Thichoderma correspondentes na hidrólise conforme julgado por essa disposição experimental. Considerando-se também a estabilidade da temperatura das endoglicanases descritas aqui, os resultados indicam que o desempenho das misturas da enzima celulase em temperaturas superiores a 45^aC pode ser melhorado por emprego das endoglicanases descritas aqui.

Exemplo 26. Hidrólise de espruce pré-tratado com vapor em temperaturas altas

Fibra de espruce explodida em vapor e lavada (impregnação com 3% peso/peso de SO₂ por 20 minutos, seguido por pré-tratamento com vapor a 215°C por 5 minutos), com matéria seca de 25,9% foi suspensa em 5 mL de 0,05 M tampão acetato de sódio na consistência de 10 mg/mL. Esse substrato foi hidrolisado usando diferentes misturas de enzima nos tubos de teste com agitação magnética no banho de água ajustado em diferentes temperaturas por 72 horas. Para cada ponto da amostra, uma triplicata dos tubos de teste foi retirada da hidrólise, fervida por 10 minutos a fim de terminar a hidrólise da enzima, centrifugada e o sobrenadante foi analisado quanto aos produtos de reação de hidrólise. Os espaços em branco contendo o substrato sozinho (apenas tampão foi adicionado ao invés das enzimas) fo4 ram também incubados nas condições correspondentes.

Uma mistura de celulases termofílicas foi preparada usando os seguintes componentes:

Préparação de CBH/Cel7 termofílica contendo Thermoascus au5 rantiacus ALKO4242 Cel7A com CBD geneticamente anexado de CBHI/Cel7A de T. reesei. A preparação da proteína foi produzida conforme descrito no Exemplo 16 e purificada de acordo com o Exemplo 2 resultando na preparação de Ta Cel7A + Tr CBD purificada com teor de proteína de 5,6 mg/mL.

A preparação de endoglicanase termofílica contendo endoglicanase de Acremonium thermophilum ALKO4245 At EG-40/Cel45A. A proteína foi produzida em T. reesei conforme descrito no Exemplo 19. A fim de enriquecer os componentes termofílicos, o meio de cultura gasto foi tratado com aquecimento (60°C por 2 horas). A preparação obtida continha 4,9 mg/mL de 15 proteína e atividade de endoglicanase (de acordo com IUPAC, 1987) 422 nkat/mL.

Preparação de β-glicosidase termofílica obtida conforme descrito no Exemplo 21 contendo β-glicosidase Ta βΟ-81/Οβ!3Α de Thermoascus aurantiacus ALKO4242. A fim de enriquecer os componentes termofílicos, o 20 caldo fermentado foi tratado com aquecimento (65°C por duas horas). A pre• paração obtida continha 4,3 mg/mL de proteína e a atividade da βglícosidaséde 6270 nkat/mL (de acordo com Bailey e Linko, 1990).

Essas preparações de enzima foram combinadas como se segue (por 10 mL de mistura); preparação de CBH/Cel7 4,51 mL, preparação 25 de endoglicanase, 5,19 mL e preparação de β-glicosidase 0,29 mL. Essa mistura foi usada como MISTURA 1 das enzimas termofílicas.

Como uma comparação e referência, uma mistura do estado da técnica comercial de enzimas de Tríchoderma reesei foi construída combinando (por 10 mL): 8,05 mL de Celluclast 1,5 L FG (da Novozymes A/S) e 30 1,95 mL de Novozym 188 (da Novozymes A/S). A mesma foi denominada como ENZIMAS DE T. REESEF.

As enzimas foram dosadas com base na atividade FPU das mis91 turas: MISTURA 1 usando a dosagem de 5,5 FPU por 1 grama de matéria seca no substrato de espruce e ENZIMAS T. REESEI usando 5,8 FPU por 1 grama de matéria seca no substrato de espruce.

As amostras foram retiradas da hidrólise após 24, 48 e 72 horas e tratadas conforme descrito acima. Os produtos de hidrólise foram quantificados usando o ensaio para reduzir os açúcares (Bemfeld, 1955), empregando glicose como padrão. A quantidade de produtos de hidrólise como açúcares de redução é apresentada na figura 9.

Os resultados mostram claramente o melhor desempenho das enzimas descritas aqui em comparação às enzimas de Trichoderma do estado da técnica a 55°C e 60°C no substrato de espruce. Com base na análise de HPLC, o rendimento máximo dos açúcares do substrato seria de 5,67 mg por 10 mg de substrato de espruce seco. Em razão da dosagem relativamente baixa da enzima os rendimentos de açúcar final foram claramente mais baixos. Para enzimas termoestáveis, o rendimento do açúcar com base no ensaio do açúcar de redução foi de 66% e 57% do teórico em 55°C e 60°C, respectivamente. Para as enzimas de Trichoderma do estado da técnica, o mesmo foi de apenas 31% e 11% a 55°C e 60°C, respectivamente.

