CN103797116A

CN103797116A - 突变型内切葡聚糖酶

Info

Publication number: CN103797116A
Application number: CN201280042920.9A
Authority: CN
Inventors: 栗原宏征; 冢田刚士; 山田胜成; 三岛由美子; 前野友香; 石川一彦
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2011-09-05
Filing date: 2012-09-04
Publication date: 2014-05-14
Also published as: EP2754712B1; EP2754712A1; JPWO2013035678A1; AU2012305442A1; US20140178947A1; EP2754712A4; JP5971811B2; US9193963B2; IN2014CN02455A; CA2847623A1; WO2013035678A1

Abstract

提供由来源于木质素的芳香族化合物造成的活性抑制降低了的内切葡聚糖酶。野生型的来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨基酸序列中的位置273的色氨酸被替换为除了芳香族氨基酸以外的氨基酸的内切葡聚糖酶。

Description

突变型内切葡聚糖酶

技术领域

本发明涉及新的突变型内切葡聚糖酶。

背景技术

近年来，受到化石资源枯竭、地球温暖化这样的问题影响，强烈要求从可再生且碳平衡的资源纤维素制造乙醇、化成品原料。

纤维素在草本系植物、木本系植物中大量含有，将这些植物总称为纤维素系生物质。纤维素系生物质的细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素构成。纤维素是由葡萄糖分子β-1,4键合而成的直链状多糖，半纤维素是木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖等多糖，木质素是具有复杂的结构的芳香族系高分子化合物，在细胞壁中与纤维素、半纤维素互相缠绕而形成三维网眼结构。

为了从纤维素系生物质制造乙醇、化成品原料，需要分解至微生物能发酵的单糖的被称为“糖化”的工序。代表性的糖化法，可列举酸处理法、酶处理法，但由于酸处理法产生大量的废液、环境负荷高，因而，现在利用纤维素酶在温和条件下进行反应的酶处理法成为开发的主流。

纤维素酶是纤维素水解酶的总称，由于底物特异性不同而被分类为纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶3种。认为通过它们协同作用而纤维素的水解进行。

在使用纤维素酶将纤维素系生物质进行糖化时，由于底物抑制、生成物抑制、非特异性吸附等各种原因而活性被抑制。此外，已知由于来源于木质素的芳香族化合物而内切葡聚糖酶等纤维素酶的活性被抑制(非专利文献1～3)。然而其抑制机理尚不明。

由嗜热菌或超嗜热菌产生的酶由于稳定性高、即使在高温条件也能长时间保持活性，因而被研究了作为产业用酶的应用。到目前为止关于由纤维素分解性嗜热菌或超嗜热菌产生的纤维素酶也进行了研究，明确了它们所具有的纤维素酶基因大多数编码内切葡聚糖酶。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Vohra,R.M等、Biotechnol.Bioeng.,22,1497-1500(1980)

非专利文献2：Paul,S.S等、Lett.Appl.Microbiol.,36,377-381(2003)

非专利文献3：Ximenes,E等、Enzym Microb Tech.,46,170-176(2010)

发明内容

发明要解决的课题

到目前为止，已知使用纤维素酶将纤维素系生物质进行糖化时，由于来源于木质素的芳香族化合物而内切葡聚糖酶等纤维素酶的活性被抑制。本发明提供由来源于木质素的芳香族化合物造成的活性抑制大幅降低了的突变型内切葡聚糖酶。另外，本发明提供在将含有纤维素、特别是木质素的纤维素系生物质进行水解来制造糖液的方法中使用分解效率高的酶组合物的制造方法。

用于解决课题的方法

本发明者们为了实现上述的目的，在来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的特定位置导入氨基酸突变，成功地获得了具有其功能改良了的性质的突变型内切葡聚糖酶。详细来说，发明者们着眼于作为野生型的亲内切葡聚糖酶的三维结构，通过蛋白质晶体结构分析，来特定参与亲内切葡聚糖酶与来源于木质素的芳香族化合物的复合体结构形成的氨基酸，通过对该氨基酸选择性地施加突变，从而成功地获得了由来源于木质素的芳香族化合物造成的活性抑制大幅降低了的内切葡聚糖酶。

即，本发明包含以下构成。

突变型内切葡聚糖酶，包含：在来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸残基被替换成从芳香族氨基酸以外选出的氨基酸的氨基酸序列。

根据[1]的突变型内切葡聚糖酶，来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨基酸序列包含以下(a)、(b)或(c)的任一氨基酸序列：

(a)序列号1、7、13、19、25、31或37所示的、编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的氨基酸序列；

(b)在序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列中缺失、替换、或添加了1个～数个氨基酸、且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的氨基酸序列；

(c)与序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列具有90％以上的序列同一性、且编码具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质的氨基酸序列。

根据[1]或[2]的突变型内切葡聚糖酶，与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸残基被替换成丙氨酸。

根据[1]～[3]的任一突变型内切葡聚糖酶，包含序列号2、8、14、20、26、32或38所示的氨基酸序列。

编码[1]～[4]的任一突变型内切葡聚糖酶的DNA。

根据[5]的DNA，包含序列号4、10、16、22、28、34或40所示的碱基序列。

表达载体，包含[5]或[6]的DNA。

转化细胞，是通过使用了[7]的表达载体的转化而制作的。

突变型内切葡聚糖酶的制造方法，包括：

(1)培养[8]的转化细胞的工序；和

(2)对由该转化细胞所生产的突变型内切葡聚糖酶进行纯化的工序。

生物质分解用组合物，包含[1]～[4]的任一突变型内切葡聚糖酶和/或[8]的转化细胞的处理物。

由来源于纤维素的生物质制造糖液的方法，包括在含纤维素的生物质悬浮液中添加[10]的生物质分解用组合物而进行水解的步骤。

根据[11]的方法，进一步包括添加来源于丝状菌的纤维素酶的步骤。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2011-193279号的说明书和/或附图所记载的内容。

