BR112013018695B1 - Célula hospedeira microbiana recombinante, processos para produzir um polipeptídeo, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, e, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão - Google Patents

Abstract

célula hospedeira microbiana transgênica, processos para produzir um polipeptídeo, para produzir um mutante, para produzir uma proteína, para degradar um material celulósico, para sintetizar um produto de 5 fermentação, para fermentar um material celulósico, para produzir um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, polipeptídeo isolado, e polinucleotídeo isolado. a presente invenção se refere aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase e aos polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. a invenção também se refere aos construtos de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como aos métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Description

Declaração dos Direitos Para as Invenções Realizadas em Pesquisa e Desenvolvimento Patrocinadas Pelo Governo Federal

[001] Esta invenção foi realizada em parte com o auxílio do Governo no acordo de cooperação DE-FC36-08GO18080, concedida pelo Departamento de Energia. O Governo apresenta certos direitos nesta invenção.

Referência a Uma Listagem de Sequência

[002] Este pedido contém uma listagem de sequência na forma legível em computador, que é aqui incorporada pela referência.

Fundamentos da Invenção Campo da Invenção

[003] A presente invenção se refere aos polipeptídeos com atividade de celobioidrolase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos. A invenção também se refere aos construtos de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos, bem como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.

Descrição da Técnica Relacionada

[004] A celulose é um polímero de glicose ligado por ligação do tipo beta-1,4. Muitos microrganismos produzem enzimas que hidrolisam beta- glicanas ligadas. Estas enzimas incluem endoglucanases, celobioidrolases e beta-glicosidases. As endoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo-o para ataque por celobioidrolases. As celobioidrolases liberam sequencialmente moléculas de celobiose a partir das extremidades do polímero de celulose. A celobiose é um dímero ligado a 1,4- beta de glicose solúvel em água. As beta-glicosidases hidrolisam celobiose em glicose.

[005] A conversão de matérias primas lignocelulíticas em etanol apresenta as vantagens da disponibilidade imediata de grandes quantidades de matéria prima, a vantagem de evitar queimar ou aterrar os materiais, e a limpeza do etanol combustível. Madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas e resíduos sólidos municipais são considerados matérias primas para a produção de etanol. Estes materiais consistem principalmente em celulose, hemicelulose, e lignina. Uma vez que a celulose é convertida em glicose, a glicose é facilmente fermentada por levedura em etanol. Considerando que glicose é facilmente fermentada em etanol por uma variedade de leveduras, enquanto a celobiose não é, qualquer celobiose que permanece no final da hidrólise representa uma perda de rendimento de etanol. De maneira mais importante, a celobiose é um inibidor potente de endoglucanases e celobioidrolases. O acúmulo de celobiose durante a hidrólise é indesejável para a produção de etanol.

[006] A presente invenção fornece polipeptídeos com atividade de celobioidrolase e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.

[007] O polipeptídeo de acordo com a invenção que apresenta atividade de celobioidrolase compartilha 80,4 % de identidade (excluindo os intervalos) com a sequência deduzida de aminoácidos de uma proteína prevista da família GH6 de Aspergillus fumigatus (número de acesso GENESEQP:ABB80166).

Sumário da Invenção

[008] A presente invenção se refere aos polipeptídeos isolados com atividade de celobioidrolase selecionados do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que apresenta pelo menos 81 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade baixa, ou média, ou médio-alta, ou alta, ou muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; ou a sequência de DNAc deste; (d) um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de celobioidrolase.

[009] A presente invenção também se refere aos polipeptídeos isolados que compreende um domínio catalítico, selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio catalítico que apresenta pelo menos 81 % de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 (por exemplo, aminoácidos 105 a 464 de SEQ ID NO: 2); (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1 (por exemplo, nucleotídeos 460-599, 678-931, 1001-1138, 1210-1470, 1541-1782, e 1854-1895 de SEQ ID NO: 1); (c) um variante de um domínio catalítico que compreende uma substituição, eliminação, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 2; e (d) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), ou (c), que apresenta atividade de celobioidrolase.

[0010] A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos da presente invenção; construtos de ácido nucleico; vetores de expressão recombinantes; células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir os polipeptídeos.

[0011] A presente invenção também se refere aos processos para degradar um material celulósico compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto, os processos compreendem adicionalmente recuperar o material celulósico degradado ou convertido.

[0012] A presente invenção também se refere aos processos de produzir um produto de fermentação compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[0013] A presente invenção também se refere aos processos de fermentar um material celulósico compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação. Em outro aspecto, os processos compreendem adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[0014] A presente invenção também se refere a um polinucleotídeo que codifica um peptídeo sinal que compreende ou que consiste nos aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO: 2, que é operavelmente ligado a um gene que codifica uma proteína; construtos de ácido nucleico, vetores de expressão, e células hospedeiras recombinantes que compreendem os polinucleotídeos; e métodos de produzir uma proteína.

Definições

[0015] Celobioidrolase: O termo “celobioidrolase” significa uma 1,4- beta-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91), que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, celo-oligossacarídeos, ou qualquer polímero contendo glicose ligada a beta-1,4, que libera celobiose a partir das extremidades reduzidas ou não reduzidas da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohydrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohydrolases: why so efficient on crystalline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). A atividade de celobioidrolase é determinada de acordo com os procedimentos descritos Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters, 149: 152-156; van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters, 187: 283-288; e Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581. Na presente invenção, o método de Tomme et al. pode ser usado para determinar a atividade de celobioidrolase.

[0016] Em um aspecto, os polipeptídeos da presente invenção apresentam pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 % da atividade de celobioidrolase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0017] Acetilxilano esterase: O termo “acetilxilano esterase” significa uma carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila e acetato de p-nitrofenila. Com propósitos da presente invenção, a atividade de acetilxilano esterase é determinada usando p- nitrofenilacetato 0,5 mM como substrato em acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, contendo TWEEN™ 20 0,01 % (monolaurato de polioxietileno sorbitano). Uma unidade de acetilxilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ânion p-nitrofenolato por minuto em pH 5, 25°C.

[0018] Variante alélico: O termo “variante alélico” significa qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossômico. A variação alélica aumenta naturalmente por meio de mutação, e pode resultar em polimorfismo nas populações. As mutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos com sequências alteradas de aminoácidos. Um variante alélico de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por um variante alélico de um gene.

[0019] Alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “alfa-L- arabinofuranosidase” significa uma alfa-L-arabinofuranosídeo arabinofuranoidrolase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise de resíduos de alfa-L-arabinofuranosídeo não reduzidos terminais em alfa-L-arabinosídeos. A enzima age em alfa-L-arabinofuranosídeos, alfa-L-arabinanos contendo ligações (1,3) e/ou (1,5), arabinoxilanos e arabinogalactanos. A alfa-L- arabinofuranosidase é também conhecida como arabinosidase, alfa- arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfa-arabinofuranosidase, polissacarídeo de alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-L-arabinofuranosídeo hidrolase, L- arabinosidase, ou alfa-L-arabinanase. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Irlanda) por mL de acetato de sódio 100 mM, pH 5, em um volume total de 200 μL por 30 minutos a 40°C, seguido por análise de arabinose por cromatografia de coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

[0020] Alfa-glucuronidase: O termo “alfa-glucuronidase” significa uma alfa-D-glucosiduronato glucuronoidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-D-glicuronosídeo em D-glicuronato e um álcool. Com propósitos da presente invenção, a atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de alfa-glucuronidase é igual a quantidade de enzima capaz de liberar 1 μmol de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto em pH 5, 40°C.

[0021] Beta-glicosidase: O termo “beta-glicosidase” significa uma beta-D-glucosídeo glucoidrolase (E.C. 3.2.1,21) que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D- glicose. Com propósitos da presente invenção, a atividade de beta-glicosidase é determinada usando p-nitrofenil-beta-D-glucopiranosídeo como substrato de acordo com o procedimento de Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D- glicosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophilum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de beta-glicosidase é definida como 1,0 μmol de ânion p- nitrofenolato produzido por minuto a 25°C, pH 4,8, a partir de p-nitrofenil- beta-D-glucopiranosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 50 mM contendo TWEEN® 20 0,01 %.

[0022] Beta-xilosidase: O termo “beta-xilosidase” significa uma beta-D-xilosídeo xiloidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta ^(4)-xilo-oligossacarídeos curtas para remover sucessivos resíduos de D-xilose a partir das terminações não reduzidas. Com propósitos da presente invenção, uma unidade de beta-xilosidase é definida como 1,0 μmol de ânion p-nitrofenolato produzido por minuto a 40°C, pH 5, a partir de p-nitrofenil- beta-D-xilosídeo 1 mM como substrato em citrato de sódio 100 mM contendo TWEEN® 20 0,01 %.

[0023] DNAc: O termo “DNAc” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula RNAm madura, unida obtida de uma célula eucariótica. O DNAc precisa de sequências intron que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial e primário é um precursor para o RNAm que é processado por meio de uma série de etapas, incluindo união, antes de aparecer como RNAm unido maduro.

[0024] Material celulósico: O termo “material celulósico” significa qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede celular primária da biomassa é a celulose, o segundo mais abundante é a hemicelulose e o terceiro é a pectina. A parede celular secundária, produzida após a célula parar de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada por lignina polimérica covalentemente reticulada em hemicelulose. A celulose é um homopolímero de anidrocelobiose e, assim, um beta-(1-4)-D-glicano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, tais como xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananas em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora em geral polimórfica, a celulose é encontrada no tecido vegetal principalmente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias paralelas de glicano. As hemiceluloses em geral ligam hidrogênio à celulose, bem como a outras hemiceluloses, o que ajuda a estabilizar a matriz da parede celular.

[0025] A celulose é encontrada em geral, por exemplo, nos caules, folhas, sépalas, cascas e sabugos de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores. O material celulolítico pode ser, mas não se limitam a, resíduo agrícola, material herbáceo (incluindo culturas que fornecem energia), resíduo sólido municipal, resíduo de polpa e papel moído, papel residual e madeira (incluindo resíduos florestais) (ver, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105-118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). Entende-se aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede celular de planta contendo lignina, celulose e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulolítico é qualquer material de biomassa. Em outro aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose, que compreende celulose, hemiceluloses e lignina.

[0026] Em um aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em outro aspecto, o material celulósico é resíduo herbáceo (incluindo culturas para produção de energia). Em outro aspecto, o material celulósico é resíduo sólido municipal. Em outro aspecto, o material celulósico é resíduo de polpa e papel moído. Em outro aspecto, o material celulósico é papel residual. Em outro aspecto, o material celulósico é madeira (incluindo resíduo florestal).

[0027] Em outro aspecto, o material celulósico é arundo. Em outro aspecto, o material celulósico é bagaço. Em outro aspecto, o material celulósico é bambu. Em outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é resíduo de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é Miscanthus. Em outro aspecto, o material celulósico é casa de laranja. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em outro aspecto, o material celulósico é painço amarelo. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo.

[0028] Em outro aspecto, o material celulósico é álamo tremedor. Em outro aspecto, o material celulósico é eucalipto. Em outro aspecto, o material celulósico é pinheiro. Em outro aspecto, o material celulósico é pinha. Em outro aspecto, o material celulósico é choupo. Em outro aspecto, o material celulósico é abeto. Em outro aspecto, o material celulósico é salgueiro.

[0029] Em outro aspecto, o material celulósico é celulose de alga. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em outro aspecto, o material celulósico é línter de algodão. Em outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico.

[0030] Em outro aspecto, o material celulósico é uma biomassa aquática. Da maneira aqui usada, o termo “biomassa aquática” significa a biomassa produzida em um ambiente aquático por um processo de fotossíntese. A biomassa aquática pode ser alga, plantas emergentes, plantas com folhas flutuantes ou plantas submersas.

[0031] O material celulolítico pode ser usado como é, ou pode ser submetido a pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na técnica, da maneira descrita aqui. Em um aspecto preferido, o material celulolítico é pré-tratado.

[0032] Enzima celulolítica ou celulase: O termo “enzima celulolítica” ou “celulase” significa uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas que hidrolisam um material celulósico. Tais enzimas incluem endoglucanase(s), celobioidrolase(s), beta-glicosidase(s) ou combinações destas. As duas abordagens básicas para medir atividade celulolítica incluem: (1) medir a atividade celulolítica total, e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobioidrolases, e beta-glicosidases) da maneira revisada em Zhang et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é medida em geral usando substratos insolúveis, incluindo filtro de papel Whatman N°1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de alga, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio de atividade celulolítica total mais comum é o ensaio de filtro de papel usando filtro de papel Whatman N°1 como o substrato. O ensaio foi estabelecido pelo International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulase activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).

[0033] Com propósitos da presente invenção, a atividade da enzima celulolítica é determinada medindo o aumento na hidrólise de um material celulolítico pela(s) enzima(s) celulolítica(s) nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína da enzima celulolítica/g de celulose em PCS por 3-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo a 50°C, 55°C ou 60°C, comparada a uma hidrólise controle sem a adição de proteína da enzima celulolítica. As condições típicas são reações de 1 mL, PCS lavado ou não lavado, 5 % de sólidos insolúveis, acetato de sódio 50 mM em pH 5, MnSO4 1 mM, 50°C, 55°C ou 60°C, 72 horas, análise de açúcar por coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

[0034] Sequência codificante: O termo “sequência codificante” significa um polinucleotídeo que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. Os limites da sequência codificante são determinados em geral por um quadro aberto de leitura, que começa com um códon inicial tal como ATG, GTG, ou TTG, e termina com um códon de parada tal como TAA, TAG ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, DNAc, DNA sintético, ou uma combinação destes.

[0035] Sequências controle: O termo “sequências controle” significa sequências de ácido nucleico necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência controle pode ser natural (isto é, do mesmo gene) ou estrangeira (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou natural ou estrangeira uma à outra. Tais sequências controle incluem, mas não se limitam a, uma sequência principal, sequência de poliadenilação, sequência de pro-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal e finalizador de transcrição. No mínimo, as sequências controle incluem um promotor e sinais de parada transcricionais e translacionais. As sequências controle podem ser fornecidas com ligantes com o propósito de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das sequências controle com a região codificante do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.

[0036] Endoglucanase: O termo “endoglucanase” significa uma endo-1,4-(1,3;1,4)-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. 3.2.1.4), que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glicanos mistos, tais como beta-D- glicanos ou xiloglicanos de cereal e outro material vegetal contendo componentes celulolíticos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada medindo a redução na viscosidade do substrato ou o aumento na redução das extremidades determinado por um ensaio de redução de açúcar (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Com propósitos da presente invenção, a atividade de endoglucanase é determinada usando carboximetil celulose (CMC) como substrato de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure e Appl. Chem. 59: 257-268, em pH 5, 40°C.

[0037] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não se limitam a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacionais e secreção.

[0038] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, e é operavelmente ligada a sequências controle que fornecem sua expressão.

[0039] Família 61 de glicosídeo hidrolase: O termo “Família 61 de glicosídeo hidrolase” ou “Família GH61” ou “GH61” significa um polipeptídeo que pertence à família 61 de glicosídeo hidrolase de acordo com Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat e Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696. As enzimas nesta família foram classificadas originalmente como uma família de glicosídeo hidrolase com base na medição da atividade muito fraca de endo-1,4-beta-D-glucanase em um elemento da família. A estrutura e modo de ação destas enzimas são não canônicas e não podem ser consideradas como glicosidases autênticas. Entretanto, são mantidas na classificação CAZy com base na sua capacidade de melhorar a quebra da lignocelulose quando usadas junto com uma celulase ou uma mistura de celulases.

[0040] Feruloil esterase: O termo “feruloil esterase” significa uma 4- hidróxi-3-metoxicinamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise dos grupos de 4-hidróxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir de açúcar esterificado, que é em geral arabinose em substratos “naturais”, para produzir ferulato (4-hidróxi-3-metoxicinamato).

[0041] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes na terminação amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro; em que o fragmento apresenta atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, um fragmento contém pelo menos 360 aminoácidos. Mais particularmente, em uma modalidade, um fragmento significa um polipeptídeo que compreende ou que consiste nos aminoácidos 105 a 464 de SEQ ID NO: 2. Um fragmento pode incluir em uma modalidade adicional o ligante, os aminoácidos 56 a 104 de SEQ ID NO: 2, ou uma parte destes.

[0042] Enzima hemicelulolítica ou hemicelulase: O termo “enzima hemicelulolítica” ou “hemicelulase” significa uma ou mais (várias) enzimas que hidrolisam um material hemicelulósico. Ver, por exemplo, Shallom e Shoham, 2003, Microbial hemicellulases. Current Opinion in Microbiology 6(3): 219-228). As hemicelulases são componentes chave na degradação da biomassa de planta. Os exemplos de hemicelulases incluem, mas não se limitam a, uma acetilmanana esterase, uma acetixilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase. O substratos destas enzimas, as hemiceluloses, são um grupo heterogêneo de polissacarídeos ramificados e lineares que são ligados por meio de ligações de hidrogênio às microfibrilas de celulose na parede celular vegetal, reticulando- as em uma rede grande. As hemiceluloses também são covalentemente anexadas à lignina, formando junto com a celulose uma estrutura altamente complexa. A estrutura variável e organização de hemiceluloses exige a ação combinada de muitas enzimas para sua completa degradação. Os módulos catalíticos de hemicelulases são tanto glicosídeo hidrolases (GHs), que hidrolisam ligações glicosídicas, quanto carboidrato esterases (CEs), que hidrolisam ligações éster de grupos laterais de acetato ou ácido ferúlico. Estes módulos catalíticos, com base na homologia de sua sequência primária, podem ser determinados nas famílias GH e CE marcadas por números. Algumas famílias, com um dobramento similar completo, podem ser agrupadas adicionalmente em clãs, marcadas alfabeticamente (por exemplo, GH-A). Uma classificação mais informativa e atualizada destas e outras enzimas ativas em carboidrato está disponível na base de dados CarbohydrateActive Enzymes (CAZy). As atividades hemicelulolíticas da enzima podem ser medidas de acordo com Ghose e Bisaria, 1987, Pure & AppI. Chem. 59: 1739-1752, em uma temperatura adequada, por exemplo, 50°C, 55°C ou 60°C, e pH adequado, por exemplo, 5,0 ou 5,5.