Exemplo 27. Hidrólise de palha de milho pré-tratado com vapor em 20 temperaturas altas

Fibra de palha de milho explodida em vapor (tratamento a 195°C por 5 minutos), com matéria seca de 45,3% foi suspensa em 5 mL de 0,05 tampão de acetato de sódio na consistência de 10 mg/mL. Os tratamentos e medições foram realizados conforme descrito no Exemplo 26.

Uma mistura das celulases termofílicas descritas aqui foi construída usando os componentes que se seguem:

Preparação termofílica de CBH contendo Cel7A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 com CBD geneticamente anexado de CBHI/Cel7A de T. reesei (Ta Cel7A + Tr CBD, Exemplo 15). O teor de proteí30 na da preparação foi de 31 mg/mL.

Preparação da endoglicanase termofílica contendo endoglicanase At EG-40/Cel45A de Acremonium thermophilum ALKO4245 foi obtida

conforme descrito no Exemplo 19. A preparação de enzima concentrada continha atividade de endoglicanase (de acordo com IUPAC, 1987) de 2057 nkat/mL

Preparação de β-glicosidase termofílica contendo β-glicosidase de Ta BBG-81/Cel3A de Thermoascus aurantiacus ALKO 4242 foi obtida conforme descrito no Exemplo 21 contendo atividade de β-glicosidase (de acordo com Bailey and Linko, 1990) de 11.500 nkat/mL.

Produto de xilanase termofílica contendo uma xilanase AM24 originária de Nonomuraea fiexuosa DSM43186. O produto foi preparado por 10 emprego de uma cepa de Trichoderma reesei recombinante que havia sido transformada com o cassete de expressão pALK1502, conforme descrito no W02005/100557. O produto sólido foi dissolvido na matéria para obter uma solução a 10% e uma preparação de enzima com atividade de xilanase (analisada de acordo com Bailey e outros, 1992) de 208.000 nkat/mL foi obtida.

Essas preparações de enzima foram combinadas como se segue (por 10 mL de mistura): preparação de CBH/Cel7 7,79 mL, preparação de endoglicanase 0,96 mL, preparação de β-glicosidase 1,14 mL e preparação da xilanase 0,31 mL. Essa mistura foi usada como MISTURA 2 das enzimas termofílicas.

Como uma comparação e referência, uma mistura do estado da » técnica comercial de enzimas de Trichoderma reesei foi construída combinando (por 10 mL), 8,05 mL de Celluclast 1,5 L FG (da Novozymes A/S) e 1,95 mL de Novozym. 188 (da Novozymes A/S). A mesma foi denominada como ENZIMAS DE T REESEI.

As amostras foram retiradas da hidrólise após 24, 48 e 72 horas e tratadas conforme descrito acima. Os produtos de hidrólise foram quantificados usando o ensaio para reduzir os açúcares (Bemfeld, 1955), empregando glicose como padrão. A quantidade de produtos de hidrólise como açúcares de redução é apresentada na figura 10.

Os resultados mostram claramente o melhor desempenho das enzimas descritas aqui em comparação às enzimas de Trichoderma do estado da técnica. A 55°C a mistura de enzimas termofílicas mostrou hidrólise mais eficiente em comparação às enzimas T. reesei: A hidrólise foi mais rápida e rendimentos de açúcar maiores foram também obtidos. Com base na análise de HPLC, o rendimento máximo dos açúcares (incluindo os açúcares solúveis livres no substrato não lavado que foi usado) do substrato seria de 5,73 mg por 10 mg de substrato seco. Assim, a hidrólise pelas enzimas da MISTURA 2 estava quase completa em 48 horas. A 55°C e 57,5°C as enzimas termofílicas descritas aqui mostraram também um desempenho claramente melhor na hidrólise em relação às enzimas de Trichoderma do estado da técnica.

Exemplo 28. Hidrólise de palha de milho pré-tratada em temperaturas altas usando mistura com uma xilanase termoestável

O procedimento explicado no Exemplo 27 foi repetido, exceto que o produto de xilanase XT 02026A3 foi substituído por preparação termofílica de xilanase contendo xilanase Ta XYN-30/Xyn10A de Thermoascus aurantiacus ALKO4242 produzida em T. reesei. O caldo fermentador, produzido conforme descrito no Exemplo 23 continha atividade de xialanase de 132.000 nkat/mL (ensaiado de acordo com Bailey e outros, 1992).

Essas preparações de enzima foram combinadas comó se segue (por 10 mL de mistura): preparação de CBH/Cel7 7,64 mL, preparação de endoglicanase 0,96 mL, preparação de β-glicosidase 1,15 mL e preparação da xilanase 0,25 mL. Essa mistura foi usada como MISTURA 3 das enzimas termofílicas.

