JP2016154548A - 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法 - Google Patents

同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法 Download PDF

Info

Publication number
JP2016154548A
JP2016154548A JP2016052143A JP2016052143A JP2016154548A JP 2016154548 A JP2016154548 A JP 2016154548A JP 2016052143 A JP2016052143 A JP 2016052143A JP 2016052143 A JP2016052143 A JP 2016052143A JP 2016154548 A JP2016154548 A JP 2016154548A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
xylosidase
polypeptide
residues
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2016052143A
Other languages
English (en)
Inventor
グティエレス、クリスティーナ
Gutierrez Christina
ミッチンソン、コリン
Colin Mitchinson
ハング、トム・ティー
T Huang Tom
ディナー、ブルース・エー
A Diner Bruce
フェーガン、ボール・ジョゼフ
Joseph Fagan Paul
ハイツ、ウィリアム・ディー
D Hitz William
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danisco US Inc
Original Assignee
Danisco US Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Danisco US Inc filed Critical Danisco US Inc
Publication of JP2016154548A publication Critical patent/JP2016154548A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01037—Xylan 1,4-beta-xylosidase (3.2.1.37)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Abstract

【課題】同時糖化発酵（ＳＳＦ）の反応効率の改善、及びバイオエタノールなどのバイオ燃料の収率増加に関係する方法及び組成物を同定する方法の提供。
【解決手段】発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び反転型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ含む完全発酵培地を、発酵生成物の生成に好適な期間及び条件下で培養することを包含する、同時糖化発酵（ＳＳＦ）の方法。
【選択図】なし