发明的效果

本发明的突变型内切葡聚糖酶，由来源于木质素的芳香族化合物所造成的活性抑制大幅降低。因此，在将含有纤维素、特别是木质素的纤维素系生物质进行水解来制造糖液时，能够高效率地分解木质纤维素，因此通过作为酶组合物使用，可以效率良好地制造糖液。

附图说明

图1-1是显示实施例1中的序列号1的来源于掘越氏热球菌的内切葡聚糖酶(EGPh)与来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的比对的图。将序列号1中的位置273的色氨酸用下划线显示。

图1-2是图1-1的继续。

图1-3是图1-2的继续。

图1-4是图1-3的继续。

具体实施方式

以下详细说明本发明。

本发明涉及由来源于木质素的芳香族化合物所造成的活性抑制与亲内切葡聚糖酶相比大幅降低的突变型内切葡聚糖酶。

在本说明书中，来源于木质素的芳香族化合物只要是作为木质素的前体物质一般称为单木质醇(monolignol)的芳香族化合物、及其生物合成途径中存在的芳香族化合物、和分解纤维素系生物质而得的芳香族化合物，就不特别限定，也可以是一种以上的混合物。作为称为单木质醇(monolignol)的芳香族化合物、及其生物合成途径中存在的芳香族化合物，可列举例如，松柏醇、芥子醇、对香豆醇、苯丙氨酸、肉桂酸、对香豆酸、咖啡酸、5-羟基阿魏酸、芥子酸、对香豆酰辅酶A、咖啡酰辅酶A、阿魏酰辅酶A、5-羟基阿魏酰辅酶A、芥子酰辅酶A、对香豆醛、咖啡醛、5-羟基松柏醛、芥子醛、咖啡醇、5-羟基松柏醇、5-脱氢莽草酸、莽草酸、莽草酸-5-磷酸、3-烯醇式丙酮酰莽草酸-5-磷酸、分支酸、预苯酸、苯基丙酮酸、对羟基苯基丙酮酸、酪氨酸、芥子醛等。作为分解纤维素系生物质而得的芳香族化合物，可列举例如，丁香醛、对羟基苯甲醛、5-甲酰基香草醛、香草酸、丁香酸、5-甲酰基香草酸、5-羧基香草醛、乙酰愈创木酮、愈创木酚、香草醇、二氢松柏醇、丁香醛、5-羟基甲基香草醛、1-愈创木基-1-丁烯-3-酮、对甲氧基偶氮苯、苯甲酸、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、三甲基没食子酸、香草酰甲酸、1,2,3-苯三甲酸、1,2,4-苯三甲酸、异半蒎酸、1,3,5-苯三甲酸、1,2,3,4-苯四甲酸、1,2,4,5-苯四甲酸、1,2,3,5-苯四甲酸、苯五甲酸、苯六甲酸、脱氢二香草酸、4,4’-二羟基-3,3’-二甲氧基查耳酮、4,4’-二羟基-3,3’-二甲氧基偶苯酰、二愈创木基乙醇酸、4,4’-二羟基-3,3’-二甲氧基二苯甲酮、二甲酰基二羟基-二甲氧基-二乙基-1,2-二苯乙烯、藜芦酸、异半蒎酸、间半蒎酸、半蒎酸、苯多甲酸、芥子酸、糠醛、羟基甲基糠醛、阿魏酰胺、香豆酰胺等，优选列举阿魏酸、香草醛、松柏醛。

在本说明书中，“内切葡聚糖酶”是水解纤维素等的β-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。作为EC号：EC3.2.1.4记载了归属于内切葡聚糖酶的酶群，但在本发明中虽然在EC号中不归属于内切葡聚糖酶、但具有上述内切葡聚糖酶活性的蛋白质也包含在内切葡聚糖酶中。可列举例如，木聚糖酶、木葡聚糖酶、甘露聚糖酶、几丁质酶、壳聚糖酶、半乳聚糖酶等。

在本说明书中，亲内切葡聚糖酶是具有导入突变之前的氨基酸序列的内切葡聚糖酶，显示上述内切葡聚糖酶活性。在本说明书中，有时将“亲内切葡聚糖酶”记载为“野生型”。此时，“亲内切葡聚糖酶”和“野生型”的记载可以互换使用。在本发明中，“亲内切葡聚糖酶”优选来源于嗜热菌。

本说明书中的嗜热菌是能在50℃以上生长的微生物群的总称，另外特别是超嗜热菌是指能在80℃以上生长的微生物群。作为该嗜热菌，可例示火球菌属(Pyrococcus)、燃球形菌属(Ignisphaera)、葡萄热菌属(Staphylothermus)、热酸菌属(Acidthermus)、螺旋体属(Spirochaeta)、硫化叶菌属(Sulfolobus)、热原体属(Thermoplasma)、暖枝菌属(Caldivirga)、热球形菌属(Thermosphaera)、嗜苦菌(Picrophilus)属、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)等。

来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶是公知的，例如在GenBank等中作为AAQ31833等注册，在本发明中可以将它们作为“亲内切葡聚糖酶”利用。在本发明中，优选亲内切葡聚糖酶包含序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列。该亲内切葡聚糖酶也包含在序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列中具有1个或多个或1个或几个氨基酸的缺失、替换、添加或插入、且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。这里对“1个或几个”的范围不特别限定，例如为10个以内、进一步优选为5个以内、特别优选为4个以内、或者为1个或2个。