Como uma comparação e referência, uma mistura do estado da técnica comercial de enzimas de Trichoderma reesei foi construída combinando (por 10 mL), 8,05 mL de Celluciast 1,5 L FG (da Novozymes A/S) e 1,95 mL de Novozym 188 (da Novozymes A/S). A mesma foi denominada como ENZIMAS DE T. REESEI.

As amostras foram retiradas da hidrólise após 24, 48 e 72 horas e tratadas conforme descrito acima. Os produtos de hidrólise foram quantificados usando o ensaio para reduzir os açúcares (Bemfeld, 1955), empregando glicose como padrão. Os resultados dos brancos do substrato foram subtraídos das amostras com enzimas, e a concentração dos produtos de

hidrólise como açúcares de redução é apresentada na figura 11.

Os resultados mostram claramente o melhor desempenho da mistura das enzimas descritas aqui em comparação às enzimas de Trichoderma dó estado da técnica. A 45°C a mistura de enzimas termofílicas mos5 trou hidrólise mais eficiente em comparação às enzimas T. reesei. A 55°C e 60°C as enzimas termofílicas descritas aqui mostraram também um desempenho claramente melhor na hidrólise em relação às enzimas de Trichoderma do estado da técnica. O desempenho da nova mistura de enzima a 60°C estava no mesmo nível de desempenho das enzimas do estado da arte a 10 45°C.

Exemplo 29. Hidrólise de espruce pré-tratado em temperaturas altas usando mistura com uma xilanase termoestável

O procedimento conforme descrito no Exemplo 28 foi repetido com fibra de espruce explodida em vapor e lavada (impregnação com 3% 15 peso/peso de SO2 por 20 minutos, seguido por pré-tratamento com vapor a 215°C por 5 minutos com matéria seca de 25,9%) como substrato usando temperaturas de hidrólise de 45°C, 55°C e 60°C. As amostras foram tomadas da hidrólise após 24, 48 e 72 horas e tratadas conforme descrito acima. Os produtos de hidrólise foram quantificados usando o ensaio para reduzir 20 os açúcares (Bemfeld, 1955), empregando glicose como padrão. Os resulta* dos dos brancos do substrato foram subtraídos das amostras com enzimas, e a concentração dos produtos de hidrólise como açúcares de redução é apresentada na figura. 12.

Os resultados mostram claramente 0 melhor desempenho da 25 mistura das enzimas descritas aqui em comparação às enzimas de Tríchoderma do estado da técnica. A 45°C a mistura de enzimas termofílicas mostrou hidrólise mais eficiente em comparação às enzimas T. reesei, evidentemente devido à melhor estabilidade em hidrólise de longo prazo. A 55°C a eficiência da mistura das enzimas descritas aqui ainda estava no mesmo 30 nível em relação a 45°C, considerando-se que a mistura do estado da técnica foi ineficaz com 0 substrato usado nessa temperatura. A 60°C as enzimas termofílicas descritas aqui mostraram hidrólise diminuída embora a hidrólise estivesse próxima ao mesmo nível de desempenho das enzimas do estado da técnica a 45°C.

Exemplo 30. Avaliação da inibição da glicose das β-glicosldases de Acremonium thermophilum ALKO4245, Chaetomium thermophiium ALKO4261 e Thermoascus aurantiacus ALKÒ4242

Os filtrados de cultura produzidos pelas cepas de Acremonium thermophiium ALKO4245, Chaetomium thermophilum ALKO4261 e Thermoascus aurantiacus ALKO4242 são descritos no Exemplo 1. As atividades da β-glicosidase (medidas de acordo com Bailey and Linko, 1990) dessas preparações foram de 21,4 nkat/mL, 5,6 nkat/mL e 18,6 nkat/mL, respectivamente. Para comparação, enzimas comerciais Celluclast 1,5 L (β-glicosidase 534 nkat/mL) e Novozym 188 (β-glicosidase 5840 nakat/mL) foram também incluídas no experimento.

A fim de avaliar a sensibilidade das β-glicosidases diferentes na direção de inibição da glicose, o procedimento de ensaio de atividade padrão foi realizado na presença de concentrações diferentes de glicose. As soluções de substrato (p-nitrofeil^-D-glicopiranosídeo) para o ensaio de atividade da β-glicosidase foram suplementados por glicose, de modo què a concentração na mistura de ensaio foi ajustada para os valores de 0 a 0,5 M. Exceto essa adição de glicose, o ensaio foi realizado usando o procedimento padrão (Bailey and Linko, 1990). As atividades na presença de concentrações variadas de glicose como uma porcentagem da atividade sem glicose são apresentadas na figura 13.