[0043] Condições de severidade alta: O termo “condições de severidade alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 65°C.

[0044] Célula hospedeira: O termo “célula hospedeira” significa qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução, ou similar a um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação.

[0045] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitam a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator que é pelo menos parcialmente removido de um ou mais, ou todos, os constituintes de ocorrência natural com os quais está associado na natureza; (3) qualquer substância modificada por manipulação humana relacionada àquela substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada pelo aumento da quantidade da substância relacionada a outros componentes com os quais está naturalmente associada (por exemplo, cópias múltiplas de um gene que codifica a substância; uso de um promotor mais forte que o promotor naturalmente associado ao gene que codifica a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[0046] Condições de severidade baixa: O termo “condições de severidade baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada, por 15 minutos, usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 50°C.

[0047] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final que permite a tradução e qualquer das modificações pós-translacionais, tais como processamento N- terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 19 a 464 de SEQ ID NO: 2, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo sinal. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois de mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

[0048] Sequência que codifica polipeptídeo maduro: O termo “sequência que codifica polipeptídeo maduro” significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro com atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 55 a 1895 de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste, com base no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê que os nucleotídeos 1 a 54 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo sinal. Em uma modalidade particular, a sequência que codifica o polipeptídeo maduro apresenta os nucleotídeos 55-76, 146-214, 290-599, 678-931, 1001-1138, 1210-1470, 1541-1782, 1854-1898 de SEQ ID NO: 1 (incluindo o códon de parada).

[0049] Domínio catalítico: O termo “domínio catalítico” significa a porção de uma enzima que contém a maquinaria catalítica da enzima. Em uma modalidade particular, o domínio catalítico apresenta os aminoácidos 105-464 de SEQ ID NO: 2.

[0050] Domínio de ligação de celulose: O termo “domínio de ligação de celulose” significa a porção de uma enzima que medeia a ligação da enzima nas regiões amorfas de um substrato de celulose. O domínio de ligação de celulose (CBD) é encontrado tanto na extremidade N-terminal quanto na C-terminal de uma enzima. Um CBD também é referido como um módulo de ligação de celulose ou CBM. Em uma modalidade, o CBM apresenta os aminoácidos 19 a 55 de SEQ ID NO: 2. O CBM é separado do domínio catalítico por uma sequência ligantea. O ligante, em uma modalidade, apresenta os aminoácidos 56 a 104 de SEQ ID NO: 2.

[0051] Condições de severidade média: O termo “condições de severidade média” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35 % formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 55°C.

[0052] Condições de severidade médio-alta: O termo “condições de severidade médio-altas” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e 35 % formamida, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 60°C.

[0053] Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, tanto de fita simples quanto de fita dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que pode não existir de outra forma na natureza, ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências controle.

[0054] Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência controle é colocada em uma posição apropriada, com relação à sequência codificante de um polinucleotídeo, de maneira tal que a sequência controle direcione a expressão da sequência codificante.

[0055] Polipeptídeo com melhor atividade celulolítica: O termo “polipeptídeo com melhor atividade celulolítica” significa um polipeptídeo GH61 que catalisa a melhoria da hidrólise de um material celulósico por enzima que apresenta atividade celulolítica. Com propósitos da presente invenção, a melhor atividade celulolítica é determinada avaliando o aumento nos açúcares redutores, ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica nas condições a seguir: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que a proteína total é compreendida de 50-99,5 % p/p de proteína celulolítica enzimática e 0,5-50 % p/p de proteína de um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica por 1-7 dias em uma temperatura adequada, por exemplo, 50°C, 55°C, ou 60°C, e pH adequado, por exemplo, 5,0 ou 5,5, comparado a uma hidrólise controle com carregamento de proteína total igual, sem melhor atividade celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELLUCLAST® 1,5 L (Novozymes A/S, Bagsv^rd, Dinamarca) na presença de 2-3 % em peso de proteína total de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014), ou 2-3 % em peso de proteína total de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus (produzida de maneira recombinante em Aspergillus oryzae da maneira descrita em WO 2002/095014) da carga de proteína celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.

[0056] Os polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica melhoram a hidrólise de um material celulósico, catalisado por enzima que apresenta atividade celulolítica, reduzindo a quantidade de enzima celulolítica exigida para atingir o mesmo grau de hidrólise, preferivelmente pelo menos 1,01 vez, por exemplo, pelo menos 1,05 vez, pelo menos 1,10 vez, pelo menos 1,25 vez, pelo menos 1,5 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes.

[0057] Resíduo de milho pré-tratado: O termo “PCS” ou “resíduo de milho pré-tratado” significa um material celulolítico derivado de resíduo de milho por tratamento com calor e ácido sulfúrico diluído, pré-tratamento alcalino ou pré-tratamento neutro.

[0058] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.

[0059] Com propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferivelmente versão 5.0.0 ou superior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (EMBOSS versão de BLOSUM62). O rendimento de Needle marcado como “melhor identidade” (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir: (Resíduos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento - Número total de intervalos no alinhamento)

[0060] Com propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra), da maneira implementada no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferivelmente versão 5.0.0 ou superior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (EMBOSS versão de NCBI NUC4.4). O rendimento de Needle marcado como “melhor identidade” (obtido usando a opção não resumida) é usado como a identidade percentual e é calculado da maneira a seguir: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Tamanho do alinhamento - Número total de intervalos no alinhamento)

[0061] Subsequência: O termo “subsequência” significa um polinucleotídeo com um ou mais (por exemplo, vários) nucleotídeos ausentes na extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência que codifica o polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento que apresenta atividade de celobioidrolase. Em um aspecto, uma subsequência codifica um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase, por exemplo, um domínio catalítico de acordo com a invenção. Em uma modalidade, uma subsequência compreende ou consiste nos nucleotídeos 460 a 1895 de SEQ ID NO: 1, e mais particularmente nos nucleotídeos 460-599, 678-931, 10011138, 1210-1470, 1541-1782, 1854-1895 de SEQ ID NO: 1.

[0062] Variante: O termo “variante” significa um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase compreendendo uma alteração, isto é, uma substituição, inserção, e/ou eliminação em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Uma substituição significa a troca do aminoácido que ocupa uma posição por um aminoácido diferente; uma eliminação significa a remoção do aminoácido que ocupa uma posição; e uma inserção significa adicionar um aminoácido adjacente e imediatamente após o aminoácido que ocupa uma posição.

[0063] Condições de severidade muito alta: O termo “condições de severidade muito alta” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 70°C.

[0064] Condições de severidade muito baixa: O termo “condições de severidade muito baixa” significa sondas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridização e hibridização a 42°C em SSPE 5X, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA desnaturado e cisalhado de esperma de salmão, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting por 12 a 24 horas. O material carreador é finalmente lavado três vezes cada por 15 minutos usando SSC 2X, SDS a 0,2 % a 45°C.

[0065] Material contendo xilano: O termo “material contendo xilano” significa qualquer material que compreende um polissacarídeo de parede celular vegetal, contendo uma parte principal de resíduos beta-(1-4)- ligados à xilose. Os xilanos de plantas terrestres são heteropolímeros que possuem uma parte principal de beta-(1-4)-D-xilopiranose, que é ramificada carboidratos de cadeias curtas. Compreendem ácido D-glucurônico ou seu éter de 4-O-metila, L-arabinose e/ou vários oligossacarídeos compostos de D- xilose, L-arabinose, D- ou L-galactose e D-glicose. Os polissacarídeos do tipo xilano podem ser divididos em homoxilanos e heteroxilanos, os quais incluem glucuronoxilanos, (arabino)glucuronoxilanos, (glucurono)arabinoxilanos, arabinoxilanos e heteroxilanos complexos. Ver, por exemplo, Ebringerova et al., 2005, Adv. Polym. Sci. 186: 1-67.

[0066] Nos processos da presente invenção, qualquer material contendo xilano pode ser usado. Em um aspecto preferido, o material contendo xilano é lignocelulose.

[0067] Atividade que degrada xilano ou atividade xilanolítica: O termo “atividade que degrada xilano” ou “atividade xilanolítica” significa uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilano. As duas abordagens básicas para medir atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade xilanolítica total, e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetilxilano esterases, feruloil esterases, e alfa-glicuronil esterases). Recentes progressos nos ensaios de enzimas xilanolíticas foram sumarizados em, por exemplo, várias publicações, incluindo Biely e Puchard, Recent progress in the assays of xylanolytic enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glicuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely e Kubicek, 1997, The beta-D-xylosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-D-xylano xylohydrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.

[0068] A atividade total que degrada xilano pode ser medida determinando a redução de açúcares formada a partir de vários tipos de xilano incluindo, por exemplo, xilanos de espelta de aveia, madeira de faia e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilano corado liberados de vários xilanos covalentemente corados. O ensaio da atividade xilanolítica total mais comum baseia-se na produção de açúcares reduzidos de 4-O-metil glucuronoxilano polimérico, da maneira descrita em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270. A atividade de xilanase também pode ser determinada com 0,2 % de AZCL-arabinoxilano como substrato em TRITON® X-100 0,01 % (4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil- polietileno glicol) e tampão sulfato de sódio 200 mM pH 6 a 37°C. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano 0,2 % como substrato em tampão fosfato de sódio 200 mM, pH 6.

[0069] Com propósitos da presente invenção, a atividade que degrada xilano é determinada medindo o aumento na hidrólise de xilano de vidoeiro (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) por enzima(s) que degrada(m) xilano nas condições típicas a seguir: reações de 1 mL, 5 mg/mL de substrato (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica/g de substrato, acetato de sódio 50 mM em pH 5, 50°C, 24 horas, análise de açúcar usando o ensaio de hidrazida do ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) da maneira descrita por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279.

[0070] Xilanase: O termo “xilanase” significa uma 1,4-beta-D-xilan- xiloidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta- D-xilosídicas em xilanos. Com propósitos da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada com AZCL-arabinoxilano 0,2 % como substrato em TRITON X-100 0,01% e tampão de fosfato de sódio 200 mM, pH 6 a 37°C. Uma unidade da atividade de xilanase é definida como 1,0 μmol de azurina produzida por minuto a 37°C, pH 6, a partir de AZCL-arabinoxilano 0,2% como substrato em tampão de fosfato de sódio 200 mM, pH 6.

Descrição Detalhada da Invenção Polipeptídeos com atividade de celobioidrolase

[0071] Em uma modalidade, a presente invenção se refere aos polipeptídeos isolados que apresentam uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 81 %, por exemplo, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que apresentam atividade de celobioidrolase. Os polipeptídeos da presente invenção apresentam pelo menos 20 %, por exemplo, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, e pelo menos 100 % da atividade de celobioidrolase do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em não mais que 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9, do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[0072] Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou um variante alélico deste; ou é um fragmento deste com atividade de celobioidrolase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 19 a 464 de SEQ ID NO: 2.

[0073] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que apresenta atividade de celobioidrolase codificada por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade média, ou condições de severidade médio-alta, ou condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, UM Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0074] O polinucleotídeo de SEQ ID NO: 1, ou uma subsequência deste, bem como o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, ou um fragmento deste, pode ser usado para determinar as sondas de ácido nucleico para identificar e clonar os polipeptídeos com atividade de celobioidrolase que codificam DNA a partir das cepas de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o DNA genômico ou DNAc de uma célula de interesse, seguindo os procedimentos padrões de Southern blotting, a fim de identificar e isolar o gene correspondente neste. Tais sondas podem ser consideravelmente menores que a sequência total, mas podem ter pelo menos 15, por exemplo, pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos em tamanho. Preferivelmente, a sonda de ácido nucleico apresenta pelo menos 100 nucleotídeos em tamanho, por exemplo, pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos em tamanho. Tanto as sondas de DNA quanto de RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Tais sondas são incluídas pela presente invenção.

[0075] Uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc preparada a partir de tais outras cepas pode ser selecionada para o DNA que hibridiza com as sondas descritas anteriormente e codifica um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase. O DNA genômico ou outro, a partir de tais outras cepas, pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido e imobilizado em nitrocelulose ou outro material carreador adequado. A fim de identificar um clone ou DNA que hibridiza em SEQ ID NO: 1, ou uma subsequência deste, o material carreador é usado em um Southern blot.

[0076] Com propósitos da presente invenção, a hibridização indica que o polinucleotídeo hibridiza em uma sonda de ácido nucleico marcado que corresponde a (i) SEQ ID NO: 1; (ii) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; (iii) a sequência de DNAc deste; (iv) o complemento de tamanho total deste; ou (v) uma subsequência desta; em condições de severidade média a muito alta. As moléculas nas quais a sonda de ácido nucleico hibridiza nestas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios-X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0077] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, o polipeptídeo maduro deste ou um fragmento deste. Em outro aspecto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste.

[0078] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado, que apresenta atividade de celobioidrolase codificada por um polinucleotídeo, com uma identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou a sequência de DNAc deste, de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 %.

[0079] Em outra modalidade, a presente invenção se refere aos variantes do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, os quais compreendem uma substituição, eliminação e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácido introduzido no polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é não mais que 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. As mudanças de aminoácido podem ser de uma natureza inferior, isto é, substituições ou inserções conservativas de aminoácido que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas eliminações, tipicamente de 1-30 aminoácidos; extensões pequenas amino ou carboxil-terminais, tal como um resíduo de metionina amino-terminal; um peptídeo ligante pequeno de até 20-25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação mudando a carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[0080] Os exemplos de substituições conservativas estão nos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidos pequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácido que não alteram, em geral, a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[0081] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza tal que as propriedades físicoquímicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alteram a especificidade do substrato, mudam o pH ideal e similares.

[0082] Os aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagênese sítio direcionada ou mutagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina simples são introduzidas e cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas com relação à atividade de celobioidrolase para identificar resíduos de aminoácido que são importantes para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado por análise física da estrutura, da maneira determinada por tal técnica como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron, ou marcação de foto afinidade, junto com mutação de aminoácidos de sítio de contato suposto. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades dos aminoácidos essenciais também podem ser inferidas a partir da análise de identidades com polipeptídeos que estão relacionados com o polipeptídeo pai. A identidade dos aminoácidos essenciais também pode ser inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[0083] As substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido simples ou únicas podem ser realizadas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de seleção relevante, tais como aqueles revelados por Reidhaar- Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa ao erro, exibição de fago (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese região-direcionada (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).

[0084] Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem ser combinados com métodos de seleção automatizados de alto rendimento para detectar a atividade dos polipeptídeos clonados e mutagenizados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893896). As moléculas de DNA mutagenizado que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrões na técnica. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos individuais de aminoácido em um polipeptídeo.

[0085] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido, em que uma região de um polipeptídeo é fundida à terminação N ou à terminação C de uma região de outro polipeptídeo.

[0086] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável, em que outro polipeptídeo é fundido na terminação N ou na terminação C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido fundindo um polinucleotídeo que codifica outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. As técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligar as sequências codificantes que codificam os polipeptídeos, de maneira que eles fiquem em alinhamento e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja no controle do(s) mesmo(s) promotor(s) e finalizador(s). Os polipeptídeos de fusão também podem ser construídos usando tecnologia de inteína, na qual os polipeptídeos de fusão são criados pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0087] Um polipeptídeo de fusão pode compreender adicionalmente um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Mediante a secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem, mas não se limitam a, o sítios revelados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, e Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

Fontes de polipeptídeos com atividade de celobioidrolase

[0088] Um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção pode ser obtido de microrganismos de qualquer gênero. Com propósitos da presente invenção, o termo “obtido de”, da maneira aqui usada junto com uma dada fonte, pode significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

[0089] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de Talaromyces.

[0090] Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Talaromyces leycettanus, por exemplo, um polipeptídeo obtido da cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68.

[0091] Será entendido que, para as espécies anteriormente mencionadas, a invenção inclui tanto os estágios perfeitos quanto os imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem levar em consideração o nome da espécie pelo qual são conhecidas. Os versados na técnica reconhecerão facilmente a identidade dos equivalentes adequados.

[0092] As cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público em inúmeras coleções de cultura, tais como o American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0093] O polipeptídeo pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondas anteriormente mencionadas. As técnicas para isolar microrganismos e DNA diretamente de seus habitats naturais são bem conhecidas na tecnologia. Um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode então ser obtido selecionando similarmente uma biblioteca de DNA genômico ou DNAc de outro microrganismo ou amostra mista de DNA. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo foi detectado com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando técnicas que são conhecidas pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Domínios catalíticos

[0094] A presente invenção também se refere aos polipeptídeos isolados que compreende um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio catalítico que apresenta pelo menos 81 % de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 (por exemplo, aminoácidos 105 a 464 de SEQ ID NO: 2); (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1 (por exemplo, nucleotídeos 460-599, 678-931, 1001-1138, 1210-1470, 1541-1782, e 1854-1895 de SEQ ID NO: 1); (c) um variante de um domínio catalítico que compreende uma substituição, eliminação, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 2; e (d) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), ou (c), que tem atividade de celobioidrolase.

[0095] O domínio catalítico apresenta preferivelmente um grau de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 de pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %. Em um aspecto, o domínio catalítico compreende uma sequência de aminoácidos que difere em dez aminoácidos, por exemplo, em cinco aminoácidos, em quatro aminoácidos, em três aminoácidos, em dois aminoácidos, e em um aminoácido do domínio catalítico de SEQ ID NO: 2.

[0096] O domínio catalítico preferivelmente compreende ou consiste no domínio catalítico de SEQ ID NO: 2 ou um variante alélico deste; ou é um fragmento deste com atividade de celobioidrolase. Em outro aspecto preferido, o domínio catalítico compreende ou consiste nos aminoácidos 105 a 464 de SEQ ID NO: 2.

[0097] Em uma modalidade, o domínio catalítico pode ser codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade média, ou condições de severidade médio-alta, ou condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta (da maneira definida anteriormente) em (i) a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc contida na sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1, ou (iii) o complemento da fita de tamanho total de (i) ou (ii) (J. Sambrook et al., 1989, supra).

[0098] O domínio catalítico pode ser codificado por um polinucleotídeo com um grau de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1 de pelo menos 60 %, por exemplo pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que codifica um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase.