另外，在本发明中，亲内切葡聚糖酶还包含以下蛋白质：包含使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center forBiological Information)(美国国家生物信息中心的基本局部比对检索工具))等(例如，默认即初始设定的参数)计算时，与序列号1、7、13、19、25、31或37所示的氨基酸序列具有90％、95％、99％、或其以上的同一性的氨基酸序列，优选由该氨基酸列组成，且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。

这里，“同一性”是指在使2个氨基酸序列在导入间隙或不导入间隙的条件下对齐时的最适的比对中，相对于重叠的全部氨基酸残基相同氨基酸和类似氨基酸残基的比例(百分比)。同一性可以使用本领域技术人员公知的方法、序列分析软件等(例如BLAST、FASTA等公知的算法)来求出。“内切葡聚糖酶活性”如以上所定义，该活性的测定可以如下进行：例如在溶解于50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH值5.2)中的磷酸膨润纤维素的底物溶液中添加酶液，在30～85℃反应1小时后，根据需要改变pH值等而使反应停止，然后使用葡萄糖定量试剂盒来定量反应液中的葡萄糖浓度。

本发明中的“突变型内切葡聚糖酶”是指在上述亲内切葡聚糖酶的氨基酸序列中，与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸残基被替换成从芳香族氨基酸以外选出的氨基酸、且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。

如下述实施例中详述的那样，本发明者们通过晶体结构分析，弄清楚了亲内切葡聚糖酶的氨基酸序列、即序列号1所示的氨基酸序列中(序列号1所示的氨基酸序列包含19个色氨酸、20个苯丙氨酸、11个组氨酸、23个酪氨酸共计73个芳香族氨基酸残基)，位于活性部位附近的第273位的色氨酸与松柏醛形成疏水性相互作用。即，明确了该氨基酸在活性部位附近与来源于木质素的芳香族化合物形成疏水性相互作用，是与作为内切葡聚糖酶的底物的纤维素的水解反应的抑制强烈地相关的氨基酸。本发明中对内切葡聚糖酶导入突变的目的在于破坏与活性抑制相关的该疏水性相互作用，其结果是在活性部位附近，来源于木质素的芳香族化合物的摄入被抑制。

这里“与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸”，是在将上述亲内切葡聚糖酶的氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列的立体结构进行比较的情况下，在所述来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的氨基酸序列中，存在于与序列号1的氨基酸序列中的第273位的色氨酸同样的位置，参与与来源于木质素的芳香族化合物的疏水性相互作用的形成的氨基酸。“与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸”的氨基酸种类优选为色氨酸。

作为“与序列号1的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸”的确定方法，可以按照以下的步骤1)～3)实施。

步骤1)在序列号1记载来源于掘越氏热球菌的内切葡聚糖酶(以下，记为“EGPh”)的氨基酸序列中，将起始甲硫氨酸定义为位置1。对于以后的氨基酸序列依次编号为位置2、3、4...，将对应于第273位的色氨酸定义为序列号1中的第273位的色氨酸。

步骤2)接着，在亲内切葡聚糖酶的氨基酸序列中确定与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸。该相当的氨基酸的位置可以通过使亲内切葡聚糖酶的氨基酸序列、特别是活性部位附近的氨基酸序列与序列号1的氨基酸序列对齐来明确。这样的操作称为氨基酸序列的比对。作为比对工具，使用ClustalW等大量广为人知的软件，使用默认的参数进行。本领域技术人员能够在不同长度的氨基酸序列之间通过比对来明确亲内切葡聚糖酶中的与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸的位置。

步骤3)将在上述比对分析中位于与序列号1所示的氨基酸的第273位的色氨酸相当的位置的氨基酸，作为上述亲内切葡聚糖酶中的上述“与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸”。

在上述亲内切葡聚糖酶中，在除了上述“与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸”以外的位置带有氨基酸的缺失、添加、或者插入等突变时，有时从N末端开始计算的“与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸”的位置不是第273位。这时，也将通过上述方法确定的“与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸”替换为除芳香族氨基酸以外的氨基酸，制成本发明的突变型内切葡聚糖酶。

作为本发明中的从芳香族氨基酸以外选出的氨基酸，除了色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸这样的芳香族氨基酸残基以外的任意的氨基酸均可以使用。作为可以替换的氨基酸残基，可列举例如，赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)，优选为丙氨酸(Ala)。另外，如果使上述与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸人为缺失的结果是能够作为保持内切葡聚糖酶活性的蛋白质制造，则可以使该与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸人为缺失。

特别优选本发明的突变型β葡糖苷酶包含序列号2、8、14、20、26、32、或38所示的氨基酸序列。

本发明的突变型β葡糖苷酶可以使用本领域技术人员公知的手法制造。例如，可以通过在编码亲内切葡聚糖酶的氨基酸序列的基因中导入突变，来制作编码突变型内切葡聚糖酶的突变基因，通过使用适当的宿主使该突变基因表达，从而制造。这里“基因”包括包含DNA、RNA、DNA/RNA杂种的核酸。

编码突变型内切葡聚糖酶的突变基因可以使用本领域技术人员公知的突变导入法来制作。

在使用例如EGPh作为亲内切葡聚糖酶来制作突变型内切葡聚糖酶时，编码EGPh的基因可以从掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii、注册号JCM9974、JCM微生物株カタログ第7版、1999年1月发行)的细胞中克隆化。