Os resultados mostram que β-glicosidases de C. thermophilum e T aurantiacus foram menos afetados pela inibição de glicose que as βglicosidases presentes nas enzimas comerciais: β-glicosidase derivada de Aspergillus em Novozym 188 ou β-glicosidase derivada de Trichoderma em Celluclast 1,5L. A enzima A. thermophilum mostrou comportamento comparável ao da enzima T. reesei de Celluclast. Especialmente a enzima C.thermophilum foi claramente menos afetada por alta concentração de glicose. Assim, esses resultados indicam que considerando-se a inibição de glicose o uso de novas β-glicosidases, especial mente de cepas Acremonium thermophilum ALKO4242 e Chaetomium thermophilum ALKO4261, fornecería vantagens claras na hidrólise em condições industriais com alta concentração de glicose.

Exemplo 31. Atividade do papel filtro das misturas de enzima em tem5 peraturas altas

A atividade do papel filtro das preparações de enzima foi medida de acordo com o método da IUPAC (1987) conforme descrito no procedimento, exceto que a reação da enzima foi realizada a temperaturas de 50°C a 70°C. A atividade de FPU calculada se baseia na quantidade de enzima 10 necessária para hidrolisar 4% do substrato de papel de filtro em 1 hora sob condições experimentais. A atividade de FPU foi considerada como representando a atividade de celulase total de uma preparação de enzima.

t As misturas de enzima foram a MISTURA 2 preparada conforme descrito no Exemplo 27, a MISTURA 3 preparada conforme descrito no E15 xemplo 28e MISTURA 4 A MISTURA 4 foi preparada por combinação das preparações de enzima descritas no Exemplo 27 como se segue (por 10 mL da mistura): preparação de CBH/Cel7, 7,84 mL, preparação de endoglicanase, 0,99 mL e preparação de β-glicosidase, 1,17 mL.

As misturas de enzima usadas como referência, representando 20 as misturas do estado da técnica foram:

» ENZIMAS A DE T. REESEF preparadas de acordo com a preparação de ENZIMAS DE T. REESEI descrita no Exemplo 26.

ENZIMAS B DE T. REESEI' que foram construídas combinando (por 10 mL), 8,05 mL de Econase CE (uma preparação comercial de celu25 lase de T.reesei da AB Enzymes Oy, Rajamaki, Finlândia) e 1,95 mL de Novozym 188 (da Novozymes A/S).

As atividades de FPU medidas para as preparações de enzima em temperaturas diferentes são apresentadas na figura 14, como as porcentagens de atividade sob condições padrão (IUPAC, 1987) (a 50°C).

Os resultados mostram claramente que as misturas da invenção mostram atividade de celulose total mais alta em temperaturas elevadas (6070°C) quando comparada às misturas do estado da técnica, com base nas

enzimas de Tríchoderma e Aspergillus.

Exemplo 32. Uso das novas beta-glicosidades na preparação de soforose

Uma mistura de hidrolisado de amido de alta concentração (Nu5 triose 74/968, Roquette) foi tratada com preparação de enzima enriquecida com βθ-81/ΟβΙ3Α de Thermoascus aurantiacus produzida conforme descrito no Exemplo 21, para obtenção de uma mistura de açúcar contendo quantidades apreciáveis de indutor de celulose (soforose) para superar a repressão da glicose.

A preparação de enzima enriquecida com Ta pG-81/Cel3A foi adicionada a uma solução de Nutriose a 70% (peso/peso) para uma concentração final de 1 g de proteína total/litro. O recipiente da mistura foi incubado em um banho de água a 65°C por 3 dias com agitação constante e usado como uma fonte de carbono em um meio de frasco agitado para duas cepas diferentes de Tríchoderma (A47 e Rut-C30). O efeito do tratamento da enzima foi medido como uma atividade da endoglicanase formada durante uma cultivo de frasco de agitação de 7 dias. Como uma referência, os cultivos foram realizados nas mesmas condições com Nutriose não tratada como uma fonte de carbono. Um aumento superior a duas vezes nas atividades foi 20 obtido nos cultivos de frasco de agitação realizados em um meio de Nutriose pré-tratado com Ta pG-81/Cel3A com as cepas testadas. Os resultados são mostrados na figura 15.

Lista de Organismos Depositados

Cepa	Plasmídeo contido	Autoridade depositária	Data do depósito	N2 do depósito
Acremonium thermophilum ALKO4245	-	CBS(1)	20 de setembro de 2004	CBS 116240
Thermoascus aurantiacus ALKO4242	-	CBS(1)	20 de setembro de 2004	CBS 116239
Chaetomium thermophilum ALKO4265	-	cbs<2)	8 de novembro de 1995	CBS 730,95w