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年１２月２３日に出願された米国特許仮出願第６１／２８９，９１７号の利益を主張し、その全体を参照として本明細書に組み込む。
（発明の分野）
本開示は、概して、同時糖化発酵反応により得られる生成物の収率を改善するための方法及び組成物を目的とする。
本発明者らは、ＯＰＥＣの石油産出が減少したために石油危機が生じた１９７０年代から、再生可能なリグノセルロース系バイオマスを発酵性糖へと生物変換し、続いて発酵させることで、代替的な液体燃料として提供し得るアルコール（例えば、エタノールすなわち「バイオエタノール」）を生成することに、強い関心を持っている（Ｂｕｎｇａｙ，「Ｅｎｅｒｇｙ：ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｏｐｔｉｏｎｓ」．ＮＹ：Ｗｉｌｅｙ；１９８１；Ｏｌｓｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ，１９９６，Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１８：３１２〜３１；Ｚａｌｄｉｖａｒ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：１７〜３４；Ｇａｌｂｅ ａｎｄ Ｚａｃｃｈｉ，２００２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：６１８〜２８）。エタノールは、ここ２０年程の間、ＵＳＡではガソリンに１０％ブレンドして、あるいはブラジルでは乗り物用にニート燃料として、幅広く使用されてきた。バイオエタノール燃料の重要性は、油の価格が高騰し、及び供給源が徐々に枯渇していることと並行して増加している。
リグノセルロース系バイオマスは、世界中で増加しているエネルギー需要に有意に対応するのに充分大きなスケールで、バイオ燃料（例えば、バイオエタノール）の持続可能な生産を支持することのできる、低コストで再生可能な資源になるものと予測されている。リグノセルロース系材料としては、限定するものではないが、トウモロコシ茎葉（植物トウモロコシから穀粒及び根を除いたもの）、林業廃棄物（おがくず及び紙など）、庭ごみ（行政の固形廃棄物由来のものなど）、草本植物（スイッチグラスなど）、及び森の植物（ポプラの木など）が挙げられる。リグノセルロース系バイオマスは３つの主要成分：ヘミセルロース、セルロース、及びリグニンを有する。ヘミセルロースは、通常、主に５炭糖（アラビノース、ガラクトース、グルコース、マンノース、及びキシロース）から構成される、非晶質の分岐鎖ポリマーである。セルロースはグルコース分子の巨大な直鎖ポリマーであり、典型的には、平行鎖間の水素結合により互いに結合して、結晶性の高い構造を構成する。リグ ニンはフェニル−プロパンからなる複雑な高分子である。
リグノセルロース系バイオマスの生物学的な加工は、セルラーゼ及びヘミセルラーゼを用い、典型的には加水分解反応によりヘミセルロース及びセルロースから糖を放出させることを包含する。次いで、得られた糖を、適切な発酵微生物を使用してバイオエタノールなどのバイオ燃料へと発酵させる。
セルラーゼによりセルロースが分解される際に放出されるグルコースは、多くの場合、このクラスの酵素の強力な阻害剤になり得る。セルロース分解（すなわち、本明細書においては「糖化」）時のグルコースの蓄積を減少させるため、発酵微生物を加えることで、糖を放出させると同時に、前述の放出された糖をバイオエタノールへと変換させることができる。この形態は、同時糖化発酵（「ＳＳＦ」）と呼ばれる。一般的に、ＳＳＦは、加水分解と発酵を個別に行う（「ＳＨＦ」）形態と比べ、これらの発酵プロセスに包含されるほとんどの酵素にとって至適である温度よりも低い温度で操作されるのにも関わらず、生成されるエタノールの変換速度、収率、及び濃度がより良好であり、あるいは効率が高い。ただし、典型的なＳＳＦ反応は、低濃度のエタノールを得るにあたっても非常に時間のかかるもの（例えば、数日間）であり得る（例えば、Ｋａｄａｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒ．２０（３）：７０５を参照されたい）。
したがって、当該技術分野において、ＳＳＦの反応効率の改善、及びバイオエタノールなどのバイオ燃料の収率増加に関係する方法及び組成物を同定することが必要とされている。
本開示は、同時糖化発酵（「ＳＳＦ」）反応に、特定のβ−キシロシダーゼを存在させると、アルキル−β−キシロピラノシド副産物の急速な蓄積が生じるという発見に基づくものである。具体的には、保持型作用機序を有する特定のβ−キシロシダーゼを、ＳＳＦ反応に使用すると、発酵生成物の収率を減少させるアルキル−β−キシロピラノシド副産物が急速に蓄積し得ることを発見した。本開示は、更に、反転型作用機序を有する特定の他のβ−キシロシダーゼをＳＳＦ反応に存在させると、アルキル−β−キシロピラノシド副産物の蓄積が減少し、又は蓄積が最小化され得るという発見に基づくものである。反転型作用機序を有するβ−キシロシダーゼをＳＳＦ反応に包含させることで、発酵生成物の収率が増加することが見出された。
本開示の目的に関し、「反転型作用機序を有するβ−キシロシダーゼ」は、「反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素」、「反転型β−キシロシダーゼ」又は「反転型β−キシロシダーゼポリペプチド」としても参照される。反対に、保持型作用機序を有するβ−キシロシダーゼは、「保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素」、「保持型β−キシロシダーゼ」又は「保持型β−キシロシダーゼポリペプチド」としても参照される。
したがって、本明細書において、保持型β−キシロシダーゼの量を減少させることを伴う、ＳＳＦ反応を実施するための改良法が提供される。同様に、本明細書において、反転型β−キシロシダーゼの量を増加させることを伴う、ＳＳＦ反応を実施するための改良法が提供される。更には、本明細書において、保持型β−キシロシダーゼの量を減少させ、反転型β−キシロシダーゼを増加させることを伴う、ＳＳＦ反応の実施に関する改良法が提供される。同様に、上記の改良法に関連する組成物、及び本明細書に記載の他の方法も企図される。
特定の態様では、本発明は、発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を少なくとも１つ含む完全発酵培地を、発酵生成物の生成に好適な期間及び条件下で培養することを包含する、ＳＳＦ法を提供する。
本開示では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する１つ以上の酵素（又は、本明細書において互換的に及びほぼ同じ意味で「少なくとも１つの酵素」としても記載）を、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する上記１つ以上の酵素を含有していない対照発酵培地と比較して、短鎖アルキル−β−キシロピラノシド（「ＡＸＰ」）（例えば、メチル−β−キシロピラノシド（「ＭＸＰ」）、エチル−β−キシロピラノシド（「ＥＸＰ」）、プロピル−β−キシロピラノシド（「ＰＸＰ」）、又はブチル−β−キシロピラノシド（「ＢＸＰ」））生成を減少させるのに有効な量で、上記完全発酵培地中に存在させることができる。例えば、このような酵素（１つ又は複数）は、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する上記１つ以上の酵素を含有していない対照発酵培地と比較したときに、ＡＸＰの生成量を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、若しくは少なくとも８０％減少させる、及び／又は（ｂ）発酵生成物（例えば、限定するものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノールなどのアルコール）の収率を増加させる（例えば、少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも０．７％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも５％、少なくとも７．５％、又は少なくとも１０％）のに有効な量で存在する。特定の実施形態では、この酵素（１つ又は複数）は、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する上記１つ以上の酵素を含有していない対照発酵培地と比較したときに、反応平衡時の上記ＡＸＰ濃度を、５０％以内、４０％以内、３０％以内、２０％以内、又は１０％以内で減少させるのに有効な量で存在する。
特定の態様では、発酵微生物は、発酵可能な少なくとも１つの炭素供給源から、アルコール、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノールを生成することができるものである。特定の態様では、発酵微生物は、バクテリア（例えば、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）など）又は真菌（例えば、酵母又は糸状菌など）である。
特定の態様では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素はＧＨ４３ファミリーの酵素である。特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼはＦｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、又はＸｙｎＢ３ポリペプチドから選択される。特に、完全発酵培地中に存在する場合、Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、配列番号２、又は配列番号２の残基２１〜３５０に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、配列番号８、又は配列番号８の残基２１〜４４５に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、配列番号１０、又は配列番号１０の残基１９〜５３０に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、配列番号１２、又は配列番号１２の残基１７〜５７４に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ａｆ４３Ａポリペプチドは、配列番号１４、又は配列番号１４の残基１５〜５５８に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、配列番号２４、又は配列番号２４の残基２１〜３４８に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、配列番号２２、又は配列番号２２の残基１９〜３４０に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、ＸｙｎＢ３ポリペプチドは、配列番号２５に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。
特定の態様では、上記完全発酵培地に含まれる反転型β−キシロシダーゼポリペプチドの量は、同様に完全発酵培地の成分である、キシラン含有バイオマス中、キシラン１グラム当たり少なくとも約０．２ｍｇ、少なくとも約０．３ｍｇ、少なくとも約０．４ｍｇ、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約０．７ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、又は少なくとも約３ｍｇである。他の態様では、反転型β−キシロシダーゼポリペプチドの量は、キシラン含有バイオマス中、キシラン１グラム当たり約３ｍｇ以下、約２ｍｇ以下、約１．５ｍｇ以下、約１．０ｍｇ以下、約０．７ｍｇ以下、約０．５ｍｇ以下、約０．４ｍｇ以下、約０．３ｍｇ以下、又は約０．２ｍｇ以下である。特定の態様では、上記完全培地に含まれる反転型β−キシロシダーゼポリペプチドの量は、例えばキシラン含有バイオマス中、キシラン１グラム当たり（ａ）０．４ｍｇ〜１０ｍｇ、（ｂ）０．５ｍｇ〜２ｍｇ、（ｃ）０．４ｍｇ〜５ｍｇ、（ｄ）０．５ｍｇ〜１．５ｍｇ、（ｅ）１ｍｇ〜２ｍｇ、（ｆ）０．３ｍｇ〜３ｍｇ、（ｇ）０．２ｍｇ〜５ｍｇ、（ｈ）０．３ｍｇ〜５ｍｇ、又は（ｉ）０．３ｍｇ〜１０ｍｇの範囲内のものであり、又はこの量は、前述の値からそれぞれ独立して選択される上限及び下限を有する範囲内のものである。
特定の態様では、完全発酵培地に含まれる反転型β−キシロシダーゼポリペプチド（１つ又は複数）の量は、保持型β−キシロシダーゼポリペプチド（１つ又は複数）の量を、モル基準で、分子量基準で、又はモル基準及び分子量基準の両方で超過する。特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼポリペプチド（１つ又は複数）対保持型β−キシロシダーゼポリペプチド（１つ又は複数）比は、モル基準で、分子量基準で、又はモル基準及び分子量基準の両方で、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、又は少なくとも５０：１である。特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素（１つ又は複数）は、完全発酵培地には含まれず、又は検出不能である。特定の実施形態では、完全発酵培地中の保持型β−キシロシダーゼの活性は検出不能である。
本明細書に記載の方法によると、完全発酵培地の培養は連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式条件下で実施される。例えば、本発明の完全発酵培地の培養は、連続式ＳＳＦ反応、バッチ式ＳＳＦ反応又はフェドバッチ式ＳＳＦ反応である。
本開示の方法の特定の態様では、培養工程の前に完全発酵培地を調製することを更に包含する。例えば、完全発酵培地は、（ａ）発酵微生物を少なくとも１つ、（ｂ）キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、（ｃ）セルラーゼを少なくとも１つ（ｄ）ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、（ｅ）反転型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ、及び（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の成分を１つ以上含有しない培地、を組み合わせることで作製できる。特定の実施形態では、セルラーゼの少なくとも１つはセルラーゼ調製物の形態で存在し得る。例えば、セルラーゼ調製物は全セルラーゼ調製物（whole cellulase preparation）であってよく、所望によりヘミセルラーゼの少なくとも１つを含有させることもできる。特定の実施形態では、セルラーゼ調製物は、糸状菌培養物（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞を用いて調製したトリコデルマ・リーゼイ培養
物）由来の培養ブロスである。特定の態様では、トリコデルマ・リーゼイ細胞は、天然β−キシロシダーゼ遺伝子が不活化されるか又は欠失するよう遺伝子操作されている。「天然β−キシロシダーゼ遺伝子が不活化されるか又は欠失するよう遺伝子操作されているトリコデルマ・リーゼイ細胞」には、予め不活化された原細胞又は親細胞だけでなく、天然β−キシロシダーゼ遺伝子が不活化又は欠失された子孫細胞も包含することは注意すべきである。
特定の態様では、本開示の方法は、キシランを含有しているバイオマスを少なくとも１つを含む、発酵ブロスを培養することに関連する。特定の態様では、キシラン含有バイオマスは、例えば、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本（giant reed）、エレファントグラス（elephant grass）、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである。例えば、キシラン含有バイオマスは、ＳＳＦ反応にスラリーの形態で好適に加えることができる。例えば、キシラン含有バイオマスは、固体の形態でＳＳＦ反応に加えることができる。したがって、キシラン含有バイオマスは液体形態（例えば、溶液、懸濁液、又は固体と液体の混合物）又は固体形態のいずれかでＳＳＦ反応に好適に加えることができる。特定の実施形態では、キシラン含有バイオマスは前処理される。
ＳＳＦ反応実施後に、所望により最後に、発酵生成物（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノール）を回収する回収工程を実施することができる。
本開示は、更に、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、β−キシロシダーゼ及び発酵微生物成分に関して本明細書に上記及び下記されるような、本方法での使用に好適な完全発酵培地を提供する。
また、本開示は、天然β−キシロシダーゼ遺伝子が不活化されるか又は欠失するよう遺伝子操作したトリコデルマ・リーゼイ細胞も提供する。トリコデルマ・リーゼイ細胞は、ＧＨ４３ファミリーの酵素、例えば、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、又はＸｙｎＢ３ポリペプチドから選択される酵素を発現するよう遺伝子組み換え操作することもできる。例えば、Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、配列番号２、又は配列番号２の残基２１〜３５０に相当するアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、配列番号８、又は配列番号８の残基２１〜４４５に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、配列番号１０、又は配列番号１０の残基１９〜５３０に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、配列番号１２、又は配列番号１２の残基１７〜５７４に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ａｆ４３Ａポリペプチドは、配列番号１４、又は配列番号１４の残基１５〜５５８に相当するアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、配列番号２４、又は配列番号２４の残基２１〜３４８に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、配列番号２２、又は配列番号２２の残基１９〜３４０に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。ＸｙｎＢ３ポリペプチドは、配列番号２５に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。
本開示は更に、（ａ）セルラーゼポリペプチドを１つ以上生成させるような条件下で、本明細書に上記及び下記されるようなトリコデルマ・リーゼイ細胞を培養すること、及び（ｂ）セルラーゼポリペプチドを回収すること（例えば、セルラーゼポリペプチドを含む培養ブロスを回収することにより）、を含む、セルラーゼポリペプチドの製造法も提供する。本開示は、更に、トリコデルマ・リーゼイ細胞により生成される培養ブロス、並びに糖化反応、例えば、ＳＳＦ反応における培養ブロスの使用を提供する。
特定の態様では、本開示は、反転型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ、発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び発酵培地を含む、完全発酵培地組成物を提供する。反転型β−キシロシダーゼは、例えば、ＧＨ４３ファミリーの酵素である。特定の態様では、反転型β−キシロシダーゼは、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、又はＸｙｎＢ３ポリペプチドから選択することができる。好適には、発酵微生物は、キシラン含有バイオマスなどの好適な炭素供給源、あるいはグルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、又はオリゴ糖などの糖を、直接又は間接的に所望の発酵生成物、例えばメタノール（「ＭｅＯＨ」）、エタノール（「ＥｔＯＨ」）、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノールへと発酵させることのできるものである。発酵微生物は、真菌（例えば、酵母又は糸状菌）、バクテリア（例えば、ザイモモナス・モビリス又はクロストリジウム・サーモセラム）から選択することができる。好適な炭素供給源又は基質としては、例えば、リグノセルロース系基質又は他の炭水化物含有原料から選択される、キシラン含有バイオマス基質が挙げられる。特定のリグノセルロース系基質には、例えば、セルロース、ヘミセルロース、及び／又はリグニンが含まれる。
例えばセルラーゼは、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、又はセロビオヒドロラーゼポリペプチドである。酵素は、名前又は酵素が属しているファミリー（例えば、ＧＨ４３ファミリーの酵素、又はＥＣ ３．２．１．９１に分類される又は属する酵素）のいずれかにより参照される。名前で参照する場合、酵素はまた、「［名前］ポリペプチド」として互換的に参照することもできる（例えば、β−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼポリペプチドとして互換的に参照することもできる）。セルラーゼは、例えば全セルラーゼ調製物の形態であっても良い。ヘミセルラーゼは、例えばキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、又はアクセサリタンパク質である。特定の実施形態では、全セルラーゼ調製物は、ヘミセルラーゼポリペプチドを１つ以上含み得る。
発酵培地は、不完全的な糖化プロセスにより生じるものであってよく、又は糖化生成物を特定の量含むものであってよい。このような組成物は、対象とする発酵生成物（１つ又は複数）を生成させるような条件下での糖化反応、例えばＳＳＦ反応に好適に使用することができる。
特定の態様では、１つ以上のセルラーゼ及び／又は１つ以上のヘミセルラーゼは、微生物を遺伝子組み換えすることで生成され、この遺伝子組み換えで、１つ以上の（天然β−キシロシダーゼの遺伝子が１つ以上存在する場合）天然β−キシロシダーゼが欠失し、又は天然β−キシロシダーゼの活性が検出不能になる。特定の実施形態では、１つ以上のセルラーゼ及び／又は１つ以上のヘミセルラーゼを生成するよう遺伝子操作した微生物は、保持型β−キシロシダーゼ含まず、又は検出可能な保持型β−キシロシダーゼ活性を有さない。
一部の態様では、本開示は、バイオエタノール発酵生成物を得るために、キシラン含有バイオマスでＳＳＦ反応を実施するための改良法に関係し、この方法は、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び発酵微生物を少なくとも１つ含む発酵培地を培養することを含むものであり、この方法には、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を使用することが改善点として含まれる。
関連する態様では、本開示は、様々な工業用途に有用でありかつ価値があることが既知である、アルキル−β−キシロピラノシドを、生成が所望される条件下で生成することに関する改良法も提供する。例えば、アルキル−β−キシロピラノシドは、生分解性の界面活性剤及び乳化剤として有用なアルキルグルコシドの合成に、化学中間体として好適に使用することができる（例えば、Ｋ．Ｓｃｈｍｉｄ ＆ Ｈ．Ｔｅｓｍａｎｎ，２００１，Ａｌｋｙｌ Ｐｏｌｙｇｌｕｃｏｓｉｄｅｓ，ｉｎ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｃｙ ｏｆ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ｓｃｉｅｎｃｅ ｓｅｒｉｅｓ，ｖｏｌ．９８；（Ｆ．Ｅ．Ｆｒｉｅｄ ｅｄ．）；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．，ＮＹ，ｐｐ．１〜７０を参照されたい）。同様に、これらの化合物は、多数の微生物において化合物自体が誘導体であり、又はキシラナーゼ生成の誘導体を調製するために使用することができる（例えば、Ｍ．Ｍａｒｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４９（１２）：３３９９〜３４０７；Ｈ．Ｓｈｉｎｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２（９）：２１９７〜２２０２を参照されたい）。加えて、様々なアルキルピラノシドを、コンドロイチン硫酸塩の開始剤として、及びプロテオグリカンの生合成刺激物質として使用することができる（例えば、Ｈ．Ｓｈｉｎｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２（９）：２１９７〜２２０２を参照されたい）。本発明の他の態様では、ＳＳＦ反応において、保持型の作用機序を有するβ−キシロシダーゼを包含させ又は生成を増加させる
ことで、これらの有用なアルキル−β−キシロピラノシドの収量を増加させることができる。
したがって、特定の実施形態では、本開示の方法には保持型β−キシロシダーゼの量を増加させることを含む。同様に、本明細書において、保持型β−キシロシダーゼの量を増加させることを伴う、ＳＳＦ反応を実施するための改良法が提供される。更なる実施例では、保持型β−キシロシダーゼの量を増加させつつ、反転型β−キシロシダーゼの量は減少させることを伴う、ＳＳＦ反応を実施するための改良法が意図される。
他の態様では、本発明は、発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を少なくとも１つ含む完全発酵培地を、アルキル−β−キシロピラノシド、例えば、メチル−β−キシロピラノシド（「ＭＸＰ」）、エチル−β−キシロピラノシド（「ＥＸＰ」）、プロピル−β−キシロピラノシド（「ＰＸＰ」）、又はブチル−β−キシロピラノシド（「ＢＸＰ」）などの生成に好適な期間及び条件下で培養することを含む、ＳＳＦ法を提供する。
特定の態様では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素は、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を含有しないか又はより少量含有している対照発酵培地と比較して、短鎖アルキル−β−キシロピラノシド（「ＡＸＰ」）（例えば、メチル−β−キシロピラノシド（「ＭＸＰ」）、エチル−β−キシロピラノシド（「ＥＸＰ」）、プロピル−β−キシロピラノシド（「ＰＸＰ」）、又はブチル−β−キシロピラノシド（「ＢＸＰ」）の生成を増加させるのに有効な量で、完全発酵培地に存在させることができる。例えば、このような酵素（１つ又は複数）は、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する１つ以上の酵素を含有しないか又はより少量含有している対照発酵培地と比較して、ＡＸＰの生成量を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％増加させるのに有効な量で、存在する。
特定の態様では、発酵微生物は、様々な短鎖アルキル−β−キシロピラノシド（「ＡＸＰ」）化合物、例えば、限定するものではないが、メチル−β−キシロピラノシド（「ＭＸＰ」）、エチル−β−キシロピラノシド（「ＥＸＰ」）、プロピル−β−キシロピラノシド（「ＰＸＰ」）、又はブチル−β−キシロピラノシド（「ＢＸＰ」）化合物など、を生成することができるものである。一部の態様では、発酵微生物は、バクテリア（例えば、ザイモモナス・モビリスなど）又は真菌（例えば、酵母又は糸状菌など）である。
特定の態様では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素は、ＧＨ３、ＧＨ３０、ＧＨ３１、ＧＨ３９、ＧＨ５２、ＧＨ５４、又はＧＨ１１６ファミリーの酵素である。特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼは、ＸｌｎＤ、Ｆｖ３０Ａ、Ｆｖ３０Ｂ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ３９Ｂ、ＸｙｎＢ、ＸｙｌＡ、又はＸｙｌ１ポリペプチドから選択される。特に、完全発酵培地中に存在する場合、ＸｌｎＤポリペプチドは、配列番号４０、又は配列番号４０の残基１８〜８０４に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｆｖ３０Ａポリペプチドは、配列番号４２、又は配列番号４２の残基２０〜５３７に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｆｖ３０Ｂポリペプチドは、配列番号４４、又は配列番号４４の残基２５〜４８５に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、配列番号４６、又は配列番号４６の残基２０〜４３９に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｆｖ３９Ｂポリペプチドは、配列番号４８、又は配列番号４８の残基１９〜４５６に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、ＸｙｎＢポリペプチドは、配列番号５０に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、ＸｙｌＡは、配列番号５２に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。完全発酵培地中に存在する場合、Ｘｙｌ１ポリペプチドは、配列番号５４、又は配列番号５４の残基２２〜５００に相当するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有するポリペプチドである。
特定の態様では、上記完全培地に含まれる保持型β−キシロシダーゼポリペプチドの量は、同様に完全発酵培地の成分である、キシラン含有バイオマス中、キシラン１グラム当たり少なくとも約０．２ｍｇ、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約０．７ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、又は少なくとも約５ｍｇである。他の態様では、反転型β−キシロシダーゼポリペプチドの量は、キシラン含有バイオマス中、キシラン１グラム当たり約１０ｍｇ以下、約５ｍｇ以下、約２ｍｇ以下、約１ｍｇ以下、約０．７ｍｇ以下、約０．５ｍｇ以下、又は約０．２ｍｇ以下である。特定の態様では、上記完全培地に含まれる保持型β−キシロシダーゼポリペプチドの量は、例えばキシラン含有バイオマス中、キシラン１グラム当たり（ａ）０．２ｍｇ〜１０ｍｇ、（ｂ）０．２ｍｇ〜５ｍｇ、（ｃ）０．５ｍｇ〜５ｍｇ、（ｄ）１ｍｇ〜１０ｍｇ、（ｅ）２ｍｇ〜１０ｍｇ、（ｆ）０．２〜５ｍｇ、（ｇ）０．２ｍｇ〜２ｍｇ、又は（ｈ）０．５ｍｇ〜１０ｍｇの範囲のものであり、又はこの量は、前述の値からそれぞれ独立して選択される上限及び下限を有する範囲内のものである。
特定の態様では、完全発酵培地に含まれる、保持型β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド（１つ又は複数）の量は、反転型β−キシロシダーゼポリペプチド（１つ又は複数）の量を、モル基準で、分子量基準で、又はモル基準及び分子量基準の両方で超過する。特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド対反転型β−キシロシダーゼポリペプチドの比は、モル基準で、分子量基準で、又はモル基準及び分子量基準の両方で少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも１０：１、又は少なくとも５０：１である。特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素は、完全発酵培地には含まれず、又は検出不能である。特定の実施形態では、完全発酵培地中の反転型β−キシロシダーゼ活性は検出不能である。
本明細書に記載の方法によると、完全発酵培地の培養は連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式条件下で実施される。例えば、本発明の完全発酵培地の培養は、連続式ＳＳＦ反応、バッチ式ＳＳＦ反応又はフェドバッチ式ＳＳＦ反応である。
本開示の方法の特定の態様では、培養工程の前に完全発酵培地を作製することを更に包含する。例えば、完全発酵培地は、（ａ）発酵微生物を少なくとも１つ、（ｂ）キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、（ｃ）セルラーゼを少なくとも１つ（ｄ）ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、（ｅ）少なくとも１つの保持型β−キシロシダーゼ遺伝子、及び（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の成分を１つ以上含有しない培地、を組み合わせることで作製できる。特定の実施形態では、セルラーゼの少なくとも１つはセルラーゼ調製物の形態で存在し得る。例えば、セルラーゼ調製物は全セルラーゼ調製物（whole cellulase preparation）であってよく、所望によりヘミセルラーゼの少なくとも１つを含有させることもできる。特定の実施形態では、セルラーゼ調製物は、糸状菌培養物（例えば、トリコデルマ・リーゼイ細胞を用いて調製したトリコデルマ・リーゼイ培養物）由来の培養ブロスである。特定の態様では、トリコデルマ・リーゼイ細胞は、天然保持型β−キシロシダーゼ遺伝子を過剰発現するか、あるいは保持型β−キシロシダーゼの外来遺伝子が組み込まれかつ発現させられるように、遺伝子操作される。「天然保持型β−キシロシダーゼ遺伝子を過剰発現するか、あるいは保持型β−キシロシダーゼの外来遺伝子が組み込まれかつ発現させられるように、遺伝子操作されているトリコデルマ・リーゼイ細胞」には、最初に不活化された原細胞又は親細胞だけでなく、子孫細胞も包含することは注意すべきである。
特定の態様では、本開示の方法は、キシランを含有しているバイオマスを少なくとも１つを含む、発酵ブロスを培養することに関連する。特定の態様では、キシラン含有バイオマスは、例えば、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本、エレファントグラス、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである。例えば、キシラン含有バイオマスは、ＳＳＦ反応にスラリーの形態で好適に加えることができる。例えば、キシラン含有バイオマスは、固体の形態でＳＳＦ反応に加えることができる。したがって、キシラン含有バイオマスは液体形態（例えば、溶液、懸濁液、又は固体と液体の混合物）又は固体形態のいずれかでＳＳＦ反応に好適に加えることができる。特定の実施形態では、キシラン含有バイオマスは前処理される。
ＳＳＦ反応の実施後、所望により完了後、続いて回収工程を行い、ＡＸＰ生成物（例えば、ＭＸＰ、ＥＸＰ、ＰＸＰ、又はＢＸＰ）を回収することができる。
本開示は、更に、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、β−キシロシダーゼ及び発酵微生物成分に関して本明細書に上記及び下記されるような、本方法での使用に好適な完全発酵培地を提供する。
本開示は、天然保持型β−キシロシダーゼ遺伝子を過剰発現するか、あるいは保持型β−キシロシダーゼの外来遺伝子を過剰発現するよう遺伝子操作されたトリコデルマ・リーゼイ細胞も提供する。トリコデルマ・リーゼイ細胞は、ＧＨ３、ＧＨ３０、ＧＨ３１、ＧＨ３９、ＧＨ５２、ＧＨ５４、又はＧＨ１１６ファミリーの酵素、例えば、ＸｌｎＤ、Ｆｖ３０Ａ、Ｆｖ３０Ｂ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ３９Ｂ、ＸｙｎＢ、ＸｙｌＡ、又はＸｙｌ１ポリペプチドから選択された酵素を発現するよう遺伝子組み換え操作することもできる。例えば、ＸｌｎＤポリペプチドは、配列番号４０、又は配列番号４０の残基１８〜８０４に相当するアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｆｖ３０Ａポリペプチドは、配列番号４２、又は配列番号４２の残基２０〜５３７に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｆｖ３０Ｂポリペプチドは、配列番号４４、又は配列番号４４の残基２５〜４８５に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｆｖ３９Ａポリペプチドは、配列番号４６、又は配列番号４６の残基２０〜４３９に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｆｖ３９Ｂポリペプチドは、配列番号４８、又は配列番号４８の残基１９〜４５６に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。ＸｙｎＢポリペプチドは、配列番号５０に相当するアミノ酸配列と、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。ＸｙｌＡポリペプチドは、配列番号５２、又は配列番号５２の残基１９〜７０５に相当するアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。Ｘｙｌ１ポリペプチドは、配列番号５４、又は配列番号５４の残基２２〜５００に相当するアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％配列同一性を有する。
本開示は更に、（ａ）セルラーゼポリペプチドを１つ以上生成させるような条件下で、本明細書に上記及び下記されるようなトリコデルマ・リーゼイ細胞を培養すること、及び（ｂ）セルラーゼポリペプチドを回収すること（例えば、セルラーゼポリペプチドを含む培養ブロスを回収することにより）、を含む、セルラーゼポリペプチドの製造法も提供する。本開示は、更に、トリコデルマ・リーゼイ細胞により生成される培養ブロス、並びに糖化反応、例えば、ＳＳＦ反応における培養ブロスの使用を提供する。
特定の態様では、本開示は、保持型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ、発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び発酵培地を含む、完全発酵培地組成物を提供する。保持型β−キシロシダーゼ遺伝子は、例えば、過剰発現させた天然保持型β−キシロシダーゼ遺伝子、又は好適な宿主細胞に導入した外来β−キシロシダーゼのいずれかである。例えば、保持型β−キシロシダーゼ遺伝子は、ＧＨ３、ＧＨ３０、ＧＨ３１、ＧＨ３９、ＧＨ５２、ＧＨ５４、又はＧＨ１１６ファミリーの酵素である。保持型β−キシロシダーゼ遺伝子は、特定の態様では、ＸｌｎＤ、Ｆｖ３０Ａ、Ｆｖ３０Ｂ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ３９Ｂ、ＸｙｎＢ、ＸｙｌＡ、又はＸｙｌ１ポリペプチドから選択されるものである。好適には、発酵微生物は、キシラン含有バイオマスなどの好適な炭素供給源、あるいはグルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、又はオリゴ糖などの糖を、直接又は間接的に所望の発酵生成物、例えばメタノール（「ＭｅＯＨ」）、エタノール（「ＥｔＯＨ」）、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノールへと発酵させることのできるものである。発酵微生物は、真菌（例えば、酵母又は糸状菌）、又はバクテリア（例えば、ザイモモナス・モビリス又はクロストリジウム・サーモセラム）である。好適な炭素供給源又は基質は、例えば、リグノセルロース系基質又は他の炭水化物含有原料から選択される、キシラン含有バイオマス基質であり得る。特定のリグノセルロース系基質には、例えば、セルロース、ヘミセルロース、及び／又はリグニンが含まれる。
例えばセルラーゼは、β−グルコシダーゼ、エンドグルカナーゼ、又はセロビオヒドロラーゼポリペプチドである。セルラーゼは、例えば全セルラーゼ調製物の形態であっても良い。ヘミセルラーゼは、例えばキシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ、又はアクセサリタンパク質である。特定の実施形態では、全セルラーゼ調製物は、ヘミセルラーゼポリペプチドを１つ以上含み得る。
発酵培地は、不完全的な糖化プロセスにより生じるものであってよく、又は糖化生成物を特定の量含むものであってよい。このような組成物は、ＡＸＰ化合物、例えば、ＭＸＰ、ＥＸＰ、ＰＸＰ、又はＢＸＰを生成させるような条件下で、糖化反応、例えばＳＳＦ反応に好適に使用することができる。
特定の態様では、１つ以上のセルラーゼ又は１つ以上のヘミセルラーゼは、微生物を遺伝子組み換えすることで生成される。この遺伝子組み換えで、１つ以上の（天然β−キシロシダーゼの遺伝子が１つ以上存在する場合）天然β−キシロシダーゼをコードしている遺伝子が過剰発現することになり、あるいは外来β−キシロシダーゼをコードしている遺伝子が導入され及び／又は発現されることになる。特定の実施形態では、１つ以上のセルラーゼ及び／又は１つ以上のヘミセルラーゼを生成するよう遺伝子操作した微生物では、保持型β−キシロシダーゼの発現活性が、同様の遺伝子操作を行わなかった対照微生物よりも増加している。特定の実施形態では、１つ以上のセルラーゼ及び／又は１つ以上のヘミセルラーゼを生成するよう遺伝子操作した微生物は、反転型β−キシロシダーゼを含まず、又は検出可能な反転型β−キシロシダーゼ活性を有さない。
特定の関連する態様では、本開示は、ＡＸＰ生成物を得るために、キシラン含有バイオマスでＳＳＦ反応を実施するための改良法に関連し、方法は、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び発酵微生物を少なくとも１つ含む発酵培地を培養することを含み、ここで、改良法には、天然β−キシロシダーゼ遺伝子を過剰発現するか、外来β−キシロシダーゼ遺伝子を発現するよう遺伝子操作したトリコデルマ・リーゼイ細胞から作製した、セルラーゼ調製物を使用することを含む。一部の実施形態では、過剰発現させる天然β−キシロシダーゼ遺伝子、又は発現させる外来β−キシロシダーゼ遺伝子は、保持型β−キシロシダーゼ遺伝子をコードしている遺伝子である。
本明細書に引用されるすべての刊行物、特許、特許公報、ＧｅｎＢａｎｋ配列及びＡＴＣＣ寄託物は、あらゆる目的のため、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
表１：ＳＳＦ条件下での、ザイモモナス・モビリス組み換え体による、トウモロコシの穂軸及びグルコース／キシロースからのＥＸＰ生成。表２：様々な種類のバイオマス基質を用いるＥＸＰ生成。
表３：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（「ＭＦ，」５６０μｇ／ｍＬ）及び精製Ｆｖ４３Ｄ（３６μｇ／ｍＬ）又はＦｖ３Ａ（５４μｇ／ｍＬ）の存在下、４６℃での、キシロビオース（２０ｍｇ／ｍＬ）／５０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ ４．７）＋０．９ＭのＥｔＯＨからの、ＥＸＰ及び／又はキシロース生成の経時変化（ＲＩ面積として記載，ｍｇ／ｍＬに比例する）。
表４：ｂｘｌ１欠失カセットを作製するためのプライマー配列。表５：Ｆ．ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｏｉｄｅｓ β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄの発現カセットを作製するためのプライマー配列。
表６：ＳＳＦ反応で使用される特定の酵素に関する配列番号の要約を提供する。
表６の続き 図１：キシロース（１０ｍｇ／ｍＬ）／５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ ４．６）＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（１．３５ｍｇ／ｍＬ）に、アルコール無添加、各０．７２Ｍで、エタノール添加（「ＥｔＯＨ」）、メタノール添加（「ＭｅＯＨ」）、又はｎ−プロパノール（「ｎ−ＰｒＯＨ」）添加し、４６℃にて４８時間インキュベーションした後に採取した試料の、ＨＰＬＣクロマトグラム。ＨＰＬＣ条件：ＨＰＸ−８７Ｈカラム，６０℃，０．６０ｍＬ／分０．０１Ｎ Ｈ２ＳＯ４，ＲＩ検出。
図２：図１の実験に記載されるものと同様の条件下での外観／アルキル−キシロピラノシド（「ＡＸＰ」）生成の経時変化。生成される発酵生成物の量を、生成物のピーク面積とキシロースのピーク面積とを比較する比として表わす。
図３：エチル−β−キシロピラノイドの存在を示すＮＭＲスペクトル。
図４：ＳＳＦ条件下での、酵母及び野生型ザイモモナス・モビリスによるＥＸＰ生成。
図５：トリコデルマ・リーゼイのＢｘｌ１を添加した場合及び未添加だった場合の、酵母ＳＳＦ条件下でのＥＸＰ生成。
図６：組み換えザイモモナスＳＳＦ条件下で、組み込みトリコデルマ・リーゼイ株２２９から生成された酵素複合体に、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１を加えた後のＥＸＰ用量反応。
図７：糖化用の下記酵素構成／混合物によるＳＳＦ反応時のＥＸＰ生成：Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００（「Ａ１５００」）＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００（「Ａ１５００」）＋ＸｌｎＡ、及びトリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９により生成された酵素複合体に加えヘミセルラーゼ（Ｆｖ３Ａ，Ｆｖ５１Ａ，又はＢｘｌ１）。
図８：ＳＳＦ反応時に、糖化用に、様々な精製セルラーゼ酵素及びＸｙｎＢ３を用いる、ＥＸＰ生成。
図９：ＳＳＦ反応時に、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１の存在下で、又は他のＧＨ４３ファミリーの特定のβ−キシロシダーゼ酵素の存在下で、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９から生成される酵素複合体を用いるＥＸＰ生成。
図１０：組み換えザイモモナスＳＳＦ条件下で、Ｆｖ４３Ｄの添加により観察される、ＥＸＰ生成の減少。
図１１：酵母ＳＳＦ条件下で、Ｆｖ４３Ｄの添加により観察される、ＥＸＰ生成の減少。
図１２：組み換えザイモモナスＳＳＦ条件下で、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋ＸｌｎＡ、及びトリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９から生成された酵素複合体、にＦｖ４３Ｄを加えた後に観察されるＥＸＰ生成の減少。
図１３：精製セルラーゼ酵素及びＸｙｎＢ３にＦｖ４３Ｄを加えた後に観察されるＥＸＰ生成の減少。
図１４Ａ：組み換えザイモモナスＳＳＦ条件下で、酵素組成物すなわちトリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９から生成されるブレンド＋トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１にＦｖ４３Ｄを添加することによる、ＥＸＰ減少用量反応を示す。図１４Ｂ：組み換えザイモモナスＳＳＦ条件下で、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９から生成された酵素複合体＋トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１にＦｏ４３Ａ又はＧｚ４３Ａを添加した後の、ＥＸＰの減少を示す。
図１５：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（５６０μｇ／ｍＬ）及び精製Ｆｖ４３Ｄ（３６μｇ／ｍＬ）及びＦｖ３Ａ（５４μｇ／ｍＬ）の存在下、４６℃での、キシロビオース（２０ｍｇ／ｍＬ）／５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ ４．７）＋０．９Ｍエタノールからのキシロース及びＥＸＰ生成の経時変化（ＲＩ面積として記載，ｍｇ／ｍＬに比例する）。
図１６：Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（５６０μｇ／ｍＬ）及びＦｖ４３Ｄ（３６μｇ／ｍＬ）及びＦｖ３Ａ（５４μｇ／ｍＬ）の存在下、４６℃での、キシロビオース（２０ｍｇ／ｍＬ，左側）又はキシロースオリゴマー（２０ｍｇ／ｍＬ，右側）／５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ ４．７）＋０．９Ｍエタノールからのキシロース及びＥＸＰ生成の経時変化。結果は、ＥＸＰの量対生成されたキシロースの量比として表される。
図１７：ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ，Ｂｘｌ１欠失，ｈｐｈ−ｌｏｘＰのプラスミドマップ。
図１８：ＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄのプラスミドマップ。
図１９Ａ：Ｆｖ４３Ｄ核酸配列（配列番号１）。図１９Ｂ：Ｆｖ４３Ｄアミノ酸配列（配列番号２）。配列番号２は、未成熟なＦｖ４３Ｄ配列である。Ｆｖ４３Ｄは、配列番号２の残基１〜２０（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２の残基２１〜３５０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予測される保存ドメイン残基を、ボールド体で示す。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２０Ａ：トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１核酸配列（配列番号３）。
図２０Ｂ：トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１アミノ酸配列（配列番号４）。シグナル配列には下線を付ける。予想される保存ドメイン残基はボールド体で記載する。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２１Ａ：Ｆｖ３Ａ核酸配列（配列番号５）。
図２１Ｂ：Ｆｖ３Ａアミノ酸配列（配列番号６）。配列番号６は、未成熟なＦｖ３Ａ配列である。Ｆｖ３Ａは配列番号６の残基１〜２３（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号６の残基２４〜７６６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予測される保存ドメイン残基を、ボールド体で示す。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２２Ａ：Ｐｆ４３Ａ核酸配列（配列番号７）。図２２Ｂ：Ｐｆ４３Ａアミノ酸配列（配列番号８）。配列番号８は未成熟なＰｆ４３Ａ配列である。Ｐｆ４３Ａは、配列番号８の残基１〜２０（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号８の残基２１〜４４５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予想保存ドメイン残基はボールド体で記載し、予想炭水化物結合モジュール（「ＣＢＭ」）残基は大文字で記載し、ＣＤ及びＣＢＭを分離する予想リンカーをイタリック体で記載する。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２３Ａ：Ｆｖ４３Ｅ核酸配列（配列番号９）。
図２３Ｂ：Ｆｖ４３Ｅアミノ酸配列（配列番号１０）。配列番号１０は、未成熟なＦｖ４３Ｅ配列である。Ｆｖ４３Ｅは、配列番号１０の残基１〜１８（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１０の残基１９〜５３０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予測される保存ドメイン残基を、ボールド体で示す。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２４Ａ：Ｆｖ４３Ｂ核酸配列（配列番号１１）。図２４Ｂ：Ｆｖ４３Ｂアミノ酸配列（配列番号１２）。配列番号１２は、未成熟なＦｖ４３Ｂ配列である。Ｆｖ４３Ｂは、配列番号１２の残基１〜１６（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１２の残基１７〜５７４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予測される保存ドメイン残基を、ボールド体で示す。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２５Ａ：Ａｆ４３Ａ核酸配列（配列番号１３）。図２５Ｂ：Ａｆ４３Ａアミノ酸配列（配列番号１４）。配列番号１４は、未成熟なＡｆ４３Ａ配列である。Ａｆ４３Ａが予想シグナル配列を有さないことは、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズム（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）の使用により導くことができる。予測される保存ドメイン残基を、ボールド体で示す。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２６Ａ：Ｆｖ５１Ａ核酸配列（配列番号１５）。
図２６Ｂ：Ｆｖ５１Ａアミノ酸配列（配列番号１６）。配列番号１６は、未成熟なＦｖ５１Ａ配列である。Ｆｖ５１Ａは、配列番号１６の残基１〜１９（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１６の残基２０〜６６０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予想Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ保存ドメイン残基をボールド体で記載する。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２７Ａ：トリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３核酸配列（配列番号１７）。 図２７Ｂ：トリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３アミノ酸配列（配列番号１８）。配列番号１８は、未成熟なトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３配列である。トリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３は、配列番号１８の残基１〜１６（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１８の残基１７〜３４７に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予想される保存ドメイン残基はボールド体で記載する。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図２８Ａ：ＸｌｎＡ核酸配列（配列番号１９）。図２８Ｂ：ＸｌｎＡアミノ酸配列（配列番号２０）。配列番号２０は、未成熟なＸｌｎＡタンパク質配列である。ＸｌｎＡは、配列番号２０の残基１〜２７（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２０の残基２８〜２１１に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。配列番号１９は、ＸｌｎＡのゲノム配列である。開始及び終止コドン残基を図２８Ａにボールド体で記載し、ＸｌｎＡ遺伝子のイントロンＡを図２８Ａに下線付で記載する。
図２９：グルコースの「α」及び「β」アノマーの立体配置を示す。アノマーは、アノマー炭素の環外酸素原子と、多くの場合環内で最も遠いキラル中心である、立体配置を構成する原子に結合している酸素（糖をＤ又はＬ糖として定義する）との立体化学の関係に基づいて、「α」又は「β」型として識別される。αアノマーは、同様の配置を有するこれらの２つの配置のうちの１つである。これらはβアノマーとは反対のものである。したがって、α−Ｄ−グルコースの構造は、Ｃ１及びＣ５の両方が同様の立体化学を有するのに対し、β−Ｄ−グルコースは、Ｃ５に対しＣ１が反対側にある立体化学を有する。
図３０Ａ：Ｇｚ４３Ａ核酸配列（配列番号２１）。図３０Ｂ：Ｇｚ４３Ａアミノ酸配列（配列番号２２）。配列番号２２は、未成熟なＧｚ４３Ａ配列である。Ｇｚ４３Ａは、配列番号２２の残基１〜１８（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２２の残基１９〜３４０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予測される保存ドメイン残基を、ボールド体で示す。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図３１Ａ：Ｆｏ４３Ａ核酸配列（配列番号２３）。図３１Ｂ：Ｆｏ４３Ａアミノ酸配列（配列番号２４）。配列番号２４は、未成熟なＦｏ４３Ａ配列である。Ｆｏ４３Ａは、配列番号２４の残基１〜２０（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２４の残基２１〜３４８に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。予測される保存ドメイン残基を、ボールド体で示す。ドメイン予想は、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、又はＮＣＢＩデータベースに基づいて実施した。
図３２−１：ＧＨ４３ファミリーの加水分解酵素のアラインメント。ファミリーメンバー間で高度に保存されたアミノ酸残基をボールド体でかつ下線付けして示す。
図３２−２：ＧＨ４３ファミリーの加水分解酵素のアラインメント。ファミリーメンバー間で高度に保存されたアミノ酸残基をボールド体でかつ下線付けして示す。
図３３：ＸｙｎＢ３アミノ酸配列（配列番号２５）。
図３４：トリコデルマ・リーゼイＢｇｌ１アミノ酸配列（配列番号４５）。シグナル配列には下線を付ける。予想される保存ドメイン残基はボールド体で記載する。コード配列は、Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９（６）：５６２〜５６７に記載される。
図３５Ａ：ＸｌｎＤ核酸配列（配列番号３９）。
図３５Ｂ：ＸｌｎＤアミノ酸配列（配列番号４０）。配列番号４０は、未成熟なＸｌｎＤ配列である。ＸｌｎＤは、配列番号４０の残基１〜１７（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４０の残基１８〜８０４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。
図３６Ａ：Ｆｖ３０Ａ核酸配列（配列番号４１）。
図３６Ｂ：Ｆｖ３０Ａアミノ酸配列（配列番号４２）。配列番号４２は、未成熟なＦｖ３０Ａ配列である。Ｆｖ３０Ａは、配列番号４２の残基１〜１９（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４２の残基２０〜５３７に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。