[0099] Em um aspecto, o polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste nos nucleotídeos 460 a 1895 de SEQ ID NO: 1 ou na sequência de DNAc destes. Em particular, o polinucleotídeo que codifica o domínio catalítico compreende ou consiste nos nucleotídeos 460599, 678-931, 1001-1138, 1210-1470, 1541-1782, e 1854-1895 de SEQ ID NO: 1.

Polinucleotídeos

[00100] A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo da presente invenção, da maneira aqui descrita.

[00101] As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na tecnologia e incluem o isolamento do DNA genômico ou DNAc, ou uma combinação destes. A clonagem dos polinucleotídeos a partir do DNA genômico pode ser realizada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase (PCR) ou seleção de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonado com características estruturas compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico, tais como reação de ligação da ligase (LCR), transcrição ativada de ligação (LAT) e amplificação a base de nucleotídeos (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Talaromyces ou um organismo relacionado e, assim, por exemplo, podem ser um alélico ou espécie variante do polipeptídeo que codifica a região do polinucleotídeo.

[00102] A modificação de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para sintetizar polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se às formas de ocorrência não natural do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir, de alguma maneira modificada por engenharia, do polipeptídeo isolado de sua fonte natural, por exemplo, variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ideal ou similares. Os variantes podem ser construídos com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou na sequência de DNAc deste, por exemplo, uma subsequência deste, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeo que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso do códon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeo que podem resultar em uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.

Construtos de ácido nucleico

[00103] A presente invenção também se refere aos construtos de ácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a ou mais sequências controle, as quais direcionam a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada em condições compatíveis com as sequências controle.

[00104] Um polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para fornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar polinucleotídeos que utilizam métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na tecnologia.

[00105] A sequência controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências controle transcricionais que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostra a atividade transcricional na célula hospedeira, incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares tanto homólogos quanto heterólogos à célula hospedeira.

[00106] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene de alfa- amilase de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene de alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL), gene de penicilinase de Bacillus licheniformis (penP), gene de amilase maltogênica de Bacillus stearothermophilus (amyM), gene de levanasacarase de Bacillus subtilis (sacB), gene xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene de agarase de Streptomyces coelicolor (dagA), e gene de beta-lactamase de procarioto (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2125). Os promotores adicionais são descritos em “Useful proteins from recombinant bacteria” em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 7494; e em Sambrook et al., 1989, supra. Os exemplos de promotores em tandem são revelados em WO 99/43835.

[00107] Os exemplos de promotores adequados para direcionar a transcrição dos construtos de ácido nucleico da presente invenção, em uma célula hospedeira de fungo filamentoso, são os promotores obtidos dos genes para acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilase de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglicosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene de alfa-amilase neutra de Aspergillus, em que a parte principal não traduzida foi substituída por uma parte principal não traduzida, a partir de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus; os exemplos não limitantes incluem promotores modificados a partir de um gene de alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, em que a parte principal não traduzida foi substituída por uma parte principal não traduzida de um gene de triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e híbridos destes.

[00108] Em uma levedura hospedeira, os promotores usados são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triose fosfato isomerase de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) e 3- fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores usados para leveduras como células hospedeiras são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[00109] A sequência controle também pode ser um finalizador de transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para finalizar a transcrição. O finalizador é operavelmente ligado na terminação 3’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer finalizador que é funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.

[00110] Os finalizadores preferidos para as células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes para protease alcalina de Bacillus clausii (aprH), alfa-amilase de Bacillus licheniformis (amyL) e RNA ribossomal de Escherichia coli (rrnB).

[00111] Os finalizadores preferidos para células hospedeiras de fungo filamentoso são obtidos dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00112] Os finalizadores preferidos para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros finalizadores usados para levedura como células hospedeiras são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[00113] A sequência controle também pode ser uma região estabilizadora de RNAm à jusante de um promotor e à montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[00114] Os exemplos de regiões estabilizadoras de RNAm adequadas são obtidos a partir de um gene cryIIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal de Bacteriology 177: 3465-3471).

[00115] A sequência controle também pode ser uma parte principal, uma região de um RNAm não traduzida, que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A parte principal é operavelmente ligada à terminação 5’ do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer parte principal que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[00116] As partes principais preferidas para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas a partir dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00117] As partes principais adequadas para levedura como células hospedeiras são obtidas dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).

[00118] A sequência controle também pode ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operavelmente ligada à terminação 3’ do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao RNAm transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira pode ser usada.

[00119] As sequências de poliadenilação preferidas para as células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas a partir dos genes para antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glicoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[00120] As sequências de poliadenilação usadas para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[00121] A sequência controle também pode ser uma região que codifica um peptídeo sinal, que codifica um peptídeo sinal ligado à terminação N de um polipeptídeo, e direciona o polipeptídeo na via de secreção da célula. A extremidade 5’ da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter intrinsecamente uma sequência de peptídeo sinal codificante naturalmente ligada no quadro aberto de leitura, com o segmente da sequência codificante que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5’ da sequência codificante pode conter uma sequência de peptídeo sinal codificante que é estrangeira à sequência codificante. Uma sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode ser exigida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência de peptídeo sinal codificante. Alternativamente, uma sequência estrangeira de peptídeo sinal codificante pode simplesmente substituir a sequência natural de peptídeo sinal codificante a fim de melhorar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de peptídeo sinal codificante que direciona o polipeptídeo expresso na via secretória de uma célula hospedeira pode ser usada.

[00122] As sequências de peptídeos sinais codificantes eficientes para células hospedeiras bacterianas são as sequências de peptídeos sinais codificantes obtidas dos genes para NCIB 11837 amilase maltogênica de Bacillus, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e prsA de Bacillus subtilis. Os peptídeos sinais adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[00123] As sequências de peptídeos sinais codificantes eficientes para células hospedeiras de fungo filamentoso são as sequências de peptídeos sinais codificantes obtidas dos genes para amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, TAKA amilase de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[00124] Os peptídeos sinais usados para levedura como células hospedeiras são obtidos dos genes para fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências de peptídeos sinais codificantes usadas são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[00125] A sequência controle também pode ser uma sequência de pro- peptídeo codificante que codifica um pro-peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pro- enzima ou pro-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pro- polipeptídeo é em geral inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pro-peptídeo a partir do pro- polipeptídeo. A sequência de pro-peptídeo codificante pode ser obtida dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), laccase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[00126] Onde tanto o peptídeo sinal quanto a sequência de pro- peptídeos estão presentes, a sequência de pro-peptídeo está posicionada próxima à terminação N de um polipeptídeo, e a sequência de peptídeo sinal está posicionada próxima à terminação N da sequência de pro-peptídeo.

[00127] Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que regulam a expressão do polipeptídeo com relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada e desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procariotos incluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2 ou sistema GAL1 podem ser usados. Em fungos filamentosos, o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, promotor de TAKA alfa-amilase de Aspergillus oryzae e promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados. Outros exemplos de sequências regulatórias são aquelas que permitem a amplificação de gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene diidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e o genes de metalotioneina que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser operavelmente ligado com a sequência regulatória.

Vetores de expressão

[00128] A presente invenção também se refere aos vetores de expressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção ligado a uma ou mais sequências controle, por exemplo, um promotor e sinais de parada transcricionais e translacionais, que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão. Os vários nucleotídeos e sequências controle podem ser reunidos para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso inserindo o polinucleotídeo, ou um construto de ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo, em um vetor apropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor de maneira tal que a sequência codificante seja operavelmente ligada com as sequências controle adequadas para a expressão.

[00129] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido aos procedimentos de DNA recombinante e pode resultar na expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor será introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[00130] O vetor pode ser um vetor que se replica autonomamente, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja a replicação é independente da replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(s) foi integrado. Além do mais, um vetor simples, ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, podem ser usados.

[00131] O vetor contém preferivelmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um produto do gene que fornece resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotróficos e similares.

[00132] Os exemplos de marcadores bacterianos selecionáveis são os genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou os marcadores que conferem resistência ao antibiótico tais como resistência à ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina ou tetraciclina. Os marcadores adequados para as células hospedeiras de levedura incluem, mas não se limitam a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 e URA3. Os marcadores adequados para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, mas não se limitam a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’- fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como equivalentes dos mesmos. Os genes preferidos para uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[00133] O vetor contém preferivelmente um(s) elemento(s) que permite(s) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou a replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[00134] Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode depender da sequência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo, ou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um(s) local(s) exato(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais podem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tais como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que apresenta um alto grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga á sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além do mais, os elementos integracionais podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[00135] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação que possibilita o vetor a replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer plasmídeo replicador que medeia a replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “plasmídeo replicador” significa um polinucleotídeo que possibilita que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[00136] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 que permitem a replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060, e pAMβl que permitem a replicação em Bacillus.

[00137] Exemplos de origens de replicação para uso em uma levedura como célula hospedeira são as origem de replicação de 2 mícron, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[00138] Exemplos de origens de replicação usadas em uma célula de filamentoso são AMA1 e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser realizados de acordo com os métodos revelados em WO 00/24883.

[00139] Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido integrando pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira, ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo, onde as células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável e, por meio disso, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando as células na presença do agente selecionável adequado.

[00140] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos anteriormente para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos pelos versados na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospedeiras

[00141] A presente invenção também se refere às células hospedeiras recombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle que direcionam a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira, de maneira tal que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossomal ou como um vetor auto replicante extra-cromossomal da maneira descrita anteriormente. O termo “célula hospedeira” inclui qualquer progênie de uma célula mãe que não é idêntica à célula mãe em virtude das mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá muito do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte.

[00142] A célula hospedeira pode ser qualquer célula usada na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procarioto ou um eucarioto.

[00143] A célula hospedeira procariota pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. As bactérias Gram-positivas incluem, mas não se limitam a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. As bactérias Gram-negativas incluem, mas não se limitam a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[00144] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitam a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[00145] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitam a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[00146] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces incluindo, mas não se limitam a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[00147] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação de célula competente (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser realizada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser realizada por transformação de protoplasto, eletroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser realizada por eletroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser realizada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). Entretanto, qualquer método conhecido na técnica para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.

[00148] A célula hospedeira também pode ser um eucarioto, tal como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

[00149] A célula hospedeira pode ser uma célula de fungo. “Fungos” da maneira aqui usada inclui os filos Ascomicota, Basidiomicota, Chitridiomicota e Zigomicota, bem como o Oomicota e todos os fungos mitospóricos (da maneira definida por Hawksworth et al., em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK).

[00150] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. “Levedura”, da maneira aqui usada, inclui leveduras ascosporogêneas (Endomycetales), leveduras basidiosporogêneas e leveduras que pertencem aos fungos imperfeitos (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de levedura pode mudar no futuro, com propósitos desta invenção, as leveduras podem ser definidas da maneira descrita em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium número de série 9, 1980).

[00151] A levedura como célula hospedeira pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, tal como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[00152] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de fungo filamentoso. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (da maneira definida por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são caracterizados em geral por uma parede de micélio composta de quitina, celulose, glicana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo de leveduras, tal como Saccharomyces cerevisiae, é por brotamento de talo unicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

[00153] As células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[00154] Por exemplo, as células hospedeiras de fungo filamentoso podem ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[00155] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida por se. Os procedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Os métodos adequados para transformar as espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147- 156, e WO 96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.

Métodos de Produção

[00156] A presente invenção também se refere aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é uma célula de Talaromyces. Em um aspecto mais preferido, a célula é uma célula de Talaromyces leycettanus. Em um aspecto acima de tudo preferido, a célula é Talaromyces leycettanus cepa CBS398.68.

[00157] A presente invenção também se refere aos métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreende (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00158] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeo usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, em um meio e condições adequados que permitem que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando os procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados são disponíveis de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, ele pode ser recuperado de lisados celulares.

[00159] O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas não se limitam a, o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto de enzima, ou o desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo.

[00160] O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitam a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por aspersão, evaporação ou precipitação.

[00161] O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitam a, cromatografia (por exemplo, de troca iônica, de afinidade, hidrofóbica, focagem isoelétrica e por exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.

[00162] Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas certamente uma célula hospedeira da presente invenção que expressa o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.

Plantas

[00163] A presente invenção também se refere a plantas isoladas, por exemplo, uma planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, que compreende um polinucleotídeo da presente invenção de maneira a expressar e produzir um polipeptídeo ou domínio em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo ou domínio pode ser recuperado da planta ou parte da planta. Alternativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo ou domínio pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar o valor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[00164] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (um dicotiledônea) ou monocotiledônea (um monocotiledônea). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como grama do prado (grama azul, Poa), gramíneas forrageiras tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho (grão de milho).

[00165] Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, tais como tremoços, batata, beterraba, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve flor, canola e o organismo modelo muito relacionado Arabidopsis thaliana.

[00166] Exemplos de partes das plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutas, sementes e tubérculos, bem como os tecidos individuais que compreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos celulares de planta específicos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos, peroxissomos e citoplasma também são considerados como uma parte da planta. Além do mais, qualquer célula de planta, seja qual for a origem do tecido, é considerada como uma parte da planta. Da mesma maneira, partes da planta tais como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

[00167] São também incluídas no escopo da presente invenção são a progênie de tais plantas, partes da planta e células da planta.

[00168] A planta transgênica ou célula de planta que expressa o polipeptídeo ou domínio pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na tecnologia. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída incorporando um ou mais construtos de expressão que codificam o polipeptídeo ou domínio no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto, e que propagam a planta modificada resultante ou célula de planta em uma planta transgênica ou célula de planta.

[00169] O construto de expressão é convenientemente um construto de ácido nucleico, que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou domínio operavelmente ligado a sequências regulatórias adequadas exigidas para a expressão do polinucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além do mais, o construto de expressão pode compreender um marcador selecionável usado para identificar células de planta, nas quais o construto de expressão foi integrado e as sequências de DNA necessárias para a introdução do construto na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado).

[00170] A escolha das sequências regulatórias, tais como sequências promotoras e finalizadoras e, opcionalmente, sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em onde, quando e como se deseja expressar o polipeptídeo ou domínio. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo ou domínio pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser para o desenvolvimento, específica de estágio ou tecido, e o produto do gene pode ser alvejado em um tecido específico ou parte da planta tal como sementes ou folhas. As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[00171] Para a expressão constitutiva, o 35S-CaMV, a ubiquitina 1 do milho ou o promotor de actina 1 de arroz podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos de órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de armazenamento metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo oleoso de semente Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor de proteína de armazenamento napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico de semente conhecido na técnica, por exemplo, da maneira descrita em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1.000), o promotor do gene adenina metiltransferase do vírus clorela (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos, tais como temperatura, aridez, ou alterações na salinidade, ou induzido por substâncias aplicadas exogenamente que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênio, hormônios vegetais, tais como etileno, ácido abscísico e ácido giberélico e metais pesados.

[00172] Um elemento melhorador de promotor também pode ser usado para atingir maior expressão de um polipeptídeo ou domínio na planta. Por exemplo, o elemento melhorador do promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou domínio. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, revelam o uso do primeiro intron do gene actina 1 de arroz para melhorar a expressão.

[00173] O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes do construto de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

[00174] O construto de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula, transformação biolística e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[00175] A transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é um método para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e para transformar monocotiledôneas, embora outros métodos de transformação possam ser usados por estas plantas. Um método para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeamento de partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneas baseia-se na transformação de protoplasto, da maneira descrita por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Os métodos de transformação adicionais incluem aqueles descritos nas patentes U.S. 6.395.966 e 7.151.204 (ambas as quais são aqui incorporadas pela referência na sua íntegra).

[00176] Após a transformação, os transformantes com o construto de expressão incorporados são selecionados e regenerados nas plantas completas de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em geral, o procedimento da transformação é designado para a eliminação seletiva de genes de seleção tanto durante a regeneração quanto após as gerações usando, por exemplo, cotransformação com dois construtos de DNA-T separados ou excisão sítio específica do gene de seleção por uma recombinase específica.

[00177] Além de direcionar a transformação de um genótipo particular de planta com um construto da presente invenção, as plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma planta com o construto em uma segunda planta que precisa do construto. Por exemplo, um construto que codifica um polipeptídeo ou domínio pode ser introduzido em uma variedade particular de planta por cruzamento, sem a necessidade de transformar diretamente uma planta daquela dada variedade. Portanto, a presente invenção inclui não apenas uma planta regenerada diretamente das células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progênie de tais plantas. Da maneira aqui usada, progênie pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta mãe preparada de acordo com a presente invenção. Tal progênie pode incluir um construto de DNA preparado de acordo com a presente invenção. Os cruzamentos resultam na introdução de um transgene em uma linhagem de planta polinizando de maneira cruzada uma linhagem inicial com uma linhagem de planta doadora. Os exemplos não limitantes de tais etapas são descritos na patente U.S. 7.151.204.

[00178] As plantas podem ser geradas por meio de um processo de conversão de retrocruzamento. Por exemplo, as plantas incluem plantas referidas como um genótipo, linhagem, inato, híbrido convertido por retrocruzamento.

[00179] Os marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um antecedente genético em outro. A seleção auxiliada por marcador oferece vantagens com relação à reprodução convencional, na qual ele pode ser usado para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, os marcadores genéticos podem fornecer dados com relação ao grau relativo de germoplasma elite na progênie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com uma característica desejada, que de outra forma apresenta um antecedente genético agronomicamente não desejável, é cruzada com uma mãe elite, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que possui não apenas a característica de interesse, mas também apresentam uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Desta maneira, o número de gerações exigidas para introgressar uma ou mais características em um antecedente genético particular é minimizado.

[00180] A presente invenção também se refere aos métodos de produzir um polipeptídeo ou domínio da presente invenção que compreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta, que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou domínio, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo ou domínio; e (b) recuperar o polipeptídeo ou domínio.

[00181] São fornecidos a seguir exemplos de usos preferidos das composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições nas quais a composição é usada podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica.

[00182] A presente invenção é também se refere aos seguintes processos para usar os polipeptídeos com atividade de celobioidrolase, ou composições destes.

[00183] A presente invenção também se refere aos processos para degradar um material celulósico compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto, os processos compreendem adicionalmente recuperar o material celulósico degradado ou convertido. Os produtos solúveis de degradação ou conversão do material celulósico podem ser separados do material celulósico insolúvel usando um método conhecido na técnica como tal, por exemplo, centrifugação, filtração ou ambiente de gravidade.