另外在将与EGPh立体结构类似的其他内切葡聚糖酶作为亲内切葡聚糖酶来制作突变型内切葡聚糖酶时，该亲内切葡聚糖酶基因可以从产生该内切葡聚糖酶蛋白质的微生物等(例如，Ignisphaera aggregans、Staphylothermus hellenicus、Pyrococcus abyssi、解纤维热酸菌(Acidthermus cellulolyticus)、嗜热螺旋菌(Spirochaeta thermophila)等)的细胞中克隆化。

编码亲内切葡聚糖酶的基因可以由保有这些内切葡聚糖酶的微生物依据公知的方法分离DNA，通过PCR等手法进行DNA扩增，从而获得。例如，将掘越氏热球菌进行培养后，使用BLAST探索法，从基因序列中通过PCR反应扩增而提取得到认为与掘越氏热球菌的内切葡聚糖酶序列类似、显示本酶活性的基因(例如序列号1)。

对上述的由内切葡聚糖酶产生菌得到的亲内切葡聚糖酶基因，在规定的部位人为地引起突变，制备突变型内切葡聚糖酶基因。在制备由来源于木质素的芳香族化合物造成的活性抑制降低了的突变型内切葡聚糖酶基因时，为了替换上述与序列号1所示的氨基酸序列的第273位的色氨酸相当的氨基酸，对亲内切葡聚糖酶人为地引起突变。

作为在基因的目的部位引起突变的定点诱变法，可以通过现有惯用的PCR法来进行。

可以通过将如上所述制备的编码突变型内切葡聚糖酶的基因，使用限制性酶和DNA连接酶连接于适当的表达载体中的启动子下游，从而制造包含该基因的表达载体。作为表达载体，可列举细菌质粒、酵母质粒、噬菌体DNA(λ噬菌体等)、逆转录病毒、棒状病毒、牛痘病毒、腺病毒等病毒DNA、SV40的衍生物等、作为植物细胞用的载体的农杆菌等，只要能够在宿主细胞中复制和生存则其他任何载体都可以使用。例如，在宿主是大肠杆菌的情况下，可例示pUC、pET、pBAD等。另外，在宿主是酵母的情况下，可列举pPink-HC、pPink-LC、pPinkα-HC、pPicZ、pPicα、pPic6、pPic6α、pFLD1、pFLD1α、pGAPZ、pGAPZα、pPic9K、pPic9等。

作为启动子，只要是与基因的表达中使用的宿主对应的适当启动子就可以是任何启动子。例如，在宿主是大肠杆菌的情况下，可列举lac启动子、Trp启动子、PL启动子、PR启动子等，是酵母的情况下，可列举AOX1启动子、TEF1启动子、ADE2启动子、CYC1启动子、GAL-L1启动子等。

作为本发明中使用的宿主细胞，优选大肠杆菌、细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞等。作为酵母细胞，可列举例如，毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等。作为真菌细胞，可列举曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)等。作为昆虫细胞可列举Sf9等，作为植物细胞可列举双子叶植物等，作为动物细胞可列举CHO、HeLa、HEK293等。

转化或转染可以通过磷酸钙法、电穿孔法等公知的方法来进行。本发明的突变型内切葡聚糖酶可以在如上所述被转化或转染的宿主细胞中在启动子的控制下使其表达，回收产生物而获得。表达时，使被转化或转染的宿主细胞增殖或成长至适当的细胞密度，然后通过温度位移或添加异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)等化学诱导手段诱导启动子，将细胞进一步培养一定时间。

在突变型内切葡聚糖酶被排出到细胞外的情况下，从培养基直接纯化突变型内切葡聚糖酶，另外在存在于细胞外的情况下，通过超声波破碎和/或机械破碎等物理手段或细胞溶解剂等化学手段破坏细胞，然后纯化突变型内切葡聚糖酶。突变型内切葡聚糖酶可以组合硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、反相高速液相层析、亲和层析、凝胶过滤层析、电泳等技术，从而从重组细胞的培养基中部分或完全地纯化出。

本发明的突变型内切葡聚糖酶与亲内切葡聚糖酶相比，可以大幅降低由来源于木质素的芳香族化合物造成的活性抑制。因此，本发明的突变型内切葡聚糖酶在来源于木质素的芳香族化合物的存在下，具有与亲内切葡聚糖酶相比约为2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍或其以上的内切葡聚糖酶活性。

本发明的突变型内切葡聚糖酶可以是纯化品，也可以是粗纯化品。

另外，本发明的突变型内切葡聚糖酶可以固定化于固相。作为固相，可列举例如，聚丙烯酰胺凝胶、聚苯乙烯树脂、多孔性玻璃、金属氧化物等(不特别限于这些)。通过将本发明的本发明的突变型内切葡聚糖酶固定于固相，在可以连续反复使用的方面是有利的。

进而，使用上述编码突变型内切葡聚糖酶的基因进行转化后的细胞的处理物也可以作为粗纯化的突变型内切葡聚糖酶利用。该“转化的细胞的处理物”中包含固定化于固相的转化细胞、以及转化细胞的死菌、破碎物、和将它们固定化于固相而得的产物等。

本发明的突变型内切葡聚糖酶通过与纤维素酶混合，可以作为生物质分解用酶组合物在含纤维素的生物质的水解中使用。这里所说的纤维素酶，只要是具有分解纤维素的活性的酶就不特别限定，也可以是一种以上的混合物。作为这样的酶，可列举例如，纤维素酶、半纤维素酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、几丁质酶、壳聚糖酶、半乳聚糖酶等。优选纤维素酶为来源于丝状菌的纤维素酶。