図３７Ａ：Ｆｖ３０Ｂ核酸配列（配列番号４３）。
図３７Ｂ：Ｆｖ３０Ｂのアミノ酸配列（配列番号４４）。配列番号４４は、未成熟なＦｖ３０Ｂ配列である。Ｆｖ３０Ｂは、配列番号４４の残基１〜２４（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４４の残基２５〜４８５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。
図３８Ａ：Ｆｖ３９Ａ核酸配列（配列番号４５）。
図３８Ｂ：Ｆｖ３９Ａのアミノ酸配列（配列番号４６）。配列番号４６は、未成熟なＦｖ
３９Ａ配列である。Ｆｖ３９Ａは、配列番号４６の残基１〜１９（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４６の残基２０〜４３９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。
図３９Ａ：Ｆｖ３９Ｂ核酸配列（配列番号４７）。
図３９Ｂ：Ｆｖ３９Ｂアミノ酸配列（配列番号４８）。配列番号４８は、未成熟なＦｖ３９Ｂ配列である。Ｆｖ３９Ｂは、配列番号４８の残基１〜１８（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４８の残基１９〜４５６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。
図４０Ａ：ＸｙｎＢ核酸配列（配列番号４９）。
図４０Ｂ：ＸｙｎＢアミノ酸配列（配列番号５０）。ＸｙｎＢは、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズム（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）により予想されるシグナル配列を有さない。
図４１Ａ：ＸｙｌＡ核酸配列（配列番号５１）。
図４１Ｂ：ＸｙｌＡアミノ酸配列（配列番号５２）。ＸｙｌＡは、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズム（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）から予想されるシグナル配列を有さないが、Ｕｎｉｐｒｏｔアルゴリズム（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ）から予想されるシグナル配列（配列番号５２の残基１〜１８に相当する（下線部））は有する。シグナル配列の切断により、配列番号５２の残基１９〜７０５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
図４２Ａ：Ｘｙｌ１核酸配列（配列番号５３）。
図４２Ｂ：Ｘｙｌ１アミノ酸配列（配列番号５４）。配列番号５４は、未成熟なＸｙｌ１配列である。Ｘｙｌ１は、配列番号５４の残基１〜２１（下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号５４の残基２２〜５００に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。シグナル配列予想は、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより行った（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）。
図４３Ａ：ｂｘｌ１−トリコデルマ・リーゼイ株２２９を使用した、ＳＳＦ反応１日目で測定されたＥＸＰ及びエタノール濃度。ＳＳＦ反応には、精製トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１のキシラン０．５又は１．５ｍｇ／ｇを添加し、あるいは精製Ｆｖ４３Ｄのキシラン１ｍｇ／ｇを添加した。
図４３Ｂ：ｂｘｌ１−トリコデルマ・リーゼイ株２２９を使用した、ＳＳＦ反応３日目で測定されたＥＸＰ及びエタノール濃度。ＳＳＦ反応には、精製トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１のキシラン０．５又は１．０ｍｇ／ｇを添加し、あるいは精製Ｆｖ４３Ｄのキシラン１ｍｇ／ｇを添加した。ＳＳＦ反応の条件は、以下実施例６に記載する。
本明細書で使用する略記の意味を以下に記載する：「分（min）」は「分（minute）」を意味する。「分（mins）」は「分（minutes）」を意味する。「時間（hr）」は「時間（hour）」を意味する。「時間（hrs）」は「時間（hours）」を意味する。「日（d）」は「日（day（s））」を意味する。「μＬ」は「マイクロリットル」を意味する。「ｍＬ」は「ミリリットル」を意味する。「Ｌ」は「リットル」を意味する。「ｎｍ」は「ナノメートル」を意味する。「ｍｍ」は「ミリメートル」を意味する。「ｃｍ」は「センチメートル」を意味する。「μｍ」は「マイクロメートル」を意味する。「ｍＭ」は「ミリモル濃度」を意味する。「Ｍ」は「モル濃度」を意味する。「ｍｍｏＬ」は「ミリモル」を意味する。「μｍｏｌｅ」は「マイクロモル」を意味する。「ｇ」は「グラム」を意味する。「μｇ」は「マイクログラム」を意味する。「ｍｇ」は「ミリグラム」を意味する。「ｋｇ」は「キログラム」を意味する。「ＲＰＭ」又は「ｒｐｍ」は「毎分回転」を意味する。「体積％（vol.%）」は「体積％（volume %）」を意味する。「重量％（wt.%）」は「重量％（weight %）」を意味する。「ＲＰＳ」は、「毎秒回転」を意味する。
６．１．共通の定義
別段の記載がない限り、本明細書に引用されるすべての米国特許及び米国特許出願は、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、又は好ましい上限値、又は好ましい下限値として与えられるとき、具体的に開示するすべての範囲又は数は、これらの範囲内で連続して形成されることは明白である。本明細書において数値範囲が引用される場合、別段の記載が無い限り、範囲は範囲の終点並びに範囲内のすべての整数及び分数を包含することが意図される。制限する範囲が引用された場合、本発明の範囲を具体的な値に限定することを意図しない。
本明細書で使用するとき、本発明の要素又は成分の前方に置かれる冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、要素又は成分の数の例（例えば、存在）に関し非限定的なものであることが意図される。したがって、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、１つ又は少なくとも１つを包含するものとして読み取られるべきであり、かつ要素又は成分の単数形も、数が明確に単数を示すものとして意味されない限り複数も包含し得る。
本明細書で使用するとき、用語、「含む（comprising）」は、請求項で参照されるような規定の特徴、整数、工程、又は要素が存在することを意味するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、要素又は群の存在又は追加を排除するものではない。用語、「含む（comprising）」には、用語、「本質的にこれからなる（consisting essentially of）」及び「からなる（consisting of）」により包含される実施形態を含むことを意図する。同様にして、用語、「本質的にこれからなる（consisting essentially of）」は、用語「からなる（consisting of）」により包含される実施形態を含むことが意図される。
本明細書で使用するとき、成分又は反応物質の量を、あるいは本発明のパラメータ量を修飾する用語、「約」は、例えば現実世界で濃度又は溶液を調製するのに使用される一般的な測定法及び液体操作手順により生じ得る、これらの手順における想定外の誤差により生じ得る、組成物を調製又は方法を実行するために使用される材料の製造元、供給源、又は純度により生じ得る、並びに同様のものにより生じ得る、数量偏差を指す。用語、「約」には、具体的な開始混合物から得られる組成物の異なる平衡条件に起因して異なる量も、包含する。用語、「約」による修飾の有無に関わらず、請求項には、「約」が引用された場合に相当する量を包含する。
用語、「同時糖化発酵」又は「ＳＳＦ」は、典型的には同じ反応容器内で、すべての生成物が同時に生成されるよう、バイオマスが糖化され、かつ糖化により生成された発酵性糖が酵素及び／又は発酵微生物により使用される、プロセス又は反応構成を指す。
用語、「糖化及び発酵ハイブリッド法」又は「ＨＳＦ」は、バイオマスが限られた範囲内で糖化（不完全にすなわち部分的に糖化）され、次いで連続して糖化及び発酵が同時に生じるプロセス又は反応構成を指す。
用語、「別個の糖化及び発酵」、「別個の加水分解及び発酵」及び「ＳＨＦ」は、本明細書において互換的に使用される。これらは、バイオマスが、糖化され又は加水分解されることで実質的に完了し（例えば、約６０％以上完了する、約７０％以上完了する、約８０％以上完了する、約９０％以上完了する、又は約９５％以上完了する）、又は完了し（例えば、約９９％以上完了する、又は所定の糖化反応により放出されるすべての発酵性糖が放出されるといったように約１００％完了する）、後に、糖化又は加水分解工程により生成される発酵糖を発酵させて発酵生成物を生成する、別個の明らかに区別できる発酵工程が続く、プロセス又は反応構成を指す。
用語、「発酵性糖」は、発酵プロセス時に微生物により炭素供給源として使用され得るオリゴ糖及び単糖を指す。
用語、「不完全糖化」は、実施された糖化が完了した場合に放出されることになる発酵性糖の合計量よりも少ない量で発酵性糖が放出される、バイオマスの限定的な糖化を指す。
用語、「セルロース性」は、セルロース及び追加成分（例えばヘミセルロース）を含む組成物を指す。
用語、「糖化」は、多糖類又は多糖類含有材料からの発酵性糖の生成を指す。
用語、「バイオマス」は、セルロースを含む材料を含み、及び所望により更にヘミセルロース、リグニン、デンプン、オリゴ糖、及び／又は単糖を含む、任意のセルロース系又はリグノセルロース系材料を指す。バイオマスはタンパク質及び／又は脂質などの追加の成分も含む。バイオマスは、単一の供給源由来のものであってよく、又はバイオマスは１つ以上の供給源に由来する混合物を含むこともできる。例えば、バイオマスは、トウモロコシ穂軸及びトウモロコシ茎葉の混合物、あるいは草及び葉の混合物を含むものであり得る。バイオマスとしては、限定するものではないが、バイオエネルギー作物、農業廃棄物、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙の際に出るスラッジ、庭ごみ、森林廃棄物が挙げられる。バイオマスの例としては、限定するものではないが、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシの皮、トウモロコシ茎葉、草、小麦、麦わら、大麦わら、乾草、稲わら、スイッチグラス、紙ゴミ、サトウキビバガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本、エレファントグラス、茅、杉、穀物のミリングにより得られる成分、樹木、枝、根、葉、木片、おがくず、潅木及び低木の茂み、野菜、果実、花及び動物肥料が挙げられる。
用語、「糖化酵素」は、発酵性糖へのバイオマス成分の変換を触媒することのできる酵素を指す。多くの場合、酵素は、バイオマスを前処理した場合に発酵性糖を生成するのにより有効なものである。
６．２．発明を実施するための形態
セルロース系材料からの物質、すなわち発酵生成物の生成は、典型的には３つの主要な工程を包含する。これらの３つの工程とは、（１）前処理すなわち前加水分解工程、（２）酵素加水分解すなわち糖化工程、並びに（３）発酵、であり、発酵後に物質、すなわち発酵生成物を回収することができる。以下の例示はエタノール生成プロセスに関するものであるが、他の物質を生成するために類似のプロセスを使用できることは明らかである。
前処理。前処理すなわち前加水分解工程において、セルロース系材料（例えば、リグノセルロース系材料が挙げられる）を加熱してリグニン及び炭水化物の構造を破壊し、ほとんどのヘミセルロースを可溶化させることで、セルロース分解酵素をセルロースフラクションに作用させる。蒸気を用いて直接的に、あるいは反応を促進させるために所望により材料に触媒を添加したスラリー又は混合物に、加熱工程を実施する。例えば、好適な触媒としては、硫酸及びＳＯ２などの強酸、又は水酸化ナトリウムなどの強塩基が挙げられる。前処理工程は、酵素及び微生物の浸透を促進する。様に、セルロース系バイオマスでも水蒸気爆砕による前処理を実施できる（例えば、米国特許公報第２００２／０１６４７３０号を参照されたい）。
糖化。糖化工程としても既知である、酵素加水分解工程において、前処理した材料に本明細書に記載の酵素を加え、セルロースフラクションをグルコース及び／又は他の糖に変換する。概して、糖化工程は、制御されたｐＨ、温度、及び混合条件下で、撹拌槽リアクタ又は発酵槽中で実施される。糖化工程は、特定の場合では最長２００時間続く。糖化は、約３０℃〜約６５℃の温度、特に約５０℃で、かつ約４〜約５のｐＨ、特にｐＨ約４．５で実施することができる。真菌（例えば、酵母又は糸状菌）又はバクテリア（例えば、ザイモモナス・モビリス又はクロストリジウム・サーモセラム）などの発酵微生物により代謝させることのできるグルコースを生成するために、典型的にはβ−グルコシダーゼの存在下で酵素加水分解工程を実施する。
発酵。前処理及び酵素加水分解工程の結果として、セルロース系材料から放出される糖は、発酵工程において、真菌（例えば、酵母又は糸状菌）又はバクテリア（例えば、ザイモモナス・モビリス又はクロストリジウム・サーモセラム）などの発酵微生物により、エタノール（又は他の物質）へと発酵する。
ＳＳＦ。本開示は、反応の収率を改善するための方法及び組成物を提供し、本開示の発酵工程は、酵素加水分解工程後の別個のすなわち分離した工程としてではなく、同じ容器内で、好ましくは制御されたｐＨ、温度、及び混合条件下で酵素加水分解工程と同時に実施される。特定の態様では、糖化及び発酵は、同時糖化発酵すなわち「ＳＳＦ」として同じ容器内で同時に実施される。本明細書に記載のこのプロセスは、「糖化及び発酵ハイブリッド法」すなわち「ＨＳＦ」構成を用いて実施するプロセスも包含する。特定の態様では、ＳＳＦ反応は、バイオマスの３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満が糖化された際に（例えば、糖化反応させるための発酵微生物を添加することで、又は発酵に好ましい条件設定を設立することで）開始される。本明細書で使用するとき、用語、「ＳＳＦ」には複数の糖の共発酵も包含する（Ｓｈｅｅｈａｎ ａｎｄ Ｈｉｍｍｅｌ，１９９９，Ｅｎｚｙｍｅｓ，ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：Ａ ｓｔｒａｔｅｇｉｃ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｎｅｒｇｙ’ｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５：８１７〜８２７）。
６．３酵素加水分解
高等植物の細胞壁は、様々な炭水化物ポリマー（ＣＰ）成分から構成される。これらのＣＰ成分は、共有結合及び非共有結合により相互作用し、堅固な細胞壁を形成しかつ膨圧に耐えるのに必要とされる構造一体性を植物にもたらす。植物に見られる主なＣＰはセルロースであり、セルロースは植物細胞壁の構造骨格を形成する。セルロースの生合成時に、ポリ−β−１，４−Ｄ−グルコース鎖は水素結合及び疎水性相互作用により自己集合してセルロースミクロフィブリルを形成し、セルロースミクロフィブリルは更に自己集合してより大きな繊維を形成する。セルロースミクロフィブリルはある程度不規則な繊維であり、かつ結晶化度の異なる領域を含有する。セルロースフィブリルの結晶化度は、任意の２本のセルロース鎖構成要素間の水素結合が、どれだけ緊密であるかによって変化する。結合密度がより疎である、すなわちグルコース鎖をより利用しやすい領域は、非晶質領域と呼ばれる。
セルロースをグルコースへと変換又は解重合させるための一般モデルには３種類の酵素活性が包含される。エンドグルカナーゼはセルロース鎖の内部を切断してより短いセルロース鎖を生成し、次いでエキソグルカナーゼにより作用させることのできる末端数を増加させる。エキソグルカナーゼは、より短いセルロース鎖の還元末端又は非還元末端のいずれにも特異的であり、かつグルコース二量体であるセロビオースを遊離させることができる。エキソグルカナーゼの例としては、限定するものではないが、様々なセロビオヒドロラーゼが挙げられる。蓄積されたセロビオースを次いでセロビアーゼにより切断し、グルコースを生成する。セロビアーゼの例としては、限定するものではないが、様々なβ−１，４−グルコシダーゼが挙げられる。
ヘミセルロースは、無水グルコースを含有するセルロース由来の、異なる糖モノマーの組を含有する。例えば、ヘミセルロース中の、グルコース以外の糖モノマーとしては、キシロース、マンノース、ガラクトース、ラムノース、及びアラビノースを挙げることができる。ヘミセルロースは主にＤ型の五炭糖を含有し、場合によりＬ型の糖も少量含有する。キシロースは最も多量に存在する糖モノマーであるが、マンヌロン酸及びガラクツロン酸も存在する傾向がある。ヘミセルロースには、例えば、キシラン、グルクロンオキシラン、アラビノキシラン、グルコマンナン、及びキシログルカンが包含される。
本開示の酵素及び多酵素組成物は、ヘミセルロース材料、例えば、キシラン、アラビノキシラン、及びキシラン−若しくはアラビノキシラン−含有物質の糖化に有用である。アラビノキシランはキシロース及びアラビノースからなる多糖であり、Ｌ−α−アラビノフラノース残基が分岐点としてβ−（１，４）−結合キシロースポリマー主鎖に結合している。
ほとんどのバイオマス供給源がセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、リグニン、タンパク質、及び灰、その他の成分を含有し得る複雑なものであることから、特定の態様では、本開示の酵素ブレンドには、効率的な方法でバイオマスを発酵性の糖に分解するために協働する基質特異性範囲を有する酵素を含有させることができる。リグノセルロース糖化に関する多酵素複合物の一例には、セロビオヒドロラーゼ類、キシラナーゼ類、エンドグルカナーゼ類、β−グルコシダーゼ類、β−キシロシダーゼ類、及び所望により様々なアクセサリタンパク質の混合物を含む。
したがって、本開示は、エタノールなどの発酵生成物を生成させるためのＳＳＦ反応時に、発酵性微生物（１つ又は複数）によりエネルギー源として使用することのできる炭水化物を個別に又は全体で生成することのできる１つ以上の酵素を使用することを企図する。
特定の態様では、多酵素組成物は、炭水化物、又は炭水化物を含有しているバイオマス基質を加水分解して、糖を生成するためにＳＳＦ反応に使用する。生成された糖は、ＳＳＦ反応において、発酵微生物により発酵される。多酵素組成物（製造製品を含む酵素アンサンブル又は「ブレンド」）が含む酵素混合物（すなわち「ブレンド」）は、特定の態様では、天然に生じるものではない。本明細書で使用するとき、用語、「ブレンド」は以下の（１）〜（５）を指す：
（１）酵素成分を組み合わせることで、発酵ブロスの形態、あるいは不完全又は完全に単離又は精製されたポリペプチドの形態、のいずれかで作製される、組成物。
（２）１つ以上の酵素成分を発現するよう改変された微生物により生成される、組成物。所望により、この微生物は、１つ以上の遺伝子が欠失するか、又は１つ以上の遺伝子生成物が不活性化されるよう改質することができ、前出の遺伝子は、キシラン加水分解、ヘミセルロース加水分解、及び／又はセルロース加水分解に影響を与えるタンパク質をコードするものである。
（３）ＳＳＦ反応時に、酵素成分を同時に、別個に、又は連続して組み合わせることで作製される組成物。並びに
（４）その場で、例えばＳＳＦ反応時に生成される、酵素混合物。
（５）上記（１）〜（４）のいずれか又はすべてのものの組み合わせ。
同様に、本明細書に具体的に記載されるいずれの酵素も、多酵素組成物を生成するために、本明細書に記載の任意の１つ以上の酵素又は任意のその他の利用可能でかつ好適な酵素と組み合わせることができることも理解される。本開示は、本明細書に記載又は例示した具体的な組み合わせ例に制限されず、又は限定されない。
本開示の方法では、発酵微生物（１つ又は複数）の増殖中又は増殖後を含む、ＳＳＦ反応の前又はＳＳＦ反応中に、本明細書に記載の任意の酵素（１つ又は複数）を加えることができる。酵素は、別個に、酵素ブレンドとして、あるいは発酵ブロスなどとして加えることができる。
本明細書で参照される酵素は、例えばバクテリア、真菌、酵母、又は哺乳類由来のものを含む、任意の好適な供給源由来のものであってよく、あるいは任意の好適な供給源から得ることができる。用語「得られる」は、天然酵素として酵素を自然に生成する微生物から前出の酵素を単離できること、あるいは遺伝子組み換え法を用い宿主生物で前記酵素を生成できること、を意味する。組み換え法を用い生成する酵素は、宿主生物にとって天然ものであるか、あるいは外来的なものであるかのいずれかであり、例えば１つ以上のアミノ酸が欠失、挿入及び／又は置換された、改質アミノ酸配列を有し、あるいは当該技術分野において既知の核酸シャッフリング法により生成される酵素である。例えば、組み換え法により生成した酵素は、天然アミノ酸配列の変異体及び／又は断片であってよい。「天然酵素」は、微生物のゲノム中の自然な位置に遺伝子生成物を包含すること、並びに同様に自然な変異体を包含することを意味する。「外来酵素」は、宿主生物では通常見出されないが、遺伝子導入により宿主生物に導入された遺伝子の、遺伝子生成物、あるいは非天然微生物又は合成遺伝子に挿入した、部位特異的変異導入又はシャッフリング法などによる組み換え法で得られる酵素を含有する遺伝子の、遺伝子生成物を包含することを意味する。
特定の態様では、酵素は精製品であってよい。本明細書で使用するとき、酵素、タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び他の成分などの物質を修飾する用語、「精製した（purified）」は、酵素が、酵素を誘導した微生物に由来する他の成分を含まない、又は実質的に含まないことを指す。特定の態様では、用語「精製した」は、酵素が、酵素を得た天然微生物に由来する成分を含まない、又は実質的に含まない状況も包含する。酵素は、「精製した」ものとしてみなすことができるが、依然として微量の他のタンパク質と会合しており又は微量の他のタンパク質が存在している。本明細書で使用するとき、用語、「他のタンパク質」は、具体的には他の酵素を指す。本明細書で使用するとき、用語、「精製」は、他の成分を除去すること、特に、他のタンパク質、より具体的には、本開示の酵素を生成する細胞中に存在する他の酵素を除去することも指す。したがって、酵素は例えば、他の成分を実質的に含まない「実質的に純粋なポリペプチド」であり得る。所定の酵素が生成される微生物は、例えば、組み替え法により酵素を生成するのに好適な宿主生物であり得る。例えば、実質的に純粋なポリペプチドは、成分として含有される混合物中に、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、９０重量％以上、９５重量％以上、９８重量％以上、又は９９重量％以上の濃度でポリペプチドが存在していることを指すことができる。他の成分を実質的に含まないポリペプチドは、混合物中に、他の成分が４０重量％未満、３０重量％未満、２０重量％未満、１０重量％未満、５重量％未満、２重量％未満又は１重量％未満含有されるものである。
６．３．１．セルラーゼ
本開示の酵素ブレンドは、１つ以上のセルラーゼを含み得る。セルラーゼは、セルロース（β−１，４−グルカン又はβ−Ｄ−グルコシド結合）を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖、及び同様物などを生成する酵素である。セルラーゼは、慣習的に３つの主要な部類：エンドグルカナーゼ（ＥＣ ３．２．１．４）（「ＥＧ」）、エキソグルカナーゼ又はセロビオヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．９１）（「ＣＢＨ」）、並びにβ−グルコシダーゼ（β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ；ＥＣ ３．２．１．２１）（「ＢＧ」）に分類される（Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５（９）：２５５〜２６１，ａｎｄ Ｓｃｈｕｌｅｉｎ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６０：２３４〜２４２）。エンドグルカナーゼが主にセルロース繊維の非晶質部位に作用するのに対し、セロビオヒドロラーゼは結晶質のセルロースを分解することができる。
本開示の方法及び組成物に従って使用するセルラーゼは、特に、１つ以上の以下の微生物から得ることができる：クリニペリス・スカペラ（Crinipellis scapella）、マクロフォミナ・ファゼオリナ（Macrophomina phaseolina）、マイセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ソルダリアフィミコラソルダリアフィミコラ（Sordaria fimicola）、ボルテラ・コッレトトリコイド（Volutella colletotrichoides）、チエラビア・テレストリス（Thielavia thermophila）、アクレモニウムｓｐ．（Acremonium sp.）、ヒメキクラゲ（Exidia glandulosa）、ツリガネタケ（Fomes fomentarius）、スポンジペリスｓｐ．（Spongipellis sp.）、リゾフリクティス・ロゼア（Rhizophlyctis rosea）、リゾムコール・プシラス（Rhizomucor pusillus）、サイコマイセス・ニテウス（Phycomyces niteus）、ケトスチラム・フレセニイ（Chaetostylum fresenii）、ディプロディア・ゴシピナ（Diplodia gossypina）、ウロスポラ・ビルグラミ（Ulospora bilgramii）、サッコボルス・ジルテルス（Saccobolus dilutellus）、ペニシリウム・ベルクロサム（Penicillium verruculosum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、サーモマイセス・ヴェルコサス（Thermomyces verrucosus）、ディアポルテ・シンゲネシア（Diaporthe syngenesia）、コレトトリカム・ラゲナリウム（Colletotrichum lagenarium）、ニグロスポラｓｐ．（Nigrospora sp.）、キシラリア・ヒポキシロン（Xylaria hypoxylon）、ネクトリア・ピネア（Nectria pinea）、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）、チエラビア・サーモフィラ（Thielavia thermophila）、ケトミウム・モロラム（Chaetomium mororum）、ケトミウム・ビレッセンス（Chaetomium virscens）、ケトミウム・ブラジリエンシス（Chaetomium brasiliensis）、ケトミウム・クニコロラム（Chaetomium cunicolorum）、シスパトスポラ・ボニネンシス（Syspastospora boninensis）、クラドリナム・フォエクンジシマム（Cladorrhinum foecundissimum）、スシタリジウム・サーモフィラ（Scytalidium thermophila）、グリオクラジウム・カテヌラタム（Gliocladium catenulatum）、フザリウム・オキシスポラムｓｓｐ．リコペリシシ（Fusarium oxysporum ssp.lycopersici）、フザリウム・オキシスポラムｓｓｐ．パシフローラ（Fusarium oxysporum ssp.passiflora）、フザリウム・ソラニ（Fusarium solani）、フザリウム・アンギオイド（Fusarium anguioides）、フザリウム・ポアエ（Fusarium poae）、ヒュミコラ・ニグレッセンス（Humicola nigrescens）、ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）、パナエオラス・レチルギス（Panaeolus retirugis）、トラメテス・サンジーナ（Trametes sanguinea）、シゾフィラム・コミューン（Schizophyllum commune）、トリコテシウム・ローゼウム（Trichothecium roseum）、ミクロスフェロプシスｓｐ．（Microsphaeropsis sp.）、アクソボラス・スチクトイデス（Acsobolus stictoideus spej.）、ポロニア・パンクタタ（Poronia punctata）、ノズリスポラムｓｐ．（Nodulisporum sp.）、トリコデルマｓｐ．（Trichoderma sp.）（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei））及びシリンドロカルポンｓｐ．（Cylindrocarpon sp.）。
特定の実施形態では、本開示の組成物に使用するセルラーゼは、以降の節に記載するようなカルコフロールアッセイにより測定される、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、又は少なくとも０．５フラクションの生成物を得ることができるものである。一部の実施形態では、本開示の組成物に使用するセルラーゼは、全セルラーゼであり及び／又は以降の節に記載するようなカルコフロールアッセイにより測定される、少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、又は少なくとも０．５フラクションの生成物を得ることができるものである。一部の実施形態では、本開示の組成物に使用するセルラーゼは、全セルラーゼであり及び／又はカルコフロールアッセイにより測定される、約０．１〜約０．５、又は約０．１〜約０．４、又は約０．２〜約０．４、又は約０．３〜約０．４、又は約０．２〜約０．５、又は約０．３〜約０．５フラクションの生成物を得ることができるものである。
６．３．１．１．カルコフロールホワイトを用いるセルラーゼ活性アッセイ
Ｗａｌｓｅｔｈ，１９７１，ＴＡＰＰＩ ３５：２２８，ａｎｄ ｏｆ Ｗｏｏｄ，１９７１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１２１：３５３〜３６２により最適化されたプロトコルを用い、Ａｖｉｃｅｌ ＰＨ−１０１からリン酸膨潤セルロース（ＰＡＳＣ）を調製する。手短に言うと、代表的な方法によりＡｖｉｃｅｌを濃リン酸に可溶化させ、次いで冷脱イオン水を用いて沈殿させる。セルロースを回収した後、水で洗浄してｐＨを中性にし、固形分が１％になるように５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）に希釈する。
すべての酵素希釈液は５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ５．０）を用い調製する。ＧＣ２２０セルラーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を２．５、５、１０、及び１５ｍｇのタンパク質／ｇＰＡＳＣへと希釈し、線形の較正曲線を作成する。試験する試料は、較正曲線の範囲内に収まるよう（すなわち、０．１〜０．４フラクション生成物に相当するよう）希釈する。好適な容器、例えば、９６ウェルマイクロタイタープレート中で、１５０μＬの１％冷ＰＡＳＣに各２０μＬの酵素溶液を加える。プレートにカバーを掛け、２００ｒｐｍで回転させながら、インキュベータ／シェイカーで５０℃にて２時間インキュベートする。次いで１００μＬの、５０μｇ／ｍＬのカルコフロール／１００ｍＭのグリシン（ｐＨ １０）を用い、反応をクエンチする。励起波長Ｅｘ＝３６５ｎｍ及び蛍光波長Ｅｍ＝４３５ｎｍで、蛍光マイクロプレートリーダーで蛍光を読み取る。結果を、次式：
ＦＰ＝１−（試料のＦｌ−セロビオースを含有する緩衝液のＦｌ）／（緩衝液が酵素を含まない場合のＦｌ−緩衝液がセロビオースを含有する場合のＦｌ）
（式中、「ＦＰ」はフラクション生成物を意味し、「Ｆｌ」は蛍光ユニットを意味する）に従うフラクション生成物として表わす。
６．３．１．２．β−グルコシダーゼ
本開示の酵素ブレンドは、所望によりβ−グルコシダーゼを１つ以上含む。本明細書で使用するとき、用語、「β−グルコシダーゼ」は、ＥＣ ３．２．１．２１に分類される又は属するβ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼを指し、及び／又は限定するものではないが、グリコシルヒドロラーゼ（「ＧＨ」）ファミリー１、３、９又は４８などといった、特定のＧＨメンバーである酵素を指す。特定の態様では、用語は、セロビオースの加水分解を触媒して、β−Ｄ−グルコースを放出させることのできる酵素を指す。
β−グルコシダーゼは、任意の好適な微生物から得ることができる。それらの酵素は、組み換え法により得る又は生成することができ、あるいは供給業者から得ることができる。例えば、好適なβ−グルコシダーゼは、バクテリア及び真菌などの微生物から得ることができる。例えば、好適なβ−グルコシダーゼは、糸状菌から得ることができる。
特定の態様では、好適なβ−グルコシダーゼは、アスペルギルス・アキュリタス（Ｋａｗａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ １７３：２８７〜２８８）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉ（Ｉｗａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．６５：５５４６〜５５５３）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ（ＰＣＴ特許出願第２００２／０９５０１４号）、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｂｉａｚｏｔｅａ（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ ２０７：７９〜８６）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ（ＰＣＴ特許出願第２００４７８９１９号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ（Ｍａｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．５４：３１４７〜３１５５）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔｕｒｅ ４１５：８７１〜８８０）、又はトリコデルマ・リーゼイから得ることができる。例えば、トリコデルマ・リーゼイ由来の好適なβ−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ１（米国特許第６，０２２，７２５号）、トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ３（米国特許第６，９８２，１５９号）、トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ４（米国特許第７，０４５，３３２号）、トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ５（米国特許第７，００５，２８９号）、トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ６（米国特許第２００６０２５８５５４号）、又はトリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ７（米国特許第２００６０２５８５５４号）が挙げられる。
一部の実施形態では、好適なβ−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼをコードしている遺伝子を発現させることで生成できる。例えば、好適なβ−グルコシダーゼは、特定のグラム陽性細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ又はＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓなど）、又は真核生物宿主（例えば、トリコデルマ、アスペルギルス、サッカロマイセス、又はピキア）により、細胞外の空間に分泌させることができる。
好適なβ−グルコシダーゼは供給業者から入手することもできる。本開示の方法、組成物及び他の実施形態に使用するのに好適なβ−グルコシダーゼ調製物の市販例としては、限定するものではないが、トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）ＢＧ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＮＯＶＯＺＹＭ（商標）１８８（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒから供給されるβ−グルコシダーゼ）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．β−グルコシダーゼ、並びにＭｅｇａｚｙｍｅから入手可能なＴｈｅｒｍａｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａβ−グルコシダーゼ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ．，Ｂｒａｙ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｂｒａｙ，Ｃｏ．Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ．）が挙げられる。
特定の態様では、好適なβ−グルコシダーゼは、以下、節６．３．１．５に記載のような全セルラーゼの成分であり得る。
β−グルコシダーゼ活性は、当該技術分野において既知である手法により測定することができる。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２１：５４〜６０に記載されるアッセイを使用することができる。アッセイでは、１ユニットのｐＮＰＧは、５０℃（又は１２２°Ｆ）かつｐＨ ４．８下で、パラ−ニトロフェニル−Ｂ−Ｄ−グルコピラノシドから１０分で遊離される１μｍｏＬのニトロフェノールを意味する。
６．３．１．３．エンドグルカナーゼ
本開示の酵素ブレンドは、所望によりエンドグルカナーゼを１つ以上含む。用語、「エンドグルカナーゼ」は、ＥＣ ３．２．１．４．に分類される任意のポリペプチドを指す。
一部の態様では、トリコデルマ・リーゼイＥＧ１（Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ６３：１０３〜１１２）及び／又はトリコデルマ・リーゼイＥＧＩＩ（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６３：１１〜２１）が本開示の方法及び組成物に使用される。他の態様では、エンドグルカナーゼは、トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼＶＩ（例えば、米国特許第７，３５１，５６８号を参照されたい）、エンドグルカナーゼＶＩＩ（例えば、米国特許第７，４４９，３１９号を参照されたい）、又はエンドグルカナーゼＶＩＩＩ（例えば、米国特許第７，０４９，１２５号を参照されたい）であり得る。
特定の実施形態では、好適なエンドグルカナーゼは、チエラビア・テレストリス熱安定性エンドグルカナーゼ（Ｋｖｅｓｉｔａｄａｚｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５０：１３７〜１４３）；トリコデルマ・リーゼイＥＧＩＩＩ（Ｏｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：５５５〜５６３）、ＥＧＩＶ（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：５８４〜５９１）、ＥＧ５（Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：２１９〜２２８）、ＥＧＶＩ（米国特許出願公開番号第２００７０２１３２４９号）、又はＥＧＶＩＩ（米国特許出願公開番号第２００９０１７０１８１号）；Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ＥＩエンドグルカナーゼ（米国特許第５，５３６，６５５号）；Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓエンドグルカナーゼＶ（ＥＧＶ）（日本蛋白質構造データバンクエントリ番号４ＥＮＧ）；Ｓｔａｐｈｙｌｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｏｃｃｏｓｐｏｒｕｍエンドグルカナーゼ（米国特許出願公開番号第２００７０１１１２７８号）；アスペルギルス・アキュリタスエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣ（Ｏｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１８：５８８４）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＩＦＯ ４３０８エンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２７：４３５〜４３９）；又はＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｒａ（Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｇｅｎｅ ９０：９〜１４）；Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ＡＬＫＯ４２４５エンドグルカナーゼ（米国特許第２００７０１４８７３２号）であり得る。
例えば、ＰＣＴ特許出願公開第９１／１７２４３号、同第９１／１７２４４号、同第９１／１０７３２号、又は米国特許第６，００１，６３９号に記載されるエンドグルカナーゼも、本開示の方法及び組成物に使用するのに好適である。
６．３．１．４．セロビオヒドロラーゼ
本明細書で使用するとき、用語、「セロビオヒドロラーゼ」は、ＥＣ ３．２．１．９１に分類される任意のセロビオヒドロラーゼを指す。本開示の方法及び組成物には、１つ以上のセロビオヒドロラーゼ（「ＣＢＨ」）を好適に含ませることができる。
一部の態様では、本開示の方法及び組成物にはトリコデルマ・リーゼイＣＢＨＩ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：６９１〜６９６）及び／又はＣＢＨＩＩ（Ｔｅｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ １：６９６〜６９９）を使用することができる。
一部の態様では、好適なＣＢＨは、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９２４００）；アスペルギルス・アキュリタスＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｏ５９８４３）；アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＣＢＨＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４２００１９）；アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ＣＢＨＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４２００１９）；アスペルギルス・ニガーＣＢＨＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５６２６８）；アスペルギルス・ニガーＣＢＨＢ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５６２６９）；クラビセプス・プルプレア（Claviceps purpurea）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｏ０００８２）；コキロボラス・カルボナラム（Cochliobolus carbonarum）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ００３２８）；クリフォネクトリア・パラシティカ（Cryphonectria parasitica）ＣＢＨ１（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ００５４８）；フザリウム・オキシスポラムＣＢＨ１（Ｃｅｌ７Ａ）（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４６２３８）；ヒュミコラ・グリセア（Humicola grisea）ｃｂｈ ＣＢＨ１．２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５０５９４）；ヒュミコラ・グリセアｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ６３５１５）；ヒュミコラ・グリセアｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ＣＢＨＩ．２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１２３４４１）；ヒュミコラ・グリセアｖａｒ．ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ ｅｘｏ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００３１０５）；メラノカルパス・アルボマイセス（Melanocarpus albomyces）Ｃｅｌ７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ５１５７０５），ニューロスポラ・クラッサ（ニューロスポラ・クラッサ）ＣＢＨＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７７７７８）；ペニシリウム・フニクロサムＣＢＨＩ（Ｃｅｌ７Ａ）（米国特許第２００７０１４８７３０号）；ペニシリウム・ジャンチネラム（Penicillium janthinellum）ＣＢＨＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｓ５６１７８）；ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）ＣＢＨ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２２２２０）；ファネロカエテ・クリソスポリウムＣＢＨＩ−２（Ｃｅｌ７Ｄ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２２６５６）；タラロマイセス・エメルソニイ（Talaromyces emersonii）Ｃｂｈ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ４３９９３５）；トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５３９３１）、又はボルバリエラボルバセア（Volvariella volvacea）Ｖ１４ ＣＢＨ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５６６９３）であり得る。
６．３．１．５．全セルラーゼ
特定の態様では、本開示の酵素ブレンドは全セルラーゼを含む。本明細書で使用するとき、用語、「全セルラーゼ」は、天然に生じるセルラーゼ含有組成物及び非天然に生じるセルラーゼ含有組成物の両方を指し、この組成物は：（１）セルロース内部のβ−１，４結合を切断し、より短いグルコオリゴ糖を生成する、エンドグルカナーゼ、（２）「エキソ型」で作用する方法で、より短いグルコオリゴ糖からセロビオース単位（例えば、セロビオース単位としては、β−１，４グルコース−グルコース二糖が挙げられる）を放出させる、セロビオヒドロラーゼ、並びに（３）短鎖セロオリゴ糖又はセロビオース（グルコース二量体）からのグルコースモノマーの放出を触媒する、β−１，４グルコシダーゼ二糖、を含む。
「天然に生じるセルラーゼ含有」組成物は、セロビオヒドロラーゼ型の成分又は活性物質を１つ以上、エンドグルカナーゼ型の成分又は活性物質を１つ以上、及びβ−グルコシダーゼ型の成分又は活性物質を１つ以上含む、天然に生じる供給源により生成される組成物であり、これらの成分又は活性物質のそれぞれは、人工的に加工されていない、天然に生じる比及び濃度で見出される。したがって、天然に生じるセルラーゼ含有組成物は、例えば、セルロース分解酵素に関する改質を受けていない微生物（天然微生物により天然に生成される場合と比べて酵素成分の比又は濃度が変更されていないものなど）により生成される。「非天然に生じるセルラーゼ含有組成物」は：（１）セルロース分解酵素成分を、天然に生じる比、又は非天然に生じる、すなわち変更された比のいずれかで組み合わせること。あるいは、（２）セルロース分解酵素を１つ以上過剰発現するよう、あるいは過小発現するよう微生物を改変すること。あるいは、（３）セルロース分解性酵素を少なくとも１つ欠失するよう微生物を改変すること、により生成される組成物を指す。「非天然に生じるセルラーゼ含有」組成物は、天然に生じる微生物を非天然条件下で増殖させ、濃度又は比を変更させて酵素を生成させるよう、天然に生じる微生物のための培養条件を調整することで得られる組成物も指す。したがって、一部の実施形態では、本開示の全セルラーゼ調製物では、１つ以上のＥＧ及び／又はＣＢＨ及び／又はβ−グルコシダーゼが欠失しており、及び／又は過剰発現している。本開示では、全セルラーゼ調製物は、セルロース系材料を加水分解することのできる任意の微生物由来のものであり得る。一部の実施形態では、全セルラーゼ調製物は、糸状菌の全セルラーゼである。例えば、全セルラーゼ調製物は、アクレモニウム、アスペルギルス、エメリセラ、フザリウム、ヒュミコラ（Humicola）、ムコール、マイセリオフトラ、ニューロスポラ、ペニシリウム、スシタリジウム、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）、又はトリコデルマ属由来のものであり得る。全セルラーゼ調製物は、例えば、アスペルギルス・アキュリタス、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・フォエチダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ジャポニクス（Aspergillus japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー、又はアスペルギルス・オリザエの全セルラーゼである。更に、全セルラーゼ調製物は、フザリウム・バクトリジオイデス（Fusarium bactridioides）、フザリウム・セレアリス（Fusarium cerealis）、（フザリウム・クルックウェレンス（Fusarium crookwellense）、フザリウム・カルモラム（Fusarium culmorum）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・グラミナム（Fusarium graminum）、フザリウム・ヘテロスポラム（Fusarium heterosporum）、フザリウム・ネグンジ（Fusarium negundi）、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・レティクラタム（Fusarium reticulatum）、フザリウム・ロゼウム（Fusarium roseum）、フザリウム・サムブシナム（Fusarium sambucinum）、フザリウム・サルコクロム（Fusarium sarcochroum）、フザリウム・スポロトリキオイド（Fusarium sporotrichioides）、フザリウム・サルフレウム（Fusarium sulphureum）、フザリウム・トルロサム（Fusarium torulosum）、フザリウム・トリコテシオイド（Fusarium trichothecioides）、又はフザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）の全セルラーゼ調製物であり得る。全セルラーゼ調製物は、クリソスポリウム・ラックノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、ヒュミコラ・インソレンス、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、マイセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ペニシリウム・パープロゲナム（Penicillium purpurogenum）、ペニシリウム・フニクロサム、スシタリジウム・サーモフィラム（Scytalidium thermophilum）、又はチエラビア・テレストリスの全セルラーゼ調製物でもあり得る。更に、全セルラーゼ調製物は、トリコデルマ・ハルジアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・リーゼイ（例えば、ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９８４、２０、ｐｐ．４６〜５３）、ＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ番号２６９２１）、ＮＲＲＬ １５７０９、ＡＴＣＣ １３６３１、５６７６４、５６４６６、５６７６７）、又はトリコデルマ・ビリデ（例えば、ＡＴＣＣ ３２０９８及び３２０８６）全セルラーゼ調製物であり得る。
特に好適な全セルラーゼ調製物は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからトリコデルマ・リーゼイＡＴＣＣ ５６７６５として入手可能な、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ３０全セルラーゼ調製物であり得る。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎからペニシリウム・フニクロサムＡＴＣＣ番号：１０４４６として入手可能な、ペニシリウム・フニクロサムの全セルラーゼも、好適な全セルラーゼ調製物であり得る。
全セルラーゼ調製物は、供給業者から入手することもできる。本開示の方法及び組成物での使用に好適な市販のセルラーゼ調製物の例としては、例えば、ＣＥＬＬＵＣＬＡＳＴ（商標）及びＣｅｌｌｉｃ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）、並びにＬＡＭＩＮＥＸ（商標）ＢＧ、ＩｎｄｉＡｇｅ（商標）４４Ｌ、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）１００、Ｐｒｉｍａｆａｓｔ（商標）２００、Ｓｐｅｚｙｍｅ（商標）ＣＰ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１０００、及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
好適な全セルラーゼ調製物は、セルロース系材料を加水分解することのできる酵素を発現させる、当該技術分野において既知の任意の微生物培養法、特に、発酵を用い調製することができる。本明細書で使用するとき、用語、「発酵」は、フラスコ振とう培養法、並びに対象とするセルラーゼ及び／又は酵素を発現させる及び／又は単離するような好適な培地及び条件下で実験室用発酵槽又は工業発酵槽で実施される、連続式、バッチ式、フェドバッチ式又は固体状態での発酵などの小規模又は大規模発酵、を指す。
概して、微生物は、セルロース系材料を加水分解することのできる酵素の生成に好適な細胞培養培地で培養される。培養は、当該技術分野において既知の手順及び変法を用いて、炭素源及び窒素源並びに無機塩類を含む好適な栄養培地中で行なわれる。増殖及びセルラーゼ生成に好適な培地、温度範囲及び他の条件が当該技術分野において既知である。非限定例として、トリコデルマ・リーゼイがセルラーゼを生成する典型的な温度範囲は、２４℃〜２８℃である。
全セルラーゼ調製物は、全く又はほとんど回収及び／又は精製せずに、発酵により生成されたものとして使用することができる。例えば、細胞培養培地にセルラーゼが分泌されたならば、このセルラーゼ含有細胞培養培地を直接使用することができる。全セルラーゼ調製物は、馴化培地（spent cell culture medium）、細胞外酵素及び細胞を含む、未分画の発酵材料成分を含み得る。その一方で、全セルラーゼ調製物は更に、例えば、沈殿、遠心沈降、アフィニティクロマトグラフィー、ろ過、又は同様の操作などの多数の所定の工程で加工することもできる。例えば、全セルラーゼ調製物は、濃縮し、次いで更に精製せずに使用することができる。全セルラーゼ調製物には、例えば、細胞生存率を低下させる、すなわち発酵後に細胞を死滅させる特定の化学製剤を配合することができる。例えば、当該技術分野において既知の方法を用い、細胞を溶解又は透過処理することができる。
全セルラーゼ調製物のエンドグルカナーゼ活性は、基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を用い測定することができる。好適なアッセイは、酵素混合物がＣＭＣに対して作用することで生成される、還元末端の生成量を測定する。ここで、１ユニットは１μｍｏＬ生成物／分を遊離する酵素量である（Ｇｈｏｓｅ，Ｔ．Ｋ．，Ｐｕｒｅ ＆ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，５９，ｐｐ．２５７〜２６８）。
全セルラーゼは、β−グルコシダーゼ濃縮セルラーゼ（β-glucosidase-enriched cellulase）であり得る。β−グルコシダーゼ濃縮全セルラーゼは、概してβ−グルコシダーゼと、全セルラーゼ調製物を含む。β−グルコシダーゼ濃縮全セルラーゼ組成物は、組み換え法により生成することができる。例えば、このような全セルラーゼ調製物は、全セルラーゼを生成することのできる微生物に、β−グルコシダーゼを発現させることで得ることができる。β−グルコシダーゼ濃縮全セルラーゼ組成物は、例えば、セルラーゼ調製物とβ−グルコシダーゼを含んでもよい。例えば、β−グルコシダーゼ濃縮全セルラーゼ組成物は、ブレンド／組成物中のタンパク質の総重量に基づいて、少なくとも５重量％、７重量％、１０重量％、１５重量％、又は２０重量％、及び最大で２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、又は５０重量％のβ−グルコシダーゼを好適に含み得る。
特定の態様では、好適な全セルラーゼは、保持型β−キシロシダーゼ活性を低下させる又は除去するために遺伝子組換えされる又は遺伝子組み換えされた微生物から得ることができる。他の態様では、好適な全セルラーゼは、反転型β−キシロシダーゼ活性を増加させるために遺伝子組換えされる又は遺伝子組み換えされた微生物から得ることができる。更なる態様では、好適な全セルラーゼは、保持型β−キシロシダーゼ活性を低下させる又は除去するだけでなく、反転型β−キシロシダーゼ活性を増加させるために遺伝子組換えされる又は遺伝子組み換えされた微生物から得ることができる。例えば、全セルラーゼは、天然ｂｘｌ１遺伝子が欠失するよう遺伝子操作されたトリコデルマ・リーゼイから好適に得ることができる。他の例では、全セルラーゼは、遺伝子組み換えにより反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を発現するよう遺伝子操作された、トリコデルマ・リーゼイから好適に得ることができる。更に他の実施例では、全セルラーゼは、天然ｂｘｌ１遺伝子を欠失し、かつ遺伝子組み換えにより反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を発現するよう遺伝子操作された、トリコデルマ・リーゼイから好適に得ることができる。反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素の例としては、限定するものではないが、Ｆｖ４３Ｄ及び本明細書の節６．４．に記載の他のものが挙げられる。