[00184] A presente invenção também se refere aos processos de produzir um produto de fermentação compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[00185] A presente invenção também se refere aos processos de fermentar um material celulósico compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase da presente invenção. Em um aspecto, a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação. Em outro aspecto, os processos compreendem adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[00186] Os processos da presente invenção podem ser usados para sacarificar o material celulósico em açúcares fermentáveis, e para converter os açúcares fermentáveis em muitos produtos de fermentação utilizáveis, por exemplo, combustível, etanol potável e/ou produtos químicos de plataforma (por exemplo, ácidos, alcoóis, cetonas, gases e similares). A produção de um produto de fermentação desejado a partir do material celulósico envolve tipicamente o pré-tratamento, a hidrólise enzimática (sacarificação) e fermentação.

[00187] O processamento do material celulósico de acordo com a presente invenção pode ser realizado usando métodos convencionais na técnica. Além do mais, os processos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para funcionar de acordo com a invenção.

[00188] A hidrólise (sacarificação) e fermentação, separada ou simultânea incluem, mas não se limitam a, hidrólise separada e fermentação (SHF); sacarificação e fermentação simultâneas (SSF); sacarificação e cofermentação simultâneas (SSCF); hidrólise híbrida e fermentação (HHF); hidrólise separada e cofermentação (SHCF); hidrólise híbrida e cofermentação (HHCF) e conversão microbiana direta (DMC), algumas vezes também denominado bioprocessamento consolidado (CBP). SHF usa as etapas de processo separadas para primeiro hidrolisar enzimaticamente o material celulósico em açúcares fermentáveis, por exemplo, os monômeros glicose, celobiose e pentose, e a seguir fermentar os açúcares fermentáveis em etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática do material celulósico e a fermentação de açúcares em etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, em Handbook on Bioetanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a cofermentação de açúcares múltiplos (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and teh environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817827). HHF envolve uma etapa separada de hidrólise e, além disso, uma etapa de sacarificação e hidrólise simultâneas que pode ser realizada no mesmo reator. As etapas em um processo de HHF podem ser realizadas em diferentes temperaturas, isto é, sacarificação enzimática em temperatura elevada, seguido por SSF em uma temperatura mais baixa que a cepa da fermentação pode tolerar. DMC combina todos os três processos (produção de enzima, hidrólise e fermentação) em uma ou mais (por exemplo, várias) etapas, onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para conversão do material celulósico nos açúcares fermentáveis, e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., e Pretorius, I. S., 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). Entende-se aqui que qualquer método conhecido na técnica que compreende o pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação destes, pode ser usado para realizar os processos da presente invenção.

[00189] Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado em lote alimentado, um reator em lote agitado, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, e/ou um reator de coluna de fluxo em pistão contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin e Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the cellobiose hydrolysis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose: 1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K., e Lee, J. M, 1983, Bioconversion of waste cellulose by using a attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, O. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Os tipos de reatores adicionais incluem: reatores do tipo leito fluidizado, de manta com fluxo ascendente, imobilizado e extrusor para hidrólise e/ou fermentação.

[00190] Pré-tratamento. Na prática dos processos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na técnica pode ser usado para romper os componentes das paredes celulares das plantas de material celulósico e/ou contendo xilano (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis enzimática of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignomaterial celulósicos for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment od lignocellulosic biomass, Bioresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. de Mol. Sci. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: The key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts nd Biorefining-Biofpr. 2: 26-40).

[00191] O material celulósico também pode ser submetido a redução de tamanho de partícula, peneiração, pré-embebimento, umidificação, lavagem e/ou condicionamento antes do pré-tratamento usando os métodos conhecidos na técnica.

[00192] Os pré-tratamentos convencionais incluem, mas não se limitam a, pré-tratamento com vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com água quente, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão com fibra de amônia, pré-tratamento com organosolve e pré-tratamento biológico. Os pré-tratamentos adicionais incluem pré-tratamentos com percolação com amônia, ultrassom, eletroporação, micro-ondas, CO2 supercrítico, H2O supercrítica, ozônio, líquido iônico e irradiação gama.

[00193] O material celulósico pode ser pré-tratado antes da hidrólise e/ou fermentação. O pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. Alternativamente, o pré-tratamento pode ser realizado simultaneamente com hidrólise enzimática para liberar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose e/ou celobiose. Em muitos casos a etapa de pré- tratamento resulta ela mesma em alguma conversão de biomassa em açúcares fermentáveis (mesmo na ausência de enzimas).

[00194] Pré-tratamento com vapor. No pré-tratamento com vapor, o material celulósico é aquecido para romper os componentes das paredes celulares das plantas, incluindo lignina, hemicelulose e celulose, para tornar a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis às enzimas. O material celulósico passa por um vaso de reação onde o vapor é injetado para aumentar a temperatura para a temperatura e a pressão exigidas e é mantido ali pelo tempo de reação desejado. O pré-tratamento com vapor é preferivelmente realizado a 140-250°C, por exemplo, 160-200°C ou 170-190°C, onde a faixa de temperatura ideal depende da adição de um catalisador químico. O tempo de permanência para o pré-tratamento com vapor é preferivelmente 1-60 minutos, por exemplo, 1-30 minutos, 1-20 minutos, 3-12 minutos ou 4-10 minutos, onde o tempo de permanência ideal depende da faixa de temperatura e da adição de um catalisador químico. O pré-tratamento com vapor permite carregamentos sólidos relativamente altos, de maneira tal que o material celulósico é úmido em geral apenas durante o pré-tratamento. O pré-tratamento com vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão de vapor, isto é, queima rápida em pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 618-628; pedido de patente U.S. 2002/0164730). Durante o pré-tratamento com vapor, os grupos de acetil hemicelulose são clivados e o ácido resultante auto-catalisa a hidrólise parcial da hemicelulose em monossacarídeos e oligossacarídeos. A lignina é removida em apenas uma extensão limitada.

[00195] Pré-tratamento químico: O termo “tratamento químico” refere- se a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Um tratamento como este pode converter a celulose cristalina em celulose amorfa. Os exemplos de processo de pré-tratamento químico adequados incluem, por exemplo, pré-tratamento com ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX), percolação com amônia (APR) líquido iônico e pré-tratamentos com organosolve.

[00196] Um catalisador tal como H2SO4 ou SO2 (tipicamente 0,3 a 5 % p/p) é frequentemente adicionado antes é ao pré-tratamento com vapor que diminui o tempo e a temperatura, aumenta a recuperação e melhora a hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523; Sassner et al., 2006, Enzyme Microb. Technol. 39: 756-762). No pré- tratamento com ácido diluído, o material celulósico é misturado com o ácido diluído, tipicamente H2SO4, e água para formar uma lama, aquecido por vapor na temperatura desejada, e após um tempo de permanência é queimado em pressão atmosférica. O pré-tratamento com ácido diluído pode ser realizado com inúmeros projetos de reator, por exemplo, reatores de fluxo em pistão, reatores contra corrente, ou reatores de leito agitado em contra corrente contínua (Duff e Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).

[00197] Vários métodos de pré-tratamento em condições alcalinas também podem ser usados. Estes pré-tratamentos alcalinos incluem, mas não se limitam a, hidróxido de sódio, cal, oxidação úmida, percolação com amônia (APR), e explosão de fibra com amônia/congelamento (AFEX).

[00198] O pré-tratamento com cal é realizado com óxido de cálcio ou hidróxido de cálcio em temperaturas de 85-150°C e tempos de permanência de 1 hora a vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959- 1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673-686). WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900, e WO 2006/110901 revelam os métodos de pré-tratamento usando amônia.

[00199] A oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente a 180-200°C por 5-15 minutos com a adição de um agente oxidante, tal como peróxido de hidrogênio ou super pressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 1669-1677). O pré-tratamento é realizado preferivelmente em 1-40 % de material seco, por exemplo, 2-30 % de material seco ou 5-20 % de material seco, e frequentemente o pH inicial aumenta pela adição de álcali, tal como carbonato de sódio.

[00200] Uma modificação do método de pré-tratamento com oxidação úmida, conhecido como explosão úmida (combinação de explosão de oxidação úmida e vapor), pode manusear material seco até 30 %. Na explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante o pré-tratamento após certo tempo de permanência. O pré-tratamento é então finalizado queimando em pressão atmosférica (WO 2006/032282).

[00201] A explosão de fibra com amônia (AFEX) envolve tratar o material celulósico com amônia líquida ou gasosa em temperaturas moderadas, tal como 90-150°C, e alta pressão tal como 17-20 bar por 5-10 minutos, onde o conteúdo do material seco pode ser tão alto quanto 60 % (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 1133-1141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Durante o pré-tratamento com AFEX, a celulose e hemicelulose permanecem relativamente intactas. Os complexos de lignina- carboidrato são clivados.

[00202] O pré-tratamento com organosolve delignifica o material celulósico por extração usando etanol aquoso (40-60 % etanol) a 160-200°C por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). O ácido sulfúrico é em geral adicionado como um catalisador. Em pré-tratamento com organosolve, a maioria da hemicelulose e lignina é removida.

[00203] Outros exemplos de métodos adequados de pré-tratamento são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. e Biotechnol. 105-108: 6985, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686, e pedido publicado U.S. 2002/0164730.

[00204] Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferivelmente realizado como um tratamento com ácido diluído, e mais preferivelmente como um tratamento com ácido diluído contínuo. O ácido é tipicamente ácido sulfúrico, mas outros ácidos também podem ser usados, tais como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio ou misturas destes. O tratamento com ácido fraco é conduzido na faixa de pH de preferivelmente 1-5, por exemplo, 1-4 ou 1-2,5. Em um aspecto, concentração de ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 10 % em peso de ácido, por exemplo, 0,05 a 5 % em peso de ácido ou 0,1 a 2 % em peso de ácido. O ácido é colocado em contato com o material celulósico e mantido em uma temperatura na faixa de preferivelmente 140-200°C, por exemplo, 165-190°C, por períodos que variam de 1 a 60 minutos.

[00205] Em outro aspecto, o pré-tratamento ocorre em uma lama aquosa. Em aspectos preferidos, o material celulósico está presente durante o pré-tratamento em quantidades preferivelmente entre 10-80 % em peso, por exemplo, 20-70 % em peso ou 30-60 % em peso, tal como em torno de 40 % em peso. O material celulósico pré-tratado pode ser não lavado ou lavado usando qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, lavado com água.

[00206] Pré-tratamento mecânico ou pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento mecânico” ou “pré-tratamento físico” se refere a qualquer pré-tratamento que promove a redução de tamanho das partículas. Por exemplo, tal pré-tratamento pode envolver vários tipos de trituração ou moagem (por exemplo, moagem a seco, moagem úmida, ou moagem com bola vibratória).

[00207] O material celulósico pode ser pré-tratado tanto física (mecanicamente) quanto quimicamente. O pré-tratamento mecânico ou físico pode ser acoplado com explosão vaporosa/de vapor, hidrotermólise, tratamento com ácido diluído ou fraco, tratamento com temperatura elevada e alta pressão, irradiação (por exemplo, irradiação com micro-ondas) ou combinações destes. Em um aspecto, a pressão elevada significa pressão na faixa de preferivelmente cerca de 100 a cerca de 2757,9 KPa, por exemplo, cerca de 1034,2 a cerca de 1723,7 KPa. Em outro aspecto, a temperatura elevada significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300°C, por exemplo, cerca de 140 a cerca de 200°C. Em um aspecto preferido, o pré- tratamento mecânico ou físico é realizado em um processo em lotes usando um sistema hidrolisador de arma a vapor que usa alta pressão e alta temperatura da maneira definida anteriormente, por exemplo, um hidrolisador Sunds disponível pela Sunds Defibrator AB, Suécia. Os pré-tratamento físicos e químicos podem ser realizados sequencialmente ou simultaneamente, se desejado.

[00208] Dessa maneira, em um aspecto preferido, o material celulósico é submetido aos pré-tratamento físico (mecânico) ou químico, ou qualquer combinação destes, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

[00209] Pré-tratamento biológico: O termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina do material celulósico ou contendo xilano. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicar microrganismos e/ou enzimas que solubilizam lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996, Pretreatments of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, em Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignomaterial celulósicos: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

[00210] Sacarificação. Na etapa da hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico ou contendo xilano, por exemplo, pré- tratado, é hidrolisado para quebrar a celulose e/ou hemicelulose em açúcares fermentáveis, tais como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição de enzimas na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase da presente invenção. As enzimas das composições podem ser adicionadas simultaneamente ou sequencialmente.

[00211] A hidrólise enzimática é realizada preferivelmente em um ambiente aquoso adequado em condições que podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Em um aspecto, a hidrólise é realizada em condições adequadas para a atividade da(s) enzima(s), isto é, ideal para a(s) enzima(s). A hidrólise pode ser realizada como um processo em lote alimentado ou contínuo, onde o material celulósico é alimentado gradualmente, por exemplo, por uma enzima contendo a solução de hidrólise.

[00212] A sacarificação é realizada em geral em reatores ou fermentadores de tanque agitado em condições controladas de pH, temperatura e mistura. As condições adequadas de tempo de processo, temperatura e pH podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica. Por exemplo, a sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada por preferivelmente cerca de 12 a cerca de 120 horas, por exemplo, cerca de 16 a cerca de 72 horas ou cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura está na faixa de preferivelmente cerca de 25°C a cerca de 70°C, por exemplo, cerca de 30°C a cerca de 65°C, cerca de 40°C a cerca de 60°C, ou cerca de 50°C a cerca de 55°C. O pH é na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, por exemplo, cerca de 3,5 a cerca de 7, cerca de 4 a cerca de 6, ou cerca de 5,0 a cerca de 5,5. O teor de sólidos secos está na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, por exemplo, cerca de 10 a cerca de 40 % em peso ou cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.

[00213] A presente invenção também se refere às composições de enzima que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em um polipeptídeo como este. O termo “enriquecida” indica que a atividade de celobioidrolase da composição foi aumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

[00214] A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição de monocomponente. Alternativamente, a composição pode compreender atividades enzimáticas múltiplas, tal como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, uma hemicelulase, polipeptídeo GH61, uma expansina, uma esterase, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[00215] Em uma modalidade preferida, a composição de enzima compreende pelo menos a celobioidrolase da invenção, pelo menos uma endoglucanase, pelo menos uma beta-glicosidase e pelo menos um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica.

[00216] As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos na técnica, e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na fora de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[00217] As composições de enzima podem compreender qualquer proteína usada na degradação do material celulósico.

[00218] Em um aspecto, a composição enzimática compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina. Em outro aspecto, a celulase é preferivelmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase adicional e uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, a hemicelulase é preferivelmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma acetilmanana esterase, uma acetilxilano esterase, uma arabinanase, uma arabinofuranosidase, uma ácido coumárico esterase, uma feruloil esterase, uma galactosidase, uma glucuronidase, uma glicuronoil esterase, uma mananase, uma manosidase, uma xilanase e uma xilosidase.

[00219] Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzima celulolíticas. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende ou compreende adicionalmente uma ou mais (por exemplo, várias) enzima hemicelulolíticas. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzima celulolíticas e uma ou mais (por exemplo, várias) enzima hemicelulolíticas. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas do grupo de enzimas celulolíticas e enzimas hemicelulolíticas. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma beta-glicosidase e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e uma celobioidrolase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase e uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma beta- glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma celobioidrolase, uma beta-glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, e uma beta-glicosidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma endoglucanase, uma celobioidrolase, uma beta- glicosidase, e um polipeptídeo com melhor atividade celulolítica.

[00220] Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilmanana esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma acetilxilano esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinanase (por exemplo, alfa-L-arabinanase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma arabinofuranosidase (por exemplo, alfa-L-arabinofuranosidase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende um ácido coumárico esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma feruloil esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma galactosidase (por exemplo, alfa-galactosidase e/ou beta-galactosidase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glucuronidase (por exemplo, alfa-D-glucuronidase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma glicuronoil esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma mananase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma manosidase (por exemplo, beta-manosidase). Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilanase. Em um aspecto preferido, a xilanase é uma xilanase da família 10. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma xilosidase (por exemplo, beta- xilosidase).

[00221] Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma esterase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma expansina. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma laccase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma enzima lignolítica. Em um aspecto preferido, a enzima lignolítica é um manganês peroxidase. Em outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma lignina peroxidase. Em outro aspecto preferido, a enzima lignolítica é uma enzima produtora de H2O2. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma pectinase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma peroxidase. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma protease. Em outro aspecto, a composição enzimática compreende uma swolenina.

[00222] Nos processos da presente invenção, a(s) enzima(s) pode(m) ser adicionada(s) antes ou durante a fermentação, por exemplo, durante a sacarificação, ou durante ou após a propagação do(s) microrganismo(s) fermentador(s).

[00223] Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (por exemplo, vários) componentes podem ser proteínas naturais de uma célula, que são usadas como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (por exemplo, vários) outros componentes da composição enzimática. Um ou mais (por exemplo, vários) componentes da composição enzimática podem ser produzidos como monocomponentes, que são então combinados para formar a composição enzimática. A composição enzimática pode ser uma combinação de preparações de proteína multicomponente e monocomponente.

[00224] As enzimas usadas nos processos da presente invenção podem estar em qualquer forma adequada para uso tal como, por exemplo, um caldo bruto de fermentação com ou sem células removidas, um lisado celular com ou sem restos celulares, uma preparação de enzima semipurificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como uma fonte das enzimas. A composição de enzima pode ser um pó seco ou granulado, um granulado sem poeira, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma proteína protegida estabilizada. As preparações de enzima líquida, por exemplo, podem ser estabilizadas adicionando estabilizantes tais como um açúcar, um álcool de açúcar ou outro poliol, e/ou ácido lático ou outro ácido orgânico de acordo com os processos estabelecidos.

[00225] As quantidades ideais das enzimas e polipeptídeos com atividade de celobioidrolase dependem de vários fatores incluindo, mas não se limitam a, a mistura de componente de enzimas celulolíticas, o material celulósico, a concentração de material celulósico, o(s) pré-tratamento(s) do material celulósico, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismo fermentador (por exemplo, levedura para a sacarificação e fermentação simultânea).

