UA114276C2 - Спосіб одночасного оцукрювання і ферментації - Google Patents

Abstract

Винахід належить до способу одночасного оцукрювання і ферментації (SSF), що включає культивування повного середовища для ферментації, причому зазначене повне середовище для ферментації містить щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше одну перетворювальну β-ксилозидазу, протягом періоду і за умов, що придатні для одержання продукту ферментації, який є спиртом, де перетворювальна β-ксилозидаза є ферментом сімейства GH43, і повне середовище для ферментації містить більшу кількість перетворювальних β-ксилозидаз, ніж кількість зберігаючих β-ксилозидаз, в розрахунку на моль, в розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку на моль.

Description

(57) Реферат:

Винахід належить до способу одночасного оцукрювання і ферментації (55Е), що включає культивування повного середовища для ферментації, причому зазначене повне середовище для ферментації містить щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше одну перетворювальну В-ксилозидазу, протягом періоду і за умов, що придатні для одержання продукту ферментації, який є спиртом, де перетворювальна В-ксилозидаза є ферментом сімейства ЗН4З3, і повне середовище для ферментації містить більшу кількість перетворювальних р-ксилозидаз, ніж кількість зберігаючих В-ксилозидаз, в розрахунку на моль, в розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку на моль.

1. ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНУ ЗАЯВКУ

Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою заявкою США Мо 61/289917, поданої 23 грудня 2010 року, що включена в її повному обсязі за допомогою посилання. 2. ОБЛАСТЬ РОЗКРИТТЯ

Дійсне розкриття загалом спрямоване на способи і композиції для поліпшення виходу продукту в реакціях одночасних оцукрювання і ферментації. 3. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ

Біоконверсія поновлюваної лігноцелюлозної біомаси у цукор, що підлягає ферментації, що далі ферментують для одержання спирту (наприклад, етанолу або "біоетанолу"), який може служити альтернативою рідким паливам, привернула особливу увагу дослідників з 1970-х років, коли трапилася нафтова криза внаслідок скорочення видобутку нафти ОПЕК (Випдау, "Епегаду:

Ше Біотавв оріоп5". МУ: Му/їеу; 1981; ОіІвзоп апа Напп-Надетгааї!, 1996, Епгіте Містор. Теснпо). 18:312-31; 7аїдімаг еї а!., 2001, Аррі. Місгобіо!. Віотесппої. 56:1 7-34; Саїре апа 7асспі, 2002, Аррі.

Місгоріо!І. ВіоїесппоЇ. 59:618-28). Протягом останніх двадцяти років етанол широко використовувався у якості 1095 сумішки у бензині в США, або як чисте паливо для транспортних засобів у Бразилії. Важливість паливного біоетанолу буде зростати паралельно стрімкому зростанню цін на нафту і поступовому виснаженню її джерел.

Припускають, що лігноцелюлозна біомаса стане дешевим поновлюваним ресурсом, що може забезпечувати стабільне виробництво біопалив (наприклад, біоетанолу) у досить великому масштабі, щоб значно покрити зростаючі світові потреби енергії. Лігноцелюлозні матеріали включають, без обмежень, кукурудзяну солому (рослина кукурудзи без зерен і коренів), відходи лісового господарства, такі як тирса і папір, садові відходи з міських твердих відходів, трав'янисті рослини, такі як просо прутоподібне, а також деревні рослини, такі як тополі. Лігноцелюлозна біомаса містить три основних компоненти: геміцелюлозу, целюлозу і лігнін. Геміцелюлоза є аморфним, розгалуженим полімером, що звичайно складається в основному з п'яти цукрів (арабінози, галактози, глюкози, манози і ксилози). Целюлоза є великим лінійним полімером з молекул глюкози, звичайно зв'язаних разом у висококристалічну структуру завдяки водневим зв'язкам між паралельними ланцюгами. Лігнін є складним феніл-пропановим полімером.

Зо Біологічна обробка лігноцелюлозної біомаси включає використання целюлаз і геміцелюлаз для вивільнення цукрів з геміцелюлози і целюлози, відповідно, звичайно завдяки реакціям гідролізу. Цукри, що виходять, потім ферментують у біопалива, наприклад, біоетанол, з використанням придатних ферментуючих мікроорганізмів.

Глюкоза, що вивільняється при руйнуванні целюлози целюлазами, часто може бути потенційним інгібітором цього класу ферментів. Для скорочення нагромадження глюкози при розщепленні целюлози (або "оцукрювання" в даному документі) можуть додаватися ферментуючі мікроорганізми, аби перетворювати цукри, що виділилися, у біоетанол одночасно з вивільненням цукрів при оцукрюванні. Ця схема називається одночасними оцукрюванням і ферментацією ("ЗБЕ"). Звичайно, 55Е дає більші/вищі частки, виходи і концентрації виробленого етанолу, ніж схема окремого гідролізу і ферментації ("ЗНЕ"), незважаючи на те, що діє за більш низьких температур, ніж ті, що є оптимальними для більшості ферментів, включених до цих процесів ферментації. При цьому, типова З5Е-реакція може бути дуже розтягнутою, такою, що триває, наприклад, кілька днів, аби досягти невисоких концентрацій етанолу (див., наприклад, Кадат есеї а!., 2004, Віоїтесппої!. Ргодг. 20(3):705).

Таким чином, на даному рівні техніки існує потреба ідентифікувати способи і композиції, що пов'язані з цим, для поліпшення ефективності 55Е-реакцій і збільшення виходу біопалива, такого як біоетанол. 4. КОРОТКИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Дійсне розкриття засноване на відкритті того, що присутність певних В-ксилозидаз в реакціях одночасних оцукрювання і ферментації ("55Е") призводить до швидкого нагромадження алкіл-р- ксилопіранозидних побічних продуктів. Зокрема, виявлено, що окремі рДр-ксилозидази зі зберігаючим механізмом дії при використанні в З5Е-реакціях, можуть приводити до швидкого нагромадження алкіл-В-ксилопіранозидних побічних продуктів, що призводять до зменшення виходу продуктів ферментації. Дійсне розкриття надалі грунтується на відкритті того, що наявність деяких інших ВД-ксилозидаз з перетворювальним механізмом дії в З5Е-реакціях може скоротити або мінімізувати нагромадження алкіл-В-ксилопіранозидних побічних продуктів. Як було виявлено, включення В-ксилозидаз з перетворювальним механізмом дії в З5Е-реакції підвищує вихід продуктів ферментації.

В контексті даного розкриття В-ксилозидаза з перетворювальним механізмом дії також бо розглядається як "фермент з перетворювальною Д-ксилозидазною активністю",

"перетворювальна В-ксилозидаза" або "перетворювальний В-ксилозидазний поліпептид".

Навпроти, В-ксилозидаза зі зберігаючим механізмом дії також розглядається як "фермент із зберігаючою ВДВ-ксилозидазною активністю", "зберігаюча В-ксилозидаза" або "зберігаючий рД- ксилозидазний поліпептид".

Таким чином, у даному документі забезпечуються поліпшені способи здійснення 55Б- реакцій, що спричиняють скорочення кількості зберігаючих В-ксилозидаз. В даному документі також забезпечені поліпшені способи проведення 55Е-реакцій, що спричиняють збільшення кількості перетворювальних В-ксилозидаз. В даному документі додатково забезпечені поліпшені способи проведення 55Е-реакцій, що спричиняють скорочену кількість зберігаючих рД- ксилозидаз і збільшену кількість перетворювальних В-ксилозидаз. Композиції, що відносяться до вищеописаних поліпшених способів і інших способів, описаних у даному документі, також розглядаються.

В певних аспектах дійсний винахід забезпечує 55Е-способи, що включають культивування повного середовища для ферментації, при цьому зазначене середовище для ферментації містить щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше один фермент з перетворювальною В-ксилозидазною активністю, на час і за умов, сприятливих для утворення продукту ферментації.

У даному розкритті один або більш ферментів (або альтернативно й взаємозамінно позначених у даному документі як "цонайменше один фермент") з перетворювальною р- ксилозидазною активністю може бути присутнім у згаданому повному середовищі для ферментації в кількості, що ефективна для зниження утворення алкіл-В-ксилопіранозиду (АХР") з коротким ланцюгом (наприклад, метил-Д-ксилопіранозиду ("МХР"), етил-Д-ксилопіранозиду (СЕХР"), пропіл-ВД-ксилопіранозиду ("РХР") або бутил-ВД-ксилопіранозиду ("ВХР")) у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації без згаданого одного або більш ферментів з перетворювальною р-ксилозидазною активністю. Наприклад, такий фермент(и) присутні в кількості, що ефективна для (а) зниження кількості утворення АХР щонайменше на 20 95, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 7095 або щонайменше на 80 95 й/або (р) збільшення виходу (наприклад, щонайменше на 0,1 96, щонайменше на 0,5 9565, щонайменше на 0,7 96, щонайменше на 1 95, щонайменше на 2 95, щонайменше на 3 95, щонайменше на 5 95, щонайменше на 7,595 або щонайменше на 10 95) продукта ферментації (наприклад, спирту, такого як, але без обмеження, метанол, етанол, пропанол, пропан-і1,3-диол або бутанол) у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації без згаданого одного або більш ферментів з перетворювальною

В-ксилозидазною активністю. У певних варіантах здійснення винаходу такий фермент(и) присутній у кількості, що ефективна для зниження кількості утворення АХР до рівня в межах 50 95, у межах 40 95, у межах 30 95, у межах 20 95 або в межах 10 95 вище рівня АХР за рівноваги реакції в порівнянні з таким контрольного середовища для ферментації без згаданого одного або більш ферментів з перетворювальною рВ-ксилозидазною активністю.

В певних аспектах ферментуючий мікроорганізм здатний продукувати спирт, наприклад, метанол, етанол, пропанол, пропан-1,3-диол або бутанол, із принаймні одного джерела вуглецю, що підлягає ферментації. В певних аспектах ферментуючим мікроорганізмом є бактерія 7утотопав побіїї5 або гриб, наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб.

В певних аспектах щонайменше одна перетворювальна ДВ-ксилозидаза належить до сімейства ферментів 5Н43. У певних варіантах здійснення винаходу перетворювальну |- ксилозидазу обирають з поліпептидів Ем430, РІ4З3А, Ем4З3Е, Ем43В, АТ4ЗА, Бо43А, 743А або

ХупВ3. Зокрема, поліпептид Ем430, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 85 9565, щонайменше 90 95, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 95 95, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ХЕО ІЮ МО:2 або 21- 350 залишкам 5ЕО ІЮ МО:2. Поліпептид РІ4ЗА, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 8095, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 94 95, щонайменше 95 9о, щонайменше 96 96, щонайменше 97 96, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗХЕО

ІО МО:8 або 21-455 залишкам 5ЕО ІЮ МО:8. Поліпептид Ем4З3Е, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 96, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 96, щонайменше 60 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 98 95,

щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО І МО:10 або 19-530 залишкам 5ЕО ІЮ МО:10. Поліпептид Ем43В, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 9565, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:12 або 17-574 залишкам 5ЕО ІЮ МО:12. Поліпептид

АТ4ЗА, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 9565, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:14 або 15-558 залишкам 5ЕО ІЮ

МО:14. Поліпептид Ео43А, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 85 9565, щонайменше 90 95, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 95 95, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:24 або 21-348 залишкам 5ЕО ІЮ МО:24. Поліпептид 5743А, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 85 9565, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 956, щонайменше 97 956, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО

ІО МО:22 або 19-340 залишкам 5ЕО ІЮ МО:22. Поліпептид ХупВ3З, якщо є присутнім у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 96, щонайменше 85 95, щонайменше 90 9о, щонайменше 91 96, щонайменше 92 956, щонайменше 93 96, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:25.

В певних аспектах кількість перетворювальних В-ксилозидазних поліпептидів у зазначеному

Зо повному середовищі складає щонайменше приблизно 0,2 мг, щонайменше приблизно 0,3 мг, щонайменше приблизно 0,4 мг, щонайменше приблизно 0,5 мг, щонайменше приблизно 0,7 мг, щонайменше приблизно 1 мг, щонайменше приблизно 2 мг або щонайменше приблизно З мг на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі, яка також є компонентом повного середовища для ферментації. В інших аспектах кількість перетворювальних В-ксилозидазних поліпептидів складає приблизно З мг або менше, приблизно 2 мг або менше, приблизно 1,5 мг або менше, приблизно 1,0 мг або менше, приблизно 0,7 мг або менше, приблизно 0,5 мг або менше, приблизно 0,4 мг або менше, приблизно 0,3 мг або менше або приблизно 0,2 мг або менше на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі. В певних аспектах кількість перетворювальних

В-ксилозидазних поліпептидів у зазначеному повному середовищі коливається, наприклад, (а) від 0,4 мг до 10 мг, (Б) від 0,5 мг до 2 мг, (с) від 0,4 мг до 5 мг, (а) від 0,5 мг до 1,5 мг, (е) від 1 мг до 2 мг, (І) від 0,3 мг до З мг, (4) від 0,2 мг до 5 мг, (Й) від 0,3 мг до 5 мг або (ї) від 0,3 мг до 10 мг на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі, або кількість знаходиться в межах діапазону, верхню і нижню границю якого кожну незалежно обирають з вищевикладених значень.

В певних аспектах кількість перетворювального р-ксилозидазного поліпептида(ів) у зазначеному повному середовищі для ферментації перевищує кількість зберігаючого р- ксилозидазного поліпептида(ів) у розрахунку на моль, у розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку як на моль, так і на молекулярну вагу. В особливих варіантах здійснення співвідношення перетворювального Др-ксилозидазного поліпептида(ів) до зберігаючого рД- ксилозидазного поліпептида(ів) складає щонайменше 2:1, щонайменше 3:1, щонайменше 471, щонайменше 5:1, щонайменше 10:1 або щонайменше 50:1 у розрахунку на моль, у розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку як на моль, так і на молекулярну вагу. В особливих варіантах здійснення фермент(и) зі зберігаючою ДВ-ксилозидазною активністю відсутні або не виявляються в повному середовищі для ферментації. У певних варіантах немає визначуваної зберігаючої ВД-ксилозидазної активності в повному середовищі для ферментації.

Згідно з описаними в даному документі способами культивування повного середовища для ферментації проводиться за безперервних, періодичних умов або умов з підживленням.

Наприклад, культивування повного середовища для ферментації даного винаходу є безперервною 55Е-реакцією, періодичною 55Е-реакцією або 55Е-реакцією з підживленням. 60 Способи дійсного розкриття в певних аспектах додатково охоплюють утворення повного середовища для ферментації перед етапом культивування. Наприклад, повне середовище для ферментації можна утворити комбінуванням (а) щонайменше одного ферментуючого мікроорганізму, (Б) щонайменше однієї ксиланвмісної біомаси, (с) щонайменше однієї целюлази, (4) щонайменше однієї геміцелюлази, (е) щонайменше однієї перетворювальної р- ксилозидази й (Її) середовища без одного або декількох компонентів (а)-(е). В певних варіантах здійснення щонайменше одна целюлаза може бути присутня у формі целюлазного препарату.

Наприклад, целюлазний препарат може бути препаратом загальної целюлази, що може необов'язково також включати щонайменше одну геміцелюлазу. В особливих варіантах здійснення целюлазний препарат є культуральною рідиною від культури міцеліального гриба, наприклад, культури Т. геезеї, отриманою з використанням клітин Т. геезеї. В певних аспектах клітина Т. геезеії може бути сконструйована таким чином, щоб нативний ген В-ксилозидази був інактивований або вилучений. Необхідно відзначити, що "клітина Т. геезеї (яка| сконструйована таким чином, щоб нативний ген ВД-ксилозидази був інактивований або вилучений" включає не тільки вихідну або батьківську клітину, у якій уперше відбулася інактивація, але також потомство цієї клітини, у якому нативний ген ВД-ксилозидази інактивований або вилучений.

В певних аспектах способи дійсного розкриття належать до культивування ферментативного бульйону, що містить щонайменше одну біомасу, яка містить ксилан. В певних аспектах ксиланвмісною біомасою є, наприклад, кукурудзяна солома, багаси, сорго, арундо очеретяний, пеннісетум червоний, міскантус, криптомерія японська, солома пшениці, просо прутоподібне, деревна маса з листяної або хвойної деревини. Наприклад, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином до 55Е-реакції у формі суспензії. Наприклад, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином до 55Е-реакції у формі твердої речовини. Таким чином, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином до З5РЕ-реакції як у рідкій формі (яка може бути, наприклад, розчином, суспензією або сумішшю твердої речовини і рідини), так і у формі твердої речовини. У певних варіантах здійснення ксиланвмісна біомаса піддана попередній обробці.

Після того як 55Е-реакція здійсниться, необов'язково до завершення, може відбуватись етап відновлення, при якому відновлюють продукт ферментації (наприклад, етанол, метанол, пропанол, пропан-1,3-диол або бутанол).

Зо Дійсне розкриття додатково забезпечує повне середовище для ферментації, що придатне для застосування в дійсних способах, наприклад, як описано вище і далі стосовно целюлазних, геміцелюлазних, В-ксилозидазних компонентів і компонентів ферментуючих мікроорганізмів.

Дійсне розкриття також забезпечує клітину Т. геезеї, що сконструйована таким чином, щоб нативний ген р-ксилозидази був інактивований або вилучений. Клітина Т. геезеі може бути сконструйована, щоб рекомбінантно експресувати фермент із сімейства СН43, наприклад, фермент, обраний з поліпептидів Ем430, РІ4ЗА, Ем4ЗЕ, Ем43В, АТАЗА, Ро43А, С7243А або ХупВ3.

Наприклад, поліпептид Ем430 має щонайменше 65 9565, щонайменше 70 9о, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 9565, щонайменше 92 96, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, по меншій мері 97 9565, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:2 або 21-350 залишкам ЗЕО ІЮО МО:2.

Поліпептид РІ4ЗА має щонайменше 65 95, щонайменше 70 9565, щонайменше 75 956, щонайменше 80956, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 9565, щонайменше 9796, щонайменше 9895, щонайменше 09995 або 10095 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:8 або 21-445 залишкам ЗЕО ІЮО МО:8.

Поліпептид Ем43Е має щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 956, щонайменше 80956, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 9565, щонайменше 9796, щонайменше 9895, щонайменше 99595 або 10095 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:10 або 19-530 залишкам 5ЕО ІЮ

МО:10. Поліпептид Ем43В має щонайменше 6595, щонайменше 7095, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 9565, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:12 або 17-574 залишкам 5ЕО ІЮ

МО:12. Поліпептид АїТ43ЗА має щонайменше 6595, щонайменше 7095, щонайменше 75 95, щонайменше 80 9о, щонайменше 85 956, щонайменше 90 956, щонайменше 91 96, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, 60 щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:14 або 15-558 залишкам 5ЕО ІЮ

МО:14. Поліпептид Бо43А має щонайменше 6595, щонайменше 7095, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 9565, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:24 або 21-348 залишкам 5ЕО ІЮ

МО:24. Поліпептид (3243А має щонайменше 6595, щонайменше 7095, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 9565, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:22 або 19-340 залишкам 5ЕО ІЮ

МО:22. Поліпептид ХупВЗ3 має щонайменше 6595, щонайменше 7095, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 9565, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 96 95, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ХЕО ІЮ МО:25.

Дійсне розкриття додатково забезпечує способи одержання целюлазних поліпептидів, що включають (а) культивування такої клітини Т. геезеї, що була описана вище і/або далі в даному документі, за умов, що дозволяють продукування одного або декількох целюлазних поліпептидів і (Б) відновлення целюлазних поліпептидів, наприклад, шляхом відновлення культуральної рідини, що містить целюлазні поліпептиди. Дійсне розкриття додатково забезпечує культуральну рідину, що одержана за допомогою клітини Т. геезеї, і її застосування в реакціях оцукрювання, що включають, наприклад, З5Е-реакції.

В певних аспектах дійсне розкриття забезпечує композицію повного середовища для ферментації, що містить щонайменше одну перетворювальну В-ксилозидазу, щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і середовище ферментації. Перетворювальною В- ксилозидазою є, наприклад, фермент сімейства СН43. Перетворювальна Д-ксилозидаза може, в певних аспектах, бути обрана з поліпептида Ем430, РІ4ЗА, Ем4ЗЕ, Ем4ЗВ, АТ4ЗА, Го4ЗА, с1243А

Зо або ХупВв3. Ферментуючим мікроорганізмом є, відповідно, організм, що здатний до ферментації придатного джерела вуглецю, такого як ксиланвмісна біомаса або цукрів, таких як глюкоза, ксилоза, арабіноза, маноза, галактоза або олігосахаридів, прямо або непрямо в необхідний продукт ферментації, що включає, наприклад, метанол ("Меон"), етанол (ЕЮН"), пропанол, пропан-1,3-диол або бутанол. Ферментуючі мікроорганізми можуть бути обрані з гриба, такого як, наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб, бактерії, такої як 7утотопаб5 торбійй або

Сіозігідіпт «пегтосеПйшт. Придатні джерела вуглецю або субстрати включають, наприклад, субстрати з ксиланвмісної біомаси, обрані, наприклад, з лігноцелюлозних субстратів або іншої сировини, що містить вуглеводи. Деякі з лігноцелюлозних субстратів можуть, наприклад, включати целюлозу, геміцелюлозу і/або лігнін.

Целюлазою є, наприклад, В-глюкозидазний, ендоглюканазний або целобіогідролазний пептид. Ферменти зазначають в даному документі або за їхніми назвами, або за сімействами ферментів, до яких вони належать (наприклад, фермент сімейства ЗН4З3 або фермент, класифікований у або за ЕС 3.2.1.91); при згадуванні за їхніми назвами вони можуть також бути еквівалентно зазначені як "Іназва| поліпептид (наприклад, В-глюкозидаза може також взаємозамінно бути зазначена В-глюкозидазний поліпептид). Целюлаза також може бути, наприклад, у формі препарату загальної целюлази. Геміцелюлаза є, наприклад, ксиланазою, Ір- ксилозидазою, І-с-арабінофуранозидазою або акцесорним білком. Препарат загальної целюлази може містити один або більше геміцелюлазних пептидів в певних варіантах здійснення.

Середовище для ферментації може бути результатом процесу часткового оцукрювання, або середовищем, що містить визначені кількості продуктів оцукрювання. Таку композицію можна відповідно застосовувати в реакції оцукрювання, що включає, наприклад, З5Е-реакцію, за умов, що дозволяють одержання продукту(-ів) ферментації, який становить інтерес.

В певних аспектах одна або більше целюлаз і/або одна або більше геміцелюлаз виробляються генетично сконструйованим мікроорганізмом, у якому гени, що кодують одну або більше (якщо присутні більше за одну нативну ВД-ксилозидазу) нативних ВД-ксилозидаз вилучені або не виявляється нативна ВДВ-ксилозидазна активність. В певних варіантах здійснення мікроорганізм, що сконструйований для продукування однієї або кількох целюлаз й/або однієї або кількох геміцелюлаз не містить зберігаючих В-ксилозидаз або не має явної зберігаючої вр- 60 ксилозидазної активності.

У деяких аспектах дійсне розкриття належить до поліпшеного способу проведення 55Б- реакції на ксиланвмісній біомасі для того, щоб одержати продукт ферментації -біоетанол, де спосіб містить культивування середовища для ферментації, що містить щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, де поліпшення включає застосування ферменту з перетворювальною ДВ-ксилозидазною активністю.

У споріднених аспектах дійсне розкриття також забезпечує способи поліпшення продукування алкіл-В-ксилопіранозидов, що, як відомо, є корисними і коштовними у ряді промислових застосувань, у ситуаціях, коли таке продукування є бажаним. Наприклад, алкіл-р- ксилопіранозид може відповідним чином застосовуватися як хімічна проміжна сполука в синтезі алкіл-глікозидів, що корисні в якості біорозкладних поверхнево-активних речовин і емульгаторів (див., наприклад, К. Зсптій 85 Н. Те5тапп, 2001, АїЇКу! Роїудіисозідев5, іп Оеіегдепсу ої Зресіайу зЗипПасіапів, Зипасіапі зсієпсе зегіев, мої. 98; (Г.Е. Нгієй ед.); Магсеї! ОеккКег Іпс., ММ, рр.1-70). Ці компоненти є індукторами самі по собі або їх можна застосовувати для одержання індукторів продукування ксиланази у ряді мікроорганізмів (див., наприклад, М. Магиї єї а!., 1985, Адгіс. Віої.

Спет. 49(12):3399-3407; Н. 5піпоуата еї аї!., 1988, Адгіс. Віої. Спет. 52(9): 2197-2202). Різні алкіл-піранозидази, до того ж, можна застосовувати як праймери для хондроітинсульфату і стимулятори біосинтезу протеогліканів (див., наприклад, Н. Зпіпоуата еї аї., 1988, Адгіс. Віо).

Спет. 52(9): 2197-2202). Включення або збільшену продукцію рВ-ксилозидаз зі зберігаючим механізмом дії у З5Е-реакціях можна застосовувати для збільшення виходу цих придатних алкіл-В-ксилопіранозидів в іншому аспекті даного винаходу.

Відповідно, у деяких варіантах здійснення спосіб розкриття містить у собі збільшення кількості зберігаючих В-ксилозидаз. У даному документі наведені також поліпшені способи проведення 55Е-реакцій, що спричиняють збільшення кількості зберігаючих В-ксилозидаз. У додатковому прикладі передбачається поліпшений спосіб проведення З5Е-реакцій, що спричиняє збільшення кількості зберігаючих ДВ-ксилозидаз, під час зниження кількості перетворювальних Д-ксилозидаз.

В інших аспектах дійсний винахід забезпечує 55Е-способи, що включають культивування повного середовища для ферментації, причому зазначене повне середовище для ферментації

Зо містить щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше один фермент із зберігаючою В-ксилозидазною активністю протягом періоду часу і при умовах, що підходять для формування алкіл-В-ксилопіранозиду, такого як, наприклад, метил-р- ксилопіранозид ("МХР"), етил-ВД-ксилопіранозид ("ЕХР"), пропіл-В-ксилопіранозид ("РХР") або бутил-ВД-ксилопіранозид ("ВХР").

В певних аспектах щонайменше один фермент зі зберігаючою В-ксилозидазною активністю може бути присутнім у зазначеному повному середовищі для ферментації в кількості, ефективній для збільшення утворення алкіл-В-ксилопіранозиду (АХР") з коротким ланцюгом (наприклад, метил-В-ксилопіранозиду ("МХР"), етил-В-ксилопіранозиду ("ЕХР"), пропіл-р- ксилопіранозиду ("РХР") або бутил-В-ксилопіранозиду ("ВХР")), у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації, у якому відсутні або присутні в меншій кількості зазначені ферменти зі зберігаючою р-ксилозидазною активністю. Наприклад, такий фермент(и) присутній у кількості, ефективній для збільшення величини утворення АХР щонайменше на 20 965, щонайменше на 30 95, щонайменше на 40 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70 95 або щонайменше на 80 95 у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації, у якому відсутні або присутні в меншій кількості зазначені один або більше ферментів зі зберігаючою рД-ксилозидазною активністю.

В певних аспектах ферментуючий мікроорганізм здатний до продукування ряду сполук алкіл-В-ксилопіранозиду (АХР") з коротким ланцюгом, включаючи, без обмеження, сполуки метил-В-ксилопіранозиду ("МХР"), етил-ВД-ксилопіранозиду (ЕХР"), пропіл-ВД-ксилопіранозиду (РХР") або бутил-В-ксилопіранозиду ("ВХР"М У деяких аспектах ферментуючим мікроорганізмом є бактерія, така як 7утотопа5 побіїїх, або гриб, такий як дріжджі або міцеліальний гриб.

В певних аспектах щонайменше однією зберігаючою рВ-ксилозидазою є фермент сімейства

СНЗ, НЗО, СНЗІ, ОНЗ9, ОН52, ОН5Я4 або СНІ116. В певних варіантах здійснення винаходу зберігаюча ВД-ксилозидаза обрана з поліпептидів ХіпО, Ем3З0А, Ем30ОВ, Ем39А, Ем398, ХупВ, ХУЇА або ХуП1. Зокрема, поліпептид ХіпО, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 85 9565, щонайменше 90 95, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 95 95, бо щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:40 або залишкам від 18 до 804 5ЕБЕО ІЮ МО:40. Поліпептид Ем3ЗОА, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 96, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 96, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 42 або залишкам від 20 до 537 5ЕО ІЮ МО: 42. Поліпептид Ем3ОВ, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 9565, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 97 95, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:44 або залишкам від 25 до 485 5ЕБО ІЮ МО:44.

Поліпептид Ем39А, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 8095, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 91 95, щонайменше 92 9о, щонайменше 93 96, щонайменше 94 956, щонайменше 95 965, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:46 або залишкам від до 439 5ЕО ІЮО МО:46. Поліпептид Ем39В, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 8095, щонайменше 8595, щонайменше 20 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 956, щонайменше 97 956, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ХЕО

ІЮО МО:48 або залишкам від 19 до 456 5ЕО ІЮО МО:48. Поліпептид ХупВ, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 95, щонайменше 94 95, щонайменше 95 95, щонайменше 96 95, щонайменше 97 96, щонайменше 98 965, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає БЕО ІЮ МО:50. ХУуїА, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 80 95, щонайменше 85 9565, щонайменше 90 95, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 95 95, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:52.

Поліпептид ХУ, якщо присутній у повному середовищі для ферментації, є поліпептидом, що має щонайменше 8095, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 91 95, щонайменше 92 9о, щонайменше 93 96, щонайменше 94 956, щонайменше 95 965, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:54 або залишкам від 22 до 500 5ЕО І МО:54.

В певних аспектах кількість зберегаючих р-ксилозидазних поліпептидів у зазначеному повному середовищі складає щонайменше приблизно 0,2 мг, щонайменше приблизно 0,5 мг, щонайменше приблизно 0,7 мг, щонайменше приблизно 1 мг, щонайменше приблизно 2 мг або щонайменше приблизно 5 мг на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі, що також є компонентом повного середовища для ферментації. В інших аспектах кількість перетворювальних В-ксилозидазних поліпептидів складає приблизно 10 мг або менше, приблизно 5 мг або менше, приблизно 2 мг або менше, приблизно 1 мг або менше, приблизно 0,7 мг або менше, приблизно 0,5 мг або менше або приблизно 0,2 мг або менше на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі. В певних аспектах кількість зберігаючих рД- ксилозидазних поліпептидів у зазначеному повному середовищі знаходиться в діапазоні, наприклад, (а) від 0,2 мг до 10 мг, (Б) від 0,2 мг до 5 мг, (с) від 0,5 мг до 5 мг, (а) від 1 мг до 10 мг, (є) від 2 мг до 10 мг, (Ї) від 0,2 до 5 мг, (9) від 0,2 мг до 2 мг або (Г) від 0,5 мг до 10 мг на грам ксилану в зазначеній ксиланвмісній біомасі, або кількість у межах діапазону, кожна з верхніх і нижніх меж якого є незалежно обраними з вищенаведених значень.

В певних аспектах кількість зберігаючого В-ксилозидазного поліпептиду(ів) у зазначеному повному середовищі для ферментації перевищує кількість перетворювального /В- ксилозидазного поліпептиду(поліпептидів) у розрахунку на моль, у розрахунку на молекулярну вагу або в розрахунку і на моль, і на молекулярну вагу. У конкретних варіантах здійснення співвідношення зберігаючих ДВ-ксилозидазних поліпептидів до перетворювальних В- ксилозидазних поліпептидів складає щонайменше 2:11, щонайменше 3:1, щонайменше 4-1, щонайменше 5:1, щонайменше 10:1 або щонайменше 50:1 у розрахунку на моль, у розрахунку бо на молекулярну вагу або в розрахунку і на моль, і на молекулярну вагу. У конкретних варіантах здійснення ферменти з перетворювальною ДВ-ксилозидазною активністю відсутні або не виявляються в повному середовищі для ферментації. В певних варіантах здійснення перетворювальна р-ксилозидазна активність, яку можна визначити, у повному середовищі для ферментації відсутня.

Відповідно до описаного в даному документі способа, культивування повного середовища для ферментації проводять при безперервних, періодичних умовах, умовах з підживленням.

Наприклад, культивування повного середовища для ферментації даного винаходу є безперервною 55РЕ-реакцією, періодичною або 55Е-реакцією 55Е-реакцією з підживленням.

Способи даного розкриття в певних аспектах додатково охоплюють утворення повного середовища для ферментації перед етапом культивування. Наприклад, повне середовище для ферментації може бути утворене комбінуванням (а) щонайменше одних ферментуючих мікроорганізмів, (Б) щонайменше однієї ксиланвмісної біомаси, (с) щонайменше однієї целюлази, (4) щонайменше однієї геміцелюлази, (є) щонайменше однієї зберігаючої р- ксилозидази і () середовища без одного або більше компонентів (а)-(е). У конкретних варіантах здійснення щонайменше одна целюлаза може бути присутня у формі целюлазного препарату.

Наприклад, целюлазний препарат може бути препаратом загальної целюлази, що може також необов'язково включати щонайменше одну геміцелюлазу. У конкретних варіантах здійснення целюлазний препарат є культуральною рідиною культури міцеліального гриба, наприклад, культури Т. геезеїі, отриманої з використанням клітини Т. геезеі. У певному аспекті клітина Т. геехзеі була сконструйована так, щоб або нативний ген зберігаючої ДВ-ксилозидази надекспресувався, або щоб чужорідний ген зберігаючої В-ксилозидази був введений і експресувався. Необхідно відзначити, що "клітина Т. геезеї (яка| була сконструйована так, щоб або нативний ген зберігаючої В-ксилозидази надекспресувався, або щоб чужорідний ген зберігаючої В-ксилозидази був введений і експресувався" включає не лише вихідну або батьківську клітину, у якій уперше відбулася інактивація, але також потомство цієї клітини.

В певних аспектах способи даного розкриття стосуються культивування ферментативного бульйону, що містить щонайменше одну біомасу, яка містить ксилан. В певних аспектах ксиланвмісною біомасою є, наприклад, кукурудзяна солома, багаса, сорго, арундо очеретяний, пенісетум червоний, міскантус, криптомелія японська, солома пшениці, просо, деревна маса листяної деревини або деревна маса хвойної деревини. Наприклад, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином у З5Е-реакцію у формі суспензії. Наприклад, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином у 55Е-реакцію у формі твердої речовини.

Відповідно, ксиланвмісна біомаса може бути додана відповідним чином у 55Е-реакцію як у рідкій формі (якою може бути, наприклад, розчин, суспензія або суміш сухих речовин і рідини), так і у формі твердих речовин. В певних варіантах здійснення винаходу ксиланвмісна біомаса піддана попередній обробці.

Після того як пройде 55Е-реакція, необов'язково до завершення, може відбуватися етап виділення, при якому виділяють АХР-продукт (наприклад, МХР, ЕХР, РХР або ВХР).

Дане розкриття додатково забезпечує повне середовище для ферментації, що підходить для застосування в даних способах, наприклад, як описано вище і далі стосовно целюлазних, геміцелюлазних, В-ксилозидазних компонентів і компонентів ферментуючих мікроорганізмів.

Дане розкриття також забезпечує клітину Т. геезеії, що була сконструйована таким чином, щоб у ній надекспресувався нативний ген зберігаючої р-ксилозидази, або щоб у ній експресувався чужорідний ген зберігаючої В-ксилозидази. Клітина Т. геезеії може бути сконструйована для того, щоб рекомбінантно експресувати фермент із сімейства СНЗ, СНЗО,

СНЗІ, ОНЗО, БН5Ь2, ОН5Я4 або СНІ116, наприклад, фермент, обраний з поліпептидів ХіпО,

Ем3О0А, Гм30В, Ем39А, Ем39В, ХупВ, ХуїА або Ху1. Наприклад, поліпептид ХіпО має, щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 9565, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 95, щонайменше 94 96, щонайменше 95 956, щонайменше 96 956, щонайменше 97 96, щонайменше 98 965, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:40 або залишкам від 18 до 804 5ЕО ІЮ МО:40. Поліпептид ЕмЗ0А має щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 9565, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 95, щонайменше 94 96, щонайменше 95 96, щонайменше 96 956, щонайменше 97 96, щонайменше 98 965, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:42 або залишкам від 20 до 537 5ЕО ІЮ МО:42. Поліпептид Ем30В має щонайменше 65 95, щонайменше 70906, щонайменше 7595, щонайменше 80 9565, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 95, бо щонайменше 94 96, щонайменше 95 956, щонайменше 96 956, щонайменше 97 96, щонайменше

98 965, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮО МО':44 або залишкам від 25 до 485 5ЕО ІЮ МО:44. Поліпептид Ем39А має щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 9565, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 95, щонайменше 94 96, щонайменше 95 956, щонайменше 96 956, щонайменше 97 96, щонайменше 98 965, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:46 або залишкам від 20 до 439 5ЕО ІО МО:46. Поліпептид Ем39В має, щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 9565, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 95, щонайменше 94 96, щонайменше 95 956, щонайменше 96 956, щонайменше 97 9065, щонайменше 98 965, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:48 або залишкам від 19 до 456 5ЕО ІО МО:48. Поліпептид ХупВ має щонайменше 65 95, щонайменше 70 95, щонайменше 75 95, щонайменше 80 95, щонайменше 8595, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 93 95, щонайменше 94 96, щонайменше 95 956, щонайменше 96 956, щонайменше 97 96, щонайменше 98 965, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО:50. Поліпептид ХуїЇА має щонайменше 65 9565, щонайменше 70 95, щонайменше 7595, щонайменше 80 95, щонайменше 85 95, щонайменше 90 9565, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 95 95, щонайменше 9695, щонайменше 9795, щонайменше 9895, щонайменше 9995 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮО МО:52 або залишкам від 19 до 705 5ЕО ІО МО:52. Поліпептид Ху!ї має щонайменше 65 9565, щонайменше 7095, щонайменше 7595, щонайменше 8095, щонайменше 8595, щонайменше 90 95, щонайменше 91 95, щонайменше 92 95, щонайменше 93 95, щонайменше 94 9565, щонайменше 95 965, щонайменше 96 95, щонайменше 97 956, щонайменше 98 95, щонайменше 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ЕО ІЮ МО:54 або залишкам від 22 до 500 5ЕО ІЮ МО:54.

Дане розкриття додатково забезпечує способи одержання целюлазних поліпептидів, що включають (а) культивування такої клітини Т. геезеї, наприклад, як було описано раніше і/чи далі в даному документі, при умовах, що уможливлюють продукування одного або більше целюлазних поліпептидів і (Б) виділення целюлазних поліпептидів, наприклад, шляхом виділення культуральної рідини, що містить целюлазні поліпептиди. Дане розкриття додатково забезпечує культуральну рідину, одержану за допомогою клітини Т. геевзеї і її застосування в реакціях оцукрювання, включаючи, наприклад, З5Е-реакції.

В певних аспектах дане розкриття забезпечує композицію повного середовища для ферментації, що містить щонайменше одну перетворювальну В-ксилозидазу, щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і середовище для ферментації. Зберігаюча р- ксилозидаза є, наприклад, або нативною зберігаючою В-ксилозидазою, що надекспресується, або чужорідною ДВ-ксилозидазою, яку вводять у відповідну клітину-хазяїна. Зберігаюча |Д- ксилозидаза є, наприклад, ферментом сімейства СНІ, ЗНЗО, НЗ1, НЗ9, ОН52, СН5БА або СОН 116. Зберігаюча р-ксилозидаза може, в певних аспектах, бути обрана з поліпетидів ХіпО, ЕмЗОА,

Ем30В, Ем39А, Ем398, ХупВв, ХУуУЇА або Ху1. Ферментуючий мікроорганізм є відповідно здатним до ферментації придатного джерела вуглецю, такого як ксиланвмісна біомаса або цукри, такі як глюкоза, ксилоза, арабіноза, маноза, галактоза або олігосахарид прямо або побічно в необхідний продукт ферментації, що включає, наприклад, метанол, етанол, пропанол, пропан- 1,3-діол або бутанол. Ферментуючим мікроорганізмом може бути гриб, такий як, наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб, або бактерія, така як 7утотопаб5 торій або Сіовігідійт

Шептосеїшт. Придатні джерела вуглецю або субстрати можуть бути, наприклад, субстратами на основі ксиланвмісної біомаси, вибраними, наприклад, з лігноцелюлозних субстратів або іншої сировини, утримуючої вуглеводи. Деякі з лігноцелюлозних субстратів можуть, наприклад, включати целюлозу, геміцелюлозу і/чи лігнін.

Целюлазою є, наприклад, ДВ-глюкозидаза, ендоглюканаза або целобіогідролазний поліпептид. Целюлаза також може бути, наприклад, у формі препарату загальної целюлази.

Геміцелюлазою, наприклад, є ксиланаза, рДВ-глюкозидаза, І1-а-арабінофуранозидаза або акцесорний білок. В певних варіантах здійснення препарат загальної целюлази може містити один або більше геміцелюлазних поліпептидів.

Середовище для ферментації може бути результатом процесу часткового оцукрювання або середовищем, що містить визначену кількість продуктів оцукрювання. Таку композицію можна, бо відповідно, застосовувати в реакції оцукрювання, включаючи, наприклад, З55Е-реакцію, при умовах, що уможливлюють одержання сполук АХР, включаючи, наприклад, МХР, ЕХР, РХР або

ВХР.

В певних аспектах одна або більше целюлаз і/або одна або більше геміцелюлаз продукуються генетично сконструйованим мікроорганізмом, де ген, що кодує одну або більше (якщо присутні більше ніж одна нативна ДВ-ксилозидаза) нативних Д-ксилозидаз, надекспресований, або ген, що кодує чужорідну ВД-ксилозидазу, введений і/або експресований.

В певних варіантах винаходу, мікроорганізм, сконструйований для продукування однієї або більше целюлаз і/або однієї або більше геміцелюлаз, має підвищений прояв зберігаючої р- ксилозидазної активності в порівнянні з контрольним мікроорганізмом, що не піддавався такому ж генетичному конструюванню. В певних варіантах здійснення мікроорганізм, сконструйований для продукування однієї або декількох целюлаз і/або однієї або декількох геміцелюлаз, не містить перетворювальну В-ксилозидазу або не має перетворювальної рДВ-ксилозидазної активності, яку можна визначити.

В певних зв'язаних аспектах дане розкриття відноситься до поліпшеного способу проведення 55Е-реакції на ксиланвмісній біомасі, для того, щоб одержати АХР-продукт, де спосіб включає культивування середовища для ферментації, що містить щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, де поліпшення включає застосування целюлазного препарату, отриманого з клітини Т. геезеї, яка була сконструйована для надекспресії нативного гена В-ксилозидази або для експресії чужорідної ВД-ксилозидази. У деяких варіантах здійснення нативний ген р-ксилозидази, що надекспресується, або чужорідний ген В-ксилозидази, що експресується, є геном, що кодує зберігаючу В-ксилозидазу.

Усі публікації, патенти, патентні заявки, послідовності із бЗепВапк і депозити АТСС, що цитуються в даному документі, даним явно включені за допомогою посилань для всіх цілей. 5. КОРОТКИЙ ЗМІСТ ФІГУР І ТАБЛИЦЬ

Таблиця 1: Утворення ЕХР з рекомбінантної 7утотопах торії при 55Е-умовах зі стрижня кукурудзяного початка і глюкози/ксилози.

Таблиця 2: Утворення ЕХР за допомогою різних типів субстратів біомаси.

Таблиця 3: Динаміки утворення ЕХР і/чи ксилози (виражені як КІ область, пропорційно мг/гл)

Зо із ксилобіози (20 мг/глу у 50 ммоль цитрату натрію, рН 4,7 плюс 0,9 М ЕН при 46С у присутності ксиланази Мийітеске ("МЕ, " 560 мкг/мл) і очищеного Ем430 (36 мкг/мл) або ЕмЗА (54 мкг/мл).

Таблиця 4: Праймерні послідовності для побудови делеційної касети рхі1.

Таблиця 5: Праймерні послідовності для побудови експресійної касети В-ксилозидази Ем430

Е. Мепісйіоідев.

Таблиця 6: приводить зведення ідентифікаторів послідовностей для визначених ферментів, застосовуваних у 55Е-реакціях.

Фігура 1: ВЕРХ-хроматограми зразків, узятих після 48 годин інкубації при 462С, ксилози (10 мг/гл) у 50 мМ цитраті натрію, рН 4,6, ксиланазі Мийітескю (1,35 мг/гл) і без спирту, з етанолом

СЕН"), метанолом ("Меон") або п-пропанолом ("п-РГОН"), кожного в кількості 0,72 М. ВЕРХ- умови: колонка НРХ-87Н при 602С, 0,60 мл/хв 0,01 М Небо», ВІ індикатор.

Фігура 2: Динаміки після появи/формування алкіл-ксилопіранозидів ("АХР") за тих самих умов, що описано в експериментах Фігури 1. Кількості утворених продуктів ферментації виражені як співвідношення зон максимуму продукту в порівнянні з такими ж максимумами ксилоЗзи.

Фігура 3: ЯМР-спектр, що вказує на присутність етил-В-ксилопіранозиду.

Фігура 4: Утворення ЕХР дріжджами і 2утотопавз тобіїї5 дикого типу при 55Е-умовах.

Фігура 5: Утворення ЕХР при 55БЕ-умовах із дріжджами з або без додавання ВХІі! Т. геезеї.

Фігура 6: Дозова залежність ЕХР після додавання Вхі! Т. геезеі до ферментного комплексу, отриманого зі штаму Ме229 Т. геезеї з вбудованим геном при 55Е-умовах з рекомбінантними 2утотопав.

Фігура 7: Утворення ЕХР під час 55Е-реакції за допомогою наступних ферментних конфігурацій/сумішей для оцукрювання: АссеПегазетм 1500 ("А1500")нксиланаза Мийтескв,

АссеїПегазе м 1500 ("А1500") «ХІпА і ферментний комплекс, отриманий зі штаму Ме229 Т. геезеї з вбудованим геном, з додаванням геміцелюлази (РУЗА, Ем51А або ВХІі!1).

Фігура 8: Утворення ЕХР під час 55Е-реакції при використанні різних очищених целюлазних ферментів і ХупВ3 для оцукрювання.

Фігура 9: Утворення ЕХР під час 55Е-реакції при використанні ферментного комплексу, отриманого зі штаму Мо229 Т. геезеії з вбудованим геном, у присутності Вхі! Т. геезеї або в бо присутності деяких інших В-ксилозидазних ферментів із сімейства сНа43.

Фігура 10: Знижене утворення ЕХР, що спостерігається в результаті додавання Ем430, при

ЗОЗЕ-умовах з рекомбінантними 2утотопав.

Фігура 11: Знижене утворення ЕХР, що спостерігається в результаті додавання Ем430, при

ЗОЗЕ-умовах з рекомбінантними дріжджами.

Фігура 12: Знижене утворення ЕХР, що спостерігається в результаті додавання Ем430О до

АссеПегазетм 1500-ксиланаза МиШйтесікя, до АссеПегазе"м 1500-ХІпА і до ферментного комплексу, отриманого зі штаму Мо229 Т. геезеі з вбудованим геном, при 55Е-умовах з рекомбінантними 7утотопав.

Фігура 13: Знижене утворення ЕХР, що спостерігається в результаті додавання Ем430О0 до очищених целюлазних ферментів і ХупВ3.

Фігури 14А-148Ф: Фігура 14А демонструє дозову залежність зниження ЕХР у результаті додавання Ем43О0 до ферментної композиції або суміші, отриманої зі штаму Ме229 Т. геезеї з вбудованим геном, при 55Е-умовах з рекомбінантними 2утотопа5. Фігура 148 показує зменшення ЕХР у результаті додавання Бо43А або с743А до ферментного комплексу, отриманого зі штаму Ме229 Т. геезеі з вбудованим геном, ї- Вхі! Т. геезеі при 55Е-умовах з рекомбінантними 7утотопав.

Фігура 15: Динаміка утворення ксилози і ЕХР (виражена як КІ зона, що є пропорційною мг/гл) із ксилобіози (20 мг/гл) у 50 мМ цитраті натрію, рН 4,7 плюс 0,9 М етанол при 462С у присутності ксиланази Мийтеске (560 мкг/мол) і очищеного Ем430 (36 мкг/мл) і ЕмЗА (54 мкг/мл).

Фігура 16: Динаміка утворення ксилози і ЕХР із ксилобіози (20 мг/гл, ліворуч) або з ксилозних олігомерів (20 мг/гл, праворуч) у 50 мМ цитраті натрію, рН 4,7, плюс 0,9 М етанолу при 462С у присутності ксиланази Мийіескю (560 мкг/мл), Ем43О0 (36 мкг/мл) або ЕмЗА (54 мкг/мл).

Результати виражені як співвідношення кількості ЕХР до кількості утвореної ксилози.

Фігура 17: Карта плазміди рСК-Вішпі ПІ-ТОРО, делеції рхі!1, прі-іох.

Фігура 18: Карта плазміди ТОРО Віпип/Реді!1-м430.