β−キシロシダーゼ活性は、人工基質ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシドの加水分解の程度を測定することにより測定できる。反応過程中に１Ｈ−ＮＭＲ解析を用いて加水分解反応を追跡してもよい。グリコシド結合の還元末端を提供する残基のアノマープロトンは、加水分解後に新しく形成される還元糖のアノマープロトンとして、軸配向又はエクアトリアルな配向に基づき、別個の化学シフトを有する。軸配向及びエクアトリアルな配向の形態の平衡混合物へ向かう、新しく形成される還元糖のアノマープロトンの変旋光は、加水分解反応と比較して速度が遅い。したがって、最初に形成された還元末端のアノマープロトンを、基質に存在している形態と比較し、１Ｈ−ＮＭＲにより配向決定することは、これらの保持型立体配置対反転型立体配置の機構について解析することを意味する。実験法は、例えば、Ｐａｕｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９：９３〜１００に記載される。
あるいは、加水分解の程度は、反転型酵素を存在させずに、保持型酵素のグリコシル基転移活性を識別することによって割り出すことができる。このようなアッセイの一例を、図１６に示す。キシロビオース又はキシロースオリゴマーは、保持型酵素（例えば、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ又はＦｖ３Ａ）の存在下で、ＥＸＰ／キシロースを、ＥｔＯＨの存在下での平衡比の７〜８倍へと急上昇させた後、ＥＸＰ／キシロースを平衡比に落とした。反転型酵素（例えば、Ｆｖ４３Ｄ）の場合、同一条件下で、ＥＸＰ／キシロースは平衡比に向けて単調に上昇する。
６．３．２．ヘミセルラーゼ 様々な真菌及びバクテリアが、酵素によりヘミセルロースを加水分解することができる。セルロース分解と同様、ヘミセルロース加水分解は複数の酵素の共働作用を包含する。多くの場合、ヘミセルラーゼは遺伝的に３つのカテゴリに分類される：多糖鎖内の内部結合を攻撃するエンド型酵素、多糖鎖の還元又は非還元末端のいずれかからプロセシングを行なうエキソ型酵素、並びにリグニンのグリコシド結合を加水分解するアクセサリ酵素、アセチルエステラーゼ、及び／又はエステラーゼ。エステラーゼの例としては、クマリン酸エステラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼが挙げられる（Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５２：３０５〜３１７；Ｔｅｎｋａｎｅｎ ａｎｄ Ｐｏｕｔａｎｅｎ，１９９２，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｅｓｔｅｒａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌａｎｓ，ｉｎ Ｘｙｌａｎｓ ａｎｄ Ｘｙｌａｎａｓｅｓ，Ｖｉｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｐｐ．２０３〜２１２；Ｃｏｕｇｈｌａｎ ａｎｄ Ｈａｚｌｅｗｏｏｄ，１９９３，Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ：Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，ｅｄ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．１１９〜１４１）。
本開示の組成物及び／又は方法で使用するのに好適なヘミセルラーゼとしては、例えば、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ、エンドガラクタナーゼ、マンナナーゼ、エンド又はエキソアラビナーゼ、エキソガラクタナーゼ、及びこれらの混合物が挙げられる。エンド型ヘミセルラーゼ及び補助酵素の例としては、限定するものではないが、エンドアラビナナーゼ、エンドアラビノガラクタナーゼ、エンドグルカナーゼ、エンドマンナナーゼ、エンドキシラナーゼ、及びフェラキサンエンドキシラナーゼ（feraxan endoxylanase）が挙げられる。エキソ型ヘミセルラーゼ及び補助酵素の例としては、限定するものではないが、α−Ｌ−アラビノシダーゼ、β−Ｌ−アラビノシダーゼ、α−１，２−Ｌ−フコシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−キシロシダーゼ、エキソグルコシダーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エキソマンノビオヒドロラーゼ（exomannobiohydrolase）、エキソマンナナーゼ、エキソキシラナーゼ、キシランα−グルクロニダーゼ、及びコニフェリンβ−グルコシダーゼが挙げられる。エステラーゼの例としては、限定するものではないが、アセチルエステラーゼ（アセチルガラクタンエステラーゼ、アセチルマンナンエステラーゼ、及びアセチルキシランエステラーゼ）及びアリールエステラーゼ（クマリン酸エステラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼ）が挙げられる。
特定の態様では、ヘミセルラーゼはエキソ型ヘミセルラーゼである。好ましくは、エキソ型ヘミセルラーゼは、酸性条件下で、例えばｐＨ ７以下でヘミセルロースを加水分解する能力を有する。
特定の態様では、ヘミセルラーゼが有効量で添加される。例えば、ヘミセルラーゼは、本開示の多酵素ブレンドに、完全発酵培地中の固形分重量に対し、約０．００１重量％以上、約０．００２重量％以上、約０．００２５重量％以上、約０．００５重量％以上、又は約０．０１重量％以上の量で添加される。他の例では、ヘミセルラーゼは、本開示の多酵素ブレンドに、完全発酵培地中の固形分重量に対し、約０．００１重量％〜約５．０重量％、例えば、約０．０２５重量％〜約４．０重量％、又は約０．００５重量％〜約２．０重量％の量で添加される。
６．３．２．１．キシラナーゼ 本開示の酵素ブレンドは、所望により１つ以上のキシラナーゼを含有する。本明細書で使用するとき、用語、「キシラナーゼ」は、ＥＣ ３．２．１．８に分類される又は属する任意のキシラナーゼを指す。好適なキシラナーゼとしては、例えば、カルドセラム・サッカロリティカム（Caldocellum saccharolyticum）キシラナーゼ（Ｌｕｔｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６（９）：２６７７〜２６８３）、サーモトガ・マリティマキシラナーゼ（Ｗｉｎｔｅｒｈａｌｔｅｒ ＆ Ｌｉｅｂｅｌ，１９９５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（５）：１８１０〜１８１５）、サーモトガＳｐ．株ＦＪＳＳ−Ｂ．１キシラナーゼ（Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７７，４１３〜４１７）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）キシラナーゼ（ＢｃＸ）（米国特許第５，４０５，７６９号）、アスペルギルス・ニガーキシラナーゼ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．７９（５）：４２２〜４２８）；ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）キシラナーゼ（Ｓｈａｒｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ １０７：７５〜８２；Ｍｏｒｏｓｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３９：５８７〜５９２；Ｋｌｕｅｐｆｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８７：４５〜５０）；バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）キシラナーゼ（Ｂｅｒｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｇｅｎｅ ２６（１）：５９〜６５）；セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fimi）キシラナーゼ（Ｃｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１３９：２７〜３５）、シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens）キシラナーゼ（Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３４：３２３９〜３２４７）；クロストリジウム・サーモセラムキシラナーゼ（Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２（７）：５６９〜７６）；バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）キシラナーゼ（Ｎｕｙｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．５６：４３１〜４３４；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６（１４Ｂ）：７１８７）；クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）Ｐ２６２キシラナーゼ（Ｚａｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８（８）：２１７９）又はトリコデルマ・ハルジアナムキシラナーゼ（Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９４（４）：７５５〜７５６）が挙げられる。
キシラナーゼは、例えば、アスペルギルス、ディスポロトリクム（Ｄｉスポロトリカム）、ペニシリウム、ニューロスポラ、フザリウム、トリコデルマ、ヒュミコラ、サーモマイセス、及びバチルスといった真菌及びバクテリアなどの、様々な供給源から好適に得ることができる。キシラナーゼ（１つ又は複数）を含む特定の市販の製剤も本開示の組成物及び方法に使用することができる。例えば、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、Ｌａｍｉｎｅｘ（登録商標）ＢＧ及びＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＣＰ（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、並びにＣｅｌｌｕｃｌａｓｔ（登録商標）及びＶｉｓｃｏｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）が挙げられる。
特定の態様では、キシラナーゼは保持型β−キシロシダーゼ活性を有するものではなく、及び／又は反転型β−キシロシダーゼ活性も有さない。上記節６．３．１．５に記載のように、保持型活性対反転型活性について酵素を試験することができる。
６．３．２．２．β−キシロシダーゼ
本開示の酵素ブレンドは、所望によりβ−キシロシダーゼを１つ以上含む。
本明細書で使用するとき、用語、「β−キシロシダーゼ」は、ＥＣ ３．２．１．３７に分類される又は属する任意のβ−キシロシダーゼを指す。例えば、好適なβ−キシロシダーゼとしては、タラロマイセス・エルメソニイＢｘｌ１（Ｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３０５（３）：５７９〜８５）；並びにゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus stearothermophilus）（Ｓｈａｌｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：３８７〜３９７）；スシタリジウム・サーモフィラム（Ｚａｎｏｅｌｏ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：１７０〜１７６）；トリコデルマ・リグノラム（Trichoderma lignorum）（Ｓｃｈｍｉｄｔ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１６０：６６２〜６７１）；アスペルギルス・アワモリ（Ｋｕｒａｋａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７２６：２７２〜２７９）；アスペルギルス・ベルシコロル（Aspergillus versicolor）（Ａｎｄｒａｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：１９３１〜１９３８）；ストレプトマイセスｓｐ．（Ｐｉｎｐｈａｎｉｃｈａｋａｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：７２７〜７３３）；サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）（Ｘｕｅ ａｎｄ Ｓｈａｏ，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２６：１５１１〜１５１５）；トリコデルマｓｐ．ＳＹ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：６４３〜６４５）；アスペルギルス・ニガー（Ｏｇｕｎｔｉｍｅｉｎ ａｎｄ Ｒｅｉｌｌｙ，１９８０，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．２２：１１４３〜１１５４）；又はペニシリウム・ウォートマンニ（Penicillium wortmanni）（Ｍａｔｓｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５１：２３６７〜２３７９）から得られるβ−キシロシダーゼが挙げられる。
特定の態様では、β−キシロシダーゼは保持型酵素β−キシロシダーゼ活性を有さない。他の態様では、β−キシロシダーゼは反転型β−キシロシダーゼ活性を有する。更なる態様では、β−キシロシダーゼは保持型β−キシロシダーゼ活性を有さず、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する。上記節６．３．１．５に記載のように、保持型活性対反転型活性について酵素を試験することができる。
６．３．２．３．Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ
本開示の酵素ブレンドは、所望により１つ以上のＬ−α−アラビノフラノシダーゼを含む。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ」は、ＥＣ ３．２．１．５５に分類される又は属する任意の酵素を指す。好適なＬ−α−アラビノフラノシダーゼは、例えばアスペルギルス・オリザエ（Ｎｕｍａｎ ＆ Ｂｈｏｓｌｅ，２００６，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２４７〜２６０）；アスペルギルス・ソーエ（Aspergillus sojae）（Ｏｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．５２：２６１〜２６５）；バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）（Ｎｕｍａｎ ＆ Ｂｈｏｓｌｅ，２００６，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２４７〜２６０）；バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：４７４〜４８２）；ビフィドバクテリウム・ブレブ（Bifidobacterium breve）（Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：７１１６〜７１２３）；ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６９：５０９６〜５１０３）；クロストリジウム・サーモセラム（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９５：３１〜３７）；フザリウム・オキシスポラム（Ｐａｎａｇｉｏｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：６３９〜６４４）；フザリウム・オキシスポラムｆ．ｓｐ．ジアンヒ（Fusarium oxysporum f.sp.dianthi）（Ｎｕｍａｎ ＆ Ｂ ｈｏｓｌｅ，２００６，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２４７〜２６０）；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＴ−６（Ｓｈａｌｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４３６６７〜４３６７３）；ホルデウム・ブルゲア（Hordeum vulgare）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：５３７７〜５３８７）；ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）（Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １６２１：２０４〜２１０）；ペニシリウムｓｐ．（Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：５８〜６４）；シュードモナス・セルローサ（Pseudomonas cellulosa）（Ｎｕｍａｎ ＆ Ｂｈｏｓｌｅ，２００６，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２４７〜２６０）；リゾムコール・プシラス（Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３８：１４６９〜１４７６）；ストレプトマイセス・チャートリューシス（Streptomyces chartreusis）（Ｎｕｍａｎ ＆ Ｂｈｏｓｌｅ，２００６，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２４７〜２６０）；ストレプトマイセス・サーモビオラカス（thermoviolacus）（Ｎｕｍａｎ ＆ Ｂｈｏｓｌｅ，２００６，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２４７〜２６０）；サーモアナエロバクター・エタノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）（Ｎｕｍａｎ ＆ Ｂｈｏｓｌｅ，２００６，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２４７〜２６０）；サーモバチルスキシラニリティカス（Thermobacillus xylanilyticus）（Ｎｕｍａｎ ＆ Ｂｈｏｓｌｅ，２００６，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３：２４７〜２６０）；サーモモノスポラ・フスカ（Thermomonospora fusca）（Ｔｕｎｃｅｒ ａｎｄ Ｂａｌｌ，２００３，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４８：１６８〜１７２）；サーモトガ・マリティマ（Ｍｉｙａｚａｋｉ，２００５，Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ ９：３９９〜４０６）；トリコデルマｓｐ．ＳＹ（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ａｇｒｉｃ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：７〜１０）；アスペルギルス・カワチ（Ｋｏｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １７６０：１４５８〜１４６４）；フザリウム・オキシスポラムｆ．ｓｐ．ジアンチ（Ｃｈａｃｏｎ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．６４：２０１〜２０８）；サーモバチルスキシラニリティカス（Ｄｅｂｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１５：２１〜２８）；ヒュミコラ・インソレンス（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２３：１００〜１０７）；メリピラス・ギガンテウス（Meripilus giganteus）（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２３：１００〜１０７）；又はラファヌス・サチバス（Raphanus sativus）（Ｋｏｔａｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５７：２３５３〜２３６２）から得ることができる。
特定の態様では、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは保持型酵素β−キシロシダーゼ活性を有さない。他の態様では、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは反転型β−キシロシダーゼ活性を有する。更なる態様では、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼは保持型β−キシロシダーゼ活性を有さず、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する。上記節６．３．１．５に記載のように、保持型活性対反転型活性について酵素を試験することができる。
６．３．３．アクセサリタンパク質
セルロース分解性を増感させる活性を有する数多くのポリペプチドを、上記酵素及び／又はセルロース分解性タンパク質と組み合わせて使用することで、バイオマス基質のセルロース成分を更に分解させることができる（例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｅ．Ｗｙｍａｎ，ｅｄ．），ｐｐ．１１９〜１４１，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．；Ｌｅｅ，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５６：１〜２４を参照されたい）。
セルロース分解性を増感させる活性を有するこのようなポリペプチド及びセルロース分解性タンパク質の最適な量は、限定するものではないが、セルロース分解性タンパク質成分の具体的な混合物、セルロース系基質、セルロース系基質の濃度、セルロース系基質の前処理（１つ又は複数）、温度、時間、及びｐＨ、並びに発酵微生物の性質などの、様々な因子に応じ異なる。
本開示の酵素ブレンド／組成物は、例えば、更に好ましくはアクセサリタンパク質を１つ以上含む。アクセサリタンパク質の例としては、限定するものではないが、マンナナーゼ（例えば、エンドマンナナーゼ、エキソマンナナーゼ、及びβ−マンノシダーぜ）、ガラクタナーゼ（例えば、エンド型及びエキソ型ガラクタナーゼ）、アラビナーゼ（例えばエンド型アラビナーゼ及びエキソ型アラビナーゼ）、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ（例えば、フェルラ酸エステラーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、クマリン酸エステラーゼ又はペクチンメチルエステラーゼ）、リパーゼ、グリコシドヒドロラーゼファミリー６１ポリペプチド、キシログルカナーゼ、ＣＩＰ１、ＣＩＰ２、スオレニン（swollenin）、エクスパンシン（expansins）、及びセルロース破壊タンパク質が上げられる。アクセサリタンパク質の例としては、ＣＩＰ１様タンパク質、ＣＩＰ２様タンパク質、セロビオース脱水酵素及びマンガンペルオキシダーゼを挙げることもできる。特定の実施形態では、セルロース破壊タンパク質はセルロース結合モジュールである。
６．４反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素
本開示に従い、ＳＳＦ反応時のＡＸＰ（例えば、ＥＸＰ）形成を減少させるために、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を使用する。したがって、一態様では、本開示は反転型β−キシロシダーゼポリペプチドを少なくとも１つ含む組成物に関する。他の態様では、本開示は、反転型β−キシロシダーゼポリペプチドを少なくとも１つ含む完全発酵培地を培養することを含む、ＳＳＦ反応で所望の発酵生成物を生成する方法に関する。
好適な反転型β−キシロシダーゼポリペプチドは、グリコシドヒドロラーゼファミリー４３（「ＧＨ４３」）のメンバーから選択することができる。ＧＨ４３ファミリーの酵素は、既知の活性を数多く有する。例えば、ＧＨ４３ファミリーの酵素のうちＥＣ ３．２．１．５５として分類され得るものは、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有し得る。別の例では、ＧＨ４３ファミリーの酵素のうちＥＣ ３．２．１．９９として分類され得るものは、エンドアラビナナーゼ活性を有し得る。更に別の例では、ＧＨ４３ファミリーの酵素のうちＥＣ ３．２．１．１４５として分類され得るものは、ガラクタン１，３−β−ガラクトシダーゼ活性を有し得る。他の例では、ＧＨ４３ファミリーの酵素のうちＥＣ ３．２．１．３７として分類され得るものは、β−キシロシダーゼ活性を有し得る。ＧＨ４３ファミリーのうち、上記のもののようなβ−キシロシダーゼは、多くの場合反転型加水分解のみを実施できる一方で、ＧＨ３、ＧＨ３９、ＧＨ５２、及びＧＨ５４ファミリー由来の様々なβ−キシロシダーゼが、対照的に、保持型活性を有することと、加水分解及び糖鎖転移反応の両方を実施し得ることが報告されてきた。（Ｓｍａａｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３：５８２〜５９０）。
ＧＨ４３ファミリーの酵素は、典型的には、βシートの羽を５枚持つプロペラ様の３次元構造を有する。構造の「プロペラ」部分は、４本のストランドからなるβ−シートを含む、「羽」様の構造が、５回繰り返して折りたたまれることに由来する。一般塩基のｐＫａを調節する、一般塩基触媒、アスパラギン酸残基、一般酸触媒、グルタミン酸及びアスパラギン酸残基が、セロビブリオ・ジャポニクス（Cellvibrio japonicus）の結晶構造ＣｊＡｒｂ４３Ａを元に同定されており、かつ部位特異的変異導入により確認されている（Ｎｕｒｉｚｚｏ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９（９）６６５〜８を参照されたい）。触媒残基は、アミノ酸配列を通し広く分布している、３つの保存ブロック中に配置されている（Ｐｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５４：４２４〜４３２）。ＧＨ４３ファミリーのβ−キシロシダーゼ酵素に関し予想される触媒残基を図３２の配列中にボールド体の大文字で示し、かつ下線する。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスキシロシダーゼ（Ｂｒｕｘ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３５９：９７〜１０９）の結晶構造は、酵素が基質に結合するにあたり重要なものであり得るいくつかの更なる残基を示す。
上記節６．３．１．５に記載のように、反転型β−キシロシダーゼ活性は、好適なアッセイにより判定することができる。
したがって、本明細書において、特定の態様では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＧＨ４３ファミリーのメンバーである。例えば、酵素はＦｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、又はＸｙｎＢ３ポリペプチドである。このようなポリペプチドを以下に記載する。
６．４．１．Ｆｖ４３Ｄポリペプチド
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＦｖ４３Ｄポリペプチドである。Ｆｖ４３Ｄ（配列番号２）のアミノ酸配列は、図１９Ｂ、及び図３２の一段目に示す。配列番号２は、未成熟なＦｖ４３Ｄ配列である。Ｆｖ４３Ｄは、配列番号２の残基１〜２０に相当する（図１９Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２の残基２１〜３５０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される保存ドメイン残基を、図１９Ｂにボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｄは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、Ｄ３７若しくはＤ７１のいずれか、Ｄ１５５、及びＥ２５１である。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ４３Ｄポリペプチド」は、配列番号２の残基２１〜３５０間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、又は３２０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましいＦｖ４３Ｄポリペプチドは、天然Ｆｖ４３Ｄと比較したときに、残基Ｄ３７若しくはＤ７１、Ｄ１５５及びＥ２５１において変更が存在しない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、図３２のアラインメントに示されるように、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ｂ、及びＦｖ４３Ｅのうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで保存されているアミノ酸残基のうち、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％に変更が存在しない。Ｆｖ４３Ｄポリペプチドは、好適には、図１９Ｂに示すような天然Ｆｖ４３Ｄの、全体が予想された保存ドメインを含む。本発明の例示的なＦｖ４３Ｄポリペプチドは、図１９Ｂに示すような成熟Ｆｖ４３Ｄ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＦｖ４３Ｄポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＦｖ４３Ｄポリペプチドは、反転型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．４．２．Ｐｆ４３Ａポリペプチド
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＰｆ４３Ａポリペプチドである。Ｐｆ４３Ａ（配列番号８）のアミノ酸配列は、図２２Ｂ、及び図３２の四段目に示す。配列番号８は未成熟なＰｆ４３Ａ配列である。Ｐｆ４３Ａは、配列番号８の残基１〜２０に相当する（図２２Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号８の残基２１〜４４５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。図２２Ｂ中、予想触媒ドメイン残基はボールド体、予想炭水化物結合ドメイン残基は大文字、触媒ドメイン及び炭水化物結合ドメインを分離する予想リンカー残基はイタリック体である。Ｐｆ４３Ａは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、Ｄ３２若しくはＤ６０のいずれか、Ｄ１４５、及びＥ１９６である。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｐｆ４３Ａポリペプチド」は、配列番号８の残基２１〜４４５間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、天然Ｐｆ４３Ａと比較したときに、残基Ｄ３２若しくはＤ６０のいずれか、Ｄ１４５、及びＥ１９６において変更が存在しない。好ましくは、Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、図３２のアラインメントに示されるように、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ｂ、及びＦｖ４３Ｅのうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで保存されているアミノ酸残基のうち、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％に変更が存在しない。Ｐｆ４３Ａポリペプチドは、好適には、図２２Ｂに示すような天然Ｐｆ４３Ａの、全体が予想された保存ドメインを含む。本発明の例示的なＰｆ４３Ａポリペプチドは、図２２Ｂに示すような成熟Ｐｆ４３Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＰｆ４３Ａポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＰｆ４３Ａポリペプチドは、反転型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．４．３．Ｆｖ４３Ｅポリペプチド
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＦｖ４３Ｅポリペプチドである。Ｆｖ４３Ｅ（配列番号１０）のアミノ酸配列は、図２３Ｂ、及び図３２の九段目に示す。配列番号１０は、未成熟なＦｖ４３Ｅ配列である。Ｆｖ４３Ｅは、配列番号１０の残基１〜１８に相当する（図２３Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１０の残基１９〜５３０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される触媒ドメイン残基は、図２３Ｂにボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｅは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース及び混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、Ｄ４０若しくはＤ７１のいずれか、Ｄ１５５、及びＥ２４２である。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ４３Ｅポリペプチド」は、配列番号１０の残基１９〜５３０間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、天然Ｆｖ４３Ｅと比較したときに、残基Ｄ４０若しくはＤ７１、Ｄ１５５、及びＥ２４２において変更が存在しない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、図３２のアラインメントに示されるように、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ｂ、及びＦｖ４３Ｅのうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで保存されているアミノ酸残基のうち、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％に変更が存在しない。Ｆｖ４３Ｅポリペプチドは、好適には、図２３Ｂに示すような天然Ｆｖ４３Ｅの、全体が予想された保存ドメインを含む。本発明の例示的なＦｖ４３Ｅポリペプチドは、図２３Ｂに示すような成熟Ｆｖ４３Ｅ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＦｖ４３Ｅポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＦｖ４３Ｅポリペプチドは、反転型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．４．４．Ｆｖ４３Ｂポリペプチド
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＦｖ４３Ｂポリペプチドである。Ｆｖ４３Ｂ（配列番号１２）のアミノ酸配列は、図２４Ｂ、及び図３２の六段目に示す。配列番号１２は、未成熟なＦｖ４３Ｂ配列である。Ｆｖ４３Ｂは、配列番号１２の残基１〜１６に相当する（図２４Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号１２の残基１７〜５７４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される触媒ドメイン残基を、図２４Ｂにボールド体で示す。Ｆｖ４３Ｂは、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド及び／又はｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを基質として用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ活性の両方を有することが示された。Ｆｖ４３Ｂは、他のキシロシダーゼ酵素の存在下で、分枝鎖アラビノキシロオリゴマーからアラビノースを放出させ、オリゴマー混合物からのキシロースの放出を増加させることが示された。予測される触媒残基は、Ｄ３８若しくはＤ６８のいずれか、Ｄ１５１、及びＥ２３６である。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ４３Ｂポリペプチド」は、配列番号１２の残基１７〜４７２間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又は５５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、天然Ｆｖ４３Ｂと比較したときに、残基Ｄ３８若しくはＤ６８、Ｄ１５１及びＥ２３６において変更が存在しない。好ましくは、Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、図３２のアラインメントに示されるように、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ｂ、及びＦｖ４３Ｅのうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで保存されているアミノ酸残基のうち、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％に変更が存在しない。Ｆｖ４３Ｂポリペプチドは、好適には、図２４Ｂに示すような天然Ｆｖ４３Ｂの、全体が予想された保存ドメインを含む。本発明の例示的なＦｖ４３Ｂポリペプチドは、図２４Ｂに示すような成熟Ｆｖ４３Ｂ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＦｖ４３Ｂポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＦｖ４３Ｂポリペプチドは、反転型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．４．５．Ａｆ４３Ａポリペプチド
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＡｆ４３Ａポリペプチドである。Ａｆ４３Ａ（配列番号１４）のアミノ酸配列は、図２５Ｂ、及び図３２の七段目に示す。配列番号１４は、未成熟なＡｆ４３Ａ配列である。予測される保存ドメイン残基を、図２５Ｂにボールド体で示す。Ａｆ４３Ａは、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いるアッセイにおいて、並びにエンドキシラナーゼの作用により生成されたオリゴマーのセットを変換することで放出されるアラビノースにより、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、Ｄ２６若しくはＤ５８のいずれか、Ｄ１３９、及びＥ２２７である。
本明細書で使用するとき、用語、「Ａｆ４３Ａポリペプチド」は、配列番号１４のアミノ酸残基の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましくは、Ａｆ４３Ａポリペプチドは、天然Ａｆ４３Ａと比較したときに、残基Ｄ２６若しくはＤ５８、Ｄ１３９及びＥ２２７において変更が存在しない。好ましくは、Ａｆ４３Ａポリペプチドは、図３２のアラインメントに示されるように、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ｂ、及びＦｖ４３Ｅのうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで保存されているアミノ酸残基のうち、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％に変更が存在しない。Ａｆ４３Ａポリペプチドは、好適には、図２５Ｂに示すような天然Ａｆ４３Ａの、全体が予想された保存ドメインを含む。本発明の例示的なＦｖ４３Ｂポリペプチドは、図２５Ｂに示すような成熟Ａｆ４３Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＡｆ４３Ａポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＡｆ４３Ａポリペプチドは、反転型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．４．６．Ｆｏ４３Ａポリペプチド
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＦｏ４３Ａポリペプチドである。Ｆｏ４３Ａ（配列番号２４）のアミノ酸配列は、図３１Ｂ、及び図３２の２段目に示す。配列番号２４は、未成熟なＦｏ４３Ａ配列である。Ｆｏ４３Ａは、配列番号２４の残基１〜１７に相当する（図３１Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２４の残基２１〜３４８に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される保存ドメイン残基を、図３１Ｂにボールド体で示す。Ｆｏ４３Ａは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、Ｄ３７若しくはＤ７２のいずれか、Ｄ１５９、及びＥ２５１である。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｏ４３Ａポリペプチド」は、配列番号２４の残基２１〜３４８間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、又は３２０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましいＦｏ４３Ａポリペプチドは、天然Ｆｏ４３Ａと比較したときに、残基Ｄ３７若しくはＤ７２、Ｄ１５９及びＥ２５１において変更が存在しない。好ましくは、Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、図３２のアラインメントに示されるように、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ｂ、及びＦｖ４３Ｅのうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで保存されているアミノ酸残基のうち、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％に変更が存在しない。Ｆｏ４３Ａポリペプチドは、好適には、図３１Ｂに示すような天然Ｆｏ４３Ａの、全体が予想された保存ドメインを含む。本発明の例示的なＦｏ４３Ａポリペプチドは、図３１Ｂに示すような成熟Ｆｏ４３Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＦｏ４３Ａポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＦｏ４３Ａポリペプチドは、反転型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．４．７．Ｇｚ４３Ａポリペプチド
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＧｚ４３Ａポリペプチドである。Ｇｚ４３Ａ（配列番号２２）のアミノ酸配列は、図３０Ｂ、及び図３２の三段目に示す。配列番号２２は、未成熟なＧｚ４３Ａ配列である。Ｇｚ４３Ａは、配列番号２２の残基１〜１８に相当する（図３０Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号２２の残基１９〜３４０に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。予測される保存ドメイン残基を、図３０Ｂにボールド体で示す。Ｇｚ４３Ａは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。予測される触媒残基は、Ｄ３３若しくはＤ６８のいずれか、Ｄ１５４、及びＥ２４３である。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｇｚ４３Ａポリペプチド」は、配列番号２２の残基１９〜３４０間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、又は３００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましいＧｚ４３Ａポリペプチドは、天然Ｇｚ４３Ａと比較したときに、Ｄ３３若しくはＤ６８のいずれか、Ｄ１５４、及びＥ２４３の残基に変更が生じていないものである。好ましくは、Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、図３２のアラインメントに示されるように、Ｆｖ４３Ｄ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｐｆ４３Ｂ、及びＦｖ４３Ｅのうちの２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、７つ以上、８つ以上、又は９つすべてで保存されているアミノ酸残基のうち、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％に変更が存在しない。Ｇｚ４３Ａポリペプチドは、好適には、図３０Ｂに示すような天然Ｇｚ４３Ａの、全体が予想された保存ドメインを含む。本発明の例示的なＧｚ４３Ａポリペプチドは、図３０Ｂに示すような成熟Ｆｏ４３Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＧｚ４３Ａポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＧｚ４３Ａポリペプチドは、反転型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．４．８．ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（G.stearothermophilus）Ｂ３ポリペプチド
他の態様では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＢ３ポリペプチドである。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＸｙｎＢ３の配列を、配列番号２５として表わす。ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＸｙｎＢ３は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＴ−６由来の、アミノ酸残基５３５個のＧＨ４３ファミリーの酵素である。酵素は、キシロオリゴマーの非還元末端からキシロース単位を１つ切断させる、活性には、３つの触媒性残基Ｄ１５、Ｄ１２８、及びＥ１８７が不可欠であることが見出された（Ｓｈａｌｌｏｍ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４４：３８７〜３９７）。
本明細書で使用するとき、用語、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＸｙｎＢ３ポリペプチド」は、配列番号２５のアミノ酸残基の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００個の連続するアミノ酸と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。好ましいゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＸｙｎＢ３ポリペプチドは、天然ＸｙｎＢ３と比較したときに、残基Ｄ１５、Ｄ１２８、及びＥ１８７において変更が存在しない。本発明の好適なゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＸｙｎＢ３ポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。特定の実施形態では、本発明のゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＸｙｎＢ３ポリペプチドは反転型β−キシロシダーゼ活性を有する。
６．４．９．ビブリオｓｐ．（Vibrio sp.）ＸｌｏＡポリペプチド
特定の実施形態では、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はビブリオｓｐ ＸｌｏＡポリペプチドである。ビブリオｓｐ ＸｌｏＡはビブリオｓｐ．のＸＹ−２１４株由来のβ−１，３−キシロシダーゼである。
本明細書で使用するとき、用語、「ビブリオｓｐ ＸｌｏＡポリペプチド」は、ビブリオｓｐのＸＹ−２１４株由来のβ−１，３−キシロシダーゼの、少なくとも５０、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す（Ｕｍｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４（１）：３０５〜３０８；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＢ３００５６４）。本発明の好適なビブリオｓｐ ＸｌｏＡポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を有する。特定の実施形態では、本発明のビブリオｓｐ ＸｌｏＡポリペプチドは、反転型β−キシロシダーゼ活性を有する。
６．５保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素
本開示に従うと、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素を使用することで、ＳＳＦ反応時のＡＸＰ生成（例えば、ＥＸＰ）が改善又は増加される。したがって、本開示は、一態様では、保持型β−キシロシダーゼポリペプチドを少なくとも１つ含む組成物に関する。他の態様では、本開示は、完全発酵培地を培養することを含む、所望のＡＸＰ化合物の生成方法あるいはＳＳＦ反応時のＡＸＰ生成物の量を改善するすなわち増加させる方法に関し、完全発酵培地には保持型β−キシロシダーゼポリペプチドを少なくとも１つ含む。
好適な反転型β−キシロシダーゼポリペプチドは、グリコシドヒドロラーゼファミリー３（「ＧＨ３」）、ＧＨ３０、ＧＨ３１、ＧＨ３９、ＧＨ５２、ＧＨ５４、又はＧＨ１１６ファミリーの酵素のメンバーから選択することができる。
上記６．３．１．５節に記載のように、保持型β−キシロシダーゼ活性は、好適なアッセイにより判定することができる。
したがって、特定の態様では、本明細書において、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素は、ＧＨ３、ＧＨ３０、ＧＨ３１、ＧＨ３９、ＧＨ５２、ＧＨ５４、又はＧＨ１１６ファミリーのメンバーである。例えば、酵素はアスペルギルス・ジャポニクスＸｌｎＤ、フザリウム・バーティシリオイデス（Fusarium verticillioides）Ｆｖ３０Ａ、フザリウム・バーティシリオイデスＦｖ３０Ｂ、フザリウム・バーティシリオイデスＦｖ３９Ａ、フザリウム・バーティシリオイデスＦｖ３９Ｂ、サーモアナエロバクター・サッカロリティカム（Thermoanaerobacter saccharolyticum）ＸｙｎＢ、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＸｙｌＡ、又はトリコデルマ・コニンギ（ヒポクレア・コニンギ（Hypocrea koningii））Ｘｙｌ１ポリペプチドである。このようなポリペプチドを以下に記載する。
６．５．１．アスペルギルス・ジャポニクスＸｌｎＤポリペプチド
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素は、ＸｌｎＤポリペプチドである。ＸｌｎＤ（配列番号４０）のアミノ酸配列は、図３５Ｂに示すものである。配列番号４０は、未成熟なＸｌｎＤ配列である。ＸｌｎＤは、配列番号４０の残基１〜１７に相当する（図３５Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４０の残基１８〜８０４に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
本明細書で使用するとき、用語、「ＸｌｎＤポリペプチド」は、配列番号４０の残基１８〜８０４間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、又は７５０個の連続するアミノ酸と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。本発明の例示的なＸｌｎＤポリペプチドは、図３５Ｂに示すような成熟ＸｌｎＤ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＸｌｎＢポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＸｌｎＢポリペプチドは、保持型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．５．２．フザリウム・バーティシリオイデスＦｖ３０Ａポリペプチド
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＦｖ３０Ａポリペプチドである。ＸｌｎＤ（配列番号４２）のアミノ酸配列を図３６Ｂに示す。配列番号４２は、未成熟なＦｖ３０Ａ配列である。ＸｌｎＤは、配列番号４２の残基１〜１９に相当する（図３６Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４２の残基２０〜５３７に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３０Ａポリペプチド」は、配列番号４２の残基２０〜５３７間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。本発明の例示的なＦｖ３０Ａポリペプチドは、図３６Ｂに示すような成熟Ｆｖ３０Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＦｖ３０Ａポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＦｖ３０Ａポリペプチドは、保持型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．５．３．フザリウム・バーティシリオイデスＦｖ３０Ｂポリペプチド
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＦｖ３０Ｂポリペプチドである。Ｆｖ３０Ｂ（配列番号４４）のアミノ酸配列を図３７Ｂに示す。配列番号４４は、未成熟なＦｖ３０Ｂ配列である。Ｆｖ３０Ｂは、配列番号４４の残基１〜２４に相当する（図３７Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４４の残基２５〜４８５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３０Ｂポリペプチド」は、配列番号４４の残基２５〜４８５間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。本発明の例示的なＦｖ３０Ｂポリペプチドは、図３７Ｂに示すような成熟Ｆｖ３０Ｂ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＦｖ３０Ｂポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＦｖ３０Ｂポリペプチドは、保持型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．５．４．フザリウム・バーティシリオイデスＦｖ３９Ａポリペプチド
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＦｖ３９Ａポリペプチドである。Ｆｖ３９Ａ（配列番号４６）のアミノ酸配列を図３８Ｂに示す。配列番号４６は、未成熟なＦｖ３９Ａ配列である。Ｆｖ３９Ａは、配列番号４６の残基１〜１９（図３８Ｂの下線箇所）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４６の残基２０〜４３９に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３９Ａポリペプチド」は、配列番号４６の残基２０〜４３９間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、又は４００個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。本発明の例示的なＦｖ３９Ａポリペプチドは、図３８Ｂに示すような成熟Ｆｖ３９Ａ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＦｖ３９Ａポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＦｖ３９Ａポリペプチドは、保持型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．５．５．フザリウム・バーティシリオイデスＦｖ３９Ｂポリペプチド
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＦｖ３９Ｂポリペプチドである。Ｆｖ３９Ｂ（配列番号４８）のアミノ酸配列を図３９Ｂに示す。配列番号４８は、未成熟なＦｖ３９Ｂ配列である。Ｆｖ３９Ｂは、配列番号４８の残基１〜１８に相当する（図３９Ｂの下線箇所）予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号４８の残基１９〜４５６に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｆｖ３９Ｂポリペプチド」は、配列番号４８の残基１９〜４５６間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、又は３５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。本発明の例示的なＦｖ３９Ｂポリペプチドは、図３９Ｂに示すような成熟Ｆｖ３９Ｂ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＦｖ３９Ｂポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＦｖ３９Ｂポリペプチドは、保持型β−キシロシダーゼ活性を持つ。