Cepa	Plasmídeo contido	Autoridade depositária	Data do depósito	Na do depósito
Escheríchla coli	PALK1635	dsmz(3>	16 de setembro de 2004	DSM 16723
Escherichte coli	PALK1642	DSMZ	16 de setembro de 2004	DSM 16727
EschGrichla coli	PALK1646	DSMZ	16 de setembro de 2004	DSM 16728
Escherichía coli	PALK1861	DSMZ	16 de setembro de 2004	DSM 16729
Escharíchfe coli	PALK1715	DSMZ	16 de setembro de 2004	DSM 16724
Escherichfa coli	PALK1723	DSMZ	16 de setembro de 2004	DSM 16725
EschGríchla coli	PALK1725	DSMZ	16 de setembro de 2004	DSM 16726
Escharíchla coli	PALK1904	DSMZ	13 de maio de 2005	DSM 17323
Escheríchía coli	PALK1908	DSMZ	13 de maio de 2005	DSM 17324
Escheríchla coli	PALK1925	DSMZ	13 de maio de 2005	DSM 17325
Escherichla coli	PALK1926	DSMZ	13 de maio de 2005	DSM 17326
Escharichlacoli	PALK2001	DSMZ	18 de outubro de 2005	DSM 17667
Escherichla coli	PALK2010	DSMZ	18 de novembro de 2005	DSM 17729

⁽¹⁾ The Centralbureau Voor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Países Baixos ⁽²⁾ The Centralbureau Voor Schimmelcultures at Oosterstraat 1, 3742 SK BAARN, Países Baixos ^{1 2 (3) 4} Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemanha ⁽⁴⁾ [Após o término do período de depósito corrente, as amostras serão armazenadas de acordo com tratados de modo a tornar a cepa disponível além do tempo permitido pela patente]

Referências

Altschul S., Gish W., Miller W., Myers E. W. and Lipman D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

Badger, P.C. (2002) Ethanol from cellulose: a general review. In Trends in new crops and new uses. J. Janick e a. Whipkey (eds.). ASHS 15 Press, Alexandria, VA, USA, pp. 17-21.

Bailey M. J. and K. Μ. H. Nevalainen (1981) Induction, isolation and testing of stable Trichoderma reesei mutants with improved production of όδδ solubilizing cellulase. Enz Microbiol Technol. 3:153-157.

Bailey, M.J., Biely, P. and Poutanen, K. (1992) Interlaboratory testing for assay of xylanase activity. J Biotechnol. 23:257-270.

Bailey, M. J. and Linko, M. (1990) Production of β-galactosidase by Aspergillus oryzae in submerged bioreactor cultivation. J. Biotechnol. 16:57-66.

Bailey M. J. and Poutanen K. (1989) Production of xylanases by strains of Aspergillus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:5-10.

Bailey M., Siika-aho M., Valkeajârvi A. and Penttilã M. (1993)

Hy- drolytic properties of two cellulases of Tríchoderma reesei expressed in yeast. Biotehnol. Appí. Biochem 17:65-76.

Bendtsen J. D., Nielsen H., von Heijne G. and Brunak S. (2004) Improved predictlon of signal peptides: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340:783-795.

Bernfeld, B. (1955) Amylases, α e β. In: Methods in Enzymology, vol. 1, Eds. Colowick, S. P. and Kaplan, N. O. Academic Press, New York, pp. 149-158.

Biely P., Vrsanska M., Tenkanen M., Kluepfel D. (1997) Endobeta-1,4-xylanase families: differences in catalytic properties. Journál of Biotechnology 57:151-166.

Coen, D. M. (2001) The polymerase chain reaction. In: Ausubel,

F. M., Brent, R., Kingston, R.E., More, D. D., Seidman, J.G., Smith, K. and Struhl, K. (eds.) Current protocols in molecular biology. John Wiley & Sons. Inc., Hoboken, USA.

Gasteiger, E., Gattiker A., Hoogle c, Ivanyi I., Appel R. D. and

Bairoch A. (2003) ExPASy: the proteiomics server for in-depth protein knowledge e analysis. Nucleic Acids Res. 31:3784-3788.

Gellissen, G. (ed.) (2005) Production of recombinant proteins. Novel microbial and eukaryotic expression systems. Wiley-VCH Verlag Gmbh&Co. Weinheim, Alemanha.

Gill, S. C, and von Hippel, P.H. (1989) Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182: 319-326.

3^

100

Gupta, R., E. Jung and S. Brunak. (2004) Prediction of Nglycosylation sites in human proteins, In preparation. www.cbs.dtu.dk/servjces/NetNGIvc/

Háakana H., Miettinen-Oinonen A., Joutsjoki V., Mantyla A_f, Suomi- nen P, and Vehmaanperà J. (2004) Cloning of cellulase genes from Melario- carpus albomyces and their efficient expression in Trichoderma reesei. Enz. Microbiol. Technol, 34:159-167.

Henrissat B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309-316.

Henrissat B. and Bairoch A. (1993) New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293:781-788.

Henrissat B. and Bairoch A. (1996). Updating the sequencebased classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695^:696

Henrissat B., Teeri T. T. and Warren R. A. J. (1998) A scheme for designating enzimas, que hydrolyse the polysaccharides in the cell wall of plants. FEBS Letters 425: 352-354.