Фігури 19А-19В: Фігура 19А: нуклеотидна послідовність Ем430 (5ЕО ІЮО МО:1). Фігура 198: амінокислотна послідовність Ема3О (5БО І МО:2). 5ЕБЕО ІЮО МО:2 є послідовністю незрілого

Ем430. Рм430 має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 20

ЗЕО ІЮ МО:2 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий

Ко) білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 21 до 350 5ЕО ІО МО:2. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаР (доступний на: пЕр:/лммли.сЬв.атш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, 5МАКТ або МСВІ.

Фігури 20А-20В: Фігура 20А: нуклеотидна послідовність Вхії (ЗЕО ІЮ МО:3) Т. геезеї. Фігура 208: амінокислотна послідовність Вхії (ЗЕО ІО МО:4) Т. геезеїз. Сигнальна послідовність підкреслена. Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом.

Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, ЗМАКТ або МСВІ.

Фігури 21А-21В: Фігура 21А: нуклеотидна послідовність ЕмЗА (5ЕО ІЮ МО:5). Фігура 218: амінокислотна послідовність ЕмЗА (5ЕО ІЮ МО:6). 5ЕО ІЮ МО:6 є послідовністю незрілого ЕмУЗА.

ЕмЗА має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 23 5ЕО ІЮ

МО:6 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 24 до 766 5ЕО ІЮ МО:6. Прогнозування сигнальної послідовності провели за допомогою алгоритму Бідпа!Р (доступний на: пЕр:/лммли.сЬв.атш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, 5МАКТ або МСВІ.

Фігури 22А-22В: Фігура 22А: нуклеотидна послідовність РІАЗА (5ЕО ІЮ МО:7). Фігура 228: амінокислотна послідовність РІ4ЇЗА (5ЕО ІО МО:8). 5ЕБО ІО МО:8 є послідовністю незрілого

РІ4ЗА. РІ4ЗА має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 20

ЗЕО ІЮ МО:8 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий

БО білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 21 до 455 5ЕО ІЮ МО:8. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаР (доступний на:

ПЕр:/лммли.сЬв.атш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом, прогнозовані залишки вуглеводних зв'язуючих модулів ("СВМ") виділені заголовними літерами і прогнозований лінкер, що розділяє СО і СВМ, виділений курсивом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, 5МАКТ або МСВІ.

Фігури 23А-23В: Фігура 23А: нуклеотидна послідовність Ем43Е (5ЕО ІЮ МО:9). Фігура 238: амінокислотна послідовність ЕмАаЗЕ (ЗЕ ІЮО МО:10). 5ЕО ІЮ МО:10 є послідовністю незрілого

Ем4З3Е. Ем43Е має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 18

ЗБО ІЮ МО:10 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає 60 зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 530 5ЕО ІЮ МО:10.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: РЕер:/Лимли.срі.аш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, 5МАКТ або МСВІ.

Фігури 24А-24В: Фігура 24А: нуклеотидна послідовність Ем43В (5ЕО ІЮО МО:11). Фігура 248: амінокислотна послідовність ЕмаЗВ (ЗЕО ІЮ МО:12). БЕО ІЮ МО:12 є послідовністю незрілого

Ем43В. Ем43В має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 16

ЗБО ІЮ МО:12 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 17 до 574 5ЕО ІЮ МО:12.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: пЕер:/Лумли.сЬз.аш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, ЗМАКТ або МСУВІ.

Фігури 25А-25В: Фігура 25А: нуклеотидна послідовність АТ4ЗА (5ЕО ІЮ МО:13). Фігура 258: амінокислотна послідовність АТ43ЗА (5ЕО ІЮ МО:14). 5ЕО ІО МО:14 є послідовністю незрілого

АТЗА. АТ43ЗА не має прогнозованої сигнальної послідовності, що може бути отримана за допомогою алгоритму зЗідпа!Р (доступний на: ПЕр:/Лумлиу.срз.ацш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, 5МАЕКТ або МСВІ.

Фігури 26А-26В: Фігура 26А: нуклеотидна послідовність Ем51А (5ЕО ІЮО МО:15). Фігура 268: амінокислотна послідовність Ем5ТА (ЗЕ ІЮО МО:16). 5ЕО ІЮ МО:16 є послідовністю незрілого

Ем51А. ЕмО1А має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 19

ЗБЕО ІЮ МО:16 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 20 до 660 5ЕО ІЮ МО:16.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму 5ідпаІР (доступний на: пЕр/ймимлми. ср. аш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену - І1-а- арабінфуранозидази виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, 5МАЕКТ або МСВІ.

Фігури 27А-27В: Фігура 27А: нуклеотидна послідовність Хуп3З Т. геезеї (ЗЕО ІОЮО МО:17). Фігура 27В: амінокислотна послідовність ХупЗ Т. геезеї (ЗЕО ІЮ МО:18). БЕО ІО МО:18 є послідовністю незрілого ХупЗ Т. геезеії Хуп3З3 Т. геезеі має прогнозовану сигнальну послідовність, що

Ко) відповідає залишкам від 1 до 16 5ЕО ІЮ МО:18 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 17 до 347 5ЕО ІЮ МО:18. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму ЗідпаІР (доступний на: перли. ср5.а(ш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних

Ріат, БМАКТ або МСВІ.

Фігури 28А-28В: Фігура 28А: нуклеотидна послідовність ХіпА (ЗЕО ІЮ МО:19). Фігура 288: амінокислотна послідовність ХіпА (ЗЕО ІЮ МО:20). 5ЕБЕО ІО МО:20 є послідовністю незрілого білка ХіІпА. ХІпА має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 27

ЗБО ІЮ МО:20 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 28 до 211 5ЕО ІЮО МО:20.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: пер:/Аммли.срз.агш.ак). 5ЕО ІЮ МО:19 є геномною послідовністю ХіІпА; залишки ініціюючого і термінуючого кодонів виділені жирним шрифтом на Фігурі 284, і інтрон А гена ХіІпА підкреслений на Фігурі 28А.

Фігура 29: Фігура 29 демонструє конфігурації "а-" ії "8-- аномерів глюкози. Аномери визначають як "а" або "В" на основі взаємозв'язку між стереохімією екзоциклічного атома кисню при аномерному вуглецю і кисню, приєднаних до конфігураційного атома (визначаючи цукор як р або І), що часто є найбільш далеким хіральним центром у кільці. с-аномер є тим, у якому ці два положення мають однакову конфігурацію; вони є протилежними в р-аномері. Таким чином, структура а-Ю-глюкози має однакову стереохімію й у С1, і в С5, тоді як В-Ю-глюкоза має протилежну стереохімію в С1 у порівнянні з С5.

Фігури ЗОА-30В: Фігура ЗО0А: нуклеотидна послідовність (з7243А (ЗЕО ІЮ МО:21). Фігура ЗОВ: амінокислотна послідовність (5243А (5ЕБО ІЮ МО:22). БЕО ІЮО МО:22 є послідовністю незрілого

С2743А. (3743А має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 18

ЗБО ІЮ МО:22 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 340 5ЕО ІЮ МО:22.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: РЕер:/Лимли.срі.аш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, 5МАКТ або МСВІ. 60 Фігури З1ТА-31В: Фігура З1А: нуклеотидна послідовність Го43А (5ЕО ІЮ МО:23). Фігура 318:

амінокислотна послідовність Го43А (5ЕО ІЮ МО:24). 5ЕО ІЮО МО:24 є послідовністю незрілого

Ео43А. Ро43А має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 20

ЗБО ІЮ МО:24 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 21 до 348 5ЕО ІЮ МО:24.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: РЕер:/Лимли.срз.аш.ак). Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Прогнозування доменів були проведені по базах даних Ріат, 5МАКТ або МСВІ.

Фігури від 32-1 до 32-2: Вирівнювання гідролаз сімейства сН4і3. Амінокислотні залишки, що є висококонсервативними серед членів сімейства, виділені жирним і підкреслені.

Фігура 33: амінокислотна послідовність ХупВЗ (ЗЕО ІЮ МО:25).

Фігура 34: амінокислотна послідовність Ва (5ЕБО ІО МО:45) Т. геезеї. Сигнальна послідовність підкреслена. Прогнозовані залишки консервативного домену виділені жирним шрифтом. Послідовність, що кодує, описана в Вагпеїй еї аї., 1991, Віо- Гесппоіоду 9(6):562-567.

Фігури З5А-35В: Фігура З35А: нуклеотидна послідовність ХіпО (5ЕО ІЮ МО:39). Фігура 358: амінокислотна послідовність ХіпО (5ЕБЕО ІЮ МО:40). 5ЕО ІЮ МО:40 є послідовністю незрілого

ХіІпО. ХіІпО має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 17 5ЕО

ІЮО МО:40 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 18 до 804 5ЕБО ІЮО МО:40.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: пер:/Лумлми.сЬз.аш.ак.

Фігури ЗбА-36В: Фігура З6А: нуклеотидна послідовність Ем30А (5ЕО ІЮО МО:41). Фігура 36В: амінокислотна послідовність ЕмЗ30А (ЗЕ ІЮ МО:42). БЕО ІЮО МО:42 є послідовністю незрілого

ЕмЗОА. ЕГмЗ0А має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 19

ЗБЕО ІЮ МО:42 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 20 до 537 5ЕО ІЮ МО:42.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: пЕр:/лмилмилми.ср5.аш.ак).

Фігури 37А-37В: Фігура 37А: нуклеотидна послідовність Ем3ОВ (5ЕО ІЮО МО:43). Фігура 37В: амінокислотна послідовність ЕМ3ОВ (5ЕО ІЮ МО:44). 5ЕО ІЮ МО:44 є послідовністю незрілого

Ем30В. Ем30В має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 24

ЗБО ІЮ МО:44 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 25 до 485 5ЕО ІЮ МО:44.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: пЕр:/лмилмилми.ср5.аш.ак).

Фігури З8А-38В: Фігура 38А: нуклеотидна послідовність Ем39А (5ЕО ІЮ МО:45). Фігура 388: амінокислотна послідовність Ем39А (ЗЕ ІЮО МО:46). 5ЕО ІЮ МО:46 є послідовністю незрілого

Ем39А. ЕГм39А має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 19

ЗБЕО Ір МО:46 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 20 до 439 5ЕО ІЮ МО:46.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: пер:/Лумлми.сЬз.аш.ак).

Фігури З9А-39В: Фігура 39А: нуклеотидна послідовність Ем39В (5ЕО ІЮО МО:47). Фігура 398: амінокислотна послідовність Ем39В (ЗЕ ІЮО МО:48). 5ЕО ІЮ МО:48 є послідовністю незрілого

Ем398В. Ем39В має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 18

ЗБЕО ІЮ МО:48 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 456 5ЕО ІЮ МО:48.

Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму 5ідпаІР (доступний на: пЕр:/лмилмилми.ср5.аш.ак).

Фігури 40А-40В: Фігура 40А: нуклеотидна послідовність ХупВ (ЗЕО ІЮ МО:49). Фігура 408: амінокислотна послідовність ХупВ (5ЕО ІЮ МО:50). ХупВ не має прогнозованої сигнальної послідовності, що може бути отримана за допомогою алгоритму 5бідпаі!Р (доступний на: пЕру/Ллимли. сові. ш.ак).

Фігури 41А-41В: Фігура 41А: нуклеотидна послідовність ХуїЇА (ЗЕО ІЮО МО:51). Фігура 418: амінокислотна послідовність ХуїА (5ЕО ІЮ МО:52). ХуїА не має прогнозованої сигнальної послідовності, що може бути отримана за допомогою алгоритму ЗідпаіР (доступний на: пЕрулммли.сЬз.аш.ак), але має сигнальну послідовність, прогнозовану за допомогою алгоритму

Опіргої (доступний на: пеЕр:/Лимлм.ипіргої.огд/ипіргої)), що відповідає залишкам від 1 до 18 5ЕО І

МО:52 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 705 5ЕО ІЮ МО:52. 60 Фігури 42А-42В: Фігура 42А: нуклеотидна послідовність Хуїї (ЗЕО ІЮ МО:53). Фігура 428В:

амінокислотна послідовність Ху! (ЗЕО ІЮ МО:54). БЕО ІЮ МО:54 є послідовністю незрілого ХУЇ1.

ХуМП має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 21 послідовності 5ЕО ОО МО:54 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 22 до 500

ЗБЕО ІЮО МО:54. Прогнозування сигнальної послідовності проводили за допомогою алгоритму зідпаІР (доступний на: пЕр://млим.сЬ5.аш.ак).

Фігури 43А-43В: Фігура 43А: Концентрації ЕХР і етанолу, вимірювані на день 1 у результаті

ЗОЕ-реакції з використанням штаму рхі1- Мо229 Т. геезеї, де в 55Е-реакцію було додано 0,5 або 1,5 мг/г ксилану, очищеного ВХІі! Т. геезеї, або де було додано 1 мг/г ксилану, очищеного Ем430;

Фігура 43В: концентрації ЕХР і етанолу, вимірювані на день З у результаті 55Е-реакції з використанням рхі!- Ме229 Т. геезеї, де в З5Е-реакцію було додано 0,5 або 1,0 мг/г ксилану, очищеного ВХІі! Т. геезеї, або де був доданий 1 мг/г ксилану, очищеного Ем430. Умови 55Б- реакції(реакцій) описані нижче в Прикладі 6. 6. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Значення абревіатур, використовуваних у даному документі, перераховані нижче: "хв." означає хвилина і хвилини; "год." означає годину і години, "дн." означає день(дні), "мкл" означає мікролітр(и), "мл" означає мілілітр(и), "л" означає літр(и), "нм" означає нанометр(и), "мм" означає міліметр(и), "см " означає сантиметр(и), "мкм" означає мікрометр(и), "мМ" означає мілімолярний(мілімолярні), "М" означає молярний(молярні), "ммоль" означає мілімольіі), "мкмоль" означає мікромоль(ії), "г" означає грам(и), "мкг" означає мікрограм(и), "мг" означає міліграм(и), "кг" означає кілограм(и), "об/хв" означає оборотів у хвилину, "об'єм. 90" означає об'ємний 95, "вага. У" означає ваговий об, і "об/с" означає оборотів у секунду. 6.1. Загальні визначення

Крім випадків, згаданих особливо, усі патенти і патентні заявки США, наведені в даному документі, включені за допомогою посилання в їхньому повному обсязі. Більш того, якщо кількість, концентрація, або інша величина, або параметр дані у вигляді діапазону, переважного діапазону або переліку верхніх переважних значень або нижніх переважних значень, це варто розуміти як конкретні розкриття усіх діапазонів або значень протягом безперервного відрізка, утвореного в цих діапазонах. При перерахуванні в даному документі діапазону числових

Зо значень, якщо не зазначене інше, мається на увазі діапазон, що включає крайні значення цього діапазону і всі цілі числа і частини в межах діапазону. Не мається на увазі, що обсяг даного винаходу обмежений конкретними значеннями, зазначеними при визначенні діапазону.

Як використовується в даному документі однина і множина елемента або компонента даного винаходу маються на увазі як необмежуючі у відношенні числа прикладів (наприклад, випадків) елемента або компонента. У такий спосіб однину варто читати як: включає одне або щонайменше одне, і форма однини елемента і компонента також включає множину, за винятком випадків, де число явно повинно означати єдине.

Як використовується в даному документі вираз "що включає" означає наявність заданих ознак, цілих чисел, етапів або компонентів, що зазначені у формулі винаходу, але це не виключає присутності або додавання одного або декількох інших ознак, цілих чисел, етапів, компонентів або їхніх груп. Вираз "що включає", як мається на увазі, включає варіанти здійснення, охоплювані виразом "що містить головним чином" і "складається 3". Аналогічно, мається на увазі, що вираз "що містить головним чином" включає варіанти здійснення, охоплювані виразом "складається 3".

Як використовується в даному документі вираз "приблизно", що модифікує кількість інгредієнта або реагенту або величину параметра даного винаходу, відноситься до варіювання числової величини, що може зустрічатися, наприклад, серед типових вимірювальних процедур і процедур, зв'язаних з переміщенням рідини, використовуваної для виготовлення концентратів або розчинів у реальних умовах роботи, внаслідок неминучих помилок у цих процедурах, внаслідок розходжень при виготовленні, джерела або чистоти інгредієнтів, використовуваних для створення композицій або виконання способів; і т. ін. Вираз "приблизно" також охоплює кількості, що розрізняються внаслідок різних рівноважних умов для композиції, отриманої з конкретної початкової суміші. Незалежно від модифікації виразу "приблизно", формула винаходу включає еквіваленти кількостям, на які вони вказують.

Вираз "одночасні оцукрювання і ферментація" або "З5Е" відносяться до схеми або процесу реакції, при якій оцукрюють біомасу й отримані в результаті оцукрювання цукри, що підлягають ферментації, використовують за допомогою ферментів і/чи ферментуючих мікроорганізмів для одержання продукту усі за один раз, як правило в тій же реакційній посудині.

Вираз "гібридне оцукрювання і ферментація" або "Н5Е" відноситься до схеми або процесу 60 реакції, при якій оцукрюють біомасу до обмеженого ступеня (неповне або часткове оцукрювання), за чим йдуть безперервні оцукрювання і ферментація, що відбуваються одночасно.

Вираз "окремі оцукрювання і ферментація", "окремі гідроліз і ферментація" і "ЗНЕ" використовуються в даному документі взаємозамінно. Вони стосуються схеми або процесу реакції, при якій оцукрюють або гідролізують біомасу до істотного завершення (наприклад, приблизно 6095 або більшого завершення, приблизно 7095 або більшого завершення, приблизно 80 95 або більшого завершення, приблизно 90 95 або більшого завершення, або приблизно 95 95 або більшого завершення) або до завершення (наприклад, приблизно 99 95 або більшого завершення, або приблизно 100 95 завершення так, щоб вивільнилися всі цукри, що підлягають ферментації, що можуть бути вивільнені в результаті даної реакції оцукрювання), за яким йде окремий і відмінний етап ферментації, при якому ферментаційні цукри, отримані в результаті етапу оцукрювання або гідролізу, ферментуються з одержанням продукту ферментації.

Вираз "цукор, що підлягає ферментації" стосується олігосахаридів і моносахаридів, що можуть використовуватися мікроорганізмом як джерело вуглецю в процесі ферментації.

Вираз "часткове оцукрювання" відноситься до обмеженого оцукрювання біомаси, де вивільнені цукри, що підлягають ферментації, менше загальної кількості цукрів, що підлягають ферментації, які можуть бути вивільнені, якщо оцукрювання пройде до завершення.

Вираз "целюлозний" відноситься до композиції що містить целюлозу і додаткові компоненти, що включають, наприклад, геміцелюлозу.

Вираз "оцукрювання" відноситься до одержання цукрів, що підлягають ферментації, з полісахаридів або матеріалів, що містять полісахарид.

Вираз "біомаса" відноситься до будь-якого целюлозного і геміцелюлозного матеріалу, що містить целюлозу, і необов'язково додатково утримуючому геміцелюлозу, лігнін, крохмаль, олігосахариди і/чи моносахариди. Біомаса також може містити додаткові компоненти, такі як білки і/чи ліпіди. Біомаса може бути отримана з одного джерела, або біомаса може включати суміш, отриману з більш ніж одного джерела. Наприклад, біомаса може включати суміш кукурудзяної соломи і кукурудзяного стебла або суміш трави і листів. Біомаса включає, але без обмежень, біоенергетичні культури, відходи сільського господарства, міські тверді відходи, промислові тверді відходи, відходи паперового виробництва, садові відходи, деревні і лісові відходи. Приклади біомаси включають, без обмежень, кукурудзяну солому, залишки зернових, таких як кукурудзяна лушпайка, кукурудзяна солома, трава, пшениця, солома пшениці, солома ячменю, сіно, рисова солома, просо, паперові відходи, багаса цукрового очерету, сорго, арундо очеретяний, пенісетум червоний, міскантус, криптомелію японську, компоненти, отримані після здрібнювання зерна, пагона, гілок, листів, деревної тирси, тирси, чагарників і кущів, овочів, фруктів, квітів і тваринного гною.

Термін "оцукрюючий фермент" стосується ферменту, що може каталізувати перетворення компонента біомаси у цукри, що підлягають ферментації. Частим випадком є те, що фермент є більш ефективним у продукуванні цукрів, що підлягають ферментації, якщо біомаса попередньо оброблена. 6.2. Докладний опис

Одержання речовини або продукту ферментації з целюлозних матеріалів звичайно включає три основних етапи. Ці три етапи являють собою (1) попередню обробку або попередній гідроліз, (2) ферментативний гідроліз або оцукрювання та (3) ферментацію, після якої речовина або продукт ферментації можуть бути відновлені. Приведений нижче приклад являє собою процес одержання етанолу, однак буде зрозуміло, що подібні процеси можуть бути використані для одержання інших речовин.

Попередня обробка. На етапі попередньої обробки або попереднього гідролізу целюлозний матеріал (що включає, наприклад, лігнінцелюлозний матеріал) нагрівають для зруйнування лігніну і вуглеводної структури, для розчинення більшої частини геміцелюлози і для того, щоб зробити целюлозну фракцію доступною для целюлолітичних ферментів. Етап нагрівання виконують, або при безпосередньому використанні пари, або в суспензії, або суміші, де до матеріалу можуть необов'язково додати каталізатор для прискорення реакцій. Придатні каталізатори включають, наприклад, сильні кислоти, такі як сірчана кислота та 50», або сильні основи, такі як гідроксид натрію. Етап попередньої обробки сприяє проникненню ферментів і мікроорганізмів. Целюлозна біомаса може також бути піддана попередній обробці у якості гідротермальної обробки парою (див., наприклад, публікацію патенту США Мо 2002/0164730).

Оцукрювання. На етапі ферментативного гідролізу, також відомому як етап оцукрювання, ферменти, як описано в даному документі, додають у попередньо оброблений матеріал для бо перетворення целюлозної фракції до глюкози і/або інших цукрів. Етап оцукрювання виконують,

зазвичай, у реакційних апаратах з мішалкою або ферментаторах при регульованих рн, температурі й умовах перемішування. Етап оцукрювання в деяких випадках може тривати до 200 годин. Оцукрювання може проводитися за температур від приблизно 30 "С до приблизно 65 "С, зокрема, приблизно 50 "С та при рН від приблизно 4 до приблизно 5, зокрема, приблизно при рН 4,5. Для одержання глюкози, що може бути метаболізована мікроорганізмом, який ферментує, таким як гриб (наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб) або бактерія (наприклад, 2утотопа5 торій або Сіовзігідішт (пептосеїшт), етап ферментативного гідролізу звичайно проходить в присутності В-глюкозидази.

Ферментація. На етапі ферментації, цукри, які виділені з целюлозного матеріалу в результаті етапів попередньої обробки і ферментативного гідролізу, ферментуються до етанолу (або інших речовин) ферментуючим мікроорганізмом, таким як гриб (наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб) або бактерія (наприклад, 2утотопах тобійй5 або Сіовігідічт (егтосеїйПит).

ЗОЕ. Дійсний опис передбачає способи і композиції поліпшення виходу реакцій, у яких відбувається етап ферментації, більш ніж у відмінних або окремих етапах, що йдуть за етапом ферментативного гідролізу, одночасно з етапом ферментативного гідролізу в тій самій посудині, переважно при регульованих рН, температурі й умовах перемішування. У деяких аспектах оцукрювання і ферментацію виконують одночасно в тій самій посудині, і, власне кажучи, вони є одночасним оцукрюванням і ферментацією, або "ЗБЕ". Цей процес, як описано в цьому документі, охоплює також процеси, що проводять з використанням "гібридного оцукрювання і ферментації" або конфігурації "НЗЕ". У деяких аспектах З5Е-реакцію ініціюють (наприклад, при додаванні ферментуючого мікроорганізму у реакцію оцукрювання, або встановленням сукупності умов для підтримки ферментації), коли не більше 30 95, не більше 25 95, не більше 2095, не більше 1595, не більше 1095 або не більше 5595 біомаси оцукрено. Як використовується в цьому документі вираз "ЗБЕ" також охоплює спільну ферментацію складних цукрів (Зпеепап апа Ніттеї, 1999, Епгутевз, епегду апа (Ше епмігоптепі: А з5ігагедіс регзресіїме оп Ше 0.5. Оєерапйтепі ої Епегдуз гезвагсп апа демеіортепі асіїмйієв їТог БіоеіНнапої, Віоїеснпої.

Ргод. 15: 817-827). 6.3. Ферментативний гідроліз

Клітинні стінки вищих рослин складаються з різноманіття вуглеводних полімерних (СР) компонентів. Ці СР компоненти взаємодіють ковалентним та нековалентним способом, забезпечуючи структурну цілісність рослин, необхідну для формування твердих клітинних стінок і для опору тургорному тиску. Велика частина СР, знайдених у рослинах, являють собою целюлозу, що формує структурний кістяк рослинних клітинних стінок. При біосинтезі целюлози ланцюги полі-В-1,4-Ю0О-глюкози з'єднуються між собою за допомогою водневих зв'язків і гідрофобних взаємодій з формуванням целюлозних мікрофібрил, що згодом з'єднуються між собою, формуючи більш великі фібрили. Целюлозні мікрофібрили почасти нерівномірні і містять ділянки кристалічності, що змінюється. Ступінь кристалічності целюлозних фібрил залежить від того, як щільно упорядковані водневі зв'язки, що розташовуються між будь-якими двома компонентами целюлозних ланцюгів. Ділянки з менш упорядкованими зв'язками, і тому більш доступними глюкозними ланцюгами, названі як аморфні ділянки.

Загальна модель перетворення або деполімеризації целюлози в глюкозу включає три ферментативні активності. Ендоглюканази розщеплюють целюлозні ланцюги зсередини з формуванням більш коротких ланцюгів і збільшенням кількості доступних кінців, що потім піддаються дії екзоглюканаз. Екзоглюканази є специфічними для або кінців, що відновлюють, або кінців, що невідновлюють, більш коротких ланцюгів, і здатні до вивільнення целобіози, димеру глюкози. Приклади екзоглюканаз включають, без обмежень, різні целобіогідралази.

Целобіоза, що нагромадилася, потім розщеплюється целобіазами з утворенням глюкози.

Приклади целобіаз включають, без обмежень, різні В-1,4-глюкозидази.

Геміцелюлоза містить ряд різних цукрових мономерів, які, на відміну від таких у целюлозі, містять безводну глюкозу. Наприклад, крім глюкози, цукрові мономери в геміцелюлозі можуть включати ксилозу, манозу, галактозу, рамнозу й арабінозу. Геміцелюлози містять, головним чином, Ю-пентозні цукри, а також іноді невеликі кількості І-цукрів. Ксилоза є цукровим мономером, що є присутнім у найбільшій кількості, але мануронова кислота та галактуронова кислота також мають тенденцію бути присутніми. Геміцелюлози включають, наприклад, ксилан, глюкуроноксилан, арабіноксилан, глюкоманан і ксилоглюкан.

Ферменти і мультиферментні композиції даного розкриття є придатними для оцукрювання геміцелюлозних матеріалів, наприклад, ксилану, арабіноксилану і субстратів, що містять ксилан- або арабіноксилан. Арабіноксилан являє собою полісахарид, що складається з ксилози й арабінози, де І-са - арабінофуранозні залишки приєднані як точки розгалуження до В-(1,4)- бо зв'язаного ксилозного полімерного кістяку.

Через складність більшості джерел біомаси, що можуть містити целюлозу, геміцелюлозу, пектин, лігнін, білки і золу серед інших компонентів, у деяких аспектах ферментні суміші цього розкриття можуть містити ферменти з діапазоном субстратних специфічностей, що діють разом для ефективного розкладання біомаси у цукри, що піддають ферментації. Один приклад мультиферментного комплексу для оцукрювання лігноцелюлози включає суміш целобіогідролаз(и), ксиланаз(и), ендоглюканаз(и), В-глюкозидаз(и), р-ксилозидаз(и) (Іі необов'язково різні акцесорні білки.

Таким чином, дане розкриття розглядає застосування одного або більше ферментів, що здатні окремо або разом продукувати вуглеводи, що можуть бути застосовані у якості джерел енергії ферментуючим(чими) організмом(ами) у ЗБЗЕ-реакції для одержання продукту ферментації, такого як етанол.

У деяких аспектах мультиферментні композиції застосовують у 55Е-реакціях для гідролізу вуглеводів або субстратів з вуглевод-утримуючою біомасою для одержання цукрів, що ферментовані в такій же реакції ферментуючими мікроорганізмами. Мультиферментні композиції (що включають продукти переробки, сукупності ферментів або "сумішки") містять суміш (або "сумішку") ферментів, що у деяких аспектах не зустрічаються у природі. Як використовується в даному документі вислів "сумішка" відноситься до: (1) композиції, створеної об'єднанням складових ферментів, або у формі ферментативного бульйону, або у формі частково або цілком ізольованих або очищених поліпептидів; (2) композиції, отриманої за допомогою організму, модифікованого для експресії одного або більше складових ферментів; необов'язково, організм може бути модифікований для видалення одного або більше генів або інактивації одного або більше генних продуктів, де гени, кодують білки, що впливають на гідроліз ксилану, гідроліз геміцелюлози і/або гідроліз целюлози; (3) композиції, створеної комбінуванням складових ферментів одночасно, окремо або послідовно під час З5Е-реакції; і (4) суміші ферментів, отриманих іп 5йи, наприклад, під час 55Е-реакції; (5) сполучення будь-яких або всіх зазначених вище пунктів (1)-(4).

Також необхідно розуміти, що кожний з ферментів, специфічно описаних у даному документі, може бути об'єднаний з будь-яким одним або більше ферментами, описаними в

Зо даному документі або з будь-якими іншими доступними і придатними ферментами для одержання мультиферментних композицій. Розкриття не обмежується або не зводиться до специфічних зразкових комбінацій, які описані та приведені у якості прикладів у даному документі.

У способах даного розкриття, будь-який (з) ферментіів), описаний у даному документі, може бути доданий до або під час 55Е-реакції, у тому числі під час або після розмноження ферментуючого(их) організму(ів).Ферменти можуть бути додані окремо, як ферментативна сумішка або як ферментативний бульйон і т.д.

Ферменти, описані в даному документі, можуть бути виділені або отримані з будь-яких придатних джерел, включаючи, наприклад, бактерії, гриби, дріжджі або ссавців. Вираз "отриманий" означає, що фермент може бути виділений з організму, що природно продукує фермент у якості нативного ферменту або фермент може бути отриманий рекомбінантно в організмі-хазяїні, де рекомбінантно отриманий фермент є або нативним, або чужорідним для організму-хазяїна, має модифіковану амінокислотну послідовність, наприклад, має одну або більше амінокислот, що вилучені, вставлені і/або заміщені, або є ферментом, отриманим у ході процесів перестановки нуклеїнових кислот, відомих у рівні техніки. Наприклад, фермент, отриманій рекомбінантно, може бути ферментом, що є мутантом і/або фрагментом нативної амінокислотної послідовності. Мається на увазі, що вираз "нативний фермент" включає продукт гена в його природному розташуванні в геномі організму, а також включає природні варіанти; мається на увазі, що вираз "чужорідний фермент" включає продукт гена, який природно не зустрічається в організмі-хазяїні, але який уведений в організм-хазяїн перенесенням генів або генною вставкою у ненативний організм, або химерні гени, що включають ферменти, отримані рекомбінантно, наприклад, сайт-специфічним мутагенезом або перестановою.

Ферменти в деяких аспектах можуть бути очищеними. Вираз "очищений" як використовується в цьому документі для модифікації речовин, таких як ферменти, білки, поліпептиди, полінуклеотиди та інші компоненти, відноситься до ферментів, вільних або здебільшого вільних від інших компонентів організмів, з яких вони були виділені. У деяких аспектах вираз "очищений" також включає ситуації, де ферменти вільні або здебільшого вільні від компонентів нативних організмів, з яких вони були отримані. Ферменти можуть вважатися "очищеними", але залишатися з'єднаними з або в присутності незначних кількостей інших білків. бо Вираз "інші білки" як використовується в цьому документі відноситься, зокрема, до інших ферментів. Вираз "очищений" як використовується в цьому документі також відноситься до видалення інших компонентів, зокрема, видалення інших білків і більш конкретно, інших ферментів, що є присутніми у вихідних клітинах ферментів цього розкриття. Таким чином, фермент може бути, наприклад, "у значній мірі чистим поліпептидом", що здебільшого звільнений від інших компонентів. Організм, у якому даний фермент отримують, може бути, наприклад, організмом-хазяїном, що підходить для рекомбінантного одержання ферментів.

Наприклад, у значній мірі чистий поліпептид може відноситися до поліпептиду, що присутній на рівні 50 ваг. 95 або більше, 60 ваг. 95 або більше, 70 ваг. 95 або більше, 80 ваг. 95 або більше, 90 ваг. У6 або більше, 95 ваг. 95 або більше, 98 95 або більше або 99 95 або більше у суміші, частиною якої він є. Поліпептид, що здебільшого звільнений від інших компонентів являє собою компонент суміші, що містить менше 40 ваг. 96, менше 30 ваг. 956, менше 20 ваг. 96, менше 10 ваг. 95, менше 5 ваг. 9о, менше 2 ваг. У», або менше 1 ваг. 95 інших компонентів. 6.3.1. Целюлази

Ферментні сумішки даного винаходу можуть містити одну або більше целюлаз. Целюлази є ферментами, котрі гідролізують целюлозу (8-1,4-глюкан або В-ЮО-глюкозидні зв'язки) для утворення глюкози, целобіози, целоолігосахаридів та т.ін. Целюлази звичайно поділяють на три основних класи: ендоглюканази (ЕС 3.2.1.4) ("ЕС"), екзоглюканази або целобіогідролази (ЕС 3.2.1.91) ("СВН") ї ВД-глюкозидази (В -О-глюкозидглюкогідролази; ЕС 3.2.1.21) ("ВО") (Кпоулез еї а!., 1987, Тгепавз іп ВіоїесНпо!. 5(9):255-261, і Зспцшеїп, 1988, Метоа5 ої Еплуптоїіоду 160:234-242).

Ендоглюканази діють головним чином на аморфні частини волокна целюлози, тоді як целобіогідролази здатні розкладати кристалічну целюлозу.

Целюлази для застосування відповідно до способів і композицій цього розкриття, можуть бути отримані, зокрема, з одного або більше наступних організмів: Стгіпірей5 5сарейа,

Масторпотіпа рНазеоїїпа, Мусеїїорпїнога Іпепгторнпіїа, Зогаагіа їйтісоїа, МоішейПа соПефїіспоїдев, ТНівіаміа Іетевійв, Асгетопішт в5р., Ехідіа діапаціовза, Ротев5 Тотепіаглив5, 5ропаіреїїїв5 вр.,

ВПігорніусіїє гозеа, АВПіготисог ризійй5, РПпусотусевз пієив5, СНаєїовіуйт езепії, Оіріодіа доззуріпа, Шіозрога бБіїдгатії, Зассороїй5 айшейПйив, Репісйит метисціовит, РепісшШит спгузодепит, Тнептотусев мегписови5, Оіаройне зупдепевзіа, СоПейфйіспит Іадепапт,

Мідговзрога з5р., Хуїайа Нурохуїоп, Месіга ріпеа, 5огдага тасгозрога, ТНівіаміа (Шепторнпіїа,

Зо Снаєютішт тогогит, Спавіотійшт мігесеп5, Спавіотішт Бгавіїепві5, Спаєїттішт сипісоіЇогит,

Зузравіозрога Бопіпепві5, СіадогпПіпит Юесипаібзвітит, 5суїаійдійт Шепторпнійа, Спіосіадіит саїепшайцшт, Ризагит охузрогит 55р. Іусорегвісі, Ривзагшт охузрогит 55р. раз5Шога, Ризагйт воЇапі, Бизагцт апдпиіоіде5, Ризагшт роає, Нитісоїа підгезсеп5, Нитісоїа дгізеа, РапаеоЇшв5 гейгидіє, Ттатеїез запдиїпеа, ЗспігорпуПйшт соттипе, Тгіспоїйесішт гозешт, Містозрпаеєгорвів в5р., Ас5ороїиз 5іісіоідеи5 5ре)., Рогопіа рипсіага, Модиїїзрогит 5р., Тісподегта зр. (наприклад,

Тпісподегта геезеї) та Суїїіпагосагроп 5р.

У конкретних варіантах здійснення целюлаза, що використовується в композиції цього розкриття, може досягати щонайменше 0,1, щонайменше 0,2, щонайменше 0,3, щонайменше 0,4 або щонайменше 0,5 долі продукту, як визначено аналізом з калькофлуором, як описано в наступному підрозділі. У деяких варіантах здійснення целюлаза, що використовується в композиції цього розкриття, є цільною целюлазою і/або здатною досягати щонайменше 0,1, щонайменше 0,2, щонайменше 0,3, щонайменше 0,4 або щонайменше 0,5 долі продукту, як визначено аналізом з калькофлуором як описано в наступному підрозділі. У деяких варіантах здійснення целюлаза, що використовується в композиції цього розкриття, є цільною целюлазою і/або здатною досягати від приблизно 0,1 до приблизно 0,5, або від приблизно 0,1 до приблизно 0,4, або від приблизно 0,2 до приблизно 0,4, або від приблизно 0,3 до приблизно 0,4, або від приблизно 0,2 до приблизно 0,5, або від приблизно 0,3 до приблизно 0,5 долі продукту, як визначено аналізом з калькофлуором як описано в наступному підрозділі. 6.3.1.1. Аналіз целюлазної активності при використанні барвника калькофлуор білий

Целюлозу, набряклу у фосфорній кислоті (РАС) готують з АмісеІ! РН-101 з використанням придатного протоколу Умаїбхеїй, 1971, ТАРРІ 35:228 та Умоса, 1971, Віоспет. 9. 121:353-362.

Коротко, у зразковому способі, АмісеІ розчиняють у концентрованій фосфорній кислоті, потім осаджують, використовуючи холодну деіонізовану воду. Після того, як целюлозу збирають і промивають водою для досягнення нейтрального рн, її розчиняють до 1 95 сухої речовини в натрій ацетатному буфері 50 ммоль, при рН 5,0.

Усі ферментні розчини готують з натрій ацетатним буфером 50 ммоль, рН 5,0. Целюлазу 5220 (бапізсо ОБ Іпс., Сепепсог) розчиняють до 2,5, 5, 10 та 15 мг білка/г РАБС, для одержання лінійної калібрувальної кривої. Зразки, котрі необхідно випробувати, розчиняють до падіння в межах калібрувальної кривої, тобто, для одержання відповіді від 0,1 до 0,4 долі бо продукту. Сто п'ятдесят (150) мкл холодної 1 96 РАБС додають у кожні 20 мкл ферментного розчину у відповідній посудині, наприклад, 96-ямкових титраційних мікропланшетах. Планшети закривають і інкубують 2 години при 50 "С, з обертанням при 200 об/хв, в інкубаторі/качалці.

Реакції потім гасять, використовуючи 100 мкл 50 мкг/мл калькофлуора в гліцині 100 ммоль, рн 10. Флуоресценцію зчитують з флуоресцентного рідера мікропланшетів при довжині хвилі збудження Ех-365 нм і довжині хвилі випромінювання Ет-435 нм. Результат виражають у долях продукту відповідно до рівняння:

ЕР-1-(РІ проби - РІ буфера з целобіозою)/(РІ вихідного ферменту - РІ буфера з целобіозою), де "ЕР" - доля продукту і "РІ" - одиниці флуоресценції. 6.3.1.2. В-Глюкозидази

Ферментні сумішки цього розкриття необов'язково містять одну або більше ДВ-глюкозидаз.

Вираз «В-глюкозидаза" як використовується в цьому документі відноситься до В-О- глюкозидглюкогідролаз, що прираховані у або згідно ЕС 3.2.1.21, або до ферменту, який є членом деяких сімейств глікозилгідролаз ("ЗН"), що включають, без обмежень, ОН сімейства 1, 3, 9 або 48. У деяких аспектах вираз відноситься до ферменту, здатного каталізувати гідроліз целобіози для вивільнення В-ЮО-глюкози.

В-глюкозидази можуть бути отримані з будь-яких придатних мікроорганізмів. Вони можуть бути виділені або отримані рекомбінантними способами, або отримані з комерційних джерел.

Придатні ВД-глюкозидази можуть, наприклад, бути виділені з таких мікроорганізмів як бактерії або гриби. Наприклад, придатна ВД-глюкозидаза може бути отримана з міцеліальних грибів.

У деяких аспектах придатна В-глюкозидаза може бути отримана з Азрегодійи5 асшеацшв (Кажадисні еї а!., 1996, Сеп 173: 287-288), АзрегуйПив Камласні (мазнйа єї аї!., 1999, Аррі. Епмігоп.

Містобіо!. 65: 5546-5553), Азрегодїіїи5 огулає (РСТ публікація патентної заявки УМО 2002/095014),

СеППМіотопавз Біагоїєа (опа еї а!., 1998, Сеп 207:79-86), Репісіййшт 7ипісшовит (РСТ публікація патентної заявки УМО 200478919), Засспагоптусорзвів Приїїдега (Маспіада єї а!., 1988, Аррі. Епмігоп.

Містобріо!. 54: 3147-3155), 5спігозасспаготусе5 ротре (УМооа еї а!., 2002, Маїшиге 415: 871-880) або Ттісподегпта геезеї. Наприклад, придатні В-глюкозидази з Тгісподепта геезеі можуть включати В-глюкозидазу 1 (патент США Мо 6022725), В-глюкозидазу З Тгісподегта геезеї (патент

США Мо 6982159), ВД-глюкозидазу 4 Тгісподегта геезеї (патент США Ме 7045332), ВД-глюкозидазу 5 Тісподегта геезеї (патент США Мо 7005289), В-глюкозидазу 6 Тгісподегта геезеї (публікація

Зо патентної заявки США 20060258554) або Др-глюкозидазу 7 Тгісподегта геезеї (публікація патентної заявки США 20060258554).

У деяких варіантах здійснення винаходу придатні В-глюкозидази можуть бути отримані за допомогою експресії генів, що кодують В-глюкозидази. Наприклад, придатна р-глюкозидаза може бути виділена в позаклітинний простір, наприклад, деякими грампозитивними організмами (такими як ВасйШи5 або Асііпоптусеїев5), або еукаріотичним хазяїном (наприклад, Тгісподегта,

Азрегоїи5, Засспаготусев, або Ріспіа).

Придатні В-глюкозидази також можуть бути отримані з комерційних джерел. Приклади комерційних ДВ-глюкозидазних препаратів, що придатні для використання в способах, композиціях та інших варіантах здійснення даного розкриття, включають, без обмежень, ВД- глюкозидазу Тгісподегта геезеї в АссеПегазе"м ВО (Оапізсо 05 Іпс., сСепепсої); МОМО2УМ м 188 (В-глюкозидаза з Азрегдійи5 підег); В-глюкозидазу Адгобрасіегішт 5р. та В-глюкозидазу

Тпептаюда тагйта, доступну від Меда7гуте (Медауте Іпіегпайбопаї Ігеїапа Ца., Вгау Вивіпе55

Раж, Вгау, Со. Міскіом, Ігеїапа.).

У деяких аспектах придатна В-глюкозидаза може бути компонентом цільної целюлази, як описано нижче в підрозділі 6.3.1.5.

Активність В-глюкозидази може визначатися способами, відомими в даному рівні техніки.

Наприклад, може використовуватися аналіз, описаний Спеп і співавт., 1992, у Віоспітіса еї

Віорпувзіса Асіа 121:54-60. У цьому аналізі, одна одиниця рМРО означає 1 мкмоль нітрофенолу, виділеного з пара-нітрофеніл-В-О-глюкопіранозиду за 10 хв при 50 "С (або 122 Р) і рН 4,8. 6.3.1.3. Ендоглюканази

Ферментні сумішки цього розкриття необов'язково містять одну або більше ендоглюканаз.

Вираз "ендоглюканаза" відноситься до будь-яких поліпептидів, прирахованих до ЕС 3.2.1.4.

У деяких аспектах ЕС1 Тгісподегта геезеї (Репціїа єї а!., 1986, Сепе 63:103-112) і/або ЕС! Т. геезвї (Заіопеїто еї а!., 1988, Сепе 63:11-21) використовують в способах і композиціях цього розкриття. В інших аспектах ендоглюканаза може бути ендоглюканазою МІ Т. геезеї (див., наприклад, патент США Мо 7351568), ендоглюканазою МІ! (див., наприклад, патент США Мо 7449319) або ендоглюканазою МІ (див., наприклад, патент США Мо 7049125).

У конкретних варіантах здійснення винаходу придатна ендоглюканаза може бути термостабільною ендоглюканазою ТпПіеїЇаміа (еггевігіз (Кмезіадае еї а!., 1995, Аррі. Віоснет. (510) Віотесппої. 50:137-143); ЕС Т/иісподегта геезеї (ОКада еї аї., 1988, Аррі. Епмігоп. Містобіо!.

64:555-563), ЕСІМ (ЗаІонеїто еї аї., 1997, Ешг. У. Віоспет. 249:584-591), ЕС5 (ЗаІонеїто еї аї., 1994, Мої. Місгобіої. 13:219-228), ЕСМІ (публікація патентної заявки США Мо 20070213249) або

ЕСМІІ (публікація патентної заявки США Мо 20090170181); ендоглюканазою Асідотегтив сепПиіоїуйсив ЕІ (патент США Мо 5536655); ендоглюканазою М Нитісоїа іпзоЇеп5 (ЕС) (Ргоїевіп

ОБаїа Вапк запис 4ЕМО); ендоглюканазою Зіарпуїоїгіспит соссозрогит (публікація патентної заявки США Ме 20070111278); ендоглюканазою Е1-СМС АзрегодїПи5 асиїєайсиз (Оої еї аї., 1990,

Мисієїс Асій Ке5. 18:5884); ендоглюканазою СМСавзе-1 Азрегодїїив5 Каугаспії ІРО 4308 (Закатою еї аІ..1995, Си. Сепеї. 27:435-439); або Егміпіа сагоїомага (Заагійіанії еї а!І., 1990, Ген 90:9-14); ендоглюканазою Асгетопішт ІПпептпорпішт АЇКО4245 (публікація патенту США Мо 20070148732).

Ендоглюканази, придатні для використання в способах і композиціях даного розкриття, можуть бути також описані в, наприклад, РСТ публікаціях патентних заявок УМО 91/17243, УМО 91/17244, МО 91/10732 або патенті США Мо 6001639. 6.3.1.4. Целобіогідролази

Вираз "целобіогідролаза" як використовується в цьому документі відноситься до будь-яких целобіогідролаз, прирахованих до ЕС 3.2.1.91. Способи і композиції даного розкриття можуть включати відповідно одну або більше целобіогідролаз ("СВН").

У визначених аспектах СВНІ Тгісподегта геезеї (5поетакег еї аї., 1983, Віо/ГесппоЇоду 1:691-696) і/або СВНІ! (Теегі еї а!., 1983, Віо/ТесппоЇду 1:696-699) використовуються в способах і композиціях даного розкриття.

У визначених аспектах придатна СВН може бути СВНІ Адагісиб5 Бівроги5 (Зм/із5 Ргої

Ассезвзіоп Мо 092400); СВНІ Азрегодійни5 асшиіеайв (Зм/із5 Ргої Ассезіоп Мо 059843); СВНА

АзрегоїНи5 піашіап5 (СепВапК Ассебзіоп Мо АЕ420019); СВНВ Азрегойи5 підшап5 (сСепВапк

Ассеззіоп Ме АР420020); СВНА Авзрегойи5 підег (сепВапк Ассеззіоп Ме АЕ156268); СВНВ

Аврегойи5 підег (ЗепВапк Ассезбзіоп Мо АР156269); СВНІ Сіамісере ригригеа (Змівв Ргої

Ассеззіоп Ме 000082); СВНІ СоспПііоБбоїш5 сагропагит (Зм/із5 Ргої Ассеззіоп Ме 5Ж0О0328); СВНІ1

Стгурпопесігіа рагазййса (Зм/і55 Ргої Ассебззіоп Мо 000548); СВНІ Ризагішт охузрогит (Се1І7А) (Зм/і55 Ргої Ассеззіоп Мо Рі46238); СЬп1.2 Нитісоїа дгізеа (сепВапк Ассеззіоп Мо 050594); СВНІ1

Нитісоїа дгізеа маг. (Тегтоїдеа (сепВапк Ассебзбзіоп Мо 063515); СВНІ.2 Нитісоїа дгізеа маг.

Зо Шегптоїдеа (СепВапк Ассеззіоп Мо АЕ123441); ехої Нитісоїа дгізеа маг. (Тегтоїдеа (СепВапк

Ассеззіоп Мо АВО03105); СеІ7/В МеїІапосагрих аіротусез (СсепВапк Ассезвіоп Мо АШЬ15705), СВНІ

Меигозрога сгазза (СепВапК Ассезвзіоп Мо Х77778); СВНІ РепісшШішт Типісцозит (СеІ7А) (публікація патенту США Мо 20070148730); СВНІ Репісіййшт |апіпіпейшт (бепВапк Ассеввіоп Мо 556178); СВН РІПапегоспаєїе сПпгузозрогішт (СепВапк Ассебзбзіоп Мо М22220); СВНІ-2

РПпапегоспаєїе спгузозрогішт (СеІ7/0) (СепВапк Ассеззіоп Ме 122656); СЬПІА ТаїЇаготусев5 етегзопії (зепВапкК Ассеззіоп Мо АР439935); СВНІ Тгісподепгта мігіде (бепВапк Ассевзіоп Мо

Х53931) або М14 СЬНІ1 МоїмагівЇа моїмасеа (СсепВапк Ассевззіоп Мо АЕ156693). 6.3.1.5. Загальні целюлази

У визначених аспектах ферментні сумішки даного розкриття включають загальну целюлазу.