[00226] Em um aspecto, uma quantidade eficiente de enzima celulolítica ou hemicelulolítica para o material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, por exemplo, cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, ou cerca de 2,5 a cerca de 10 mg por grama do material celulósico.

[00227] Em outro aspecto, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase para o material celulósico é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, ou cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por grama do material celulósico.

[00228] Em outro aspecto, uma quantidade eficiente de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase para a enzima celulolítica ou hemicelulolítica é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, cerca de 0,1 a cerca de 0,25 g, ou cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por grama de enzima celulolítica ou hemicelulolítica.

[00229] Os polipeptídeos com atividade da enzima celulolítica ou atividade da enzima hemicelulolítica, bem como outras proteínas/polipeptídeos usados na degradação do material celulósico, por exemplo, polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica (coletivamente daqui por diante “polipeptídeos com atividade enzimática”), podem ser derivados ou obtidos de qualquer origem adequada, incluindo de origem bacteriana, fúngica, levedura, planta ou mamífero. O termo “obtido” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro, empregando métodos aqui descritos, em que a enzima produzida recombinantemente é tanto natural quanto estrangeira ao organismo hospedeiro, ou apresenta uma sequência modificada de aminoácidos, por exemplo, com um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos que são eliminados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência natural de aminoácidos, ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucleico conhecidos na técnica. São incluídos no significado de uma enzima natural os variantes naturais, e no significado de uma enzima estrangeira são os variantes obtidos recombinantemente, tal como por mutagênese sítio-direcionada ou embaralhamento.

[00230] Os mutantes quimicamente modificados ou modificados por engenharia proteica também podem ser usados.

[00231] Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima pode ser um componente recombinante, isto é, produzido por clonagem de uma sequência de DNA que codifica o componente único e a subsequente célula transformada com a sequência de DNA e expressa em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (a enzima é estrangeira ao hospedeiro), mas o hospedeiro também pode, em certas condições, ser um hospedeiro homólogo (a enzima é natural do hospedeiro). As proteínas celulolíticas monocomponentes também podem ser preparadas purificando uma proteína como esta a partir de um caldo de fermentação.

[00232] Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas celulolíticas compreendem uma preparação de enzima celulolítica comercial. Os exemplos de preparações de enzima celulolítica comercial adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC™ CTec (Novozymes A/S), CELLIC™ CTec2 (Novozymes A/S), CELLUCLAST™ (Novozymes A/S), NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S), CELLUZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S), e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), FILTRASE® NL (DSM); METHAPLUS® S/L 100 (DSM), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são adicionadas em quantidades eficientes de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, por exemplo, cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos ou cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.

[00233] Os exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, uma endoglucanase de Acidothermus cellulolyticus (WO 91/05039; WO 93/15186; patente U.S. 5.275.944; WO 96/02551; patente U.S. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III de Thermobifida fusca (WO 05/093050) e endoglucanase V de Thermobifida fusca (WO 05/093050).

[00234] Exemplos de endoglucanases fúngicas que podem ser usadas na presente invenção incluem, mas não se limitam a, uma endoglucanase I de Trichoderma reesei (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253-263, endoglucanase I de Trichoderma reesei Cel7B (acesso ao GENBANK™ número M15665), endoglucanase II de Trichoderma reesei (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22), endoglucanase II de Trichoderma reesei Cel5A (acesso ao GENBANK™ número M19373), endoglucanase III de Trichoderma reesei (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563, acesso ao GENBANK™ número AB003694), endoglucanase V de Trichoderma reesei (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228, acesso ao GENBANK™ número Z33381), endoglucanase de Aspergillus aculeatus (Ooi et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 5884), endoglucanases de Aspergillus kawachii (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 27: 435-439), endoglucanase de Erwinia carotovara (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14), endoglucanase de Fusarium oxysporum (acesso ao GENBANK™ número L29381), endoglucanase de Humicola grisea var. thermoidea (acesso ao GENBANK™ número AB003107), endoglucanases de Melanocarpus albomyces (acesso ao GENBANK™ número MAL515703), endoglucanases de Neurospora crassa (acesso ao GENBANK™ número XM_324477), endoglucanase V de Humicola insolens, endoglucanases Myceliophthora thermophila CBS 117.65, endoglucanases de basidiomiceto CBS 495.95, endoglucanases de basidiomiceto CBS 494.95, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E, endoglucanases de Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F, endoglucanases de Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A e endoglucanase de Trichoderma reesei cepa número VTT-D-80133 (acesso ao GENBANK™ número M15665).

[00235] Os exemplos de outras celobrioidrolases usadas na presente invenção incluem, mas não se limitam a, celobioidrolase II de Aspergillus aculeatus (WO 2011/059740), celobioidrolase I de Chaetomium thermophilum, celobioidrolase II de Chaetomium thermophilum, celobioidrolase I de Humicola insolens, celobioidrolase II de Myceliophthora thermophila (WO 2009/042871), celobioidrolase II de Thielavia hyrcanie (WO 2010/141325), celobioidrolase II de Thielavia terrestris (CEL6A, WO 2006/074435), celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II de Trichoderma reesei e celobioidrolase II de Trichophaea saccata (WO 2010/057086).

[00236] Os exemplos de beta-glicosidases usados na presente invenção incluem, mas não se limitam a, beta-glicosidases de Aspergillus aculeatus (Kawaguchi et al., 1996, Gene 173: 287-288), Aspergillus fumigatus (WO 2005/047499), Aspergillus niger (Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980), Aspergillus oryzae (WO 2002/095014), Penicillium brasilianum IBT 20888 (WO 2007/019442 e WO 2010/088387), Thielavia terrestris (WO 2011/035029) e Trichophaea saccata (WO 2007/019442).

[00237] A beta-glicosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glicosidase é uma proteína de fusão variante BG da beta- glicosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637) ou uma proteína de fusão de beta-glicosidase de Aspergillus oryzae (WO 2008/057637).

[00238] Outras endoglucanases, celobioidrolases e beta-glicosidades usadas são reveladas em várias famílias de glicosil hidrolase, usando a classificação de acordo com Henrissat, 1991, A classification of glycosil hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309316, e Henrissat and Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosil hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

[00239] Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, patente U.S. 5.457.046, patente U.S. 5.648.263 e patente U.S. 5.686.593.

[00240] Nos processos da presente invenção, qualquer polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica pode ser usado.

[00241] Os exemplos de polipeptídeos GH61 com melhor atividade celulolítica usados nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, polipeptídeos GH61 de Thielavia terrestris (WO 2005/074647, WO 2008/148131, e WO 2011/035027), Thermoascus aurantiacus (WO 2005/074656 e WO 2010/065830), Trichoderma reesei (WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Aspergillus fumigatus (WO 2010/138754), polipeptídeos GH61 de Penicillium pinophilum (WO 2011/005867), Thermoascus sp. (WO 2011/039319), Penicillium sp. (WO 2011/041397) e Thermoascus crustaceous (WO 2011/041504).

[00242] Em um aspecto, o polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica é usado na presença de um cátion metálico divalente de ativação solúvel de acordo com WO 2008/151043, por exemplo, sulfato de manganês.

[00243] Em um aspecto, o polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica é usado na presença de um composto de dióxi, um composto bicíclico, um composto heterocíclico, um composto contendo nitrogênio, um composto de quinona, um composto contendo enxofre, ou um licor obtido de um material celulósico pré-tratado, tal como resíduo de milho pré-tratado (PCS).

[00244] O composto dióxi pode incluir qualquer composto adequado contendo dois ou mais átomos de oxigênio. Em alguns aspectos, os compostos dióxi contêm uma fração arila substituída, da maneira aqui descrita. Os compostos dióxi podem compreender uma ou mais (por exemplo, várias) hidroxilas e/ou derivados de hidroxila, mas também incluem frações arila substituída que não apresentam hidroxila e derivados de hidroxila. Os exemplos não limitantes dos compostos dióxi incluem pirocatecol ou catecol; ácido caféico; ácido 3,4-diidroxibenzóico; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2- benzenodiol; pirogalol; ácido gálico; metil-3,4,5-triidroxibenzoato; 2,3,4- triidroxibenzofenona; 2,6-dimetoxifenol; ácido sinapínico; ácido 3,5- diidroxibenzóico; 4-cloro-1,2-benzenodiol; 4-nitro-1,2-benzenodiol; ácido tânico; galato de etila; metil glicolato; ácido diidroxifumárico; 2-butino-1,4- diol; (ácido crocônico; 1,3-propanodiol; ácido tartárico; 2,4-pentanodiol; 3- etióxi-1,2-propanodiol; 2,4,4’-triidroxibenzofenona; cis-2-buteno-1,4-diol; 3,4-diidróxi-3-ciclobuteno-1,2-diona; diidroxiacetono; acroleína acetal; metil- 4-hidroxibenzoato; ácido 4-hidroxibenzóico e metil-3,5-dimetoxi-4- hidroxibenzoato, ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00245] O composto bicíclico pode incluir qualquer sistema de anel fundido substituído adequado, da maneira aqui descrita. Os compostos podem compreender um ou mais (por exemplo, vários) anéis adicionais, e não são limitados a um número específico de anéis, a menos que de outra forma declarada. Em um aspecto, o composto bicíclico é um flavonóide. Em outro aspecto, o composto bicíclico é um isoflavonóide opcionalmente substituído. Em outro aspecto, o composto bicíclico é um íon flavílio opcionalmente substituído, tal como uma antocianidina opcionalmente substituída ou antocianina opcionalmente substituída, ou derivados dos mesmos. Os exemplos não limitantes dos compostos bicíclicos incluem epicatequina; quercetina; miricetina; taxifolina; caempferol; morina; acacetina; naringenina; isoramnetina; apigenina; cianidina; cianina; curomanina; ceracianina ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00246] O composto heterocíclico pode ser qualquer composto adequado, tal como um anel aromático ou não aromático opcionalmente substituído compreendendo um heteroátomo, da maneira aqui descrita. Em um aspecto, o heterocíclico é um composto compreendendo uma fração heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou uma fração heteroarila opcionalmente substituída. Em outro aspecto, a fração de heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída, é uma heterocicloalquila de 5 elementos opcionalmente substituída ou uma fração de heteroarila de 5 elementos opcionalmente substituída. Em outro aspecto, a heterocicloalquila opcionalmente substituída ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma fração opcionalmente substituída selecionada de pirazolila, furanila, imidazolila, isoxazolila, oxadiazolila, oxazolila, pirrolila, piridila, pirimidila, piridazinila, tiazolila, triazolila, tienila, diidrotieno-pirazolila, tianaftenila, carbazolila, benzimidazolila, benzotienila, benzofuranila, indolila, quinolinila, benzotriazolila, benzotiazolila, benzooxazolila, benzimidazolila, isoquinolinila, isoindolila, acridinila, benzoisazolila, dimetilidantoína, pirazinila, tetraidrofuranila, pirrolinila, pirrolidinila, morpholinila, indolila, diazepinila, azepinila, tiepinila, piperidinila, e oxepinila. Em outro aspecto, a fração de heterocicloalquila opcionalmente substituída, ou fração heteroarila opcionalmente substituída é uma furanila opcionalmente substituída. Exemplos não limitantes dos compostos heterocíclicos incluem (1,2-diidroxietil)-3,4-diidroxifuran-2(5H)- ona; 4-hidróxi-5-metil-3-furanona; 5-hidróxi-2(5H)-furanona; [1,2- diidroxietil]furan-2,3,4(5H)-triona; a-hidróxi—Y—butirolactona; ribônico Y— lactona; ácido aldoexurônico Y—lactona; ácido glucônico δ—lactona; 4— hidroxicoumarina; diidrobenzofurano; 5—(hidroximetil)furfural; furoína; 2(5H)—furanona; 5,6—diidro—2H—piran—2—ona; e 5,6—diidro—4—hidróxi—6—metil— 2H—piran—2—ona; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00247] O composto contendo nitrogênio pode ser qualquer composto adequado com um ou mais átomos de nitrogênio. Em um aspecto, o composto contendo nitrogênio compreende uma amina, imina, hidroxilamina ou fração de nitróxido. Os exemplos não limitantes dos compostos contendo nitrogênio incluem acetona oxima; ácido violúrico; piridina-2-aldoxima; 2-aminofenol; 1,2-benzenodiamina; 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinilóxi; 5,6,7,8- tetraidrobiopterina; 6,7-dimetil-5,6,7,8-tetraidropterina e ácido maleâmico; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00248] O composto de quinona pode ser qualquer composto adequado que compreende uma fração de quinona da maneira aqui descrita. Exemplos não limitantes dos compostos de quinona incluem 1,4-benzoquinona; 1,4- naftoquinona; 2-hidróxi-1,4-naftoquinona; 2,3-dimetoxi-5-metil-1,4- benzoquinona ou coenzima Q0; 2,3,5,6-tetrametil-1,4-benzoquinona ou duroquinona; 1,4-diidroxiantraquinona; 3-hidróxi-1-metil-5,6-indolinediona ou adrenocromo; 4-terc-butil-5-metóxi-1,2-benzoquinona; pirroloquinolina quinona; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00249] O composto contendo enxofre pode ser qualquer composto adequado compreendendo um ou mais átomos de enxofre. Em um aspecto, o composto contendo enxofre compreende uma fração selecionada de tionila, tioéter, sulfinila, sulfonila, sulfamida, sulfonamida, ácido sulfônico, e éster sulfônico. Os exemplos não limitantes dos compostos contendo enxofre incluem etanotiol; 2-propanotiol; 2-propeno-1-tiol; 2-ácido mercaptoetanossulfônico; benzenotiol; benzeno-1,2-ditiol; cisteína; metionina; glutationa; cistina; ou um sal ou solvato dos mesmos.

[00250] Em um aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente para o material celulósico como uma razão molar em unidades de glucosila de celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10, por exemplo, cerca de 10-6 a cerca de 7,5, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2.5, cerca de 10-6 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 1, cerca de 10-5 a cerca de 10-1, cerca de 10-4 a cerca de 10-1, cerca de 10-3 a cerca de 10-1, ou cerca de 10-3 a cerca de 10-2. Em outro aspecto, uma quantidade eficiente de um composto como este descrito anteriormente é cerca de 0,1 μM a cerca de 1 M, por exemplo, cerca de 0,5 μM a cerca de 0,75 M, cerca de 0,75 μM a cerca de 0,5 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,25 M, cerca de 1 μM a cerca de 0,1 M, cerca de 5 μM a cerca de 50 mM, cerca de 10 μM a cerca de 25 mM, cerca de 50 μM a cerca de 25 mM, cerca de 10 μM a cerca de 10 mM, cerca de 5 μM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,1 mM a cerca de 1 mM.

[00251] O termo “licor” significa a fase da solução, tanto aquosa, orgânica, quanto uma combinação destas, que surge a partir do tratamento de um material com lignocelulose e/ou hemicelulose em uma lama, ou monossacarídeos destes, por exemplo, xilose, arabinose, manose, etc., em condições da maneira aqui descrita, e os conteúdos solúveis destes. Um licor para melhoria celulolítica de um polipeptídeo GH61 pode ser produzido tratando um material com lignocelulose ou hemicelulose (ou matéria prima), aplicando calor e/ou pressão, opcionalmente na presença de um catalisador, por exemplo, ácido, opcionalmente na presença de um solvente orgânico, e opcionalmente em combinação com interrupção física do material, e a seguir separando a solução dos sólidos residuais. Tais condições determinam o grau de melhoria celulolítica, obtido por meio da combinação de licor e um polipeptídeo GH61, durante a hidrólise de um substrato celulósico por uma preparação de celulase. O licor pode ser separado do material tratado usando um método padrão na técnica, tal como filtração, sedimentação ou centrifugação.

[00252] Em um aspecto, uma quantidade eficiente do licor para celulose é cerca de 10-6 a cerca de 10 g por g de celulose, por exemplo, cerca de 10-6 a cerca de 7,5 g, cerca de 10-6 a cerca de 5, cerca de 10-6 a cerca de 2.5 g, cerca de 10-6 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 1 g, cerca de 10-5 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-4 a cerca de 10-1 g, cerca de 10-3 a cerca de 10-1 g, ou cerca de 10-3 a cerca de 10-2 g por g de celulose.

[00253] Em um aspecto, a uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas hemicelulolíticas compreendem uma preparação de enzima hemicelulolítica comercial. Os exemplos de preparações comerciais de enzima hemicelulolítica adequadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec (Novozymes A/S), CELLIC™ HTec2 (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xilanase (Genencor), ACCELLERASE® XY (Genencor), ACCELLERASE® XC (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido), e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, Reino Unido).

[00254] Os exemplos de xilanases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, xilanases de Aspergillus aculeatus (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (WO 2011/041405), Penicillium sp. (WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/079210) e Trichophaea saccata GH10 (WO 2011/057083).

[00255] Os exemplos de beta-xilosidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, beta-xilosidases de Neurospora crassa (número de acesso ao SwissProt Q7SOW4), Trichoderma reesei (número de acesso ao UniProtKB/TrEMBL Q92458), e Talaromyces emersonii (número de acesso ao SwissProt Q8X212).

[00256] Os exemplos de acetilxilano esterases usados nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, acetilxilano esterases de Aspergillus aculeatus (WO 2010/108918), Chaetomium globosum (número de acesso Uniprot Q2GWX4), Chaetomium gracile (número de acesso GeneSeqP AAB82124), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (WO 2005/001036), Myceliophtera thermophila (WO 2010/014880), Neurospora crassa (número de acesso UniProt q7s259), Phaeosphaeria nodorum (número de acesso Uniprot Q0UHJ1) e Thielavia terrestris NRRL 8126 (WO 2009/042846).

[00257] Os exemplos de feruloil esterases (ácido ferúlico esterases) usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, feruloil esterases de Humicola insolens DSM 1800 (WO 2009/076122), Neosartorya fischeri (número de acesso UniProt A1D9T4), Neurospora crassa (número de acesso UniProt Q9HGR3), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/127729) e Thielavia terrestris (WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[00258] Os exemplos de arabinofuranosidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, arabinofuranosidases de Aspergillus niger (número de acesso GeneSeqP AAR94170), Humicola insolens DSM 1800 (WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. giganteus (WO 2006/114094).