Hong J., H. Tamaki, K. Yamamoto, and Kumagai H. (2003a) Cloning of a gene codificando a thermostabile endo-β-1,4-glicanase from Thermoascus aurantiacus and its expressão in yeast. Biotech. Letters 25: 657-661.

Hong J., Tamaki H., Yamamoto K. and Kumagai H. (2003b) Cloning of a gene codificando thermostable cellobiohydrolase from Thermoascus aurantiacus and its expressão in yeast. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 42-50.

IUPAC (International Union of Pure e applied Chemistry) (1987). Measurement of cellulase activities. Pure e appl. Chem. 59: 257-268.

Joutsjoki, V. V., Torkkeli T.K. and Nevalainen K. Μ. H. (1993) Transformation of Trichoderma reesei with the Hormoconis resinae glucoamylase P (gamP) gene: production of a heterologous glucoamylase by Trichoderma reesei. Curr. Genet. 24: 223-228.

Karhunen T.₍ Mãntylã A., Nevalainen K. Μ. H. and Suominen P.

101

L. (1993) High frequency one-step gene replacement in Tríchoderma reesei. I. Endoglicanase I overproduction. Mol. Gen. Genet. 241:515-522.

Kurabi A., Berlin A, Gilkes N., Kilburn D., Markov A., Skomarovsky A., Gusakov A., Okunev O., Sinitsyn A., Gregg D. Xie D. and Saddler 5 J. (2005) Enzymatic hydrolysis of steam-exploded and ethanol organosolvpretreated Douglas-Fir by novel e commercial fungai cellulases. Appl. Biochem and Biotechn. Vol 121 -124:219-229.

Lever, M. (1972) A new reaction for colorimetric determination of

carbohydrates. Anal. Biochem., 47:276-279.

Lo Leggio, L., Kalogiannis S., Bhat Μ. K., and Pickersgill R.W.

(1999) High resolution structure and sequence of the T. aurantiacus xylanase I: implications for evolution of thermostability in família 10 xylanases and enzymes with (beta) alpha-barrel architecture. Proteins 36(3):295-306.

Lowry, O., Rosenbrough, N., Farr, A. and Randall, R. (1951 ) 15 Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265275.

Needleman S. and Wunsch C. (1970) A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. Journal of Molecular Biology 48, 443-453.

Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. and von Heijne G. (1997)

Identification of prokaryotic and eykaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10:1-6.

Paloheimo M., Mântylâ A., KaIMo J., and Suominen P. (2003) High- yield production of a bacteríal xylanase in the filamentous fungus Tri25 choderma reesei requires a carrier polypeptide with an intact domain structure. Appl. Env. Microbiol. 69: 7073-7082.

Parry N., Beever D., Owen E„ Nerinckx W. Claeyssens M, Van Beeumen J. and Bhat M. (2002) Biochemical characterization and mode of action of a thermostable endoglicanase purified from Thermoascus aurantia30 cus, Arch, of Biochem. and Biophys. 404: 243-253.

Penttilã M., Nevalainen H., Ratt[omicron] M., Salminen E. and Knowles J. (1987) A versatile transformation system for the cellulolytic filaô69

102

mentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61 :155-164.

Raeder U. and Broda P. (1985) Rapid preparation of DNA from filamentous fungi. Lett. Appl. Microbiol. 1 :17-20.

Rice P, Longden I and Bleasby A. (2000). EMBOSS: The Euro5 pean Molecular Biology Open Software Suite. Trends in Genetics 16:276277.

Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.

Sambrook J. and Russell D. W. (2001) Molecular cloning, a labo10 ratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York, US.

Srisodsuk M, Reiníkainen T, Penttilá M and Teeri T. (1993) Role of the interdomain linker peptide of Trichoderma reesei cellobiohydrolase I in its interaction with crystalline cellulose. J. Biol. Chem. Oct 5;268(28): 2075661.

Sundberg, M., and Poutanen, K. (1991) Purification and properties of two acetylxylan esterases of Trichoderma reesei. Biotechnol. Appl. Bio-chem. 13:1-11.

Suurnãkki, A., Tenkanen M., Siika-aho, M., Niku-Paavola, M.-L., Vii- kari, L. and Buchert, J. (2000) Trichoderma reesei cellulases and their 20 core domains in the hydrolysis and modification of chemical pulp. Cellulose • 7: 189-209.

Tenkanen, M., Puls, J. and Poutanen, K (1992) Two major xylanases of Trichoderma reesei. Enzyme Microbiol. Technol. 14: 566-574. Tomme, P. McRae, S., Wood, T. e claeyssens, M. (1988) Chromatographic 25 separation of cellulolytic enzymes. Methods in Enzymol. 160: 187-192.

Tuohy M., Walsh J„ Murray P., Claeyssens M., Cuffe M., Savage A. e coughan M. (2002) Kinetic parameters and mode of action of cellobiohy- drolases produced by Talaromyces emersonii. Biochem. Biophys. Acta 1596: 366-380 (abstract).