作为生产上述丝状菌纤维素酶的微生物，可列举木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、纤维单胞菌属(Cellulomonas)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、腐质霉属(Humicola)、枝顶孢霉属(Acremonium)、耙齿菌属(Irpex)、毛霉属(Mucor)、篮状菌属(Talaromyces)等的微生物。这些微生物在培养液中产生纤维素酶，因而既可以将培养液作为未纯化的丝状菌纤维素酶直接使用，也可以将纯化培养液而制剂化的产物作为丝状菌纤维素酶混合物使用。在作为从上述培养液中纯化丝状菌纤维素酶混合物而制剂化而得的产物使用的情况下，可以使用添加了蛋白酶抑制剂、分散剂、溶解促进剂、稳定剂等除了酶以外的物质的制剂作为纤维素酶制剂。

本发明中使用的来源于丝状菌的纤维素酶优选是来源于木霉属的纤维素酶。来源于木霉属的纤维素酶只要是具有分解纤维素的活性的酶就不特别限定，可以是一种以上的混合物。作为这样的酶，可列举例如，纤维素酶、半纤维素酶、纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、木葡聚糖酶、几丁质酶、壳聚糖酶、半乳聚糖酶等。这样的木霉属中，更优选来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维素酶混合物。作为来源于里氏木霉的纤维素酶混合物，可列举里氏木霉ATCC66589(Trichoderma reesei ATCC68589)、里氏木霉QM9414(Trichoderma reesei QM9414)、里氏木霉QM9123(Trichoderma reeseiQM9123)、里氏木霉RutC-30(Trichoderma reesei Rut-30)、里氏木霉PC3-7(Trichoderma reesei PC3-7)、里氏木霉CL-847(Trichoderma reeseiCL-847)、里氏木霉MCG77(Trichoderma reesei MCG77)、里氏木霉MCG80(Trichoderma reesei MCG80)、绿色木霉QM9123(Trichodermaviride QM9123)的纤维素酶混合物。另外，也可以是来源于上述木霉属、通过突变剂或紫外线照射等进行突变处理而纤维素酶生产性提高了的突变株。

如上所述得到的突变型内切葡聚糖酶可以通过单独或与纤维素酶组合而在食品、饲料、洗剂、含纤维素的织物的处理、由纤维素系生物质的糖液的制造中使用。

所述食品和饲料至少包含本发明的突变型内切葡聚糖酶，根据需要进一步含有其他成分。作为所述食品和饲料中的本发明的突变型内切葡聚糖酶的含量，不特别限制，可以根据目的适宜选择。另外，作为所述食品和饲料的制造方法，不特别限制，可以根据目的适宜选择。另外，所述食品和饲料包含本发明的突变型内切葡聚糖酶，因而例如，可以分解食品和饲料所含的纤维素等，可以效率良好地消化。

作为所述洗剂中的突变型内切葡聚糖酶的含量，不特别限制，可以根据目的适宜选择。另外，作为所述洗剂的制造方法，不特别限制，可以根据目的适宜选择。所述洗剂包含本发明的突变型内切葡聚糖酶，因而例如，可以效率良好地除去塞在洗涤对象物的纤维素纤维中的污垢。

所述含纤维素的织物的处理方法包括使用本发明的突变型内切葡聚糖酶来处理含纤维素的织物的步骤(处理工序)，根据需要进一步包括其他工序。作为所述含纤维素的织物，不特别限制，可以根据目的适宜选择，例如，可列举斜纹布(jeans)。另外，对所述处理工序中的本发明的突变型内切葡聚糖酶的使用量、温度、时间等不特别限制，可以根据目的适宜选择。例如，可以通过用本发明的含纤维素的织物的处理方法处理所述斜纹布(jeans)，从而进行例如石洗加工等。

本发明中的含纤维素的生物质只要是至少含有纤维素的物质就不限定。更具体地是甘蔗渣、玉米秸、玉米穗轴、柳枝稷、稻秸、麦秸、树木、木材、废建材、报纸、旧纸、纸浆等。这些含纤维素的生物质含有高分子芳香族化合物木质素、半纤维素等杂质，作为前处理，可以使用酸、碱、加压热水等，从而将木质素、半纤维素部分分解，将所得的含纤维素的生物质作为纤维素利用。

本发明中的含纤维素的生物质悬浮液是以固体成分浓度0.1～30％含有上述的含纤维素的生物质的悬浮液。作为悬浮中使用的溶剂不特别限制，可以根据目的适宜选择。

本发明中所说的“添加”是指将突变型内切葡聚糖酶、转化后的细胞的处理物、纤维素酶等加入该含纤维素的生物质悬浮液中。作为添加量，不特别限制，可以根据目的适宜选择，例如相对于所述含纤维素的生物质1g优选为0.001mg～100mg，更优选为0.01～10mg，特别优选为0.1～1mg。

作为糖液的制造中的含纤维素的生物质悬浮液的酶处理中的温度，不特别限制，优选为反应温度30～100℃，更优选为40～90℃，特别优选为50～80℃。作为处理pH值，不特别限制，优选为pH值2～8，更优选为pH值3～7，特别优选为pH值4～6。含纤维素的生物质固体成分浓度优选为固体成分浓度0.1～30％。

通过设定在该范围，可以最大限度发挥本发明的生物质分解用酶组合物的分解效率。该酶处理可以以分批式进行，也可以以连续式进行。通过这样的酶处理获得的水解物包含葡萄糖、木糖等单糖成分，因而可以作为乙醇、乳酸等的原料糖使用。