[00259] Os exemplos de alfa-glucuronidases usadas nos processos da presente invenção incluem, mas não se limitam a, alfa-glucuronidases de Aspergillus clavatus (número de acesso UniProt alcc12), Aspergillus fumigatus (número de acesso SwissProt Q4WW45), Aspergillus niger (número de acesso Uniprot Q96WX9), Aspergillus terreus (número de acesso SwissProt Q0CJP9), Humicola insolens (WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (WO 2009/068565), Talaromyces emersonii (número de acesso UniProt Q8X211) e Trichoderma reesei (número de acesso Uniprot Q99024).

[00260] Os polipeptídeos com atividade enzimática, usados nos processos da presente invenção, podem ser produzidos por fermentação das cepas microbianas citadas anteriormente em um meio nutriente contendo fontes adequadas de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios adequados são disponíveis a partir de fornecedores comerciais, ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras condições adequadas para crescimento e produção de enzima são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Bailey, J.E., e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986).

[00261] A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula que resulta na expressão ou isolamento de uma enzima ou proteína. Portanto, a fermentação pode ser entendida como aquela que compreende cultivo em frasco de agitação, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em lotes, em lote alimentado ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industrial, realizada em um meio adequado e em condições que permitem que a enzima seja expressa ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos anteriormente podem ser recuperadas a partir do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.

[00262] Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos do material celulósico hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (por exemplo, vários) microrganismos fermentadores capazes de fermentar os açúcares direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. “Fermentação” ou “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. Processos de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de consumo de álcool (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de panificação (por exemplo, produtos de panificação fermentados), indústria de couro e indústria do tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e do organismo fermentador, e podem ser facilmente determinadas pelos versados na técnica.

[00263] Na etapa de fermentação, os açúcares, liberados do material celulósico como um resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática e, são fermentados em um produto, por exemplo, etanol, por um organismo fermentador, tal como levedura. A hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, da maneira descrita aqui.

[00264] Qualquer material celulósico hidrolisado adequado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção. O material é em geral selecionado com base no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação, e no processo empregado, da maneira bem conhecida na técnica.

[00265] Entende-se aqui que o termo “meio de fermentação” refere-se a um meio antes do(s) microrganismo(s) fermentador(s) ser(m) adicionado(s), tal como um meio que resulta de um processo de sacarificação, bem como um meio usado em um processo de sacarificação e fermentação simultânea (SSF).

[00266] “Microrganismo fermentador” refere-se a qualquer microrganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequados para uso em um processo de fermentação desejado para produzir um produto de fermentação. O organismo fermentador pode ser organismos fermentadores de hexose e/ou pentose, ou uma combinação destes. Tanto os organismos fermentadores de hexose quanto de pentose são bem conhecidos na técnica. Os microrganismos fermentadores adequados são capazes de fermentar, isto é, converter açúcares, tais como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose e/ou oligossacarídeos, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado.

[00267] Exemplos de organismos fermentadores bacterianos e fúngicos que produzem etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl. Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.

[00268] Exemplos de microrganismos fermentadores que podem fermentar os açúcares hexose incluem organismos bacterianos e fúngicos, tal como levedura. As leveduras preferidas incluem cepas de Candida, Kluyveromyces e Saccharomyces, por exemplo, Candida sonorensis, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisiae.

[00269] Exemplos de organismos fermentadores que podem fermentar os açúcares pentose em seu estado natural incluem organismos bacterianos e fúngicos, tais como algumas leveduras. As leveduras fermentadoras de xilose preferidas incluem cepas de Candida, preferivelmente C. sheatae ou C. sonorensis; e cepas de Pichia, preferivelmente P. stipitis, tal como P. stipitis CBS 5773. As leveduras fermentadoras de pentose preferidas incluem cepas de Pachysolen, preferivelmente P. tannophilus. Organismos que não são capazes de fermentar açúcares pentose, tais como xilose e arabinose, podem ser geneticamente modificados para realizar isto por métodos conhecidos na técnica.

[00270] Exemplos de bactérias que podem fermentar eficientemente hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Bacillus coagulans, Clostridium acetobutilicum, Clostridium thermocellum, Clostridium phytofermentans, Geobacillus sp., Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas mobilis (Philippidis, 1996, supra).

[00271] Outros organismos fermentadores incluem cepas de Bacillus, tal como Bacillus coagulans; Candida, tais como C. sonorensis, C. methanosorbosa, C. diddensiae, C. parapsilosis, C. naedodendra, C. blankii, C. entomophilia, C. brassicae, C. pseudotropicalis, C. boidinii, C. utilis e C. scehatae; Clostridium, tais como C. acetobutilicum, C. thermocellum e C. phytofermentans; E. coli, especialmente cepas de E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento do etanol; Geobacillus sp.; Hansenula, tal como Hansenula anomala; Klebsiella, tal como K. oxytoca; Kluyveromyces, tal como K. marxianus, K. lactis, K. thermotolerans e K. fragilis; Schizosaccharomyces, tal como S. pombe; Thermoanaerobacter, tal como Thermoanaerobacter saccharolyticum e Zymomonas, tal como Zymomonas mobilis.

[00272] Em um aspecto preferido, a levedura é uma Bretannomyces. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii. Em outro aspecto preferido, a levedura é uma Candida. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida sonorensis. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida blankii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida entomophiliia. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida scehatae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em outro aspecto preferido, a levedura é uma Clavispora. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em outro aspecto preferido, a levedura é uma Kluyveromyces. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces thermotolerans. Em outro aspecto preferido, a levedura é uma Pachysolen. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em outro aspecto preferido, a levedura é uma Pichia. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é uma Pichia stipitis. Em um aspecto preferido, a levedura é uma Saccharomyces spp. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum.

[00273] Em um aspecto preferido, a bactéria é um Bacillus. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Bacillus coagulans. Em outro aspecto preferido, a bactéria é um Clostridium. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium acetobutilicum. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium phytofermentans. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Geobacilus sp. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é um Thermoanaerobacter. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Thermoanaerobacter saccharolyticum. Em outro aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis.

[00274] As leveduras comercialmente disponíveis e adequadas para a produção de etanol incluem, por exemplo, BIOFERM™ AFT e XR (NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, Estados Unidos), levedura ETANOL RED™ (Fermentis/Lesaffre, Estados Unidos), FALI™ (Fleischmann’s Yeast, Estados Unidos), FERMIOL™ (DSM Specialties), GERT STRAND™ (Gert Strand AB, Suécia), e levedura fresca SUPERSTART™ e THERMOSACC™ (Ethanol Technology, WI, Estados Unidos).

[00275] Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador foi geneticamente modificado para fornecer a capacidade de fermentar açúcares pentose, tais como microrganismos que utilizam xilose, que utilizam arabinose, e que coutilizam xilose e arabinose.

[00276] A clonagem de genes heterólogos em vários microrganismos fermentadores levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (cofermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter e Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walfridsson et al., 1995, Xylose- metabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and TAL1 genes encoding the pentose fosfato pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principle, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda et al., 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xilose isomerase).

[00277] Em um aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Candida sonorensis. Em outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Escherichia coli. Em outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Klebsiella oxytoca. Em outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto preferido, o microrganismo fermentador geneticamente modificado é Zymomonas mobilis.

[00278] É bem conhecido na técnica que os organismos descritos anteriormente também podem ser usados para produzir outras substâncias, da maneira aqui descrita.

[00279] O microrganismo fermentador é tipicamente adicionado ao material celulósico degradado ou hidrolisado, e a fermentação é realizada por cerca de 8 a cerca de 96 horas, por exemplo, cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura é tipicamente entre cerca de 26°C a cerca de 60°C, por exemplo, cerca de 32°C ou 50°C, e cerca de pH 3 a cerca de pH 8, por exemplo, pH 4-5, 6, ou 7.

[00280] Em um aspecto, a levedura e/ou outro microrganismo são aplicados ao material celulósico degradado, e a fermentação é realizada por cerca de 12 a cerca de 96 horas, tal como tipicamente 24-60 horas. Em outro aspecto, a temperatura é preferivelmente entre cerca de 20°C a cerca de 60°C, por exemplo, cerca de 25°C a cerca de 50°C, cerca de 32°C a cerca de 50°C, ou cerca de 32°C a cerca de 50°C, e o pH é em geral cerca de pH 3 a cerca de pH 7, por exemplo, cerca de pH 4 a cerca de pH 7. Entretanto, alguns organismos fermentadores, por exemplo, bactérias, apresentam temperatura de fermentação ideal mais elevada. A levedura ou outro microrganismo é preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 105 a 1012, de maneira preferível em aproximadamente 107 a 1010, de maneira essencial aproximadamente contagens de 2 x 108 células viáveis por mL de caldo de fermentação. Diretriz adicional com relação ao uso de levedura para a fermentação pode ser encontrada em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, Reino Unido 1999), que é aqui incorporado pela referência.

[00281] Em relação à produção de etanol, após a fermentação, a lama fermentada é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com os processos da invenção pode ser usado, por exemplo, como etanol combustível, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis, ou etanol industrial.

[00282] Um estimulador de fermentação pode ser usado em combinação com qualquer dos processos aqui descritos para melhorar adicionalmente o processo de fermentação e, em particular, o desempenho do microrganismo fermentador, tal como, melhoria da taxa e rendimento de etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se aos estimuladores para crescimento dos microrganismos fermentadores, em particular, leveduras. Os estimuladores de fermentação preferíveis para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotínico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido para- aminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e vitaminas A, B, C, D, e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é aqui incorporado pela referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais minerais que podem suprir nutrientes que compreendem P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn e Cu.

[00283] Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada a partir da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, n- butanol, isobutanol, etanol, glicerol, metanol, etileno glicol, 1,3-propanodiol [propileno glicol], butanodiol, glicerina, sorbitol e xilitol); um alcano (por exemplo, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, undecano, e dodecano), um cicloalcano (por exemplo, ciclopentano, cicloexano, cicloeptano e ciclooctano), um alceno (por exemplo penteno, hexeno, hepteno e octeno); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina e treonina); um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2) e monóxido de carbono (CO)); isopreno; uma cetona (por exemplo, acetona); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido 2,5-diceto-D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3-hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido lático, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succínico e ácido xilônico) e policetídeo. O produto de fermentação também pode ser proteína como um produto de alto valor.

[00284] Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é um álcool. Será bem entendido que o termo “álcool” inclui uma substância que contém uma ou mais frações hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é n-butanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é isobutanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é butanodiol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é etileno glicol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerina. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, em Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Alemanha, 65: 207-241; Silveira e Jonas, 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam e Singh, 1995, Processs for fermentative production of xilitol - a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117124; Ezeji et al., 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 e in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603.

[00285] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alcano. O alcano pode ser um alcano não ramificado ou ramificado. Em outro aspecto mais preferido, o alcano é pentano. Em outro aspecto mais preferido, o alcano é hexano. Em outro aspecto mais preferido, o alcano é heptano. Em outro aspecto mais preferido, o alcano é octano. Em outro aspecto mais preferido, o alcano é nonano. Em outro aspecto mais preferido, o alcano é decano. Em outro aspecto mais preferido, o alcano é undecano. Em outro aspecto mais preferido, o alcano é dodecano.

[00286] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um cicloalcano. Em outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é ciclopentano. Em outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloexano. Em outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloeptano. Em outro aspecto mais preferido, o cicloalcano é cicloctano.

[00287] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um alceno. O alceno pode ser um alceno não ramificado ou ramificado. Em outro aspecto mais preferido, o alceno é penteno. Em outro aspecto mais preferido, o alceno é hexeno. Em outro aspecto mais preferido, o alceno é hepteno. Em outro aspecto mais preferido, o alceno é octeno.

[00288] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspártico. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutâmico. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard e Margaritis, 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production e other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515.

[00289] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um gás. Em outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em outro aspecto mais preferido, o gás é H2. Em outro aspecto mais preferido, o gás é CO2. Em outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka et al., 1997, Studies on hidrogen production by continuous culture system of hidrogen- producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. em Biomass e Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.

[00290] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é isopreno.

[00291] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona. Será bem entendido que o termo “cetona” inclui uma substância que contém uma ou mais frações de cetona. Em outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.

[00292] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adípico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido cítrico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5-diceto-D-glucônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucárico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3-hidroxipropiônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itacônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido lático. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido málico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido succínico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico. Ver, por exemplo, Chen e Lee, 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435- 448.

[00293] Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é policetídeo.

[00294] Recuperação. O(s) produto(s) de fermentação pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido na técnica incluindo, mas não se limitam a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Por exemplo, o álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. O etanol com uma pureza de até cerca de 96 vol. % pode ser obtido, o qual pode ser usado, por exemplo, como combustível etanol, etanol para bebidas, isto é, espíritos neutros potáveis ou etanol industrial.

Peptídeo sinal

[00295] A presente invenção também se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal, compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO: 2. O polinucleotídeo pode compreender adicionalmente um gene que codifica uma proteína, que é operavelmente ligado ao peptídeo sinal. A proteína é preferivelmente estrangeira ao peptídeo sinal. Em um aspecto, o polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal apresenta os nucleotídeos 1 a 54 de SEQ ID NO: 1.

[00296] A presente invenção também se refere aos construtos de ácido nucleico, vetores de expressão e células hospedeiras recombinantes que compreendem tais polinucleotídeos.

[00297] A presente invenção também se refere aos métodos de produzir uma proteína que compreendem: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende tal polinucleotídeo; e (b) recuperar a proteína.

[00298] A proteína pode ser natural ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não significa aqui que se refere a um tamanho específico do produto codificado e, portanto, inclui peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos. O termo “proteína” também inclui dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos e polipeptídeos fundidos.

[00299] Preferivelmente, a proteína é um hormônio, enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste, ou repórter. Por exemplo, a proteína pode ser uma hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorredutase, ou transferase, por exemplo, uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, invertase, laccase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, xilanase ou beta-xilosidase.

[00300] O gene pode ser obtido de qualquer procarioto, eucarioto ou outra fonte.

Lista das modalidades preferidas

[00301] Modalidade 1. Um polipeptídeo isolado que apresenta atividade de celobioidrolase, selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo que apresenta pelo menos 81 %, por exemplo, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade média, ou condições de severidade médio-alta, ou condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; ou a sequência de DNAc deste; (d) um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, que compreende uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b), (c), ou (d) que apresenta atividade de celobioidrolase.

[00302] Modalidade 2. O polipeptídeo da modalidade 1, que apresenta pelo menos 81 %, pelo menos 82 %, pelo menos 83 %, pelo menos 84 %, pelo menos 85 %, pelo menos 87 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00303] Modalidade 3. O polipeptídeo da modalidade 1 ou 2, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza em condições de severidade média, ou condições de severidade médio-alta, ou condições de severidade alta, ou condições de severidade muito alta em (i) a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) a sequência de DNAc deste, ou (iii) o complemento de tamanho total de (i) ou (ii).

[00304] Modalidade 4. O polipeptídeo de qualquer das modalidades 13, que é codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 % ou 100 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de DNAc deste.

[00305] Modalidade 5. O polipeptídeo de qualquer das modalidades 14, que compreende ou que consiste em SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.

[00306] Modalidade 6. O polipeptídeo da modalidade 5, em que o polipeptídeo maduro apresenta os aminoácidos 19 a 464 de SEQ ID NO: 2.

[00307] Modalidade 7. O polipeptídeo de qualquer das modalidades 14, que é um variante do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 que compreende uma substituição, eliminação, e/ou inserção em uma ou mais posições.

[00308] Modalidade 8. O polipeptídeo da modalidade 1, que é um fragmento de SEQ ID NO: 2, em que o fragmento apresenta atividade de celobioidrolase.

[00309] Modalidade 9. Um polipeptídeo isolado que compreende um domínio catalítico selecionado do grupo que consiste em: (a) um domínio catalítico que apresenta pelo menos 81 % de identidade de sequência com o domínio catalítico de SEQ ID NO: 2; (b) um domínio catalítico codificado por um polinucleotídeo que apresenta pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência que codifica o domínio catalítico de SEQ ID NO: 1; (c) um variante de um domínio catalítico que compreende uma substituição, eliminação, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do domínio catalítico de SEQ ID NO: 2; e (d) um fragmento de um domínio catalítico de (a), (b), ou (c), que apresenta atividade de celobioidrolase.

[00310] Modalidade 10. O polipeptídeo da modalidade 9, que compreende ou que consiste no domínio catalítico de SEQ ID NO: 2.

[00311] Modalidade 11. O polipeptídeo da modalidade 10, em que o domínio catalítico apresenta os aminoácidos 105 a 464 de SEQ ID NO: 2.

[00312] Modalidade 12. O polipeptídeo de qualquer das modalidades 9-11, que compreende adicionalmente um domínio de ligação de celulose.

[00313] Modalidade 13. O polipeptídeo de qualquer das modalidades 1-12, que é codificado pelo polinucleotídeo contido na cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68.

[00314] Modalidade 14. Uma composição de enzima que compreende o polipeptídeo de qualquer das modalidades 1-13.

[00315] Modalidade 15. Um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de qualquer das modalidades 1-13.

[00316] Modalidade 16. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo da modalidade 15 operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle, que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

[00317] Modalidade 17. Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo da modalidade 15 operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle, que direcionam a produção do polipeptídeo.

[00318] Modalidade 18. Um método para produzir o polipeptídeo de qualquer das modalidades 1-13 compreendendo: (a) cultivar uma célula, que em sua forma tipo selvagem produz o polipeptídeo, em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00319] Modalidade 19. Um método para produzir um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira da modalidade 17 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00320] Modalidade 20. Uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de qualquer das modalidades 1-13.

[00321] Modalidade 21. Um método para produzir um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase compreendendo: (a) cultivar a planta transgênica ou célula de planta da modalidade 20 em condições que conduzem para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

[00322] Modalidade 22. Um polinucleotídeo isolado que codifica um peptídeo sinal que compreende ou que consiste nos aminoácidos 1 a 18 de SEQ ID NO: 2.

[00323] Modalidade 23. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligado ao polinucleotídeo da modalidade 22, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

[00324] Modalidade 24. Uma célula hospedeira recombinante que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligado ao polinucleotídeo da modalidade 22, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

[00325] Modalidade 25. Um método para produzir uma proteína compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligado ao polinucleotídeo da modalidade 22, em que o gene é estrangeiro ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal, em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.

[00326] Modalidade 26. Um processo para degradar um material celulósico compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase de qualquer das modalidades 1-13.