Van Petegem e outros (2002) Atomic resolution structure of major endoglicanase from Thermoascus aurantiacus, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 296, pp. 161-166.

103

Van Tilbeurgh, H., Loonties, F., de Bruyne, C. e claeyssens, M.

(1988) Fluorogenic e chromogenic glycosides as substracts and ligands of carbohyd rases. Methods Enzymol. 160:45-59.

Wyman, CE. (2001) Twenty years of trials, tribulations, and re5 search progress in bioethanol technology. Applied Biochemistry and Biotechnology 91-93:5-21.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110>

Roal <120>

Tratamento de material celulósico e enzimas úteis para o mesmo <130>

2051999 <160>

<170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211>

3192 <212>

DNA <213>

Thermoascus aurantiacus <220>

<221> CDS <222> (1514).. (2122) <223>

<220>

<221> íntron <222> (2123)..(2187) <223>

<220>

<221> CDS <222> (2188)..(2949) <223>

<400> 1

30	ctagaccttt	atcctttcat	ccgaccagac	ttcccctttg	accttggcgc	cctgttgact	60
	acctacctac	ctaggtaggt	aacgtcgtcg	accctcttga	atgatcctcg	tcacactgca	120

aacatccgaa acatacggca aaagatgatt gggcatggat gcaggagaca tcgaatgagg

Claims (54)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para tratar material celulósico com celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase, caracterizado pelo fato de que a dita celobioidrolase compreende uma sequência de aminoácido apresentando SEQ ID NO: 2, 4, 6 ou 8, o dito método compreendendo contactar o dito material celulósico com a dita celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase.
2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a celobioidrolase é obtida de a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum.
3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a celobioidrolase é obtida de a partir de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, ou Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as enzimas recombinantes são usadas em uma cepa do gênero Trichoderma ou Aspergillus.
5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as enzimas recombinantes são produzidas em uma cepa do gênero Trichoderma ou Aspergillus.
6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que compreende o emprego de uma celobioidrolase obtida de Thermoascus aurantiacus ou Acremonium thermophilum às quais um domínio de ligação de celulose foi anexado geneticamente.
7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação de celulose anexado é derivado de Trichoderma reesei ou Chaetomium termophilum, e a proteína de fusão resultante compreende uma sequência de aminoácido apresentando SEQ ID NO: 28 ou

   30.
8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a endoglicanase compreende uma sequência de aminoácido apresentando SEQ ID NO: 10, 12, 14 ou 16.
9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo

   Petição 870180047558, de 04/06/2018, pág. 5/16 fato de que a endoglicanase é obtida de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a endoglicanase é obtida de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240 ou Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a beta-glicosidase compreende uma sequência de aminoácido apresentando SEQ ID NO: 22, 24 ou 26.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a beta-glicosidase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, ou Chaetomium thermophilum.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que a beta-glicosidase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240, ou Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é material lignocelulósico.
15. 15. Método, de acordo a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende tratamento do material lignocelulósico com uma enzima adicional xilanase, que consiste em uma sequência de aminoácido apresentando SEQIDNO: 18 ou 20.
16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a xilanase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus ou Acremonium thermophilum.
17. 17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a xilanase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus CBS 116239 ou de Acremonium thermophilum CBS 116240.
18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as enzimas são adicionadas ao material celulósico simultaneamente.
19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo

    Petição 870180047558, de 04/06/2018, pág. 6/16 fato de que as enzimas são adicionadas ao material celulósico sequencialmente.
20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma das enzimas é codificada por um gene incluído em um microrganismo apresentando número de acesso DSM 16723, DSM 16728, DSM 16729, DSM 16727, DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.
21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é selecionado do grupo consistindo em palha de milho, gramínea do tipo switchgrass nativa da América do Norte, palha de cereais, bagaço de cana de açúcar e materiais derivados de madeira.
22. 22. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de que compreende celobioidrolase, endoglicanase e beta-glicosidase, em que a dita celobioidrolase compreende uma sequência de aminoácido apresentando SEQ ID NO: 2,4, 6 ou 8.
23. 23. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a dita celobioidrolase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum.
24. 24. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a celobioidrolase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240 ou Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
25. 25. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que as enzimas são enzimas recombinantes, preferivelmente produzidas em uma cepa do gênero Trichoderma ou Aspergillus.
26. 26. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que as enzimas são produzidas em uma cepa do gênero Trichoderma ou Aspergillus.