Як використовується в цьому документі "загальна целюлаза" відноситься як до природних, так і до штучних композицій, що містять целюлазу, які включають: (1) ендоглюканазу, що розщеплює внутрішні В-1,4 зв'язки целюлози, які приводять до більш коротких глюкоолігосахаридів, (2) целобіогідролазу, що діє "екзо" способом для вивільнення одиниць целобіози з більш коротких глюкоолігосахаридів; приклади одиниць целобіози включають ІВ-1,4 глюкоза-глюкоза дисахарид і (3) В-глюкозидазу, що каталізує вивільнення глюкозних мономерів з коротких целоолігосахаридів або целобіоз, що є димерами глюкози. "Природна, що містить целюлазу" композиція є такою, котра продукується природним джерелом, що включає один або більше компонентів і активностей целобіогідролазного типу, один або більше компонентів і активностей ендоглюканазного типу й один або більше компонентів і активностей В-глюкозидазного типу, де кожний з цих компонентів або активностей виявлені в співвідношеннях і рівнях, продукованих у природі, неторканій рукою людини. Таким чином, природна композиція, що містить целюлазу, є, приміром, композицією, що одержують за допомогою організму немодифікованого щодо целюлозних ферментів так, що співвідношення або рівні складових ферментів є незміненими в порівнянні з такими, отриманими за допомогою природного організму в природі. "Штучна композиція, що містить целюлазу" відноситься до композиції, отриманої за допомогою: (1) об'єднання складових целюлолітичних ферментів, або у природному, або штучному, тобто зміненому, співвідношенні; або (2) модифікації організму для надекспресії або зниженої експресії одного або більше целюлолітичних ферментів; або (3) модифікації організму таким чином, щоб видалити щонайменше один целюлолітичний фермент. бо "Штучну" композицію, що містить целюлазу, можна також віднести до композиції, отриманої завдяки регулюванню умов культивування для природних організмів так, щоб природні організми вирощувалися при неприродній умові і продукували змінений рівень або співвідношення ферментів. Таким чином, у деяких варіантах здійснення препарат загальної целюлази даного розкриття може мати один або більше ЕС і/або СВН і/або р-глюкозидаз, вилучених і/або надекспресованих. У даному розкритті препарат загальної целюлази може бути з будь-якого мікроорганізму, здатного гідролізувати целюлозний матеріал. У деяких варіантах здійснення препарат загальної целюлази є загальною целюлазою міцеліального гриба.

Наприклад, препарат загальної целюлази може бути з видів Асгетопішт, АзрегудйШи5, ЕтегісейПа,

Еизагішт, Нитісоїа, Мисог, Мусеїорпїйога, Мешйгозрога, РепісіПит, суїаїйдіит, ТНієїЇаміа,

Тоїуросіадіит або Тгісподепта. Препарат загальної целюлази є, наприклад, загальною целюлазою АзрегуйШив5 асціеацив5, АзрегудйШи5 ажматогі, Азрегойи5 Тоейдив5, Азрегдійи5 іаропісив,

Азрегоїйи5 підшціап5, Азрегойи5 підег або Азрегоййи5 огулае. Крім того, препарат загальної целюлази може бути препаратом загальної целюлази ЕРизагішт бБасігідіоіде5, Ризагічт сегеаїїв5,

Еивагтішт стооКмеПепбзе, ЕРивапйит ситогит, Еивзапйцт дгатіпеагит, Ривзагпйт дгатіпит,

Еизатцт Пеїегозрогит, ЕРизагішт педипаї, Ризагпит охузрогит, ЕРизагт геїйсшацшт, Ризагйт гозецт, Еизапйцт затбрисіпит, Еивзагпит загсоспгоцт, Ризапйцт зрогоїпспіоіїде5, ЕРизагт 5МІрпигешт, ЕРизагішт їогиЇо5ит, ЕРизагішт ігіспоїпесіоїдеб5 або Ризагішт мепепаїшт. Препарат загальної целюлази також може бути препаратом загальної целюлази СПпгузозрогіит

ІнсКпожепзе, Нитісоїа іпзоЇеп5, Нитісоїа Іапидіпоза, Мисог тієйеї, МусеїЇорпїнога Шепторніїа,

Мешцгозрога стазза, Репісійит ригритодепит, РепісшШіит ?ипісцовит, 5суїгаїйдійт ШТепппорнйит або Тпівіаміа геггевігі5. Крім того, препарат загальної целюлази може бути препаратом загальної целюлази Тгісподегта Ппагліапит, Тгісподегпта Копіпадії, Тгісподегпта Іопдібгаспіаєшт, Тгісподегта геезеї (наприклад, КІ-РЗ37 (ЗНеї-Меїв5 Сї еї а). Аррі. Місгобіо!. Віотесппої. 1984, 20, рр.46-53),

ОМ9414 (АТС Мо. 26921), МАВІ 15709, АТС 13631, 56764, 56466, 56767) або Тгісподепта мігіде (наприклад, АТСС 32098 і 32086).

Препарат загальної целюлази, зокрема, може бути відповідно препаратом загальної целюлази КиїЗОТгісподегта геезеї, що доступний з Американської колекції типових культур як

Тіісподегпта геезеі АТСС 56765. Наприклад, препарат загальної целюлази також може бути відповідно загальною целюлазою Репісіййшт Типісшовит, що доступний з Американської колекції

Зо типових культур як РепісшШит їипісшозит АТСС номер 10446.

Препарат загальної целюлази може бути також отриманим з комерційних джерел. Приклади комерційних препаратів целюлази, що підходять для застосування в способах і композиціях даного розкриття, включають, наприклад, СЕГГ ОСІ АБТМ, Її СеПЦстм (Момогуте5 А/Б5), і

ГАМІМЕХ М ВО, Іпаідде "м 44|, Ргітатаві м 100, Ргітагабхі мМ 200, Брегуте"мМм СР, АссеїйІегабе м 1000 і Ассеїегазе "м 1500 (Оапізсо О5. Іпс., бепепсог).

Придатні препарати загальної целюлази можна приготувати, використовуючи будь-які способи культивування мікроорганізмів, відомі в даному рівні технікию, головним чином ферментацію, що приводить до експресії ферментів, здатних гідролізувати целюлозний матеріал. Як використовується в цьому документі "ферментація" відноситься до культивування у колбі, що струшується, ферментації у дрібному або великому масштабі, такий як безперервна, періодична ферментація, ферментація з підживленням або у твердому стані в лабораторії або промислових ферментерах, що виконується в придатному середовищі і при умовах, що дозволяють експресувати і/або ізолювати целюлазу і/або ферменти, що цікавлять.

Звичайно мікроорганізм культивують у середовищі для клітинних культур, що підходить для одержання ферментів, здатних гідролізувати целюлозний матеріал. Культивування проводиться в придатному живильному середовищі, що містить джерела вуглецю й азоту і неорганічні солі, ізастосуванням способів і варіантів, відомих у даному рівні техніки. Придатне культуральне середовище, діапазон температур та інші умови для росту і одержання целюлази відомі в даному рівні техніки. Як необмежуючий приклад типовий діапазон температур для одержання целюлази за допомогою Тгісподегта геезеї складає від 24 "С до 28 76.

Препарат загальної целюлази можна використовувати, з тим як його отримують у результаті ферментації, без або з мінімальним відновленням і/або очищенням. Наприклад, як тільки целюлази секретуються в середовищі клітинної культури, середовище клітинної культури, що містить целюлази, може негайно використовуватися. Препарат загальної целюлази може включати нефракціонований вміст матеріалу ферментації, включаючи використане середовище клітинних культур, позаклітинні ферменти і клітини. З іншої сторони, препарат загальної целюлази можна також піддати додатковій обробці в ряді загальноприйнятих етапів, наприклад, осадження, центрифугування, адсорбційна хроматографія, фільтрація і т.ін. Наприклад, препарат загальної целюлази можна концентрувати і потім використовувати без додаткового 60 очищення. Препарат загальної целюлази можна, наприклад, скласти з включенням визначених хімічних засобів, що зменшують життєздатність клітин або вбивають клітини після ферментації.

Клітини можна, наприклад, лізувати або порушувати проникність мембрани із застосуванням способів, відомих у даному рівні техніки.

Ендоглюканазну активність препарату загальної целюлази можна визначити, використовуючи карбоксиметилцелюлозу (СМС) як субстрат. Придатний аналіз вимірює продукування кінців, що редукують, вироблених сумішшю ферментів, що діють на СМС, де 1 одиниця є кількістю ферменту, що вивільняє 1 мкмоль продукту/хв. (опоз5е, Т. К., Риге 8. Аррі.

Спет. 1987, 59, рр. 257-268).

Загальна целюлаза може являти собою целюлазу, збагачену В-глюкозидазою. Загальна целюлаза, збагачена ВД-глюкозидазою, звичайно включає р-глюкозидазу і препарат загальної целюлази. Композиції загальної целюлази, збагаченої В-глюкозидазою, можна одержати рекомбінантним способом. Наприклад, такий препарат загальної целюлази можна забезпечити за допомогою експресії ВрВ-глюкозидази в мікроорганізмі, здатному продукувати загальну целюлазу. Композиція загальної целюлази, збагаченої ВД-глюкозидазою, також може, приміром, включати препарат загальної целюлази і Д-глюкозидазу. Наприклад, композиція загальної целюлази, збагаченої В-глюкозидазою, може відповідно включати щонайменше 5 ваг. 9», 7 ваг. 95, 10 ваг. 95, 15 ваг. 95 або 20 ваг. 95 і до 25 ваг. 95, 30 ваг. 95, 35 ваг. 905, 40 ваг. 95 або 50 ваг. 96 ВД-глюкозидази, виходячи загальної ваги білків у цій сумішці/композиції.

У деяких аспектах придатну загальну целюлазу можна одержати з мікроорганізму, що створюють або створили способами генної інженерії для скорочення або виключення зберігаючої активності ВД-ксилозидази. В інших аспектах придатну загальну целюлазу можна одержати з мікроорганізму, що створюють або створили способами генної інженерії для скорочення або виключення перетворювальної активності В-ксилозидази. У ще додаткових аспектах придатну загальну целюлазу можна одержати з мікроорганізму, що створюють або створили способами генної інженерії не тільки для скорочення або усунення зберігаючої активності В-ксилозидази, але також для підвищення перетворювальної активності Д- ксилозидази. Наприклад, загальну целюлазу можна відповідно одержати з Тгісподепта геезеї, що сконструйований таким чином, щоб видалити нативний ген Бхі!1. В іншому прикладі загальну целюлазу можна відповідно одержати з Тгісподегта геебзеії, що сконструйований для

Зо рекомбінантної експресії ферменту з перетворювальною активністю В-ксилозидази. У ще одному прикладі загальну целюлазу можна відповідно одержати з Тгісподегта геезеї, що сконструйований таким чином, щоб видалити його нативний ген рхі!, і щоб він рекомбінантно експресував фермент з перетворювальною активністю В-ксилозидази. Приклади ферментів з перетворювальною активністю В-ксилозидази включають без обмежень Ем430 та інші, описані в дійсному документі в розділі 6.4.

Активність В-ксилозидази можна визначати за допомогою виміру рівня гідролізу штучного субстрату р-нітрофеніл-В-ксилопіранозиду. За реакцією гідролізу можна стежити, застосовуючи

І"Н-ММЕ аналіз під час ходу реакції. Аномерний протон залишку, що представляє редукуючий кінець глікозидного зв'язку, має виразне хімічне зрушення, що залежить від його осьової або екваторіальної орієнтації, також як і аномерний протон знову утвореного редукуючого цукру після гідролізу. Мутаротація аномерного протона знову утвореного редукуючого цукру до рівноважної суміші осьової або екваторіальної форм є більш повільною у порівнянні з реакцією гідролізу. Таким чином, "Н-ММЕК визначення орієнтації аномерного протона першого утвореного редукуючого кінця у порівнянні з формою, що є присутньою у субстраті, є аналізом механізмів, що зберігають конфігурацію на противагу тим, що інвертують конфігурацію. Експериментальні способи описуються в, наприклад, Рашіу еї аї., 1999, Сіусобіоіоду 9:93-100.

Альтернативно, рівень гідролізу можна визначати за допомогою розрізнення трансглюкозилазної активності зберігаючих ферментів, що відсутні в перетворювальних ферментах. Приклад такого аналізу показаний на Фігурі 16. Ксилобіоза або ксилозні олігомери в присутності зберігаючого ферменту (наприклад, Мийтеске ксиланази або ЕмЗА) демонструють стрімке зростання відношення ЕХР/ксилоза до 7-8 разів від рівноважного відношення в присутності ЕН, після якого відношення ЕХР/ксилоза падає до рівноважного відношення. У випадку перетворювальних ферментів (наприклад, Ем43О0)), за тих самих умов, ЕХР/ксилоза зростає монотонно до рівноважного відношення. 6.3.2. Геміцелюлази

Велике різноманіття грибів і бактерій здатні ферментативно гідролізувати геміцелюлози.

Подібно розкладанню целюлози гідроліз геміцелюлози припускає координовані дії ряду ферментів. Геміцелюлази часто групують у три основні категорії: діючі усередині ферменти, що атакують внутрішні зв'язки усередині полісахаридних ланцюгів; діючі зовні ферменти, що діють бо поступально або з редукуючого, або з нередукуючого кінця полісахаридного ланцюга і акцесорні ферменти, ацетилестерази і/або естерази, що гідролізують глікозидні зв'язки лігніну. Приклади естераз можуть включати естеразу кумарової кислоти та естеразу ферулової кислоти (Умопод еї а!., 1988, Містобріо!. Веу. 52:305-317; ТепКапеп апа Рошапеп, 1992, Бідпітісапсе ої евівгазез іп Ше дедгадайогп ої хуїап5, іп Хуїап5 апа Хуїапазев, Мівзег єї аї., єд5., ЕІвемівї, Мем мок, М.У., рр. 203- 212; Соцдніап апа Налієжшосй, 1993, НетісеШіозе апа НетісеїшШіазез5, Ропапа, І опдоп, ОК;

Вііднат еї аї., 1996, НетісеїІшШавзев5: Оімегейу апа арріїсайоп5, іп НапарооК оп Віоєїнапо!:

Ргодисійп апа ІЛіїїганоп, УУуутап, ед., Тауїюг 8. Егапсів, ММазпіпаїюп, О.С., рр. 119-141).

Придатні геміцелюлази для застосування з композиціями і/або способами даного розкриття включають, наприклад, ксиланази, арабінофуранозидази, ацетилксиланестерази, глюкуронідази, ендогалактази, мананази, ендо- або екзоарабінази, екзогалактанази та їхні суміші. Приклади діючих усередині геміцелюлаз і допоміжних ферментів включають, без обмежень, ендоарабінаназу, ендоарабіногалактаназу, ендоглюканазу, ендомананазу, ендоксиланазу і фераксанендоксиланазу. Приклади геміцелюлаз, що діють зовні, і допоміжних ферментів включають, без обмежень, а-іІ-арабінозидазу, В-І-арабінозидазу, а-1,2-1- фукозидазу, а-О-галактозидазу, В-О-галактозидазу, В-ЮО-глюкозидазу, В-ЮО-глюкуронідазу, В-О- манозидазу, В-ЮО-ксилозидазу, екзоглюкозидазу, екзоцелобіогідролазу, екзоманобіогідролазу, екзомананазу, екзоксиланазу, ксилан а-глюкуронідазу і коніферин рД-глюкозидазу. Приклади естераз включають, без обмежень, ацетилестерази (ацетилгалактанестеразу, ацетилмананестеразу й ацетилксиланестеразу) і арилестерази (естеразу кумарової кислоти і естеразу ферулової кислоти).

У конкретних аспектах геміцелюлаза є діючою зовні геміцелюлазою. Переважно, діюча зовні геміцелюлаза має здатність гідролізувати геміцелюлозу при кислих умовах, наприклад, при або нижче рн 7.

У конкретних аспектах геміцелюлазу додають в ефективній кількості. Наприклад, геміцелюлазу додають у мультиферментні сумішки даного розкриття в кількості приблизно 0,001 ваг. 965 або більше, приблизно 0,002 ваг. 95 або більше, приблизно 0,0025 ваг. Уо або більше, приблизно 0,005 ваг. 95 або більше або приблизно 0,01 ваг. 96 або більше щодо ваги сухої речовини в повному середовищі для ферментації. В іншому прикладі геміцелюлазу додають у мультиферментні сумішки даного розкриття в кількості від приблизно 0,001 ваг. 95 до

Ко) приблизно 5,0 ваг. 95, наприклад, від приблизно 0,025 ваг. 95 до приблизно 4,0 ваг. 95, від приблизно 0,005 ваг. 95 до приблизно 2,0 ваг. 95 щодо ваги сухої речовини в повному середовищі для ферментації. 6.3.2.1. Ксиланази

Ферментні сумішки цього розкриття необов'язково включають одну або більше ксиланаз.

Вираз "ксиланаза" як використовується в цьому документі відноситься до будь-якої ксиланази, прирахованої до або згідно ЕС 3.2.1.8. Придатні ксиланази включають, наприклад, ксиланазу

СаідосейШт зассНагоїуїїсит (І ші еї аї., 1990, Аррі. Епмігоп. МістобріоІї. 56(9)2677-2683), ксиланазу Тпептайда тагййта (М/піегпанег 85 Гіереї, 1995, Аррі. Епмігоп. Місгобіої. 61(5):1810-- 1815), ксиланазу Тпегтайода 5р. штам БО55-В.1 (бітрзгоп евї а!., 1991, Віоснет. 9. 277, 413-417), ксиланазу ВасШизх сігсшапвь (Вс) (патент США Мо 5405769), ксиланазу Азрегоїи5 підег (Кіпозпйа еї аї., 1995, У. Регтепі. Віоепао. 79(5):422-428); ксиланазу 5ігеріотусез Імідап5 (Зпагеск еї аї., 1991, Сбепе 107:75-82; Могозоїї єї а!., 1986, Віоспет. У. 239:587-592; КіІнерієї! еї аї., 1990,

Віоспет. У. 287:45-50); ксиланазу Васійн5 5,ибійї5 хуїапазе (Вепіег еї аЇ., 1983, Сепе 26(1):59- 65); ксиланазу СеПшШотопаз їті (Сіагке еї аїІ., 1996, РЕЕМ5 Місгобіо!. Ген. 139:27-35), ксиланазу

Реєидотопаз Пиогезсепе (Сірет єї аЇ., 1988, 9У. Сеп. МісторіоІї. 134:3239-3247); ксиланазу

Сіовігідінт (ШептосеПйнт (Оотіпдиє? еї аіІ.,1995, Маї. Зігисі. Віо!. 2(7):569-76); ксиланазу Васійи5 ритіш5 (Миуепз еї аї!., 2001, Аррі. Місгобіо!. Віоїесн. 56:431-434; Мапа еї а1І.,1988, Мисівєїс Асій5

Кез. 16(148):7187); ксиланазу Сіовігідішт асершуїїсит Р262 (2арре еї аї., 1990, Мисієвїс Асіа5

Кев. 18(8):2179) або ксиланазу Тгісподегта Пагліапит (Козе еї аї., 1987, 9. Мої. Вісі. 194(4):755-- 756).

Ксиланази можна відповідно одержати з ряду джерел, включаючи, наприклад, грибні і бактеріальні організми, такі як Азрегойив5, Оіврогоїгіспит, Репісіййшт, Меигозрога, Еизагішт,

Тпісподепгта, Нитісоїа, Тпегтотусев5 і Васіййи5. Конкретні комерційно доступні препарати, що включають ксиланазу(ий) можна також використовувати в композиціях і способах даного розкриття; вони включають ксиланазу Мийескв, | атіпех? ВО, та ЗрегутеФ СР (Бапізсо 5,

Сепепсог), і СеїПисіавкю, і Мізсогутеб (Момо7утез А/5).

У конкретних аспектах ксиланаза не володіє зберігаючою активністю р-ксилозидази і/або перетворювальною активністю В-ксилозидази. Фермент можна протестувати на зберігаючу проти перетворювальної активності, як описано вище в розділі 6.3.1.5. 60 6.3.2.2. ВД-Ксилозидази

Ферментні сумішки даного розкриття необов'язково включають одну або більше р- ксилозидаз.

Вираз "ВД-ксилозидаза" як використовується в цьому документі відноситься до будь-якої р- ксилозидази, прирахованої до або згідно ЕС 3.2.1.37. Придатні ВД-ксилозидази включають, наприклад Вхі! ТаїЇаготусе5 етегзопії (Кееп еї аїЇ.,, 2003, Віоспет. Віорпуз. Ке5. Соттип. 305(3):579-85); а також В-ксилозидази, отримані з сеобрасійи5 5івагоїпегпторпйиз (ЗпаПот еї аї., 2005, Віоспет. 44:387-397); Зсуїгаійдіит Шепторпішт (7апоеїо еї аї., 2004, 9. Іпа. Місгобіо).

Віотесппої. 31:170-176); Тісподегпта Ідпогит (5сптіді, 1988, Мешоадв Епгутої. 160:662-671);

Аврегуйив амжатогі (КигтакКкаКе еї аї!., 2005, Віоспіт. Віорпуз. Асіа 1726:272-279); АзрегоіПи5 мегзісоїог (Апагаде еї аї., Ргосез55 Віоспет. 39:1931-1938); бігеріотусез зр. (Ріпрпапіснакат еї а!., 2004, Мопа 9. Містобіо!. Віоїтесппої. 20:727-733); Тпеппоїода тагййта (Хие і 5пао, 2004,

Віотесппої. Гей. 26:1511-1515); ТПісподепта 5р. ЗМ (Кіт еї аї., 2004, 9. Містобіо!І. Віотесппої. 14:643-645); АзрегойШив5 підег (Одипійтеїп і Кейу, 1980, Віоїесппої. Віоепд. 22:1143-1154) або

РепісйШит моптанппі (Маївио еї а!., 1987, Адгіс. Віої. Снет. 51:2367-2379).

У конкретних аспектах В-ксилозидаза не володіє зберігаючою активністю В-ксилозидази. В інших аспектах рД-ксилозидаза володіє перетворювальною активністю ДрВ-ксилозидази. У ще додаткових аспектах В-ксилозидаза не володіє зберігаючою активністю рВ-ксилозидази, але володіє перетворювальною активністю В-ксилозидази. Фермент можна перевірити на зберігаючу проти перетворювальної активності, як описано вище в розділі 6.3.1.5. 6.3.2.3. І -л-арабінофуранозидази

Ферментні сумішки даного розкриття необов'язково включають одну або більше І -а- арабінофуранозидаз.

Як застосовано в даному документі вираз "І --арабінофуранозидаза" відноситься до будь- якого ферменту, класифікованого в або згідно ЕС 3.2.1.55. Придатну І-а-арабінофуранозидазу можна одержати, наприклад, з АзрегуйШив огулає (Митап 5 Впоз5іє, 2006, У. Іпа. Місгорбіо|.

Віоїеснпої. 33:247-260); Аврегодійиє воздає (О5піта єї аї., 2005, 9. Аррі. Сіусовсі. 52:261-265);

Васіив Бгеміє (Митап є Впов5іє, 2006, У. Іпа. Містобіо!І. ВіоїеснппоїЇ. 33:247-260); ВасшШив вівагоїпепторніїи5 (Кіт еї аї., 2004, 9). Містобріо!. Віоїесппої. 14:474-482); Війдобрасієгішт Бргеме (піп еї аї., 2003, Аррі. Епмігоп. Місгобіо!ї. 69:7116-7123; Вітідобасієтішт Іюпдит (Магооїев еї аї.,

Зо 2003, Аррі. Епмігоп. МістобріоІ. 69:5096-5103); Сіовзійдішт І ептосеїїшт (Тауог єї аї., 2006,

Віоспет. У). 395:31-37); Ризагішт охузрогит (Рападіоїои єї а!., 2003, Сап. У. Містобріо!. 49:639- 644); Ризапйит охузрогит Її. 5р. аіапійі (Митап 4 Впозіє, 2006, 4. Іпа. Місгобіо!. Віотесппої. 33:247- 260); Сеобрасіи5 вівагоїпепторнйшив5 Т-6 (Знаот еї аї., 2002, 9. Віої. Спнет. 277:43667-43673);

Ногдешт уцідаге (ее еї аї., 2003, 9. Віої. Спет. 278:5377-5387); Репісійшт спгузодепит (ЗаКатой еї а!., 2003, Віорпувз. Асіа 1621:204-210); Репісійшт 5р. (Вантап еї аї., 2003, Сап. у.

Містобіо!. 49:58-64); Реєидотопаєх сеїїшовза (Митап « Впозіє, 2006, у. Іпа. Містобіої!. Віотеснпо). 33:247-260); ВПіготисог ривзіїйшє (Ванйтап еї аїЇ., 2003, Сагропуаг. АВез. 338:1469-1476); зігеріотусев сНаптеивзіз (Митап 4 Впозіє, 2006, 9. Іпа. Містобіої. Віоїесипої. 33:247-260); зігеріотусев ІШептоміоїасив (Митап а Віовіє, 2006, у). Іпа. Місгобіо!ї. Віоїесппої. 33:247-260);

Тпептоапаєгобрасієг еіпапоїїсив (Митап є Вповзіє, 2006, у. Іпа. Містобіо!. Віоїесппої. 33:247-260);

Тпепторасійив5 хуїапіпуйсив (Митап 5 Впозіє, 2006, У. Іпа. Містобріої. Віоїесппої. 33:247-260);

Тпептотопозрога Тизса (Типсег і ВаїЇ, 2003, Роїїа Місгоріо!. (Ргапа) 48:168-172); Тпептоїода татййта (Міуагакі, 2005, Ехігтеторпіїєз 9:399-406); Тісподепта 5р. 5 (дип еї аї!., 2005, Адігіс.

Спет. Віоїесппої. 48:7-10); Азрегоїйи5 Камаснії (КозекКі єї аї., 2006, Віоспіт. Віорпув. Асіа 1760:1458-1464); Ривагішт охуврогит Її. вр. аіапійі (Снасоп-Мапйіпе? еї аї., 2004, РНузіої. Мої.

Ріапі Раїної. 64:201-208); ТПнептобасіїив5 хуїапінуїіси5 (Оересне еї аї., 2002, Ргоївїп Епо. 15:21-28);

Нитісоїа іпзоЇїепе (богепбзеп єї аї., 2007, ВіоїесйпоїЇ. Ргод. 23:100-107); Мепрінв аідапіви5 (богепзеп еї аї., 2007, Віоїесппої. Ргод. 23:100-107) або Карпапизх заїїмив (Коїаке еї аї., 2006, 4.

Ехр. Вої. 57:2353-2362).

У певних аспектах І --арабінофуранозидаза не має зберігаючої рД-ксилозидазної активності.

В інших аспектах І -4-арабінофуранозидаза має перетворювальну ВД-ксилозидазну активність. У ще одних аспектах І-а-арабінофуранозидаза не має зберігаючої р-ксилозидазної, але має перетворювальну ДВ-ксилозидазну активність. Фермент можна перевірити на зберігаючу у порівнянні з перетворювальною активністю, як описано в розділі 6.3.1.5 вище. 6.3.3. Акцесорні білки

Ряд поліпептидів з активністю, що підсилює целюлолітичну, можна також використовувати разом з вищезгаданими ферментами і/або целюлолітичними білками для подальшого розкладання целюлозного компонента біомаси субстрату (дивися, наприклад, Вгідпат еї аї., 1995, іп НапароокК оп Віоєїйтапо! (Спапез Е. М/утап, ей.), рр. 119-141, Тауюг 4 Егапсів, 60 УМ/авпіпдіоп 0.С.; І ее, 1997, 9. Віотесппо!. 56: 1-24).

Оптимальні кількості таких поліпептидів з активністю, що підсилює целюлолітичну, і целюлолітичних білків, залежать від ряду факторів, що включають, без обмеження, специфічну суміш компонентних целюлолітичних білків, целюлозний субстрат, концентрацію целюлозного субстрату, попереднюйії) обробку(и) целюлозного субстрату, температуру, час і рН, а також природу ферментуючого організму.

Ферментативні сумішки/композиції даного розкриття можуть, наприклад, відповідно додатково включати один або більше акцесорних білків. Приклади акцесорних білків включають, без обмеження, мананази (наприклад, ендомананази, екзомананази і р- маннозидази), галактанази (наприклад, ендо- і екзогалактанази), арабінази (наприклад, ендоарабінази і екзоарабінази), лігнінази, амілази, глюкуронідази, протеази, естерази (наприклад, естерази ферулової кислоти, ацетилксиланестерази, естерази кумарової кислоти або пектинметилестерази), ліпази, глюкозидгідролазні поліпептиди сімейства 61, ксилоглюканази, СІР'Т, СІР2, своленін, експансини і руйнуючі целюлозу білки. Приклади акцесорних білків можуть також включати СІР1-подібні білки, СІР2- подібні білки, дегідрогенази целобіози і пероксидази, що містять марганець. У певних варіантах здійснення білки, що руйнують целюлозу, є зв'язуючими целюлозу модулями. 6.4 Ферменти з перетворювальною В-ксилозидазною активністю

Згідно з даним розкриттям фермент з перетворювальною В-ксилозидазною активністю застосовують для зменшення утворення АХР (наприклад, ЕХР) у 55Е-реакціях. Таким чином, дане розкриття відноситься в одному аспекті до композиції, що включає щонайменше один перетворювальний В-ксилозидазний поліпептид. В іншому аспекті дане розкриття відноситься до способу одержання бажаного продукту ферментації в 55Е-реакції що включає культивування повного середовища для ферментації, причому зазначене повне середовище для ферментації включає щонайменше один перетворювальний р-ксилозидазний поліпептид.

Придатні перетворювальні ДВ-ксилозидазні поліпептиди можна вибрати з таких, що є членами глікозидгідролазної сімейства 43 ("ЗНА3"). Сімейство ферментів ЗН4З має ряд відомих активностей. Наприклад, сімейство ферментів 5Н4АЗ може бути такою, що класифікована по ЕС 3.2.1.55, і може мати І-а-арабінофуранозидазну активність. В інших прикладах сімейство ферментів ЗН4З3 може бути такою, що классифікована по ЕС 3.2.1.99, і може мати

Зо ендоарабіназну активність. У ще одному прикладі сімейство ферментів ЗН4АЗ може бути класифікована по ЕС 3.2.1.145 і може володіти галактан-1,3-с-галактозидазною активністю. В інших прикладах сімейство ферментів 5Н4З3 може бути класифікована по ЕС 3.2.1.37 і може володіти В-ксилозидазною активністю. У той час як сімейство зН4АЗ ДВ-ксилозидаз, таких як описані вище, часто може тільки здійснювати перетворювальний гідроліз, повідомляли, що різні

В-ксилозидази із родин ОНЗ, -39, -52 і -54, на відміну, мають зберігаючу активність і здатні здійснювати як реакцію гідролізу, так і реакцію трансглікозилювання. (5Іпааїї еї аї., 2006, Аррі.

Місгобіо!. Віоїтесппої. 73:582-590).

Сімейство ферментів ЗН4АЗ звичайно виявляє п'ятилопатеву В-пропелерну тривимірну конформацію. "Пропелерна" частина структури грунтується на п'ятикратній повторності структури у формі "лопаті", що включає чотири скручені В-шари. Каталітична загальна основа, аспартат, каталітична загальна кислота, глютамат і залишок аспартата, що регулює рКа загальної основи, були визначені за кристалічною структурою Сеїїмібгіо іаропісив5 СіАгр4ЗА і були підтверджені сайт-специфічним мутагенезом (дивися, Мигі270 еї аї., 2002, Маї. бігисі. Віої. 9(9) 665-8). Каталітичні залишки розподіляються в трьох консервативних блоках, що широко рознесені по всій амінокислотній послідовності (Ропз еї аї., 2004, Ргоїеіп5: Зігисіиге, Еипсіоп і

Віоіптоптаїйсв5 54:424-432). Для В-ксилозидазних ферментів сімейства ОНАЗ прогнозовані каталітичні залишки виділені жирним шрифтом і підкреслені в послідовностях на Фігурі 32.

Кристалічна структура ксилозидази Сеобасійн5 5івагоштепторпйиз5 (Вгих еї аї. 2006, 9. Мої. Віо. 359:97-109) припускає кілька додаткових залишків, що можуть бути важливими для субстратного зв'язування в цьому ферменті.

Як описується в розділі 6.3.1.5 вище перетворювальну В-ксилозидазну активність можна визначати придатними методами.

Таким чином, у конкретних аспектах фермент з перетворювальною В-ксилозидазною активністю в даному документі є членом сімейства ЗН4і3. Наприклад, фермент є поліпептидом

Емаз0, РІ4ЗА, Ем4ЗЕ, ЕГм43В, АМЗА, Ео43А, С243А або ХупВ3. Такі поліпептиди описані нижче. 6.4.1. Поліпептиди Ем430

У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною В-ксилозидазною активністю являє собою Ем430 поліпептид. Амінокислотна послідовність Ем430 (5ЕО ІЮ МО:2) показана на

Фігурі 198 і в першому рядку на Фігурі 32. 5ЕО ІЮ МО:2 є послідовністю незрілого Ем430. Рм430 60 має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від 1 до 20 послідовності

ЗЕО ІЮ МО:2 (підкресленої на Фігурі 198); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам від 21 до 350 послідовності «ЕО ІЮ МО:2. Прогнозовані залишки консервативних доменів виділені жирним шрифтом на фігурі 198. В аналізі, що використовує р-нітрофеніл-В-ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати, було показано, що Ем430 має В-ксилозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або 037, або 071; 0155 і Е251.

Як використовується в даному документі ""м43О0 поліпептид" відноситься до поліпептиду і або його варіанту, що включає послідовність із щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 У», 88 90, 89 ФУ, 90 о, 91 У, 92 90, 93 90, 94 9, 95 Фо, 96 9, 97 90, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовностей з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 або 320 сусідніми амінокислотними залишками від 21 до 350 5ЕО ІЮ МО:2. Гм430 поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Ем430 у залишках 037 або 071; 0155 і Е251. Ем430 поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 95, 75 90, 80 9о, 85 о, 90 Уо, 95 95, 98 95 або 99 95 амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше, або всіх дев'яти з Ем430О, Бо43А, 5743А, РІ4З3А, Ем4ЗА, Ем4ЗВ,

АТ4ЗА, РІ4З3В і Ем4ЗЕ, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Ем430 поліпептид відповідно включає цілюом прогнозований консервативний домен нативного Ем430, як показано на Фігурі 198. Типовий Ем430 поліпептид даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 95, 86 95, 87 У», 88 90, 89 ФУ, 90 о, 91 У, 92 90, 93 90, 94 9, 95 Фо, 96 9, 97 90, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичністю зі зрілою Ем430 послідовністю, показаною на Фігурі 198. Ем430 поліпептид даного винаходу відповідно має В-ксилозидазну активність. У конкретних варіантах здійснення винаходу поліпептид Ем430 даного винаходу має перетворювальну В-ксилозидазну активність. 6.4.2. Поліпептиди РІ4ЗА

У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною р-ксилозидазною активністю є поліпептидом РІ4ЗА. Амінокислотна послідовність РІ4ЗА (ЗЕО ІЮО МО:8) показана на Фігурі 22В і в четвертому рядку Фігури 32. 5ЕБЕО ІЮ МО:8 є послідовністю незрілого РІ4ЗА. РІ4ЗА має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам з 1 до 20 5ЕО ІЮ МО:8 (підкреслені на Фігурі 228); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення

Ко) зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам від 21 до 445 5ЕО ІЮ МО:8. Прогнозовані залишки каталітичних доменів виділені жирним шрифтом, прогнозовані залишки доменів зв'язування вуглеводів виділені заголовними буквами а також прогнозовані лінкерні залишки, що розділяють каталітичний домен і домен зв'язування вуглеводів, виділені курсивом на Фігурі 22В. В аналізі, що використовує р-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати було показано, що РІЗА має ВД-ксилозидазну активність.

Прогнозованими каталітичними залишками є: або 032 або 060; 0145 і Е196.

Як використано в даному документі "поліпептид РІ43А" відноситься до поліпептиду і/або його варіанту, що включає послідовність щонайменше з 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 95, 8895, 8995, 90 96, 91 95, 92 96, 93 96, 94 96, 95 96, 96 96, 97 Уо, 98 9о, 9995 або 100 95 ідентичністю послідовностей з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 сусідніми амінокислотними залишками з 21 по 445 5ЕО ІЮ МО:8.

РІ4ЗА поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним РІ43А у залишках 032 або

О0б6о; 0145 і Е196. РІ4ЗА поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 95, 75 95, 80 95, 85 95, 90 9, 95 Фо, 98 95 або 99 95 амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше, або в усіх дев'яти з Ем430), Ео43А, (2243А, РІ4ЗА, Ема4ЗА, Ем4ЗВ,

АТ4ЗА, РІ4З3В і Ем4ЗЕ, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. РІ43А поліпептид відповідно включає цілююм прогнозований консервативний домен нативного РІ4ЗА, показаного на Фігурі 228. Типовий РІ4ЗА поліпептид даного винаходу містить послідовність із щонайменше 85 95, 86 95, 87 95, 88 бо, 89 95, 90 90, 91 Фо, 92 95, 93 90, 94 Фо, 95 95, 96 95, 97 Фо, 98 95, 99 95 чи 100 95 ідентичністю зі зрілою РІ4ЗА послідовністю, показаною на Фігурі 22В. РІ4ЗА поліпептид даного винаходу відповідно має В-ксилозидазну активність. У конкретних варіантах здійснення РІ4ЗА поліпептид даного винаходу має перетворювальну В-ксилозидазну активність. 6.4.3. Поліпептиди Ем4З3Е

У конкретних варіантах здійснення фермент з перетворювальною ДВ-ксилозидазною активністю є Ем4ЗЕ поліпептидом. Амінокислотна послідовність Ем4З3Е (ЗЕО ІЮО МО:10) показана на Фігурі 23В і в дев'ятому рядку Фігури 32. 5ЕО ІЮ МО:10 є послідовністю незрілого Ем4ЗЕ.

Ем4З3Е має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам з 1 до 18 5ЕО ІЮ

МО:10 (підкреслені на Фігурі 238); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для 60 утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам з 19 до 530 5ЕО ІЮ МО:10.

Прогнозовані залишки каталітичних доменів виділені жирним шрифтом на Фігурі 238. В аналізі, що використовує р-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати, було показано, що Ем43Е має ДВ-ксилозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або 040 або 071; 0155 і Е242.

Як застосовано в даному документі "Рм43Е поліпептид" відноситься до поліпептиду і/або його варіанту, що містить послідовність із щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 95, 8895, 8995, 90 96, 91 95, 92 96, 93 96, 94 96, 95 96, 96 96, 97 Уо, 98 9о, 9995 або 100 95 ідентичністю послідовностей з щонайменше, 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500 сусідніми амінокислотними залишками з 19 по 530 5ЕО ІЮ

МО:10. Рм43Е поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Ем43Е у залишках раб або 071; 0155; і Е242. Гм4З3Е поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 95, 7596, 80 95, 85 95, 90 9, 95 95, 98 95 або 99 95 амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше, або усіх дев'яти з Ем430, Бо43А, 743А, РІ4ЗА,

Ем4ЗА, Ем43В, АГЗА, РІ4ЗВ і Ем4ЗЕ, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Ем4ЗЕ поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного Ем4З3Е, показаний на Фігурі 238. Типовий Ем43Е даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 965, 86 95, 87 У», 88 90, 89 ФУ, 90 о, 91 У, 92 90, 93 90, 94 9, 95 Фо, 96 9, 97 90, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичністю зі зрілою Ем4З3Е послідовністю, показаною на Фігурі 238. Ем43Е поліпептид даного винаходу відповідно має В-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення Ем4ЗЕ поліпептид даного винаходу має перетворювальну В-ксилозидазну активність. 6.4.4. Поліпептиди Ем43В

У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною р-ксилозидазною активністю є

Ем43В поліпептидом. Амінокислотна послідовність Ем43В (5ЕО ІЮ МО:12) показана на фігурі 248 і в шостому рядку Фігури 32. 5БО ІО МО:12 є послідовністю незрілого Ем43В. Рм43В має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам з 1 до 16 5ЕО ІЮ МО:12 (підкреслені на Фігурі 24В); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам з 17 по 574 5ЕО ІЮ МО:12. Прогнозовані залишки каталітичних доменів виділені жирним шрифтом на Фігурі 24В. В аналізі, що

Зо використовує р-нітрофеніл-В-ксилопіранозид і/або р-нітрофеніл-а-І -арабінофуранозид як субстрати, було показано, що Ем43В володіє як В-ксилозидазною, так і 1-а- арабінофуранозидазною активністю. Було показано, що вивільнення арабінози з розгалужених арабіно-ксилоолігомерів і збільшення вивільнення ксилози з олігомерних сумішей у присутності інших ксилозидазних ферментів. Прогнозованими каталітичними залишками є: або 038 або рбав; 0151 і Е236.

Як використовується в даному документі "Ем43В поліпептид" відноситься до поліпептиду і або його варіанту, що включає послідовність із щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 У», 88 90, 89 ФУ, 90 о, 91 У, 92 90, 93 90, 94 9, 95 Фо, 96 9, 97 90, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовностей з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 або 550 сусідніми амінокислотними залишками з 17 по 472 5ЕО

ІО МО:12. Ем43В поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Ем43В у залишках рз38 або 068; 0151 і Е236. Гм43В поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 95, 7596, 80 95, 85 95, 90 9, 95 95, 98 95 або 99 95 амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше, або усіх дев'яти з Ем430, Бо43А, 743А, РІ4ЗА,

Ем4ЗА, Ем43В, АТЗА, РІ4ЗВ, і Ем4ЗЕ, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Ем43В поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного Ем43В, показаного на Фігурі 248. Типовий Ем43В поліпептид даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю зі зрілою Ем43В послідовністю, показаною на Фігурі 248.

Ема3В поліпептид даного винаходу відповідно має ДВ-ксилозидазну активності. У певних варіантах здійснення Ем43В поліпептид даного винаходу має перетворювальну р-ксилозидазну активність. 6.4.5. Поліпептиди АТЯЗА

У певних варіантах здійснення винаходу фермент з перетворювальною В-ксилозидазною активністю є АЇТ4ЗА поліпептидом. Амінокислотна послідовність АТЗА (5ЕО ІЮ МО:14) показана на Фігурі 258 і в сьомому рядку Фігури 32. 560 ІЮО МО:14 є послідовністю незрілого АЇ4ЗА.

Прогнозовані залишки консервативних доменів білка виділені жирним шрифтом на фігурі 258. В аналізі, що використовує р-нітрофеніл-а-І -арабінофуранозид, і за допомогою вивільнення бо арабінози при перетворенні ряду олігомерів, отриманих шляхом дії ендоксиланази, було показано, що АГТ4ЗА має І-а-арабінофуранозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або 026, або Ю58; 0139 і Е227.

Як використовується в даному документі "АТ43ЗА поліпептид" відноситься до поліпептиду і або його варіанту, що включає послідовність із щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 85 965, наприклад, щонайменше 86 95, 87 95, 88 95, 8995, 90 95, 91 95, 92 95, 93 95, 94 Уо, 95 905, 96 96, 97 Зо, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовності з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 300 сусідніми амінокислотними залишками

ЗБЕО ІЮ МО:14. АТ4ЗА поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним АЇ4ЗА у залишках 026 або Ю58; 0139 і Е227. АТ43А поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 7095, 7596, 8095, 8596, 9096, 95965, 9895 або 9995 амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше або усіх дев'яти з Ем430,

Ео43А, 5743А, РІ4ЗА, Ем4ЗА, Ем43В, АТ4ЗА, РІ4ЗВ і Ем4ЗЕ, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. АТЗА поліпептид відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного АїТ4ЗА, показаного на Фігурі 258. Типовий Ем43В даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 95, 86 95, 87 Уо, 88 Ус, 89 Уо, 90 У, 91 Уо, 92 Ус, 93 Уо, 94 Фо, 95 о, 96 95, 97 Ув, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичністю зі зрілою АЇ43А послідовністю, показаною на

Фігурі 258. АТЗА поліпептид даного винаходу відповідно має р-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення АїЗА поліпептид даного винаходу має перетворювальну рД- ксилозидазну активність. 6.4.6. Поліпептиди Бо43А

У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною рВ-ксилозидазною активністю є

Ео43А поліпептидом. Амінокислотна послідовність Го43А (ЗЕО ІЮ МО:24) показана на фігурі 318 ї в другому рядку Фігури 32. 5ЕО ІО МО:24 є послідовністю незрілого РГо43А. Бо43А має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від ї до 17 5ЕО І МО:24 (підкреслені на Фігурі 318); відщеплення сигнальної послідовності прогнозується для утворення зрілого білка з послідовністю, що відповідає залишкам з 21 до 348 5ЕО ІО МО:24. Прогнозовані залишки консервативних доменів виділені жирним шрифтом на Фігурі 318. В аналізі, що використовує р-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як

Зо субстрати, було показано, що Бо43А має В-ксилозидазну активність. Прогнозованими каталітичними залишками є: або 037, або 072; 0159 і Е251.

Як використовується в даному документі "бо43А поліпептид" відноситься до поліпептиду і або його варіанту, що включає послідовність із щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 У», 88 90, 89 ФУ, 90 о, 91 У, 92 90, 93 90, 94 9, 95 Фо, 96 9, 97 90, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичністю послідовності з щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 або 320 сусідніми амінокислотними залишками з 21 по 348 5ЕО ІЮО МО:24. Го43А поліпептид переважно є незміненим у порівнянні з нативним Ро43А у залишках 037 або 072; 0159 і Е251. Ро43А поліпептид є переважно незміненим щонайменше в 70 95, 75 90, 80 9о, 85 о, 90 Уо, 95 95, 98 95 або 99 95 амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше або усіх дев'яти з Ем430, Бо43А, (3743А, РІ4ЗА, Гм43А, Ем43В, АТМЗА,

РІ4З3В і Ем4ЗЕ, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. ЕГо43А поліпептид відповідно включає цілююм прогнозований консервативний домен нативного Ео43А, показаного на Фігурі 318.

Типовий Ео43А поліпептид даного винаходу включає послідовність із щонайменше 85 95, 86 95, 87 95, 8895, 8995, 90 96, 91 95, 92 96, 93 96, 94 96, 95 96, 96 96, 97 Уо, 98 9о, 9995 або 100 95 ідентичністю зі зрілою Ео43А послідовністю, показаною на Фігурі 318. Бо43А поліпептид даного винаходу відповідно має В-ксилозидазну активність. У конкретних варіантах здійснення Бо43А поліпептид даного винаходу має перетворювальну В-ксилозидазну активність. 6.4.7. Поліпептиди 27274З3А

У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною р-ксилозидазною активністю є поліпептидом 243А. Амінокислотна послідовність (3243А (5ЕО ІЮ МО:22) показана на фігурі

ЗОВ їі на третьому рядку Фігури 32. 5ЕО ІЮ МО:22 є послідовністю незрілого 572743А. 5243А має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає залишкам від ї до 18 5ЕО І МО:22 (підкреслену на Фігурі 308); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 340 5ЕО ІЮО МО:22. Прогнозовані залишки консервативних доменів виділені напівжирним шрифтом на Фігурі ЗОВ. Було показано, що (57243А має ВД-ксилозидазну активність, в аналізі що використовує р-нітрофеніл-р- ксилопіранозид, ксилобіозу або змішані лінійні ксилоолігомери як субстрати. Прогнозованими каталітичними залишками є: або ОЮ33, або Юб8; 0154; і Е243. 60 Як використовується в даному документі "поліпептид (3243А " відноситься до поліпептиду іМабо його варіантів, що включають послідовність що має щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250 або 300 суміжних амінокислотних залишків з 19 по 340 5ЕО ІО

МО:22. Поліпептид 5243А переважно є незмінним у порівнянні з нативним с5243А у залишках, або 033, або Юб68; 0154 і Е243. Поліпептид 57243А переважно є незмінним щонайменше в 70 95, 7596, 80 95, 85 95, 90 9, 95 95, 98 95 або 99 95 амінокислотних залишків, що є консервативними серед двох або більше, трьох або більше, чотирьох або більше, п'яти або більше, шести або більше, семи або більше, восьми або більше або усіх дев'яти Ем430О, ЕРо43А, (743А, РІ4ЗА,

Ем4ЗА, Ем43В, АТКЗА, РІ4ЗВ і Ем4ЗЕ, як показано у вирівнюванні на Фігурі 32. Поліпептид 5243А відповідно включає цілком прогнозований консервативний домен нативного с7243А, як показано на Фігурі ЗОВ. Ілюстративний поліпептид 5243А даного винаходу включає послідовність, що має щонайменше 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність до послідовності зрілого Бо43А, як показано на Фігурі ЗОВ.