[00327] Modalidade 27. O processo da modalidade 26, em que o material celulósico é pré-tratado.

[00328] Modalidade 28. O processo da modalidade 26 ou 27, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[00329] Modalidade 29. O processo da modalidade 28, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[00330] Modalidade 30. O processo da modalidade 28, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, um acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[00331] Modalidade 31. O processo de qualquer das modalidades 2630, que compreende adicionalmente recuperar o material celulósico degradado.

[00332] Modalidade 32. O processo da modalidade 31, em que o material celulósico degradado é um açúcar.

[00333] Modalidade 33. O processo da modalidade 32, em que o açúcar é selecionado do grupo que consiste em glicose, xilose, manose, galactose e arabinose.

[00334] Modalidade 34. Um processo para sintetizar um produto de fermentação compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase de qualquer das modalidades 1-13; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microrganismos fermentadores para sintetizar o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[00335] Modalidade 35. O processo da modalidade 34, em que o material celulósico é pré-tratado.

[00336] Modalidade 36. O processo da modalidade 34 ou 35, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[00337] Modalidade 37. O processo da modalidade 36, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[00338] Modalidade 38. O processo da modalidade 36, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, um acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[00339] Modalidade 39. O processo de qualquer das modalidades 3438, em que as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultânea.

[00340] Modalidade 40. O processo de qualquer das modalidades 3439, em que o produto de fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alceno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico ou policetídeo.

[00341] Modalidade 41. Um processo de fermentar um material celulósico compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais microrganismos fermentadores, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase de qualquer das modalidades 1-13.

[00342] Modalidade 42. O processo da modalidade 41, em que a fermentação do material celulósico sintetiza um produto de fermentação.

[00343] Modalidade 43. O processo da modalidade 42, que compreende adicionalmente recuperar o produto de fermentação a partir da fermentação.

[00344] Modalidade 44. O processo de qualquer das modalidades 4143, em que o material celulósico é pré-tratado antes da sacarificação.

[00345] Modalidade 45. O processo de qualquer das modalidades 4144, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma celulase, um polipeptídeo GH61 com melhor atividade celulolítica, uma hemicelulase, uma esterase, uma expansina, uma laccase, uma enzima ligninolítica, uma pectinase, uma peroxidase, uma protease e uma swolenina.

[00346] Modalidade 46. O processo da modalidade 45, em que a celulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma endoglucanase, uma celobioidrolase e uma beta-glicosidase.

[00347] Modalidade 47. O processo da modalidade 45, em que a hemicelulase é uma ou mais enzimas selecionadas do grupo que consiste em uma xilanase, um acetilxilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase e uma glucuronidase.

[00348] Modalidade 48. O processo de qualquer das modalidades 4147, em que o produto de fermentação é um álcool, um alcano, um cicloalcano, um alceno, um aminoácido, um gás, isopreno, uma cetona, um ácido orgânico, ou policetídeo.

[00349] A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui revelados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Pretende-se que qualquer dos aspectos equivalentes estejam no escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas aqui mostradas e descritas se tornarão evidentes pelos versados na técnica a partir da descrição precedente. Também se pretende que tais modificações estejam no escopo das reivindicações em anexo. No caso de conflito, a presente revelação, incluindo as definições, prevalecerá.

Exemplos Materiais

[00350] Os produtos químicos usados como tampões e substratos foram os produtos comerciais de pelo menos grau reagente.

Cepas

[00351] A cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68 foi usada como a fonte de um polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase. A cepa Aspergillus oryzae MT3568 foi usada para a expressão do gene de Talaromyces leycettanus que codifica o polipeptídeo que apresenta atividade de celobioidrolase. A. oryzae MT3568 é um derivado com gene amdS (acetamidase) interrompido de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694), em que a auxotrofia de pyrG foi recuperada interrompendo o gene acetamidase (amdS) de A. oryzae.

Meios e soluções

[00352] O meio YP+2 % de glicose era composto de 1 % de extrato de levedura, 2 % de peptona e 2 % de glicose.

[00353] As placas de ágar PDA eram compostas de infusão de batata (a infusão de batata foi realizada fervendo 300 g de batatas picadas, lavadas, mas não descascadas) em água por 30 minutos, e a seguir decantando ou espremendo o caldo por meio de morim. A água destilada foi então adicionada até o volume total da suspensão atingir um litro, seguido por 20 g de dextrose e 20 g de ágar em pó. O meio foi esterilizado autoclavando em 103,4 KPa por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998).

[00354] As placas de LB eram compostas de 10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de Bacto-ágar, e água deionizada para 1 litro. O meio foi esterilizado autoclavando em 103,4 KPa por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998).

[00355] As placas de sacarose COVE eram compostas de 342 g de sacarose (Sigma S-9378), 20 g de ágar em pó, 20 mL de solução de sal Cove (26 g de MgSO4.7H2O, 26 g de KCL, 26 g de KH2PO4, 50 mL de solução de metal traço Cove) e água deionizada para 1 litro. O meio foi esterilizado autoclavando em 103,4 KPa por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998). O meio foi resfriado a 60°C e adicionou-se acetamida 10 mM, CsCl 15 mM, Triton X-100 (50 μL/500 mL)).

[00356] A solução de metal traço Cove era composta de 0,04 g de Na2B4O7.10H2O, 0,4 g de CuSO4.5H2O, 1,2 g de FeSO4.7H2O, 0,7 g de MnSO4.H2O, 0,8 g de Na2MoO4.2H2O, 10 g de ZnSO4.7H2O, e água deionizada para 1 litro.

[00357] O meio Dap-4C era composto de 20 g de dextrose, 10 g de maltose, 11 g de MgSO4.7H2O, 1 g de KH2PO4, 2 g de ácido cítrico, 5,2 g K3PO4.H2O, 0,5 g de extrato de levedura (Difco), 1 mL de Dowfax 63N10 (Dow Chemical Company), 0,5 mL de solução de metais traço KU6, 2,5 g de CaCO3, e água deionizada para 1 litro. O meio foi esterilizado autoclavando em 103,4 KPa por 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8a Edição, Revisão A, 1998). Antes de usar, foi adicionado ao meio Dap-4C 3,5 mL de (NH4)2HPO4 50 % estéril e 5 mL de ácido lático 20 % estéril por 150 mL meio.

[00358] A solução de metais traço KU6 era composta de 0,13 g de NiCl2, 2,5 g de CuSO4.5H2O, 13,9 g de FeSO4.7H2O, 8,45 g de MnSO4.H2O, 6,8 g de ZnCl2, 3g de ácido cítrico, e água deionizada para 1 litro.

Exemplo 1: Fonte de informação de sequência de DNA para a cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68

[00359] A informação de sequência genômica foi gerada pelo sequenciamento de DNA em Illumina no Beijing Genome Institute (BGI), em Beijing, China, a partir do DNA genômico isolado da cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68. Uma montagem preliminar do genoma foi analisada usando o Pedant-ProTM Sequence Analysis Suite (Biomax Informatics AG, Martinsried, Alemanha). Os modelos de gene construídos pelo software foram usados como um ponto inicial para detectar homólogos de GH6 no genoma. Os modelos de gene mais precisos foram construídos manualmente usando as sequências de proteína de GH6 múltiplas e conhecidas como uma orientação.

Exemplo 2: Extração do DNA genômico da cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68

[00360] Para obter o DNA genômico para amplificação por PCR, a cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68 foi propagada em placas de ágar PDA crescendo a 26°C por 7 dias. Os esporos coletados das placas de PDA foram usados para inocular 25 mL de meio YP+ glicose 2 % em um frasco de agitação com saliências no fundo, e incubados a 30°C por 72 horas com agitação em 85 rpm.

[00361] O DNA genômico foi isolado de acordo com um protocolo modificado do estojo DNeasy Plant Maxi (Qiagen Danmark, Copenhagen, Dinamarca). O material fúngico da cultura anterior foi coletado por centrifugação em 14.000 x g por 2 minutos. O sobrenadante foi removido e 0,5 g do precipitado foi congelado em nitrogênio líquido com areia de quartzo e triturado em um pó fino em um almofariz pré-refrigerado. O pó foi transferido para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicionou-se 5 mL de tampão AP1 (pré-aquecido a 65°C) e 10 μL de solução estoque de RNase A (100 mg/mL), seguido por vortexação vigorosa. Após incubação por 10 minutos a 65°C com inversão regular do tubo, 1,8 mL de tampão AP2 foi adicionado ao lisado misturando suavemente, seguido pela incubação no gelo por 10 minutos. O lisado foi então centrifugado a 3.000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente, e o sobrenadante foi decantado em uma coluna QIAshredder maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 mL. Isto foi seguido por centrifugação a 3.000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. O fluxo obtido foi transferido para um novo tubo de 50 mL e adicionou-se 1,5 volumes de tampão AP3/E, seguido por vortexação. 15 mL da amostra foram transferidos para uma coluna DNeasy Maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 mL, e centrifugados em 3.000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. O fluxo obtido foi descartado e 12 mL de tampão AW foram adicionados à coluna DNeasy Maxi spin colocada em um tubo de coleta de 50 mL, e centrifugados em 3.000 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. Após descartar o fluxo obtido, a centrifugação foi repetida para eliminar o restante do álcool. A coluna DNeasy Maxi spin foi transferida para um novo tubo de 50 mL e 0,5 mL de tampão AE (pré-aquecido a 70°C) foi adicionado. Após a incubação por 5 minutos em temperatura ambiente, a amostra foi eluída por centrifugação em 3.000 x g por 5 minutos em temperatura ambiente. A eluição foi repetida com um mais 0,5 mL de tampão AE e os eluídos foram combinados. A concentração do DNA coletado foi avaliada por um espectrofotômetro de UV a 260 nm.

Exemplo 3: Construção de um vetor de expressão de Aspergillus oryzae contendo a sequência genômica da cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68 que codifica um polipeptídeo da família GH6, que apresenta atividade de celobioidrolase

[00362] Dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos mostrados a seguir foram determinados para amplificar por PCR o gene da cepa Talaromyces leycettanus CBS398.68 P23YSW, a partir do DNA genômico preparado no exemplo 2. Um estojo de clonagem IN-FUSION™ (BD Biosciences, Palo Alto, CA, USA) foi adicionado para clonar o fragmento diretamente no vetor de expressão pDau109 (WO 2005/042735). F-P23YSW 5’-ACACAACTGGGGATCCACCATGCGGTCTCTCCTGG CT -3’ (SEQ ID NO: 3) R-P23YSW 5 ’-CCCTCTAGATCTCGAGCAGAATGAGGCAGAGTTAC GAGA -3’ (SEQ ID NO: 4)

[00363] As letras em negrito representam a sequência do gene. A sequência sublinhada é homóloga aos sítios de inserção de pDau109.

[00364] Um aparelho MJ Research PTC-200 DNA foi usado para realizar a reação de PCR. Um estojo Phusion® High-Fidelity PCR (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia) foi usado para a amplificação por PCR. A reação de PCR era composta de 5 μL de tampão HF 5X (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 0,5 μL de dNTPs (10 mM), 0,5 μL de DNA polimerase Phusion® (0,2 unidades/μL) (Finnzymes Oy, Espoo, Finlândia), 1 μL de oligonucleotídeo iniciador F-P23YSW (5 μM), 1 μL de oligonucleotídeo iniciador R-P23YSW (5 μM), 0,5 μL de DNA genômico de Talaromyces leycettanus (100 ng/μL), e 16,5 μL de água deionizada em um volume total de 25 μL. As condições de PCR foram 1 ciclo a 95°C por 2 minutos. 35 ciclos cada um a 98°C por 10 segundos, 60°C por 30 segundos, e 72°C por 2 minutos; e 1 ciclo a 72°C por 10 minutos. A amostra foi então mantida a 12°C até ser removida da máquina de PCR.

[00365] Os produtos de reação foram isolados por eletroforese em gel de agarose a 1,0 % usando tampão Tris base 40 mM, acetato de sódio 20 mM, EDTA dissódico 1 mM (TAE), onde uma banda do produto de 1.977 bp foi excisada do gel e purificada usando um estojo Illustra GFX® PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences, Brondby, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante. O fragmento foi então clonado em Bam HI e Xho I digeridos com pDau109, usando um estojo de clonagem IN-FUSION™ que resulta no plasmídeo pP23YSW. A clonagem do gene P23YSW em Bam HI-Xho I digerido com pDau109 resultou na transcrição do gene P23YSW de Talaromyces leycettanus no controle de um promotor duplo NA2-tpi. NA2-tpi é um promotor modificado a partir do gene que codifica a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, em que a parte principal não traduzida foi substituída por uma parte principal não traduzida do gene que codifica a triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[00366] O protocolo de clonagem foi realizado de acordo com as instruções do estojo de clonagem IN-FUSION™, que gerou um construto P23YSW GH6. O plasmídeo tratado e o inserto foram transformados em células de E. coli quimicamente competentes One Shot® TOP10F' (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) de acordo com o protocolo do fabricante, e colocados em placas de LB suplementadas com 0,1 mg de ampicilina por mL. Após incubação a 37°C por toda a noite, observou-se que as colônias cresciam em seleção nas placas de LB com ampicilina. Quatro colônias transformadas com o construto P23YSW GH6 foram cultivadas em meio LB suplementado com 0,1 mg de ampicilina por mL, e o plasmídeo foi isolado com um estojo QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) de acordo com o protocolo do fabricante.

[00367] Os plasmídeos isolados foram sequenciados com os oligonucleotídeos iniciadores do vetor e os oligonucleotídeos iniciadores específicos do gene P23YSW, a fim de determinar um clone do plasmídeo de expressão representativo que fosse livre de erros de PCR.

Exemplo 4: Caracterização da sequência genômica de Talaromyces leycettanus CBS398.68 que codifica um polipeptídeo P23YSW GH6, que apresenta atividade de celobioidrolase

[00368] O sequenciamento de DNA do clone genômico de Talaromyces leycettanus CBS398.68 P23YSW GH6 foi realizado com um sequenciador de DNA automatizado Applied Biosystems Modelo 3700, usando a versão 3.1 BIG-DYE™ terminator chemistry (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) e a estratégia do oligonucleotídeo iniciador que caminha. Os dados de sequência de nucleotídeos foram analisados com relação à qualidade e todas as sequências foram comparadas umas com as outras com auxílio do software PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, Estados Unidos). A sequência obtida foi idêntica à sequência de BGI.

[00369] A sequência de nucleotídeos e a sequência deduzida de aminoácidos do gene P23YSY de Talaromyces leycettanus são mostradas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente. A sequência codificante apresenta 1.898 bp, incluindo oito introns e o códon de parada. A proteína prevista codificada apresenta 464 aminoácidos. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo sinal de 18 resíduos foi previsto. A proteína madura prevista contém 446 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 47 kDa e um pH isoelétrico de 4,41.

[00370] Um alinhamento global aos pares comparativos de sequências de aminoácido foi determinado usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), com penalidade de abertura de intervalo de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que a sequência deduzida de aminoácidos do gene Talaromyces leycettanus que codifica o polipeptídeo P23YSW GH6, que apresenta atividade de celobioidrolase, compartilha 8,4 % de identidade (excluindo intervalos) com a sequência deduzida de aminoácidos de uma proteína prevista da família GH6 de Aspergillus fumigatus (número de acesso GENESEQP:ABB80166), com atividade de celobioidrolase.

Exemplo 5: Expressão da celobioidrolase GH6 P23YSW de Talaromyces leycettanus

[00371] O plasmídeo de expressão pP23YSW foi transformado em Aspergillus oryzae MT3568. Aspergillus oryzae MT3568 é um derivado de AMDS (acetamidase) interrompido de JaL355 (WO 2002/40694), em que a auxotrofia de pyrG foi recuperada no processo de neutralizar o gene de acetamidase (AMDS) de A. oryzae. Os protoplastos de MT3568 são preparados de acordo com o método da patente Europeia, EP0238023, páginas 14-15, que é aqui incorporado pela referência.

[00372] Os transformantes foram purificados em placas de seleção de sacarose de COVE, por meio de conídios simples, antes dos mesmos esporularem em placas de PDA. A produção do polipeptídeo GH6 de Talaromyces leycettanus pelos transformantes foi analisada a partir dos sobrenadantes da cultura dos cultivos em fase estacionária, em placas de 96 poços profundos de 1 mL, a 30°C em meio YP+ glicose 2 %. A expressão foi verificada em um gel E-Page SDS-PAGE a 8 % de 48 poços (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) por coloração com Coomassie. Um transformante foi selecionado para funcionar mais e foi determinado Aspergillus oryzae 78.2.

[00373] Para a produção em larga escala, os esporos de Aspergillus oryzae 78.2 foram dispersos em uma placa de PDA e incubados por cinco dias a 37°C. A placa com esporo confluente foi lavada duas vezes com 5 mL de TWEEN® 20 0,01 % para maximizar o número de esporos coletados. A suspensão de esporos foi então usada para inocular vinte e cinco frascos de 500 mL contendo 100 mL de meio Dap-4C. A cultura foi incubada a 30°C com agitação constante em 100 rpm. No quarto dia após a inoculação, o caldo da cultura foi coletado por filtração através de um filtro PES de 0,2 μm na parte superior do frasco MF75 Supor MachV (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca). O caldo de cultura fresco deste transformante produziu uma banda de proteína GH6 de aproximadamente 70 kDa. A identidade desta banda como o polipeptídeo GH5 de Talaromyces leycettanus foi verificada por sequenciamento de peptídeo.

Exemplo 6: Método alternativo para produzir a celobioidrolase GH6 P23YSW de Talaromyces leycettanus

[00374] Com base na sequência de nucleotídeos identificada como SEQ ID NO: 1, um gene sintético pode ser obtido a partir de inúmeras fontes comerciais, tal como Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str. 11, 93053, Regensburg, Alemanha) ou DNA 2.0 (DNA2.0, 1430 O'Brien Drive, Suite E, Menlo Park, CA 94025, USA). O gene sintético pode ser determinado para incorporar mais sequências de DNA, tal como sítios de restrição ou regiões de recombinação homóloga, para facilitar a clonagem em um vetor de expressão.