    TI. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que compreende uma celobioidrolase obtida a partir de Thermoascus aurantiacus à qual um domínio de ligação de celulose foi

    Petição 870180047558, de 04/06/2018, pág. 7/16 anexado geneticamente.
27. 28. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação de celulose anexado é derivado a partir de Trichoderma reesei ou Chaetomium termophilum, e a proteína de fusão resultante compreende uma sequência de aminoácidos apresentado SEQ ID NO: 28 ou 30.
28. 29. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a endoglicanase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando SEQ ID NO: 10, 12, 14 ou 16.
29. 30. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que a endoglicanase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum ou Chaetomium thermophilum.
30. 31. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que a endoglicanase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240 ou Chaetomium thermophilum CBS 730.95.

    31. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a beta-glicosidase compreende uma sequência de aminoácido apresentando SEQ ID NO: 22, 24 ou 26.
31. 32. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que a beta-glicosidase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus, Acremonium thermophilum, ou Chaetomium thermophilum.
32. 33. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que a beta-glicosidase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus CBS 116239, Acremonium thermophilum CBS 116240 ou Chaetomium thermophilum CBS 730.95.
33. 34. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que compreende uma enzima adicional xilanase, que consiste em uma sequência de aminoácidos apresentando SEQ ID NO: 18 ou 20.
34. 35. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 34, caPetição 870180047558, de 04/06/2018, pág. 8/16 racterizada pelo fato de que a xilanase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus ou Acremonium thermophilum.
35. 36. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizada pelo fato de que a xilanase é obtida a partir de Thermoascus aurantiacus CBS 116239 ou Acremonium thermophilum CBS 116240.
36. 37. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que uma das enzimas é codificada por um gene incluído em um microrganismo apresentando número de acesso DSM 16723, 5 DSM 16728, DSM 16729, DSM 16727, DSM 17326, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16724, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.
37. 38. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que está na forma de meio de cultura gasto, pó, grânulos ou líquido.
38. 39. Uso de uma preparação de enzima, como definida em qualquer uma das reivindicações 22 a 38, caracterizado pelo fato de que é para degradação de material celulósico.
39. 40. Uso, de acordo com reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o material celulósico é selecionado a partir do grupo consistindo em palha de milho, gramínea do tipo switchgrass nativa da América do Norte, palha de cereais, bagaço de cana de açúcar e materiais derivados de madeira.
40. 41. Uso do método, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é em um processo para preparação de etanol a partir de material celulósico.
41. 42. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende como uma sequência heteróloga um polinucleotídeo, de SEQ ID NO: 3, 5, 11,13, 15,19, 21,23, ou 25.
42. 43. Vetor, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que é capaz de expressar um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando SEQ ID NO: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 ou 26.

    Petição 870180047558, de 04/06/2018, pág. 9/16
43. 44. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que é uma célula de fungo que compreende o vetor, como definido na reivindicação 42.
44. 45. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que é capaz de expressar o polipeptídeo codificado pela sequência de polinucleotídeo heteróloga.
45. 46. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que é uma cepa do gênero Trichoderma ou Aspergillus.
46. 47. Cepa de Escherichia coli, caracterizada pelo fato de que possui número de acesso DSM 16728, DSM 16729, DSM 17324, DSM 17323, DSM 17729, DSM 16726, DSM 16725, DSM 17325 ou DSM 17667.
47. 48. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo apresentando SEQ ID NO: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 ou 26.
48. 49. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que está na forma de meio de cultura gasto, pó, grânulos ou líquido.
49. 50. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 48 ou 49, caracterizada pelo fato de que compreende atividade de celobioidrolase, endoglicanase, beta-glicosidase, e opcionalmente de xilanase.
50. 51. Uso de um polipeptídeo apresentando SEQ ID NO: 4, 6, 12, 14, 16, 20, 22, 24 ou 26, ou uma preparação de enzima, como definida na reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que é na indústria de combustíveis, têxteis, detergentes, polpa e papel, alimentos, suprimentos ou bebidas.
51. 52. Uso, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a enzima é empregada no tratamento de polpa kraft, polpa mecânica ou papel reciclado.
52. 53. Uso, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que a preparação de enzima é meio de cultura gasto.
53. 54. Método para preparar um polipeptídeo, apresentando atividade celulósíca e:

    a) compreendendo uma sequência de aminoácido apresentando SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:16,

    Petição 870180047558, de 04/06/2018, pág. 10/16

    SEQ ID NO: 20, SEQ ID N°:22 ou 24, ou SEQ ID N°:26;

    caracterizado pelo fato de que compreende transformação de uma célula hospedeira com um vetor codificando o dito polipeptídeo, e cultivo da célula hospedeira sob condições que permitem expressão do dito polipeptídeo,

    5 e opcionalmente recuperação e purificação do polipeptídeo produzido.
54. 55. Método para tratar material celulósico, caracterizado pelo fato de que é com um meio de cultura gasto deum microrganismo capaz de produzir um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido apresentando SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 10 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 ou SEQ ID NO:24, ou SEQ ID NO: 26;

    o dito método compreendendo reação do material celulósico com o meio de cultura gasto para obtenção de material celulósico hidrolisado.