６．５．６．サーモアナエロバクター・サッカロリティカムＸｙｎＢポリペプチド
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＸｙｎＢポリペプチドである。ＸｙｎＢ（配列番号５０）のアミノ酸配列を図４０Ｂに示す。ＸｙｎＢは、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズム（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）により予想されるシグナル配列を有さない。
本明細書で使用するとき、用語、「ＸｙｎＢポリペプチド」は、配列番号５０のアミノ酸残基の、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。本発明の例示的なＸｙｎＢポリペプチドは、図４０Ｂに示すような成熟ＸｙｎＢ配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明の好適なＸｙｎＢポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を持つ。特定の実施形態では、本発明のＸｙｎＢポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を保有する。
６．５．７．ゲオバチルス・ステアロサーモフィルスＸｙｌＡポリペプチド
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＸｙｌＡポリペプチドである。ＸｙｌＡ（配列番号５２）のアミノ酸配列を図４１Ｂに示す。ＸｙｎＡは、ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズム（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）により予想されるシグナル配列を有さないが、Ｕｎｉｐｒｏｔアルゴリズム（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ）から予想されるシグナル配列（配列番号５２の残基１〜１８に相当する（下線部））は有する。シグナル配列の切断により、配列番号５２の残基１９〜７０５に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
本明細書で使用するとき、用語、「ＸｙｌＡポリペプチド」は、配列番号５２の少なくとも５０、例えば、少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、又は６５０個の連続するアミノ酸残基、又は配列番号５２の残基１９〜７０５に相当するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含むポリペプチド及び／又はその変異体を指す。本発明の例示的なＸｙｌＡポリペプチドは、図４１Ｂに示す成熟ＸｙｌＡ配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明のＸｙｌＡポリペプチドは、好適にはβ−キシロシダーゼ活性を有する。特定の実施形態では、本発明のＸｙｌＡポリペプチドは、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する。
６．５．８．トリコデルマ・コニンギ（ヒポクレア・コニンギ）Ｘｙｌ１ポリペプチド
特定の実施形態では、保持型β−キシロシダーゼ活性を有する酵素はＸｙｌ１ポリペプチドである。Ｘｙｌ１（配列番号５４）のアミノ酸配列を図４２Ｂに示す。配列番号５４は、未成熟なＸｙｌ１配列である。Ｘｙｌ１は配列番号５４の残基１〜２１（図４２Ｂ中下線部）に相当する予想シグナル配列を有する。シグナル配列の切断により、配列番号５４の残基２２〜５００に相当する配列を有する成熟タンパク質が生成されるものと予測される。
本明細書で使用するとき、用語、「Ｘｙｌ１ポリペプチド」は、配列番号５４の残基２２〜５００間の、少なくとも５０個、例えば、少なくとも少なくとも７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、又は４５０個の連続するアミノ酸残基と、少なくとも８５％、例えば、少なくとも８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％配列同一性を有する配列を含む、ポリペプチド及び／又はその変異体を指す。本発明の例示的なＸｙｌ１ポリペプチドは、図４２Ｂに示す成熟Ｘｙｌ１配列と、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性を有する配列を含む。本発明のＸｙｌ１ポリペプチドは、好適にはβ−キシロシダーゼ活性を有する。特定の実施形態では、本発明のＸｙｌ１ポリペプチドは、β−キシロシダーゼ活性を保有する。
６．６ ＳＳＦに使用する酵素を生成するための組み換え法
６．６．１．核酸及び発現ベクター
反転型β−キシロシダーゼポリペプチド又は他の糖化酵素（１つ又は複数）（例えば、セルラーゼ又はヘミセルラーゼ）を含む、ＳＳＦに使用する酵素（「ＳＳＦ酵素」）をコードしている天然又は合成ポリヌクレオチド断片を、非同一性の核酸コンストラクト又はベクターに組み込むことができる。次いで、これらのベクターを、好適な宿主細胞（例えば、糸状真菌、酵母、又はバクテリア細胞など）に導入又は複製することができる。本明細書で開示されるベクター及び方法を使用して、１つ以上のＳＳＦ酵素を発現させることができる。導入された細胞内で複製可能でありかつ実行可能であるならば、任意のベクターを使用することができる。多くの好適なベクター及びプロモータが当業者に既知であり、その内の多くのものは市販されている。クローニングベクター及び発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）などの文献に明示的に記載されてきた。これらの文献が対照とする各発現ベクターの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。真菌宿主セルセア（cellsare）に好適な、他の例示的な発現ベクターは、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｌａｓｕｒｅ（ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．３９６〜４２８．に記載されている。
対象とする様々なＤＮＡ配列を、様々な標準的な手順を用いプラスミド又はベクター（総じて本明細書では「ベクター」と呼ぶ）に挿入することができることは、当該技術分野において既知である。典型的には、例えば、対象とするＤＮＡ配列は、標準的な手順を用い、標準的な条件下で、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。このような手順及び関連するサブクローニング法は、当業者の認識の範囲内のものである。
ＳＳＦ酵素をコードしているＤＮＡ配列を、糸状菌宿主細胞の遺伝子材料内に含む、非同一性の核酸コンストラクトを組み込むことで、ＳＳＦ酵素のコード配列を含む組み換え糸状菌を作製することができる。
ＳＳＦ酵素をコードしている所望の形態の核酸配列が得られたならば、この核酸配列は、所望により様々な方法で改変することができる。配列が、フランキング領域をコードしていない領域を包含する場合、フランキング領域には、削除、変異導入などを行なうことができる。したがって、天然に生じる配列に対し転移、塩基転換、欠失、及び／又は挿入を実施することができる。
選択されたＳＳＦ酵素コード配列は、周知の組み換え技法に従い、ＳＳＦ酵素を発現することのできる糸状菌宿主細胞を形質転換させるのに使用することができる好適なベクター内に挿入することができる。遺伝暗号には縮重が固有であることから、実質的に同様の又は機能的に等価のアミノ酸配列をコードしている他のＤＮＡ配列を使用して、ＳＳＦ酵素をクローン化し、発現させることができる。
本開示は、上記のような、ＳＳＦ酵素をコードしている核酸配列を１つ以上含む、組み換え核酸コンストラクトも包含する。それぞれのコンストラクトは、好適には、順方向又は逆方向で本開示の配列が挿入されたベクター、例えばプラスミド又はウイルスベクターを含む。
非同一性の核酸コンストラクトは、好適にはＳＳＦ酵素のコード配列を：（ｉ）単独で。（ｉｉ）追加のコード配列、例えば、所望のＳＳＦ酵素コード配列が優性コード配列である融合タンパク質又はシグナルペプチドコード配列などとの組み合わせで。（ｉｉｉ）１つ以上の非コード配列、例えば、イントロン及び調節領域（例えば、好適な宿主でコード配列を発現させるのに有効な、プロモータ及びターミネータ領域、又は５’及び／又は３’非翻訳領域）との組み合わせで。及び／又は（ｉｖ）ＳＳＦ酵素コード配列が、宿主細胞に対し非同一性のものである、ベクター又は宿主環境中で、含有し得る。
特定の態様では、非同一性の核酸コンストラクトを使用して、ＳＳＦ酵素コード核酸配列を、インビトロで細胞、例えば樹立された糸状菌又は酵母の細胞株内に移行させる。ＳＳＦ酵素を長期にわたって生成させるにあたり、発現が安定的であることは好ましい。それにともない、安定な形質転換細胞を生成するのに効果的である任意の方法を好適に使用して、本明細書に開示される発明を実施することができる。
適切なベクターは、典型的には、選択マーカーをコードしている核酸配列、挿入部位、及び好適な調節領域、例えば、プロモータ及びターミネータ配列など、を備える。ベクターは、例えば、制御可能であるようにコード配列と連結され、かつ宿主細胞においてコード配列を発現させるのに有効な、イントロン及び調節領域などの非コード配列を含む、制御配列を含み得る。例えば、好適な調節領域としては、プロモータ及びターミネータ領域、又は５’及び／又は３’非翻訳領域が挙げられる。様々なベクター及びプロモータが当業者に既知であり、その内の多くのものが市販されている。同様に、好適なベクター及びプロモータは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）などの文献に記載される。
例示的なプロモータとしては、例えば、限定するものではないが、ＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモータ、ＥＦ−１αプロモータ、テトラサイクリン応答因子（ＴＲＥ）をｔｅｔ−ｏｎ又はｔｅｔ−ｏｆｆシステムに含有しているプロモータ（例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ（登録商標）及びＴｅｔ−Ｏｆｆ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍに関する、ＣｌｏｎＴｅｃｈの記載を参照されたい）、又は特定の金属塩を付加することで上方制御することができるβアクチンプロモータ及びメタロチオニンプロモータなどの、常時発現型プロモーター及び誘導型プロモーターが挙げられる。プロモータ配列は、発現を目的とする特定の糸状菌宿主細胞により認識されるＤＮＡ配列である。このＤＮＡ配列は、制御できる状態で、対象とするＳＳＦ酵素をコードするＤＮＡ配列と連結される。連結させることで、発現ベクター内で対象とするＳＳＦ酵素をコードするＤＮＡ配列の開始コドンに対し、プロモータが配置される。プロモータ配列は、対象とするＳＳＦ酵素の発現を仲介する、転写及び／又は翻訳制御配列を含有する。例としては、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・アワモリ（A.awamori）、又はアスペルギルス・オリザエ（A.oryzae）のグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、又はα−グルコシダーゼコード遺伝子。アスペルギルス・ニデュランス（A.nidulans）のｇｐｄＡ又はｔｒｐＣ遺伝子；ニューロスポラ・クラッサのｃｂｈ１又はｔｒｐ１遺伝子；アスペルギルス・ニガー（A.niger）又はリゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のアスパラギン酸プロテアーゼコード遺伝子；ヒポクレア・ジェコリナ（H.jecorina）のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、又は他のセルラーゼコード遺伝子、由来のプロモータが挙げられる。
選択マーカーの選択は、宿主細胞、並びに当該技術分野において既知である、異なる宿主細胞で使用するのに好適な適切な選択可能なマーカー、によって決まる。例示的な選択可能なマーカー遺伝子としては、アスペルギルス・ニデュランス又はヒポクレア・ジェコリナ由来のａｒｇＢ、アスペルギルス・ニデュランス由来のａｍｄＳ、ニューロスポラ・クラッサ又はヒポクレア・ジェコリナ由来のｐｙｒ４、アスペルギルス・ニガー又はアスペルギルス・ニデュランス由来のｐｙｒＧが挙げられる。他の好適な選択マーカーとしては、例えば、トリプトファン、ピリミジン又はロイシン要求性変異株などの変異株を形質転換するために使用される非同一性の核酸コンストラクトに含有される、ｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤ又はｌｅｕ２が挙げられる。
このような選択マーカーは、本来であれば宿主細胞により代謝されない代謝生成物を利用するための能力を形質転換体に付与し得る。例えば、酵素アセトアミダーゼをコード化する、ヒポクレア・ジェコリナ由来のａｍｄＳ遺伝子は、アセトアミドを窒素源として形質転換細胞を増殖させる。更なる実施例では、選択マーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は、栄養要求性の変異株が選択用最少培地で増殖するための能力を復元することができる。更に他の実施例では、選択マーカー（例えば、ｏｌｉｃ３１）は、阻害剤又は抗生物質の存在下で増殖するための能力を形質転換体に付与することができる。
選択マーカーのコード配列は、当該技術分野において既知の方法及び技術を用い、プラスミド中に好適にクローン化される。例示的なプラスミドとしては、限定するものではないが、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ、及びｐＵＣ１００が挙げられる。例えば、ｐＲＡＸプラスミドは、アスペルギルス・ニガーでの複製を可能にする、アスペルギルス・ニデュランス由来のＡＭＡＬ配列を含有する。
本開示の実施は、別途記載のない限り、当該技術の範囲内のものである、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学に関する、従来の技術を採用する。このような技術は、文献中に広範に記載される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，２００５，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）；及びＤｕｎｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗｉｌｅｙ）を参照されたい。本明細書で引用されるすべての特許、特許公報、記事及び出版物は、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
６．６．２．宿主微生物及びタンパク質発現
本明細書に記載の方法に使用するために、対象とするＳＳＦタンパク質を発現するよう遺伝子操作されている宿主細胞を、本開示により提供する。好適な宿主細胞としては、任意の微生物が挙げられる（例えば、バクテリア、原生生物、藻類、真菌（例えば、酵母、又は糸状菌）、又は任意の他の微生物）。好適な宿主細胞は、好ましくはバクテリア、酵母、又は糸状菌細胞である。
好適なバクテリア種としては、限定するものではないが、エシェリキア（Escherichia）、バチルス、ラクトバチルス（Lactobacillus）、シュードモナス（Pseudomonas）及びストレプトマイセス（Streptomyces）が挙げられる。好適なバクテリア種としては、限定するものではないが、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・ズブチルス、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、ラクトバチルス・ブレビス、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）及びストレプトマイセス・リビダンスが挙げられる。
好適な酵母属としては、限定するものではないが、サッカロマイセス、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hansenula）、ピキア、クリベロマイセス（Kluyveromyces）、及びファフィア（Phaffia）が挙げられる。好適な酵母種としては、限定するものではないがサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ピキアパストリス（Pichia pastoris）、ピキア・カナデンシス（Ｐ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）及びファフィア・ロードザイマ（Phaffia rhodozyma）が挙げられる。
好適な糸状菌としては、糸状形態のすべてのユーミコチナ（Eumycotina）亜門が挙げられる。好適な糸状菌属としては、限定するものではないが、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギルス、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ブジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、クリソポリウム（Chrysoporium）、コプリナス（Coprinus）、コリオラス（Coriolus）、コリナスカス（Corynascus）、ケトミウム（Chaertomium）、クリプトコッカス（Cryptococcus）、フィロバシジウム（Filobasidium）、フザリウム（Fusarium）、ジベレラ（Gibberella）、ヒュミコラ、マグナポルテ（Magnaporthe）、ムコール、マイセリオフトラ、ムコール、ネオカリマスティクス（Neocallimastix）、ニューロスポラ、パエシロマイセス（Paecilomyces）、ペニシリウム、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フレビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、スキタリジウム（Scytaldium）、シゾフィラム（Schizophyllum）、スポロトリカム（Sporotrichum）、タラロマイセス（Talaromyces）、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム、トラメテス、及びトリコデルマが挙げられる。
好適な糸状菌種としては、限定するものではないが、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フミガタス、アスペルギルス・フォエチダス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペルギルス・ニデュランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、クリソスポリウム・ラックノウエンス、フザリウム・バクトリジオイデス、フザリウム・セレアリス、フザリウム・クルックウェレンス、フザリウム・カルモラム、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・グラミナム、フザリウム・ヘテロスポラム、フザリウム・ネグンジ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・レティクラタム、フザリウム・ロゼウム、フザリウム・サムブシナム、フザリウム・サルコクロム、フザリウム・スポロトリキオイド、フザリウム・サルフレウム、フザリウム・トルロサム、フザリウム・トリコテシオイド、フザリウム・ベネナタム、ブジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・アネイリナ、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、セリポリオプシス・リブローサ（Ceriporiopsis rivulosa）、セリポリオプシス・スブフファ（Ceriporiopsis subrufa）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、コプリナス・シネレウス（Coprinus cinereus）、コリオラス・ヒルストゥス（Coriolus hirsutus）、ヒュミコラ・インソレンス、ヒュミコラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエヘイ、マイセリオフトラ・サーモフィラ、ニューロスポラ・クラッサ、ニューロスポラ・インターメディア（Neurospora intermedia）、ペニシリウム・パープロゲナム、ペニシリウム・カネスセンス（Penicillium canescens）、ペニシリウム・ソリタム（Penicillium solitum）、ペニシリウム・フニクロサム、ファネロカエテ・クリソスポリウム、フレビア・ラジエート（Phlebia radiate）、プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、チエラビア・テレストリス、トラメテス・ビローサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・リーゼイ、及びトリコデルマ・ビリデが挙げられる。
例えば、本明細書に記載の方法に従って、組み換えＳＳＦ酵素の発現コンストラクトが生成されたならば、所定の方法論を用い、好適な宿主細胞をコンストラクトで形質転換させることができる。
６．６．３．酵素の単離及び／又は精製法
特定の態様では、組み換えＳＳＦ酵素が宿主細胞の培養培地に分泌されるよう、シグナル配列を用い、組み換えＳＳＦ酵素を設計する。特定の態様では、対象とするＳＳＦ酵素は発酵ブロスの形態で回収される。本明細書で使用するとき、用語「発酵ブロス」は、発酵により生成され、かつ次いで全く又はほとんど回収及び／又は精製されていない酵素調製物を指す。例えば、微生物培養物は、炭素を制限した条件下でインキュベーションすることでタンパク質を合成（例えば、酵素を発現）させると、増殖して飽和状態になる。細胞培養培地中に酵素が分泌されたならば、発酵ブロスは、対象とするＳＳＦ酵素を回収することができるブロスになる。例えば、発酵ブロスは、発酵終了時に得られる発酵材料の、分画されていない又は分画された含有物を含有し得る。典型的には、発酵ブロスは分画されておらず、使用した培養培地、並びに微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）を例えば遠心沈降により除去した後に存在する細胞片、を含む。特定の実施形態では、発酵ブロスは使用した細胞培養培地、細胞外酵素、及び微生物細胞の生細胞若しくは死細胞を含有する。一部の実施形態では、発酵ブロスは微生物細胞を除去するために、使用した細胞培養培地及び細胞外酵素を含むように分画される。
一部の態様では、ＳＳＦ酵素がある程度又は完全に精製されることが望ましい。特定の実施形態では、ＳＳＦ酵素は少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％均一になるよう精製される。
しかしながら、他のある種の態様では、対象とするＳＳＦ酵素は、細胞内形態で生成される場合があり（すなわち、不完全に又は完全に分泌されていない）、細胞可溶化物から回収する必要があり得る。このような場合、ＳＳＦ酵素は、当該技術分野で慣習的に選択される技術を用い生成された細胞から精製される。このような技術の例としては、限定するものではないが、アフィニティクロマトグラフィー（例えば、ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９８４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１６９：２１５〜２１８を参照されたい）、イオン交換クロマトグラフィー法（例えば、Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ．３６：３７〜５０；Ｆｌｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：３１４〜３１８；Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：３３６〜３４５；Ｅｌｌｏｕｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３９６：３０７〜３１７を参照されたい）、高い分離能を有する物質を選択するイオン交換クロマトグラフィー法（例えば、Ｍｅｄｖｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８０８：１５３〜１６５を参照されたい）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（例えば、Ｔｏｍａｚ ａｎｄ Ｑｕｅｉｒｏｚ，１９９９，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８６５：１２３〜１２８を参照されたい）、並びに二相分配（例えば、Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ７：２８７〜２９５を参照されたい）が挙げられる。
好適には、ＳＳＦ酵素は、例えば、抗体又は受容体などの特定の結合剤又は溶媒に対する結合親和性；特定の分子量範囲；又は特定の等電点範囲などの、予め同定された特徴を有するタンパク質を分離するよう画分される。
所定のＳＳＦ酵素が発現されたならば、生成されたＳＳＦ酵素は、細胞又は細胞培養物から精製することができる。このような精製に好適な例示的な手順としては、限定するものではないが、抗体アフィニティクロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂（ＤＥＡＥ）でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；及び例えばＳｅｐｈａｄｅｘＧ−７５を用いるゲルろ過、などが挙げられる。タンパク質精製に関する様々な方法を選択することができ、かつこれらの方法は当該技術分野において既知であり、文献に広範に記載されている。例えば、タンパク質精製法は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（５７）：７７９；及びＳｃｏｐｅｓ，１９８２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９０：４７９〜９１に記載される。
多くの場合、精製工程（１工程又は複数工程）又は方法の選択は、例えば、生成プロセスの性質、及び生成される特定のタンパク質に応じて異なる。
６．６．４．発酵微生物
本開示のＳＳＦ法は、「発酵微生物」を使用することで、付随する糖化反応で生成された糖及び／又は系に加えられた糖から発酵生成物（例えば、エタノール）を生成する。エタノールを生成することのできる発酵微生物は、しばしばエタノロジェン（ethanologen）と呼ばれる。
本明細書で使用するとき、用語、「発酵微生物」は、所望の発酵プロセスで使用するのに好適な任意の微生物を指す。本開示に従う好適な発酵微生物は、発酵することができるものであり、すなわち、糖、例えば、グルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、又はオリゴ糖などを、直接的に又は間接的に所望の発酵生成物へと転換することのできるものである。
好適な発酵微生物の例としては、限定するものではないが、真菌微生物、例えば酵母などが挙げられる。具体的には、好適な酵母は、サッカロマイセスｓｐｐ．（サッカロマイセスｓｐｐ．）の菌株から選択することができ、具体的には、サッカロマイセス・セレヴィシエが挙げられる。様々な種類の酵母が市販されており、その内のいくつか、例えば、ＥＴＨＡＮＯＬ ＲＥＤ（商標）酵母（Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ／Ｌｅｓａｆｆｒｅ，ＵＳＡから入手可能）、ＦＡＬＩ（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ’ｓ Ｙｅａｓｔ，ＵＳＡから入手可能）、ＳＵＰＥＲＳＴＡＲＴ（商標）及びＴＨＥＲＭＯＳＡＣＣ（登録商標）フレッシュイースト（Ｅｔｈａｎｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能）、ＢＩＯＦＥＲＭ ＡＦＴ及びＸＲ（ＮＡＢＣ−−Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＧＡ，ＵＳＡから入手可能）、ＧＥＲＴ ＳＴＲＡＮＤ（Ｇｅｒｔ Ｓｔｒａｎｄ ＡＢ，Ｓｗｅｄｅｎから入手可能）、又はＦＥＲＭＩＯＬ（ＤＳＭ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓから入手可能）を、本明細書に記載の本発明の方法を実施するために選択することができる。
他の態様では、酵母はサッカロマイセス・ディスタティクス（Saccharomyces distaticus）又はサッカロマイセス・ウバルム（Saccharomyces uvarum）である。更に他の態様では、酵母はクリベロマイセスである。非限定例としては、クリベロマイセス（Kluvermoyces）としては、クリベロマイセス・マルキシアヌス、又はクリベロマイセス・フラジリス（Kluyveromyces fragilis）が挙げられる。更に他の態様では、酵母はカンジダである。カンジダの非限定例としては、カンジダ・シュードトロピカリス（Candida pseudotropicalis）及びカンジダ・ブラシカエ（Candida brassicae）が挙げられる。更に他の態様では、酵母はクラビスポラ（Clavispora）である。クラビスポラの非限定例としては、クラビスポラ・ルジタニエ（Clavispora lusitaniae）及びクラビスポラ・オプンティア（Clavispora opuntiae）が挙げられる。他の態様では、酵母はパチソレン（Pachysolen）、例えば、パチソレン・タノフィルス（Pachysolen tannophilus）である。他の態様では、酵母はブレタノマイセス（Bretannomyces）であり、例えば、ブレタノマイセス・クラウセニイ（Bretannomyces clausenii）である。酵母発酵は文献に記載されている。例えば、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，１９９６，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ（Ｗｙｍａｎ，ｅｄ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１７９〜２１２）を参照されたい。
グルコースをエタノールヘと効果的に発酵することのできるバクテリアとしては、例えば、ザイモモナス・モビリス及びクロストリジウム・サーモセラムが挙げられる（例えば、上掲のＰｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，１９９６を参照されたい）。
サッカロマイセス・セレヴィシエで（例えば、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｈｏ，１９９３，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９〜４０：１３５〜１４７；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：１８５２〜１８５９を参照されたい）、あるいはエシェリキア・コリ（例えば，Ｂｅａｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．３８：２９６〜３０３を参照されたい）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ（例えば，Ｉｎｇｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５８：２０４〜２１４を参照されたい）、又はザイモモナス・モビリス（例えば，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：２４０〜２４３；Ｄｅａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：４４６５〜４４７０を参照されたい）などの微生物で、非同一性の遺伝子のクローニングを行なうことで、ヘキソース及びペントースをエタノールへと転換（共発酵）することのできる微生物が作製されるこのような微生物は、本開示の方法に有利に使用することができる。
特定の実施形態では、発酵微生物は、酢酸塩に対する耐性を改良したザイモモナス・モビリスである（例えば、米国特許公報第２００９／０２２１０７８号を参照されたい）。
特定の実施形態では、発酵微生物はキシロースの利用効率を改良したザイモモナス・モビリスである（例えば、米国特許公報第２００９／０２４６８４６号を参照されたい）。
特定の実施形態では、発酵微生物は、ペントースをエタノールに発酵する能力を有するザイモモナス・モビリスである（例えば、米国特許公報第２００３／０１６２２７１号を参照されたい）。
６．６．５．発酵培地
一部の態様では、本開示のＳＳＦ反応又は方法は、発酵培地又は完全発酵培地で実施される。本明細書で使用するとき、用語、「発酵培地」は、ＳＳＦ反応を行う前に、反応に必要とされるすべての成分が存在している培地を指す。したがって、発酵培地は、例えば不完全な糖化プロセスから得られる培地であり得る。他の実施形態では、発酵培地は、ＳＳＦ反応を行なうのに必要とされるすべての成分を含有している培地であり得る。この場合、発酵培地は「完全発酵培地」とも呼ばれる。加えて、更に他の実施形態では、発酵培地は、ＳＳＦ反応の進行中又は反応下で、特定の糖化生成物を含有することのできるような培地であり得る。
完全発酵培地は、炭水化物系のセルロース系基質又は他の基質を加水分解することのできる酵素、発酵微生物、及び炭水化物系のセルロース系基質又は他の基質（例えば、以下６．７．２節に記載のものなど）を含有する。完全発酵培地での培養過程にわたり、酵素加水分解により発酵性の糖が形成され、次に、この糖が発酵微生物により代謝されることで、発酵生成物が生成される。
６．７．同時糖化発酵プロセス
特定の態様では、本開示のＳＳＦ反応は、２５℃〜５０℃の温度で実施される。例えば、ＳＳＦ反応は、２５℃以上、２８℃以上、３０℃以上、３２℃以上、３５℃以上、又は３８℃以上の温度で実施される。例えば、ＳＳＦ反応は、５０℃以下、４５℃以下、４０℃以下、３８℃以下、３５℃以下、又は３０℃以下の温度で実施される。例えば、ＳＳＦ反応は、２８℃〜４５℃、例えば３０℃〜４０℃、３２℃〜３８℃の範囲の温度で実施される。例示的な実施形態では、ＳＳＦ反応は、３２℃〜３５℃の温度で実施される。他の実施形態では、ＳＳＦ反応は約３２℃の温度で実施される。実施されるＳＳＦ反応の温度は、例えば、反応時に調節して上昇させても低下させてもよい。
ＳＳＦでは、セルロースの酵素加水分解、並びにグルコースからエタノールへの発酵を一工程に組み合わせる（例えば、Ｐｈｉｌｉｐｐｉｄｉｓ，１９９６，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｗｙｍａｎ，ｅｄ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．１７９〜２１２を参照されたい）。
ＳＳＦプロセスは、通常、バッチ式発酵プロセスとして実施される。この発酵は、開始から終了まで単一の槽で行われる。あるいは、ＳＳＦプロセスは、中断させずに操作され、発酵の各ステージが所与の発酵系の別個のセクションで生じ、必要とされる滞留時間に対応するように流速が設定される、定常状態の発酵系である、連続的な発酵プロセスとして実施することができる。換言すれば、本開示の発酵プロセスの個々の工程は、バッチ式又は連続式で実施することができる。すべての工程がバッチ式で実施されるプロセス、又はすべての工程が連続式で実施されるプロセス、又は１つ以上の工程がバッチ式で実施され、かつ１つ以上の工程が連続式で実施されるプロセスが本明細書で企図される。
特定の実施形態では、フェドバッチ式ＳＳＦプロセスが望ましいものであり得る。フェドバッチ式プロセスは、バッチ相及び供給相を必要とする。バッチ相の培養培地及び供給相で添加された培養培地は基地の組成のものであり、かつ供給相の培養培地を、予め定めた指数関数に従う供給速度で少なくとも供給相を分画するために添加することで、固有の成長率を予め定めた値に維持した。
本開示のＳＳＦ反応は、３〜７日間で好適に進行させることができる。例えば、本開示のＳＳＦ反応は、３、４、５、６、又は７日間進行させることができる。
本開示のＳＳＦ発酵プロセスとしては、限定するものではないが、発酵生成物を生成させるために使用される発酵プロセスであって、アルコール（例えば、エタノール、メタノール、ブタノール、１，３−プロパンジオール）；又は有機酸（ganic acids）（例えば、クエン酸、酢酸、イタコン酸、乳酸、グルコン酸、グルコン酸塩、乳酸、コハク酸、２，５ジケト−Ｄ−グルコン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、グルタミン酸）；気体（例えば、Ｈ２及びＣＯ２）、及びより複雑な化合物、例えば、抗生物質（例えば、ペニシリン及びテトラサイクリン）；酵素；ビタミン（例えば、リボフラビン、Ｂ１２、β−カロテン）；ホルモン、及び他の化合物などを包含する発酵プロセスが挙げられる。
特定の態様では、本開示は、ザイモモナスなどの発酵バクテリアの組み換え体を使用するのに特に好適である、ＳＳＦ条件（すなわち、本明細書では、ザイモモナス組み換え体ＳＳＦ条件」とも呼ぶ）の設定を提供する。例えば、これらの条件には、前処理した基質、例えば、トウモロコシの穂軸、バガス、クラフトパルプ基質などを用い、好適なザイモモナス・モビリス組み換え体下でＳＳＦフラスコを嫌気的に用意することと、約３３℃、ｐＨ ５．８、かつ特定の基質及び前処理に応じ固形分含量約１０重量％〜２５重量％で、前処理反応を実施すること、を包含する。これらの条件には、例えば、好適なザイモモナス・モビリス株、例えば、ＺＷ７０５株（組み換え体）又はＺＷ１（野生型）株の接種菌液（５ｇ）を、任意の追加の栄養素は加えずに反応混合物中に１０％添加することにより発酵を開始することも包含する。
特定の態様では、本開示は、真菌などの発酵微生物、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ酵母を使用するのに、特に好適であるＳＳＦ条件（すなわち、本明細書では「酵母ＳＳＦ条件」とも呼ばれる）の設定を提供する。例えば、これらの条件には、好適な酵母株により反応を実施すること、例えば、３８℃かつｐＨ ５．０で、任意の追加の栄養素は加えずに、ＴＨＥＲＭＯＳＡＣＣ（登録商標）ドライ酵母を０．１重量％接種することで反応を実施すること、嫌気的に、例えばＣＯ２脱ガスして、ＳＳＦ反応を実施すること、前処理した基質、水、硫酸、糖化酵素（１つ又は複数）及び酵母株を含む、反応混合物を用いること、並びに反応槽を適切な速度で、例えば１００ＲＰＭで、好適な期間、例えば３日間撹拌すること、を含む。
６．７．１．ＳＳＦ生成物の回収
発酵生成物は発酵微生物により生成される任意の物質であり得る。特定の態様では、物質はアルコールである。用語「アルコール」には、ヒドロキシル基を１つ以上含有する物質が包含されることが理解されるであろう。特定の態様では、アルコールはアラビニトールである。他の態様では、アルコールはブタノールである。他の態様では、アルコールはエタノールである。他の態様では、アルコールはグリセロールである。他の態様では、アルコールはメタノールである。他の態様では、アルコールは１，３−プロパンジオールである。更に他の態様では、アルコールはソルビトールである。更に他の態様では、アルコールはキシリトーである。例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｒｅｎｅｗａｂｌｅ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｅｐｅｒ，ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ，６５：２０７〜２４１；Ｓｉｌｖｅｉｒａ ａｎｄ Ｊｏｎａｓ ２００２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９：４００〜４０８；Ｎｉｇａｍ，ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ，１９９５，Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０（２）：１１７〜１２４；Ｅｚｅｊｉ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９（６）：５９５〜６０３を参照されたい。
発酵工程由来の発酵ブロスを蒸留することで、発酵生成物、例えば、エタノールを回収することができる。発酵及び蒸留工程は同時に又は別個に／連続的に実施することができる。一部の態様では、蒸留後、２つの生成物：アルコール、例えばエタノール及び発酵残渣又は副産物（全蒸留廃液）を回収することができる。水との共沸混合物であるアルコールは、標準的なプロセス、例えば分子ふるい法などにより、更に別個の工程で精製される。例えば、約９６体積％以上の純度を有するエタノールを得ることができ、このエタノールは例えば燃料用エタノール、飲料用エタノール、すなわち、飲料用中性スピリッツ又は工業用エタノールとして使用することができる。
他の物質又は発酵生成物については、回収には、限定するものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動法（例えば、分取等電点電気泳動）、溶解度の差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、蒸留、又は抽出などの、当該技術分野において既知の任意の方法を使用することができる。
６．７．２．炭水化物又は原料の供給源
本開示のＳＳＦプロセスを実施するにあたり、任意の好適なセルロース系基質又は原材料を使用することができる。基質は所望される発酵生成物に基づいて選択することができ、すなわち、基質は発酵から得られるものであり、選択されるプロセスは当該技術分野において周知のものである。
本開示の方法に使用するのに好適な基質の例としては、セルロース含有材料、例えば、木材若しくは植物廃棄物、又はセルロース系材料の処理から得られる、次いで発酵微生物により代謝することのできる、低分子量の糖ＤＰ１〜３が挙げられ、及び／又は糖は発酵培地に直接加えて供給することもできる。
バイオマスには、セルロース及び／又はヘミセルロース（リグノセルロース系バイオマスはリグニンも含み得る）、例えば、種、穀物、芋類、植物廃棄物又は食品加工若しくは工業加工の副産物（例えば、茎）、トウモロコシ（穂軸、茎葉及び同様物）、草（例えば、パルマローザ（Indian grass）、例えばソルガストラム・ヌータンツ（Sorghastrum nutans）；又はスイッチグラス、例えば、キビ種、パニクム・バーガタム（Panicum virgatum）など）、木材（木片、加工廃棄物など）、紙、パルプ、再生紙（例えば新聞紙）を含む、任意の組成物を包含し得る。他のバイオマス材料としては、限定するものではないが、じゃがいも、ダイズ（菜種）、大麦、ライ麦、オーツ麦、小麦、ビーツ又はサトウキビバガスが挙げられる。
６．８．バイオマスの前処理
ＳＳＦ反応に先立ち、キシラン、ヘミセルロース、セルロース及び／又はリグニン材料を、より酵素で処理しやすいものにするために、ひいては本開示の方法により、より糖化及び発酵しやすくするために、好ましくはバイオマス（例えば、リグノセルロース系材料）には前処理工程を行う。
一態様では、前処理には、好適な容器、例えば反応容器内で、乾燥させたバイオマス材料を、強酸及び金属塩の希釈溶液からなる触媒に晒すことを伴う。この処理を行なうことで、セルロース加水分解に関する活性化エネルギー又は温度を下げた場合にもより高い糖収率を得ることができる；例えば、米国特許第６，６６０，５０６号；同第６，４２３，１４５号を参照されたい。
他の例示的な前処理法は、大部分のセルロースをグルコースへと脱重合させずに、ヘミセルロースの一次脱重合を実施するために選択される温度及び圧力レベルにて水性媒質中での第一期加水分解工程を実施することで、バイオマスを加水分解することを伴う。この工程は、スラリーに、ヘミセルロースの脱重合から得られる単糖が溶解している液体水相並びにセルロース及びリグニンを含有する固相を生じる。第２加水分解工程は、少なくとも大部分のセルロースが脱重合し、セルロースの脱重合生成物が溶解した、すなわちセルロースの可溶性の脱重合生成物を含有している液体水相を生じる条件を包含し得る。例えば、米国特許第５，５３６，３２５号を参照のこと。
他の例示的な方法は、約０．４％〜２％の強酸を用い、希酸による１段階以上の加水分解を行うことでバイオマス材料を加工すること。並びに酸加水分解したバイオマス材料のうち、未反応のリグノセルロース系固形成分を、アルカリにより脱リグニンすることで処理することを含む。例えば、米国特許第６，４０９，８４１号を参照のこと。
他の例示的な前処理方法は、前加水分解容器、例えば反応容器中で、バイオマス（例えば、リグノセルロース系材料）を予め加水分解すること、酸性の液体をリグノセルロース系固形材料に添加して、混合物を作製すること。混合物を好適な反応温度に加熱すること、グノセルロース系材料を、リグノセルロース系材料由来のリグニンを少なくとも約２０％含有している可溶性画分及びセルロースを含有している固形画分に分画するのに十分な時間にわたり、反応温度を維持すること、混合物を反応温度付近に維持しながら、固体画分から可溶性画分を取り出すこと（ここで、固体画分中のセルロースはより酵素消化しやすくなるよう処理される）、並びに可溶性画分を回収すること、を含む。例えば、米国特許第５，７０５，３６９号を参照のこと。
他の例示的な方法では、前処理方法は過酸化水素Ｈ２Ｏ２を用いるものである。例えば、Ｇｏｕｌｄ，１９８４，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇｒ．２６：４６〜５２を参照されたい。
更に他の例示的な方法では、前処理は、非常に低濃度のバイオマスを化学量論的な量の水酸化ナトリウム及び水酸化アンモニウムと接触させることを含む。例えば、Ｔｅｉｘｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７７〜７９：１９〜３４を参照されたい。
他の実施形態では、前処理は、リグノセルロースを、温和な温度、圧力及びｐＨで、例えばｐＨ約９〜約１４の化学物質（例えば、炭酸ナトリウム又は水酸化カリウムなどの塩基）と接触させることを含む。例えば、ＰＣＴ特許出願公開第２００４／０８１１８５号を参照されたい。
他の例示的な方法では、前処理にアンモニアを用いる。例えば、前処理方法は、固形分濃度の高い条件下で、バイオマスを低濃度のアンモニアに晒すことを含む。例えば、米国特許公報第２００７００３１９１８号、ＰＣＴ特許出願公開第２００６／１１９０１号を参照されたい。
以下の実施例により本発明が更に説明される。例は例示目的のみのために提供される。これらは、どのような方法であれ、本発明の範囲又は内容を制限するものとして解釈されるものではない。
７．実施例１：ＳＳＦ反応時のＥＸＰ生成の解析
７．１．材料＆方法
７．１．１．基材
以下は本実施例で使用される基質の一覧である。基質を予め処理したセルロース、キシラン、及びリグニン組成物も同様に列挙する。標準的なバイオマス解析手順用のＮＲＥＬプロトコルに記載の標準的なアッセイを用い、組成解析を実施する（右記ＵＲＬで利用可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｒｅｌ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ｐｄｆｓ／４２６１８）：
希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸。トウモロコシの穂軸は、例えば米国特許公開第２００７−００３１９１８−Ａ１号、同第２００７−００３１９１９−Ａ１号、同第２００７−００３１９５３−Ａ１号、同第２００７−００３７２５９−Ａ１号、及びＰＣＴ特許出願公開第０６／１１０９０１Ａ２号に記載の方法及び加工範囲に従って、酵素加水分解に先立ち前処理した（別段の記載が無い限り）。基質組成物は：３４．８％セルロース、２９．２％キシラン、１２．８％リグニンを含む。
希硫酸で前処理したサトウキビバガス。この基質は、Ｓｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ，２００３，（Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．１０５〜１０８，６９〜８５）により記載されるように、ＮＲＥＬにより生成し、提供した。バガスは、固形分濃度２０％（体積／体積）で、温度１６５℃にて、１．４４％（体積／体積）酸により、滞留時間約８分で前処理した。基質組成物は：５５．０％セルロース、３．１％キシラン、３１．２％リグニンを含む。
工業的に未漂白の混合広葉樹パルプ基質。この基質は、クラフト法及び酸素脱リグニン（カッパー価＝１３）を用いて生成された。（実験はｌ’Ａｇｅｎｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ（ＡＮＲ−０５−ＢＩＯＥ−００７）〜ｌ’Ａｇｅｎｃｅ ｄｅ ｌ’Ｅｎｖｉｒｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｍａｉｔｒｉｓｅ ｄｅ ｌ’Ｅｎｅｒｇｉｅ（ＡＤＥＭＥ ０５０１Ｃ００９９）に基づく）。基質組成物は：７４．６％セルロース、２０．７％キシラン、２．６％リグニンを含む。
工業的に未漂白の針葉樹パルプ基質この基質は、クラフト法及び酸素脱リグニン（カッパー価＝１４）を用い生成した。（実験はｌ’Ａｇｅｎｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ（ＡＮＲ−０５−ＢＩＯＥ−００７）〜ｌ’Ａｇｅｎｃｅ ｄｅ ｌ’Ｅｎｖｉｒｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅ ｌａ Ｍａｉｔｒｉｓｅ ｄｅ ｌ’Ｅｎｅｒｇｉｅ（ＡＤＥＭＥ ０５０１Ｃ００９９）に基づく）。基質組成物は：８１．９％セルロース、８．０％キシラン、１．９％リグニンを含む。
７．１．２．酵素
以下は本実施例で使用される酵素及び酵素混合物の一覧である。
Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）は、概して改変トリコデルマ・リーゼイにより生成される、β−グルコシダーゼ活性の高いセルラーゼ酵素複合体である。このセルラーゼ酵素複合体は複数の酵素活性を含有し、主要な活性はエキソグルカナーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、及びヘミセルラーゼ活性である。
Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（Ｄａｎｉｓｃｏ Ｕ．Ｓ．Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）もトリコデルマ・リーゼイにより生成されるものであり、リグノセルロース系バイオマスの加工産業において、キシラナーゼ活性を有する全セルラーゼ活性を補いかつ相乗作用して様々な多糖の転換率を向上させるための、アクセサリ生成物として機能するよう設計されたヘミセルラーゼ酵素複合体である。Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼの主要なキシラナーゼ活性はトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ２のものである（ＬａＧｒａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１０３６〜１０４４を参照されたい）。
Ｂｘｌ１：はトリコデルマ・リーゼイ由来のβ−キシロシダーゼである。Ｂｘｌ１のアミノ酸配列は、本明細書では配列番号４として提供される。Ｂｘｌ１は、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。
Ｘｙｎ３：はトリコデルマ・リーゼイ由来のＧＨ１０ファミリーキシラナーゼである。Ｘｙｎ３のアミノ酸配列は本明細書では配列番号１８として提供される。Ｘｙｎ３は、カバ材のアゾキシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いエンドキシラナーゼ活性を示し、かつ前処理したバイオマス又は単離したヘミセルロースに対してＸｙｎ３とキシロビオシダーゼを組み合わせて作用させた場合に、キシロビオシダーゼの存在下でキシロースモノマーの生成を増加させる能力を間接的に示した。
Ｆｖ３Ａ：は、フザリウム・バーティシリオイデス由来のＧＨ３ファミリーの酵素である。Ｆｖ３Ａのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号６として提供される。Ｆｖ３Ａは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、及びヘミセルロース由来の直鎖キシロオリゴマー（図１５及び１６）及び分岐鎖アラビノキシランオリゴマーの混合物を用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。
Ｆｖ５１Ａは、フザリウム・バーティシリオイデス由来のＧＨ５１ファミリーの酵素である。Ｆｖ５１Ａのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１６として提供される。Ｆｖ５１Ａは、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いるアッセイにおいて、エンドキシラナーゼの作用によりヘミセルロースから放出されたオリゴマーセットから放出されたアラビノースにより、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。
Ｆｖ４３Ｄ：は、フザリウム・バーティシリオイデス由来のＧＨ４３ファミリーの酵素である。Ｆｖ４３Ｄのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号２として提供される。Ｆｖ４３Ｄは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。（図１５及び１６）。
Ｆｖ４３Ｂ：は、フザリウム・バーティシリオイデス由来のＧＨ４３ファミリーの酵素である。Ｆｖ４３Ｂのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１２として提供される。Ｆｖ４３Ｅは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。
Ｐｆ４３Ａ：は、ペニシリウム・フニクロサム由来のＧＨ４３ファミリーの酵素である。Ｐｆ４３Ａのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号８として提供される。Ｐｆ４３Ａは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。
Ｆｖ４３Ｅ：は、フザリウム・バーティシリオイデス由来のＧＨ４３ファミリーの酵素である。Ｆｖ４３Ｅのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１０として提供される。Ｆｖ４３Ｅは、基質として、ｐ−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド、キシロビオース、又は混合した直鎖キシロオリゴマーを用いるアッセイにおいて、β−キシロシダーゼ活性を有することが示された。
Ａｆ４３Ａ：は、アスペルギルス・フミガタス由来のＧＨ４３ファミリーの酵素である。Ａｆ４３Ａのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１４として提供される。Ａｆ４３Ａは、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドを用いるアッセイにおいて、エンドキシラナーゼの作用によりヘミセルロースから放出されたオリゴマーセットから放出されたアラビノースにより、Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ活性を有することが示された。
ＸｌｎＡ：ＸｌｎＡはアスペルギルス・ツベンゲンシス（Aspergillus tubengensis）由来のキシラナーゼである。ＸｌｎＡのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号２０として提供される。本実施例で使用されるＸｌｎＡタンパク質は、主な構成成分がＸｌｎＡである、未精製の酵素調製物形態のものであった。
Ｂｇｌ１：Ｂｇｌ１は、トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ１（配列番号２６）である。Ｂｇｌ１遺伝子は、例えば、Ｂａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９（６）：５６２〜５６７に記載されている。
７．１．３．菌株
２２９株：変異導入し、セルロース産生能の高さについて選別することで、ＲＬ−Ｐ３７から誘導される、トリコデルマ・リーゼイ株（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ ａｎｄ Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，１９８４，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６〜５３）を、ＰＥＧ介在型の形質転換法（例えば、Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅ ６１（２）：１５５〜６４を参照されたい）を用い、β−グルコシダーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモータ、トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ１遺伝子、ｃｂｈ１ターミネータ、及びａｍｄＳマーカー（アスペルギルス・ニデュランスアセトアミダーゼ）から構成）、及びエンドキシラナーゼ発現カセット（ｃｂｈ１プロモータ、トリコデルマ・リーゼイｘｙｎ３、及びｃｂｈ１ターミネータから構成）により同時形質転換した。多数の形質転換体を単離し、β−グルコシダーゼ生成及びエンドキシラナーゼ生成について試験した。トリコデルマ・リーゼイ株２２９として表される形質転換体は、本明細書に記載の特定の実験で使用した。
Ｈ３Ａ株：トリコデルマ・リーゼイ株２２９を、電気穿孔法（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第２００８／１５３７１２Ａ２号を参照されたい）を用い、β−キシロシダーゼＦｖ３Ａ発現カセット（ｃｂｈ１プロモータ、ｆｖ３Ａ遺伝子、ｃｂｈ１ターミネータ、及びａｌｓＲマーカー（天然トリコデルマ・リーゼイアセト乳酸シンターゼのクロリムロンエチル耐性変異）から構成）、β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇｌ１プロモータ、ｆｖ４３Ｄ遺伝子、天然Ｆｖ４３Ｄターミネータから構成）及びＦｖ５１Ａα−アラビノフラノシダーゼ発現カセット（ｅｇｌ１プロモータ、ｆｖ５１Ａ遺伝子、天然ｆｖ５１Ａターミネータから構成）により同時形質転換した。クロリムロンエチルを含有しているＶｏｇｅｌｓ寒天プレートで形質転換体を選別した。多数の形質転換体を単離し、β−キシロシダーゼ及びＬ−α−アラビノフラノシダーゼ生成について試験した。トリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ１、トリコデルマ・リーゼイｘｙｎ３、Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ５１Ａ、及びＦｖ４３Ｄを組み換えることで発現する、トリコデルマ・リーゼイ組み換え発現株Ｈ３Ａを単離し、本明細書に記載の特定の試験に使用した。