Поліпептид (5243А даного винаходу відповідно має р-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення винаходу поліпептид 5243А даного винаходу має перетворювальну В- ксилозидазну активність. 6.4.8. Поліпептиди ХупВ3 0. «еагоїпегторпіи5

В інших аспектах фермент з перетворювальною ДрД-ксилозидазною активністю є поліпептидом ХупВЗ (0. віеагоїпептпорпйи5. Послідовність ХупВ3З 0. зіеагоїпегторпіїи5 представляють як 5ЕО ІЮ МО:25. ХупВ3З б. 5івагоїпегторпйи5 є 535-амінокислотою ферменту сімейства ЗН4АЗ з Сеорасійи5 5їеагоїпегторпййи5 Т-6. Фермент розщеплює окремі одиниці ксилози з невідновлюючих кінців ксилоолігомерів; три каталітичних залишки 015, 0128 і Е187, як було виявлено, є необхідними для його активності (Зпайот еї аї., 2005, Віоспетівігу, 44:387-- 397).

Як застосовано в даному документі "поліпептид ХупВЗ о. 5івеагоїпегторпййи5 " відноситься до поліпептиду і/або його варіантів, що включають послідовність, що має щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 У, 88 95, 89 95, 90 о, 91 о, 92 95, 93 о, 94 Уо, 95 о, 96 9о, 97 95, 9895, 9995 або 10095 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад,

Зо щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500 суміжних амінокислотних залишків 5ЕО ІЮ МО:25. Поліпептид ХупВЗ б. 5івагоїпегторпйи5 переважно є незмінним у порівнянні з нативним ХупВЗ3 у залишках 015, 0128 і Е187. Поліпептид ХупВЗ3 б. вівєагоїпеппорпйи5 даного винаходу відповідно має В-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид ХупВЗ (3. «5Іеагоїпепторпйи5 даного винаходу володіє перетворювальною р-ксилозидазною активністю. 6.4.9. Поліпептиди ХІбА Мібгіо 5р.

У певних варіантах здійснення фермент з перетворювальною р-ксилозидазною активністю є поліпептидом ХІбА Ммібгіо 5р. ХІОА Ммібгіо зр. є ВД-1,3-ксилозидазою зі штаму ХУ-214 Мірго 5р.

Як застосовано в даному документі "поліпептид ХіІоА Міргіо 5р." відноситься до поліпептиду іМабо його варіантів, що включають послідовність що має щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 суміжних амінокислотних залишків В-1,3- ксилозидази зі штаму ХУ-214 Мірпо 5р. (Штетоїй еї а!., 2008, Аррі. Епмігоп. Містобіо!ї. 74(1): 305- 308; СепрапК Ассеззіоп Мо. АВ300564). Поліпептид ХІоА Мібгіо 5р. даного винаходу відповідно має р-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид ХІбА Мібгіо 5р. даного винаходу має перетворювальну В-ксилозидазну активність. 6.5. Ферменти зі зберігаючою ВД-ксилозидазною активністю

Згідно із даним розкриттям фермент зі зберігаючою В-ксилозидазною активністю використовують для поліпшення або збільшення АХР продукції (наприклад, ЕХР) у 5З5Е- реакціях. Таким чином, дане розкриття належить в одному аспекті до композицій, що включають щонайменше один поліпептид зі зберігаючою В-ксилозидазною активністю. В іншому аспекті дане розкриття належить до способу одержання бажаної АХР сполуки або поліпшеної, або збільшеної кількості АХР продукту в 55Е-реакції що включає культивування повного середовища для ферментації, зазначене повне середовище для ферментації містить щонайменше один поліпептид з перетворювальною В-ксилозидазною активністю.

Придатні поліпептиди з перетворювальною В-ксилозидазною активністю можуть бути вибрані з таких, що є членами глікозидгідролазної сімейства З ("ЗНЗ"), ЗНЗО, ОНЗ1, ОНЗ9,

СН52, СН54 або СНІ116 родин ферментів. бо Як описано вище в підрозділі 6.3.1.5, зберігаюча р-ксилозидазна активність може бути визначена придатними аналізами.

Таким чином, у деяких аспектах фермент зі зберігаючою ДВ-ксилозидазною активністю в даному документі є членом сімейства: ЗНЗ, ЗНЗО, ЗНЗ, ЗНЗО, Н52, Н5Я4 або СНІ116.

Наприклад, фермент є поліпептидом ХіпО Азрегоїййи5 іаропіси5, Ем30А ЕРизагішт мепісШіоідев,

Е«ЗОВ Ризагішт мепісіПоїде5, ЕмЗ9А Ризагішт мепісіПШоіїде5, Ем39В Ризагцт мепісйіоіде5, ХупВ

ТНнептоапаегорасієї зассНагоїуїйсит, ХуїА Сеобрасіїйш5 5іеагоїпегторийи5 або Ху Ттгісподегта

Копіпадії (Нуросгеа Копіпдії). Такі поліпептиди описані нижче. 6.5.1. Поліпептиди ХіпО Азрегойиз5 |іаропіси5

У певних варіантах здійснення фермент зі зберігаючою ВрВ-ксилозидазною активністю є поліпептидом ХіпоО. Амінокислотна послідовність ХіпО (5ЕО ІЮ МО:40) показана на Фігурі 358.

ЗЕО ІЮ МО:40 є послідовністю незрілого ХіпО. ХІпО має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає від 1 до 17 залишкам 5ЕО ІЮ МО:40 (підкреслену на Фігурі 358); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає від 18 до 804 залишкам 5ЕО ІО МО:40.

Як застосовано в даному документі " поліпептид ХіпО " відноситься до поліпептиду і/або його варіантів, що включають послідовність що має щонайменше 8595, наприклад, щонайменше 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 або 750 суміжних амінокислотних залишків серед залишків від 18 до 804 5ЕБО ІЮ МО:40. Ілюстративний поліпептид ХіпО даного винаходу включає послідовність, що має щонайменше 85 95, 86 95, 87 95, 8895, 8995, 90 96, 91 95, 92 96, 93 96, 94 96, 95 96, 96 96, 97 Уо, 98 9о, 9995 або 100 95 ідентичність до зрілої послідовності ХіпО, як показано на Фігурі 358. Поліпептид ХіпО даного винаходу відповідно має р-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид

ХІпО даного винаходу має зберігаючу В-ксилозидазну активність. 6.5.2. Поліпептиди ЕмЗОА Ризагішт мепісіНоідев5

У певних варіантах здійснення фермент зі зберігаючою ДВ-ксилозидазною активністю є поліпептидом ЕмуЗб0А. Амінокислотна послідовність ХіпО (ЗЕО ІО МО:42) показана на Фігурі 36В.

ЗЕО ІО МО:42 є послідовністю незрілого ЕмЗОбА. ХІпО має прогнозовану сигнальну послідовність,

Зо що відповідає від 1 до 19 залишкам 5ЕО ІЮ МО:42 (підкреслену на Фігурі 368); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, яка відповідає від 20 до 537 залишкам 5ЕО ІО МО:42.

Як застосовано в даному документі "поліпептид ЕмЗ0А " відноситься до поліпептиду і/або його варіантів що включають послідовність яка має щонайменше 8595, наприклад, щонайменше 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500 суміжних амінокислотних залишків серед залишків 20-537 5ЕО ІЮ МО:42. Ілюстративний поліпептид Ем30А даного винаходу включає послідовність, що має щонайменше 85 95, 86 95, 87 Фо, 88 Уо, 89 Ус, 90 Фо, 91 95, 92 95, 93 Фо, 94 9о, 95 95, 96 9ь, 97 90, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичність до зрілої послідовності ЕмЗОА, як показано на Фігурі 368. Поліпептид ЕмЗ0А даного винаходу відповідно має рВ-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид ЕУЗ0А даного винаходу має зберігаючу В-ксилозидазну активність. 6.5.3. Поліпептиди Ем30ОВ Ризагішт мепісіНоідев5

У певних варіантах здійснення фермент зі зберігаючою ДрВ-ксилозидазною активністю є поліпептидом Ем30В. Амінокислотна послідовність Ем3ОВ (5ЕО ІЮ МО:44) показана на фігурі 378. 5БО ІЮ МО:44 є послідовністю незрілого Ем30В. Ем30ОВ має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає від 1 до 24 залишкам 5ЕО ІЮ МО:44 (підкреслену на Фігурі 37В); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність,

БО яка відповідає від 25 до 485 залишкам 5ЕО ІЮО МО:44.

Як застосовано в даному документі "поліпептид Ем30ОВ" відноситься до поліпептиду і/або його варіантів що включають послідовність яка має щонайменше 8595, наприклад, щонайменше 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 суміжних амінокислотних залишків серед залишків від 25 до 485 5ЕО ІЮ МО:44. Ілюстративний поліпептид Ем3ОВ даного винаходу включає послідовність, що має щонайменше 85 95, 86 95, 87 Уо, 88 95, 89 Фо, 90 Уо, 91 95, 92 9о, 93 9, 94 9, 95 9, 96 9», 97 Фо, 98 ФУ, 99 95 або 100 95 ідентичність до зрілої послідовності ЕмЗОВ, як показано на Фігурі 37В. Поліпептид Ем30ОВ даного винаходу відповідно має В-ксилозидазну бо активність. У певних варіантах здійснення поліпептид Ем3З0ОВ даного винаходу має зберігаючу Д-

ксилозидазну активність. 6.5.4. Поліпептиди Ем39А ЕРизагішт мепісіПоідев

У певних варіантах здійснення фермент зі зберігаючою ДВ-ксилозидазною активністю є поліпептидом Ем39А. Амінокислотна послідовність Ем39А (5ЕО ІЮ МО:46) показана на фігурі 388. 5БО ІЮ МО:46 є послідовністю незрілого Ем39А. Ем39А має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає від 1 до 19 залишкам 5ЕО ІЮ МО:46 (підкреслену на Фігурі 388В); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, що відповідає від 20 до 439 залишкам ЗЕО ІЮО МО:46.

Як застосовано в даному документі "поліпептид ЕмЗ9А " відноситься до поліпептиду і/або його варіантів що включають послідовність яка має щонайменше 8595, наприклад, щонайменше 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 або 400 суміжних амінокислотних залишків серед залишків від 20 до 439 5ЕО ІЮ МО:46. Ілюстративний поліпептид Ем3З9А даного винаходу включає послідовність, що має щонайменше 85 95, 86 95, 87 Фо, 88 Уо, 89 Ус, 90 Фо, 91 95, 92 95, 93 Фо, 94 9о, 95 95, 96 9ь, 97 90, 98 У, 99 95 або 100 95 ідентичність до зрілої послідовності Ем3З9А, як показано на Фігурі 388. Поліпептид Ем39А даного винаходу відповідно має рВ-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид ЕмУ39А даного винаходу має зберігаючу В-ксилозидазну активність. 6.5.5. Поліпептиди Ем39В Ризагішт мепісіПоідев5

У певних варіантах здійснення фермент зі зберігаючою ДВ-ксилозидазною активністю є поліпептидом Ем39В. Амінокислотна послідовність Ем39В (5ЕО ІЮ МО:48) показана на фігурі 398. 5БО ІЮ МО:48 є послідовністю незрілого Ем39В. Ем39В має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає від 1 до 18 залишкам 5ЕО ІО МО:48 (підкреслену на Фігурі 398); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, яка відповідає від 19 до 456 залишкам 5ЕО ІЮ МО:48.

Як застосовано в даному документі "поліпептид Ем39В" відноситься до поліпептиду і/або його варіантів що включають послідовність, яка має щонайменше 8595, наприклад, щонайменше 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 то, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300 або 350 суміжних амінокислотних залишків серед залишків від 19 до 456 5ЕБЕО ІЮО МО:48. Ілюстративний поліпептид Ем39В даного винаходу містить послідовність, що має щонайменше 85 95, 86 95, 87 Фо, 88 Уо, 89 Ус, 90 Фо, 91 95, 92 95, 93 Фо, 94 9о, 9595, 9695, 97 95, 9895, 9995 або 100 95 ідентичність до послідовності зрілого ЕмМ39В, як показано на Фігурі 398. Поліпептид Ем39В даного винаходу відповідно має р-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид Ем39В даного винаходу має зберігаючу Д- ксилозидазну активність. 6.5.6. Поліпептиди ХупВ Пептоапаеєгобасієг засспагоїуїйсит

У певних варіантах здійснення фермент зі зберігаючою ДВ-ксилозидазною активністю є поліпептидом ХупВ. Амінокислотна послідовність ХупВ (ЗЕО ІЮ МО:50) показана на Фігурі 408.

ХупВ не має прогнозованої сигнальної послідовності по алгоритму Зідпа! (доступний на: пЕру/Ллимли. сові. ш.ак).

Як застосовано в даному документі "поліпептид ХупВ" відноситься до поліпептиду і/або його варіантів, що включають послідовність, що має щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 У», 88 90, 89 ФУ, 90 о, 91 У, 92 90, 93 90, 94 9, 95 Фо, 96 9, 97 90, 98 90, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 суміжних амінокислотних залишків ЗЕО 10 МО:50.

Ілюстративний поліпептид ХупВ даного винаходу включає послідовність, що має щонайменше 85 95, 86 Фо, 87 Уо, 88 90, 89 о, 90 90, 91 9, 92 95, 93 У, 94 90, 95 90, 96 9, 97 Уо, 98 У, 99 96 або 100 95 ідентичність до послідовності ХупВ, як показано на Фігурі 40В. Поліпептид ХупВ даного винаходу відповідно має р-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид

ХупВ даного винаходу має зберігаючу рВ-ксилозидазну активність. 6.5.7. Поліпептиди ХуїА Сеорасійиз5 зіеагоїпегторнпі шив

У певних варіантах здійснення фермент зі зберігаючою ДВ-ксилозидазною активністю є поліпептидом ХУЇА. Амінокислотна послідовність ХУїА (ЗЕО ІЮО МО:52) показана на Фігурі 418.

Ху(А не має прогнозованої сигнальної послідовності по алгоритму зЗідпа! (доступний на: пЕр:/у/лммли.сЬв.агцш.ак), але має сигнальну послідовність, прогнозовану по алгоритму Опіргої (доступний на: пер:/млум. ипіргої.огу/ипірго), що відповідає від 1 до 18 залишкам 5ЕО ІО МО:52 (підкреслена); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має 60 послідовність, що відповідає залишкам від 19 до 705 5ЕО ІЮ МО:52.

Як застосовано в даному документі "поліпептид ХУЇА" відноситься до поліпептиду і/або його варіантів, що включають послідовність, яка має щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 9, 88 95, 89 90, 90 У, 91 9, 92 У, 93 Уо, 94 95, 95 У, 96 У, 97 У, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 або 650 суміжних амінокислотних залишків ЗЕО ІЮ

МО:52 або до залишків від 19 до 705 ЗЕО ІЮ МО:52. Ілюстративний поліпептид ХУуїА даного винаходу включає послідовність, що має щонайменше 85 95, 8695, 87 Зо, 88 о, 89 90, 90 9о, 9195, 9295, 9396, 9495, 9590, 9695, 97 90, 9895, 9995 або 10095 ідентичність до зрілої послідовності ХУуЇА, як показано на Фігурі 418. Поліпептид ХУуЇА даного винаходу відповідно має

ДВ-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид ХУуЇА даного винаходу має зберігаючу рД-ксилозидазну активність. 6.5.8. Поліпептиди Ху Тгісподегта Копіпадії (Нуросгеа Копіпаії)

У певних варіантах здійснення фермент зі зберігаючою ДВ-ксилозидазною активністю є поліпептидом ХуЇ/1. Амінокислотна послідовність Ху!1(ЗЕО І МО:54) показана на Фігурі 428.

ЗЕО ІЮО МО:54 є послідовністю незрілого Ху1. Хуї1ї має прогнозовану сигнальну послідовність, що відповідає від 1 до 21 залишкам 5ЕО ІЮ МО:54 (підкреслену на Фігурі 428); прогнозовано, що відщеплення сигнальної послідовності дає зрілий білок, що має послідовність, яка відповідає від 22 до 500 залишкам 5ЕО ІО МО:54.

Як застосовано в даному документі "поліпептид ХуЇ1" відноситься до поліпептиду і/або його варіантів, що включають послідовність, яка має, щонайменше 85 95, наприклад, щонайменше 86 95, 87 9, 88 95, 89 90, 90 У, 91 9, 92 У, 93 Уо, 94 95, 95 У, 96 У, 97 У, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність послідовності до щонайменше 50, наприклад, щонайменше 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 або 450 суміжних амінокислотних залишків серед залишків 22-500 5ЕО

ІЮ МО:54. Ілюстративний поліпептид Хуїї! даного винаходу включає послідовність, що має щонайменше 85 то, 86 то, 87 то, 88 то, 89 то, 90 то, 91 то, 92 то, 93 то, 94 то, 95 то, 96 то, 97 то, 98 95, 99 95 або 100 95 ідентичність до зрілої послідовності Ху!1, як показано на Фігурі 428.

Поліпептид Хуї! даного винаходу відповідно має В-ксилозидазну активність. У певних варіантах здійснення поліпептид Хуї/! даного винаходу має зберігаючу В-ксилозидазну активність. 6.6 Рекомбінантні способи одержання ферментів для застосування в З5Е

Зо 6.6.1. Нуклеїнові кислоти і вектори експресії

Природні або синтетичні полінуклеотидні фрагменти, що кодують ферменти для застосування в 55Е ("55Е фермент"), що включають поліпептид з перетворювальною В- ксилозидазною або інший фермент(и) з оцукрюючою активністю (наприклад, целюлаза або геміцелюлаза), можуть бути убудовані в гетерологічні конструкти і вектори нуклеїнових кислот.

Ці вектори можуть бути потім внесені, або репліковані в придатній клітині-хазяїні, включаючи, наприклад, клітини міцеліальних грибів, дріжджів, або бактеріальні клітини. Вектори і способи, розкриті в даному документі, можуть бути використані для експресії одного або більш 55Е ферменту(ів). Може бути використаний будь-який вектор, за умов його здатності до реплікації і життєздатності у клітинах, у які він внесений. Фахівцям у даній галузі техніки відомі багато придатних векторів і промоторів, у числі яких велика кількість доступних в продажі. Вектори клонування і вектори експресії докладно описані в літературі, наприклад, у Затбгоок еї аї., 2001, МоїІесшіаг Сіопіпо: А Гарогаюгу Мапиаї (СНІ. Ргевз5) і в АиМмзибеї еї аї., 2002, Зпогі Ргоїосої5 іп Моїесшіаг Віооду (Сипепі РгоїосоїІ5), зміст кожного, що стосується векторів експресії, однозначно включений посиланнями в даний документ. Інші ілюстративні вектори експресії, що підходять для клітин-хазяїнів грибів, описані в мап деп Нопавеї еї а1.,1991, Веппей і І азиге (едв.)

Моге Сепе Мапіриїайоп іп Рипді. Асадетіс Ргезв, рр. 396-428.

У рівні техніки відомо, що різні послідовності ДНК, що представляють інтерес, можуть бути убудовані в плазміди або вектори (разом іменовані в даному документі як "вектори"), використовуючи ряд стандартних способів. Як правило, наприклад, послідовність ДНК, що становить інтерес убудована у відповідний сайт рестрикційної ендонуклеази, використовуючи стандартні способи і при стандартних умовах. Такі способи і пов'язані способи субклонування знаходяться в об'ємі знань фахівця в даній галузі техніки.

Рекомбінантні міцеліальні гриби, що включають кодуючу послідовність для 55Е ферменту, можуть бути отримані за допомогою внесення гетерологічного конструкта нуклеїнової кислоти, що включає 5541: фермент, кодуючу послідовність ДНК, у генетичний матеріал клітини-хазяїна міцеліального гриба.

Як тільки одержують бажану форму послідовності нуклеїнової кислоти, кодуючу 55Е фермент, вона може бути факультативно модифікована в різних напрямках. Де послідовність залучає некодуючі фланкуючі області, фланкуючі області можуть бути піддані резекції, бо мутагенезу і т.д. Таким чином, переміщення, трансверсії, делеції і/або інсерції можуть бути виконані в послідовності, що зустрічається в природі.

Вибрана кодуюча послідовність 557 ферменту може бути убудована в придатний вектор відповідно до широко відомої рекомбінантної техніки, що може бути згодом використана для трансформації клітини-хазяїна міцеліального гриба, здатної до експресії 55Е ферменту.

Завдяки властивій генетичному коду виродженості, інші послідовності ДНК, що кодують головним чином такі ж або функціонально еквівалентні амінокислотні послідовності, можуть бути використані для клонування й експресії 55ЄЕ ферменту.

Дане розкриття також включає рекомбінантні конструкти нуклеїнових кислот, що включають одну або більше послідовностей нуклеїнових кислот, що кодують 5З5Е фермент як описано вище. Кожен конструкт відповідно містить вектор, такий як плазмідний або вірусний вектор, у який убудовується в передньому або задньому положенні послідовність розкриття.

Гетерологічний конструкт нуклеїнової кислоти може відповідно включати кодуючу послідовність ЗЕ ферменту: (ї) окремо; (її) у сполученні з додатковими кодуючими послідовностями, такими як, наприклад, послідовності, що кодують химерний білок або сигнальний пептид, де бажана кодуюча З5Е фермент послідовність є домінантною кодуючою послідовністю; (ії) у сполученні з однією або більше некодуючими послідовностями, такими як, наприклад, інтрони і контролюючі елементи, такі як, наприклад, промоторні і термінаторні елементи, або 5' і/або 3 нетрансльовані області, що впливають на експресію кодуючої послідовності у придатному хазяїні і/або (ім) у векторному оточенні або оточенні хазяїна, у якому кодуюча послідовність 554 ферменту є гетерологічною стосовно клітини-хазяїна.

У певних аспектах гетерологічний конструкт нуклеїнової кислоти використовують для переносу кодуючої 554: фермент послідовності нуклеїнових кислот у клітину іп міго, наприклад, клітину встановленої лінії міцеліальних грибів або дріжджів. Для тривалого одержання З5Е ферменту, стабільна експресія вважається за кращу. Звідси випливає, що будь-який спосіб, ефективний для створення стабільних трансформантів, може відповідно бути використаний у практиці даного винаходу, розкритого в даному документі.

Відповідні вектори звичайно оснащені послідовністю нуклеїнової кислоти, кодуючою селектовні маркери, сайтами інсерції і придатними контролюючими елементами такими як, наприклад, промоторні і термінаторні послідовності. Вектори можуть включати регулюючі послідовності, що включають, наприклад, некодуючі послідовності, такі як інтрони і контролюючі елементи, що функціонально зв'язані з кодуючими послідовностями, і які є ефективними для експресії кодуючої послідовності у клітині-хазяїні. Придатні контролюючі елементи включають, наприклад, промоторні і термінаторні елементи або 5' і/або 3' нетрансльовані області. Серед ряду векторів і промоторів, відомих фахівцям у даній галузі техніки, багато є доступними в продажі. Придатні вектори і промотори також описані в літературі, наприклад, у Затюогоок, еї аї., 2001, МоІесшаг Сіопіпа: А І арогаюгу Мапиа! (СНІ. Ргев5).

Типові промотори включають, наприклад, конститутивні промотори і індуцибельні промотори, такі як, без обмеження, промотор СМУМ, ранній промотор 5М40, промотор КБУ, промотор ЕЕ-1а, промотор, що включає тет-діючий елемент (ТЕЕ) у їеї-оп або їеї-оїї системі (див., наприклад, опис СіопТесп його ТебОпФ і Тесотже Аймапсей Іпаисіріе СбСепе Ехргезвіоп

Зузіет) або ДВ-актиновий промотор і металотіоніновий промотор, що може позитивно регулюватися додаванням визначених солей металів. Промоторна послідовність є ДНК- послідовністю, що впізнається визначеною клітиною-хазяїном міцеліального гриба для цілей експресії. Вона функціонально зв'язана з ДНК послідовністю, кодуючою 55Е фермент, що становить інтерес. Такий зв'язок позиціонує промотор стосовно ініціюючого кодона ДНК послідовності, кодуючої 554: фермент, що становить інтерес, у векторі експресії. Промоторна послідовність включає транскрипційні і/або трансляційні контролюючі послідовності, що опосередковують експресію 554 ферменту, що становить інтерес. Приклади включають промотори з генів, що кодують глюкоамілазу, а- амілазу або с-глюкозидазу Азрегойи5 підег, А. ажатогі або А. огу/ає; гени дра або ігр А. підшапве; гени срп1 або ігр1 Меигозрога сгазза; гени, що кодують аспарагінову протеіназу А. підег або КПпіготисог тіепеї; гени, що кодують СБ, сЬп2, ецді1, еді2 Н. |есогіпа або інші целюлази.

Вибір селектовного маркера буде залежати від клітини-хазяїна і придатних селектовних маркерів, що підходять для застосування в різних -клітинах-хазяїнах, відомих у даній галузі техніки. Ілюстративні селектовні маркерні гени включають агад з А. підшап5 або Н. |есогіпа, атаз з А. підшапв, руг4 з Мешигозрога сгазза або Н. іесогіпа, руго з АзрегоїйЇн5 підег або А. піашапв.

Інші придатні селектовні маркери включають, наприклад, ігрс, їгр1, оЇЇС31, піа0 або Ієи2, що включають у гетерологічні конструкти нуклеїнових кислот, застосовуваних для трансформації мутантного штаму, такого як, ігр", руг або Іе/" мутантний штам і т.ін. бо Такі селектовні маркери дають трансформантам здатність утилізувати метаболіт, що у противному випадку не метаболізується клітиною-хазяїном. Наприклад, ген атаз з Н. іесогіпа, що кодує фермент ацетамідазу, дозволяє трансформованим клітинам рости на ацетаміді, як джерелі азоту. У додатковому прикладі, селектовний маркер (наприклад, руго) може відновлювати здатність ауксотрофного мутантного штаму рости на селективному мінімальному середовищі. У ще іншому прикладі, селектовний маркер (наприклад, оїїс31) може давати трансформантам здатність рости в присутності інгібіторних лікарських засобів або антибіотиків.

Кодуючу послідовність селектовного маркера, відповідно клонують у плазміді з використанням загальноприйнятих у даній галузі техніки способів. Ілюстративні плазміди включають, без обмежень, руС18, рВК322, рКАХ і рОС100. Наприклад, плазмида ркАХ включає послідовності АМАГ. з А. підшапе, що уможливлюють реплікацію в А. підег.

Практичне здійснення даного розкриття буде використовувати, якщо конкретно не зазначене інше, стандартні методики молекулярної біології, мікробіології, рекомбінантної ДНК і імунології, що відомі з рівня техніки. Такі методики докладно описані в літературі. Див., наприклад, затрюргоок еї аї!., 2001, МоїІесшаг Сіопіпд: А Гарогаюгу Мапиаї (С5НІ. Ргезв); А!йзибеї еї аї., 2002, 15. поп Ргоїосоїв іп МоіІесшціаг Віоіоду (Ситепі Ргоїосої!в); Егезппеу, 2005, Сипиге ої Апітаї! Сеїв: А

Мапиаї! ої Вазіс Тесппідие (УМіеу-Гіз5) і Юцпп еї аїЇ., 2003, Зпогі Ргоїосої!5 іп Ргоївеіп Зсіепсе (УмМіеу). Усі патенти, патентні заявки, статті і публікації, згадані в даному документі, включені за допомогою посилань. 6.6.2. Організми-хазяїни і експресія білка

Забезпечені дійсним розкриттям клітини-хазяїни, сконструйовані для експресії 55Е білка, що становить інтерес для застосування в способах, описаних у даному документі. Придатні клітини- хазяїни включають будь-які мікроорганізми (наприклад, бактерія, одноклітинний організм, водорість, гриб (наприклад, дріжджі або міцеліальний гриб) або будь-які інші мікроорганізми).

Придатна клітина-хазяїн є переважно бактерією, дріжджами або клітиною міцеліального гриба.

Придатні роди бактерій включають, без обмежень, ЕбсПегіспіа, Васійи5, ІГасіобасіййив5,

Рзейдотопаз і 5ігеріотусез. Придатні види бактерій включають, без обмежень, Е5сПегіспіа соїї,

Васійив5 5ибіййв5, Васійив Іспепітогтів, І асіобасійи5 Бгемі5, Рзендотопаз аєгидіпоза і зігеріотусев

Імідапв.

Придатні роди дріжджів включають, без обмежень, Засспаготусев5, Зспі7озасспаготусев,

Сапаїда, Напзепшіа, Ріспіа, Кіпумеготусе5 і Рпайа. Придатні види дріжджів включають, без обмежень, Засспаготусез сегемівіає, Зспігозасспаготусе5 ротрбе, Сапаїда аїбісап5, Напзепиша роїутогрпа, Ріспіа разіогі5, Р. сападепвзі5, Кіпумеготусев5 тагхіапиз і Ріайіа гподогута.

Придатні міцеліальні гриби включають усі міцеліальні форми підвідділу Ешптусоїіпа.

Придатні роди міцеліальних грибів включають, без обмежень, Асгетопішт, Абврегойив5,

З5 Ацгеобравійішт, Вієїкапаєга, Сепрогпорві5, СНгузорогішт, Соргіпи5, Согіоїшб5, Согупазсив,

Спаепотішт, Стуріососсив, НБіобавідіит, Ризайит, СсірбрегеїПа, Нитісоїа, Мадпаропне, Мисог,

Мусеїорпійога, Мисог, Меосаїйтавіїх, Мейгозрога, Раесіотусев5, РепісйШіиит, РНапегоснаєеє!е,

РІеріа, Ріготусев, Рієцтоїш5, ЗсуїаІідійт, ЗспігорпуПйит, Брогоїіснпит, Таіаготусев,

Тпептоазсиз, Тпіеіаміа, Тоїуросіадіит, Тгатегез і Тгісподегта.

Придатні види міцеліальних грибів включають, без обмежень, Авзрегдйи5 ауатогі,

Аврегой 5 Тштідаїив5, Азрегоіив5 Тоеїйдив, АзрегойШив5 |аропісив, Азрегойив5 підшапв, Азрегойив підег, АзрегдіЙив5 огугає, Спгузовзрогішт ІсКпомжепвзе, Ризагпцт бБасігайоіде5, Ризагпцт сегеаїв,

Еивагтішт стооКмеПепбзе, Еивайцйт ситогит, Еивзапйцт дгатіпеагит, Ривзагпйт дгатіпит,

Еизатцт Пеїегозрогит, Еизагішт педипаї, Ризагйшт охузрогит, ЕРизагішт геїйсшацшт, Ризагт гозецт, Еизапйцт затбрисіпит, Еивзагпит загсоспгоицт, Ризапйцт зрогоїпспіоіїде5, Ризагійт 5шрпигтейт, Еивзапйцт гшо5ит, Еивагішт іспоїпесіоїде5, Ризагт мепепашт, ВієЖапаеєга адивєїа, Сепрогпорвзів апеїїпа, Сепрогіорвзіз апеїіпа, Сепрогіорзіє сагедієа, Сегірогіорвів дімезсепв, Сегірогіорзів раппосіпіа, Сегірогпіорвів гімціоза, Сегірогіорзіз зибіша, Сепрогіорзів зирмептізрога, Соргіпив сіпегеив, Согіоїшв Пігтешщив, Нитісоїа іпзоЇеєпв5, Нитісоїа Іапидіпоза, Мисог тієйеї, Мусеїйорпійога ІШепторНпіа, Мецйгобзрога стабзза, Мешгозрога іпівптеєдіа, РепісйШит ригритодепит, РепісіШит сапезсеп5, РепісШіит з5оїйит, Репісіййшт пісшовит, Рнапегоснаєїе спгузозрогішт, РНПебіа гадіате, Рівитоїшв егупаіїї, Таіаготусе5 Памив, ТНівїаміа іетевігв, Тгатеїев5 мійоза, Тгатеїев мегвісоо!, ПТіісподепта Пагліапит, Тіісподепта Копіпдії, Тісподетта

Іопдібгаспіаєшт, Тгісподегіта геезеї і Тгісподегта мігіде.

Після того як рекомбінантний конструкт 55Е ферменту був отриманий, наприклад, відповідно до способів, описаних в даному документі, конструкт може бути трансформований у придатну клітину-хазяїна, при використанні рутинної методології. 6.6.3. Способи виділення і/або очищення ферментів

У певних аспектах рекомбінантний 55:7:-: фермент конструюють із сигнальною послідовністю бо так, щоб рекомбінантний З5Е фермент виділявся в середовище для культивування клітини-

хазяїна. У певних аспектах 55Е фермент, що становить інтерес, відновлюється у ферментативному бульйоні. Вираз "ферментативний бульйон", як застосовано в даному документі, відноситься до ферментного препарату, отриманого шляхом ферментації, котрий пізніше не піддається або піддається мінімальному відновленню і/або очищенню згодом.

Наприклад, мікробні культури вирощують до насичення, інкубують при умовах, обмежуючих вуглець, для того щоб уможливити синтез білка (наприклад, експресія ферментів), і після того як фермент виділяється в середовище для культивування клітин, ферментативний бульйон є єдиним, звідки З5Е фермент, що становить інтерес, може бути відновлений. Ферментативний бульйон, наприклад, може включати нефракціонований або фракціонований вміст ферментативних матеріалів, отриманих до кінця ферментації. Звичайно, ферментативний бульйон є нефракціонованим і включає використані середовища для культивування і клітинні залишки, що є присутніми після того як видаляють мікробні клітини (наприклад, клітини міцеліальних грибів), наприклад, центрифугуванням. У певних варіантах здійснення ферментативний бульйон включає використані середовища для культивування клітин, позаклітинні ферменти а також, або живі, або подавлені мікробні клітини. У певних варіантах здійснення ферментативний бульйон фракціонується для видалення мікробних клітин, і сам по собі включає використане середовище для культивування клітин і позаклітинні ферменти.

У певних аспектах часткове або повне очищення 5З5Е ферменту може бути бажаним. У певних варіантах здійснення 55 фермент очищають до щонайменше 40 96, щонайменше 50 95, щонайменше 60 о, щонайменше 70 906, щонайменше 80 956, щонайменше 95 9565, щонайменше 98 95 або щонайменше 99 95 однорідності.

Однак, в інших аспектах 55Е фермент, що становить інтерес, може бути отриманий у клітинній формі (тобто частково або зовсім несекретованій), що потім може потребувати відновлення з клітинного лізита. У подібних випадках 55 фермент очищають від клітин, у яких він був отриманий, використовуючи способи, звичайно застосовувані в даному рівні техніки.

Приклади таких способів включають, без обмежень, афінну хроматографію (див., наприклад, мап Тіїбеитон еї а!., 1984, РЕВ5 І ей. 169:215-218), способи іонообмінної хроматографії (див., наприклад, Сбуаї єї аї., 1991, Віогезоигсе Тесппо!ї. 36:37-50; Нііе55 еї аї., 1983, ЄЕиг. У. Аррі.

Місгобріо!. Віотесппої. 17:314-318; Впікпарбнаї сеї а!., 1984, 9. Аррі. Віоспет. 6:336-345; ЕПои? еї аї.,

Зо 1987, 9. Сптотайїодгарну 396:307-317), способи іонообмінної хроматографії з застосуванням матеріалів, що мають високу роздільну здатність, (див., наприклад, Мейме еї аї., 1998, 9.

Спготаїоагарпу А 808:153-165), хроматографію з гідрофобною взаємодією (див., наприклад,

Тота; і О!цеїго7, 1999, У. Спгота(одгарпу А 865:123-128) і двофазний розподіл (див., наприклад,

Вгитбвацет", єї а!., 1999, Віозерагайоп 7:287-295).

Відповідно, З5Е фермент фракціонують до окремих білків, що мають визначені властивості, такі як зв'язувальна здатність до визначених зв'язувальних засобів або середовища, наприклад, антитіла або рецепторів; визначений діапазон молекулярної ваги; або визначений діапазон ізоелектричних крапок.

Як тільки досягають експресії даного 55Е ферменту, 55Е фермент, отриманий таким способом, може бути очищений від клітин або культур клітин. Ілюстративні процедури, що підходять для такого очищення включають, без обмежень, колонкову хроматографію з іммобілізованими антитілами; іонообмінну хроматографію; осадження етанолом; зворотно- фазна ВЕРХ; хроматографія на силікагелі або на катіонообмінній смолі, такій як ОЕАЕ; хроматофокусування; 5О5-РАСЕ; осадження сульфатом амонію; і використання гель- фільтрації, наприклад, зерпадех 0-75. Ряд способів очищення білка може бути застосований і ці способи відомі в даному рівні техніки і докладно описані в літературі. Наприклад, способи очищення білка описані в ЮОеці5спег, 1990, Мейїйоа5 іп Еплутоїіоду, 182(57):779; і Зсорев5, 1982,

Меїнодз іп Епгутоїіоду 90: 479-91.

Дуже часто вибір етапу(ів) очищення або способів залежить від, наприклад, природи способу одержання й окремих білків, які одержують. 6.6.4. Ферментуючі мікроорганізми

ЗЕ способи даного розкриття застосовують "ферментуючий мікроорганізм" для утворення продукту ферментації (наприклад, етанолу) з цукрів, отриманих у пов'язаній реакції оцукрювання і/або доданих у систему. Ферментуючі мікроорганізми, здатні виробляти етанол, іноді відносять до етанологенів.

Вираз "ферментуючий мікроорганізм", як застосовано в даному документі, відноситься до будь-яких мікроорганізмів, що підходять для використання в заданому процесі ферментації.

Придатні ферментуючі мікроорганізми, згідно із даним розкриттям, здатні ферментувати, тобто, перетворювати, цукри, такі як, наприклад, глюкоза, ксилоза, арабіноза, маноза, галактоза або бо олігосахариди, прямо або опосредковано в заданий продукт ферментації.

Приклади придатних ферментуючих мікроорганізмів включають, без обмежень, грибні організми, такі як дріжджі. Специфічно, придатні дріжджі можуть бути вибрані зі штамів засспаготусе5 5рр. і, зокрема, Засспаготусе5 сегемізіає. Різні типи дріжджів доступні в продажі, серед яких, наприклад, ЕТНАМОЇ КЕЮО'"М дріжджі (доступні від Репптпепії5/І езайтге,

США), РАГІ (доступні від Ріеїзсптапп' Меазі, США), ЗОРЕКЗТАКТ "М ії ТНЕНМОЗАССО свіжі дріжджі (доступні від Е(Шапо! Тесппоіоду, Умізсопзіпуо, США), ВІОРЕКМ АБЕТ і ХК (доступні від

МАВС--Могпій Атегісап Віоргодисіє Согрогайоп, ЗА, БА), СЕКТ ЗТКАМО (доступні від сег зЗігапа АВ, Змедеп) або РЕКМІОЇ. (доступні від ОЗ5М Зресіаціеє) можуть застосовуватися у виконанні способів даного винаходу, описаного в даному документі.

В інших аспектах дріжджі являють собою Засспаготусев аієїайси5 або Засспаготусев5 имагит. У ще інших аспектах дріжджі являють собою Кінумеготусе5. Без обмежень приклади

Кіимегтоусе5 включають Кінумеготусе5 тагхіапих або Кіпумеготусев їадіїйбє. У ще інших аспектах дріжджі являють собою Сапаїда. Без обмежень приклади Сапаїда включають Сападіда рзхецпдоїгорісаїї5 і Сапаїда Бгаззісає. У ще інших аспектах дріжджі являють собою Сіамізрога. Без обмежень приклади Сіамізрога включають Сіамізрога Ішзйапіає і СіІамізрога орипііає. В іншому аспекті дріжджі являють собою Распузоїеп, наприклад, Распузоїеп Таппорпйо5. В іншому аспекті дріжджі являють собою Вгегаппотусе5, наприклад, Вгейаппотусев5 сіаицйзепії. Дріжджова ферментація описана в літературі. Див., наприклад, РПйіррідіх, 1996, СеїІшіове Біосопмегзіоп

ІїесппоЇІоду, у НапароокК оп Віоеїйапої!: Ргодисіп апа Шні2айоп (Ууутап, ед., Тауюог 5 Егапсів,

Мазпіпдюп, 0.С., 179-212).

Бактерії, що можуть ефективно ферментувати глюкозу до етанолу, включають, наприклад, 2утотопавз торії і Сіовігідічт (пегтосеїїшт (див., наприклад, РПйірріаді5, 1996, зирга).

Клонування гетерологічних генів у Ззасспаготусез сегемізіає (Див., наприклад, Спеп апа Но, 1993, Аррі. Віоспет. Віоїесппої. 39-40:135-147; Но еї аї., 1998, Аррі. Епмігоп. Містобіої. 64:1852- 1859) або в таких бактеріях як Е5сПегіспіа соїї (Див., наприклад, Веаї! еї аї., 1991, Віоїесй.

Віоепа. 38: 296-303), Кіерзієїа охуюса (Див., наприклад, Іпдгат, еї а!., 1998, Віоїесппої. Віоепад. 58:204-214) або 7утотопавх пторбіїї5 (Див., наприклад, Напад еї аї!., 1995, 5сівєпсе 267:240-243;

Оєапада єї аї., 1996, Аррі. Епмігоп. МістобріоІї. 62:4465-4470), призвело до конструювання організмів, здатних перетворювати сгексози і пентози в етанол (коферментація). Такі

Зо мікроорганізми можуть бути переважно застосовними в способах даного розкриття.

У певних варіантах здійснення ферментуючий мікроорганізм являє собою 7утотопа5 торбіїїє з поліпшеною толерантністю до ацетату (див., наприклад, публікацію патенту США 2009/0221078).

У певних варіантах здійснення ферментуючий мікроорганізм являє собою 2утотопа5 тобі з поліпшеною утилізацією ксилози (див., наприклад, публікацію патенту США 2009/0246846).

У певних варіантах здійснення ферментуючий мікроорганізм являє собою 7утотопа5 торбіїїє зі здатністю ферментувати пентози до етанолу (див., наприклад, публікацію патенту

США 2003/0162271). 6.6.5. Середовище для ферментації

У певних аспектах З5РЕ-реакції або способи даного винаходу проводять на середовищі для ферментації або повному середовищі для ферментації. Вираз "середовище для ферментації", як застосовано в даному документі, відноситься до середовища, у якому ще не присутні всі компоненти, необхідні для проходження 55Е-реакції. Середовище для ферментації в такий спосіб може бути, наприклад, середовищем, отриманим в результаті процесу часткового оцукрювання. Середовище для ферментації в інших варіантах здійснення може бути середовищем, що містить усі компоненти, необхідні для проходження 55Е-реакції. У такому випадку середовище для ферментації також називають "повним середовищем для ферментації." Більш того, середовище для ферментації у ще інших варіантах здійснення може бути середовищем, де З5Е-реакція знаходиться в процесі або виконується в даний момент, і сама по собі може містити визначені продукти оцукрювання.

Повне середовище для ферментації включає ферменти, здатні гідролізувати целюлозні або інші субстрати на основі вуглеводів, ферментуючі організми і целюлозні або інші субстрати на основі вуглеводів (наприклад, як описано в розділі 6.7.2 нижче). В ході культивування повного середовища для ферментації цукри, що підлягають ферментації, утворяться за допомогою ферментативного гідролізу, що по черзі метаболізуються ферментуючим організмом для одержання продукту ферментації. 6.7. Одночасні процеси оцукрювання і ферментації

У певних аспектах 55Е-реакції даного розкриття виконують при температурі від 25 "7С до бо 50 "С. Наприклад, З5Е-реакція проходить при температурі 25 "С або вище, 28 "С або вище,

30 "С або вище, 32 "С або вище, 35 "С або вище, або 38 "С або вище. Наприклад, З5Е-реакція проходить при температурі 50 "С або нижче, 45 С або нижче, 40 "С або нижче, 38 С або нижче, 35 "С або нижче, або 30 "С або нижче. Наприклад, 55Е-реакція проходить у діапазоні температур від 28 "С до 45 "С, таких як від 30 "С до 40 "С, від 32 "С до 38 "С. В ілюстративних варіантах здійснення, 55Е-реакцію проводять при температурі від 32 "С до 3570. В іншому варіанті здійснення З5Е-реакцію проводять при температурі близько 32 "С. Температура, при якій проводять З5Е-реакцію, може, наприклад, регулюватися вгору або вниз під час реакції.

У 55Е, ферментативний гідроліз целюлози і ферментацію глюкози до етанолу поєднують в один етап (див., наприклад, РпПйірріді5, 1996, СейПшовзе Біосопмегзіоп ТесппоЇоду, НапароокК оп

Віоеішапо!: Ргодисіоп і (ЛПі:айоп, М/утап, єд., Тауог б Егапсів, МУазпіпоїюп, О.С., рр. 179-212).

ЗЗЕ процеси, як правило, проводять як процеси періодичної ферментації, де ферментацію проводять від початку до кінця в окремому резервуарі. Альтернативно, 554: процеси можуть проводитися як безперервні процеси ферментації, що є стаціонарними системами, що діють без зупинки і де кожен етап ферментації відбувається в окремій частині даної ферментативної системи, і швидкості потоків установлюють, для відповідності необхідному часу перебування.

Іншими словами, окремі етапи в процесі ферментації даного розкриття можуть проводитися серійно або безперервно. Процеси, де всі етапи виконують серійно, або процеси, де всі етапи виконують безперервно, або процеси, де один або більш етапів виконують серійно й один або більше етапів виконують безперервно, розглядають у даному документі.

У визначених варіантах здійснення З5Е процеси з підживленням можуть бути бажаними.

Процес з підживленням включає періодичну фазу і фазу підживлення. Культуральне середовище в періодичній фазі і культуральне середовище, що додається під час фази підживлення, є хімічно визначеними, і культуральне середовище фази підживлення додають щонайменше для частки фази підживлення, при рівні підживлення, який дотримується передвстановленої експонентної функції, у такий спосіб підтримуючи питому швидкість росту на передвстановленому значенні.

З5Е-реакція даного розкриття може, відповідно, продовжуватися протягом періоду від З до 7 днів. Наприклад, 55Е-реакція даного розкриття може продовжуватися до З днів, 4 днів, 5 днів, 6 днів або 7 днів.

Зо З5ЗЕ процеси ферментації даного розкриття включають, без обмежень, процеси ферментації, застосовувані для одержання продуктів ферментації, що включають спирти (наприклад, етанол, метанол, бутанол, 1,3-пропандіол); органічні кислоти (наприклад, лимонна кислота, оцтова кислота, ітаконова кислота, молочна кислота, глюконова кислота, глюконат, молочна кислота, бурштинова кислота, 2,5 дикето-О-глюконова кислота); кетони (наприклад, ацетон); амінокислоти (наприклад, глютамінова кислота); гази (наприклад, Нео і СО») і більш складні сполуки, що включають, наприклад, антибіотики (наприклад, пеніцилін і тетрациклін); ферменти; вітаміни (наприклад, рибофлавін, Віг, В-каротин); гормони й інші компоненти.

У певних аспектах дане розкриття передбачає набір 55Е умов, що специфічно придатні для застосування з рекомбінантними ферментуючими бактеріями, такими як 7утоптопах (тобто також названі тут "ЗБЕ умови рекомбінантних 7утотопах "). Наприклад, ці умови включають проведення в ємності для 55Е в анаеробних умовах при придатному рекомбінантному 2утотопах торбіїєх, застосовуючи попередньо оброблені субстрати, такі як, наприклад, кукурудзяна солома, багаса, субстрат крафт-целюлози, і проведення реакції при приблизно 339, рН 5,8 і приблизно від 10 ваг. 95 до 25 ваг. 95 сухого залишку, що знаходиться під впливом визначених субстратів і попередньої обробки. Ці умови також включають, наприклад, початок ферментації шляхом додавання 10 95 інокуляту (5 г) придатного штаму 2утотопав5 тобії5, наприклад, штамів 2МУ/705 (рекомбінантний) або 2ММ1 (дикий тип) у реакційну суміш без додаткових живильних речовин.

У певних аспектах дане розкриття передбачає набір 55Е умов, що специфічно придатними для застосування з ферментуючим мікроорганізмом, що є грибом, наприклад, дріжджі 5. сегемізіае (тобто також названі тут "дріжджові 55Е умови"). Наприклад, ці умови включають проведення реакції з придатним штамом дріжджів, наприклад ТНЕКМО5БАССФ ОКУ дріжджі при 38 С ії рН 5,0, інокуляція при 0,1 ваг. 95 без додаткових живильних речовин, проведення 55Е проходить в анаеробних умовах, наприклад, СОг дегазування, застосовуючи реакційну суміш, що містить попередньо оброблений субстрат, воду, сірчану кислоту, оцукрюючий ферменти) і дріжджовий штам, а також перемішування реакційної посудини при відповідній швидкості, наприклад, при 100 обертах у хвилину відповідний період часу, наприклад, З дні. 6.7.1. Відновлення 55Е продуктів

Продуктом ферментації може бути будь-яка речовина, що виробляється ферментуючими бо мікроорганізмами. У визначених аспектах речовина є спиртом. Розуміють, що термін "спирт"

охоплює речовину, що містить одну або більше гідроксильних частин. У визначеному аспекті, спирт є арабінітолом. В іншому аспекті спирт є бутанолом. В іншому аспекті спирт є етанолом. В іншому аспекті спирт є гліцеролом. В іншому аспекті спирт є метанолом. В іншому аспекті спирт є 1,3-пропандіолом. У ще іншому аспекті спирт є сорбітом. У ще іншому аспекті спирт є ксилітом. див., наприклад, Сопд еї аї., 1999, Е(Шапої! ргодисіоп їгот гепежаріеє гезоигсе5, у

Адуапсез іп Віоспетіса! Епдіпеегіпо/Віоїесппоіоду, ЗсПперег, єй., Зргіпдег-Мейад Вепіп

НеїдеІрегу, Септапу, 65: 207-241; 5іїмеїга апа допав 2002, Аррі. Містобріо!. Віотеснпо!. 59: 400-408;

Мідат, і 5іпуой, 1995, Ргосе5з5 Віоспет. 30 (2): 117-124; Ееєїї еї аї.,, 2003, УМопа 9. Містобіої.