[00375] Usando os dois oligonucleotídeos iniciadores sintéticos F- P23YSW e F-P23YSW descritos anteriormente, uma reação de PCR simples pode ser usada para amplificar o quadro aberto de leitura de tamanho completo a partir do gene sintético. O gene pode ser então clonado em um vetor de expressão, por exemplo, da maneira descrita anteriormente, e expresso em uma célula hospedeira, por exemplo, em Aspergillus oryzae da maneira descrita anteriormente.

Exemplo 7: Purificação da celobioidrolase GH6 P23YSW de Talaromyces leycettanus

[00376] 1.000 mL de caldo da cepa de expressão Aspergillus oryzae 78.2 foram ajustados em pH 7,0 e filtrados em filtro PES de 0,22 μm (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Dinamarca). A seguir, o filtrado foi adicionado a sulfato de amônio 1,8 M. O filtrado foi carregado em uma coluna de fluxo rápido Phenyl Sepharose™ 6 (sub alto) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) (com um volume de coluna de 60 mL) equilibrada com sulfato de amônio 1,8 M pH 7,0, HEPES 25 mM pH 7,0. Após aplicação, a coluna foi lavada com 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio, seguido por coluna de 7 volumes de coluna de sulfato de amônio 1 M (a proteína mantendo ligação com a coluna). A seguir, a proteína foi eluída com 5 volumes de coluna de HEPES 25 mM pH 7,0, em uma vazão de 15 mL/min. As frações de 10 mL foram coletadas e analisadas por SDS-page. As frações foram agrupadas e aplicadas em uma coluna Sephadex™ G-25 (médio) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada em HEPES 25 mM pH 7,0. As frações foram aplicadas em uma coluna SOURCE™ 15Q (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada em HEPES 25 mM pH 7,0 (volumes de coluna de 60 mL). Após a aplicação, a coluna foi lavada com 3 volumes de coluna com tampão de equilíbrio, e as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente linear em 20 volumes de coluna de cloreto de sódio 0-500 mM. As frações de 10 mL foram coletadas e analisadas por SDS-page, e as frações com a proteína foram agrupadas. A concentração de proteína foi determinada por absorbância A280/A260.

Exemplo 8: Ensaio de hidrólise de resíduo de milho pré-tratado

[00377] O resíduo de milho foi pré-tratado no U.S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando 1,4 % em peso de ácido sulfúrico a 165°C e 737,7 KPa por 8 minutos. Os sólidos insolúveis em água no resíduo de milho pré-tratado (PCS) continham 56,5 % de celulose, 4,6 % de hemicelulose e 28,4 % de lignina. A celulose e hemicelulose foram determinadas por uma hidrólise de ácido sulfúrico em duas etapas, com análise subsequente de açúcares por cromatografia líquida de alto desempenho, usando o procedimento analítico padrão NREL #002. A lignina foi determinada gravimetricamente após hidrolisar as frações de celulose e hemicelulose com ácido sulfúrico usando o procedimento analítico padrão NREL #003.

[00378] O PCS não lavado e não moído (a lama complete de PCS) foi preparado ajustando o pH do PCS para 5,0 pela adição de NaOH 10 M com mistura extensiva, e a seguir autoclavando por 20 minutos a 120°C. O peso seco da lama completa de PCS foi 29 %. O PCS foi usado lavado ou não lavado com água. O PCS não lavado moído (peso seco 32,35 %) foi preparado moendo a lama completa de PCS em um moedor de multi- utilidades úmido Cosmos ICMG 40 (EssEmm Corporation, Tamil Nadu, Índia). O PCS lavado e moído (peso seco 32,35 %) foi preparado da mesma maneira, com subsequente lavagem com água deionizada e decantando a fração de sobrenadante repetidamente.

[00379] A hidrólise de PCS foi conduzida usando placas de poços fundos de 2,2 mL (Axygen, Union City, CA, Estados Unidos), em um volume de reação total de 1,0 mL. A hidrólise foi realizada com 50 mg de sólidos insolúveis de PCS por mL de tampão de acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo sulfato de manganês 1 mM e vários carregamentos proteicos de várias composições de enzima (expresso como mg de proteína por grama de celulose). As composições de enzima foram preparadas e a seguir foram adicionadas simultaneamente a todos os poços, em um volume que varia de 50 μL a 200 μL, para um volume final de 1 mL em cada reação. A placa foi então selada usando um selador quente de placas ALPS-300™ (Abgene, Epsom, Reino Unido), totalmente misturada e incubada em uma temperatura específica por 72 horas. Todos os experimentos relatados foram realizados em triplicata.

[00380] Após a hidrólise, as amostras foram filtradas usando uma placa de 96 poços com filtro de 0,45 μm MULTISCREEN® (Millipore, Bedford, MA, Estados Unidos), e os filtrados foram analisados com relação ao teor de açúcar da maneira descrita a seguir. Quando não usadas imediatamente, as alíquotas filtradas foram congeladas a -20°C. As concentrações de açúcar das amostras diluídas em H2SO4 0,005 M foram medidas usando uma coluna de 4,6 x 250 mm AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, Estados Unidos) por eluição com 0,05 % p/p de ácido benzóicoH2SO4 0,005 M a 65°C, em uma vazão de 0,6 mL por minuto, e a quantificação por integração dos sinais de glicose, celobiose e xilose a partir da detecção do índice refrativo (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos) foi calibrada por amostras puras de açúcar. Os equivalentes de glicose e celobiose resultantes foram usados para calcular o percentual da conversão de celulose para cada reação.

[00381] A glicose, celobiose e xilose foram medidas individualmente. As concentrações medidas de açúcar foram ajustadas com o fator de diluição apropriado. As concentrações líquidas dos açúcares, produzidos enzimaticamente a partir de PCS não lavado, foram determinadas ajustando as concentrações medidas de açúcar às concentrações de açúcar anteriores correspondentes em PCS não lavado no ponto de tempo zero. Todos os processamentos de dados de HPLC foram realizados usando o software MICROSOFT EXCEL™ (Microsoft, Richland, WA, Estados Unidos).

[00382] O grau de conversão de celulose para glicose foi calculado usando a seguinte equação: % de conversão = (concentração de glicose/concentração de glicose em uma digestão limite) x 100. A fim de calcular o % de conversão, um ponto de conversão de 100 % foi ajustado com base em um controle de celulase (100 mg de celulase de Trichoderma reesei por grama de celulose), e todos os valores foram divididos por este número e a seguir multiplicado por 100. Os pontos de dados em triplicata tiveram a média calculada e o desvio padrão foi calculado.

Exemplo 9: Preparação de uma composição de enzima

[00383] A celobioidrolase I GH7A de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6) foi preparada de maneira recombinante em Aspergillus oryzae da maneira descrita em WO 2011/057140. O caldo filtrado de celobioidrolase I GH7A de Aspergillus fumigatus foi concentrado e o tampão foi trocado usando um concentrador de fluxo tangencial (Pall Filtron, Northborough, MA, USA), equipado com uma membrana de polietersulfona de 10 kDa (Pall Filtron, Northborough, MA, USA) com Tris-HCl 20 mM pH 8,0. O caldo dessalinizado de celobioidrolase I GH7A de Aspergillus fumigatus foi purificado em uma coluna de cromatografia de troca iônica Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) ) em Tris-HCl 20 mM pH 8, com um gradiente linear de NaCl de 0 a 1 M. As frações foram coletadas e as frações contendo a celobioidrolase I celulase foram agrupadas com base em SDS-PAGE sem corante a 8-16 % CRITERION® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).

[00384] Preparação de polipeptídeo GH61A com melhor atividade celulolítica de Penicillium sp. (emersonii). O polipeptídeo GH61A de Penicillium sp. (emersonii) (SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8) foi preparado de maneira recombinante de acordo com WO 2011/041397. O polipeptídeo GH61A de Penicillium sp. (emersonii) foi purificado de acordo com WO 2011/041397.

[00385] Preparação de endoglucanase II GH5 de Trichoderma reesei. A endoglucanase II GH5 de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10) foi preparada de maneira recombinante de acordo com WO 2011/057140, usando Aspergillus oryzae como um hospedeiro. O caldo filtrado de endoglucanase II GH5 de Trichoderma reesei foi dessalinizado e o tampão foi trocado por Tris 20 mM pH 8.0, usando fluxo tangencial (membrana de 10K, Pall Filtron, Northborough, MA, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00386] Preparação de xilanase GH10 de Aspergillus fumigatus NN055679. A xilanase GH10 de Aspergillus fumigatus NN055679 (xyn3) (SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12) foi preparada de maneira recombinante de acordo com WO 2006/078256, usando Aspergillus oryzae BECh2 (WO 2000/39322) como um hospedeiro. O caldo filtrado de xilanase GH10 de Aspergillus fumigatus NN055679 (xyn3) foi dessalinizado e o tampão foi trocado por acetato de sódio 50 mM pH 5,0 usando uma coluna de dessalinização HIPREP® 26/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00387] Preparação de beta-glicosidase Cel3A de Aspergillus fumigatus NN055679. (SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 14) foi preparada de maneira recombinante de acordo com WO 2005/047499, usando Aspergillus oryzae como um hospedeiro. O caldo filtrado foi ajustado em pH 8,0 com acetato de sódio a 20 %, o que deixou a solução turva. Para remover a turbidez, a solução foi centrifugada (20.000 x g, 20 minutos), e o sobrenadante foi filtrado através de uma unidade de filtração de 0,2 μm (Nalgene, Rochester, NY, USA). O filtrado foi diluído com água deionizada para atingir a mesma condutividade que em Tris/HCl 50 mM, pH 8,0. A solução de enzima ajustada foi aplicada em uma coluna de fluxo rápido Q SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), equilibrada em Tris- HCl 50 mM, pH 8,0, e eluída com um gradiente linear de cloreto de sódio 0 a 500 mM. As frações foram agrupadas e tratadas com 1 % (p/v) de carvão vegetal ativado para remover a cor do agrupamento de beta-glicosidase. O carvão vegetal foi removido por filtração da suspensão por meio de uma unidade de filtração de 0,2 μm (Nalgene, Rochester, NY, USA). O filtrado foi ajustado em pH 5,0 com 20 % de ácido acético e diluído 10 vezes com água deionizada. O filtrado ajustado foi aplicado em uma coluna de fluxo rápido SP SEPHAROSE™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), equilibrada em ácido succínico 10 mM, pH 5,0, e eluída com um gradiente linear de cloreto de sódio 0 a 500 mM.

[00388] Preparação de beta-xilosidase GH3 de Aspergillus fumigatus NN051616. A beta-xilosidase GH3 de Aspergillus fumigatus NN051616 (SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16) foi preparada de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, da maneira descrita em WO 2011/057140. O caldo filtrado de beta-xilosidase GH3 de Aspergillus fumigatus NN051616 foi dessalinizado e o tampão foi trocado por acetato de sódio 50 mM pH 5,0 usando uma coluna de dessalinização HIPREP® 26/10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00389] A concentração de proteína para cada um dos monocomponentes descritos anteriormente foi determinada usando um estojo de ensaio de proteína em microplaca BCA™ (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA), em que a albumina bovina sérica foi usada como um padrão proteico. Uma composição de enzima era composta de cada monocomponente, preparada da maneira descrita anteriormente, da maneira a seguir: 37 % de celobioidrolase I Cel7A de Aspergillus fumigatus, 15 % de polipeptídeo GH61A com melhor atividade celulolítica de Penicillium emersonii, 10 % de endoglucanase II GH5 de Trichoderma reesei, 5 % de xilanase GH10 de Aspergillus fumigatus, 5 % de beta-glicosidase de Aspergillus fumigatus e 3 % de beta-xilosidase de Aspergillus fumigatus. A composição de enzima é aqui determinada como a “composição de enzima sem celobioidrolase II”.

Exemplo 10: Preparação de celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus

[00390] Preparação de celobioidrolase II de Aspergillus fumigatus NN055679. A celobioidrolase II GH6A de Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18) foi preparada de maneira recombinante em Aspergillus oryzae, da maneira descrita em WO 2011/057140. O caldo filtrado de celobioidrolase II GH6A de Aspergillus fumigatus teve seu tampão trocado em Tris 20 mM pH 8,0, usando uma coluna de 400 mL SEPHADEX™ G-25 (GE Healthcare, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. As frações foram agrupadas e ajustadas em sulfato de amônio 1,2 M-Tris 20 mM pH 8,0. A proteína equilibrada foi colocada em uma coluna de fluxo rápido PHENYL SEPHAROSE™ 6 (sub alto) (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), equilibrada em Tris 20 mM pH 8,0 com sulfato de amônio 1,2 M, e as proteínas ligadas foram eluídas com Tris 20 mM pH 8,0 sem nenhum sulfato de amônio. As frações foram agrupadas. A concentração de proteína foi determinada usando um estojo de ensaio de proteína em microplacas BCA™ com albumina sérica bovina como um padrão proteico.

Exemplo 11: Efeito da celobioidrolase da família GH6 de Talaromyces leycettanus (P23YSW) na hidrólise de PCS moído e não lavado a 50-65°C, por uma composição de enzima.

[00391] A celobioidrolase da família GH6 de Talaromyces leycettanus (P23YSW) foi avaliada em uma composição de enzima sem celobioidrolase II a 50°C, 55°C, 60°C, e 65°C, usando PCS moído e não lavado como um substrato. A composição de enzima sem celobioidrolase II (Exemplo 9) foi adicionada às reações de hidrólise de PCS em 2,25 mg de proteína total por g de celulose, e os resultados de hidrólise foram comparados com os resultados de uma composição de enzima em temperatura elevada similar com e sem celobioidrolase II GH6 adicionada (3,0 mg de proteína por g de celulose).

[00392] O ensaio foi realizado da maneira descrita no exemplo 8. As reações de 1 mL com PCS moído e não lavado (5 % de sólidos insolúveis) foram conduzidas por 72 horas em tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo sulfato de manganês 1 mM. Todas as reações foram realizadas em triplicata e envolveram mistura simples no começo da hidrólise.

[00393] Da maneira mostrada na tabela 1 a seguir, a composição de enzima que incluiu a celobioidrolase II da família GH6 de Talaromyces leycettanus (P23YSW) superou significativamente a composição de enzima sem a celobioidrolase II (2,25 mg de proteína/g de celulose e 3,0 mg de proteína/g de celulose) a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C (uma vez que o grau de conversão de celulose em glicose para a celobioidrolase II da família GH6 de Talaromyces leycettanus (P23YSW) foi maior que a composição de enzima sem celobioidrolase II a 50°C, 55°C 60°C e 65°C). Os resultados na tabela 1 a seguir mostram que a composição de enzima que incluiu a celobioidrolase II da família GH6 de Talaromyces leycettanus (P23YSW) superou a composição de enzima que incluiu a celobioidrolase II da família GH6 de Aspergillus fumigatus a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C (uma vez que o grau de conversão de celulose em glicose para a celobioidrolase II da família GH6 de Talaromyces leycettanus (P23YSW) foi maior que a composição de enzima contendo a celobioidrolase II da família GH6 de Aspergillus fumigatus a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C). Tabela 1.

Exemplo 12: Avaliação de duas celobioidrolases II em PCS moído e lavado a 50-65°C

[00394] Duas celobioidrolases II foram avaliadas em 1 mg de proteína por g de celulose a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C, usando PCS moído e lavado como um substrato, com 1 mg de proteína por g de celulose de beta- glicosidase da família GH3 de Aspergillus fumigatus. As celobioidrolases II a seguir foram testadas: celobioidrolase GH6 de Talaromyces leycettanus (P23YSW) e celobioidrolase II GH6A de Aspergillus fumigatus.

[00395] O ensaio foi realizado da maneira descrita no exemplo 8. As reações de 1 mL com PCS moído e lavado (5 % de sólidos insolúveis) foram conduzidas por 72 horas em tampão de acetato de sódio 50 mM pH 5,0, contendo sulfato de manganês 1 mM. Todas as reações foram realizadas em triplicata e envolveram mistura simples no começo da hidrólise.

[00396] Os resultados mostrados na tabela 2 a seguir demonstraram que, a 50°C, 55°C, 60°C e 65°C, a celobioidrolase GH6 de Talaromyces leycettanus (P23YSW) apresentou uma conversão de celulose para glicose significativamente maior que a da celobioidrolase II GH6 de Aspergillus fumigatus. Tabela 2.

[00397] A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no escopo pelos aspectos específicos aqui revelados, uma vez que estes aspectos são pretendidos como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer dos aspectos equivalentes são pretendidos para estar no escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção, além daquelas aqui mostradas e descritas se tornarão evidentes aos versados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também são pretendidas para estar no escopo das reivindicações em anexo. No caso de conflito, a presente revelação, incluindo as definições, prevalecerá.

Claims (8)

1. Célula hospedeira microbiana recombinante, caracterizada pelo fato de compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase, em que o polinucleotídeo consiste de SEQ ID NO: 1 ou a sequência dos nucleotídeos 55 a 1895 de SEQ ID NO: 1, e em que o polinucleotídeo está operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle heterólogas que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

2. Célula hospedeira microbiana recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo com atividade de celobioidrolase consiste de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 19 a 464 da SEQ ID NO: 2.

3. Processo para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivar a célula hospedeira microbiana recombinante como definida na reivindicação 1 ou 2 em condições adequadas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

4. Célula hospedeira microbiana recombinante, caracterizada pelo fato de compreender um construto de ácido nucleico ou um vetor de expressão, que compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada à sequência de polinucleotídeo dos nucleotídeos 1 a 54 de SEQ ID NO: 1; em que o gene é heterólogo ao polinucleotídeo que codifica o peptídeo sinal.

5. Processo para produzir uma proteína, caracterizado pelo fato de compreender: (a) cultivar a célula hospedeira microbiana recombinante como definida na reivindicação 4 em condições que conduzem para a produção da proteína; e (b) recuperação da proteína.

6. Processo para degradar um material celulósico, caracterizado pelo fato de compreender tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase que consiste de SEQ ID NO: 2 ou os aminoácidos 19 a 464 da SEQ ID NO: 2.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que ainda compreende recuperar o material celulósico degradado.

8. Construto de ácido nucleico ou um vetor de expressão, caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo com atividade de celobioidrolase, em que o polinucleotídeo consiste de SEQ ID NO: 1, ou a sequência dos nucleotídeos 55 a 1895 de SEQ ID NO: 1, operavelmente ligado a uma ou mais sequências controle heterólogas que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.