实施例

以下列举实施例具体地说明本发明。但本发明不限于这些实施例。

(实施例1)来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶中的第273位的氨基酸残基的确定

为了探索与EGPh的氨基酸序列同一性高的来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶，进行BLAST检索。

为了进行BLAST检索，将序列号1作为查询(query)而利用ProteinBLAST。其结果作为与EGPh显示75％以上的同一性的来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶，找到了序列号7记载的来源于Ignisphaera aggregans的内切葡聚糖酶1(EGIa1)、序列号13记载的来源于Ignisphaera aggregans的内切葡聚糖酶2(EGIa2)、序列号19记载的来源于Staphylothermushellenicus的内切葡聚糖酶(EGSh)、序列号25记载的来源于Pyrococcusabyssi的内切葡聚糖酶(EGPa)、序列号31记载的来源于解纤维热酸菌(Acidthermus cellulolyticus)的内切葡聚糖酶(EGAc)、序列号37记载的来源于嗜热螺旋菌(Spirochaeta thermophila)的内切葡聚糖酶(EGSt)。

为了进行EGPh与序列号7、13、19、25、31、37记载的来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶的比对，使用本领域技术人员熟知的软件ClustalW实施比对。其结果将位于与序列号1所示的氨基酸的位置273的色氨酸相同的位置的氨基酸确定为序列号7、13、19、25、31、37记载的来源于嗜热菌的内切葡聚糖酶中的位置273，在图1-1～1-4中用下划线显示。

(参考例1)亲内切葡聚糖酶的制备

EGPh、EGIa1、EGIa2、EGSh、EGPa、EGAc、EGSt基因，分别完全合成序列号1、7、13、19、25、31、37记载的基因，使用DNA LigationKit＜Mighty Mix＞(タカラバイオ)与pET11d的NcoI和BamHI连接，转化JM109(タカラバイオ)。使用含有氨苄青霉素作为抗生素的LB琼脂培养基进行筛选。通过小量提取试剂盒(キアゲン)从转化得到的JM109株中分离制作的载体pET-EGPh、EGIa1、EGIa2、EGSh、EGPa、EGAc、EGSt，进行碱基序列分析。用pET-EGPh、EGIa1、EGIa2、EGSh、EGPa、EGAc、EGSt转化表达用大肠杆菌BL21(DE3)pLysS株，制作BL21-PfuBGL株。将BL21-PfuBGL株接种于含氨苄青霉素的LB培养基10mL中，在37℃振荡培养一夜(前培养)。作为主培养，在含氨苄青霉素的LB培养基1L中接种前培养所得的菌体，振荡培养至波长600nm的吸光度OD600为0.6。然后，加入异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)使其最终浓度为0.5mM，再在25℃培养一夜。培养后，通过离心分离回收菌体，再悬浮于50mM磷酸钾缓冲液(pH值7.0)中。将该溶液一边冰冷却一边进行超声波破碎，将其上清作为无细胞提取液通过离心分离回收。将所得的无细胞提取液在85℃保温15分钟，使除该内切葡聚糖酶以外的来源于大肠杆菌的蛋白质凝集沉淀。通过离心分离除去沉淀物，将上清使用截流分子量10000的再生纤维素制透析膜(スペクトラム·ラボラトリーズ制)对50mM乙酸缓冲液(pH值5.0)进行透析。使用所得的蛋白质溶液作为野生型的EGPh、EGIa1、EGIa2、EGSh、EGPa、EGAc、EGSt。

(实施例2)突变型内切葡聚糖酶的制备

本发明的突变型内切葡聚糖酶使用表1所示的引物对，通过以下手法制作。

表1

对编码序列号1所示的氨基酸序列的基因，使用序列号5和6的碱基序列所示的寡核苷酸利用定点突变法制作突变型EGPh(序列号2)。另外同样地，对编码序列号7所示的氨基酸序列的基因，使用序列号11和12的碱基序列所示的寡核苷酸制作突变型EgIa1(序列号8)，对编码序列号13所示的氨基酸序列的基因，使用序列号17和18制作突变型EgIa2(序列号14)，对编码序列号19所示的氨基酸序列的基因，使用序列号23和24制作突变型EGSh(序列号20)，对编码序列号25所示的氨基酸序列的基因，使用序列号29和30制作突变型EGPa(序列号26)，对编码序列号31所示的氨基酸序列的基因，使用序列号35和36制作突变型EGAc(序列号32)，对编码序列号37所示的氨基酸序列的基因，使用序列号41和42制作突变型EGSt(序列号38)。确认所得的基因的序列后，通过参考例1记载的步骤用大肠杆菌实施表达。可以确认EGPh突变体、EGIa1突变体、EGIa2突变体、EGSh突变体、EGPa突变体、EGAc突变体、EGSt突变体在大肠杆菌中全部能够作为异种蛋白质表达。

(参考例2)磷酸膨润纤维素的制备

在测定内切葡聚糖酶的水解活性时作为底物使用的磷酸膨润纤维素，按照Walseth(1971)Tappi35：228(1971)和Wood Biochem J.121：353(1971)所述的方法从微晶纤维素(Avicel)制备。将该物质使用缓冲液和水进行稀释而得到2重量％混合物，制成乙酸钠的最终浓度为50mM、pH值5.2。以此作为磷酸膨润纤维素，在以下的实施例中使用。

(实施例3)突变体的磷酸膨润纤维素分解活性

将实施例2所得的突变体与参考例1制备的亲内切葡聚糖酶的磷酸膨润纤维素分解活性通过以下实验进行比较。底物使用1％磷酸膨润纤维素/50mM乙酸缓冲液(pH值5.2)，分别以终浓度0.5μM添加参考例1、实施例2中制备的酶，在50℃进行1小时酶反应。将上述反应条件下由亲内切葡聚糖酶生成的葡萄糖浓度(g/L)作为100％，将各突变体中的磷酸膨润纤维素分解活性以相对值示于表2。