Віотесппої. 19 (6): 595-603.

Дистиляцію можна виконувати на ферментативному бульйоні з етапу ферментації для відновлення продуктів ферментації, таких як, наприклад, етанол. Етапи ферментації і дистиляції можуть проводитися одночасно або окремо/послідовно. У певних аспектах після дистиляції два продукти відновлюються: спирт, такий як, наприклад, етанол, і залишок ферментації або залишковий продукт (цільна нефільтрована барда). Спирт, змішаний азеотропно з водою, надалі очищають на етапі розділення стандартними способами, такими як, наприклад, гель- фільтрація. Наприклад, може бути отриманий етанол з чистотою до приблизно 96 об. 95, який можна застосовувати в якості, наприклад, паливного етанолу, питного етанолу, тобто, придатного для питва спирту без смакових добавок, або промислового етанолу.

Для інших речовин або продуктів ферментації будь-які відомі в даній галузі техніки способи можна застосовувати для відновлення, включаючи, без обмежень, хроматографію (наприклад, іонообмінну, афінну, гідрофобну, хроматофокусування і ексклюзійну), способи електрофорезу (наприклад, препаративне ізоелектричне фокусування), диференціальну розчинність (наприклад, осадження сульфатом амонію), 505-РАСЕ, дистиляцію або екстракцію. 6.7.2. Джерела вуглеводів або вихідної сировини

Будь-які придатні целюлозні субстрати або сирі матеріали можна застосовувати в здійсненні

ЗЕ способів даного розкриття. Субстрат можна вибрати на основі бажаного продукту ферментації, тобто, речовини, яку необхідно одержати в результаті ферментації, і використовуваних способів, відомих у даній галузі техніки.

Приклади субстратів, що підходять для застосування в способах даного розкриття,

Зо включають матеріали, що містять целюлозу, такі як залишки деревини або рослин, низькомолекулярні цукри ЮОР1-3, отримані з оброблених целюлозних матеріалів, що можуть бути метаболізовані ферментуючим мікроорганізмом, і/або які можуть бути доставлені безпосереднім додаванням у середовище для ферментації.

Біомаса може включати будь-які композиції, що містять целюлозу і/або геміцелюлозу (лігноцелюлозна біомаса також може містити лігнін), наприклад, насіння, зерна, бульби, рослинні відходи або побічні продукти харчової обробки або промислової обробки (наприклад, стебла), кукурудза (включаючи стрижні качанів, солому і т.п.), трави (наприклад, індійські трави, такі як Богдпазігит пшапе; або просо, наприклад, види Рапісит, такі як Рапісит мігдашт), деревину (включаючи деревну стружку, відходи обробки), папір, деревну масу, повторно використовуваний папір (наприклад, газети). Інші матеріали біомаси включають, без обмежень, картоплю, сою (насіння рапсу), ячмінь, жито, овес, пшеницю, буряк або багасу цукрового очерету. 6.8. Попередня обробка біомаси

До 55РЕ-реакції біомасу (наприклад, лігноцелюлозний матеріал) переважно піддають етапу попередньої обробки для того, щоб привести матеріали ксилану, геміцелюлози, целюлози і/або лігніну в більш доступний для ферментів стан, і, таким чином, що більше піддається оцукрюванню і ферментації способами даного розкриття.

В одному аспекті попередня обробка спричиняє вплив на висушений матеріал біомаси у придатній посудині, такій як, наприклад, реактор, каталізатора, що містить розведений розчин сильної кислоти і солей металів; це може знижувати енергію активації або температуру гідролізу целюлози, щоб одержати більш високий вихід цукрів; див., наприклад, патенти США Мо 6660506; 6423145.

Інший ілюстративний спосіб попередньої обробки спричиняє гідроліз біомаси, шляхом піддавання матеріалу першому ступеню етапу гідролізу у водяному середовищі при температурі і рівні тиску, вибраному, щоб виконати первинну деполімерізацію геміцелюлози, без значної деполімерізації целюлози до глюкози. Цей етап приводить до суспензії, у якій рідка водяна фаза містить розчинені моносахариди, отримані в результаті деполімерізації геміцелюлози, і тверда фаза містить целюлозу і лігнін. Другий етап гідролізу може включати умови, при яких щонайменше значна частка целюлози деполімеризується, призводячи до рідкої водяної фази, бо що містить розчинені/розчинні продукти деполімерізації целюлози. див., наприклад, патент США

Мо 5536325.

Інший ілюстративний спосіб включає обробку матеріалу біомаси за допомогою однієї або більше стадій гідролізу розчиненою кислотою, використовуючи приблизно від 0,495 до 2 95 сильної кислоти; і обробляючи тверді лігноцелюлозні компоненти, що не прореагували, матеріалу гідролізованої кислотою біомаси шляхом лужного руйнування лігніну. Див., наприклад, патент США Мо 6409841.

Інший ілюстративний спосіб попередньої обробки включає передгідролізовану біомасу (наприклад, лігноцелюлозні матеріали) у посудині для передгідролізу, наприклад, реакторі; додавання кислотної рідини до твердого лігноцелюлозного матеріалу для одержання суміші; нагрівання суміші при відповідній температурі реакції; підтримка температури реакції на період часу, достатній для фракціонування лігноцелюлозного матеріалу у водорозчинну частину, що містить щонайменше приблизно 20 95 лігніну з лігноцелюлозного матеріалу і твердої фракції, що містить целюлозу; видалення водорозчинної частини з твердої фракції при підтримці суміші при або приблизно температурі реакції, де целюлоза у твердій фракції виявляється такою, що більше піддається ферментативному розщепленню; і відновлення розчиненої частини. Див., наприклад, патент США Мо 5705369.

В інших ілюстративних способах, спосіб попередньої обробки використовує перекис водню

Нгб». Див., наприклад, Сопціа, 1984, Віоїтесі. Віоепаг. 26:46-52.

В інших ілюстративних способах попередня обробка включає контактування біомаси зі стехіометричною кількістю гідроксиду натрію і гідроксиду амонію при дуже низькій концентрації біомаси. Див., наприклад, Теїхеїга еї а!., 1999, Аррі. Віоспет. Віоїтеспй. 77-79:19-34.

В інших варіантах здійснення попередня обробка включає контактування лігноцелюлози з хімічним реактивом (наприклад, основою, такою як вуглекислий натрій або гідроксид калію) при рН від приблизно 9 до приблизно 14 при помірній температурі, тиску і рН. Див., наприклад, РСТ публікацію патентної заявки УМО2004/081185.

В інших ілюстративних способах попередня обробка використовує аміак. Наприклад, спосіб попередньої обробки включає піддавання біомаси впливу низьких концентрацій аміаку при умовах з високим вмістом твердих часток. Див., наприклад, публікація патенту США Мо 20070031918, РСТ публікація патентної заявки УМО 2006/11901.

Даний винахід далі ілюструють наступними прикладами. Приклади забезпечені тільки для ілюстративних цілей. Вони сформовані як не обмежуючі обсяг або зміст даного винаходу будь- яким чином. 7. Приклад 1: Аналіз утворення Ехр у 55Е-реакціях 7.1. Матеріали і способи 7.1.1. Субстрати

Нижче приведений список субстратів, використаних у даному винаході. Також перераховані композиції целюлози, ксилану і лігніну в попередньо оброблених субстратах. Аналіз сполук виконували з застосуванням стандартних аналізів, докладно описаних у МКЕЇ!. протоколах для зіапаага Віотав55 Апа/уіісаї Ргоседиге5 (доступний на: пЕрулимли. пе! дом/Ббіотавв/раїв/42618. раї):

Солома кукурудзи, попередньо оброблена розведеним аміаком. Кукурудзяна солома була попередньо оброблена перед ферментативним гідролізом, відповідно до способів і діапазонів обробки, описаних, наприклад, у публікаціях патентних заявок США 2007-0031918-А1, 2007- 0031919-А1, 2007-0031953-А1, 2007-0037259-А1 і РСТ публікації патентної заявки УМО06/1 10901

А2 (якщо не зазначено інше). Композиція субстрату містить: 34,8 95 целюлози, 29,2 95 ксилану, 12,8 95 лігніну.

Багаса цукрового очерету, попередньо оброблена розведеною сірчаною кислотою. Цей субстрат був вироблений і наданий МЕКЕЇ, як докладно описано в 5сНеї! еї аї, 2003, (Арр.

Віоспет. Віоїеснпої. Мої. 105-108, 69-85). Багаса була попередньо оброблена при концентрації сухої речовини 20 95 (ваговий відсоток), температурі 165 "С, 1,44 95 (ваговий відсоток) кислоти і приблизному часу перебування 8 хв. Композиція субстрату містить: 55,0 95 целюлози, 3,1 95 ксилану, 31,2 95 лігніну.

Змішаний субстрат промислової невибіленої целюлози листяної деревини. Цей субстрат був отриманий із застосуванням сульфатного варіння целюлози і кисневої делігніфікації (перманганатне число - 13). (Дослідження фінансувалося ГАдепсе МайопаІе де Іа Кеспегопе (АМА-05-ВІОЕ-007) при ГАдепсе де ГЕпмігоппетепі еї де Іа Майгізе де ГЕпегдіе (АСЕМЕ 0501С0099). Композиція субстрату містить: 74,6 95 целюлози, 20,7 95 ксилану, 2,6 95 лігніну.

Субстрат промислової невибіленої целюлози хвойної деревини. Цей субстрат був отриманий із застосуванням сульфатного варіння целюлози і кисневої делігніфікації (Карра бо Митбег-14). (Дослідження фінансувалося ГАдепсе Маїопаїе де Іа Кеспегоспе (АМК-05-ВІОЕ-007)

при ГАдепсе де ГЕпмігоппетепі еї де Іа Майгізе де ГЕпегдіе (АСОЕМЕ 0501С20099). Композиція субстрату містить: 81,9 95 целюлози, 8,0 95 ксилану, 1,9 95 лігніну. 7.1.2. Ферменти

Нижче приведений список ферментів і сумішей ферментів, що застосовуються у даному винаході.

АссеПегазетм 1500 (Оапізсо Ш.5. Іпс., Сепепсог) є високооактивним Д-глюкозидазним комплексом целюлазних ферментів, що виробляється генетично модифікованим Тгісподегта геезеї. Він містить численні ферментні активності, більшість яких є екзоглюканазними, ендоглюканазними, В-глюкозидазними і геміцелюлазними активностями.

Мийітеске Хуїапазе (Оапібзсо Ц.5. Іпс., зепепсог), також такий, що виробляється Тгісподепта геезеії, є комплексом геміцелюлазних ферментів, призначених працювати як допоміжний продукт, щоб доповнювати всі целюлази ксиланазною активністю і синергічно працювати для збільшення перетворень різноманітних полісахаридів у лігноцелюлозній промислово обробленій біомасі. Переважна ксиланазна активність у ксиланази Мийіескю є активністю

Хупва Т. геезві (Див., Гасгапде еї аї., 1996, Аррі. Епмігоп. Місгобіо!. 62:1036-1044).

Вхі1: є В-ксилозидазою з Тгісподегпта геезеї. Амінокислотна послідовність Вхі1! представлена в даному документі в якості ЗЕО ІЮ МО:4. Вхі1ї має р-ксилозидазну активність, як було показано в аналізах із застосуванням р-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних лінійних ксилоолігомерів в якості субстратів.

Хуп3: є ксиланазою сімейства СНІ1І0 з Тгісподепта геезві. Амінокислотна послідовність Хуп3 представлена в даному документі в якості БЕО ІЮ МО:18. Хуп3 володіє ендоксиланазною активністю, як було показано з застосуванням азоксилану деревини берези (Меда7уте,

УМіскіому, Ігеїапа), і опосередковано по його здатності збільшувати продукцію мономерів ксилози в присутності ксилобіозидази, коли Хуп3 у сполученні з ксилобіозидазою діє на попередньо оброблену біомасу або на ізольовану геміцелюлозу.

ЕмЗА: є ферментом сімейства ЗНЗ з ЕРизагішт мегіісіПоіде5. Амінокислотна послідовність

Ем3ЗА представлена в даному документі в якості ЗЕБЕО І МО:6. Ем3ЗА має рД-ксилозидазну активність, як було показано в аналізі з застосуванням р-нітрофеніл-В-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних лінійних ксилоолігомерів (Фігури 15 і 16) і розгалужених олігомерів

Зо арабіноксилану з геміцелюлози в якості субстратів.

Ем51А є ферментом сімейства СН51 з Ризагішт мепісіПоіде5. Амінокислотна послідовність

Ем51А представлена в даному документі в якості ЗЕБЕО 10 МО:16. Ем51А володіє І-а- арабінофуранозидазною активністю, як було показано в аналізі з застосуванням р-нітрофеніл-а-

І-арабінофуранозиду і по вивільненню арабінози з набору олігомерів, вивільнених з геміцелюлози дією ендоксиланази.

Ем4а30р: є ферментом сімейства ОНАЗ з Ризагішт мепісіПоіїде5. Амінокислотна послідовність

Ема3зО представлена в даному документі в якості БЕО ІЮ МО:2. Рм4а3О має р-ксилозидазну активність, як було показано в аналізах із застосуванням р-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних лінійних ксилоолігомерів в якості субстратів. (Фігури 15 і 16).

Ем4аз3В: є ферментом сімейства СН4ІЗ з Ризагішт мепісіПоіде5. Амінокислотна послідовність

Ем4а3В представлена в даному документі в якості БЕО ІЮ МО:12. Ем43Е має В-ксилозидазну активність, як було показано в аналізах із застосуванням р-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних лінійних ксилоолігомерів в якості субстратів.

РІ4ЗА: є ферментом сімейства ЗНАЗ з Репісійшит їпісшовит. Амінокислотна послідовність

РІ4ЗА представлена в даному документі в якості БЕО ІЮ МО:8. РІ43А має Др-ксилозидазну активність, як було показано в аналізах із застосуванням р-нітрофеніл-ВД-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних лінійних ксилоолігомерів в якості субстратів.

ЕмаЗЕ: є ферментом сімейства ОНАЗ з Ризагішт мепісіПоідев5. Амінокислотна послідовність

Ема3ЗЕ представлена в даному документі в якості ХЕ ІЮ МО:10. Ем4азЕ має р-ксилозидазну активність, як було показано в аналізах із застосуванням р-нітрофеніл-Д-ксилопіранозиду, ксилобіози або змішаних лінійних ксилоолігомерів в якості субстратів.

АТ4ЗА: є ферментом сімейства 5Н4іЗ з Азрегойи5 Титідаг5. Амінокислотна послідовність

АТЗА представлена в даному документі в якості ЗЕБЕО 10 МО:14. АТЩЗА має 1 -а- арабінофуранозидазну активність, як було показано в аналізах із застосуванням р-нітрофеніл-а-

І -арабінофуранозиду і по вивільненню арабінози з набору олігомерів, виділених з геміцелюлози дією ендоксиланази.

ХіІпА: ХіпА є ксиланазою з Абзрегодййи5 їшрепдепз5зі5. Амінокислотна послідовність ХіпА представлена в даному документі в якості зЕО ІЮ МО:20. Білок ХІпА, що застосовується у даних прикладах, був неочищеним, у формі ферментного препарату, головним елементом якого був 60 ХіпА.

Ва!1: ВоІї є В-глюкозидазою 1 Т. геезеі (ЗЕО ІЮ МО:26). Ген Во описаний, наприклад, у

Ватеїй еї а!., 1991, Віо-Тесппоїоду 9(6):562-567. 7.1.3. Штами

Штам Ме229: Штам Тгісподегта геезеї, отриманий з КІ-РЗ37 (5Пеїї-Меїз5 апа Мопіепесоцті, 1984, Аррі. Містобіої!. Віотесппої. 20:46-53) за допомогою мутагенезу і селекції на високий титр виробництва целюлази, був спільно трансформований з експресійною касетою ДВ-глюкозидази (яка містила промотор СБ, ген рД-глюкозидази! Т. геезеї, термінатор СБ1 і маркер атаз (А. підшапв» ацетамідаза)), і експресійною касетою ендоксиланази (яка містила промотор СБА1, Хуп3

Т. геезеії і термінатор Срп1) із застосуванням трансформації, опосередкованої РЕС (див., наприклад, Репніа еї аї!., 1987, Сепе 61(2):155-64). Численні трансформанти були виділені і досліджені на продукцію В-глюкозидази і ендоксиланази. Один трансформант, названий як штам Ме229 Т. геезеї, був застосований у деяких дослідженнях, описаних у даному документі.

Штам НЗА: Штам Ме229 Т. геезеї був спільно трансформирмований з експресійною касетою

В-глюкозидази ЕмЗА (яка містила промотор СрА1, ген УЗА, термінатор срп1 і маркер аїЇ5к (хлоримурон-етил резистентний мутант нативної ацетолактатної синтази Т. геевеї),, експресійною касетою В-ксилозидази Ем430О0 (яка містить промотор едії, ген їм430, нативний термінатор їм430)) і експресійною касетою а-арабінофуразидази Ем91А (яка містила промотор едії, ген їМ51А, нативний термінатор їм51А), застосовуючи електропорацію (див., наприклад,

РСТ публікація патентної заявки УМО2008/153712 А2). Трансформанти були відібрані на агарових пластинах Модеії5, що утримують хлоримурон-етил. Численні трансформанти були виділені і досліджені на продукцію ДВ-ксилозидази і І-«-арабінофуранозидази. Штам НЗА Т. геезеї для експресії інтегрованого гена, що рекомбінантно експресує р-глюкозидазу 1 Т. геезеїі,

ХупВв3, ЕМЗА, Емо1А і ЕРм430 Т. геезеї, був виділений і застосований у деяких дослідженнях, описаних у даному документі. 1.1.4. Організми і підготовка посівного матеріалу 7.1.4.1. 7утотопах торбіїїв

Передумови: Штам 2МИ 2утотопах тобіїїх є штамом дикого типу подібним до штаму 2МА з

Американської колекції типових культур (АТСС 31821, Мапавтза5, МА). Рекомбінантний штам 2МТ05 2утотопах торії був отриманий зі штаму 2М/801-4, як викладено нижче. Культури

Зо штаму 2М/801-4 7. тобі були вирощені в умовах стресу, як викладено нижче. 2МУ/У801-4 є рекомбінантним утилізуючим ксилозу штамом 7. торбіїї5, що був описаний у публікації патентної заявки США 2008/0286870. Штам 2МУ801-4 був отриманий зі штаму 2МУ/80О0, що був, у свою чергу, отриманий зі штаму 2М/658, усе це описано в публікації патентної заявки США 2008/0286870. 2658 був сконструйований інтеграцією двох оперонів, РозрхуїАВ і Рогріанккі, що містять чотири гени утилізації ксилози, що кодують ксилозоіїзомеразу, ксилолокіназу, трансальдолазу і транскетолазу, в геном 2М/1 (АТСС 231821) за допомогою наступних транспозиційних подій і з наступним етапом адаптації проведеним на селективному середовищі, що містить ксилозу. 2АММ658 був зареєстрований як АТСС ЯРТА-7858. У ЛМб658, ген, кодуючий глюкозо-фруктозні оксидоредуктази був інсерційно інактивований із застосуванням хазяїн-опосередкованої гомологічної рекомбінації з подвійним кросинговером і спектиноміцин- резистентності як селектовного маркеру для створення 2М/800. Маркер спектиноміцин- резистентності, обмежений сайтами ОхР, був вилучений шляхом сайтом-специфічної рекомбінації з застосуванням Стге-рекомбінази для створення 2М/801-4.

Безперервна культура 2ММ801-4 була вирощена в 250 мл з перемішуванням, рн- і термо- регульованих ферментаторах (5іхіог5; ВошШтіпдеп, Зм/йгепапа). Базальне середовище для ферментації містило 5 г/л екстракту дріжджів, 15 ммоль фосфату амонію, 1 г/л сульфату магнію, 10 ммоль сорбітолу, 50 г/л ксилози і 50 г/л глюкози. Адаптація до росту в присутності високих концентрацій ацетату й аміаку досягалася поступовим збільшенням концентрації оцтовокислого амонію в середовищі для безперевного культивування при збереженні установленої швидкості росту, як виміряно за визначеною швидкістю розведення протягом 97 днів до концентрації 160 ммоль. Подальше збільшення концентрації іонів амонію досягалося поступовим додаванням фосфату амонію до кінцевої загальної концентрації іонів амонію 210 ммоль до кінця 139 дня безперервного культивування. Штам 2М/705 був виділений з адаптованої популяції посівом,

ПЛР-ампліфікацією і/або іншими традиційними добре відомими способами. 7.1.4.2. Ріст посівних культур для 55Е

Штами 2ММ705 ії АМИ 2утотопа5 тобі зберігали у вигляді стоків 2095 гліцерину, заморожених при -80 "С. Для створення посівних культур відтавали 2 мл цього замороженого стоку і використовували для інокуляції 45 мл середовища, що містить 5 г/л екстракту дріжджів, 4 г/л дигідрофосфату калію, 1 г/л сульфату магнію і 100 г/л глюкози при рН 5,8. Початковий ОЮ бо 600 нм склав 0,4. Культуру вирощували при 32 "С у закритій 50 мл колбі до ОЮ 600 нм приблизно 2,5 і пізніше використовували для інокуляції кінцевої посівної культури, що містить 200 г/л глюкози, 4 г/л дигідрофосфату калію, 2 г/л сульфату магнію і 20 г/л екстракту дріжджів при рН 5,85. Цю культуру вирощували при 32"С у рН-регульованому і з перемішуванням ферментаторі до ОО 600 нм приблизно 10 і залишкової концентрації глюкози приблизно 80 г/л.

Обсяг цієї посівної культури (що має ОО 600 нм приблизно 10), еквівалентний 10 95 обсягу 5ЗЕ ферментації, був використаний для старту 55БЕ. 7.1.4.3. Дріжджі

Використовуваний етанологен дріжджів належав ТНЕКМОБАССЯ ОКУ дріжджам (Етапої

Тесппоіоду, Мім"аиКеє, УМІ), що здатні ферментувати тільки Сб (тобто, глюкозу) вуглецеві цукри до етанолу (ЕЮН). Сухі дріжджі були гідратовані в стерильній деіонізованій воді протягом 2-3 годин до інокуляції. 7.1.5. Ферментація із застосуванням цукрів

Ферментацію 2утотопазвз тпоріїї5 із застосуванням синтетичних цукрів проводили протягом З днів у 500 мл біореакторі 5Біхіог5, використовуючи періодичний процес і процес з підживленням.

Синтетичні цукри складалися з глюкози і ксилози. Для періодичних процесів, цукри спочатку завантажували при концентрації приблизно 80 г/л глюкози і 70 г/л ксилози. Для процесу з підживленням, спочатку був приготований концентрований розчин стоків цукрів, що потім подавали в біореактор застосуванням шприцевого насоса (РНО2О00, Нагуага Аррагаїс»,

Ноїїсіоп, МА). Швидкість потоку встановлювали і контролювали так, щоб він давав кінцевий еквівалент завантаження цукру приблизно 80 г/л глюкози і 70 г/л ксилози на день 3. Для періодичного процесу або процесу з підживленням інокулят 7утотопах завантажили в реакційну суміш спочатку при 10 ваг. 95 і ферментацію провели в анаеробних умовах при 332С і рн 5,5. 7.1.6. Одночасне оцукрювання і ферментація (551)

Цикли З5Е у колбі проводили в анаеробних умовах при придатних умовах ферментації з рекомбінантними 2утотопав тобії5 і дріжджами. Якщо не зазначене інше, З5Е-експерименти з рекомбінантними 2утотопах з використанням попередньо оброблених розведеним аміаком субстратів кукурудзяної соломи, багаси або крафт-маси, проводили при 332С, рН 5,8 і 25 ваг. 95, 20 ваг. 95, 10 ваг. 96 завантаженні сухої речовини, відповідно. 25 ваг. 96 сухої речовини (12,5 г

Зо сухої ваги), 20 ваг. 95 сухої речовини (10,0 г сухої ваги) або 10 ваг. 95 сухої речовини (5,0 г сухої ваги) відповідних субстратів завантажили спочатку в 125 мл колбу Ерленмейера, з наступним додаванням дейіонізованої води, попередньо змішаної з необхідною кількістю бМ сірчаної кислоти для того, щоб відтитрувати рН субстрату до 5,8. Целюлазні і геміцелюлазні ферменти, описані вище, додавали в кількості, заснованій на мг целюлазного білка/лт целюлози і мг геміцелюлазного білка/лг ксилану в біомасі субстрату, відповідно. Ферментацію ініціювали додаванням 10 ваг. 95 інокулюму (5 г) штамів 2М/705 (рекомбінантний) або 2/1 (дикий тип) 2утотопах торії у реакційну суміш без додаткових живильних речовин. Для 55Е із дріжджами ТНЕКМОЗАССФ ОКУ реакції проводили при 38"С і рн 5,0. Рівень інокуляції дріжджів був 0,195 вага/вага без яких-небудь додаткових живильних речовин. Анаеробне середовище і дегазацію СО підтримували 23 каліберною голкою, виступаючою з гумової пробки, яку використовували для закриття колби. Спочатку ферментації всі цикли 55Е мають початкову загальну реакційну вагу 50 г у колбі, і реакційна суміш складається з попередньо обробленого субстрату, води, сірчаної кислоти, ферменту і або 7утотопавх, або дріжджових клітин. Колби збовтували усередині інкубатора із шейкером (Мем/ Вгип5м/ісК Зсіепійс, Іппома 44,

Едізоп, Мем Уегзеу) при 100 об./хв протягом З днів. 7.1.7. Окремі гідроліз і ферментація (ЗНЕ)

Цикли ЗНЕ містили в собі етап оцукрювання з наступним етапом ферментації. Умови оцукрювання були по МЕЕЇГ. І арогагу Апаїуїїса! Ргоседиге (див., 5еїїд еї аіІ., 2008, Еп7утаїйіс засспагіїїсайоп ої І ідпосеїІшіовіс Віотав5 І арогаїюгу Апаїуїїса! Ргоседиге (ГАР), ТесНпіса! Нероп

МАЕ /ТР-510-42629), за винятком визначених модифікацій ферментних типів і/або рівнів, завантаження целюлози і рН. 25 ваг. 95 сухої речовини (12,5 г сухої ваги) кукурудзяної соломи, попередньо обробленої розведеним аміаком, або 10 ваг. 95 сухої речовини (5,0 г сухої ваги) змішаної деревної маси листяної деревини завантажили в 125 мл колбу Ерленмейера. За цим потім йшло додавання деїонізованої води, попередньо змішаної з необхідною кількістю бМ сірчаною кислоти для того, щоб відтитрувати рН субстрату до 5,3. Етап оцукрювання починали з додавання целюлазних і геміцелюлазних ферментів в кількості, заснованій на мг всього білка/г целюлози і мг всього білка/г ксилану в біомасі субстрату, відповідно. Для всіх циклів ЗНЕ з 2утотопа5 застосовували температуру 50 С їі рН 5,30 для оцукрювання протягом З діб, з наступним етапом ферментації, з використанням таких же умов, як описані в процесі 55Е бо (раніше). Гідроксид натрію використовували для підвищення рН від 5,3 до 5,8. Після цього йшло додавання 10 ваг. 95 інокулюму 2утотопах для запуску ферментації. 7.1.8. 55Е з підживленням

Дослідження З5Е з підживленням проводили при подібних умовах, описаних для процесу

ЗЕ (раніше), за винятком того, що субстрат на основі кукурудзяної соломи, попередньо обробленої розведеним аміаком (необхідний для досягнення кінцевих 25 ваг. 95 сухої речовини) був розділений нарівно на 8 партій і періодично подавався в біореактор, з останньою партією, доданою на 30-ій годині. 1.1.9. ВЕРХ-аналіз і кількісний аналіз ЕХР

Зразки ферментації забирали через встановлені інтервали й аналізували на етанол, залишкові цукри, етил-ВД-ксилопіранозид (ЕХР) і інші продукти метаболізму, такі як, наприклад, оцтова кислота і гліцерин, за допомогою ВЕРХ системи Умаїег5 (АПапсе 5узіет, Умаїег5 Согр.,

Міїога, МА). ВЕРХ-колонку придбали в ВіоКкай (Атіпех НРХ-87Н, ВіоРаай Іпс., Негсшев5, СА).

Після кількісного аналізу ЕХР при визначенні коефіцієнта переломлення йшов ряд процедур, що були подібні описаним в 7Ппапод еї аї. "у 2009, Еплуте апа Місгоріа! Тесппоіоду 44:196--202).

Було виявлено, що інший побічний продукт метаболізму, бурштинова кислота, спільно елюював з ЕХР і потенційно завищував кількість ЕХР. Було визначено, що для ферментації із дріжджами і 7утотопав, концентрації бурштинової кислоти, утвореної при тестових умовах, складали не більше 1-2 г/л при вимірі за допомогою як Уф-детектора при 220 нм, так і набору для ферментного аналізу (К-50ОСС, Медауте, Со. Уміскіом/, Ірландія). 1.2. Результати 7.2.1. Утворення й ідентифікація ЕХР 7.2.1.1. Утворення ЕХР у 55Е з рекомбінантним 7утотопаз торії

Утворення побічного продукту спостерігали в умовах 55Е-ферментації, описаних вище, за допомогою рекомбінантного штаму 7утотопах5 торії, що здатний до спільної ферментації глюкози і ксилози в етанол. Субстратом, що використовували у даному дослідженні, була попередньо оброблена розведеним аміаком кукурудзяна солома, що має високий зміст ксилану, оброблена комерційними препаратами целюлазних/геміцелюлазних ферментів (АссейПегаве "м 1500 при 20 мг/г целюлози) і ксиланаза Мийіеске (5 мг/г ксилану), обоє отримані з Тгісподегта геезвї (Т. геезеї). При тестових умовах найвища величина утворення побічного продукту була

Зо виявлена при З5Е з підживленням, а друга найвища - у 55Е (Таблиця 1). ЗНЕ з використанням кукурудзяної соломи, попередньо обробленої розведеним аміаком, періодичний процес ферментації і процес ферментації з підживленням із застосуванням цукрів (80 г/л глюкоза ж 70 г/л ксилози) утворюють малу кількість цього побічного продукту.

Побічний продукт, утворений при 55Е-умовах із застосуванням кукурудзяної соломи, попередньо обробленої розведеним аміаком, і штаму 2утотопах тобБіїї5, як описано вище, мав час елюювання на ВЕРХ-колонці НРХ-87Н приблизно 11,75 хв. (при швидкості потоку 0,6 мл/хв.), близький до такого показника бурштинової кислоти. Фігура 1 секція 2 показує пікове елюювання при 11,611 хв., після інкубації ксилози і ксиланази Мийіїескю з етанолом. Такий окремий пік був відсутній, якщо при інкубації не був присутній спирт. Спостерігали, що положення побічного продукту, утвореного в присутності спирту під час інкубації, змістилося за протяжністю й у напрямку, що супроводжував додавання спирту. Час елюювання побічного продукту, отриманого після інкубації з метанолом (МеоН) 19,46 хв., і побічного продукту, отриманого після інкубації з п-РгОН 27,65 хв., був коротше і довше, відповідно, у порівнянні з побічним продуктом, отриманим після інкубації з етанолом (ЕН) 21,99 хв. Час елюювання продуктів, отриманих за допомогою інкубації ксилози з ксиланазою Мийптеске і 0,72 М спиртом, зміщується стосовно індукованих етанолом продуктів (11,61 хв.) до більш короткого часу елюювання з Меон (11,03 хв.) і довшому часу елюювання з п-РгОН (13,60 хв.). Ці результати узгоджуються з висновком, що розглянуті пікию, що пересуваються, були ксилозо-спиртовими аддуктами (алкіл-ксилопіранозидами), утвореними зворотним гідролізом ксилози і спирту, З компонентами, що елюють при 11,03, 11,61 ії 13,60, що відповідає метил-, етил- і п-пропіл- ксилопіранозидам, відповідно. 7.2.1.2. Динаміка

Динаміка появи метил-, етил- і п-пропілксилопіранозидів показана на Фігурі 2. Порівняльні кількості продуктів, утворених через 100 годин, приведені в такий спосіб: метил»етил-»п-пропіл- ксилозид (Фігура 2), що узгоджується з порядком, описаним Огоцеї еї аїЇ. (у 1994, Віоїтесп. 5

Віоепд. 43:1075-1080) для утворення алкіл-В-Ю-ксилопіранозидів за допомогою зворотного гідролізу в присутності МеОН, ЕН і п-РГОН. Збіг часу елюювання етилксилопіранозиду (ЕХР) з тим, який спостерігається при 55Е-умовах, залежності часу елюювання від присутності і природи спирту, і відносні реакційні здатності цих спиртів, усе підтверджує те, що ЕХР був бо побічним продуктом, утвореним при З5Е-умовах.

7.2.1.3. Ідентифікація етил-Д-глікозидів у зразку ЕХР за допомогою "Н ЯМР аналізу

Одержання стандартного етил-б-Ю-ксилопіранозиду: Зразок етилксилозидів одержали шляхом розчинення 50 мг Ю-ксилози в З мл етанолу і нагрівання отриманого розчину в присутності 15 Ня смоли Атрепувбі (100 мг) при 70 "С протягом З годин. Смолу фільтрували і розчинник етанол видаляли при зниженому тиску з виходом безбарвного масла. Аналіз за допомогою "Н ЯМР виявив суміш етилксилозидів, при цьому а-О-ксилопіранозид переважав, поряд з кількостями етил-ВД-ксилопіранозиду і етил-а/В-ксилофуранозиду.

ІН ЯМР зразка ЕХР: Ліофілізований зразок ЕХР, очищений і фракціонований (за допомогою

ВЕРХ) зі зразка ферментативного бульйону для 55Е кукурудзяної соломи, попередньо обробленої розведеним аміаком, відновили в 750 мкл О2О і перенесли в РР-528 скляну пробірку для ММК. Спектр протонного ЯМР одержали на системі для ЯМР МММА5 500 МН? Магіап із застосуванням Вабвіс 52ри! риїбхе зедоепсе для більше 8 імпульсів. "Н ЯМР-спектр (500 МГц, 020), щодо сигналу НОО при а 4,80, показав наявність щонайменше 4 окремих етилглікозидів, грунтуючись на появі декількох триплетних сигналів в області а 1,20-1,26. Спектр також містив 5 окремих дублетів 4 4,43, 4,49, 4,53 і 4,66 з константою взаємодії 7,8 Гц, що вказує на р- глюкозидні зв'язки. Сигнал у й 4,43 був найбільш сильним і відповідає хімічному зміщенню, описаному в літературі (Огоцеї еї аї., 1994, Віоїесп. 5 Віоепод. 43:1075-1080), 7Напо еї а!. (2009,

Епгуте апа Містобіа! ТесппоЇоду 44:196-202) для етил-В-О-ксилопіранозиду. Сумарні сигнали, що спостерігаються в "НН ЯМР-спектрі (Фігура 3) показали присутність ДВ-аномеру, В8-0- етилксилопіранозиду поряд з 3-4 додатковими етил-В-глікозидами. 7.2.2. Утворення ЕХР дріжджами і 7утотопавз торії дикого типу

Спільна ферментація С5/С6 цукрів за допомогою утворюючого етанол 7утотопах5 торії при 55Е-умовах і З5Е-умовах з підживленням з кукурудзяною соломою, попередньо обробленою розведеним аміаком, давала високі рівні ЕХР. Розробили новий експеримент для визначення того, чи утвориться ЕХР при проведенні 55Е за допомогою дріжджів і гупотопав тобіїїх дикого типу, що є організмами, здатними до ферментації лише Сб цукрів. Результати (Фігура 4) показали, що ЕХР одержували на високих рівнях у 55Е-реакціях, у яких дріжджі (5,5 г/л)у або 7утотопав тпоБіїї5 (9,1 г/л) дикого типу робили ферментацію. Таким чином, утворення

ЕХР не є специфічним для рекомбінантного 2утотопавх тпорБбіїї5, як це було також визначено під час 55Е за допомогою дріжджів засспаготусез сегемізіає і Хутотопавз тобіїї5 дикого типу. 7.2.3. Утворення ЕХР з інших джерел біомаси

Додаткові експерименти розробили, щоб визначити, чи міг утворитися ЕХР із застосуванням інших субстратів, ніж кукурудзяна солома, попередньо оброблена аміаком. З результатів, показаних у Таблиці 2, утворення ЕХР, виявляється зв'язаним з ферментацією будь-яких субстратів З високим вмістом ксилану при ЗзЗЕ-умовах З т. геезеї целюлазними/геміцелюлазними препаратами. Наприклад, аж до 16,1 г/л ЕХР було утворено при рекомбінантних 2утотопах 55Е-умовах, застосовуючи змішану промислову крафт-масу з листяної деревини з високим вмістом ксилану. З іншого боку, субстрати зі зниженим вмістом ксилану, такі як, попередньо оброблена багаса і деревна маса з хвойної деревини, виробляли низькі кількості ЕХР (0,91 і 4,75 г/л, відповідно) при таких же умовах. Крім того, було ще раз показано, що тільки при 554 процесах, описаних у даному документі, утворяться великі кількості ЕХР. Утворення ЕХР сильно знижувалося при умовах ЗНЕ процесу, (3,52 г/л), навіть при використанні субстратів з високим вмістом ксилану. 7.2.4. Утворення ЕХР при різних перестановках ферментів, що використовуються у З5Е 7.2.411. Утворення ЕХР за допомогою Вхі!1

Згідно Огоцеї еї аї. (іп 1994, Віоїеснй. 5 Віоєпа. 43:1075-1080), ЕХР утворення ЕХР каталізується Т. геезеї Вхі/1 через і трансксилозилювання, і реакцію зворотного гідролізу. Фігура 5 показує, що утворення ЕХР при дріжджових 55Е-умовах, описаних вище, збільшувалося в присутності Т. геезеї Вхі1. При додаванні 5 мг/г Вхі1 утворення ЕХР збільшувалося від 5,5 г/л до 18,8 г/л.

ЕХР утворення при рекомбінантних 7утотопаб5 тобіїх З5Е-умовах з субстратом, що містить 25 ваг. 95 сухої речовини попередньо обробленої розбавленим аміаком кукурудзяної соломи, було також збільшене в присутності Т. геехеі Вхії, як показано на Фігурі 6. ЕХР виходить на плато при концентрації 25, г/л, при додаванні б мг/г Вхі!ї Т. геезеі.

Целюлазний/геміцелюлазний ферментний комплекс із штаму Ме229 Т. геезеії з вбудованим геном (що надекспресує ксиланазу Хуп3 Т. геезеї) був використаний у цих експериментах замість АссеПегазетм 1500 ї- ксиланаза Мийітескя. Здатність Вхі! Т. геезеї каталізувати ЕХР утворення надзвичайно висока, тому що при додаванні його в концентрації лише 1 мг/г частка

ЕХР збільшується більше ніж у два рази в порівнянні з контрольними зразками (ферментний бо комплекс зі штаму Ме229 Т. геезеї з вбудованим геном).

Був досліджений ефект додавання геміцелюлази Ризагішт мегіісіЦПоїде5 на ЕХР утворення.

АссеїПегазе"м 1500 яї- ксиланаза Мийтесів, АссеПегазе"м 150054ХІпО і ферментний комплекс зі штаму Ме229 Т. геезеі з вбудованим геном, при додаванні Вхії і геміцелюлаз Ризагійт мегпіісіПоіде5 (БмМЗА і Ем51А І-а-арабінофуранозидази були використані. Дане дослідження проводили при рекомбінантних 2утоптопа5 З5Е-умовах. Використовуваний субстрат складав 25 ваг. о сухої речовини попередньо обробленої розбавленим аміаком кукурудзяної соломи.

Результати показані на Фігурі 7, що показує, що при додаванні ХіпО і АссеїЇегазе"м 1500 виробляли більше ЕХР (31,5 у порівнянні з 19,5), чим при додаванні ксиланази Мийескю і

АссеїІегахе м 1500. Ферментний комплекс зі штаму Ме229 Т. геезеї з вбудованим геном, сам по собі виробляв найменшу кількість ЕХР (9,1 г/л) серед усіх трьох ферментних конфігурацій. Це можливо через те, що ВхіїЇ являв собою меншу фракцію з загальної кількості білків у ферментному комплексі штаму Ме229 Т. геезеї, котрий також виробляв відносно велику кількість накопиченої ксилобіози в порівнянні з двома іншими ферментними конфігураціями. Для

АссеПегазе м 1500 ї- ксиланаза Мийітеске і АссеПегазе м 1500-ХІпО, додавання ЕмЗА або Ем51А не приводило до істотного збільшення ЕХР утворення. З ферментним комплексом зі штаму

Мо229 Т. геезеї з вбудованим геном, однак, додавання тільки ЕуЗА дає дворазове збільшення

ЕХР утворення, при цьому додавання Ем51А збільшило ЕХР утворення в 1,4 рази в порівнянні з

З-кратним збільшенням ЕХР утворення при додаванні Т. геезеї Вхії до ферментного комплексу, отриманого зі штаму Мо229 Т. геезеї з вбудованим геном. 7.2.4.2. Утворення ЕХР при використанні очищених ферментів

Результати, розглянуті вище, показують, що утворення ЕХР було сильно піддане впливу й ефективно каталізовано Т. геезеї ВХ! і що Т. геезеї ВхІ!1 у найвищій мірі й особливо ефективний при утворенні ЕХР при 55Е-умовах при використанні біомаси деяких субстратів з високим вмістом ксилану. Однак, усі ферменти, перевірені дотепер (і описані вище) були не очищені і можуть містити фонові ферментні активності, подібні до таких у Т. геезеї Вх/1, здатному до утворення ЕХР. Для дослідження дії фонових ферментних активностей також була вивчена дія очищених ферментів на утворення ЕХР. Суміш целюлаз очищених целобіогидраз Т. геезеї

СВНІ ї СВН2О; ендоглюканази Т. геезеї ЕС2 і Д-глюкозидази Т. геезеї ВДд1, використовували для заміни АссеПегазе"м 1500, при цьому очищений Хуп3 Т. геезеі використовували для заміни

Зо Мийітесі м ХуІапазе. З результатів, зображених на Фігурі 8, зрозуміло, що сама по собі целюлаза не виробляє ЕХР. Додавання неочищеного Хуп3 Т. геезеії приводить до вироблення великої кількості ЕХР, наприклад, близько 13,1 г/л. Причиною цьому значному збільшенню служить більший фон Т. геезеї Вхі1, що присутній серед неочищених ХупЗ зразків. Т. геезеї. 7.2.4.3. Утворення ЕХР при використанні ферментів Вхі! класу ОНАЗ.

ВХ, що є гідролазою сімейства ЗНЗ, як було показано, є активним і ефективним при каталізуванні утворення ЕХР при 55Е-умовах (вище). Залишається питання стосовно можливості Д-ксилозидаз іншої ЗН сімейства В-ксилозидаз також каталізувати утворення ЕХР при подібних умовах. Ряд В-ксилозидаз з ЗНАЗ сімейства, що включає Ем43В, РІ43ЗА, Ем4ЗЕ і

АТЗА, були протестовані при рекомбінантних 2утотопах 55Е-умовах при використанні 25 ваг. 96 сухої речовини субстрату попередньо обробленої розбавленим аміаком кукурудзяної соломи. РІ4З3А, Ем4ЗЕ і АТЗА, як було виявлено, незначно збільшують утворення ЕХР в порівнянні з контрольним зразком, виготовленим із препарату білка штаму Ме229. З іншого боку,

Ем43В дає велике збільшення утворення ЕХР в 1,5 рази (Фігура 9). Через те що усі ферменти сімейства СН4З були експресовані в Т. геезеї, а також тому, що в даному дослідженні усі вони є неочищеними білковими препаратами, можна припустити, що збільшення утворення ЕХР може бути пов'язане з присутністю нативного Вхі! у білкових препаратах. 8. ПРИКЛАД 2: ЗНИЖЕННЯ ЕХР ЗА ДОПОМОГОЮ ГЕМІЦЕЛЮЛАЗ

Наступні приклади демонструють, що ЕХР зменшується при додаванні визначеної геміцелюлази до 55Е-реакцій. 8.1. Зниження ЕХР за допомогою Ем430 у 55Е 2утотопав

Утворення ЕХР звичайно споживає як ксилозу (безпосередньо, або з ксилобіози, або інших ксилоолігомерів), так і етанол на рівній молярній основі. Цей механізм споживання безпосередньо приводить до значного зменшення виходу етанолу, тому що багато мікроорганізмів, включаючи 7утотопав, нездатні до розкладання і ферментації або утилізації

ЕХР в інший спосіб. Обчислено, що один (1) г ЕХР є еквівалентним втраті 0,688 г етанолу, який міг бути отриманий (припускаючи, що ксилоза ферментується в етанол з коефіцієнтом 0,51 г/г ксилози). Таким чином, запобігання утворенню ЕХР може приводити до супутнього збільшення виходу етанолу. Було виявлено, як показано на фігурі 10, що додавання р-ксилозидази

Еизагішт мегіісіПоіїде5, Ем43О, з розрахунку лише 1 мг/г ксилана значно знижує («тв 4 рази) бо кількість утворених ЕХР за 55Е-умов з рекомбінантним 7утотопав.

8.2 Зниження ЕХР за допомогою Ем430 у 55Е дріжджами

Подібно до результатів, що отримані з С5/Сб6-ферментуючим рекомбінантним 7утотопав, додавання АссеїЇегазетм 1500-Мийтеске Ксиланази разом з Ем43О0 у 55Е-реакцію, з використанням дріжджів у якості Сб-ферментуючих мікроорганізмів, також приводить до зниження утворення ЕХР. А саме, додавання Ем430 з розрахунку 1 мг/г ксилана приводить до 2-

З-кратного зниження ЕХР (Фігура 11). 8.3 Зниження ЕХР за допомогою Ем43О0 у 55ЗЕ Миййесі ксиланазою, разом з ХіпА й ферментним комплексом зі штаму Ме229 Т. геезеїі з вбудованим геном

Було досліджено зниження ЕХР при додаванні Ем430О0 до трьох ферментних конфігурацій,

АссеїІегазе м 1500-Миййескю Ксиланаза, АссеїІегазе"м 1500ксиланаза А. підег й ферментний комплекс, отриманий зі штаму Мо229 Т. геезеі з вбудованим геном, за 55БЕ-умов з рекомбінантним 7утотопах. Субстратом, що використовувався, був попередньо оброблений розведеним аміаком стрижень кукурудзяного качану з 25 ваг. 9о сухої речовини.

На фігурі 12 показано, що додавання Ем43О0 з розрахунку лише 1 мг/г ксилана до

АссеїІегазе м 1500-Мийітескю Ксиланази і до АссеїІегазе"м 1500кХІпА приводить до більш ніж чотирикратного зниження в утворенні ЕХР, а таке ж саме додавання до ферментного комплексу, що отриманий зі штаму Ме229 Т. геезеі з вбудованим геном, приводить до 1,36- кратного зниження утворення ЕХР. У той же час, спостерігали відповідне збільшення етанолу з усіма трьеома ферментними конфігураціями, що підтверджує перевагу Ем43О з точки зору зниження утворення ЕХР й запобігання втраті виходу етанолу. 8.4 Зниження в утворенні ЕХР в 55Е очищеними ферментами

Для того, щоб упевнитися, що зниження ЕХР з Ем430 відбувалося не внаслідок фонових ферментних активностей, для перевірки знижень в утворенні ЕХР були використані очищені ферменти, включаючи очищений Ем430. Целюлазну суміш Т. геезеі з очищених СВНІ, СВН2,

Еб2 і Во використовували для заміни АссеїПегазе"м 1500, а очищений ХупЗ3 Т. геезеї використовували для заміни Мийіескю Ксиланази. Результати, які зображені на Фігурі 13, демонструють незначне зниження в утворенні ЕХР і супутнє невелике збільшення в титрі етанолу при додаванні очищеного і неочищеного Ем430О0. Порівняно невелике зниження в утворенні ЕХР, імовірно, відбувалося через відсутність фонової Вхі!ї Т. геезеії в очищених

Зо ферментах (наприклад, целюлазах і Хуп3). Також відзначено, що лише невелика кількість ЕХР (5,7 г/л) утворилася у контрольному зразку через дію Хуп3З Т. геезеі Подальше додавання

Ем4з0р, таким чином, істотно не знижує утворення ЕХР. Щоб дослідити це додатково, виконали інше дослідження, результати якого показані на Фігурі 14А, що досліджує ефект зниження ЕХР при додаванні Ем430 у присутності великої кількості Вхі1. 8.5 Дозова залежність зниження ЕХР внаслідок додавання Ем430 у 55Е

Утворення ЕХР у присутності Вхі!1 було істотним, причому систематично визначалося більш ніж 20 г/л ЕХР, хоча точна кількість змінювалася за 55Е-умов, що використовувалися. Вивчення дозової залежності виконали, щоб визначити зниження в утворенні ЕХР відносно кількості

Ем4а3О, що додавалася. На фігурі 14А показані результати зниження ЕХР при додаванні зростаючої кількості ЕмА3О до ферментного комплексу, отриманого зі штаму Ме229 Т. геезеї з вбудованим геном і Вхі! Т. геезеї. Подібно до результатів, які показані раніше, було виявлено, що 1 мг/г Ем430 ефективний в зниженні утворення ЕХР приблизно в З рази, й у той же час приводять до збільшення титру етанолу. Однак, додавання зростаючих кількостей Ем430, з розрахунку 3, 6 і 9 мг/г, не знижує значним чином утворення ЕХР, хоча спостерігали значне збільшення титру етанолу. Виявляється, що навіть при додаванні великої кількості Ем430 (9 мг/г), концентрація ЕХР не може знижуватися нижче 6,6 г/л, тобто рівня, при якому кількість ЕХР може досягати рівноваги за специфічних умов, які застосовували при дослідженні. За цих визначених експериментальних умов подальше додавання Ем430, що є вищим, наприклад, за 1 мг/г ксилана, більше не впливає на зниження утворення ЕХР.