７．１．４．微生物及び接種菌液の調製
７．１．４．１．ザイモモナス・モビリス
背景：ザイモモナス・モビリスのＺＷ１株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関のＺＭ４株（ＡＴＣＣ ３１８２１，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）と類似の野生種株である。ザイモモナス・モビリス組み換え株ＺＷ７０５は、以下に要約するようにＺＷ８０１−４株から作製した。ザイモモナス・モビリス株ＺＷ８０１−４の培養物を次のようなストレス条件下で増殖させた。ＺＷ８０１−４は、米国特許公開第２００８／０２８６８７０号に記載のような、キシロースを利用するザイモモナス・モビリス組み換え株である。ＺＷ８０１−４株は、米国特許第２００８／０２８６８７０号にすべて記載されるようにＺＷ８００株から誘導され、同様にＺＷ６５８株から誘導される。連続的な遺伝子転位イベントにより、ＺＷ１（ＡＴＣＣ＃３１８２１）のゲノムに、キシロース異性化酵素、キシルロキナーゼ（xylulokinase）トランスアルドラーゼ、及びトランスケトラーゼをコードしている４つのキシロース利用遺伝子を含有している、２つのオペロン、ＰｇａｐｘｙｌＡＢ及びＰｇａｐｔａｌｔｋｔを組み込み、続いてキシロースを含有する選択培地で適応工程を実施することで、ＺＷ６５８を作製した。ＺＷ６５８は、ＡＴＣＣ ＃ＰＴＡ−７８５８として登録されている。ＺＷ６５８では、宿主により介在される、ダブルクロスオーバーな相同組み換えを用い、かつＺＷ８００を作製するための選択マーカーとしてスペクチノマイシン耐性を用いることで、挿入により、グルコース−フルクトース酸化還元酵素コード遺伝子が不活化されるかした。ＺＷ８０１−４を作製するために、Ｃｒｅリコンビナーゼを用い部位特異的な組み換えを行い、ｌｏｘＰ部位に結合していたスペクチノマイシン耐性マーカーを除去した。
ＺＷ８０１−４の連続培養物２５０ｍＬを、ｐＨ及び温度を制御した発酵槽（Ｓｉｘｆｏｒｓ；Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、撹拌しながら増殖させた。発酵用の基本培地は、５ｇ／Ｌの酵母エキス、１５ｍＭのリン酸アンモニウム、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、１０ｍＭのソルビトール、５０ｇ／Ｌのキシロース、及び５０ｇ／Ｌのグルコースからなる。高濃度の酢酸及びアンモニアの存在下で増殖させるために、特定の希釈率で測定される、所定の増殖速度を９７日間にわたって維持しながら、上記連続培養培地中の酢酸アンモニウムの濃度を濃度１６０ｍＭまで徐々に上昇させて、適応させた。１３９日間の連続培養の最終日にアンモニウムイオンの合計最終濃度が２１０ｍＭになるよう、リン酸アンモニウムを徐々に添加していき、アンモニウムイオン濃度を更に上昇させた。適応させた集団から、蒔き込み、ＰＣＲ増幅、及び／又は他の従来の周知の方法でＺＷ７０５株を単離した。
７．１．４．２．ＳＳＦ用の種培養の増殖
ザイモモナス・モビリスＺＷ７０５株及びＺＷ１株は、２０％グリセロールストックとして−８０℃で凍結させて維持する。種培養のため、２ｍＬの凍結ストックを解凍し、５ｇ／Ｌの酵母エキス、４ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム、１ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、及び１００ｇ／Ｌのグルコースを含有している４５ｍＬの培地（ｐＨ ５．８）に接種した。開始ＯＤ ６００ｎｍは０．４だった。蓋をした５０ｍＬのチューブ内で、ＯＤ ６００ｎｍが約２．５になるまで３２℃で培養物を増殖させ、次いで２００ｇ／Ｌのグルコース、４ｇ／Ｌのリン酸水素カリウム、２ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、及び２０ｇ／Ｌの酵母エキスを含有している最終的な種培養培地（ｐＨ ５．８）に培養物を接種した。ｐＨ制御下で、発酵槽を撹拌しながら、ＯＤ ６００ｎｍが約１０になり、かつ残存グルコース濃度が約８０ｇ／Ｌになるまで、３２℃にて培養物を増殖させた。ＳＳＦ発酵体積の１０％に相当する体積の種培養物（ＯＤ ６００ｎｍは約１０）を使用して、ＳＳＦを開始した。
７．１．４．３．酵母
Ｃ６炭糖（すなわちブドウ糖）のみをエタノール（ＥｔＯＨ）へと発酵することのできるＴＨＥＲＭＯＳＡＣＣ（登録商標）ドライ酵母（Ｅｔｈａｎｏｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を、酵母エタノロジェンとして使用した。接種前に、ドライ酵母を滅菌脱イオン水により２〜３時間水和した。
７．１．５．糖を用いる発酵
バッチ式プロセス及びフェドバッチ式プロセスを用い、５００ｍＬのＳｉｘｆｏｒｓバイオリアクター中で、合成糖を用いるザイモモナス・モビリス発酵を３日間にわたって実施した。合成糖はグルコース及びキシロースからなる。バッチ式プロセスでは、最初に約８０ｇ／Ｌグルコース及び７０ｇ／Ｌキシロースの濃度で糖を充填した。フェドバッチ式プロセスでは、まず、濃縮した糖原液を調製し、次いでシリンジポンプを用い原液をバイオリアクタに供給した（ＰＨＤ２０００，Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）。最終的に、３日目の時点で約８０ｇ／Ｌグルコース及び７０ｇ／Ｌキシロースに相当する糖が充填されるよう、流速を設定し、調節した。バッチ式プロセス又はフェドバッチ式プロセスの際、まず始めにザイモモナス接種材料を反応混合物に１０重量％充填し、３３℃及びｐＨ ５．５で、発酵を嫌気的に実施した。
７．１．６．同時糖化発酵（ＳＳＦ）
好適なザイモモナス・モビリス組み換え体及び酵母発酵条件を用い、ＳＳＦフラスコ反応を嫌気的に実施した。別途記載のない限り、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸、バガス、又はクラフトパルプ基質を、それぞれ固形分充填量２５重量％、２０重量％、１０重量％で用い、組み換えザイモモナスＳＳＦ実験を、３３℃、ｐＨ ５．８で実施した。固形分２５重量％（乾燥重量１２．５ｇ）、固形分２０重量％（乾燥重量１０．０ｇ）、又は固形分１０重量％（乾燥重量５．０ｇ）の各基質を、まず始めにそれぞれ１２５ｍＬの三角フラスコに充填し、続いて、基質のｐＨを５．８に滴定するのに必要とされる量の６Ｎ硫酸と予め混合した脱イオン水を加えた。それぞれのバイオマス基質に、上記のセルラーゼ及びヘミセルラーゼ酵素を、セルラーゼタンパク質ｍｇ／セルロースｇ、及びヘミセルラーゼタンパク質ｍｇ／キシランｇに基づく量で加えた。任意の追加の栄養素は加えずに、１０重量％のザイモモナス・モビリスＺＷ７０５株（組み換え体）又はＺＷ１株（野生型）接種材料（５ｇ）を反応混合物に加え、発酵を開始した。ＴＨＥＲＭＯＳＡＣＣ（登録商標）ドライ酵母ＳＳＦに関しては、３８℃及びｐＨ ５．０で反応を実施した。接種酵母の濃度は０．１体積／体積％であり、いかなる追加の栄養素も加えなかった。フラスコにふたをするために使用したゴムストッパーから、２３ゲージの針を突き出させ、嫌気性環境及びＣＯ２脱ガスを維持した。実施したすべてのＳＳＦで、発酵開始時のフラスコ中の合計反応物重量は５０ｇであり、反応混合物は、前処理した基質、水、硫酸、酵素、及びザイモモナス細胞若しくは酵母細胞のいずれか、から構成された。シェーカーインキュベータ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｎｏｖａ ４４，Ｅｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）内で、１００ＲＰＭで３日間にわたってフラスコを撹拌した。
７．１．７．別個の加水分解及び発酵（ＳＨＦ）
ＳＨＦの実行には、糖化段階と、それに続く発酵段階を包含した。糖化条件は、酵素の種類及び／又は濃度、セルロースの充填、及びｐＨに特定の変更を加えたことを除き、ＮＲＥＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（Ｓｅｌｉｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓａｃｃｈａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ Ｂｉｏｍａｓｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＬＡＰ），Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒｅｐｏｒｔ ＮＲＥＬ／ＴＰ−５１０−４２６２９を参照されたい）に基づいた。希アンモニアで前処理した、固形分２５重量％（乾燥重量１２．５ｇ）のトウモロコシの穂軸、又は固形分１０重量％（乾燥重量５．０ｇ）の広葉樹の混合パルプを１２５ｍＬの三角フラスコに充填した。次いで、このフラスコに、基質のｐＨを５．３に滴定するのに必要とされる量の６Ｎ硫酸と予混合した脱イオン水を加えた。セルラーゼ及びヘミセルラーゼ酵素を、それぞれのバイオマス基質に、タンパク質ｍｇ／セルロースｇ、及びタンパク質ｍｇ／キシランｇに基づく量で加え、糖化工程を開始した。すべてのザイモモナスＳＨＦの実施に関し、温度５０℃及びｐＨ ５．３０を３日間の持続的な糖化に用い、続く発酵工程では、ＳＳＦプロセス（上記）に記載のものと同様の条件を用いた。水酸化ナトリウムを使用して、ｐＨを５．３から５．８へと上昇させた。続いて１０重量％のザイモモナス接種材料を添加して発酵を開始させた。
７．１．８．フェドバッチ式ＳＳＦ
希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸基質（最終固形分２５重量％が得られる量）を均等に８バッチに分け、３０時間の時点で最終バッチが充填されるようフェドバッチ式にバイオリアクターに供給したことを除き、ＳＳＦプロセス（上記）に記載のものと同様の条件でフェドバッチ式ＳＳＦ実験を実施した。
７．１．９．ＨＰＬＣ解析及びＥＸＰ定量
予め設定した時間間隔で発酵試料を採取し、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ系（Ａｌｌｉａｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用い、エタノール、残存糖類、エチル−β−キシロピラノシド（ＥＸＰ）、及び他の代謝生成物（例えば酢酸及びグリセロール）について解析した。ＨＰＬＣカラムはＢｉｏＲａｄから購入した（Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈ，ＢｉｏＲａｄ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。屈折率を検出しＥＸＰ定量を行い、続いてＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４：１９６〜２０２）に記載のものと同様の手順を行った。他の代謝副産物、コハク酸がＥＸＰにより共溶出され、ＥＸＰ定量を増量させている可能性があることが判明した。２２０ｎｍの紫外検出器及び酵素を用いるアッセイキット（Ｋ−ＳＵＣＣ，Ｍｅｇａｚｙｍｅ，Ｃｏ．Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）の両方を使用して測定した結果、酵母及びザイモモナス発酵に関し、試験条件で生成されたコハク酸濃度は１〜２ｇ／Ｌ未満であることが結論づけられた。
７．２．結果
７．２．１．ＥＸＰ生成及び同定
７．２．１．１．ザイモモナス・モビリス組み換え体を用いるＳＳＦ時のＥＸＰ生成
上記のＳＳＦ発酵条件下で、グルコース及びキシロースをエタノールへと共発酵させることのできるザイモモナス・モビリス組み換え株を用いることで、副産物の生成が観察された。本実験には、キシラン含量が高いトウモロコシの穂軸を希アンモニアで前処理したものを基質として使用し、この基質をトリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）から誘導される、市販のセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素調製物（２０ｍｇ／ｇセルロースのＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００）及びＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（５ｍｇ／ｇキシラン）で処理した。試験条件下で、副産物の生成はフェドバッチ式ＳＳＦで最も多量であり、ＳＳＦで２番目に多量であることが判明した（表１）。希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸を用いるＳＨＦ、糖（８０ｇ／Ｌグルコース＋７０ｇ／Ｌキシロース）を用いるバッチ式及びフェドバッチ式発酵プロセスでは、この副産物の生成は少なかった。
上記のように、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸及びザイモモナス・モビリス株を用いるＳＳＦ条件下で生成される副産物の溶出時間は、ＨＰＬＣ ＨＰＸ−８７Ｈカラムで約１１．７５分（流速０．６ｍＬ／分）であり、コハク酸の溶出時間に近かった。図１のパネル２は、キシロース及びＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼとエタノールとのインキュベート後、１１．６１１分の時点に溶出ピークを示す。この特定のピークは、インキュベーション時にアルコールを存在させない場合には出現しない。インキュベーション時にアルコールの存在下で生成された副産物のピーク位置は、加えたアルコールを補足する程度及び方向へとシフトすることが観察された。メタノール（ＭｅＯＨ）とのインキュベーション後に生成された副産物の溶出時間（１９．４６分）、及びｎ−ＰｒＯＨとのインキュベーション後に生成された副産物の溶出時間（２７．６５分）は、エタノール（ＥｔＯＨ）とのインキュベーション後に生成された副産物の溶出時間（２１．９９分）に比べ、それぞれより短く及びより長かった。キシロースと、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及び０．７２Ｍアルコールとのインキュベーションにより生成される生成物の溶出時間は、エタノールにより誘導した生成物（１１．６１分）の溶出時間と比較して、ＭｅＯＨ（１１．０３分）ではより短い方に、及びｎ−ＰｒＯＨ（１３．６０分）ではより長い方にシフトした。これらの結果は、問題になっている移動性ピークは、キシロース及びアルコールから脱水縮合により形成されるキシロース−アルコール付加物（アルキル−キシロピラノシド）のものであるという結論と一致し、１１．０３、１１．６１及び１３．６０分に溶出される成分は、それぞれメチル−キシロピラノシド、エチル−キシロピラノシド及びｎ−プロピル−キシロピラノシドに相当する。
７．２．１．２．時間経過
メチル−キシロピラノシド、エチル−キシロピラノシド及びｎ−プロピルキシロピラノシドの出現についての時間経過を図２に示す。１００時間後に生成された生成物の相対量は次のとおりであり：メチル−＞エチル−＞ｎ−プロピル−キシロシド（図２）、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、及びｎ−ＰｒＯＨの存在下での、脱水縮合によるアルキル−β−Ｄ−キシロピラノシドの生成に関する、Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ １９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．４３：１０７５〜１０８０）の報告と一致する。エチルキシロピラノシド（ＥＸＰ）の溶出時間が、ＳＳＦ条件下で観察されるものと一致すること、溶出時間がアルコールの存在及び性質並びにこれらのアルコールの相対的な活性に対し依存することなどのすべてが、ＥＸＰがＳＳＦ条件下で生成される副産物であったことを示唆していた。
７．２．１．３．１Ｈ ＮＭＲ解析によるＥＸＰ試料中のエチル−β−グリコシドの同定
エチルｂ−Ｄ−キシロピラノシド標準の調製：５０ｍｇのＤ−キシロースを３ｍＬのエタノールに溶解させ、得られた溶液を、アンバーリスト１５Ｈ＋樹脂（１００ｍｇ）の存在下で７０℃で３時間加熱することで、エチルキシロシド試料を調製した。樹脂をろ過し、エタノール溶媒を減圧下留去して無色油を生成した。１Ｈ ＮＭＲ解析により、エチルキシロシド混合物は、ａ−Ｄ−キシロピラノシドが主成分であり、その他にエチルβ−キシロピラノシド及びエチルα／β−キシロフラノシドを含むものであることが明らかになった。
ＥＸＰ試料の１Ｈ ＮＭＲ：希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸のＳＳＦ発酵ブロス試料から精製及び画分した（ＨＰＬＣを用い）、凍結乾燥したＥＸＰ試料を、７５０μＬのＤ２Ｏで再構成し、ガラス製のＮＭＲ管ＰＰ−５２８に移した。Ｖａｒｉａｎ ５００ＭＨｚ ＶＮＭＲＳ ＮＭＲシステムで、８パルスにわたり標準パルスシークエンスｓ２ｐｕｌを用い、プロトンＮＭＲスペクトルを得た。ｄ４．８０のＨＯＤシグナルを参照にした１Ｈ ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）では、ｄ １．２０〜１．２６領域に複数のトリプレットシグナルが出現したことから、少なくとも４つの異なるエチルグリコシドが存在することが示された。また、スペクトルは、ｄ４．４３、４．４９、４．５３、及び４．６６に、ｂ−グリコシド結合の指標になる７．８Ｈｚの結合定数を有する５つの異なるダブレットシグナルも含有していた。ｄ４．４３のシグナルが最も強く、かつ文献（Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．４３：１０７５〜１０８０），Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００９，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４：１９６〜２０２）でエチル−β−Ｄ−キシロピラノシドについて報告されている化学シフトと一致していた。１Ｈ ＮＭＲスペクトル（図３）で観察されたシグナルは、全体的に、β−アノマー、β−Ｄ−エチルキシロピラノシドの存在と、その他３〜４つの追加的なエチルβ−グリコシドの存在を示した。
７．２．２．酵母及び野生型ザイモモナス・モビリスによるＥＸＰ生成
希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸基質を使用するＳＳＦ及びフェドバッチ式ＳＳＦ条件下で、エタノロジェンのザイモモナス・モビリスを用いる、Ｃ５／Ｃ６糖の共発酵により、高濃度のＥＸＰが得られた。ＳＳＦを野生型酵母及びザイモモナス・モビリス（Ｃ６糖のみを発酵することのできる微生物）を用いて実施した場合にＥＸＰが生成されるのか否かを判定するため、新規の実験を設計した。結果（図４）は、酵母（５．５ｇ／Ｌ）又は野生型ザイモモナス・モビリス（９．１ｇ／Ｌ）に発酵させた場合に、ＳＳＦ反応でＥＸＰが高濃度で生成されたことを示す。したがって、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ及び野生型ザイモモナス・モビリスによるＳＳＦ時にも検出されたことから、ＥＸＰ産生はザイモモナス・モビリス組み換え体に特異的なものではなかった。
７．２．３．他のバイオマス供給源からのＥＸＰ生成
希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸以外の基質を用いた場合にもＥＸＰを生成させることができるかを判定するために、更なる実験を設計した。表２に示される結果から、ＥＸＰ生成は、ＳＳＦ条件下での、トリコデルマ・リーゼイセルラーゼ／ヘミセルラーゼ調製物による、キシラン含量の高い任意の基質の発酵に関連付けられることが明らかである。例えば、組み換えザイモモナスＳＳＦ条件下で、キシラン含量の高い工業用広葉樹混合クラフトパルプを用いることで、１６．１ｇ／ＬものＥＸＰが生成された。それに対し、キシラン含量の低い基質、例えば前処理したバガス及び針葉樹パルプでは、同様の条件下で生成されたＥＸＰ量が少なかった（それぞれ０．９１及び４．７５ｇ／Ｌ）。更に、本明細書に記載のＳＳＦプロセス下でのみ大量のＥＸＰが生成され得ることが再度証明された。ＳＨＦプロセス条件下だと、よりキシラン含量の高い基質を使用した場合でさえも、ＥＸＰ生成は著しく低下した（３．５２ｇ／Ｌ）。
７．２．４．異なる酵素置換体を用いるＳＳＦでのＥＸＰ生成
７．２．４．１．Ｂｘｌ１によるＥＸＰ生成
Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ １９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆Ｂｉｏｅｎｇ．４３：１０７５〜１０８０）に従って、キシロシル基転位反応（transxylosylation）及び脱水縮合反応の両方を介し、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１によりＥＸＰ生成を触媒した。図５は、上記の酵母ＳＳＦ条件下でのＥＸＰ生成が、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１の存在下で増加したことを示す。５ｍｇ／ｇ Ｂｘｌ１の添加により、ＥＸＰ生成量が５．５ｇ／Ｌから１８．８ｇ／Ｌに増加した。
図６に示すように、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸の固形分２５重量％の基質を用いる、ザイモモナス・モビリス組み換え体のＳＳＦ条件下でのＥＸＰ生成量も、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１の存在下で増加した。ＥＸＰは、６ｍｇ／ｇトリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１の添加により、濃度２５．６ｇ／Ｌで平衡に達した。本実験には、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼの代わりに、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９（キシラナーゼを過剰発現しているトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３）由来のセルラーゼ／ヘミセルラーゼ酵素複合体を使用した。ほんの１ｍｇ／ｇを添加しただけで、対照試料（トリコデルマ・リーゼイ組み換え株＃２２９単独由来の酵素複合体）と比較してＥＸＰが２倍も増加したことが明白に観察されたことから、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１のＥＸＰ生成の触媒能は驚く程強いものである。
フザリウム・バーティシリオイデスのヘミセルラーゼを添加することで、ＥＸＰ生成に及ぼされる効果を調査した。Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋ＸｌｎＡ、並びにＢｘｌ１及びフザリウム・バーティシリオイデスヘミセルラーゼ（Ｆｖ３Ａ及びＦｖ５１Ａ Ｌ−α−アラビノフラノシダーゼ）を添加したトリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９由来の酵素複合体を使用した。本実験は、組み換えザイモモナスのＳＳＦ条件下で実施した。固形分２５重量％の、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸を基質として用いた。結果は図７に示す。図７は、ＸｌｎＡ及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００を添加することで、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００を添加した場合よりも多量のＥＸＰ（３１．５対１９．５）が生成されたことを示す。トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９由来の酵素複合体単独だと、生成されるＥＸＰ（９．１ｇ／Ｌ）は全３つの酵素組成のうち最小量であった。これは、他の２つの酵素組成と比較して、Ｂｘｌ１の、酵素複合体中の合計タンパク量の分画が、トリコデルマ・リーゼイ株２２９酵素複合体においてより小さかったという事実、及びＢｘｌ１が、比較的多量のキシロビオースを生成し、堆積するという事実に起因する可能性がある。Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋ＸｌｎＡに関しては、Ｆｖ３Ａ又はＦｖ５１ＡはＥＸＰ生成を実質的に増加させなかった。しかしながら、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９由来の酵素複合体に関しては、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９由来の酵素複合体にトリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１を添加した場合にＥＸＰが３倍増加した場合と比較して、Ｆｖ３Ａのみを添加した場合ではＥＸＰ生成が２倍増加しており、その一方、Ｆｖ５１Ａを添加した場合のＥＸＰ生成は１．４倍増加した。
７．２．４．２．精製酵素を用いるＥＸＰ生成
上記に議論された結果は、ＥＸＰ生成が、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１強く影響を受け、かつ効果的に触媒されたことを示す。トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１は、キシラン高含有のバイオマス基質を用いる、ＳＳＦ条件下でのＥＸＰ生成に顕著にかつ非常に有効である。しかしながら、今までのところ試験した（及び上記で議論した）すべての酵素は未精製品であり、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１と同様にＥＸＰを生成することのできる持ち込み酵素活性を含有している可能性がある。持ち込み酵素活性の効果を調査するために、ＥＸＰ生成に対する精製酵素の効果も試験した。精製トリコデルマ・リーゼイセロビオヒドロラーゼ、ＣＢＨ１及びＣＢＨ２；トリコデルマ・リーゼイエンドグルカナーゼ、ＥＧ２；及びトリコデルマ・リーゼイβ−グルコシダーゼ、Ｂｇｌ１、からなるセルラーゼ混合物を、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００の基質として使用した一方、精製トリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３を、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（商標）キシラナーゼの代わりに使用した。図８に示された結果から、セルラーゼ単独ではＥＸＰが生成されないことは明らかである。未精製のトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３を添加することで、大量のＥＸＰが、例えば約１３．１ｇ／ＬのＥＸＰが生成された。この大幅な増加は、未精製のトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３試料中に存在する持ち込みトリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１がより多量であることに起因する可能性がある。
７．２．４．３．ＧＨ４３クラスのＢｘｌ酵素を用いるＥＸＰ生成
ＧＨ３ファミリーの加水分解酵素であるＢｘｌ１は、ＳＳＦ条件下（上記）でのＥＸＰの生成を活発にかつ有効に触媒することが示された。他のＧＨファミリーβ−キシロシダーゼも、同様の条件下でＥＸＰの生成を触媒し得るのか否かについては疑問が残る。Ｆｖ４３Ｂ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、及びＡｆ４３Ａを包含する、ＧＨ４３ファミリー由来の様々なβ−キシロシダーゼを、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸の固形分２５重量％の基質を用い、組み換えザイモモナスＳＳＦ条件下で試験した。Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、及びＡｆ４３Ａは、２２９株のタンパク質調製物から作製した対照試料と比較して、ＥＸＰ生成をわずかに増加させることが判明した。それに対し、Ｆｖ４３Ｂは、ＥＸＰ生成を１．５倍も増加させた（図９）。これらのＧＨ４３ファミリーの酵素のすべてがトリコデルマ・リーゼイで発現したものであったこと、並びに本実験においてこれらのすべてが未精製のタンパク質調製物であったことから、ＥＸＰ生成の増加は、タンパク質調製物中に存在する天然Ｂｘｌ１に起因し得ることが仮定され得る。
８．実施例２：ヘミセルラーゼによるＥＸＰの減少
以降の例は、ＳＳＦ反応に特定のヘミセルラーゼを添加することにより、ＥＸＰが減少することを示す。
８．１．ザイモモナスを用いるＳＳＦでのＦｖ４３ＤによるＥＸＰの減少
典型的には、ＥＸＰ生成はキシロース（直接的にはキシロース、又はキシロビオース若しくは他のキシロオリゴマー）及びエタノールの両方を等モルベースで消費する。ザイモモナスを包含する多くの微生物にはＥＸＰを分解及び発酵することができないことから、ないしはＥＸＰを利用することができないことから、この消費機構はエタノールの収率を実質的に減少させる直接の原因になる。１ｇのＥＸＰを存在させることは、生成されることになるエタノール（０．５１ｇ／キシロースｇの速度でキシロースが消費されエタノールへと発酵される）を０．６８８ｇ損失させることと等価であると計算される。したがって、ＥＸＰの生成を防ぐことで、結果としてエタノール収率を増加させることができる。図１０に示すように、フザリウム・バーティシリオイデスのβ−キシロシダーゼ、Ｆｖ４３Ｄをほんの１ｍｇ／キシランｇ添加することで、組み換えザイモモナスのＳＳＦ条件下で生成されるＥＸＰの量が非常に減少する（約４倍）ことが判明した。
８．２酵母を用いるＳＳＦでのＦｖ４３ＤによるＥＸＰの減少
Ｃ５／Ｃ６を発酵する組み換えザイモモナスから得られる結果と同様に、Ｃ６を発酵する微生物として酵母を用いるＳＳＦ反応にＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼとＦｖ４３Ｄを添加することでも、ＥＸＰ生成が減少した。具体的には、Ｆｖ４３Ｄを１ｍｇ／キシランｇ添加することで、ＥＸＰが２〜３倍減少した（図１１）。
８．３ Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔキシラナーゼ、ＸｌｎＡ及びトリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９由来の酵素複合体を用いるＳＳＦでのＦｖ４３ＤによるＥＸＰの減少
組み換えザイモモナスのＳＳＦ条件下で、３つの酵素組成Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ、Ａｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋アスペルギルス・ニガーキシラナーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９から生成される酵素複合体、にＦｖ４３Ｄを加えることで、ＥＸＰの減少率を調査した。固形分２５重量％の、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸を、基質として用いた。
図１２は、Ｆｖ４３Ｄの１ｍｇ／キシランｇのみをＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及びＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００＋ＸｌｎＡに添加することで、ＥＸＰ生成が４倍減少し、同様に、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９から生成される酵素複合体を加えることで、ＥＸＰ生成が１．３６倍減少することを示す。同時に、３つの酵素組成すべてについて、ＥＸＰ生成の減少に対応するエタノールの増加が観察され、ＥＸＰ生成を減少させるという点、及びエタノールの収率低下を防止するという点でＦｖ４３Ｄが有効であることが確認された。
８．４精製酵素を用いるＳＳＦでのＥＸＰ生成の減少
Ｆｖ４３Ｄに由来するＥＸＰの減少が、持ち込み酵素活性によるものではなかったことを保証するため、精製Ｆｖ４３Ｄを包含する精製酵素を用い、ＥＸＰ生成の減少について試験した。精製ＣＢＨ１、ＣＢＨ２、ＥＧ２及びＢｇｌ１のトリコデルマ・リーゼイセルラーゼ混合物をＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ（商標）１５００の代わりに使用し、かつ精製トリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３をＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼの基質として使用した。図１３に記載の結果は、精製及び未精製Ｆｖ４３Ｄを添加した場合に、ＥＸＰ生成のわずかな減少を示し、かつ結果としてエタノール力価のわずかな増加を示した。ＥＸＰ生成が比較的わずかに減少したのは、精製酵素（例えば、セルラーゼ及びＸｙｎ３）中にトリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１の持ち込み酵素が存在しなかったことに起因する可能性がある。トリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３の作用に起因し、対照試料により生成されたＥＸＰの量が非常に少なかったことも観察された。したがってＦｖ４３Ｄを更に添加してもＥＸＰ生成は実質的に減少しない。この点を更に調査するために、図１４Ａに示す結果を有する他の実験を実施して、多量のＢｘｌの存在下でＦｖ４３Ｄを添加することによるＥＸＰの減少効果を調査した。
８．５ ＳＳＦへのＦｖ４３Ｄの添加に用量反応するＥＸＰ減少
Ｂｘｌ１の存在下でのＥＸＰ生成は、相当なものであり、使用したＳＳＦ条件により正確な量は変化するものの、２０ｇ／Ｌ以上のＥＸＰが一貫して検出された。ＥＸＰ生成の減少をＦｖ４３Ｄの添加量との関連で評価するため、用量反応試験を実施した。図１４Ａは、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９及びトリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１から生成される酵素複合体へのＦｖ４３Ｄの添加量を増加させることで、ＥＸＰの減少に関して得られた結果を示す。以前に示した結果と同様、１ｍｇ／ｇのＦｖ４３ＤはＥＸＰ生成を３倍近く減少させるのに効果的であると同時に、エタノール力価を上昇させることが判明した。しかしながら、Ｆｖ４３Ｄの添加量を３、６、及び９ｍｇ／ｇ増加させても、エタノール力価の有意な上昇が観察されるにも関わらずＥＸＰ生成は大きく減少しない。Ｆｖ４３Ｄを大量（９ｍｇ／ｇ）に添加した場合でさえも、ＥＸＰ濃度は６．６ｇ／Ｌ以下に減少せず、ＥＸＰの量は試験に使用した特定の条件についてその濃度で平衡に達している可能性があることが明らかであった。３種類の特定の実験条件下で、Ｆｖ４３Ｄを更に（例えば１ｍｇ／キシランｇ）添加したところで、ＥＸＰ生成の減少には何ら影響なかった。
これらの観察結果は、ＳＳＦ条件下でのＥＸＰの生成機構及び減少機構により説明され得る可能性がある。
この実験により得られた観察結果に基づくものであり、かつ文献（例えば、Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆ Ｂｉｏｅｎｇ．４３：１０７５〜１０８０及びＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４：１９６〜２０２を参照されたい）に報告されるデータと一致する、提案される機構を、以下実施例３に詳述する。
８．６ Ｆｏ４３Ａ及びＧｚ４３ＡをＳＳＦに添加することによるＥＸＰの減少
反転型ＧＨ４３ファミリーβ−キシロシダーゼであるＦｏ４３Ａ及びＧｚ４３Ａも、本明細書に記載のＳＳＦ条件下でＥＸＰ生成を減少させる効果について試験した。図１４Ｂに示す結果に基づくと、トリコデルマ・リーゼイ組み換え株２２９から生成されるタンパク質複合体、トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸基質、及び組み換えザイモモナス、及び３ｍｇ／キシランｇを含む酵素ブレンドに添加した場合に、これらの２つの酵素はそれぞれＥＸＰ生成を４倍近く減少させた。Ｆｖ４３Ｄ（上記）を添加した場合に観察されたものと同様、ＥＸＰ生成の減少及び対応するエタノール力価の上昇（約１０ｇ／Ｌ）が観察された。
９．実施例３：ＥＸＰの生成機構
ＳＳＦ条件下で、フザリウム・バーティシリオイデスβ−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄの存在下で生成されるＥＸＰと比較して、フザリウム・バーティシリオイデスβ−キシロシダーゼＦｖ３Ａの存在下でＥＸＰがおよそ４倍も多く生成された（図１０及び１１）ことは、ＥＸＰ生成機構を理解するための手がかりをもたらす。
ＥＸＰの生成には、可能性のある２つの経路が存在する：（１）糖鎖転移反応によるもの。又は（２）脱水縮合によるもの。これらの経路はそれぞれ次のように記載される：
１）糖鎖転移化反応：Ｘ−Ｏ−Ｘ＋ＥｔＯＨ→Ｘ−Ｏ−Ｅｔ＋Ｘ
２）脱水縮合：Ｘ＋ＥｔＯＨ⇔Ｘ−Ｏ−Ｅｔ＋Ｈ２Ｏ
Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆ Ｂｉｏｅｎｇ．４３：１０７５〜１０８０）によると、糖鎖転移機構はこれら２つの経路のなかでより急速なものである。βアノマーのみ（図２９を参照のこと）が糖鎖転移反応で生成されるという事実は、反応が、アノマーの立体配置を保持するよう制御する酵素により触媒されることを意味する。この場合、糖はβ−グリコシル結合により結合する。それに対し、脱水縮合によりＥＸＰのβアノマーが生成される場合、アノマーの立体配置の反転又は保持のいずれによりＥＸＰが生成されるのかによって、開始基質がそれぞれα−又はβ−キシロースのいずれであるか決まることを示唆する。
β−キシロシダーゼ、Ｆｖ３Ａ（ＧＨ３ファミリーのメンバー）及びＦｖ４３Ｄ（ＧＨ４３ファミリーのメンバー）は、それぞれ、配置の保持及び反転を制御する。上記２つの可能性のある機構のいずれが本当の機構であるのかを識別及び同定するために、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（トリコデルマ・リーゼイＸｙｎ２の活性を保有することを特徴とする酵素調製物）並びに精製Ｆｖ４３Ｄ及びＦｖ３Ａを、キシロビオース及びエタノールと共に４６℃でインキュベートすることで、実験を実施した。これらの試料におけるＥＸＰ生成の動態をＨＰＬＣにより評価した。
１５及び表３に示すように、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼとＦｖ３Ａが、短時間経過後に相当量のＥＸＰを生成したことは、キシロース生成に対応すること（例えば、経時的にＥＸＰ生成対キシロース生成に関し一定の比率を有する）は明らかであった。それに対し、Ｆｖ４３ＤをＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼと共に使用した場合、ＥＸＰがキシロース生成に相対して有意に遅延していることは明らかであった。Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及びＦｖ３Ａは、糖鎖転移反応を介しＥＸＰを急速に生成したものと仮定することができる。キシロース−酵素のエステル付加物は、第１にＣ１アノマーを反転させ、続いて第２に、キシロースを結合しているカルボキシル基の活性部位のＣ１炭素にてエタノールによりＳＮ２置換を行うことで、２度目の反転を行う。この２度の反転により生成物の立体配置が保持される。それに対し、Ｆｖ４３Ｄが糖鎖転移反応を触媒することは明らかにならなかった。その代わりに、ＥＸＰを脱水縮合により更にゆっくりと生成した。Ｆｖ４３Ｄがアノマーの立体配置を反転させるよう機能することから、ＥＸＰは、α−Ｄ−キシロースから生成され、α−Ｄ−キシロースは、Ｆｖ４３Ｄにより、ただし同様にβ−Ｄ−キシロースのＣ１を水溶液中で反転させることにより、キシロビオースから生成されるようであった。図１５は、ＥＸＰはＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼにより触媒される、キシロースの脱水縮合により生成され得ることも示す。この場合、β−キシロシダーゼ機構が保持されたことから、この反応に関してはβ−Ｄ−キシロースが基質である可能性がある。
９．１ ＥＸＰ生成に関する平衡方程式
ＳＳＦ条件下で、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及びＦｖ３Ａは、キシロビオースだけでなく、より多量のキシロースオリゴマーとも遭遇する。キシロースオリゴマーが加水分解されることで、ＥＸＰ産量が増加し得る。切断によりＥＸＰが生成される場合、オリゴマー生成物のうちの一つが糖鎖転移されて、エチルグリコシル付加物が生成される。糖鎖転移反応により更に切断することで、次いで追加のエチル付加物が生成され、キシロビオースのみを糖鎖転移した場合に観察されるものと比較して、ＥＸＰ生成対キシロース生成の比が大きくなる場合がある。例えば、
３）Ｘ４＋ＥｔＯＨ→Ｘ２−Ｅｔ＋Ｘ２
４）Ｘ２−Ｅｔ＋ＥｔＯＨ→２ＥＸＰ
５）Ｘ２＋ＥｔＯＨ→ＥＸＰ＋Ｘ
キシロビオースのみを糖鎖転移させた場合、ＥＸＰ生成のみが５）の反応由来のものであることが記載される。
同様の３つの酵素：Ｆｖ３Ａ、Ｆｖ４３Ｄ、及びＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼを用い、キシロビオースを有するキシロースオリゴマー（平均分子量＝５３９）の加水分解と比較することでこれらの可能性を評価した。結果を図１６に示す。
キシロビオース（２０ｍｇ／ｍＬ）（図１６（左側））又はキシロースオリゴマー（２０ｍｇ／ｍＬ）（図１６（右側））を、それぞれ２つの因子内に収まるキシロース生成速度を与える濃度で、０．９Ｍ ＥｔＯＨの存在下で、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ（５６０μｇ／ｍＬ）、Ｆｖ４３Ｄ（３６μｇ／ｍＬ）、又はＦｖ３Ａ（５４μｇ／ｍＬ）の存在下で、４６℃でインキュベートした後に生じる、ＥＸＰのＲＩピーク面積対キシロースのＲＩピーク面積比を図１６（左側パネル）及び図１６（右側パネル）にプロットした。ＥＸＰ生成速度は、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及びＦｖ４３Ｄの存在下でキシロビオース及びキシロースオリゴマーに関するものとおよそ同様であった。しかしながら、Ｆｖ３Ａについて言えば、キシロースオリゴマーを存在させた場合、ＥＸＰ収率が、キシロビオースを存在させた場合と比較して約１／３ほど高かった。上記に概説されるように、本観察結果は、少なくともＦｖ３Ａについて、糖鎖転移反応により、キシロビオースよりも大量のオリゴマーが切断されることで、エタノールが生じ得ることを示唆する。このような、×ｄｐ３オリゴマーの糖鎖転移反応は、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼで一般的なものとして生じるようには見えないが、ＥＸＰの収率は、Ｆｖ３Ａに関しキシロビオース及びキシロースオリゴマーの両方で観察されるよりも高いことは明らかであった。この高収率は、Ｆｖ３ＡよりもＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼに関してエタノールの糖鎖転移速度が速い可能性があることを示す。実際、５５ＭのＨ２Ｏと比較してエタノールのモル濃度が０．９Ｍであることを考慮すれば、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及びＦｖ３Ａの何れもに関し、２．５〜３．５切断反応毎にＥＸＰが生成されていることが顕著である。エタノール選好に関する選択性は特定の酵素の活性部位又は活性部位付近で、水に対する親和性よりも、エタノールに対する親和性のほうが大きいことを示し、この親和性はＦｖ３Ａに比べてＭｕｌｔｉｆｅｃｔ）（登録商標）キシラナーゼに対しより高い。キシロビオース又はキシロースオリゴマーを基質としたときに、ＥＸＰ対キシロース比がＦｖ４３Ｄと同一であることは、Ｆｖ４３Ｄの場合、キシロビオース及びキシロースオリゴマー基質の両方の加水分解生成物であるキシロースを脱水縮合することでＥＸＰが形成されるという事実により説明することができる。
Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ及びＦｖ３Ａの場合、ＥＸＰの最高収率は、３．５時間インキュベーションした後に得られる。Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼを用い、３．５時間インキュベーションした時点でのＥＸＰ収率は、Ｆｖ４３Ｄを用いた場合に得られるＥＸＰ収率の約７〜８倍であった。３．５時間後以降、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼ反応のＥＸＰ収率は減少し、Ｆｖ３Ａ反応は４０〜６０時間でｔ１／２であった。Ｆｖ３Ａを包含する反応は、恐らく、ＥＸＰと、脱水縮合により生成されるキシロースとを平衡値へと向かわせる糖鎖転移反応で値が高くなることから、酵素により触媒されるＥＸＰ加水分解であった。ＳＳＦ反応において、保持型活性を有するβ−キシロシダーゼの存在下でのＥＸＰ生成の速度及び続くＥＸＰ加水分解の不活発さは、反転型β−キシロシダーゼが存在するときに、保持型β−キシロシダーゼの方が多く存在させた場合に、ＳＳＦ反応を持続させている間中、ＥＸＰの濃度が実質的により高くとどまっているのであろうことを示す。これは更に、ＳＳＦ反応で、保持型β−キシロシダーゼを反転型β−キシロシダーゼと置き換えると、生成物の収率に有効であり得ることを示す。上述の反応のすべてが酵素により触媒されていることを書き添える。酵素を含まない対照サンプル／反応では、０．９Ｍのエタノールの存在下で、４６℃にてキシロビオース、キシロースオリゴマー又はキシロースをインキュベーションしてもＥＸＰ生成は示されなかった。
９．２平衡定数の算出
Ｄｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ １９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈ．＆ Ｂｉｏｅｎｇ．４３：１０７５〜１０８０）により、脱水縮合によるアルキル−キシロピラノシド（ＡＸＰ）（例えばＥＸＰ）の生成範囲は、アルコール、キシロース及びアルキル−キシロピラノシド生成物間に得られる平衡関係によって割り出すことができることが示唆された。
エチル−キシロピラノシド（ＥＸＰ）の解離定数は：
Figure 2016154548
である。
この式を用いると、ＳＳＦ反応にＭｕｌｔｉｆｅｃｔ（登録商標）キシラナーゼを存在させた場合の平衡定数として、図２のデータからＫｄが２７Ｍであることが算出できる。この式を用いると、ＳＳＦ反応にＦｖ４３Ｄを存在させた場合の平衡定数として、図１６のデータからＫｄが９．４Ｍであることが算出できる。ＥＸＰ濃度は明らかにされていないが、トリコデルマ・リーゼイβ−キシロシダーゼを使用し、かつＫｄを４０Ｍと算出したＤｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．（１９９４，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．４３：１０７５〜１０８０）では、インキュベーションの１６０時間後にやっと平衡定数に達している。上記平衡定数の算出は、すべて、キシロース及びエタノールで開始させたＳＳＦ反応（Ｆｖ４３Ｄによりキシロビオース及びキシロースオリゴマーを２０時間で完全に加水分解させ、ただしＳＳＦ反応は合計１４５時間にわたって進行させた）から行なったが、本開示の図１６に示された結果は除外した。したがって、反転型β−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄが、反転型反応により平衡下で有意な量のＥＸＰを生成することから、Ｋｄは約１０〜約４０Ｍの範囲内であり、かつ恐らくはより低い値に近いものと仮定される。
１０．実施例４：トリコデルマ・リーゼイのＢＸＬ１遺伝子の欠失
１０．１ｂｘｌ１欠失カセットの作製ｂｘｌ１欠失カセットを作製するため、ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、プライマー対ＭＨ３７５／ＭＨ３７６及びＭＨ３７７／ＭＨ３７８をそれぞれ（表４に示す）使用して、ＰＣＲによりトリコデルマ・リーゼイのゲノムＤＮＡから、ｂｘｌ１遺伝子の５’及び３’フランキング配列（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２（１０）：３８４０〜６）を増幅させた。ｂｇｌ１遺伝子付近が含有されることを回避するため、３’フランキング配列にはＢｘｌ１コード配列の一部を含有させた。プライマーＭＨ３７６の５’末端をリン酸化した。５Ｕ／μＬ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の濃度のＴ４ ＤＮＡリガーゼ１μｌ、１０Ｘ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）１μＬ及びＰＣＲフラグメントおよそ２０ｎｇを、合計容量１０μＬで室温で１０分にわたってインキュベートした。ライゲーション反応の混合物を、ＰＣＲ反応のテンプレートとして、プライマー対ＭＨ３７９／ＭＨ３８０及びＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と共に使用した。
得られた４．０ｋｂのフラグメントを、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従ってｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯにクローン化した。このプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。ＴＯＰＯベクター中にクローン化した４．０ｋｂのｂｘｌ１ ５’＋３’ＰＣＲ融合生成物を含有するコロニーを単離した。プラスミドをＱｉａＰｒｅｐ ｐｌａｓｍｉｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出し、配列を確認した（Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。得られたプラスミドをＡｃｌＩ及びＡｓｃＩ（ＮＥＢ）で消化して、続いて、ハイグロマイシン耐性遺伝を含有しているフラグメントをクローン化した。
ＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、プライマーＭＨ２９２／ＭＨ２９０により、アスペルギルス・ニデュランスｏｌｉＣプロモータ、ハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｅ．ｃｏｌｉ，ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ，ｈｐｈ）、及びアスペルギルス・ニデュランスｔｒｐＣターミネータを含有しているベクターから、ハイグロマイシン耐性遺伝子を増幅させた。ＰＣＲで増幅させたフラグメントをｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。コロニーを単離し、プラスミドを抽出して配列を確認したところ、５’ＡｓｃＩ制限部位がＮａｒＩ部位（ＧＧＣＧＣＧＣＣ→ＧＧＣＧＣＣＣ）により置き換えられるという変異が示された。続いてＢｘｌ１−欠失プラスミド中にクローン化するのに備え、次いでコンストラクトをＮａｒＩ（Ｒｏｃｈｅ）、ＡｓｃＩ（ＮＥＢ）及びＤｒａＩ（Ｒｏｃｈｅ）により消化し、生じた２．５ｋｂのフラグメントを、製造元のプロトコルに従ってＱｉａＱｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ）ゲル抽出キットを用い、単離した。
反応容量１０μＬ中に、１０Ｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）１μＬ、５Ｕ／ｍＬ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）１μＬ、及び各フラグメント５０ｎｇを含有させて、上記のように、単離した２つのフラグメントをライゲーションした。ライゲーション反応物でＥ．ｃｏｌｉ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓをクローン化し、シングルコロニーを単離した。ｌｏｘＰに隣接したハイグロマイシン耐性遺伝を含有する、ｂｘｌ１−欠失ベクター（図１７，ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ，ｂｘｌ１欠失，ｈｐｈ−ｌｏｘＰ）をＥ．ｃｏｌｉから抽出し、Ｂｍｔ１を用い制限消化することで、適切なライゲーションが行われたか検証した。制限消化により、４７５４、２１９５、１８９９、及び１１８２塩基対のフラグメントが生じた。
ｂｘｌ１を欠失させたプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯのフラグメントを、プライマーＭＨ３７９／ ＭＨ３８０（ｂｘｌ１欠失，ｈｐｈ−ｌｏｘＰ）及びＰｆｕＵｌｔｒａ ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、合計量１０ｍＬで増幅させることで、ｂｘｌ１−欠失カセットを生成した。ＱｉａｅｘＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、ＰＣＲ生成物をクリーンアップし、濃縮した。ＳｐｅｅｄＶａｃにより、更にＤＮＡを約１．５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。
１０．２ ｂｘｌ１欠失プラスミドによるトリコデルマ・リーゼイの形質転換
本明細書中に前述したように、トリコデルマ・リーゼイＢｇｌ１及びトリコデルマ・リーゼイＸｙｎ３を過剰発現させたトリコデルマ・リーゼイ株２２９を、ｂｘｌ１−欠失カセットのＤＮＡで形質転換した。１００ｐｐｍのハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有している培地で、形質転換体を選択した。ｂｘｌ１欠失カセットを含有している形質転換体をＰＣＲにより選択した。本明細書では、ｂｘｌ１−欠損トリコデルマ・リーゼイ株を「ｂｘｌ１−」株として参照する。
１１．実施例５：トリコデルマ・リーゼイ株によるｆｖ４３Ｄの発現
以降の例により、どのようにしてトリコデルマ・リーゼイを遺伝子操作してＦｖ４３Ｄを発現させたかを示す。本明細書では、Ｆｖ４３Ｄを発現するよう遺伝子操作されたトリコデルマ・リーゼイ株を、「Ｆｖ４３Ｄ＋」株として参照する。
１１．１発現カセットの作製
プライマーＳＫ１３２２／ＳＫ１２９７（表５）を用い、フザリウム・バーティシリオイドゲノムＤＮＡサンプル中のＦｖ４３Ｄ遺伝子をＰＣＲ増幅することでフザリウム・バーティシリオイドβ−キシロシダーゼＦｖ４３Ｄの発現カセットを作製した。遺伝子操作したトリコデルマ・リーゼイ株ＲＬ−Ｐ３７から抽出した、トリコデルマ・リーゼイゲノムＤＮＡサンプル中の、エンドグルカナーゼ遺伝子ｅｇｌ１のプロモータ領域を、プライマーＳＫ１２３６／ＳＫ１３２１を用い増幅させた（例えば，Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ Ｇ．ａｎｄ Ｂ．Ｓ．Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０（１９８４）ｐｐ．４６〜５３を参照されたい）。増幅させた２つのフラグメントを、続いて、プライマーＳＫ１２３６／ＳＫ１２９７を用い、ＰＣＲ反応で一緒に融合させた。得られたＰＣＲフラグメントをｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、プラスミドＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄ（図１８）を生成し、次にプラスミドを用い、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。複数のＥ．ｃｏｌｉクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で消化して確認した。
プライマーＳＫ１２３６／ＳＫ１２９７（表５）を用い、ＴＯＰＯ Ｂｌｕｎｔ／Ｐｅｇｌ１−Ｆｖ４３Ｄの発現カセットをＰＣＲにより増幅させ、トリコデルマ・リーゼイを形質転換するためのＤＮＡ生成物を生成した。発現カセットは、存在していた、ａｌｓ（アセト乳酸シンターゼ）遺伝子を含有する選択マーカーカセットと同時形質転換させた。
１１．２ Ｆｖ４３Ｄ発現カセットでのｂｘｌ１−欠損トリコデルマ・リーゼイの形質転換
標準的な形質転換方法（例えば、電気穿孔法など）を用い、ｂｘｌ１−欠失トリコデルマ・リーゼイ宿主株を、Ｆｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇ１プロモータ，Ｆｖ４３Ｄ翻訳領域，及びＦｖ４３Ｄの天然ターミネータを含む）、及び存在している、天然ａｌｓ遺伝子を含有している選択マーカーカセットにより、形質転換した（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第０８／１５３７１２号を参照されたい）。クロリムロンエチルを含有している最少培地の寒天プレートで形質転換体を選択した。これらの形質転換体はｂｘｌ１−Ｆｖ４３Ｄ＋トリコデルマ・リーゼイである。
１１．３ Ｆｖ４３Ｄ発現カセットでのｂｘｌ１−発現トリコデルマ・リーゼイの形質転換
野生型ｂｘｌ１遺伝子を有するトリコデルマ・リーゼイ宿主株（ＰＣＴ特許出願公開第２００５／００１０３６（Ａ２）号）を、標準的な形質転換法、例えば、電気穿孔法を用い、Ｆｖ４３Ｄ発現カセット（ｅｇ１プロモータ，Ｆｖ４３Ｄ翻訳領域，及びＦｖ４３Ｄの天然ターミネータを含む）、及び存在する、天然ａｌｓ遺伝子を含有する選択マーカーカセットにより、形質転換した（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第０８／１５３７１２号を参照されたい）。クロリムロンエチルを含有している最少培地の寒天プレートで形質転換体を選択した。これらの形質転換体はＦｖ４３Ｄ＋トリコデルマ・リーゼイである。
１２．実施例６：ＳＳＦ下での組み換え型トリコデルマ・リーゼイ株により生成されたセルラーゼの使用
形質転換体ｂｘｌ１−Ｆｖ４３Ｄ＋トリコデルマ・リーゼイ、及びＦｖ４３Ｄ＋トリコデルマ・リーゼイを使用して、セルラーゼ含有培養ブロスを生成する。次いで、本明細書に記載のとおりに、これらの培養ブロスを、連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式ＳＳＦ反応に使用し、脱水縮合生成物のトランスキシロシル化（trans-xylosication）により、ＡＸＰ生成を減少させ、かつ糖収率の低下を減少させる。
特定の実施例では、ｂｘｌ１−トリコデルマ・リーゼイ株２２９（「２２９ Ｂｘｌ欠失」）形質転換体を培養して、セルラーゼ含有培養ブロスを生成し、次いでこの培養ブロスに、精製トリコデルマ・リーゼイＢｘｌ１（キシラン濃度０．５ｍｇ／ｇ又は１ｍｇ／ｇ）又は精製ＦＶ４３Ｄ（キシラン濃度１ｍｇ／ｇ）を添加した。１日目及び３日目のＥＸＰ及びエタノールの濃度を、図４３Ａ（１日目）及び図４３Ｂ（３日目）にそれぞれプロットした。反応は、希アンモニアで前処理したトウモロコシの穂軸を固形分充填量２５重量％で用い、組み換えザイモモナスＳＳＦ条件下で実施した。