表2

确认了在50℃，亲内切葡聚糖酶和各突变体之间活性无差异。

(实施例4)由来源于木质素的芳香族化合物造成的抑制实验1

测定松柏醛存在下的、野生型和突变型内切葡聚糖酶的磷酸膨润纤维素的分解活性。底物使用1％磷酸膨润纤维素/50mM乙酸缓冲液(pH值5.2)，添加松柏醛(シグマアルドリッチ)至终浓度0、5、10、15mM，分别以终浓度0.5μM添加参考例1、实施例2中制备的酶后，在50℃进行1小时酶反应。将在添加浓度0mM由亲内切葡聚糖酶生成的葡萄糖浓度(g/L)作为100％，将各个突变体中的磷酸膨润纤维素分解活性以相对值示于表3。

表3

确认了在各突变体中活性抑制大幅降低。

(实施例5)由来源于木质素的芳香族化合物造成的抑制实验2

测定香草醛存在下的、野生型和突变型内切葡聚糖酶的磷酸膨润纤维素的分解活性。底物使用1％磷酸膨润纤维素/50mM乙酸缓冲液(pH值5.2)，添加香草醛(シグマアルドリッチ)至终浓度0、5、10、15mM，分别以终浓度0.5μM添加参考例1、实施例2所制备的酶后，在50℃进行1小时酶反应。将在添加浓度0mM由亲内切葡聚糖酶生成的葡萄糖浓度(g/L)作为100％，将各个突变体中的磷酸膨润纤维素分解活性以相对值示于表4。

表4

确认了各突变体中活性抑制大幅降低。

(实施例5)由来源于木质素的芳香族化合物造成的抑制实验3

测定阿魏酸存在下的、野生型和突变型内切葡聚糖酶的磷酸膨润纤维素的分解活性。底物使用1％磷酸膨润纤维素/50mM乙酸缓冲液(pH值5.2)，添加阿魏酸(シグマアルドリッチ)至终浓度0、5、10、15mM，分别以终浓度0.5μM添加参考例1、实施例2所制备的酶后，在50℃进行1小时酶反应。将在添加浓度0mM由亲内切葡聚糖酶生成的葡萄糖浓度(g/L)作为100％，将各个突变体中的磷酸膨润纤维素分解活性以相对值示于表5。

表5

确认了各突变体中活性抑制大幅降低。

(参考例3)木质纤维素的制备

如下制备在测定内切葡聚糖酶的水解活性时作为底物使用的磷酸膨润纤维素1～3。

1.木质纤维素1的制备(氨处理)

作为纤维素使用稻秸。将上述纤维素加入小型反应器(耐压硝子工业制、TVS-N230ml)中，用液氮冷却。在该反应器中流入氨气，使样品完全浸渍于液体氨中。盖上反应器的盖，在室温放置15分钟左右。接着，在150℃的油浴中处理1小时。处理后将反应器从油浴取出，在通风中直接漏掉氨气，然后再用真空泵将反应器内抽真空至10Pa使其干燥。将产物作为木质纤维素1在以下的实施例中使用。

2.木质纤维素2的制备(稀硫酸处理)

作为纤维素使用稻秸。将纤维素浸渍在硫酸1％水溶液中，在150℃进行30分钟高压釜处理(日东高压制)。处理后进行固液分离，分离成硫酸水溶液(以下称为稀硫酸处理液)和硫酸处理纤维素。接着将硫酸处理纤维素以固体成分浓度为10重量％的方式与稀硫酸处理液搅拌混合，然后用氢氧化钠将pH值调整到5左右。将该产物作为木质纤维素2在以下的实施例中使用。

3.木质纤维素3的制备(水热处理)

作为纤维素使用稻秸。将上述纤维素浸于水中，一边搅拌一边在180℃进行20分钟高压釜处理(日东高压株式会社制)。此时的压力为10MPa。处理后使用离心分离(3000G)而固液分离成溶液成分(以下称为水热处理液)和处理生物质成分。将该处理生物质成分作为木质纤维素3在以下的实施例中使用。

(实施例6)使用了包含来源于丝状菌的纤维素酶混合物和突变型内切葡聚糖酶的酶组合物的木质纤维素的糖化1

将对木质纤维素底物作用该酶组合物时的葡萄糖生成量的变化进行比较。在50mM乙酸缓冲液(pH值5.2)中悬浮5重量％的木质纤维素1～3(参考例3所制备)，将所得的悬浮液作为底物。反应在50℃进行至24小时，适宜取样而测定生成的葡萄糖浓度。作为来源于丝状菌的纤维素酶混合物，使用市售的来源于里氏木霉的纤维素酶(Celluclast、シグマ)。作为内切葡聚糖酶，分别使用实施例2所制备的突变型内切葡聚糖酶和参考例1所制备的野生型内切葡聚糖酶。酶添加量为纤维素酶1.0mg/mL、内切葡聚糖酶0.1mg/mL(纤维素酶的1/10量)。表6、7、8分别比较了由木质纤维素1、2、3反应24小时后生成的葡萄糖浓度(g/L)。