Ці дослідження потенційно можна пояснити механізмами утворення і зниження ЕХР за 55БЕ- умов.

Запропонований механізм, що базується на спостереженнях, проведених у даному винаході, і погоджується з даними, наведеними в літературі (див., наприклад, Огоцеї еї аї., 1994,

Віотесн. « Віоепд. 43:1075-1080 і 2папод єї аї., 2009, Еплуте апа Місгоріа! Тесппоіоду 44:196- 202), докладно описують нижче в Прикладі 3. 8.6 Зниження ЕХР шляхом додавання Ео43А і 5743А до 551

Ео43А і 07243А, які є перетворювальними В-ксилозидазами сімейства СНа4іЗ, також перевіряли на ефективність знижування утворення ЕХР за 55Е-умов, що описані у даному документі. На підставі результатів, показаних на Фігурі 14В, кожний з цих двох ферментів був бо здатний знижувати утворення ЕХР приблизно в 4 рази при додаванні їх до ферментного сполучення, що містить білюовий комплекс, отриманий зі штаму Ме229 Т. геезеї з вбудованим геном, Вхі1!Т. геезеії, субстрату з попередньо обробленого розведеним аміаком стрижня кукурудзяного качану, і рекомбінантного 7утотопах і З мг/г ксилана. Подібно до того, що спостерігали з додаванням Ем430 (вище), спостерігали зниження утворення ЕХР і відповідне збільшення (на близько 10 г/л) титру етанолу. 9. ПРИКЛАД 3: МЕХАНІЗМ УТВОРЕННЯ ЕХР

Спостереження, у яких вихід ЕХР був приблизно в чотири рази вищий за 55Е-умов (Фігури ї 11) у присутності Д-ксилозидази ЕмЗА Ризагішт мепісіПоїде5 у порівнянні з виходом ЕХР у присутності В-ксилозидази Ем430 Ризагішт мепісійоіде5, призвели до спроби зрозуміти механізм 10 утворення ЕХР.

Потенційно існує два можливих шляхи утворення ЕХР: (1) шляхом трансглікозування; або (2) шляхом зворотнього гідролізу. Кожний з цих шляхів представлений нижче: 1) Трансглікозування: Х-О-ХАЕЮН -» Х-О-ЕЇХ 2) Зворотний гідроліз: ХАН «» Х-О-ЕНННгО

Згідно Огоцеї еї аї. (іп 1994, Віоїесп. 5 Віоепд. 43:1075-1080) механізм трансглікозування більш швидкий із двох. Той факт, що в реакції трансглікозування утворюється лише В-аномер (див. фігуру 29), припускає, що реакцію каталізують ферменти, які функціонують зі збереженням аномерної конфігурації, на субстратах, де цукри зв'язуються р-глікозильними зв'язками. З іншого боку, утворення В-аномеру ЕХР шляхом зворотного гідролізу буде означати, що вихідним субстратом є а- або рД-ксилоза в залежності від того, або ЕХР утворюється внаслідок інверсії або збереження аномерної конфігурації, відповідно.

В-ксилозидази, ЕмЗА (член сімейства ЗНЗ) і Ем430 (член сімейства СН4З3), функціонують зі збереженням і інверсією конфігурації, відповідно. Щоб розрізнити і визначити, який із двох потенційних механізмів, що описані вище, є вірним механізмом, здійснили експеримент, у якому

Мийітескю Ксиланазу (яка є ферментним препаратом, що характеризується зберігаючою активністю, Хуп2 Т. геезеі і очищені Ем430 і ГмЗА інкубували при 46 "С із ксилобіозою і етанолом. Кінетику утворення ЕХР у цих зразках визначали за допомогою НРІ С.

Як показано на Фігурі 15 і в Таблиці 3, після короткого періоду часу Микітескю Ксиланаза разом з ЕмЗА продукували значну кількість ЕХР, що, як виявилося, відповідає утворенню

Зо ксилози (тобто, з постійним співвідношенням утворення ЕХР до утворення ксилози у часі). З іншого боку, коли з Мийескюй Ксиланазою застосовували Ем43О0, ЕХР виник з істотною затримкою відносно утворення ксилози. Можна припустити, що Мийтеск» Ксиланаза і ЕмЗА швидко продукували ЕХР шляхом трансглікозування. Адукт ксилози і ферменту через складно- ефірний зв'язок може бути утворений спочатку за допомогою С1 аномерної інверсії з наступною вторинною інверсією етанолом, з виконанням 5м2 заміщення на С1-вуглеці приєднаної ксилози з карбоксильною групою активного центра. Подвійна інверсія дає збереження конфігурації в продукті. З іншого боку, Ем430, як виявилося, не каталізує реакцію трансглікозування; замість цього він продукує ЕХР набагато повільніше завдяки зворотньому гідролізу. Оскільки Ем430 функціонує з інверсією аномерної конфігурації, ЕХР ймовірно утворився з а-Ю-ксилози, яка у свою чергу утворилася з ксилобіози завдяки Ем43О0, а також при інверсії С1 В-Ю-ксилози у водяному розчині. На Фігурі 15 вказано, що ЕХР може також утворюватися шляхом зворотнього гідролізу із ксилози, каталізованої Мийіескю Ксиланазою. Оскільки у цьому випадку зберігався р-ксилозидазний механізм, імовірним субстратом цієї реакції була В-О-ксилоза. 9.1 Рівняння рівноваги для утворення ЕХР

За 55Б-умов Миййескю Ксилоназа і Ем3ЗА взаємодіють не лише з ксилобіозою, але й з великими олігомерами ксилози. Гідроліз таких олігомерів може призводити до підвищеного утворення ЕХР, якщо при розрізуванні один з олігомерних продуктів трансглікозується з утворенням етил-глікозилового адукту. Подальше розрізування шляхом трансглікозування може потім утворити додатковий етиловий адукт, так, що відношення утворення ЕХР до утворення ксилози може бути більшим, ніж спостерігали, коли трансглікозувалася лише ксилобіоза.

Наприклад: 3) ХА-ЕЮН -» Х2-Еї-Х2 4) Х2-ЕНЕЮН -» 2ЕХР 5) Х2АЕЮН -» ЕХРАХ

Відзначено, що при трансглікозуванні однієї ксилобіози в реакції рядка 5 відбувається утворення одного ЕХР

Ці можливості досліджували порівнянням гідролізу ксилозних олігомерів (середня молекулярна вага - 539) з таким ксилобіози, використовуючи кожний з тих же трьох ферментів:

ЕмМЗА, Ем430 і Мийтесів Ксиланаза. Результати показані на фігурі 16. бо Графіки на фігурі 16 (ліва панель) і фігурі 16 (права панель) є відношенням КІ площ піків

ЕХР до Ксилози, утворених після інкубації ксилобіози (20 мг/мл) (Фігура 16 (ліворуч)) або ксилозного олігомеру (20 мг/мол) (фігура 16 (праворуч)) з 0,9 М ЕЮН при 46 "С у присутності

Мийтеске Ксилонази (560 мкг/мл), Ем430 (36 мкг/мл) або ЕмузЗА (54 мкг/мл), у концентраціях, що дали би швидкості утворення ксилози, що були в межах двох порядків один від іншого.

Швидкості утворення ЕХР були майже однаковими для ксилобіози і ксилозних олігомерів у присутності Мийтескю Ксилонази й Ем430. Однак, у випадку ЕуУЗА вихід ЕХР був приблизно на 1/3 вищим у присутності ксилозних олігомерів у порівнянні з присутністю ксилобіози. Як відзначається вище, це спостереження припускає те, що принаймні для ЕмЗА може здійснюватися трансглікозування з етанолом при розрізуванні більш великих олігомеров, ніж ксилобіоза. Таке трансглікозування зхарЗ олігомерів, як виявилося, не здійснюється як переважне у випадках Мийтеске Ксиланази, хоча вихід ЕХР виявився вищим, ніж той, що спостерігали для ЕуЗА у випадках як ксилобіози, так і ксилозних олігомерів. Цей підвищений вихід ймовірно є ознакою більш високої швидкості трансглікозування з етанолом для Мийтеске

Ксиланази, ніж для ЕмЗА. Є дивним той факт, що як для Мийтескю Ксиланази, так і для ЕмЗА

ЕХР утворюється в кожній з 2,5-3,5 реакцій розрізування, з огляду на те, що молярність етанолу складає 0,9 М у порівнянні з 55 М для НгО. Селективність відносно етанолу ймовірно означає більшу спорідненість до етанолу в порівнянні з водою у або біля активного центру визначеного фермента, при цьому спорідненість більш висока для Мийтеске Ксиланази стосовно такій для

ЕмЗА. Відношення ЕХР до ксилози є однаковим для Ем430О із ксилобіозою або ксилозним олігомером у якості субстрата, що можна пояснити тим фактом, що у випадку Ем430 ЕХР утворюється зворотним гідролізом із ксилози, що була продуктом гідролізу як ксилобіозних, так і субстратів з ксилозних олігомерів.

У випадку Мийеске Ксиланази і ЕмЗА максимальний вихід ЕХР досягається після 3,5 годин інкубації. Вихід ЕХР на цьому етапі інкубації з використанням Миййеске Ксиланази був приблизно у 7-8 разів вищим, ніж вихід ЕХР, отриманий, з використанням Ем430. Після 3,5 годин вихід ЕХР знижується у реакції з Мийтеске Ксиланазою і реакції з ЕмЗА з її» 40-60 годин.

Реакція, що включає ЕмЗА, була, імовірно, каталізованим ферментом гідролізом ЕХР від найбільшого значення, утвореного в реакції трансглікозування, у напрямку до рівноважного значення ЕХР/ксилози, що утворюється внаслідок зворотного гідроліза. У ЗЗЕ-реакціях

Зо швидкість утворення ЕХР і уповільненість наступного ЕХР гідролізу в присутності ВД-ксилозидаз із зберігаючою активністю, припускає те, що концентрація ЕХР ймовірно залишається істотно вищою протягом З5Е-реакції, коли присутня зберігаюча В-ксилозидаза, ніж коли присутня перетворювальна рВ-ксилозидаза. Надалі це припускає, що заміщення зберігаючих В-ксилозидаз перетворювальними В-ксилозидазами в 55Е-реакціях було б корисним для виходу продукту.

Відзначено, що усі вищезгадані реакції каталізуються ферментами. Контрольні зразки/реакції за відсутності ферментів не продемонстрували утворення ЕХР при інкубації ксилобіози, ксилозних олігомерів або ксилози в присутності 0,9 М етанолу при 46 "С. 9.2 Обчислення константи рівноваги

ЮОгоцеї єї аї. (іп 1994, Віоїесп. а Віоепд. 43:1075-1080) було запропоновано, що ступінь утворення алкілксилопіранозиду (АХР), наприклад, ЕХР, при зворотному гідролізі можна визначити за рівновагою, що встановлюється між спиртовим, ксилозним (ІП алкілксилопіранозидним продуктами.

Константа дисоціації для етилксилопіранозиду (ЕХР) буде:

Ка - (ксилозаЦЕєЕЮНІ

ІЕХРІ

Використовуючи цю формулу, з даних фігури 2 можна обчислити константу рівноваги, Ка дорівнює 27 М, коли в 55Е-реакції була присутня Мийтескю Ксиланаза. Також, використовуючи цю формулу, з даних фігури 16 можна обчислити константу рівноваги Ка близько 9,4 М, коли у

ЗОЗЕ-реакції був присутній Ем43О. За Огоцеї еї аЇ. (1994, Віоїесп. Віоепд. 43:1075-1080), використовували В-ксилозидазу Т. геезеі й обчислили, що Ка дорівнює 40 М, хоча, як виявилося, концентрація ЕХР не досягла константи рівноваги навіть після 160 годин інкубації.

Усі вищевказані обчислення констант рівноваги здійснені з 55Е-реакцій, що початі з ксилози і етанола, за винятком результатів, зображених на фігурі 16 дійсного розкриття, де ксилобіоза і ксилозні олігомери були цілком гідролізовані за допомогою Ем430 упродовж 20 годин, але 55Е- реакції дозволили тривати в цілому 145 годин. У такий спосіб припускають, що Ка падає в діапазоні від близько 10 до близько 40 М і ймовірно ближче до нижнього значення, тому що перетворювальна р-ксилозидаза Ем430 продукує значну кількість ЕХР зворотною реакцією при рівновазі. 10. ПРИКЛАД 4: ВИДАЛЕННЯ ВХІ1 ГЕНА З Т. геезеї бо 10.1 Конструювання рхі! делеційної касети

Для конструювання рхі!ї делеційної касети, 5" і 3" фланкуючі послідовності гена рхі1 (МагаооїІе5-Сіа/К еї аї!., 1996, Арр. Епмігоп. Містобріо!. 62(10):3840-6) з геномної ДНК Тгісподегпгта геезеї ампліфікували за допомогою ПЦР із праймерними парами МНЗ75/МНЗ76 ії МНЗ77/МНЗ78 відповідно (показано в Таблиці 4), використовуючи РішШНга І Ривзіоп Н5 ДНК-полімерази (Зігаїадепе). 3З'-фланкуюча послідовність містила частину кодуючої послідовності Вхі!1, щоб уникнути прилеглого гена бді1. Праймер МНЗ76 був фосфорильований на 5'-кінці. Один (1) мкл

Т4 ДНК-лігази з концентрацією 5 од./мкл (Коспе Арріїей Віозсіепсе), 1 мкл 10Х буфера для лігування (Коспе) і приблизно 20 нг ПЦР-фрагментів інкубували протягом 10 хвилин за кімнатної температури в загальному об'ємі 10 мкл. Реакційну суміш для лігування застосовували як шаблон для ПЦР-реакції з праймерною парою МНЗ79/МНЗ80 і РішШнга ПЇ

Еизіоп Н5 ДНК-полімеразою (5ігагадепе).

Отриманий фрагмент у 4,0 т.н. клонували в рскК-Вішпі ІПІ-ТОРО відповідно до інструкцій виробника (Іпмігодеп). Плазміду трансформували в хімічно компетентних клітинах Е. соїї Опе

Зпокш ТОРІО (Іпмйгодеп). Колонію, що містить 4,0 т.н. рхії 5-3" ПЦР гібридного продукту, клонованого у ТОРО вектор, ізолювали. Плазміду екстрагували за допомогою плазмідного очищення СіаРгер (Оіадеп) і підтвердили її послідовність (5едциебесі, Моипіайп Міем/у, СА).

Отриману плазміду розщепили з Асі і Азс (МЕВ), щоб забезпечити наступне клонування з фрагментом, що містить ген резистентності до гігроміцину.

Ген резистентності до гігроміцину ампліфікували з праймерами МН292/МН290 з вектора, що містить оС промотор АзрегуйШив5 підшап5, ген резистентності до гсігроміцину (Б. соїїЇ, гігроміцинфосфотрансфераза, прп) і Ігр термінатор Азрегойиз5 підшапв, застосовуючи РішШнга ЇЇ

Еивзіоп Н5 ДНК-полімерази (5ігаїадепе). ПЦР-ампліфікований фрагмент клонували в рекК-рішпі

П-ТОРО (Іпмігодеп) і трансформували в хімічно компетентних клітинах Е. соїї Опе пок ТОР10 (Іпмігодеп). Колонію виділили і підтвердили секвенуванням, що у екстрагованій плазміді знайшли мутований 5" Авбс рестрикційний сайт, що був заміщений на Маг сайт (аабабасбо-сОосСОоСссс). Конструкцію потім розщепили Маг (Коспе), А5с (МЕВ) і Ога (Коспе) і виділили отриманий фрагмент у 2,5 т.н., застосовуючи набір для гель-екстракції Оіасйиціск згідно протоколу виробника (СОіадеп), у ході підготовки для клонування згодом у ВХхі!-делеційну плазміду.

Зо Лігування двох виділених фрагментів, як описувалося вище, виконали з 1 мкл 10Х буфера для лігування (Коспе), 1 мкл/5 од./мл Т4 ДНК-лігази (Коспе) і 50 нг кожного фрагмента в об'ємі реакційної суміші 10 мкл. Суміш для лігування клонували в хімічно компетентні клітини Е. соїї

Опе пок ТОРІ, і виділили окремі колонії. рхі1-делеційний вектор (фігура 17, рекК-ВійпІ-

ТОРО, рХхІ1 делеція, прі-іох), що містить ІохР-фланкований ген резистентності до гігроміцину, виділили з Е.соїї і належне лігування перевірили за допомогою рестрикційного розщеплення, з використанням Вітії, що приводить до утворення 4 фрагментів з 4754, 2195, 1899 і 1182 пар основ. рхІ1-делеційну касету створили ампліфікацією фрагмента з плазміди рСЕ-Війпі-ТОРО, хіт делеції, прі-іох, застосовуючи праймери МНЗ79/МНЗ80 у загальному об'ємі 10 мл і РішШкКга ІЇ

Еивзіоп Н5 ДНК-полімеразу (5ігаїадепе). ПЦР-продукт очистили і концентрували, застосовуючи набір Оіаехі! (Оіадеп). ДНК додатково концентрували за допомогою Зреєамас до концентрації близько 1,5 мкг/мкл. 10.2 Трансформація БХхІ! делеційної плазміди у Т. геезеї

ДНК з рхіІ1-делеційної касети трансформували в штам Ме229 Т. геезеї, що надекспресував

Ва! Т. геезеї і Хуп3Т. геезеї, як описано в даному документі раніше. Трансформанти відібрали на середовищі, що містить 100 частин на мільйон Гігроміцину В (Іпмігодеп). Трансформант, що містить Бхії делецію, відібрали за допомогою ПЦР. Штам Т. геезеії, позбавлений БХхІі!, називають в даному документі як "рхі1-" штам. 11. ПРИКЛАД 5: ЕКСПРЕСІЯ їм430 ШТАМОМ Т. Кеезеї

У наступних прикладах показано, як конструювали Тгісподегта геезеї для експресії Ем430.

Штам Т. геезеї, сконструйований для експресії Ем43О0, називають у даному документі як "Рм430-7 штам 11.11 Побудова експресійної касети

Експресійну касету Ем430 р-ксилозидази Р. мепісіййоідеє побудували ПЦР-ампліфікацією гена Ем43О зразка геномної ДНК Р.мепісШоїде5 за допомогою праймерів 5К1322/5К1297 (Таблиця 5). Ділянку промотору ендоглюканазного гена едії ампліфікували за допомогою ПЦР зі зразка геномної ДНК Т. геезвеї, який екстраговано із сконструйованого штаму КІ-РЗ7 Т. гееввї (див., наприклад, Зпеїг-Меїв5 Сх. апа В.5. Мопієпесоши, Аррі. Містобріо!. Віоїесппоіоду, 20 (1984) рр. 46-53) за допомогою праймерів 5К1236/5К1321. Ці два ампліфікованих фрагменти були бо згодом злиті разом у ПЦР-реакції злиття за допомогою праймерів 5К1236/5К1297. Отриманий

ПЦР-фрагмент злиття клонували у вектор рСК-Вішпі 1І-ТОРО (Іпмігодеп) з виходом плазміди

ТОРО ВішпуРедії-Рм430 (Фігура 18), що була, у свою чергу, використана для трансформації хімічно компетентних клітин Е. соїї Опе поко ТОРІ10 (Іпмігодеп). Плазмідну ДНК екстрагували з декількох клонів Е.соїї і підтвердили рестрикційним розщепленням.

Еспресійну касету з ТОРО Вішп/Реді1-Єм430О0 ампліфікували за допомогою ПЦР із використанням праймерів 5К1236/5К1297 (Таблиця 5) для створення ДНК-продукту для трансформації Т. геезеії. Експресійну касету трансформували спільно з наявною маркерною касетою для добору, що містить ген аіІ5 (ацетолактатсинтаза). 11.2 Трансформація Т. геезеї з дефіцитом по рхі! експресійною касетою Ем430

Штам-хазяїн Т. геезеї з делецією по Бх!ї трансформували експресійною касетою Ем430 (що містить промотор есд1, відкриту рамку зчитування Ем430 і нативний термінатор Ем430)) і наявною маркерною касетою для добору, що містить нативний ген аіє5, за допомогою стандартних способів трансформації, таких як, наприклад, електропорація (див, наприклад, РСТ публікацію патентної заявки М/О 08/153712). Трансформанти відбирають на агарових чашках з мінімальним середовищем, що містить хлорімурон-етил. Ці трансформанти є Бхі1"Рм430-Т. геезеі. 11.3 Трансформація Т. геезеї, яка експресує БхІ!1, експресійною касетою Ем430

Штам-хазяїн Т. геезеї, що має ген рхі! дикого типу (див., РСТ публікацію патентної заявки

УМО 2005/001036 А2) трансформували експресійною касетою Ем430 (що містить промотор есд1, відкриту рамку зчитування Ем430 і нативний термінатор Ем430)) і наявною маркерною касетою для добору, що містить нативний ген аії5, за допомогою стандартних способів трансформації, таких як, наприклад, електропорація (див., наприклад, РСТ публікацію патентної заявки М/О 08/153712). Трансформанти відбирали на агарових чашках з мінімальним середовищем, що містить хлорімурон-етил. Ці трансформанти є Ем430-Т. геезеі. 12. ПРИКЛАД 6: ЗАСТОСУВАННЯ СКОНСТРУЙОВАНИХ ШТАМІВ Т. геезеї, ЩО продукують целюлазу, У 557

Трансформанти рхі1"Рм43О-Т. геезеі і Ем4а3О-Т. геезеі застосовують для одержання культуральних рідин, що містять целюлазу. Ці культуральні рідини згодом застосовують у 55І- реакціях у безперервних, періодичних схемах або з підживленням, як описано в даному документі, для зниження продукції АХР і зниження втрати виходу цукрів за допомогою

Зо продукування транс-ксилозилювання продукту зворотного гідролізу.

У визначеному прикладі трансформант штаму Ме229 рхі1-Т. геевзєї (229 ВхіІ дае!" культивували для одержання культуральної рідини, що містить целюлазу, яку потім доповняли очищеним ВХІі! Т. геезеї (0,5 мг/м або 1 мг/м ксилана) або очищеним ЕМ430, 1 мг/м ксилана.

Концентрацію ЕХР і етанолу на 1 і З день розмістили на графіках на фігурах 43ЗА (День 1) і 438 (День 3), відповідно. Реакції проводили за 55Е-умов з рекомбінантними 7утотопа5 з використанням завантаження субстрату з 25 ваг.9о сухої речовини на основі стрижня кукурудзяного качану, попередньо обробленого розведеним аміаком.

Таблиця ї

Мроцеє Стостраї: Завантаження «рерхієвтцк КО надзлень ЕХЕ на лень звераею 0 Застоговуюкь: феряєнтанн 0 фермензаєні печовинон ЕК (ЕВ

Періодичний Глюкозаєксилоза Без лолананція 7т6 1553 (80 те в фермецта

З Глюкозаткевяюза Без додавання 780 0,99 твдживленняМ Во га г) що - фермента шини

НЕ Стриженькачана (255 А1ТОВМЕ З М

НК тен, (05 міг) ше НН

ЩЕ Стрижень качана 12505 АТ500МЕ 375 5-0 ікукурулян ох мот піні пкт

СБК з Єтрижецьачана 1256 ІОВ МЕ 40 143 іпідживлезням кУКУрУуди ЗОНУ міг : 5О0

Таблиця 2

Піннієє 00 бзбеграк. Жепляйона вантаження Фермент, що КОН наз ЕХР на З компознцін хвераню заетоств уні» лень лен субстрнча: речавинену | Фемечеянії 0 ферментанії

ШИ | ШИ Тл) БО

ТОНЕ Багаса: Зо 2 дім ща ОТ шишку | шо см І Й

ЗБЕ Маса з хнойної 8.0 но АТЯХНМЕ 48,6 8,73 перевини (2015 мп/г)

НЕ Зміпани маса З 20,75 | ни» АТЗИМЕ 1 | 3,52. люесуяної (ня мот) шо дерекини ' Ш «ЕЕ Змішана маса з 20,75 Пт дім 43 1657 листяної (Оу ми) леревнви

БЕ Зманана мася з 20,75 59 АІБОМЕ із Іва ! листяної (5 мот) деревини | !

Таблиця 3

Часітол. 0 МЕ І МЕ І Жк430 Ку КУЗА УЗА :ЕХР | кенилоза ЕХР кснлоза | ЕХР г Жсилоза 05 | 47400 91600 56 59800 44000 яю 1 72000 125000 4563 62500 М750 98300. 151000 М7ОЮ рові | О7000 98800 153000 118000 1 89100 150000 14000о 220000. яю 326000 94100 | 364000 0 Нлешалоказниказаломлення

Таблиця 4

Праймерні послідовності для конструювання бхі?-делеційної касети п ЩО

Назва ібеціВ 0 Праймерна кіеслідевнкть (яна Онаг праймера (Мо. і - а -- - секр кт кт кю тіні юю тю жит Я тт жо тю тку ж кт тт тіж ую

Мис 27 ВВС ОСС Оса АТААСТІСОТАТААТ Пе зворотний праймер Асі ІохР сайта 4

СТАТОСТАТАСОААСТТАТСВОСОВОСО

! ТАТТОСОТИТТАСО шк пи

Мц292 28 ПААлОССОСОССАСАПВАТААСТТСИаТАТА "Бра ерямий краймерослювного проматора с

НЕАТАСАТТАТАСОААЄТТАТеТрресирі ПохР сайта нт к асілоісрсваи - щк

МН: во: ссавісасстрісневсає і й й ВЕУ прямий Й

МН 10 |Ігаврасве С САТСТСТІТСЧАТСТСААСАЄ 0 ВХ Ж зворотний Адсї

МНІЙ; 031000 вапесдаісвосрісасввсснйсвасс. СТТВХИ У прямий ля АС мні 135 0/0 ТОСТОСАЛОСТТОЛАТОТААСАОС 1ВХИ у'зноротний праймер

ВІДС веВвастааерісіс о ЕВвхХі зчеплевийн с лелецієкпрамий праймер

Б Мми3во ІК ССТОСАТТСТТОСААСААСЦЮЄ ВХ зчеплений с делецією зворотний праймер

Таблиця 5

Праймерні послідовності для консгруювання експресійної касети й-ясвлозндаза КУА

КЕ. уепісйПоійех

Назва прайменя Праймерна послідовність (5-4 ЕОЮ

Прямий праймер САССАТОСАБСТСААСТТ СТО ТС 35 (ЗК1322) і о і Що

І Звор вені СТ ТАСТАНТСААСТОССССТТСТОТАСОПАО 36 праймер(ЗКІ297 | Й Й Що Шо Шо .

Прямий праймер С ОСОАТСВОБАСЄТТТТОЄТОАООТОВ 37

ОКО. м - я

Зворотний: ПАСАСВАДАСТ ТОСАОССТОСАТОСТОТООПАСААСААСААСО: Ії (прадмер(вКІ321) й й ще й і

Таблиця б

КОЮ 0 Нуклеотидна або. в п Обне Ш

МЕ зано Кіетевниа !

Нуклеотидна | Нуклеотилна послідовність для ЕУ430, родіна ферментів ЯНЯЗ

ВИМИ ін У т зпівіваіЙ

З, Нуклеотнлна Нуклеотадна послідовність ВХ, СНІ В-ксилознлаза з 0 Щ Тісйайеттва тей 4. Амінокислотна Послідовність біяка ВХ ОС Й (5. Нуклеотидна Нуклеогидна послідовність для ЕУЗА, родина ферментів СОНЯ Я С

Що Еихатіцт уєгисійоЇдЕх з Ренісій поп Ліпісщохит .

Послідовність білка РЕЇЗА | п шк

Нуклеотидна послідовність для ЕУ43Б, родина ферментів СНЯЗ С ! І 0 Із Кихаєійшт бекненНовех 6. " Амінокислотня Ііослідовність білка БУЯЗЕ й

Ії. Нуклеотидна Нуклеотидна послідовність ддя ЕхА3В, родина ферментів ЗНЯЗ тонн в іатнт Ус 13. ОАмінокислотна Послідовність білка ЕУЯ3В с я пн ЯЗ з Авренвійн лето пн

Послідовністьбілка ЛЯЗА с Й 15, Нуклеотидна "Нуклеотидна послідовність для ЕУ5і А, родина ферментів

БО кан лет Ніні я-- "ТПоспіловнютьойка ГА

Нуклеотидна ІШНуклеотинна послідовність для Хуп3, родина ксиланаз СНІ з

Ікіспоцента геехеї | і

Нуклеотидна Нуклеотидна послідовність для хівА, кеиланаза Язрегийнх с 127171 0. Вібіпренхіх нн шт -

Амінокислотна Послідовність білка хіпА. я ! Щ зЛЬБехена свй Й Що шо ші

РУ ІАмінокислотна І Послідовність білка СА 3 Евхакінт охухромивй

Послідовність білка ХупАЗ, родина ферментів СНАЗ з

Стеобасінйих зіеогоїВегтораиних Тв

Послідовність білка Ве, родина ферментів СНЗ з 7. геєвеї

Продовження таблиці б 39. ІНуклеотидня Пуклеотидна послідовність для ХіпЮ, родина ферментів СН з 14 збромісня | !

Амінокислотна Послідовність білка Хі. ШИ п

З. Нуклеєотидна Нуклеотидна послілонність РУЗОА; ролина ферментів (ЗНЗ

Що АК, екнсийоїйех І

Амінокислотна Послідовність білка РУХ я а, Нуклеотидна ІНуклеатидна послідовність ЕУЗОВ, родина ферментів СНО з

КоуекнсИноїйех 184. Амінокислотна Послідовність білка РУЗОВ 45, Нуклеотидна Нуклеотилна послідовність ГУЗ9А, родина ферментів НІ з ЩІ

Ж тепісййонісх ,

Амінокислотна Мослідовність білка ЕУЗОА, : 47, |Нуклеотидна ІНуклєотидна послідовність ЕХ39В, родина ферментів ОНЗУ з й Ж уемісійеїйев . ші жишш ян 48: 0000 Амінокнелотна 0 Послідовність білка ЕУ3ОВ 49. Нуклеотидна ІНуклеотниня послідовність Ус, родива ферментів СНІ з ! т: кассакоїуйснт 50. ІАмінокислотна: Послідовність білка ХУЛВ. ! нд віть шен - етилен О о вве уки аа ла о пот Є і. Пуклеотидна Нуклестидна послідовність УА, родиня ферментів СНУ від с. педкоаненторпй их 5, Амінокислотна Послідовність білка ХА Щ 53; Нуклеотидна Нуклеюотидна послідовність ХУЙ, родина ферментів СН5Я від

Т Копінві (А; Допінет) 54, Амінокислотна Послідовність білка ХУ Щ Й

ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ

«110» Дданіско США ІНК.

Гутиеррез, Крістіна

Мітчінсон. Колін

Хуанг, ТМ ТТ.

Дайнер, Брюс А.

Фаган, лЛол джозеф

Хітц. Вільям Д. г. «120» СПОСОБИ ПОЛІПЕЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ РЕАКЦІЙ ОДНОЧАСНИХ СЦУКРЮВАННЯ: Х

ФЕРМЕНТАЦІЇ кіз» 31433й0-2 «1405 РСТИЛИБ10И61087 «Щ41з 2010-12-17 «50» Ше 61/2859,917 «151 2069-12-93 -16502 55 «1705 васевттп версія 3.5 «РіО 1 «21ї» 71053 «І ДЯК , І «213» Бизакіцнют мектїтсі | іо0їіде5 «ах її акоасзастса зустІстокс ттісаосаєто гтостасстї гозссядсаз сКасустосо; ва саздасаста атчатаєссос ссстетавис вссоасстст сахстосада состссоєт 120 саєЯаттісєссо аддосавааст ссадаєстає ссаїтсесасо асатсдавос сватоєсоєс 1850 засдоасасєсоа дадасасеса стасоссато зоздаттакс асасстаттс сасодзасасс 240 акстасуцав вапаєсссяї Таєсзассат чдосуЕсЯстс ассадісуа тЧабїссса 300 тадоссавос досазаєута досксстдас дсядсібаса завасоосяд атаїтатстс 360 тасттссссо ссааодаєва адаєчачатс сссачааіта задттостає сессвасазд 420 ссєаасодтс стттсаадоє спасававос тадасссссо агасттасад таїсдатсст: «80 пстадстата тсСодасаєтаа тоаасозодся тасстсатст одаосддтає ствоасасває 540 саствсачо сстодсадоа ссасзадасє тЕсзатваді сотвасєсоо сдасааносі 600 асесссзасо адсассзасаєс сстатстсст Садзссосса зоастазосаай ддоасатосас 6бО аабдатсассо адасассссо саажсьсаєс атсссддсес седадасача саазкоссяЕ 728 сазасададцоа асзатаадсо асааттетес даадодасссє дадастсасла дсосадсаво 780 стоатастасс ссатасасес тассодсоас асосасттсс тсасстасоє дастєссава ков) часасєсстасо чссссатас статсаводс зайасестсо ассетуєсоа тоодеовасе 300 зсосатучзаа атассостоа дтасазудоа састатосх тогкстекає здатосусах збо астсустодая зодаксассї садзсасвате аадуссавчаз адахстоаха сзасавочає 1024 часаацасєтє касттастса сстаасат тад 3253 «2305 «в1іїх ЗО «ійх БІЛОК «213» Бизакіцт мектісії11ісіде5 «а00х 2 мех біп бКецш гу сне еп зег бек Аа ів цен івеу бек їв Те -Щ1у 1 1

Ап суб діа дів іп Ах те Ай дор Тіе Рго Рго Кеу те Твг Ар

Й у 30

Се тгроб5еб Аїа аеро Рго баг Аїа нів Уа! Ре біо біУу уз Ге тер 35 40 | 45.

Уа! Ту пто бег Ні А5р ге сін АТа Ап Уаї уві Ап біу твг осіу і г сіу АТа біп тук Ала Мет до Абротуг нія тТие Жук 5ег Меб зуб тА 65 пн хи 75 80 тіе Туг бі Цув ях? Вго уаї т1є дер нів сіу Уа! Аїа Мей ог Уа! хі 5 дер Ар Ма! РгОо тро діа тує біп бій Мех тгроАїа Рго дер дід діва 100 105 110

Туг рук АБИ б1у уз туг туго Гео Тут Рпе РгО АЇЯ 1уб5 А5р уз дер о лІ5 120 125 сш ІТе Ре дго Ів біу Уз1 Аза Уа1ї бег Ап вує Рко бег б1у Рго 150 135 140

Ре ву5 АтТа Абр обу бег тр ліве РРО 51у тТИКотуг заг Т16 А5р РгОо 145 ха що 155 їбо

АТа 5ег Тук уаї Ав ТК Аа Ту о! АТВ туго вбеу ї1їе тгробіу п1у

Те 170 175 те тгробту біу бій беч бій Аза Тер обів д5р Ні уз Тег оРве Ап 180 185 ! 150 сіб чек Тер без біу Ар вух АТа АТЗ РКО деп о біу ТК Ал Ав 1ец 195 | 200 295

Баг рго біп 116 АТа їу5 бец 5ег цуз Ар Ме ні цуз Т1е Твг ати 210 8215 | 220

ТигоРгО Аго Ар без уа! т1Іє їеш АТа во 1) Твг о біу ту5 Рг тен 225 230. 235 240 сіп Аїа бід АброА5п суз Ага Ага Рпе Ре бій біу Рго тер уаії Ні 245 250 255

Був Ага б1у рух без туго тук бен Меб туг 5ег тк 01 А5ротве нів 750 шк 265 270 ве іец о уа! Туг Аїа тк обер оїу5 Аби їш1е Тук с1у рго Тут ТИР тує 275 28а 285 сбіп о е1у уз Хі Сен Ар Рго маі Азрос1іу тер оТве тб нія су 5ег а. 295 300 їїе мазі бі туг їу5 сіу сіп о ТкроТгрогрей Рпе РпЄ Аа дер АЇТя Ні 305. | 315 ОЗ 320

Тнгоб5еє Ту вує Аєр туг ге АРУ св Маї бує АТа Ага цу Те Тер ! ШРІ 330 335

Туг д5р ух А5р о сС1у Му їТе ве Сес тТнг Ага бсо буз Т1е 340 345 550 «М З «241 9394 «гій ДНК «213» тгіскодегта гевевеї «бю З й агавдсозата асосадстст хсссвдссдєс стдтсастс хсстдєссас доссстодсе. бо сачазсавтс заасатасує свастастсь чстсадауесс васстазест стассседаб 120 асасттосся сусєсасасєт сесасосссс дассосддзає ахадсссссу свачаасває 180 сесосстЯто астсатсодс созстасокта даосоадссс арассстсає сссостстЕс 245 ассстсбазчоа адстсаєєст сазсасоасва вастсодоасс ссодсосасс хсосстадох 300 сесссаваст ассааєчессто дазкаадасє скдсасвасєє судассосує саасттсдсс 360 ассвадачса дссацітсда асодосаасс ссдттессса тодсесатесх састасчасо 420 ассстсазсс дсасаттаах ссассадатт дссдасатсз сстсавссса аостсазаса 480 тІсвосласа псудссуутта собксксовс астатосус сазаасоєсая кадсккссов 540 аассссстсї авадссотоо ссаддадчасо сссудслачеа аєдсстсск ссесдасьсс бо зссіасастї асчадтасаї сасатосаїє садаотачсо Есдасссстоа псасстсаваа 660 чіІтассасса сЗдсдната сттоссода тасавсессо адзастудаа саассатсс 720 саксесацету тсдасоссатє сасвастсао садорасстст ссудаатасста састосссад МЕ) тжсстсасто соадсесуєта тосаавотся сосадсетова тогусосата саастссоте каО азсчаосавоаєЄ ссвостатає сезсачсттс ттсстасада состтстаса саздаастод 900

Частсссссо аатодоадата саєстсосос дастосодато ссосстасаа соте тсаас 96 сстсаїтоаст зсоассвоасав ссаутссса одссоссосса зсісастасу адссодсасс 1020 здатаєсдасі осозісацас ттасссоцод сасстсвасо ауссстетає одассодсава 3О8о аістсссасо асозоаісуа осабсссотЄ асесукстах асоссваєст сахссвтсте 1140 зсасастссо асавазадза ссватассоє ссстсодст озавосаксоє соссаавася 120 вахтасстауа асатстсота соацпоуєтуст страасуса ссоїсстаЯасе савазаасоахт 1250 цасастстес сістестссаа пвасагесує зодсастостсс ЄЗаєсодаєс асддадссаає 1320 здссасвассс азахосавоую савстастає Засестоссс сатасеєсат саукестека 13850 пазастоста зозасоссод стаєсасосс аастттолас тсоусасада дзгсоссвас 1440 засзасасся стобсттОс сааддссаст остдссасса зоазастсода тассатсате. 1500 тасстсоосо Ззазтсдасяа сассаїтудаз саддадоясо стдассясаєс оуасаттост 1560 тодсссопта аїсаостоца сстсаєсазу садстсацсо адассодсаа вссссстдЕс 16520 птестовсава сусасочкчЯ ссадусадає хсатсстсос тсазузоєвгза сазузадвутс 1680 вастсссесо сстададзсаз ататсссдас садхісчадза асаїкоссст сттсдасати 1740 сІсСТСтдоса адсотоєтсс Коссоудссба стодеЕсСасса сссаовтасєсс дастедадтах 1800

Яастсассвзає їссСоссадаа совсСатозає Єєтссдассся атодазачіс азассостода ї8БО сасасттаса тїстабіасас содсазлассс дЕСТасдаді седосадтда сессткстас 1920 аєсасссєса зпоздастстї сассавадссає сссзададсс стсзадеЕтсва сасстсаєсо 1980 асстстств сесстсассе содоавтасасє сасадєчацс адаттоссою стбасесстс 2049 запассзаса їсаадзаєтс чадсвачаса дадтссссат атасаассат ості тасє 2300 сасасавоса асоастооссс анссссосає ссовзасазує дасесотсво астсдуассоа 2160 сттоссучаса ссазчсстоо їсастсттсс взадсесаяаса їссссаїтссс соссадеісе век сесосссЯата ттЧатсстса собааассоо астдтатаєс ссоадсавота стадостадсс 2289 тгозасасса асааотссуї даадсесоау став соуодадайоз одтаасоатє 2340 дабавстадс суто дЧа осавсадатс аводасеста сасстаасос акад 2394 «210» 4 «вії 799 «12» БІЛОК «213» ТРісводегта гевзаї «4005 4 мет Ма! дяп о Азп АТа АТа цен гбец АТа соч іє бек АЇТа ев ре го 1. 5 16 15 тТАг АТа ей пів сп АвиИ Ап бій Ме Туг Аїа да тує заг АТва сп

Кк Тк сіу їв го во Ге тТув рга фе ТвВе це Ата тв ів Ті гео 5ег зо ' 45

Ра вдо АБр сух «108 нів су Рко рем їух Ав лев рей омуаї Суб дер г: що сег бек Аїя Єєїу туг маі б Аго АТла біб дія без ті бег ген РНе 65 70 75 8 твг оїев ТО у (во 11е бец Ап те Бій деп баг о о1іу Рго Оу Уа! вто дра сей біу гей Рго деп тує сій Уа! Те о А5п сі АТа Сев нів 10. і 305 МО. сту цей аАбр Ага Аїа АБО РМ А1а Твг ому б1у б1у бій вле сій то 115 | 120 125

АТа тйг бек Ре Рго Мек Рго Хе цес тег ТВг ОАТа АТа Мей АЗИ. КО 130 | 135 шк 140

Тс оБбем тіє Ні сій ті Аз Абр тіє її баб тТиг об1іп Аа Агу Ата 145 150 155. бо

Рпе 5ег Аб5п бег біу Аго Туг су Бе Ар ма! туг АТасбко дей ма 165 і 170 5

Ап обіу Ре АгоЯ 5ег Рго бец тер су Аг біу бій бій ТнгорРго біу 180 185 | Ол. сі Ар Аїа РИ РНе Бец бег аг АТа туго тп отук біб тує тів тяг 195 00 205. І

ТУ ї116 біп с1у Ту ма1ї Ар Рг 1 нів беу су УаТ Аа АТа ТА 210 215 220

Уаї гу Ні ра Аїя біу тук А5р бео січ АБИ тгроАб5В АБа Ой 5еб уж ШІ 230 235 | 240

Ага сем бу пе до Аїа тт тіє тб обій біп д5р веб бек бі туг 245 250 255 тус тпгоргРо с1іп Ре їв) АТа Аза Аїд Аг тує АЇа8 гу бак Агар ваг 260 285 ва їей Мес бує Аїа туго А5п бЗег Маії д5п б1у уаії Рго бек Суб АТа деп 275 280 | 285

Зеєр Ре пе цей біп Тиб Бей їец ака бій бег о Тер осі ве рРго бід за 295 300

Тгробтіу туг Уа баг обег АБр Сух Ар Аїа Ууді туго Абзп о Маї РВЕ Аби 305 310 313 320

Рго Ні Ар туг АТа бек Ахп бій бе" бек АТа Аіїа Аїз бег Бег Ммец 325 330 335

Ага Аїа с1у Тк Ар о ї11е АкросСуз Ту бів твготукє бга отеронів вен 348 345 З.

Ап бін Бек РИе Уа! діа б1у 51 маї бекоагоа бі бій ї12е біб дка 355 360 365

Зег маї г Ага вес туг Аів Ал бе чаї АК бе) О1у тує Рве Або

З70 | 375 380

Муз у Ап сій Ту" дру с5ег Ге СТУ тгр о цу А5роуаї уаї гу таб 385 390 395 490

Азр о Аїа Тгр дбав Ії6 беготуг 10 АТа дія маї біо сіу т1е маї гео 403 410 с: 5: НИ ем муз АхпоАхр о БІУ ТИг о Се рго Гей об5ег ув руб Маї Аг бег Те 429 525 430

Ата вен жів Сіу Рго тгроАЇВ Ап Аза тик твг о біп мес обій б1у АБ 435 440 445 туг Тук бі Рго Аїа Рго тТуг бев їіе 5еговго тец БТ АтТа Аза гу 450 455 400. муз АТа сіу Туг Ні5 Уа! Ави Рпе сін тен сіу тп бі їТе АТа «1у 465 470 і 475 480 деп о бес тс о Тпгобіу Ре Аїа Гу5 Аїд т1е Ала АТа Аїа їу5 цу5 5ег

І 4855 яз і 495.