Claims (129)

  1. 発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び反転型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ含む完全発酵培地を、発酵生成物の生成に好適な期間及び条件下で培養することを包含する、同時糖化発酵（ＳＳＦ）の方法。
  2. 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成する短鎖アルキル−β−キシロピラノシド（「ＡＸＰ」）の量よりも、前記完全発酵培地が生成するＡＸＰの量が少なくなるように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するＡＸＰよりも、前記完全発酵培地が生成するＡＸＰが少なくとも４０パーセント減少するように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するＡＸＰよりも、前記完全発酵培地が生成するＡＸＰが少なくとも５０パーセント減少するように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するＡＸＰよりも、前記完全発酵培地が生成するＡＸＰが少なくとも６０パーセント減少するように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項４に記載の方法。
  6. 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地が生成するＡＸＰよりも、前記完全発酵培地が生成するＡＸＰが少なくとも７０パーセント減少するように、有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＡＸＰが、メチル−β−キシロピラノシド（ＭＸＰ）、エチル−β−キシロピラノシド（ＥＸＰ）、プロピル−β−キシロピラノシド（ＰＸＰ）、又はブチル−β−キシロピラノシド（ＢＸＰ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記完全発酵培地が、前記反転型β−キシロシダーゼを含まない対照発酵培地の培養から得られる前記発酵生成物の収率と比較して、前記発酵生成物の収率を増加させるのに有効な量の前記反転型β−キシロシダーゼを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記発酵生成物の収率が少なくとも１％増加する、請求項８に記載の方法。
  10. 前記発酵生成物の収率が少なくとも２％増加する、請求項９に記載の方法。
  11. 前記発酵生成物の収率が少なくとも３％増加する、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記発酵生成物の収率が少なくとも５％増加する、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記発酵生成物の収率が少なくとも７．５％増加する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記発酵生成物の収率が少なくとも１０％増加する、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記発酵生成物がアルコールである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノールである、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記反転型β−キシロシダーゼがＧＨ４３ファミリー酵素である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記反転型β−キシロシダーゼが、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ又はＸｙｎＢ３ポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記Ｆｖ４３Ｄポリペプチドが、配列番号２、又は配列番号２の残基２１〜３５０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記Ｐｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号８、又は配列番号８の残基２１〜４５５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記Ｆｖ４３Ｅポリペプチドが、配列番号１０、又は配列番号１０の残基１９〜５３０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記Ｆｖ４３Ｂポリペプチドが、配列番号１２、又は配列番号１２の残基１７〜５７４に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
  23. 前記Ａｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号１４、又は配列番号１４の残基１５〜５５８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
  24. 前記Ｆｏ４３Ａポリペプチドが、配列番号２４、又は配列番号２４の残基２１〜３４８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
  25. 前記Ｇｚ４３Ａポリペプチドが、配列番号２２、又は配列番号２２の残基１９〜３４０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
  26. 前記ＸｙｎＢ３ポリペプチドが、配列番号２５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１８に記載の方法。
  27. 前記反転型β−キシロシダーゼが、前記キシラン含有バイオマス中のキシラン１グラム当たり０．３ｍｇ〜１０ｍｇの濃度で、前記完全発酵培地中に存在する、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記反転型β−キシロシダーゼが、前記キシラン含有バイオマス中のキシラン１グラム当たり０．４ｍｇ〜１０ｍｇの濃度で存在する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記反転型β−キシロシダーゼが、前記キシラン含有バイオマス中のキシラン１グラム当たり０．３ｍｇ〜３ｍｇの濃度で存在する、請求項２７に記載の方法。
  30. 連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式ＳＳＦプロセスとして実施される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記完全発酵培地を調製する工程を更に含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記完全発酵培地を調製する工程が、（ａ）前記発酵微生物、（ｂ）前記キシラン含有バイオマス、（ｃ）前記セルラーゼ、（ｄ）前記ヘミセルラーゼ、（ｅ）前記反転型β−キシロシダーゼ、及び（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の１つ以上又はすべてを含まない培地、を混合すること含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記セルラーゼが、全セルラーゼ調製物の形態で存在する、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記全セルラーゼ調製物が、糸状菌の培養から得られる培養ブロスである、請求項３３又は３４に記載の方法。
  36. 前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）が、前記天然β−キシロシダーゼ遺伝子が欠失する又は不活性化するように遺伝子操作された、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記発酵微生物が真菌である、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記真菌がサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記発酵微生物がバクテリアである、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記バクテリアがザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）である、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本（giant reed）、エレファントグラス（elephant grass）、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記キシラン含有バイオマスがスラリーである、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記キシラン含有バイオマスが前処理された、請求項４２又は４３に記載の方法。
  45. 前記発酵生成物を回収する工程を更に含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記完全発酵培地が、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、保持型β−キシロシダーゼの量よりも多い反転型β−キシロシダーゼの量を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記完全発酵培地中の前記反転型β−キシロシダーゼ対前記保持型β−キシロシダーゼの比が、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、少なくとも２：１である、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記天然β−キシロシダーゼ遺伝子を欠失する、又は検出可能なβ−キシロシダーゼ活性を有さないように遺伝子操作された、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  49. 遺伝子組換えによりＧＨ４３ファミリー酵素を発現するよう遺伝子操作された、請求項４８に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  50. 遺伝子組換えによりＦｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ、又はＸｙｎＢ３ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された、請求項４８に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  51. 前記Ｆｖ４３Ｄポリペプチドが、配列番号２、又は配列番号２の残基２１〜３５０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項４９又は５０に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  52. 前記Ｐｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号８、又は配列番号８の残基２１〜４４５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  53. 前記Ｆｖ４３Ｅポリペプチドが、配列番号１０、又は配列番号１０の残基１９〜５３０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  54. 前記Ｆｖ４３Ｂポリペプチドが、配列番号１２、又は配列番号１２の残基１７〜５７４に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  55. 前記Ａｆ４３Ａポリペプチドが、配列番号１４、又は配列番号１４の残基１５〜５５８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  56. 前記Ｆｏ４３Ａポリペプチドが、配列番号２４、又は配列番号２４の残基２１〜３４８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  57. 前記Ｇｚ４３Ａポリペプチドが、配列番号２２、又は配列番号２２の残基１９〜３４０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  58. 前記ＸｙｎＢ３ポリペプチドが、配列番号２５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５１に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  59. 前記セルラーゼ調製物の生成を得られる条件下で、請求項４９〜５８のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞を培養することを含む、セルラーゼ調製物の生成方法。
  60. 前記セルラーゼ調製物を回収することを更に含む、請求項５９に記載の方法。
  61. 請求項５９又は６０に記載の方法を実施することで得られるセルラーゼ調製物。
  62. 請求項４９〜５８のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞を培養することで生成される培養ブロス。
  63. 前記バイオマスと、請求項６１に記載のセルラーゼ調製物を接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
  64. 前記バイオマスと、請求項６２に記載の培養ブロスを接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
  65. 発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び反転型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ含む、組成物。
  66. 前記反転型β−キシロシダーゼがＧＨ４３ファミリー酵素である、請求項６５に記載の組成物。
  67. 前記反転型β−キシロシダーゼが、Ｆｖ４３Ｄ、Ｐｆ４３Ａ、Ｆｖ４３Ｅ、Ｆｖ４３Ｂ、Ａｆ４３Ａ、Ｆｏ４３Ａ、Ｇｚ４３Ａ又はＸｙｎＢ３ポリペプチドである、請求項６５に記載の組成物。
  68. 前記Ｆｖ４３Ｄポリペプチドが、存在する場合、配列番号２、又は配列番号２の残基２１〜３５０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６６又は６７に記載の組成物。
  69. 前記Ｐｆ４３Ａポリペプチドが、存在する場合、配列番号８、又は配列番号８の残基２１〜４４５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６６又は６７に記載の組成物。
  70. 前記Ｆｖ４３Ｅポリペプチドが、存在する場合、配列番号１０、又は配列番号１０の残基１９〜５３０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６６又は６７に記載の組成物。
  71. 前記Ｆｖ４３Ｂポリペプチドが、存在する場合、配列番号１２、又は配列番号１２の残基１７〜５７４に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６６又は６７に記載の組成物。
  72. 前記Ａｆ４３Ａポリペプチドが、存在する場合、配列番号１４、又は配列番号１４の残基１５〜５５８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６６又は６７に記載の組成物。
  73. 前記Ｆｏ４３Ａポリペプチドが、存在する場合、配列番号２４、又は配列番号２４の残基２１〜３４８に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６６又は６７に記載の組成物。
  74. 前記Ｇｚ４３Ａポリペプチドが、存在する場合、配列番号２２、又は配列番号２２の残基１９〜３４０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６６又は６７に記載の組成物。
  75. 前記ＸｙｎＢ３ポリペプチドが、存在する場合、配列番号２５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項６６又は６７に記載の組成物。
  76. 前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本（giant reed）、エレファントグラス（elephant grass）、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、請求項６５〜７５のいずれか一項に記載の組成物。
  77. 前記発酵微生物が真菌又はバクテリアである、請求項６５〜７６のいずれか一項に記載の組成物。
  78. 前記真菌がサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）酵母である、請求項７７に記載の組成物。
  79. 前記バクテリアがザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）である、請求項７７に記載の組成物。
  80. 前記セルラーゼが全セルラーゼ調製物の形態で存在する、請求項６５〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
  81. 前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項８０に記載の組成物。
  82. 前記組成物が、保持型β−キシロシダーゼを実質的に含まず、又は検出可能な保持型β−キシロシダーゼ活性を有さない、請求項６５〜８１のいずれか一項に記載の組成物。
  83. 請求項６５〜８２のいずれか一項に記載の組成物を一定期間培養することを含む、発酵生成物の生成方法。
  84. 前記発酵生成物がアルコールである、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記アルコールがメタノール、エタノール、プロパノール、プロパン−１，３−ジオール、又はブタノールである、請求項８４に記載の方法。
  86. 発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び保持型β−キシロシダーゼを少なくとも１つ含む完全発酵培地を、アルキル−β−キシロピラノシド（「ＡＸＰ」）の生成に好適な期間及び条件下で培養することを包含する、同時糖化発酵（ＳＳＦ）の方法。
  87. 前記完全発酵培地が、保持型β−キシロシダーゼを含まない、又はより少量で含む対照発酵培地が生成するＡＸＰよりも多く前記完全発酵培地がＡＸＰを生成するのに有効な量の前記保持型β−キシロシダーゼを含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記ＡＸＰが、メチル−β−キシロピラノシド（ＭＸＰ）、エチル−β−キシロピラノシド（ＥＸＰ）、プロピル−β−キシロピラノシド（ＰＸＰ）、又はブチル−β−キシロピラノシド（ＢＸＰ）である、請求項８６又は８７に記載の方法。
  89. 前記保持型β−キシロシダーゼが、ＧＨ３、ＧＨ３０、ＧＨ３１、ＧＨ３９、ＧＨ５２、ＧＨ５４、又はＧＨ１１６ファミリー酵素である、請求項８６〜８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 前記保持型β−キシロシダーゼが、ＸｌｎＤ、Ｆｖ３０Ａ、Ｆｖ３０Ｂ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ３９Ｂ、又はＸｙｎＢポリペプチドである、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 前記ＸｌｎＤポリペプチドが、配列番号４０、又は配列番号４０の残基１８〜８０４に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記Ｆｖ３０Ａポリペプチドが、配列番号４２、又は配列番号４２の残基２０〜５３７に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
  93. 前記Ｆｖ３０Ｂポリペプチドが、配列番号４４、又は配列番号４４の残基２５〜４８５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
  94. 前記Ｆｖ３９Ａポリペプチドが、配列番号４６、又は配列番号４６の残基２０〜４３９に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
  95. 前記Ｆｖ３９Ｂポリペプチドが、配列番号４８、又は配列番号４８の残基１９〜４５６に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
  96. 前記ＸｙｎＢポリペプチドが、配列番号５０に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
  97. 前記ＸｙｌＡポリペプチドが、配列番号５２、又は配列番号５２の残基１９〜７０５に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
  98. 前記Ｘｙｌ１ポリペプチドが、配列番号５４に相当するアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項９０に記載の方法。
  99. 連続式、バッチ式、又はフェドバッチ式ＳＳＦプロセスとして実施される、請求項８６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記完全発酵培地を調製する工程を更に含む、請求項８６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記完全発酵培地を調製する工程が、（ａ）前記発酵微生物、（ｂ）前記キシラン含有バイオマス、（ｃ）前記セルラーゼ、（ｄ）前記ヘミセルラーゼ（ｅ）前記保持型β−キシロシダーゼ、及び（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の１つ以上又はすべてを含まない培地、を混合すること含む、請求項１００に記載の方法。
  102. 前記セルラーゼが、全セルラーゼ調製物の形態で存在する、請求項１０１に記載の方法。
  103. 前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項１０２に記載の方法。
  104. 前記全セルラーゼ調製物が、糸状菌の培養から得られる培養ブロスである、請求項１０２又は１０３に記載の方法。
  105. 前記糸状菌がトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）である、請求項１０４に記載の方法。
  106. 前記トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）が、天然保持型β−キシロシダーゼ遺伝子を過剰発現させる、又は外来保持型β−キシロシダーゼ遺伝子を発現させるよう遺伝子操作された、請求項１０５に記載の方法。
  107. 前記発酵微生物が真菌又はバクテリアである、請求項８６〜１０６のいずれか一項に記載の組成物。
  108. 前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本（giant reed）、エレファントグラス（elephant grass）、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、請求項８６〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記キシラン含有バイオマスが前処理された、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記ＡＸＰ化合物を回収する工程を更に含む、請求項８６〜１０８のいずれか一項に記載の方法。
  111. 前記完全発酵培地が、モル基準において、分子量基準において、又はモル基準及び分子量基準の両方において、反転型β−キシロシダーゼよりも多い量の保持型β−キシロシダーゼを含む、請求項８６〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 天然β−キシロシダーゼ遺伝子が過剰発現される、又は外来β−キシロシダーゼ遺伝子を発現されるように遺伝子操作された、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  113. 遺伝子組換えによりＧＨ３、ＧＨ３０、ＧＨ３１、ＧＨ３９、ＧＨ５２、ＧＨ５４、又はＧＨ１１６ファミリー酵素を発現するよう遺伝子操作された、請求項１１２に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  114. 遺伝子組換えによりＸｌｎＤ、Ｆｖ３０Ａ、Ｆｖ３０Ｂ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ３９Ｂ、ＸｙｎＢ、ＸｙｌＡ、又はＸｙｌ１ポリペプチドを発現するよう遺伝子操作された、請求項１１２に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞。
  115. 前記セルラーゼ調製物の生成を得られる条件下で、請求項１１２〜１１４のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞を培養することを含む、セルラーゼ調製物生成の方法。
  116. 前記セルラーゼ調製物を回収することを更に含む、請求項１１５に記載の方法。
  117. 請求項１１５又は１１６に記載の方法を実施することで得られるセルラーゼ調製物。
  118. 請求項１１２〜１１４のいずれか一項に記載のトリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）細胞を培養することで生成される培養ブロス。
  119. 前記バイオマスと、請求項１１７に記載のセルラーゼ調製物を接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
  120. 前記バイオマスと、請求項１１８に記載の培養ブロスを接触させることを含む、バイオマス糖化方法。
  121. 発酵微生物を少なくとも１つ、キシラン含有バイオマスを少なくとも１つ、セルラーゼを少なくとも１つ、ヘミセルラーゼを少なくとも１つ、及び保持型β−キシロシダーゼを少なくとも１つを含む、組成物。
  122. 前記保持型β−キシロシダーゼが、ＧＨ３、ＧＨ３０、ＧＨ３１、ＧＨ３９、ＧＨ５２、ＧＨ５４、又はＧＨ１１６ファミリー酵素である、請求項１２１に記載の組成物。
  123. 前記反転型β−キシロシダーゼが、ＸｌｎＤ、Ｆｖ３０Ａ、Ｆｖ３０Ｂ、Ｆｖ３９Ａ、Ｆｖ３９Ｂ、ＸｙｎＢ、ＸｙｌＡ、又はＸｙｌ１ポリペプチドである、請求項１２１に記載の組成物。
  124. 前記キシラン含有バイオマスが、トウモロコシ茎葉、バガス、モロコシ、大きな根茎のある多年生草本（giant reed）、エレファントグラス（elephant grass）、茅、杉、麦わら、スイッチグラス、広葉樹パルプ、又は針葉樹パルプである、請求項１２１〜１２３のいずれか一項に記載の組成物。
  125. 前記発酵微生物が真菌又はバクテリアである、請求項１２１〜１２４のいずれか一項に記載の組成物。
  126. 前記セルラーゼが全セルラーゼ調製物の形態で存在する、請求項１２１〜１２５のいずれか一項に記載の組成物。
  127. 前記全セルラーゼ調製物が、ヘミセルラーゼを含む、請求項１２６に記載の組成物。
  128. 前記組成物が、反転型β−キシロシダーゼを実質的に含まず、又は検出可能な反転型β−キシロシダーゼ活性を有さない、請求項１２１〜１２７のいずれか一項に記載の組成物。
  129. 請求項１２１〜１２８のいずれか一項に記載の組成物を一定期間培養することを含む、ＡＸＰ化合物の生成方法。
JP2016052143A 2009-12-23 2016-03-16 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法 Pending JP2016154548A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28991709P 2009-12-23 2009-12-23
US61/289,917 2009-12-23