表6

表7

表8

将使用野生型内切葡聚糖酶和突变型内切葡聚糖酶的情况进行比较，

结果对于木质纤维素1～3任一者，反应24小时后的葡萄糖生成量，突变型内切葡聚糖酶均大幅上升至野生型内切葡聚糖酶的约1.4倍。

(参考例4)来源于木霉属的纤维素酶的制备

通过以下方法制备来源于木霉属的纤维素酶。

1.前培养

以玉米浸渍液2.5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14(w/vol)、磷酸二氢钾0.2％(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将100mL加入500mL带挡板的三角烧瓶中，在121℃高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121℃高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.1％。在该前培养培养基中接种里氏木霉ATCC66589(Tricoderma reesei ATCC66589)的孢子使其为1×10⁷个/ml培养基，以28℃、72小时、180转/分钟振荡培养，作为前培养(振荡装置：TAITEC社制BIO-SHAKER BR-40LF)。

2.主培养

以玉米浸渍液5％(w/vol)、葡萄糖2％(w/vol)、纤维素(艾维素)10％(w/vol)、酒石酸铵0.37％(w/vol)、硫酸铵0.14％(w/vol)、磷酸二氢钾0.2%(w/vol)、氯化钙二水合物0.03％(w/vol)、硫酸镁七水合物0.03％(w/vol)、氯化锌0.02％(w/vol)、氯化铁(III)六水合物0.01％(w/vol)、硫酸铜(II)五水合物0.004％(w/vol)、氯化锰四水合物0.0008％(w/vol)、硼酸0.0006％(w/vol)、七钼酸六铵四水合物0.0026％(w/vol)的方式添加至蒸馏水中，将2.5L加入5L容量的搅拌广口瓶(ABLE社制DPC-2A)容器中，在121℃高压釜灭菌15分钟。放冷后，添加与其分别在121℃高压釜灭菌15分钟的PE-M和Tween80各0.1％，接种250mL预先通过上述的方法在液体培养基中进行了前培养的里氏木霉ATCC66589(Tricoderma reesei ATCC66589)。然后，以28℃、96小时、300转/分钟、通气量1vvm进行培养，离心分离后，将上清进行膜过滤(ミリポア社制ステリカップ-GV材质：PVDF)。

(实施例7)使用了包含来源于丝状菌的纤维素酶混合物和突变型内切葡聚糖酶的酶组合物的木质纤维素的糖化2

使用参考例3所制备的木质纤维素1～3作为底物，使用参考例4所制备的里氏木霉培养液作为来源于丝状菌的纤维素酶混合物，使酶添加量为纤维素酶1.0mg/mL、β-葡糖苷酶0.1mg/mL(纤维素酶的1/10量)、β-葡糖苷酶(Novozyme188)0.01mg/mL(纤维素酶的1/100量)，除此以外，与实施例6同样地实施木质纤维素1～3的水解。

表9、10、11中分别比较了由木质纤维素1、2、3反应24小时后生成的葡萄糖浓度(g/L)。

表9

表10

表11

将使用野生型内切葡聚糖酶和突变型内切葡聚糖酶的情况进行比较，结果对于木质纤维素1～3的任一者，反应24小时后的葡萄糖生成量，突变型内切葡聚糖酶均大幅上升至野生型内切葡聚糖酶的约1.4倍。判明了不仅如实施例6那样的市售的纤维素酶，使用里氏木霉培养液也具有突变导入的效果。

(比较例1)突变型内切葡聚糖酶的制作

作为比较例，使用表12的引物制作将第273位的色氨酸替换成了其他芳香族氨基酸的突变体。

表12

对编码序列号1所示的氨基酸序列的基因，使用序列号43和44的碱基序列所示的寡核苷酸利用定点突变法制作EGPh(W273Y)(第273位色氨酸替换为酪氨酸：序列号49)。另外同样地，使用序列号45和46所示的寡核苷酸制作EGPh(W273F)(将第73位的色氨酸替换为苯丙氨酸：序列号50)，使用序列号47和48所示的寡核苷酸制作EGPh(W273H)(将第73位的色氨酸替换为组氨酸：序列号51)。可以确认这些突变体在大肠杆菌中全部能够作为异种蛋白质表达。

(比较例2)突变体的磷酸膨润纤维素分解活性

将比较例1所得的突变体通过与实施例3同样的手法比较活性。将上述反应条件下由亲内切葡聚糖酶生成的葡萄糖浓度(g/L)作为100％，将各突变体中的磷酸膨润纤维素分解活性以相对值示于表13。

表13

酶	野生型／突变型	相对活性
			ＥＧＰｈ	野生型	100％
ＥＧＰｈ（Ｗ273Ｙ）	突变型	100％
			ＥＧＰｈ（Ｗ273Ｆ）	突变型	100％
ＥＧＰｈ（Ｗ273Ｈ）	突变型	100％

确认了在50℃亲内切葡聚糖酶和各突变体之间活性无差异。

(比较例3)由来源于木质素的芳香族化合物造成的抑制实验

测定松柏醛存在下的、野生型和比较例1的突变型内切葡聚糖酶的磷酸膨润纤维素的分解活性。实验通过与实施例4相同的步骤进行，各个突变体中的磷酸膨润纤维素分解活性以相对值示于表14。

表14

确认了在进行了向与色氨酸同样的芳香族氨基酸的替换的比较例1的突变体中，相对于野生型，活性抑制没有改善。即，判明了有必要将第273位的色氨酸替换为除了芳香族氨基酸以外的氨基酸。

产业可利用性

本发明中的突变型内切葡聚糖酶可以在通过投料木质纤维素进行的糖液的制造中使用。通过提高木质纤维素分解效率的效果，可以大幅削减酶成本，因此在产业上非常有益。

本说明书中所引用的全部出版物、专利和专利申请均直接作为参考并入本说明书中。