АзроАїа т1е ї116 Тут Беш бім бу І1е А5родяп Тагохів би бій оо 505 510

СТУ АЇа АБО Аг ТВг АВ ЇТ16 АТа тер рго с1у А5побіп ве) Ар Сеє 515 58 525

Іїе вуз сій цей бег біз Узі біу зує РРО сви мдаї уд! Ге біп мех --О 535 549 сіу біу біу біп маі дер бек бек баг їей іує бегодзп ух ув Уді 545 550 Кк 580 дей Бе ів) маї тросі сіу тук орко о1іу бій зе біу сі чаї Ала 555 | 579 575 би вив дротів без 5ег б1іу бує Аг Аа Рго Аїа С1У АКб о гн ма . 580 585 , 590

ТВеотвк сій ту РГО АЇа сту тує маії Ні бій Ре вго бій Ап АбВ 595 БОЮ 605

Мех Ап сем Аг го Ар Оу губ бек Ап о рго біу бій ТВе отук Те то . 615 6520 тер 'отує тв біу суб Рго Уа! тує бій РБе біу бай біу сер вп туг 625 | | 5130 | 535 бай тТвеотве Ре бує с тТиг оцет Аа бек Ні вго (ує бек (ей цу РНе 645 650 555

АвпотТнг обБег бег тіє ви зег Аа Бга ні Рго оту тує Тйг о туг 5ег 660 665 670 сім бій І1е Рг маї пе тйг РНе бій АТа А5и ї1Те Суб деп бег Ту 6/5 бо 585 цу тиг обі бек рга Тус ТагоАТа мес іє Ре Маії ака тйг бек Аби 690 І 655 703

АТасоіу РРО Аїд РО Туг РКО Абл гує Тгр ге узі сбіу РВЕ АЗр Ага 705 710 715 720 іви АТа АвроїТе бух Рго біу Ні бег бек г ує еп Зек І16 Рго те г 780. 735 вго маї баг Аїа Бей АТа да уаї Аєр бек ні біу Ап о Аго Те уаї 80 745 7 туго Рго с1у Су5 туп віч Бей Аза сеу Ап о тТйг деросін бег ма! зу 755 750 ТЕ ть й їео бі РБеа зі іен ма 5 січ бін уаї Таготіє Ту Ап тер его

ОО. ши 77 780 іем сій єї Єв Є165 ІТе 1у5 Абро Аза ТйгоРгГО Ар оАТа 7855 790 795 «10 5 «ії» 2358 «ла» ДНК Що І хаї3» Бибакіцчт УегтісзтІ11о0о1бе5 «4005 5 ! | | І агастоастса атстісацаї состоассаає чстттоссас себсестІттЄ авдтадвасса бо дстоадасто стасоссата тасссттссЯ дастутасса аводасстітЕ дзосазадах 120 пазасєстасо атасттсаєтт атессссвосо зазадайсою стостстаоє тастостста 180 асусссузає адагадтдца саахестааїс апатазааста касссесесс сатавесасії 240 агтсосазає гоазаставс ттаасеасачє азтусаасто зсосассаво аатсодаске З00 сса«остаса астоазстудаз сааажфессЕ сасзчсстсо ссодассссс адасочЕсос 3650 тттОоссцчася СІССтТЄсСста срасосачсс асассасттс ссавасстоє єсссаєачесс 420

Ястосіттсб асчатуатст сзєссасдає ассодсаасо єсавсодсає єдзайсоисої 480 пшсатссаєста асодсозтта дсасудадіс дасстсстада сасссзасоє саассстет 540 ааацдаєсстс астадцаоксо соасессова астссацдото аадатоссст тсатоссвос бо соптасоастс дстасатсої садосоєстс ззадасдата задвосазса асотатєтотї 660 астасетаса адсястатує тудазасоас сесозодасє оуадачасеє сасусотсас 720 пастстодата ссаадатєтас сстсадоас ксвуєтоаоює астасуєсау дсетосссад 75 чдзатосассс оспасосава доссодсссс ассататосоа сстасаатоає сфооаасоус 850 аттессосас ососааасто зсаєстосаз дздасдатсс ксадавдуса стодаастот 200 асдсоассата асзастодаї састадтдає їоїоаодсосса тасзадасаї стодсададї 950 сасавотаєо ссаздаассвза сЯстозавоє чпсссасосад сттєсвадаа созсатауає 1020 хсЕВОСТОСЯ загатастас тассадедає дкстссдаїтх сотзсвадся адзссестто Т1о8О0 астдададас тсатодатсао стсоссодад соссесттсо забодстсох гсасастодах 1140 тестттозсо отоссавззає зсазтбоаас Есосссазєє соусадаєує сзасассаво 1200 дзачдстсадо ассттдсаст садакстеєх ясдозадата соску сст садова цас т260 пасасттстоас ссстудаадет саадааззадо даєзасуєто саасааксоя актстадосс 1320 насоакастє ссазостоса достростзс зрдтддасосо сссососсї ссасаусессо 1380 сЕЕсасосад ствадачастї тЧассстВвас ассзасуєою сетоазчїсс засасєтасад 1540 засацстсаї сесаєцасаа стосаєсаєє засоастатсо стосдодсаза пазастдах 1500

Касаєсстст асттсдокоо ссстрасосс єскустосто есдавдасво здатсотоаво 1550 зассттчасс аасстдадза ссадстоасс сткстесадя застсестяд стсвасваа 620 ссзсецоста статссзост сдтоаесаа аесдасоаса ссостстке озасазсвад 1650 задаттіваса дЕдїтсІтто дотсааєтає сстддссаво атддсоддсаєс осаді сасо 1740 засстостса стаЗасоазаз дауесстоаст суссуаєтає ссоссасоса ататссесаде 1500 азатасаєсту айсацдаттоя сатдасєтдас атодоасстсв дасстассза десотсвеса 860

Часадаастї зісастдаоса сесваастсса Ядїтсттссст зсодстттдва сехссаєтаєс 1920 ассзачексс задссазає: саадкссдає азугтодасоє ткоасаїсса спавосєттсте 1980 азоацастоса дсастсзата стссдатаст жкосєдсуєтос єсессатсся аатхтавдеуте 2040 задазсасся дссосатєтас стссдаєттт аїстстстою сте Катсаа дастоазосу 2100 саасствачс стбвсессест сазазсссст дсодсстатя Зссосєаса соасассосу 2160 ссЕссаєсда сдааодатах схсастодац годасогтоо асзасаєтос дсдасодода гега задзаєвота асстосастес гЕассстодо асесасастс сетоссода созусстаса 2280 сапаадссаада їссапаєсає дсічастуда аадааддста СЕСтодатва вЕдассссва 2340 дассссаац: стасоусаа і 2358 «а В. «11» 765 «712 БІЛОК я «213» Бц5асіше местістї11105іде» «00 б мет цер Сей А ее сіп Уаї АїТа Аза зег діа Ге) чек гей Зег їеш ей у у цес Аїа біш А1з АВ т вро Туг Тир Гей Біг Азв су»

ТвЕ уч У РГО Бен 5ег ух ро оіу Її1е Су д5р я зак цей баг го діа вуз Аго Аа Аїа мів зїен Уа! Аа Аїв в Твгорго іш ої уз ума! бЄ1іу А5поГец уаї бек а5и діа Те сіу Аїа Рго дгу т1е с1іу 65 75 75 що іец Рго Агу тук дей теротер АБИ в дів Кеш нів сту бец дів сеіу бег рРго біу біу Аг РЕ АЇа Ар ТИгорго Рго Тут А5р Аїа Аа ТК 100 і 105 130 чего Ре рРго Меж Рго цей без Меї Аїв АЇВ АТа РПе дер Ар Арени 115 І 120 125

ІТе нів д5о ї1е сіу делома!ї маї с1іу так бін Аа Ага АТ впе тиг 130 35 і 140

Ап остТу Є1у тер аАго с1у Узі Аброрне тив пк бго АЗп ма? А5п рРго 145 | 150 155 160

Ре Суб А5р о вго Ага ТрробіМ Аго б1у чес би тТвг о Рго сіу сіб Азр 1655 170 - ЯуУ5

АТа йец нія уаї баг го туг АТ Ага туго Те хаї Аго оту Кей 61 180. 185 190 сіб а5росує бі бій Ага Ако Ії маї АТа тйбоСує Буб Ні Тук А1а 195 700. 205 сіу ап Аброрне біц Ар о тТкробіу біу РКе тик Аго Ні АБО» Ре Ар 210 215 276

АТа уз т1іе Тпгорго сів А5ріє; АТЗ 16 тує Туг маі Ага Рго ває 225 | 230 | 835. 240 сіп'оїш Сує Таб ОА Ар о АТа уз маї о1іу бег ЖІ Мебє сує АТа Туг 245 250 | ке кН

Ап Аа Уа! Ап о сіу Т1е Рго ліз сСує Аїа Ап бег тук ей сій бу бо 265 270

Те жт1є Сев дго бТу НіЗ Тетродбп тер Твг о Агу дер дей Ап отТер отіе 775 280 485 тис о5ег о АхробЄув б1У АТа Ме бів Ар о їТе Теробіп АБИ Ні був Туг 290 295 З00 І уа!ї іує Трг дело АтТа біц біу АТа біл омаї Аа Рба бін АбЗпобіу мет 305 зю з 320

Ар баг его сСух сій туг Те ТвВге ТР обБег Ар омаї чЗеє др овес Туг 325 330 335 їбуб5 біпобіу ем без ТВе о оТу Суз їеи Межє Азр аго зе Гем Гуз Аго 340 . 345 350 рем Рпе бій с1у цей омаї Ні тк о с1у Ре РАе А5р бім АТа уз АТа й 355 50 3165 бін Тегродвп его бе беб Рйе АТа Азроуді Аби твг осСуз сСтй Аїа Єв

З 325 380 ахр о беи Аїд вен АгЯ 5ег діа уза! бі сіУ Аїа ха! Сец сей туз Ал 385 380 395 що

А5росТу ТВгоїеу Рго без ух бен цу ух їу5 д5р о бег Уа! діа мех 495 10 415 тіє б1іу Рпе те Аїд дет азр тп бек вуз веш бій о1у бу тук бек 425 30 сТ1у гу АТЗ Рго РВе Гец Ні 5еговго сей туго Аїя АТа от фує те 435 4340 445. сСіу іец о А5р Те АБ мві Аїа Тгробіу Рго Тнгоіе) біб А5побекг бег 450 455 або

Бек нів А5р АЗпотРр о тТАг о тТпгодеп Аїд маї АТа АТа АТа Суб Бу бе 455 470 АВ «ва дер тує ІТа Гец Ц Рне сіу сіу Гей Ар АТЗ бе Аза АТа біу 10 485 490. 485

Ар Ага Ар оАко бі Абя бе Ар ото го СТИ 5ег бій іви твгк гу 500 505 о

Сен біп суб цес бег бег бен біу уз Рго цес уві Уаї Ї1е біп бед 515 520 525

СТУ Ар бів Уа! Ар одер ТНг Аа сви ей зуб Ап вуз вуз тіе АБИ 530 535 0 за0 і зек ї16 Гец тероуаї Ат о Туг рго біу сіп дб5р о сіу с1у ТВгОАТа ха 545 З 7555 | 560 мет дер сен цец тт сіу Ага рух зег Ро Аза с1у АгЯ бе вто Уа

І 555 570 575

Тве бій Туг рРго бег су тує ТВк сію біп о ї1іе біу Мат Так Ар меж 580 585 590

Ар іеи АгЯ РО Те Гуз 5ег Бей го сІуУ Ага твг тує Ака теротує 395 Й 600 | 605 Й 5ег тигр РКО УЗ! цей РКО тук біу Ре с1у Гву ні Тук тп був РНЄ 610 515 520 сій Аа губ рве іу5 бег Ап бух беч тик о РНе Авр тів б1п гу бен 625 530 535 640 цен ту біу бух Зек Аїа сів тує 5ег А5ротТНг Сух АТа сви рго рРГО і 645 і 550 6555 те сіп Уа! бас уаї уз Ап тб сіу дга їїе Тс бег одер РНе Маї 660 665 бю бек рей Узі Ре ті Мубє бек сій Уаї С1у Вго Бу5 РгОо тТук рго цей 675 БВ й 6585 іу5 Таг Бей Аїа Аїа Тут біу Агу 1їен Ні дзр уаі АВ Рго бе ов 690 5ЗУ 700 ве Суб дб ІТе бег осей) бі Тгротйгб Се дер деп тів АТа вга ря 795 710 715 77

Оу іш Ап обіу ароїей маї Уаї тує рРго біу Таб тує тНе Сей геу 725 730 | 735 фей дяр бій РгОо пе бій АТа туз Т11в шій уа! тб ої ТК остіу Дух 740 745 758 був Аза ї1е ей др уз тТегрорго віп Ав о рго бух баг Аа 755 750 755 «10 «її» 1338 «гій» ДНК «213» вепіст1т1іїой ТоптісоТо50 «40057 асассссадс пажітостта тактссасса стодостстат ссадтастоа абсозаваєс 6о засвасесстї тЕоходсадая саєстасаєс дстдаєссод сассдатоді акаєвзаєодас ї29 соасатстато ксттсастода ссатдзсавяс ассдозаста сстассасва сабдвсадас 180 тдусаєссає сстсуссаЯс зуататучсо аабтоуєсвая ассаєсєчасає єссавсодае 240 стдассваєт єсасєстодасє сазасосазає дсвтавоссс сосадастсат сесстсдсаас 390 сассааттст асттттатас тсстосссоа сасзаєдато атсстатаає таєсчоката. 3650 дозпсдадса дсассаксас востссатас сатоатоєста тспосазаєс дстадсапад 20 заєвасдвда ттоакЕсссас сасотІсвїіс уассаєдасо десвадсата сстасастоо 480 дозаасссад асстотодта соагсязаєта ааяссаацата сдасатсата сассодцозас 540 бо сетасесада ктссастсас сасаустлуа ттсодосастс давсдоосва тостсезасай ОО ссдассастт тгозадаадс ссасуууота тасадасаса асоусассіа статаєсосс во тасосавасса астасстоттс совадатаст сустаєтсса садозассац вассастоде 220 ссасовассє ассазоадсяє саїсатассу асссаадоса дсапскісас саассвсоаа 250 ататтаєсо асєсссяаза саастествс кер стаЕс асаасоюсЯає тесссссадс 840 цаадоасадст ассдасаатс тотаєзсата двасааттса затасзатує адасодаасс 900 астссцдаєсдча тсдалатуас сассуссоут ссаостсааа Хсодбастсх саасссткає 950 одсосоасаду заудссдазає сосодсякаа тсттсавоса тсастасцав дак 1020 даадасодуаа гсоакоссвда окт аєсяас заїдесавеї асаєсазаді тазадососа 1960

ЧдстєссоЧе саддадссса іст КСссса дсосодоєто стуссасаза євасовсовЄ ва) астастосла тасасстсоо звусасваст пдсасостса содосаскт тастотсссе 1200 зосастоосо сстодсачає стосастасс дгтасстоєх стоссастую сосатстуао 1260 асссаддато кохає сттсСоатоає дасодаясаб частасстуєх сластеєсцат 1370 татточсває сосатай 1338 «2105 8 «11» 445 «Рійх БІДОК «13» вевістіїтїшт бувтеи Той «005 5 мех рей бій Аг ре АТа туг Те цем рго вий Аїв беу гви зх Уа! сіу чаї губ пів дер Ай ргОо РА уві вів Бек Те тус ве діа АБр га АТа ре меж Уаї Туг Ап по Дго Маї Тук Уаї рве Мет Ар НІ о 45 д5р вав твВе ТУ Аїа тет г Ту Аби мех ть йо Тер ні Кей еле

Баг озег діа Азр о меє Аза Авип тгр бій А5б ні С1у І16 РРО Меї 5 65 70 75 50

Ге дія Абп РН ве ТгроАТа Ав Аа дол діа тгр Аїя Ро вп чаї

ТТ рго Ага Ап піу бій Ре тук Ре туг Аа Рго Ма1ї Ага снів; яп 100 105 їла

А5р о сіу зек мМеє Аїа шТе сту уаї Сім ма1ї его б5ег тар оїТе тп су 115 120 125

Рго туг Ніз Ар Аїа Ті б1у цуз РРО гецп ма! бів деп Ай сти Те 130 | 135 й , 10

Азр о Рго Тгоуаії РБе ї1е АБр дер Ар б1іу біп Аа Тугоїец туго тер 145 150 ! 155: 160 с1у Ад5п бко Ар оСец тТеротує уаї губ гео дп сій А5р о Мек те 5ег 165 170 Тиз туг бег біу баг овго Тгобіп тТе реко веу о тТйготнК Аїа біу ве. сіу 180 185 190 тТиг ага те о о1у АБИ АТа бій до Вга Те оте Ре сіб бій АЇа РКО 195 279 205

Ттр о маї тут (ув Ага Азпобіу тї16 Тук тТуг 112 Аїа Туг АїТа АТа Ар 210 | 25 223 Й су суб век 10 Ахр І16 вдго тує ес тре о1у те Бек Аїа ТИ Ії 225 230 23 28 веб тер о ТвРотТувкодка о1у ма! їїа Ммеє го Тк ост біу бак бер РНе 245 250 255

Тв Ав нів бі бу Те ІТ аїр орпе бій А5п деп баг отуг Рпе Ре 2650 | 265 270 тТугк нів АЗп о сіУу Аа Сей о рго біу Ру Біу б1у туго 51» ака вагоуаї 275 280 285 суб ма! 10 ой Ре цу туго дп АТа АБросіу тТиг Хі Рго Тве їїв

Ко | і 295 300 зіш мет Тег Тйг діа сім Рго Аїа бій їі бЇу Тк осСев А5поРгГО тує 305 350 315 320 чаї ака сій бі Аа сій тТйгоАТа АТа теробег бег обоїу хто так оте 325 310 | 335 ой ма! су5х бе бів с1у б1у ІТе д5р Маї Ту Ре те дей Ап об1у 340 345 350

Азр тус іє бух Уді ту біу Уві АТа Рре сіу бек со1у дТа Нів бег 355 360 365 вне Зенк Аіа дга ма! Аїз 5ек дів Ап зе" с1у сі тб їт1е АтТа Пе 370 | 5 380 нів це біу Зек тс тат сім те бец маї сту твк Суб ТНК ма? Рго

385 380 395 400

Берг Тиг сту бТу Тгр бій Твг тер оте о тае ма! ТнгоСує его уаї бег 405 410 415 су Аа бег о сіу ТВгоаіп А5роуаї тує Ріпа уаї Ре б1у 0іу бек біу 420 495 430

Тве о біу Туг беи Ре Ап о Рие дор о Туг тетроб1й Ре АЇа 435 44й 445 «іх З «її» 1893 «2125 ДНК «213» Бивакіт мегсісі | Ттоїдев «4005 9 акуазачотат астудсісої даосукодосс асстстетоа суссудсаєт чосесоста 50 агтоадасаєс чксосЯссас сасстесвзас затсстаєса гствстсадча євЕсскадах 120 аасдатекаї тесстсодссс адзасааєтає састасттст стостессва сесссастсє 180 аусссачачао сасссдєстє дааддтстава заєстоства асівоцчаєєт саєсудссах 240 тсаактссес дсстозасех тоддсчасчає басвдатстіс стсстувстє асуєкаскає 300 ситададаєса стєздасатс аїссстсаца сасадазада осаатодаса згоувастоа 3650 ассодастоса тсзасттста одсздасстой статасасса сстсатсУсе вузадуєсса го їпохасяаса аодчавасес соусоасаяс аастостаст асуасваєою сатаседаєс 480

Часдаєдато атассатата тоссотасбас ост ссоко вадссвавах асстсавста 5-Ю тстсазчасо чаєссзуєса дассааатсстї садотазітї ссСзабазсасє суатаєссадо 600 дсссаздаст тдазодатаа ссосатутає азбдатєсаасу достстаста татсстазас Бо г датадсссва дсдасадкса дасстдовії сводвавтсда заїсасоста дудсссевах 20 цпацтстаадо ссстсдссоЯа сСазадтсасс ссуєстасст стодтдосаа стсдседсв 780 садцодтауіє тбСатазадас Єсссзатоду достодтаст їсатуєсатєт састтааочесс 840 тайсстоєсу ассаксетсс ЗасЕстеоса ссцаттасає ододтдаасда аа Есссс 900 астстсосса здаФсостза Бдасоатод вдаєсатстб асссавсаст тестодсасо 960 здасоутосєаа сазадлаєтаЯ дасавуцласє ддтассттсє дсддаассяс асткосессо 1020 тестОдаві йозассатаз тссодасуюс аастсстктса статсвасваа сросстдаст ово сюсосаєта стаосаїєтас чаадодатаст стассадосоа дозасасася аїстсассда 1140 застсзтЧЯто атсаєссзас азозасавія ааодаткаавс Кстсессдає дазадчасоас 1200

Чассоудоєсо достІксадс зссбсдачас сазайтосат асахсдадтає їсаксдадає 1260 засодазаді їсасаатссос таспвадсаї доддасдааста сосаєдадсо озасопйзаса 1320 асяхсадчаєсс гдддасаавт зазапссася дстазтосас сттстодаяаз дассавоаєс І13850 тдпастоадасє ттсСаасєттох Кассваєсся осадонасто дсаасастає скгЕстеас їа40 зоастадчако даоссазота сдавасасста зассссзаст тсСааастоста сватааткад 1500 дсасестета стосттаєса атісядсатс тссвасттсо ссоздасадс гссаодавос 1560 тсоаксазад їтсдадтстеєс сасадестоса тай | 1593 2105 10 «241» 530 «2125. БІЛОК «213» Биваєсіши мексіст Ті оїдйев «Оз ЛО меє ух ма! тук їв Кей уаї Аїа про ма Те 5егоїец тНг тго Ала 1 !

Бей Аза б1у ем Тів СТУ нія АГгО во Аза те Тнг риє яви дб вго те іє Ту 5ег Ар Ре вго дво Ази Ар Ма! Ре ле С1уУ Рго Ар р; !

АЗА Ту ЖТуг туго впае: зег -а 5ег Ах ре: ЯЕЕ бе 5ег Рро біу Ата -

Рго маії сер оіуз баг цу Авр мезо цей дп теродвр сем ЇТе сіу нів 65 79 75 8 чек чів РгОо АгД сви А5п Ре 51у Ар ЕК тує дер ген ра рго о1у 5 5 бек дку тує Тук Ага соїм о1у так тер АТа беб баг ге) Аа тує Ага ї00 105 110 ів Бег Ап сту їй тТеротув тТгроїіеє б1іу Сух ІТе дб вне ткр вій 5 | 120 | 1255

Те отТкромаї Тук те Аїа бек о зек о рго біз сіу го Тгротук Ап о Тув 130 135 1490. . І с1у деп о РМИе біу дер Ази Ап Сує туго тук Або Ай біу 16 їео пе 145 150 1» 160

АБрР Ар Ахродяр о тиг о Мех туго Уаї Уаї тує б1у баг сіу бін Узі ух 165 1720 175 в2 ма! Бег сій цец бег біп Ар біу Ре бег сіп Уа! буз 5ег оп. Уві 180 85 1950 уа1ї ене туз Ази тик Ар Те Ту Ма! сій А5р оре сід Зіу деп де 195 200 205 меє тук бує Пе Ап аіу ей Туг туго хе Ге дБл др хег рго Бек 210 жів о с1у бег бій тйготгро їТ6 Тгр обу бек гу бек Рго Тер Б1у РгГО Ту 225 230 235 ШО) сі бек уз Маї їн Аїда А5робм5 уві! ТАгоРго Рго ЇТе бек біу с1У 245 250 255

Ай бек орко Ні а1іпй с1у его бе тів вуз ТК ОРГО дей біу с1у тер 250 | 265 27) туго вве мес бек ре Тк їКроАТа туго РГО Аїя бБіу АгЯ Кей рго Уа 275 280 , 285

Бен Аїд Рго тів Те Тго о сіу яекб Або бі ббе рго Те їен Уа! Гу 7290 295; 300 сім АТа Ава біу бу тер осіу чего обег тує рго тТВгоїер о вго сту те 305 ! 310 315 320

Ар су маї тис їуз дей тгроОтТАг Ага тТаг о Ар отит еле Аго щу те 325 | 330 335 зег цец АТа РгОо с 5ек Тгробіц Ткродбп Ні АП ОРГО Ар о Уді Ап обег 340 345 350

Рпе тйг маії А5п А5п о сіу се Тпг о Гец о дго ТК АЇТа бек їТе твгогув 355 360 365

Азов їі тує оїй Аіа АгЯ Ап отпгоге) беб Ні дед ТК ні су Ар ву) 325 350

Ні Рго тТипг обу тіє УЩщі Бує 116 А5р Рбе б5ег орго Меб буз Азр осТу 385 с... 890 35 4095 дер Ага Аіа б1у зецобзег Аїд Рпе Аго Авробів бек Азіа тує Хв ву 405 410 415

Те Ніз Аг Азр доп сіу ух Ре тпг їі АТа о твгобуз Ні бім Мек 42 430

Ап Мет двр вію тер о Абп с1у те Твк те дер обен бу бай ле бух 435 | 440 445

АЗїа тТиг о Аїа Ап о Маї Рго бек біу Аг ТНгогСуз Іїе Тгроїви Ага Сеу 450 455 І 460 біп Ген оАзр Тс о дбп ого А1а біу Тк о 01У Аби Тс ЇТе Рйе бег туг 465 470 475 480

Зак тгр Або біу ха1ї уз туго сі) ТВг без сту го А5п о рНе ру ге 485 4з0 495 туго ди біу тер Аїа РМНе РНе же Аїд туг Ага вне с1у Т1е рве де 500 505 за

Рне Аїа бі) тйгоАТа сво бі сію его ї116 губ маі сі бек рве те 515 520 525

АТа Аа 530 «210» 11 «21» 1795 «2125: ДНК , к?2ії3» Бивакіцт ченгсісті1їоіде5 «4005 11 атососеест сттодстаєс отосєссстї ствоєдатоЯ чазотусіст тсстдаваса бо аасасодата кітсСоасаса Сассаассостї ссстєссаЗ дасоосассс обаєссатса 120 жхасасєссада задатадсст сттесЕсЕЯсС дссастєсаз саттсакстс стесссвадче о стксссакст ахоссссадзо озасстадсс застоадсавс ссСаєсаосса сохссосаас 4О сусоазоачає зустоасессдуа састаосстоо авовсодосаз дасадсався совдаатосає 300 дсассзакса ттсорасасса савосдзаса тастасотса тстуковата сстаЧасоес 60 спдадататта ттососоєсат сстсвзадасс зссзатссої одбозсозозо тапдстададє 420 адзссстаста ссттсавоєсс ваатсасаєс дассссдатс їасістобоа сбахсасода 480 зазадіттаєт дєостассса тдодсаєсаєї стосаддада сстовзесєкода звассодачад 540 сттадсссоу адстваатає стодвасодс всадуваося татодсстда одорасесесає 60 аестасаадс зсаасодсєта стастатстс атуаїтассо зздасудзає госсадвадає 66О0 сасасстаєса сааїсостсо чдосесосаад атсасевасс сстастовадс стасватсаас 720 васссзаєст кдассаассо соодасатст бдастассссс адастоассоз ссасовасддаї 780 седстссаад ахтассзавца саастадсдо сасетскоєс стостастсо сахсасбаоса 840 сацадацітс сасссатодо ссотозачеєї встесостса ахєодсасасо дзасвадаче 900 дааєцдєсса адстдсаасс адсасозоді сосатассто дазасстсст сссазадессу 960 асасддлаасо кЕсссодаса тодассстес засастуасє Ссадасавста сСзасттоав9 1020 звадастазча адатссєстесс тсаєтЕката сассатзово ссссаадаая садтоссвс 1085о сті тоєстЕ ссазаоухст усасатсобту сстадесова зсваєсусттає содсадсова 1140

ІтассаодЧад ясоадаєтоз опстаїсадоа свосбароїс тасстттсаї содасдскає 1200 сазастсяса сестаттсаа асатадтос: вабатсуаст ссвзадсссав зсссвзасцах 1260 саддазаосса дзаєссассує гтссосаса садеесвасс асбаїсдатєся тоесаткаєх 1320 сассЕтсста Сазассаацу садсвасаад азаєстзадс сеасстісся атсссддоуєс 1380 асадааостс дпозватактсс тосСассдадд одтаосассоє сессдатоад стачдчабаао 1440 дасусааєса стстасататї сЗазасзасс засасдасус астаєзасст тодазстса 1500 адссасачач дсааоасіст сдасатсося асадсаєсао сазоєсттЯаї дастаддадос 15350 асоадуєссає стастоотад стсострода ссттвтаста сстасвасоя сазадцаєся 1620 даадсодаат чесссаадцдяад задтдатасс тасотсасєсс затддастта тазосссога ІбБО зсасаадазда стоастсатод соска азактсвоаак тата 1725 «їй» 12 «фії» 574 «а?» БІЛОК. «2135 Бизагіцт мектіст1110ідез «ЩЮ» 1 !

Мет Ага рве Зег їв бе) їец Суб рго ів че Ала меє сіу бег Аїд . 10 15 цей Рго о1у те ру ти А5ро уві й ТВ тує Тиг АБИ Рго Уаї Сеи : 5 КІ,

Рго СТУ Ттр Ні5 его Ар рго заг Сує т16 сів Ку азР сіу Бей Рре ви су уаї тик 5ег тпг рве Хе баг Ре Рга Км Мед Рга Уа! тук

Аза баг Аг А5рогец Уа! дяпотго Агу без т1іеочег Ні Уа! тер оАб5А 65 і 70 75 о

Ага бу Буз Ти ен Рго сі 118 Бег ОР Був те АТа у ві сп біп біу меї тук Аїа Рго тЕг о І1е Аго туго нів рух сім ТВг тує Туг 100 І 108 110 уа! їїе суз біц туг цей біу уві б1у Азр тів ї1е сіу уа!ї ї11е РБе 115 120 125 ру тб таб ода РгГО Тер ар оц бек бек Тгробег д5ровго Ууаї тВг 18 5 435 15

Ре суб Ро АБ нів ї1е д5р РГО Ар осцеу Рйе тгр о АБр Ар оАхр ТУ 145 150 І 155 . ї650

Бух Уа! Туг Суз Аїз Твг нія біу тіє тб о бец біп бій Те Азрорей . 165 | 170 ої сій тигос1у бу вен озеб го біц зей дей т1іе о тгродей сіу тиг б1у 150. 185 о сіу Уа! тер оРгО 15 Ту РгО Ні Тіе Тук Суб Ага Ар о Біу Тут Туг 195 200 Шо 205

Туг йец мет І1е АТа бі оіу С1у тпгоАТа сій Або нів А1а т1е Те 210 245 220

Іїе Аїв Ага Аіа Ага іух ї11е тс обіу Рго тує бій Аїда туго Ап очи 225 230 235 240

Авап о ебго І1е мец тТпг АБИ Аг о1у тк 5егости тує Ре іп тв ма! . 245 250 258 сту нів біу А5р цем Рпе бій А5р Тиг зуб біу Ап Тер отер с1у ев 250 285 270 суз сей АТа тиг оАгу ті6 тиг Аа біп о сіу маї 5ег о рго Меж сіу Ага

Щ ГЕНИ 280 і 285 сів АТа ма! ген Рпе дп сту ТК тер Ай уз бі біб тер орго гу 2590 | | 295 300 йец бій Рго Маї Аг 51 го Меї Рго с1у Ап Се се врго Гу рго 305 310 | 315 | 3720

Те Ага Ай Уа! рго а1у Ар о біу Рго Рре А5п дія Ахр о РгО Ар АЗИ 325 130 335

Тут Аяи Се цує уз тик гу Бує ІЇе Рто Бго Ні РНЄе ді НІ НІ з 345 350

Ака ма1і РгОо АгуО Ахробіу Аа пе бек цей 5ег о5ег ух бу тей Ні : 355 зо 365

ІтТе ма! Рго Бег Аго Ахпо доп уаї ТПпгобіу бЗес Уа! без Рго Су дер 370 375: ЗЕ бів тіє оц бе бек сту бів Ага сту сей АТа Рпе ТТ о1у Аго Ага

385 390 395 490 сій Те оНнів тат Сен РБе Гу Туг бег о уді АзроІ11є Авро вне Гуз РКО 405 . 310 415 цуз бег Ар о АБр о біп сій Аїа сту Хі Твг уві Ре Аго тТве біп РВе 425 й А | | Ос дер нів Ті Або це) су тів маї Аго цец рго Твг деп біп біу бек 435 440 445...

Ап Гуз Муя 5ег іу5 гГеи АТЯ Ре Ага Ре Аго АТа Тег обі Аза віп 450 І 455 450 .

Аб5п оуаї бго Аа Рго уз уд! Уді рго Уаї Рго А5р о біУ Тео сій Сув 465 470 475 во сту маї т1іе бек іви ні5 І1е бі 4Аі4 Аїа дп Аа тб Вії Туг ди

Я що І 495 без б1у АТа ек бег Ні Агу с1у бух таб о сСец Ар гіе АТа Тнг Аа 500 505 510 аг АіЇа бег рец Уаії бЗег сіу біу тйг б1іу баг о РБе чаї 6Єїу баг гей 515 вух 525 сац о сіу Рго туго Аїа ТИГ оСуб дп бТу буз б1у бег 01у Уві бін суз 3 і 335 540

Рго уз біу сту Азр ма! Туг маії тб бій тгроТНг тук о гу рго Уа! ща | з50 І 553 56О0

Аїд біп СТШ їіе дер ні бі маї Рбе уаї уз бек боїв Гей 555 570 «210х 13 «її 1677 «оїря ДНК «вїЗ3» Азрегоії1а5 боитідатне «4005 13 асоодсадсес свачеттатс стасессасв офсатссаде сотатассва хостес во сетоаоттозс астссдаксе свостусосс сасотацсва зосаазасає стсктсетає 120

ЗЕдасцтсса сестсаїтос сстссссодЕ сткссвсвІК агосвадссо вратскосао 180 застудазає єпОсаачсза таттттсааЕ содсссадсс аздатсестяда тстесосасс 2450 асадаєоцзасє адсадссода таїстатусу сссастстоє дстатсаєа дадссаасЕс Зо тасттцчаєсо їттсосзест поодсссдсад астадучаст тостаєтсає сксвЕстоах зва ссатасдасо асоссососо дачесчатсся сесогаєсся сдосасаєдо сассдасесса 520 чдататсттст дочаєсасоа сСспддддасоаєс таєдтусасєдє ссассовода ссавдатуаєи 45 заодсадтаса Састсєдаєст дазаасадод зсавесодсс соаосеідаста ссістоадвас 540 дасаєсдвяза дадсстодсс сопзоадссся сасатетаса здававасда атзстастає 500 стсаєоадеся Ссасаводадо тассавасєс доссастсова адассатодес осавасстада БО асссодасад чесестода ссатасссо сасзатссас ксттвісбад: сазудасаєсс. 729 свозасасе пссачастоасє сооссасоко пасусостсс задчасадова садсСавсєво 780 тваассвідо согсоадсас седаєсавоі сстосатодча зазастаєсс сахтоодоссод 840 чазасочктос ссасесссяс ссттодоаза вададсдазі часстессає сзасстета 900 адаодссяаа тосацуудосс дтбтссасса ссваатадує дадтссстся спасолодас З60 аасаочаєса вудсаасссоа сязадчтодаї тссвацсссо Чаїсобгадає ассдасосаєс 1020 тЕссадсасє досцахатсс савдасададя дасстсассо сстссестса ддоссасссд 1050 захтасьстсс достсасвсс сессії Кас васстсвссу чвзаскосова ссссавасся. 1140 даєдакчаєс твксосткає тасосусаза сазчассодаса сстквтксас дтасастато 1200 засокатсткЕ їїдассссза дагтоссцпат опаздадосоо чої дастх теЕссттасе 1260 саздсачсазс асаксцатст тдотатстасс скЕстссада сазссозада Ястоксотто 1320 тссЕКссЧпт сссасутоЧа задссоасцяє аастасоаао Ятсстеттсс адазаєсясс 1350 дкчсстастс ссазодааста осекоЗасад ассатссоЗс кбСаадасьса оддссасавох 1440 дасассолат асзтстттус достдссссо астсдасасс стосасаудаа Зсазатсасс 1500 зоаскосцєса астсдстоає тоссадсдос даваспдоас чагевасвдо стеосетасе 1560 асосасато ссасоєсова савовЧососс дсаєссасос ссосасасаї садсачатов 1620 адасасоали дасводоаєса даєдастдає сек сЧчад садссссоад стаєтаа 1677 «2105 14 кх?21ї» 555 «12» БІЛОК «2413» Аврегаії7Шше Ритідажив «400» 14

Мет АтТа АЇа Рго ий цен баг туг Рго тяг -у тіебіп баг тут Тиг 1 ї 1 деп о Рго сей вне вто оіу Ткр нів Зег Ар орго бЗег Сух лів тук Уві

Аїа біб біп Ар лаг оре Ре Суб Уа ївБг бек Тис Рпе ї1іе Аа Рве

35 4 й рго Нм бец о вго цез Туг щік баг Арка А5ро Гей вів А5а Тер оцув цеш ; !

АТа зег А5п тів Рпа Ази кдд о рко 5егобій т11е Рго Аєр без Ага Уа! 65 І и: ем 75 во

Ти др ооїу бій бів бег сіу т16 туг ків Бго тиб ге Ага Ту нів 5 : ! сій оту Та Ре тук без ї1е мМаї бе Тує уец 61Уу Рго бій ТБе вух 100 ц 105. 116 с1у Гей рен Рбе Таг бег бег А5р бго Туг Ар Азр.АЇа Аа Тер бек 115 120 125 дбзрорРгОо іїец бі Ре Аїа маї ні б1у їі16 Абр РгО АЗрої16 Ре тгр то 135 140 !

Ар Ні А5р аіу Тк маї туго уаї їйг озег Аа 010 Ар біп мес її18 1455 150 155 160 іубБ бій тує ТНК сечо АБробео бух Те обіу АТа ІТе біу бго маї Ар 165 170 175

Туг ке тгр о дяпо б1у тик о біу ту Уа1ї Тер оРго зів бу РРО Ні Ї1е 180 185 | 190 туп руб Агб Аяросіу тує туг тук гео мех 116 Аа біб б1у с1у тв 195 2050 205 сій ен осіу Ні бег осі тТВг Мет Ай АБО бек дк ТИР ОАгу те бу 210 | 215 220 ШИ го ТКробіч бро Туг вго Ні АЗп Рго Бен оїец бег Ай ру біу Те 275 ШО 235 | 240 чего бТу Тук бе біб Те Уа? б1у Ні АТа вер оїео вне біл дор СТУ 245 2750 255

А5а б1У Азпоттр тер АтТа хаї А1я4 Сец Зег Тнг о дго бек біу Рго Аа 260 255 270

Тттр суб дей Туг бго Мек сіу Ака бі таб ув! Бен Аа РГО Аза АТа

ОЙ | 280 285 теРв осн су5 с1у сій Тер Рго Уа! ї1т1е бій Бго Уа? Ага с1у 61 мех 290 295 300 сіп 01у Рго Ре Рго Рго РгОо Аби (м5 Аго Уаї РГО Ага Ф1у Ти бу 305 310 315 320 с«іу тер тте гу бій бго др куб уаії й5в вва агу вго оту чек гу й 325 Й 330 335

ЯТе рго АЇа Ні Рйе сіп Туг ТероАгО Туб Рго був тйг обу Абр вве 340. 345 | 350

Тег оуаї бек Рго АгЯ су Ні РгО Авпотвг ге Аго бец ТЯг о вго бек 355 360 | 365

Ре тук Аза гео таб осіу таб Аа Абр Ре був Рго Ар Азр Ту ви 370 375 380 5ег цен Маї Ммебоага суб біп ТАК оАбо тв Сей Ре Твг тує Те ма 385 390 395. 400

А5воуаї бек РПе Абр РКО Гуз уа! іа Абр сім бі АТа с1у мії тег 405 | АТО Й 415 уа! Рпе цен ТБгобіп бій сп ні іє др беу біу 712 Маї бер сей 420 425 430 біп тик тк обі о1у Бей бег рей бек РБе Ас Ре дга маї сти сту 415 440 445

Ага Я1у А5поТук ій саїу го ей Рго бій АТа твс уві Рго мУаї го аа 455 450 цуз бій тер оСуб с сіу бій тТнг о х1е дго іец бін їі бій діа ма1 бер 3655 47 475 480

Ахр так осо тує Уа! Ре АТа АТа АТа Рго Аїа Аку Ні Рго йів оп 85 450 495

Ага бій т1іе 112 бЗег'Аг9 АТа с А5п 5ег Ген Іа уді бек ім Або тЬг 500. 305. 510 біу Ако ейпе тб осіу бек бе уаї б1У маії Туг АТа тгобеє два су 055 520 529 с1у Аа біу бег тік Бго А1з тує Ї1е его Аг тер ого Туб біш Є1Уу

З 5 5ай

Ага сік сія Ме ї1е Аср Ре б1у Аг Уві Узі! Рго бек тТуг 545 550 555 «910» 15 «21її» 2156 «212» ДНК «РІі3» Биваніцй чегеісі!ісіде5

«Ох 15 Що акочітсост хсауксесаат сстадсодес дсодсттосе жсЯтдЯасеоєЄ сдадтссаотс бо засассяаайо їссасаосва удосзаавас пстастаосо оїсассавта сойсттсстх 120 сасуадуєта укаєтодсас ассассдосо ассаттодвах тоставасттоа язостадозуї 150 аїсзасааїс сєсдотуаєуо соадсатстас адстовостса тссосаавсо ост сс29 240 тасадсадов засвсессток тЕссставст достодасасє ссассвасуй тостаавсеє 00 тссстісавсє чістсдасає тсстктстсс оасоаЄєтстес ссасеКесає Чувасасваао збо сстодвайоо осавЯчссав озачаєтоді сЕсСстсвасо адодессасто додаатоадаїт 420

Чпісазачавас азаачтасас тодстевскс тазодставоз дсосттасав. чочесаст во асазстЕстІ сосдасссав ссєтассдає датоссттт асавасоєссяа адісавовес 540 заачассачса адаяасеута доскдадсях чадтскакає єтастостаз саядааасс 500 сстізасаоса асвасасттт тоастассасєє тасаасссса аодтоадтви сзатсаваає БО тадазсасоз тасасаєтов свасттосас дасоствасо двастсттов сетсаассте. 720 чЕТаЯсткає тСссесСесас стасааЗадс сасзачааст ЧЕССтсдадю тва 7во

ЧаЧастстсо азоутсесса сссосотадад сстассутсе Сасосоєатс асозасадес 540 сстоастТає адазаасвоас стустасост хссссодсса бзасатосес Часдасаваса 900 ссазсаадас сіЗатЯдвас тодазодата сссссадаєс сстссасаас сусссБое 960 тїсавазогає ссадаассає садсадассє асоусствод азссстодач сасстесаде 1020

Чдедстсацца сатдавсєїє даазассадта согсстатаз ааїссабтой сабЕсасота 1050 сатастааса даттесачії зіІсуакаєст асостдадске стасесстсоає дастссохса 1140 сесесааруа ссвзастссад сссстсатсо ассасосаст суасуадатс дааєссавес 1200 дачоссссає сассієдйвад саЗодазада зососастоа асссооссає сесазаєсть 1260 тсасастстс стасоттоаа уссодаавсо аддастодся состваєтає сссастоуст 1320 дазастстта сазудадсас састтєссса тосссстсоа оустассаво завястсасс 1350 ссааксссас сотсаєстсс сстодтосте стаєтзассс соттаотазо ааодатуєто 1440

Чесесватає тсстустсст соазатсодсо астассаєсс гтаєсосяза сстпакаЕсс 1500 ссеоссдадча зсксдаассто сесратставса абазататоад ссасатсаєсє дутузаЧчета 1560 стїстасссСа ссссаасоаї сазасточет осачтодтваа ссттатаєсь тасссстоди 1620 цоаїскссча саєсдосолеа оссдісоасте стосувіта гудаодсусаає дссдаєсута 1580 тісссадаас атестасаст ссбатссіся адайсуаова ссЯссочсва Єдодстаєса 1740 ссатозісса агтсоассосс пастссяусса ковссассса стссяассаас бота т800 чассастстт сосазоссаєс сесатаассс асаскстссс сассаєсосс дастсдаєс ї86а єссстстасса сатсаствасЄ задазсоз3о асаздоадаас їтсттасстод ззвадкаста 1920 соахатаасас сазссвадсоє пстузсвЕсс ссухусстрсу утестесаао ув єсвавс 1980 сспдасастса азстадасте зсесвестда ссазасаацод дазасдаєсстї тстоасоптеса 2040 атдатсстса сзадудсзас захтастуєто атастаяаова дассоттстс вадоссодата емю чазадчоатас стттсазсттс аадстссста асстаацсах сестасессх дадассстса 28160 адазоачоаза ассттастстї аостаа 2186 «2105 16 «г1ії» 660 х212з БІЛОК «213» Базагіцт менгтісіНПіотае5 «400» їб мех Уаї Ага РНе рег зе те їси Аа ще АТа А1а су РНе ча! А1а

Уаї ЄТи ваг уа! Аби тів ву Уа! вер 5зег вуз і Оу дол Аа тик чег віу нів сіп Туг 61у вне ее Ні Чу А5р о ЇТе аа двп бек оту

З дер ву сту тів тус АТ сім Ге їїе Ага Ап вро Аїа вйг шій туг б5ег рух ту Туг Рго Уа! 5ег без 5ег о1у Тер Аго Рго І1е А5п Ар 53 20 75 ща

Аїа бух бен вег рез АБп о АгОо 1ей Або ве вго сечо 5ег Ар Фа меч а го мМаії бег Меї Абпо Уа! Гуз РГО сіу цуз б1у Му АТа туз ої Те 100 но . ЕВ) сіУу Ре тей Ап сів біу ту тТРО біу мек Ар маї цу5 Гу ой суб 115. 120 | 125 туго тТбк обім зек о рве тгр уві рух б1у АТа ту їуз СТу Ні вне тн 430 135 140

Аїа бек ей АгЯ бек дп се Тео Аяр Ар уд! Не біу его уа!ї Су 145 350 55 160 маї вух бек цу АЇЗ Ах гу ву бій тер омаї Єв онів біб рРМНе суді 165 170 175 рей таб о вго дело обу Аа Аа РКО ей бег дело деп ТВ о Рйе Аа Ії 180 155 190

ТНК тує Ар о РгОо фу б1уУ АТа Або б1уУ АТа ей Ар Рв Ап вен ті1е 195 юю 2а5 бек Мей РБе Рго Рго їбг тук Гуз біу Ага Ку Ап о біу бе Ако Ма! 210 215 | 220 о Саш Аза сін АТа сей ід 0іу сей нів Рго б5ег ве беу Ако Рре га «За 235 240

Вго біу біу Ап мет їец бін оіу А5й ТИР оАбИ 1у5 Тс о теротго дер 245 250 | 0 а55

Тгробух дер Тс грец бТу Рго ів Аг АБп Ага Вго бі вле о вібє б1у 260 І 265 270 уаії ТгроА5о Тут бів сій Тс ні бту Сей су 112 їей бі) тує Кеч ай5 280 285 біп тер Аїя с дхр мет Ап ме би І16 ї116 Маї біу маї тує Аа 290 295 300 сту еп баг грец Абр сіу бек Уаї ТйгоРКО бує дер бій сен бій РКО 305 310 315 320 ви Т11е Ар Ар Аза цен Ар бін їв сти вве ІТе Або сту рго Уа 325 330 ЗБ

ТпР бБег фу тер бім бух Суб Ага АТа бі) бен біу Ні5 РКО уз РКО 40 . 345 350

Ре дгЯ шен бег тук уаї сти Уві! су Ап осі АБ Тер обей АТа Фу 355 | 360 365

Туг вро твеобіу Тр оАза бЗеготуг губ сів тує ря пе вго Меж вне 370 І 375 380 цеч бі Аза ті Буз ух Аа Ні Рко АбБроГеу тик уаї ї11е бек б5ег 385 390 | 395 400 сІу Аїа бЗег ї11е А5роРго мМаї бу уз суз Азр Аїа біу Рпе др те 405 410 415 го АтТа Рго б1у ї1е с1у дер тус нів РгО Тук Ага бі Рго АЗр Ма 420 425 430 цеи ма! соб сти РБе Ап ов оРНе др Ао Ап огує Туб б1у Ні Те 435 | 440 І 445. їТв бі бін ома! Аїд бекотйг Віз рго аз осб1іу б1у твг ос1іу тер о бег 450 435 450 бі Алое Меб вго Тукг РгГОо ТгротТероїТа 5ег о сіу маї сіу сій Аїд 465 470 475 480 уа!ї АТа гей Суз біу тук сій Аг деп АТа Ар оагу те вго біу тег і 485 490 495

Ре Туг Аіа Рго тів реп груз АБ бі Аби Аго Теробій Тор Аїа те 500 505 510

Тигомеї ї1е с1п Ре діа Аа Абробег АТа Меб тпг о тпг Агу Зес Те 5і5 520 525 заг тер о Туг маї тгроб5ег грец Ре АТа су нія вго Мет тйгоні тТвг 530 535 | 54

Без во таг оТнг о АТа Ар Ре Ар вго Сен туго туго ма! АТа сіу у 545. 550 555 55650

Азп обі дер су біу ТК обей тів тер гуз біу Ата АЗа Тугк Аби тик 565 І 570 575

ТНе о сув сіу діа Ар омаї Рго уаї 5ег гей бег Рпе Гуз біу маї Гу 580 585 590 вга сім Аїд сій Аза бів бе тнг оре бен таб Аби ух біш Ту Ар 5. Об 505 вка Ре Аа РВе Аби до РКО нів руб с1у деп Аби Уа! Маії Ар тТНг 510 | 515 620 ру уз ТпгоУаї сву цу АТа А5робіу Був сіу Аа Ре Ап РН Ку5 525 530 | 615 вай іїецп о Рго Ай Беу бек уаї АТа Уаї сечу біш тТИгоієч Су Гуз сіу ух 645 55о0 655

Рго туг бег 5ег веб «Рій 17 «2115 1352 «їй» дик «2ї3» тТгРіснойеста гевчві «40025 17 атувавуєва асатсатсто дсасстссто оссссоства теддссЯстст ссссассова 50 ассатссасс тсдассссда Зстсоссост стссасусса асстсассда осозасвасс 120 даєстстода ассассааус стсесааадс атсдассяаудс тсассаводай азазабусаав. 180 стєтаєтстаЯ одсассоссас сдассуєвос стісстесаяс додваааасвна сосодссаєс 240 агссавосад ассбсоддсса десоасосся дадвасадсв сдавотадса дісостсоаа зо заєзаєсази дссайстуаа стододацас дссуаєтатс тсоєсааєть тоасссзосва 360 «асдосааоє соабтасосуо ссавсастста аєстодсаст сасачстасє сосУсодоКо 420 аасаатасєса асаасосода састстосдд саадссатсс дсасссатає стстастота 489

Чссупасосої асадодосаа оаттсусост соддсувоке ссозасасса сатуссестє 540

Есбевасс дстсстостє сесЕтораас сЕстсасацє татадессявса сасзасаєьс 600 дасаучааакє сталцдасоас застаствдає часта шсгазсозс аасаддвсох 6бо

Чоссайсуаа ассокссзасо зддатауаас оастоасастст ссасвст ссачостсся: 723 соадсаводай сткоссісда КтоссЕстса таСтостсаз заїастдасєсє стІстуссса 789 тстттасаєс азсуастаса акстсваско суссзастат досвадотса асповЕкава 840 часттасоїс тссдвсптоса Сстстсавад аясссссаєт часодсаєта педацссасо чо асссстазає дісссссатт: аздадтсісЕс сссаазоасса збосттовая ссабтесвода 960 астоасасдя бадссттсіс тасачовазс садтсссатс ссадсавсоє сода го дотасастоо ососостсса дсаассбоса асдатаєсся ссассозасєт доссаєтасс 1980 давстодаса стсадцадос ассоасдасо даЕтасассс аадісаєтса адсасосста 1140 аусаєсксса аотосутсва сассассато тоадозсатса дкдасвадає авуггостес 1200 ссстасстО: дсЕсСассадє сдтавосядс азвзсаастоає остоїстУєс сттасстаца 1250 асесато9дсу тдссадсаєс зассстсстс тусесвасос заастіїсаас сссавуєсоа 1320: сатасаасад саскостовс атстктасаак ай і 1352 «2105 18 келії» 347 «гзїй» БІЛОК «13» теїсвподеста свебеї «400» 18 ! .