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012546088A Division JP2013515482A (ja) 2009-12-23 2010-12-17 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2016154548A true JP2016154548A (ja) 2016-09-01

Family

ID=44196386

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012546088A Pending JP2013515482A (ja) 2009-12-23 2010-12-17 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法
JP2016052143A Pending JP2016154548A (ja) 2009-12-23 2016-03-16 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2012546088A Pending JP2013515482A (ja) 2009-12-23 2010-12-17 同時糖化発酵反応の効率を改善するための方法

Country Status (13)

Country Link
US (2) US10138499B2 (ja)
EP (1) EP2516663B1 (ja)
JP (2) JP2013515482A (ja)
KR (1) KR20120106774A (ja)
CN (2) CN102686736B (ja)
AU (1) AU2010333801B2 (ja)
BR (1) BR112012018407A8 (ja)
CA (1) CA2784355A1 (ja)
CO (1) CO6551739A2 (ja)
MX (1) MX2012007224A (ja)
RU (1) RU2012131405A (ja)
UA (1) UA114276C2 (ja)
WO (1) WO2011079048A2 (ja)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3296394T3 (da) * 2009-09-23 2020-12-21 Danisco Us Inc Hidtil ukendte glycosylhydrolaseenzymer og anvendelser heraf
AU2010333801B2 (en) 2009-12-23 2015-12-17 Danisco Us Inc. Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
JP2011160753A (ja) * 2010-02-12 2011-08-25 Univ Of Tokyo 糖の製造方法、エタノールの製造方法、及び乳酸の製造方法
AR085379A1 (es) * 2011-02-23 2013-09-25 Syngenta Participations Ag Potenciacion de sacarificacion enzimatica
RU2013146245A (ru) 2011-03-17 2015-04-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Способ уменьшения вязкости в процессе осахаривания
US20140289905A1 (en) * 2011-11-11 2014-09-25 Novozymes Inc. Polypeptides Having Xylanase Activity and Polynucleotides Encoding Same
WO2013067964A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-16 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
EP2785732B1 (en) * 2011-12-01 2017-04-12 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
CN103060418A (zh) * 2012-12-06 2013-04-24 南昌大学 一种构建混合菌体系发酵稻草秸秆生产乙醇的方法
EP2929021A1 (en) 2012-12-07 2015-10-14 Danisco US Inc. Compositions and methods of use
CN105916981A (zh) 2013-07-29 2016-08-31 丹尼斯科美国公司 变体酶
WO2015048087A1 (en) * 2013-09-25 2015-04-02 Novozymes A/S Processes of producing fermentation products
WO2015057520A1 (en) * 2013-10-16 2015-04-23 Novozymes A/S Processes of producing fermentation products
US9994872B2 (en) * 2013-12-13 2018-06-12 Lantmännen Energi Integration of first and second generation bioethanol processes
KR101806223B1 (ko) * 2014-11-07 2017-12-07 한국과학기술연구원 리그닌-셀룰로오스 동시 분해 생촉매 및 이를 이용한 당화액과 바이오 연료의 제조방법
EP3234166A1 (en) * 2014-12-19 2017-10-25 Danisco US Inc. Glucoamylase blends
US10392742B2 (en) * 2015-06-26 2019-08-27 Novozymes A/S Biofinishing system
CN108883400B (zh) 2016-02-19 2021-09-17 洲际大品牌有限责任公司 由生物质源形成多值料流的方法
CN108779456B (zh) * 2016-03-31 2022-04-05 东丽株式会社 蛋白质的制造方法
WO2017170918A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 東レ株式会社 変異型ｂｘｌ１遺伝子を有するトリコデルマ属真菌及びそれを使用したキシロオリゴ糖とグルコースの製造方法
EP3472337B1 (en) * 2016-06-20 2023-08-16 MetGen Oy Method for producing fructose from glucose obtained from lignocellulosic biomass
US10793886B2 (en) * 2016-06-20 2020-10-06 Metgen Oy Method for converting xylose into xylulose
WO2019074828A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Danisco Us Inc CELLOBIOSE DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE
CN109694890B (zh) * 2017-10-24 2021-02-23 朱一民 混菌系统、利用其分解半纤维素的方法及生产酒精的方法
RU2705262C2 (ru) * 2018-03-29 2019-11-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки "Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук" (ФИЦ ПНЦБИ РАН) Ферментный препарат для гидролиза растительного сырья и способ его получения с помощью рекомбинантных продуцентов на основе pichia pastoris
CN108265018A (zh) * 2018-04-04 2018-07-10 北京航天恒丰科技股份有限公司 一种使用秸秆发酵制备肥料的复合菌剂及其制备方法
JP2020025468A (ja) * 2018-08-09 2020-02-20 国立研究開発法人産業技術総合研究所 キシラナーゼ及びその利用
JP7323307B2 (ja) * 2019-03-18 2023-08-08 積水化学工業株式会社 エタノール
WO2020159964A1 (en) * 2019-01-28 2020-08-06 University Of Florida Research Foundation Method for fermentation under reduced pressure
JP7339751B2 (ja) * 2019-03-18 2023-09-06 積水化学工業株式会社 エタノール
JP7323306B2 (ja) * 2019-03-18 2023-08-08 積水化学工業株式会社 エタノール
JP7339749B2 (ja) * 2019-03-18 2023-09-06 積水化学工業株式会社 エタノール
JP7339750B2 (ja) * 2019-03-18 2023-09-06 積水化学工業株式会社 エタノール
JP7323305B2 (ja) * 2019-03-18 2023-08-08 積水化学工業株式会社 エタノール
US11421257B2 (en) 2019-07-01 2022-08-23 Cotton Inc. Process for production of sugar from a cotton-containing textile
CN111004789B (zh) * 2019-12-11 2021-10-15 云南师范大学 一种耐硫酸铵的木糖苷酶突变体v322dh328dt329e
CN111334538B (zh) * 2020-03-20 2023-04-11 鄂州职业大学 一种强化绳状青霉发酵葡萄糖生产葡萄糖酸的方法
CN111500338B (zh) * 2020-05-28 2021-09-07 广东洁冠科技有限公司 一种燃速快的生物质燃料制造设备

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11507837A (ja) * 1995-06-23 1999-07-13 ダニスコ・イングレディエンツ・アー／エス（ダニスコ・アー／エス） 新規β−キシロシダーゼ、それをコードするヌクレオチド配列、およびそれらの使用
US20080076159A1 (en) * 2006-07-10 2008-03-27 Dyadic International, Inc. Methods and Compositions for Degradation of Lignocellulosic Material
US20090099079A1 (en) * 2007-09-07 2009-04-16 Emalfarb Mark A Novel Fungal Enzymes
US20090280541A1 (en) * 2006-10-10 2009-11-12 Jordan Douglas B Beta-xylosidase for conversion of plant cell wall carbohydrates to simple sugars

Family Cites Families (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5366558A (en) 1979-03-23 1994-11-22 Brink David L Method of treating biomass material
US4797361A (en) 1983-10-24 1989-01-10 Lehigh University Microorganism and process
CA1333777C (en) 1988-07-01 1995-01-03 Randy M. Berka Aspartic proteinase deficient filamentous fungi
US5536655A (en) 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
DK16490D0 (da) 1990-01-19 1990-01-19 Novo Nordisk As Enzym
DE69107455T3 (de) 1990-05-09 2004-09-23 Novozymes A/S Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung.
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
DK0562003T4 (en) 1990-12-10 2015-07-13 Danisco Us Inc Improved saccharification of cellulose by cloning and amplification of.-Glucosidase gene from Tricodermareesei
US5997913A (en) 1990-12-10 1999-12-07 Genencor International, Inc. Method enhancing flavor and aroma in foods by overexpression of β-glucosidase
DE69225522T2 (de) 1991-03-18 1998-09-10 Gist Brocades Nv Klonierung und Expression einer Acetylxylanesterase aus Fungi
US5405769A (en) 1993-04-08 1995-04-11 National Research Council Of Canada Construction of thermostable mutants of a low molecular mass xylanase
DK81293D0 (da) 1993-07-06 1993-07-06 Novo Nordisk As Enzym
DK83993D0 (ja) 1993-07-13 1993-07-13 Novo Nordisk As
US5437992A (en) 1994-04-28 1995-08-01 Genencor International, Inc. Five thermostable xylanases from microtetraspora flexuosa for use in delignification and/or bleaching of pulp
US6099844A (en) 1994-08-22 2000-08-08 Triarco Industries, Inc. Increasing yield of extractable substances from botanicals with an enzyme composition
US5705369A (en) 1994-12-27 1998-01-06 Midwest Research Institute Prehydrolysis of lignocellulose
CN1182451A (zh) 1995-03-17 1998-05-20 诺沃挪第克公司 新的内切葡聚糖酶
US5811381A (en) 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
CN1261571C (zh) 1997-07-11 2006-06-28 金克克国际有限公司 米黑木霉膨胀素蛋白质与编码dna序列
US20020084046A1 (en) 1998-09-29 2002-07-04 Jay Chiehlung Hsu Enzymatic paper and process of making thereof
DK1117808T3 (da) 1998-10-06 2005-04-25 Mark Aaron Emalfarb Transformaationssystem inden jfjor området filamentöse svampeværter: I chrysosporium
CA2374524A1 (en) * 1999-05-26 2000-11-30 Lonnie O'neal Ingram Recombinant hosts suitable for simultaneous saccharification and fermentation
US6409841B1 (en) 1999-11-02 2002-06-25 Waste Energy Integrated Systems, Llc. Process for the production of organic products from diverse biomass sources
US6248535B1 (en) 1999-12-20 2001-06-19 University Of Southern California Method for isolation of RNA from formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens
NZ520022A (en) 1999-12-30 2005-01-28 Genencor Int Protein and DNA sequences for XYL-IV from Trichoderma reesei
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
US7223575B2 (en) 2000-05-01 2007-05-29 Midwest Research Institute Zymomonas pentose-sugar fermenting strains and uses thereof
NZ523192A (en) * 2000-06-26 2005-03-24 Univ Florida Methods and compositions for simultaneous saccharification and fermentation
US6423145B1 (en) 2000-08-09 2002-07-23 Midwest Research Institute Dilute acid/metal salt hydrolysis of lignocellulosics
DE10043662A1 (de) 2000-08-30 2001-02-22 Saechsisches Inst Fuer Angewan Verfahren zur enzymatischen Aktivierung von lignocellulosen Faserstoffen zur Herstellung von Werkstoffen
AU2002316785A1 (en) 2001-05-18 2002-12-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiase activity and polynucleotides encoding same
US6982159B2 (en) 2001-09-21 2006-01-03 Genencor International, Inc. Trichoderma β-glucosidase
US7056721B2 (en) 2001-12-18 2006-06-06 Genencor International, Inc. EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7005289B2 (en) 2001-12-18 2006-02-28 Genencor International, Inc. BGL5 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7045332B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. BGL4 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7045331B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. EGVII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7049125B2 (en) 2001-12-18 2006-05-23 Genencor International, Inc. EGVIII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US20040005674A1 (en) 2002-04-30 2004-01-08 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose
EP2305800B1 (en) 2002-08-16 2015-05-27 Danisco US Inc. Novel variant hyprocrea jecorina CBH1 cellulases
BRPI0314498B1 (pt) 2002-10-04 2019-08-20 E.I. Du Pont De Nemours And Company Escherichia coli transgênica e método para a bioprodução de 1,3-propanodiol
ES2601145T3 (es) 2002-11-07 2017-02-14 Danisco Us Inc. Beta-glucosidasa BGL6 y ácidos nucleicos que codifican la misma
US7407788B2 (en) 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
WO2004078919A2 (en) 2003-02-27 2004-09-16 Midwest Research Institute Superactive cellulase formulation using cellobiohydrolase-1 from penicillium funiculosum
US20040231060A1 (en) 2003-03-07 2004-11-25 Athenix Corporation Methods to enhance the activity of lignocellulose-degrading enzymes
WO2005028636A2 (en) 2003-03-21 2005-03-31 Genencor International, Inc. Novel cbh1 homologs and variant cbh1 cellulases
EP2385104A1 (en) 2003-04-01 2011-11-09 Danisco US Inc. Variant Scytalidium thermophilium CBH1
ES2371362T3 (es) 2003-05-29 2011-12-30 Genencor International, Inc. Nuevos genes de trichoderma.
EP1668125B1 (en) 2003-09-15 2014-06-18 Danisco US Inc. Modified enzymes, methods to produce modified enzymes and uses thereof
CN102766614A (zh) 2003-12-03 2012-11-07 明治制果药业株式会社 内切葡聚糖酶stce和含有内切葡聚糖酶的纤维素酶配制品
CA2550549A1 (en) 2003-12-18 2006-02-02 Trustees Of Princeton University Radionuclide detector and software for controlling same
US20080227166A1 (en) * 2004-01-16 2008-09-18 Novozymes A/S Fermentation Processes
CN1980953B (zh) 2004-01-30 2014-12-24 诺维信股份有限公司 具有分解纤维增强活性的多肽及其编码多核苷酸
EP1733033B1 (en) 2004-02-06 2012-06-20 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
DK3219806T3 (da) * 2004-03-25 2020-07-13 Novozymes Inc Fremgangsmåder til nedbrydning eller omdannelse af plantecellevægspolysaccharider
WO2005093050A2 (en) 2004-03-25 2005-10-06 Genencor International, Inc. Cellulase fusion protein and heterologous cellulase fusion construct encoding the same
EP1749092A2 (en) 2004-05-27 2007-02-07 Genencor International, Inc. Acid-stable alpha amylases having granular starch hydrolyzing activity and enzyme compositions
CA2586779A1 (en) 2004-06-03 2005-12-15 Novozymes A/S Mashing process and enzyme composition useful therein
US20060075522A1 (en) 2004-07-31 2006-04-06 Jaclyn Cleveland Genes and uses for plant improvement
CA2592550C (en) 2004-12-30 2015-05-19 Genencor International, Inc. Novel variant hypocrea jecorina cbh2 cellulases
JP5804666B2 (ja) 2005-04-12 2015-11-04 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ バイオマスの処理および利用における別の供給流れの集中
US7781191B2 (en) 2005-04-12 2010-08-24 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain a target chemical
DK1877568T4 (da) 2005-04-26 2021-01-11 Novozymes As Hydrolysering af arabinoxylan
AR053066A1 (es) * 2005-04-26 2007-04-18 Novozymes As Arabinofuranosidasas
BRPI0616721A2 (pt) 2005-09-30 2011-06-28 Novozymes Inc métodos para degradar ou converter um material celulósico e para produzir uma substáncia, e, composição detergente
FI120045B (fi) 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
US7256032B2 (en) 2005-12-22 2007-08-14 Ab Enzymes Oy Enzymes
DK2450439T3 (da) 2006-02-10 2014-02-10 Verenium Corp Cellulosenedbrydende enzymer, nucleinsyrer, der koder for dem, og fremgangsmåder til at fremstille og benytte dem
ES2538360T3 (es) * 2006-07-21 2015-06-19 Novozymes, Inc. Métodos para aumentar la secreción de polipéptidos que tienen actividad biológica
US8017373B2 (en) 2006-08-31 2011-09-13 Iogen Energy Corporation Process for enzymatic hydrolysis of pretreated lignocellulosic feedstocks
US8138321B2 (en) 2006-09-22 2012-03-20 Danisco Us Inc. Acetolactate synthase (ALS) selectable marker from Trichoderma reesei
US7741119B2 (en) 2006-09-28 2010-06-22 E. I. Du Pont De Nemours And Company Xylitol synthesis mutant of xylose-utilizing zymomonas for ethanol production
BRPI0718641B1 (pt) 2006-11-13 2017-09-12 Danisco Us Inc., Genencor Division Method for converting a cellulosic material into glucose or cellobiose
WO2008140749A2 (en) 2007-05-10 2008-11-20 Novozymes, Inc. Compositions and methods for enhancing the degradation or conversion of cellulose-containing material
EP2152892B1 (en) 2007-05-21 2013-05-01 Danisco US, Inc., Genencor Division Method for introducing nucleic acids into fungal cells
BRPI0812267A2 (pt) 2007-05-31 2014-10-14 Novozymes Inc Célula hospedeira fúngica filamentosa, método para produzir uma composição de proteína celulolítica, composição de proteína celulolítica, e, métodos para degradar ou converter um material, contendo celulose e para produzir um produto de fermentação
MX2009012845A (es) 2007-05-31 2009-12-15 Novozymes Inc Metodos para aumentar la actividad celulosica mejorada de un polipeptido.
CA2693084A1 (en) 2007-06-08 2008-12-18 Benjamin S. Bower Heterologous and homologous cellulase expression system
CN105063099A (zh) 2007-06-27 2015-11-18 诺维信公司 产生发酵产物的方法
EP2380988A3 (en) 2007-07-10 2012-04-11 Mosanto Technology LLC Transgenic plants with enhanced agronomic traits
US7819976B2 (en) 2007-08-22 2010-10-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Biomass treatment method
CA2698765A1 (en) 2007-09-07 2009-03-19 Danisco Us Inc. Beta-glucosidase enhanced filamentous fungal whole cellulase compositions and methods of use
WO2009045627A2 (en) 2007-10-03 2009-04-09 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
BRPI0817541A2 (pt) 2007-10-12 2014-11-25 Danisco Us Inc Métodos e composições para a produção otimizada de substâncias orgânicas de micro-organismos de fermentação
US7803623B2 (en) 2007-10-30 2010-09-28 E.I. Du Pont De Nemours And Company Zymomonas with improved ethanol production in medium containing concentrated sugars and acetate
BRPI0819896B1 (pt) 2007-12-12 2019-03-19 Novozymes A/S Processo para converter um material vegetal derivado de um aracaceae sp. contendo manana em um álcool
RU2545699C2 (ru) 2007-12-13 2015-04-10 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Композиции и способы получения изопрена
EP2245050A2 (en) 2007-12-19 2010-11-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US10676751B2 (en) 2008-02-29 2020-06-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Production and use of plant degrading materials
RU2536256C2 (ru) 2008-03-21 2014-12-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Композиция ферментной смеси для гидролиза смеси целлюлозных и гемицеллюлозных материалов (варианты) и способы ее использования (варианты)
EP2271743A2 (en) 2008-03-27 2011-01-12 E. I. du Pont de Nemours and Company Zymomonas with improved xylose utilization
CA2722189A1 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Chromatin, Inc. Methods and materials for processing a feedstock
CA2725430A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-05 Danisco Us Inc. Swollenin compositions and methods of increasing the efficiency of a cellulase
EP2626422A1 (en) 2008-06-06 2013-08-14 Danisco US Inc. Compositions and methods comprising cellulase variants with reduced affinity to non-cellulosic materials
US8518684B2 (en) 2008-11-18 2013-08-27 Novozymes, Inc. Methods and compositions for degrading cellulosic material
RU2560424C2 (ru) 2009-02-20 2015-08-20 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Способ получения состава ферментационного бульона
WO2010096931A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Iogen Energy Corporation Novel lignin-resistant cellulase enzymes
AU2010253848C1 (en) 2009-05-29 2015-02-19 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
KR20120062643A (ko) 2009-06-03 2012-06-14 다니스코 유에스 인크. 향상된 발현, 활성 및/또는 안정성을 갖는 셀룰라아제 변이체, 및 이의 용도
CA2765715A1 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Codexis, Inc. .beta.-glucosidase variants
DK3296394T3 (da) 2009-09-23 2020-12-21 Danisco Us Inc Hidtil ukendte glycosylhydrolaseenzymer og anvendelser heraf
IN2012DN03825A (ja) 2009-11-20 2015-08-28 Danisco Us Inc
AU2010333801B2 (en) 2009-12-23 2015-12-17 Danisco Us Inc. Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
US8647850B2 (en) 2009-12-23 2014-02-11 E I Du Pont De Nemours And Company Process for simultaneous saccharification and fermentation for production of ethanol
US8906235B2 (en) 2010-04-28 2014-12-09 E I Du Pont De Nemours And Company Process for liquid/solid separation of lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth
US8721794B2 (en) 2010-04-28 2014-05-13 E I Du Pont De Nemours And Company Production of high solids syrup from lignocellulosic biomass hydrolysate fermentation broth
US8962295B2 (en) 2010-06-01 2015-02-24 California Institute Of Technology Stable, functional chimeric cellobiohydrolase class I enzymes
EP2397491A1 (en) 2010-06-21 2011-12-21 Technische Universität Wien LeaA from Trichoderma reesei
EP2611901B1 (en) 2010-08-30 2016-05-11 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
US8476048B2 (en) 2010-12-17 2013-07-02 E I Du Pont De Nemours And Company Xylose utilizing zymomonas mobilis with improved ethanol production in biomass hydrolysate medium
AU2012229042B2 (en) 2011-03-17 2017-03-02 Danisco Us Inc. Glycosyl hydrolase enzymes and uses thereof for biomass hydrolysis
RU2013146245A (ru) 2011-03-17 2015-04-27 ДАНИСКО ЮЭс ИНК. Способ уменьшения вязкости в процессе осахаривания
US20140073017A1 (en) 2011-03-17 2014-03-13 Danisco Us Inc. Cellulase compositions and methods of using the same for improved conversion of lignocellulosic biomass into fermentable sugars
CN103547672B (zh) 2011-05-10 2017-10-27 丹尼斯科美国公司 热稳定性碳酸酐酶及其使用方法
EP2748317B1 (en) 2011-08-22 2017-04-19 Codexis, Inc. Gh61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance gh61 activity
KR20140122704A (ko) 2011-12-13 2014-10-20 다니스코 유에스 인크. 혼합 배양으로부터 제조된 효소 칵테일
US20150252343A1 (en) 2012-10-31 2015-09-10 Danisco Us Inc. Beta-glucosidase from magnaporthe grisea
BR112015009201A2 (pt) 2012-10-31 2017-11-14 Danisco Us Inc composição compreendeendo um polipeptídeo recombinante, ácido nucleico codificando o mesmo, célula hospedeira, bem como métodos para produzir uma beta-glucosidase e para hidrolisar um substrato de biomassa lignocelulósica
US9938551B2 (en) 2012-12-12 2018-04-10 Danisco Us Inc Variants of cellobiohydrolases
BR112015029081A2 (pt) 2013-05-20 2017-09-19 Abengoa Bioenergia Nuevas Tecnologias Sa Célula hospedeira myceliophthora thermophila expressando uma enzima beta-xilosidase recombinante, enzima beta-xilosidase recombinante expressada por meio da mesma, composição, uso de célula hospedeira, enzima beta-xilosidase ou composição e métodos de produção de açúcares fermentescíveis e de produção de bioproduto a partir de biomassa
EP2824428A1 (en) 2013-07-11 2015-01-14 Itron France Coaxial flow meter
CN105916981A (zh) 2013-07-29 2016-08-31 丹尼斯科美国公司 变体酶
WO2015084596A1 (en) 2013-12-04 2015-06-11 Danisco Us Inc. Compositions comprising a beta-glucosidase polypeptide and methods of use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11507837A (ja) * 1995-06-23 1999-07-13 ダニスコ・イングレディエンツ・アー／エス（ダニスコ・アー／エス） 新規β−キシロシダーゼ、それをコードするヌクレオチド配列、およびそれらの使用
US20080076159A1 (en) * 2006-07-10 2008-03-27 Dyadic International, Inc. Methods and Compositions for Degradation of Lignocellulosic Material
US20090280541A1 (en) * 2006-10-10 2009-11-12 Jordan Douglas B Beta-xylosidase for conversion of plant cell wall carbohydrates to simple sugars
US20090099079A1 (en) * 2007-09-07 2009-04-16 Emalfarb Mark A Novel Fungal Enzymes

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012018407A2 (pt) 2015-10-06
UA114276C2 (uk) 2017-05-25
AU2010333801B2 (en) 2015-12-17
CA2784355A1 (en) 2011-06-30
BR112012018407A8 (pt) 2018-11-27
US20130143277A1 (en) 2013-06-06
CO6551739A2 (es) 2012-10-31
WO2011079048A3 (en) 2012-06-14
CN107287250A (zh) 2017-10-24
EP2516663A2 (en) 2012-10-31
US20190161772A1 (en) 2019-05-30
WO2011079048A9 (en) 2011-08-25
CN102686736B (zh) 2017-05-31
JP2013515482A (ja) 2013-05-09
CN102686736A (zh) 2012-09-19
RU2012131405A (ru) 2014-01-27
KR20120106774A (ko) 2012-09-26
MX2012007224A (es) 2012-07-30
WO2011079048A2 (en) 2011-06-30
AU2010333801A1 (en) 2012-06-07
EP2516663B1 (en) 2020-02-12
US10138499B2 (en) 2018-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190161772A1 (en) Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
UA121113C2 (uk) Спосіб ферментативного гідролізу лігноцелюлозного матеріалу й ферментації цукрів
CA2964192C (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP3802843B1 (en) Process for producing sugars from carbohydrate materials
BR112020007246A2 (pt) processo para hidrólise enzimática de material lignocelulósico e fermentação de açúcares
CA3216054A1 (en) Enzyme composition
AU2015261652B2 (en) Methods for improving the efficiency of simultaneous saccharification and fermentation reactions
US11319559B2 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US11193145B2 (en) Enzyme composition
US20220340943A1 (en) Enzyme composition
WO2019086370A1 (en) Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
BR112020023198A2 (pt) processo para produção de um polipeptídeo

Legal Events

Date Code Title Description
A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20170314

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170608

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170810

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170914

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20171003

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20171226

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20180605