Мет рух А1Я АБИ ув! ІТ Кей Сує гей і ви А1іа го сви Уа! діа Аїа

Мей бко тВг вв тк же нів веу де Рго ой це Аїа ща Мей Ага в; 0

АТа АБ Сен ТвВг осі ага тат дів АБО Мец тгроАво да іп Аа бек ; «5 св Ваг те А5р сіп Геу ті ув Ага бух 1У су цем тує вна с1у

Ти діа таб оаяр о АКо б5іу ве вец стй два сі) су А5и АТа АТа тів 53 . г ИН 73 Шо 80

Ті 5іп АТа дер їеи су вій маї твг вго бін Ав бек мех щу Тер сотий бек о сец бій Ап дей біб о1іу бій ге дбай Теробіу Азр АТа Або 100 105 їЮю

Туг ген Уа! Ап Рпе АТа бій біп А5посіу цуз бего тів Агу сту нів 115 120 ! 125

Тик Ме ІТе тер оніх Зек сій Се Рго Аа Тероуаї деп А те Ав 130 | 135 140

А5а Аїа А5р о тб Бен Аг бів Уа? 11е Аг Те онНів ма? Зако отак Уа! 445 . 150 І 155 160

Уаї еїу Аго Туг цу біу їу5 ІЇТе Агу АТд тгр Ар оуді! Ма! А5п 1 1655 170 175 те вне аби о оли дербі тег мен асо зак Бек уа!ї Рпйа 5аек Ага гей 150 18 190 їес бі біц бін РМе ма! бек ї1е АТа Ре Аго А1а Аа АКЯ Ар Аа 195 4 що 205 : дер рРго вес дів дгЗ Геи тук гів А5поАЗр о тук дп ге Ав АгО. Аа 20. 215 | КУ 220 Ше

Адзп оту" с1у Гуз Ма1ї АЗп сту рей ух ТИг оТуг уаї бег гу тер ї1е 225 230 235 240 заг обі сіу ма! Рго ІТ А5р су Ії біу бег о б1поб5ег Ні геу 5ег 7545 250 255 біу сі оТ1у біу Баг б1у тік вес Ту Аїа цеш бів б1й Сей АТа те 20. 265 279 уаї рго маї тиг ос єв АТа їі твг бів Бей Ар тів отв. СТУ Аїа 27575 2850 285

Рго тТАг Ота о Аротук твигосійп уаї маї бій АТа Суб іє бегоуаї 5ек 294 | 295 І 300 шк туз Суб Ма! бТу 116 твнгомаї ТгробІу хів 5ек Ар бух АбЗробеко тро 305 зі1б 315 320

Ака Аа бег ТК Ап Ро Гей їец РЙе Ар Аа А5п о РНе Ап о рго бує 325 339 135

Бго Аїа тує Аби зег о ї1е ма! біу їІе Кеш бій

ЗО 345 «210 195 «21ї» 2054 «2102 ДНК Я «213» Аврекуі це тибінпденпвіз «4і00» 19 засаєстоаса втсссотаст зестассааа акоссадасєсс ассдосудає зкасавстте бо обаатаєдії дссодадіса дсссстастс сстдатадеоє гсссастюсє гасттастіс 120 стастдоаусєа чсацастсст айзатодоуу азачтетоасс заазаттсва ссссвасстх їво акстасосст: ооастзоачсао дасссєсаота азстЧчасодс ссстосаєкс ссасстудох. 240 чзЕттІсесвасє атазосодаца гіїассатас сстсєсСвЯасЗа здсссадатав гссосусєсов 300 чактоассст оссттсасса сстасасаза соаастостсЯ дссвастссє даси 3650 дадстссааа дтасстксос дасситтаос садтоссссє сасавсоєсє астадоєста 420 адасЕсоста саатагатад здаЧасатаяй СсСтутОдсадта сатасдєстІв дтасавусода 480 дазластоатат ссадтадіза аїсадєвпоє асатаатсає овасатодаст сстозассад 540 ааавсстєст осасодвасс оЧгдавдава ссссастесс ссдссєссас гаастосадес бо сестгсатсс дсетоссУєс сатттадеса аататаЗЕсс атттадссаз зкосоукеса 6бО жЕСЕвоссаво СсСсауєусте адастваосад стасасяода засоассако чзатотадаса 720 сСаастатада астосссста дазатадасс сазадттасс зпазасоасета авотватосо 780 осазаасоаса сасуасідад ссдсттсазс дсосабодса зададатааа гас 840 сосадаатає азасадачоє адацсодосє сусавсааса їсвассавча садаоскесе 00 тЕсссадета сатасатсса ттсасадсає ссаостктст тсавтїсаєса тааводксає 200 тасзоскест осачоссстЕ тадссасаос асссоссось сетуссссвоа аасссдатся 1029 чагагсасда аадбооссоаота СсаастасоЯє дсеззаастає азастоасваєс стадтватєтт зо8а сасстасєчасє спадчахоссу двасаєеквс сСатосастодо даапаєчазо соадстссца 1140 сЕЄСптсуєт оуєстадаєє оддассаєтод тсссестває хбаутоаста сасестсєва 1200 ссаадцчісєта дбдаїстаасо стсссавсяо стассасста сіскуссуаа гасадсусте 12650 стоадстссас ттсстассєє дстатосасо усстодоїсяа стаїсстсаа дстзадтаст 1320 асаїсоссспа опсастасвух дестастаасс сттеосавтсс доссасаацє сттовсасса ї38а їзтассстба єбозассаєс тассаваоаїсо оасассдчасає їсодвасавнає даассоаєска 1440 тсасоцочас задсасасіє асусаціасє хсессосьса апазасяся содсассса 1500 здзаасуаєдас таствссаас састтсвасс єссодасоса ссасЄцууасієс дасаасачсу 1558 астісааєта ссаоотсара сода овазо сагтодаєсов састуесаце астадтаєса 1520 сааєстстєтсс стдададчаєс адсассстай тадісодаао атаєсзаєсдє дасадсеас 1585 тстсадотаа тасодатсуатс ддассосодес ссеЕдоаоста саттозаост дтатаавостоа 1740 жтатудочсс дадстастсао свостосате сесвасттос асадатааєс засксссоєє 1800 тЕСТаєстстї сус єдстастваї ссіяатссата датваттаїт тстосссаста 1860 ссасаастта сссвоуєсуса іадїсаєтс суадсядодссактододааах дооочасасе 1920 чаасстасЯ тассстсстаа сстздддсає ссєвазачат акттасссес садатаскся 1980 зтазастасао астесттасу астосдадта агсасадачад сдаава:твсюх асадтесаає 2040 зсадсєсаає дсда 2054 «105 20 «їх 211 «їж БІЛОК «213» АзрегоїНи5 сибіпрепвів «ОО» 20 , | , мех уз ма)! тТвЕ ва діа РпесАТа біу тей рес уаі Таг Аїд Ре діа : ; 10 15

Аїа Рго АТа ре віч Рго дер Бей ув зекг Ага 5ег А14 СУ ІТе дп тує Уаї сів Авт тук Ай СТУ доп їеч сіу йд5р вве М туг Ар ау 4 : вай ва сіу те рВе 5еб мех туг тр іш єр ву Уві баг 5ег Або вве ма! Уа1ї сту без сіу Тер Тйг о Тиг о біу бек б5ег дБ Аїа їТе тис 70 | 75 , ва

Туг бег Аїа біо щ зег АТасбег «у бек АТа 5ег Туг Гей діа чаї

Хук е1у тгрооМаї АбпотТуг рго оіп АТа сій тує отуг ХТе маї СТЬ Авр о) 105 110

Тут с1у дер тук А5п РгО Суб бег бег' Аа Те о бег бен обу те ма ца 15 125 тук зак Ар сту его тр туго с1п маї сує ТНК Адвр ТНК Аг тТго дей 130 155 140 бі овво бек тіє Те б1у ТигобЗає ТвеоРне ТвгобЇй Туб вве бег Уа

145 150 155. 0-46

Ага бій б5ек тб оАго Тйгозегобіу тайга! Твгоуаї Азїа А5й Ні РНе 165 175 175 деп Ре Тгр Аїа нія ні бу Ре сіу АБп обег Абр Ре А5потуг сп 180 | 185 5 150 уаї Уйі АїТа уаї 18 АТа тер озек сіу А1а б1у зег АТа бек муаї тиг

Й 195 200 205 ів бек 5ег 210 «10» 21 «115 1023 вїех ДНК ШИ «213» Бібреге!1а єеде «йо» 41 І І І І асозацссса загсу татт сссастсстес ксттссавєсто оссвааватст соссассвас 50 паєчастотс стсЕСатсає тадізоаізо астуєодаєс ствсоостся Тесс тсвас 120 дасассттує дастстассс акстсатовс аєссатоста чаггсоауза звассстоах 150 чЧазаЧессаОЕ асоссасоад адаттассат уєсєастста тсдасазрат ссасодєтсс Ай стзссдвеса ассаєсдотас доссстотса охуддаадата єсссстудас стсссодасад 300 аєасцдасес сідасосеус ссасаауавс дусавзасаєт асстатасту ссстассвад 3650 цЧасзаудцату атаєсттсао ааксодсасоаєт дсеестсає саасссссуЯ судастатт 20 асссссдаса адачтітосат ссстсасаст сїсадсаєсо ассссоассад ссхсоїссоах 459 часчатодаса часфсстасес сасятаЧоух субаєсатод діоусСсадест ссвасватаа 54 садодатавда асзадіасаа созаєстоде астдадссао Чазасдасає состассева 500 адссстсада жтассааочєт оадсдадояс атусасасіс таодсачааза сс содсоас 560 ахтастсастс ссаассссза дастудсазо ссостсосесх стдадоаєда адасспасос то їхссксуазу дасесстодчає ссасаадсос йасаадаєсь астаєсєстсає стасістасие 750 пасасаассс астатсттає ссатасаяст сСсададассс сстатадссс ссбасасстас вай сапдусвва гестадаосс аЧїїдакодс стадастастс астстадтат соагсваатає 900 савадісацс одкдастаєє гтатсаспат дссаадасає сстоасаацав стассттсос 960 сацоїзааазо ствадайдчатї еоустасуаї адсаазачдода асаєссєцає адвачадосст 1029 тва що 1023 «10» 22 хеїї» 340 «212х БІЛОК -2135 бібББегеїТа хеае «40025 29 мес Гуз бек ту ен Сей Ре го гей і 5Зег рРне маї 1у бій 56 и 15

Се Аїа тйг деп Ар Ар о Суз РгОо Сей ІТе Тпг зЗек Ага їв так Аїд 2 23 З

Ап РгО їег АТа Ні Уа! вве Ася Аз тк вец Тер ви Тук вго 5ег нів в5о Іа Авр Аїа су спе сі Абзподер Рго аБр біу сту ств туг

А1і1а Ме Аго Ар Туг нів уаї Тук б5ег 112 Або ору5 ІТ тує о1у бек 65 70 75 во

Гей Рго Ууаї Ар нів сім тпг А1а ев зег Ууаї сій Азр Уа! Всо тер ; З

Аіа бек Аг бій Меє Тер Аїа его АзроАТа АТа Ні бує Ап біу Гу 00 | 105 110

Тупг тТуг бец Туг рРНе рРго АїТа гу Аза ГУ Азр Азр те Ре дго ї1е 115 | 0153 125 сту ма! Аїа маї ек о рго тТйг его б1у б1у гго Ре ма! Рго А5роГуз 130 135 | 150 б5ег тгр те рго ні ТВгОРНе Яви І18 Азр Ро А1д бек Ве Уа! Або 145 150 Щ 155 | 0160

Азр о Абр Абр Аг Аїа туго цеч АТа тгросіу а1у їТе меж б1у сту Сів

І | 165. , 170 175

Сей сіп Ага Тгросій Абр БУ АБ Гуз Туг АБИ бій 5ег о сіу тайг о біц 180 1855 . 190

РгО біУ Абпобіу Тг о Аїа АТ рей зегоРго сій 116 АТа Су5 іви бе 195 200 205

Туз дероМес Ні тб Бе) діа біб зу рРГО Аго АВ Меб гей Тіє гео

ШК аО 215 | 220 і

АБроРГО Су ТИгосіу уз Рко цей веб 5ег ої Або бі Азр Аго Ага

225 230 235 240

Ре Ре сім сіУ Рго тгротіє Ні Су5 Аг Авпобуз Її Туг Туг Ге 245 259 255 твготук бег Тиг сту тйг отак нт Тук бе) уаї туг А1З тВг 5ег Був 260 253 279

Твгорго Туг б1у рга Тук Тк Туг біп сіу Ак Ті Сезон Рго Уві! 275 г8О 285 дзросїу тер о тТвйге тве нів ет хек І11е ма! уз тує бій бі о1п Тер 290 295 300 тгробейп ве тує нія Ар Аїа гу ТИГР о Жег б1у Суб Ар отук гей ого 305. ЗО | 315 320 сіп ма! уз Аїз їуз 1у5 тів тТеротук Абробаг о Сує б1у Гуз 116 Кей 325 83 335

Так: Суз су Рго 340 са 23 «РІ» 7047 «212з ДНК «213» Би5агіци охузрогит «400 23 ще акосадстса аусттстасс тссСадсаєта стасестстс тбассадсва атосостоса бо саздасастяз асозсаттсс тсссстдаєс ассдаєстст досссосача сестсооасЕ 120 саїтуттстсод ааадсаваєї стодосстас ссатстсяса асассувадс саатоттате 180 засдосасад оаодсустса атасоссата адодаєтаєс атасстастс сатозадаипс 250 асстаїсдоєа ааздассссЧче соссчассас оосоїсуєтс ссесатссва сдасовсссс 300 тадосазадс адсааасого досксстдас асачсісата адзасадсаз атаєтаксто з60 тасткссссо ссаасуасаз ддаєдаЗаєс тесадаатто дадттоастає сессаасаада 420 сесаосопЯєс стттсСвацос саасазовос тодатєсссто дсасогасзоа татсдатссх 450 чдесадстасу хсуасастда єаасдаачесс тассісатст ооабосачсає ссаодасаде 540 садсессаай сстдодсасца тазазадзас тгтаасдаду сутедастод адасаддуст 500 дсїсеставсЯ осассвзатасє сстатстсст саозссасса аостазасза ддасатоасас 660 аздатсаєсо аавсаєссся соатстсдЕє атсевсуссс ссдадасацоа саачсеске 720 садустогов асаасавосо асдаєтсттс озодуодсссте здасссасаа дсосодсзад 788 стттастасс ссатотассс сассподсоат асссастксс єсСтЕстасос тасттссаау 540 засакстаєд Яакссттасає стассодуусє аачасссттоа аїсстаєтоах тадасадвасе 900 астсатодаз усаєтаксца дстатстаадоча сачкоссдає тЕссстстос сдатососає 960 асосстооса аучастасстї їсдасвадіЧ азодсозода ачасссадса сдасавааас т02а дусзаваєст гостєсасєсоа тест 1047 «210» 24 «213ж 346 «аМїд» БІЛОК «9132» ЕБсеагіцт охузрогшн «Ой» 24 мех сій ве кує Ре іеу бег 5ег АТа сви Сен РНє 5ег меш ТП 5ег ; І ух Суб діа діа с1п А5в тк два вер І1е Рго Рго ви ІТе ТВе АБО

З За їеч теВ ста АТа Абр РКО бег дів Нтя мМаї РНе біз бу уз Бей тр ма ру РКО Бек Ні А5р те бій АТа Аза Мав тв! АБп щу тк оту сіУ АТа біп Туг АТа Меб Агб А5ротуг Ні тТИК Туг зЗег Меж вух 5ег 6 70 75 80

Те тут Ту ку яей Рго Ууаі Уа1ї Акр во сту ді А18 ей БЕе чаї дер АБО уаії Рго ТгроАтТа Су ІЙ бій меї Тер о АїЯ рго Ар АТа діа о 100 405. 110

НІ ух Ап біу уз Туг туго рец ТугоРВе Рго Аа Гуз А5р о ЦУу5 Ар 115 120 125

СТ т1е Рпе Ага І1е сбіу маї дія ма! 5ег А5лп ух РГОо 5ег сту вго 150 135 140. енпе у Аїд Ар Су5 бек о тгроїі6 вго біу ТАС тук Бек тів А5рОорРГО 145 150 | 155 | | 160

Аїа заг отуг маї Ар о тТВг о Ар одеп бі Аїа тук рен ї1е тео бі о1у 165 170 175

І1е Тер ос1у с1у біп бе бл. Аїа Тгробій Аброгуз му Ап РВЕ Аби

180 що 185 шо 190 біш бек тгроІїе б1у Абр Гуз Аїа АТа Рго Або бТу ТИР Ап. Аа сен 195 290 205

Бег рго бій її2е АТа сує ем бек губ Абромет нів мує Ті ТнНг со 730 215 220

ТНК о РгО Аг Ар оіви маї тіе рез Аїа вго бін тб об1у був го Гев 225 230. 235 240 біп АТ бід Ар о АЗп обу Ага Ага Рае Ре 1 біу Бо то тт н15 245 250 в

Гу Ако біу уз сей Туг тує ген мес Туг 5ег ТагосТу Абротве Ні 250 255 В.

Ре ів омаї Тук Аїа тс заг оту Ах тів тук б1у Рго тує те туг 75 280 285.

Ага о1у вуз ІТ геу А5роРГО маї Аброб1у Тгр оте тТигоніє сту 5ег 290 295 З І чів уаї сіб туго бух б1у бів Тгротерогеш Ріє Рене Аїд А5р АТа ніх 305 310 315 320

Те б5ег сіу вуз дброТуР гей Ага біп Уа?! уз дід Аг ух Тіе тер 325 | 330 і 335 туг Ар рух АЗИ сту вуз їіє Гей їец Ні Агу РКО 340 345 «2130 25 «2115 535 «2125 БІЛОК. у «213» беобБасі!їц5 зсеагоспегторніїц5 «НН 25 ; цех бек куз ТіЄє Су Ап рго Же сви тве сі1у РНе нів вго ній рго

І ї ії «аг ЇТе сСуз дра уа1ї сіу Азр Ар Ту тує Пе Ав ар Бек ТигоРне вій тер ре РРО бі Уа! Ага те тут Ні зви Гу Итій Гец ух Ап їгв вро се оуаї Аза Ага вго сви А5п Ага Бей Заг сСТй гей Абп мех тт с1у Ав его А5р Баг сту бу Уа! тв Аа Рго ні сен Бе Ту ; 70 7

Кег Або біу Гу бе тв Сей щїе туг цлй АБроуаї ух Ма! ув а сіу біп Тгробу5 Ар бу нів Ап о Туг ївц уд! Таб оСуз Ар о тпг опе

Ве) 105 110

АБ соіу Аїа тро бег Ар оРго тів Тук без А5п о б5ег 5ек о1у рРпе Абр 115 1285 125

РгГОо 5ег Гей РМе Ні Ар бі АВ Оу Аго цуз Туг без УТ АблоМех 130 | 135 що тТук Тр Ар ні Аг Ма! Ар о Ніз Ні Рго Рпе Туг оїу 112 Уаї сец 145 150 155 160 сіп біо тує обеє маї 01 бій пух уз Єви маї біу бі ро вуз Ще 165 170 . 175

ІТе Рпе Суб о1у ТВг Ар бен ага ї16 те осів сбЇу вго ніб веб отуг 150 185 150

Гуз Ті Али о сіу Туг тук тТуг без бен тнг АТа іш б1у 21у тк Аа 195 200 205 тує Ап ніб АТа АТ тТниг І1е АТ Аго зекотигобег гео тук СТУ го зю 215 220

Ту бій мМаї Ні рго АброАЗа Рго бер оце Тг бек Тгрорго тує рго 225 230 | о й35 240

Ага Ап ого гец біп о єу5 Аа біу Ні АТа бек І1е Уа! нів таг Ні 245 о 250 253 тТпгоАбрости Тер ве сечо Уа! ні Без ТВг сту Аго Рго ви Рг Ага 260 2605 27 «ім 01Уу б1п РРО бе меш бі ніЄ Аго бу Тур Сує Рго сем о1у дго 275 В 285 біб їйК АТ І1е бїй Ага бен б1ц тгросуз а5р о Б1іу Теровго тує уді 290 | 295 300 уаї сіу сіу д5п сіу рго бек Ге сш тіе Ар п1у Рго бек маї си 305 330 315 320 сім Уаї бег тер озійш Суб А5р туго дзр біц рух Ар Ар Ре Азросту 325 330 3235 дер ТАК овен дей Ні Ні Ре бій Тег оген Агу їв Ро сеу О1у 51 340 345 350 дер їТе АЇЯ тиг вен гу АТа Ага РгО біу ні5 Бей Аго Ген туг С1у 155 ЗБ 355

Аг сі бегоїву Тебе бе Аго пе тег бій АТа Рпбе маї АТа дга Ага 370. ВЗ 3850 ш

Тер бій Ні Рйе Ніз РБе Ма1ї Афа бід ТВкоїу5 Уаї бек Ре Аго Рео

З85 390 395 400

Твигояйг Ре о1іп с1я 5ек Аїд о1у ге) Уаї Аби стук тує Ап те ОС 105 410 815 деп отр оте таб ву бій ї1в тик Тра Ні сти біз бу« бі Ага ї16 429 425 439 ем бій йеш мес те Суб Ар о нНіз ген Уа! Мі Або бій Рго Сей Аго 435 | 440 а45 оіУу Аго біш ї1е Уа! Ма! Рго АероАвр тіе їй туго маї туг цей Ак 450 455 460

Уаї тТбгозаї бій Аа твеотвкотув бує Ту баг отук баг Ре Ар оту 465 470 475 480

Меї А5а Тер їі А5рогеу его Уді ТНг Ре сі 5еготуг бує рей бег дя 490 495

Ар Ар тує тів був зек Аго Аїа Аїа вне тб об1у Аїа РБе ма! Ф1У 500 505 10 мес ні« Суб Ага Ар о сіу бек бі сій Аблов тує діа АБО РНе др 515 520 525

Ту РВЕ бен о тТук бу5 біш ей 530 535 «2105 26 киії» 744 «212» БІЛОК «213» трРіспОодерта геезеї «4005 76 І

МеЖ Ага тує Ага те Аіїз Аїа Аїа цем ся беч Аїа те су го рне ї и я

АТа Ага Аа пер вес Нія зеє ТЕ ей о1у АТа б5ег АТа сій діа Уа уаї Ркго го Аа с1у тпг о рго ї0е біу тВпг дія Туг дер у АТа Був 4 45 діа ще цей АТта сух цей во мреи Та Арі ув Уві «ТУ їТе маі бер сіу маї б1у тер Ази сіу біу го бу Ма! біу Ай Тйг об5еб вго Аа 65 70 75 во 5ег су Та 5ег тус Рго Зек цец Суб меш сів Ав с1у Рго Се сту ма! Аго тує бег Тит сту бег оте АТа Ре тве Рго сту уаї Є1п АТа 100 105 жа

Аа 5ег таб тер оАброма! Ап рей Тв Аго бій Або сту бів ве тів 115 420 125 с1іу січ бі) Уаї їу5 АТа бек обіу тів нія Уаї 11 ей бу Ро ха 130 135 140

Аїа сіу вго ен с1у ух ТВгорго біп сту су Аго Аавп оТгросі с1уУ

ТЗ . зт50 155 ше 160

Рпе сіу Уа! Ар оРго Туг обме тнг о оіу 11 АТа Меб сІу біп тнг Ії 165 І 170. 175 деп біу тТе бій 5ег о маї сїу хаї іп Аїа тео АТа був ніє тТук Ше Т80 155 190 це ай бій бій 55 Се) Абп ас сти твгоїт1іа баг зег дбп о РгО АБр 195 Ше 2705

А5роАга Ти Сей нія ої сен оту ТАг о теровго вве Аа Ар АТа Уві

А) й 2415 | 220 сіп Аїд допомаї Аа бесоуа! Меє Суз 5ег о туг Ап огуз уд! д5п тнг 225 о й30. 235 240

Тк отТер о АТа Суб Бі Ар обій тує Те огеч бій тег оУаї гез ру5 дер 2А5 258 255 біп цей Фу рве РРО су тук ма! меж тнг Абротегро Ай А1а бій нів

І 250 | 265 270

Те отак омаї біп бег АТа Абп бек бі ей Ар Меї бег Мес Рго су 275 І 280 285

Тиг А5р Ре АБп о1іу Аб5п о АЗпоАга Сеу Тер б1у го АТа гец тик Ах

298: 295 300 да уаї Ап об5ег Ап біп Маї бго тв Бег лего Ма! Ар Ар Мет Уа! 305 310 31 320

ТНг Ага те Бец ата Аїа теротуб їец те ооТу бій абробій АТа с1у 395 | 330 Щ них

Тус Рго Зб6г Ре Ап Те бег Ага Аза МУаї бів с1у Аза Ні Су таб ! 340 345 І 350

Ап Уа! Ак АТа ЇТе АТа Ага Ар о1у тів уаї Се гей Суб А5п АВр 355 360 І 365.

АТа дБИ ІТе фешоРго бен бу Ку РгО дій 5ег Ті Аїа уді уаї 615 370 | 375. й за0 че" Аза АТа І1Те ті піу А5п НТ Аа Аго Ай бег РРО бек о сСує АБИ 385 3950 395 . 400

А5ро1ух біУу суз Ар А5р сіУ діа гей о1у Меї біу їгр о б1у бек сіу 405 а 415 діа чаї Ап туго Бго ту Рйе Уа! АТа веб туг Ар АТа тів Аяй ТР 426 425 430

Агу Аїа бек бек бій б1у ТВгосіп уа! ТР обен зер ай Тг о АБр. Ай ! 435. , 440 | 445 й

ТЕ его беб п1у АТа бег Аа Аіз Ага біу уз др уаї Аа їїТе ма! 450 . 455 Й ча . вне хі таб Аза дер заг с1у о сіу тук же твгоуа1ї ов о1У АВ 4653 470 425 АКО діа с1уУ Абр Аг Ай АЗИ Сей Ар овго го Ніє Ал ос1у А5п Аа ген 4 шо АЗО 495. ма! біп Атасуаії АТа біу Аза А5в бе Аби Ма! І1е ма! Уа! маї Ні5 500 595 | 5

Заг ма! ві АТа ге тів їец біч бій Се бен АТа беу о вго іп ма! 515 520 525

Гуз АТа маї маї тр АТа біу ге рРгОо бек сій сі бег сіу Ап Аа 530 | 535 в імен уаії Азр Ууаї бе тр обу д5ромаї баг орКка чего б1у Гуз їеч уд 545 550 ! 555 550

Тук Тег тів АЇв Гу бег рго Аза Абр отут А5п Тг о Аго Те Уа! бес 565 ! 570 575 оту біу бегодб5р о зек рРНе 5ег осі 01у бен вне тів д5р тує гу нів і 5 й 585 | 5а0 вне дер А5р АЇа Аби ї1е ТВ оРго Агу Туб сто Рпе біу тТуг сту еп що 595 | бро шо БО5 бБег тук тйг цу Ре Ал о Туг 5ег Аго цеш бег уаї ге б5ег тйг дів 610 615 620 іїух бег су РГо АТа Тигобіу діа маї Ма! Рго біу біу РгОо 5ег о А5о б25 о | 635 бай ев вне бій аа Уа! АТа тб охаї Те Уаі Ар ої1е АТа Ай баг оту ба5 550 Б55 біп Маї таб обіу Аїа бій Уді АТа сія би Тує 16 Те о Тує Рго бег

БО 655 670 аг Аа рГО АКо тТпгОоРКОо Рго руб б1й гей Аго б1у Рпе АТа Су ви 675 680 | 585

Ази рей ТВгогго сту б1п бегобіу Так АТа тТИйг РМКе Аби 16 Аг АКа 6590 вах ю дАкЯ АБр гей озег тує тероАбр отаг Аа бег осі бує Тер оуаї Уаї рго 705 710 й 715 і 720 5ег біу б5ег Рпе біу 116 бег Ма! біу Аїд 5ег 5ег Агу Авр ІТе Агй 225 230 735

Сен ти 5ег о твговбец Зеб оуді Аїд 740 «В» 027 «21 й «21Ях ДНК «713» Штучна «ово» «223» синтетичний праймер «00» а саадоасосос сазусатаяс стсусатаат сбахостаха созадітстатєс дадссдасота бо тЕсаавіЧЕтТа со 72

«їх 28 «21ї» 73 «2125. ДНК «213» Штучна «вед «2232 синтетичний праймер «4005 98 даадососос сасадатаас сссусасадс атасаєтаєа сравуєєзіс ссодЗсесої БО дассвоєсос дав 73 «2105 29 «вії» 2 «212» дик «13» Штучна «д20х «айЗ3» синтетичний праймер «ад ссавассасс суссттовас ас 22 «2102 30 «11» 31 «їй» ДНК «2135 Штучна «г20х «223» Синтетичний праймер «400» 30 саадасосас саєстсттєс датсесваса в 31 «2305 31 «211» 32 ккї2» ДНК «д13»ю Штучна «220» «йд23ж синтетичний пранневд «005 зі сахттдсцдатс зссатстаса асогтттсва єс и «Щі 32 «211» 23 «217» ДНК -213» Штучна хг «ййзх синтетичний праймер «400х 32

Часссяасст КОгвасуїаає вос 23 «2105 33 «122 «212» ДНК «гї3» Штучна «ЙО ! «223» синтетичний праймер «Ю» 33 чіассостаа асахтааааєс те 22 «2105 З «11» з «иа ДНК

«213» штучна кг» Й «23» синтетичний праймер «400» 34 сстссатвст гссаасааує. с 21 «іх 35 «2іїх 94 «аме ДНК «213» Штучна «Рай» . «пйїх синтетичний праймер «4005 15 | й саєсатусао стісваятсїс ос 74 «21йх 36 «2115 35 «2195 ДНК «135» Штучна ках и, «23» синтетичний праймер «400» 36 ни і

Зоссастачт саастосссо тЕстосвосо ад 32 «2105 37 «гії 89 «їй ДНК ха13» Штучна «20х Й . «Р23ж синтетичний праймер «А0Ох 37 сахусцдатєтсоя сдасоєстто Чесадасся 259 «10» 38 «211» 40 «212» ДНК «2135 Штучна «Кей» «223» синтетичний праймер «адбх 38 дасадавастї тоздастдсає адсдтоадоазс азсаздазоуй 20 «2305 39 «21ї5 2415 «125 ДНК «РіЗ3» А5регазіїи5 Таропісне «400» 39 зидастуєдуи савсесттас кстостаася стастуєстє задстстуоа дсаасатааес 5о0 засадстаса то93їтасаа соссовабсс аатссодасі когстссаса асдеставас 120 асазваєстссс татсстєссс суастассзо адсоцісстє гдадсавдайа сетсцєстоє 150 дастсдаску сстІсвссста сгЗассосоасс зсвасестуа тстсесвсвЕ сассстсаза 24 даастсатсЯ ссаасастдо сзасассадс ссодакатсс сссдкстада кстасстсся 300 тассабвтістї чазотдвоос сстосатодс сіЗостсасо ссазсіїсає сваєзасадао 360 чсстасазсї звоасдасотс стісссстса сосавестеї ссосавсдас стесваєсяс 420 ассстодвсса ассзаахсоє суссаттаєь ксузстсаоу уссакуссє саасаасуєс 450 чЧассасесто чсстсоасає ссасесосса аасаїсаата сстксесасса сесазсссод 540

Часедсадчас водазастсс кдасовачат дсатасастс ктасоуссоєс стасосстає 600 даатасаєса соддїзїсса додкассого аассевовос аксстозаасі сдссосовса ббо тссаадсаст сбоссодста сзасатсцад аастаочаса ассастссся устацодайс 720 сатотсааса їтасосааса абасстдосс дадсастаса соссусачії ссістссасс 750 пеосеосдасо сесасуєсса сзуусттсата состсстаса асуссоєтай содазсоссс 840 застастсса асассттстт тстосадасєс сссстосасо асасстістс сек соас 900 сасачссасЯа сстссдасаа сстасцасЯсс дестасодсо кесттсваєсс ссасаустає 950 адсодссаасо адсссзасиє соассасслпає ассавсстса сеасастоя саттдастоє 1020 поасасстсскх атсаататса ссссааспяд тссатсасса сєсодачетКоє сесссосЧає 180 цасаєсуадс отозЕсЕсає ссодстутає дссаассєсе гСозассуда: стасстєсцзас 1150 цасзасацса осадсаосава сссотзєсас афестадоєє яосссуасує ссауаадаса 1200 часоасатоада асатстсста сдазасочса чесаааддса ссассстсст пвадаасоас 1260 досасесєсс стсттасстс сесстссодо одсазодаса аатссаїсас ссссасспде 1370 сестіддасса асооєсассає ссадстссац доєвастасе асодсоасзс ссатасстс 1380 аїсаасссо9д тсдасосстє сасодссасс водстасасад тасастасяасє ссессяосасяо 1440 озазЕстсова созасссвас дасааасттс адсдссдсас ссессасадес всосУуєссосе 1500 пасаєсатєся тастстсдда ддосатсоаї засассатсо азассоаадс ссазозссоєс 1560 во9сесуаєсо сссчоасссодо сСяассаастсс бвадстоаєстї сясаастсос: дососаваза 1620 тсечасрасс асссстває достасассвоя асусасозса ассаодвесаай стессссуєє 16560 стсаватсса асасодаацоє свасуусєсстс сескддуася дстасссодо ссазатосоде 1749 чассісдссс соасаЯсчасат ссссасазас асасосассс ссассаасся сстсассвЗсо 3500 асссзотасс сосассосста кассдадзоєс тІсесоцесс усоасатдва ССТОСоОЧесо 18650 затоуадаста сасздвассс дадссадаєс тасатасозі асассооєда дсссокстас 1320 осстссдасЄ асадчсстцес стасассаєс ттсаясасєть ссксадссса вусабсдаау та8) асдзачтстата ссттсаасає сассдасссс асстесосся сасасссада сассасаасс 2040 оссодссаас дсассссстї саастісаса дсссссатса сазастссспо асауааодає 2105 їссцаєтаса ссоссстодЕ дсасуєсаас ассісоасто спдосссстс сесотасссо 2168 аатаватаос тсоєспадЕК ссассоддсес десоссосоє соааодааоо садсасудес 28220 одаоастозато соссочгдас здточаатсово стодсододо тазатоаладе ддосвасасс 2280 осастаєттс содддасодста сдадасоссс стчЧаатаасо адсусоаочх сутаЧЕсоаЗд 2540 дсочадісою тобоїбадса достокесто стодаотоює свогобавох осадвчо99 2400 зсочачсатса адтаюд 2415 -2105 40 «211» 04 «212» БІЛОК , «2135 Ав регаії!Ти5 іаропіси5 «4005 0 й мес Аїа Уа! АЇїа Аа Се АТа геу ем зі зйт Меп рРго сів діа цем ше сіу ств нів доп ес ват тує Уа! дви тус дп уд ст Ап о РГО азр цей «су Бго са Суз цей аб тнг о т1іе 5ег Бей тех Рне рго АБр 4

Су ве 5ег біу рРго 1 гу Зв" Гу Ап Гец маї су Азр бег ТАг Аа : зу ваг оРГО Тук Ар Ага Аїд Аа АТа їеин маї 5еб сен вейе те Бен бів бе і 70 75 ч0 вій бе пів Аїд с твгосТу дбпотие ег рРко с1у маї Рго все ви с1у сеш го РКО туго бій маї Тер Бек 01 АТа вец ніх біу це Аа 0 105 110

Аг Аа Аби Ре твг Ар Ап с1у Аїа Туг бег Тгр о АТа Те Звг вне 115 120 125

Рго бек орко Тіе ем бег аїз Аїа Аїа РНе А5п о дгЯ ТНгогео т1е лев 130 135 140 біп тів АтТа зекб їі її бек тро бій сту дгЯ А1а РНВ Ап Ай Аа 145 150 155 іб50 с1Уу Ага Ре біу ен а5р маї тук бек ко А5п тів дей таб РВЕ Ага

Щі 165 0 | о пу5

Ні вко маї терос1іу Ако ові 61 010 тв о вКо біу сій дер Аа тує 150 185 | л90

ТвВе геш Тиг о Аїа АТа тук АТа тує осіц Тук І16 твбг ос1у Т1е 216 пу 195 й 200 І 205 сіу уаії Авп Рго січ нія це уз цей Аза Ата Тйг о Аїа вух нів вне г І 215 220 діа біу стук Ар ті ст) АБа Тер Ар о Ачи нія 5ег о Аго їео Ту АБ 775 І 230. | 235 | 240 дзр Уа! А5п осів те сій сіл одер без АТа сій Тугє тує тб РгО ОЙ

І 245 Що ей | 255

Рке ге маї АТа Аа Аг Ар Аїа Ні Уаї Ні 5ег РПе Меб Суб бек 260 255 270

Тут Ап Аа Уаї Ап біу ма1ї Рго б5ек Су бег Аби ТИП Ре РПе ву 275 780 | 285 стіп тве сей реб Або А5ротТйе РБе бев РНе уді Абр нів біу стук ма! 290 295 300 й бег бі Ар Су с1у Аїд Уа! Тук біу умаї Рне деп РгГо Міє сіу Тус 305 З 315 | 320

Аїа Аіїа Аба бі рго Зег Аа Аза Аа Ар АТа 112 меш АТа сту тТВе

ЗВУ. 330 335 дер х12е Ар оСуз біу тйгобБеє тує бій тує нів Ре Ап б 5ег Щ81а 30. | 345 з5а

Тиг тип» с1у Аа Ма! Аїа Агу Ар о Абр т1е біз Аєд о1у РАе те Ага 355 360 | 365 їеи тук Аа Ап обеи Ма! бі бе) біу Туг Ре Ар с1у Ап б5ег бег 3/3 375 380 зег 5ег деп о рРго тук Ага Зего бе) б1у тер орго А5роуаї бі су ТВ 385 390 395 400

Авр о АЇТа тгро Ази Ії бек тує 010 Аїа Аїа ма! б1Ш біу х1і6 уаї вер 405. | 410 415 івги ух АЗп о Азросіу твкоСен Рго Сей АЇш бек оРго 5егосів сіу Був 420 425 430

Ап Гуз Зек ХІТ Аїа Мей їі сіу Рго тртр Аа АБИ АТа ті о тйго їй 435 440 445

Гей сій с1у Аби оту Тук сіу Абр Аза ко туксіец КІЄ Зег Рг. Ма! 430 455 460

Ар Аїд Рйе ТВгб о Аїа АТа сту тує твгомат ні тук Аїа РГО сіу ТВ 465 . 470 475 450 пін їТе зек о тТвгоАЗп о беб ТТГ ОАТа аАбп Рйе бег АТа АТа їевозег Аа 485 490 495

АТа Аго АТа Аа Або твголіе маі! вре ге сіу бі тів А5р Ап Твг 500 505 510 їїе ої АТа сі Афа сій Ар оАго бег бег те АТа тер о вго бу Ап | 520 525 біп веу боти Сец їіа ес б1п бе АТа Аї3 бій рух 5ег А5р Ар Бій 530 | 535 540 рга беи уаії а! Тут бій Меб с1у сіу б1у бій Ма? А5р Бег чеїг АтТа 545 550 555 560 іїео вух Зег о АЗп АТа су маї д5п АТа ген бе) Тер обіу су тує вка 565 я ШТ: б1Уу сій беєб с1у сіу іецу АТа бен Ага Ар т1іе ку ТНг о біУ Аа Ага 580 585 Щ 590

АТа Рго Аїа біу Ага се тб їйе тйе сій тує обго АТа Аза туг Аїа 595 . бо 605 біч бег Рйе бег Аїда іец А5р Мет Ап Мей Ага РгОо А5й о бти тТВе отв вій 615 620 біп Або рго ЄТУу СІп о твготТуг меї тер тує ТвгК сту вії Рго ма! Туєг

Б25 630 635 бай

АТа Рне сім ніх сіу Сей вне Туб тс тс вне Або Аїа бек баг АТа 645 650 655 сп АТа АТа у тйг вуз тує Те ОРйе А5п їТе Тйг о АЗробед ТВКоЗее 560 665 670

АТа Аза ніх РГО Абротиг Тве тйе Ома? Є1у біл Або ТК бен вне Ай 675 680 65 рве трпг Аїа б5ег Ті тТпгоАзп бег о1у аїп Або АБр о бег Абротук тАг 690 59 УЮ.

Аїа їец уаії тує Аа Ап Те обег тТВг АТа о1у Рго бег о вго туго Ррго 705 710 50. 720

Аз Су Терен у! б1у РПе Ар Аго Гей АЇа Аа ма! АТа Гуз сти . 725 730 І 35 сіу біу тпг оАїа біц це Ап оуаї Рго маії Аїа Маї Ар о дга сво Аа 740. 745 750

Агд маї Аброаїц Аїд біу Ав тТигомаї бе Не Ркго Сіу Агд тує сти 755 760 7653

Уа! АТа фей Ап Ахи БІ АР сіб маії ма? Уві бій уві стй ей маї 779 775 780 сіу сій біп о уаї маї Се сечо їу5 ТР бго біц біз узі біб б5іу Уаї 785 790 795 800

Аіа Ту Акр о к?М» 41 кеії» 1695 «12» ДНК ши «213» Буваєіци уе"хісіїТтотйвх «00х 41 асастсттстх сосссаєтст їсстасссто одссттссвад ссачсстуєюс остсвусває Бо асаїссотта стоатсдасасє садссадЗаза сСтссасаєса ксоасоспстх судтакстса 20 даачдесстасд дссасоссаа аслаттссаз засстсвосс стддассаса чададачадє 150 сісчдаксттс хсттсансає тасаассудє осадцстіває ссаїсаєссо аазсадоясс чо цастосозсо сеессвасес сатсассває ассвасассо йспясссаца таводсавосе 300 зеттассасту ссвасдоасова свастсасвяає сауосасоот стаосаааса аЗссатоадс 360 татадсукєава абастатста састаатоаст кобістеасує студтабасає дзачЕсацсє 420 саздачтаєоо дссптсска сддтасасст десасуєсоє остсстстод апаєсоуаоа. 450 сатсуктасо сстоазвесас зостоазоастаєс ссстсстасє асазусаєвдс тудсаєсеса 540 шоісосасо гтадаттісст саасоздоає дасодсесоа асеттасост сесадеснсе БО аасасдсто сасзєоксат тестсстста сасацсоєсті Сасавсссяа додестсоде 5БО чататсвада тоасосустЯ судасаасаєс дуттдазоє сасадвсода статассуєс тий зачстачста засттдадох з5адааутак стаєстаєса тсасаєссса суачсасвсс 7О зосацшсссса ассадесєтат даасастаса сСЕдссаасєсє бдасоїосода дададзстосс 54 ваїдаєсаоч сатттдссасє зоасобадтас чЕсазсоддсо ат ссазсуа зад саса 900 тпддсаціса адатсопсаса адоасатєсотс затоссрасс тостсаосогта гаєстастоа з6о зазбсосЗєта адзассаасєза сазачодосст статстсасо тсассуасає ддасадеасс 1020 зазестаєса тажєсстсчає їстстводсс астоастсасе сдЯссесосса татгссовссст 1050 цдакусасаса дастттсдас сесасооік дгодсаадаса савскоєтою сесассгуво 1150 азсоксдчато осачсчесує сасдатостс ассвастста усассостує ссадастоса 1200 дассєтуачта стгсоодавоа стайстестса асзастсадча стжтсастесє ддатассава 12050

Чеусачасучо їсуатассаа одсдастсто сссоасочЕс Фіуссавояї сасодесссо 1520 дідсасоото їсоуссастоє даадстсаса зсадйсадаза пстссвадся чассесаваєх 4380

ФпетасстссЯ сосааєстоє сессастсса астадтоаста адсасаєстт дасссассяча 1440 аадасетсЕс саасласастї стсдассасс аздасеєссая ссіссаєтса бастасстсє 1500 дсадессдаці садссаапас доспадатас сстдотссссс статадсаєс садоддатсс 1560 тсодзададтв стсссазуза одотассазо вадаєсаста созадзадад стсссассаа 1620 кхсодсасаадо сосатазтоє тТасєсатсок сзатоссосс атодааатта ссаєсатвас 1680 састасасса асіза | | | 1695 «2105 42 «211» 537 кій» БІЛОК «2135 Бизагіцт мебсіїсі11і019е5 «005 45

Мет Ген Ре ес Ге Уа! Кеч вго ти Се Аїа РНе сіп діа ЗЕ їецй

Аїа їги бу вер ТвБг охак о ма1ї Ве Уа Ар отТВгобБег осів ув без сп ма! ле зеВ сіу вне сіу ма! зег бів Ата туг 61У ні Ала уз бІ1п : 4 4

РНе ві" АБа ген су РгОо віх Рго біп вух СИ і івц а5ріви гей

Ї ; (з)

Рпе д5и Тнг оте о Тне б1у АТа бу ем обеб тіє ті Аке АБпоїуз Те 65 70 75 Бо сіу суз АБО Аа де" дяп озекотЛе ти Заг ТК одЕп ТНК дар ВЕ" Его

Ахрогуз сіп Аїа уаї Туг о ніз Ре др біУу Ах Ар Або бу ба 5ег 100 195 110

Аїа бій аг мес сі1у Абд бен Су біу Твгорго біу ма! 5ег су 5ек що пе І 120 І 125 зер біу дкр тер Ага ні ще Тук уаї бі Мет її АТа бій тує Сей 135 140

Бек Тут ТУуг Бу5 бІп Атїа б1у їТе Рко Узі его оНів Уаї біу РБе тез 145 150 ! 155 160

А5п осіб б1у Ар о біу 5ег дер РЕ Меї ів бек тн АТа 01 сів діа 165 | 120 175

Аіїа ляр уаї г1е го Мей бе) нія Зег Аїа Сей бій бег о бу5 б1у цей

Деві 185 190 с1іу Абр т1іе ух мах тб сСух сує Аяр Аби Ї1е сту тгр вує 5ег сп 195 200 205

Меї Ахр оТук Тік оАіа губ гей АТа біс бен сін Уді сш Суз Тугє ей 210 215 221 - заг уд! 1126 ТНК обег нія бі ту" зеб б5аек бе РгОо Ака бій рго Мет

225 230 235 240

А5потТає тйгогец о Бго ТВ тТкроМеє бек бін с1у Аїа Аїа Аби Ар бів 245 255 255

Аїа вне Аїа тиг оАТа тер отуг чаї дп обі о1у бЗегоАхв сів су Ре 260 262 270 тис те Аїа уаї суз ї1е дій бій бі їі маї Аби Аїа Аб5робем Баг 275 До) 285.

АТа тТуг їТє туго тгросїш 51у ма1ї ЄТв ТНг ОА деп о гГує б1у бек Гей 290 255 за 5ег нія Уаї Ті Ахр Так Авробіу таб обу Бе Ті Ї1е бек бек т16 305 310 315 і 320

Сец Тер АТа тів АТа Ні тро бек Аго ні І11е АКО РгОо б1у Аа ні 325 | 330 335

Ага вен хег те 5егос1іу муаї Уа! сій А5ротне т1е ма! о1у Аїд Ре 340 . 345 350 біш дсп омаії А5робіу бер Ма|! Удаї Меж Уві Сез Тнг Аби о беб біу тат 355 збо 353

АТа діа біп тіж Узі Ар оїбец Ту Ма! бег сту 5ег 5ес Рбе Баг тиг

Зо | | 375 | 380

Аїа сій Аа ве тйг бек Ар АТа сіц Аїа сій мет маї дер оте сує 385 390 395 00

Ууа1і тагобен обег Ар осіУу Аго ма! 1уз уаї тВгомаї Рго Уаї ні 61у 405 410 415 чаї уаї тиг маї їує ге) тТйг отВе АТа цу бег баг ув Рго Ма! бек 420 425 30

Тнг о Ата уат б5ег Аїа б1іп бек Аїа го тб ово тТВгобек омуаі вуз Ні 435 440 445

Тиеобец твгоніз біп гу ТВгеобеє бек о ТигБ Твеогеу За тйг АТа вух 40 455 460

АЗіа Рго тТНг об5ег тагобіп Тс тВгобег оуаї маї соч бег Аа 1у5 Аїд 465 470 475 4850

Уа! ру Тут Рго Уаї вго Рго уаї АТЯ бег о їу5 біу бек Бар рух Зар 485 40 495

Аза Рго уз мух бІУ Вк овух Сує таки тик ле бух гу 5 зек Ні 500 505 | зи біп бе ніз їу5 Аа Ні бег Аїа ТигоНіб5 Аго Аго Су Ага нів 5іу 515 й 54240 325 б5ег туго Ага Аг о1у Ні5 Суб Тйг дей 535 «2105 43. «й1їх 1934 «212» ДНК й «213» Бузагіцт УуегсісіІтоїдех «400» 3 акадакестє тасстстсод ссттассяссе ттдадсстс содастасує одоатотсаас Ще) жкжхтветасад сстессссСас сцуаттсявас хсадусссся аадкстсоат сестоссдах 120 даєсасдєта аасассааца дсєтдасода тЕтоакосто сасавасаєт ссвасадаєс 180 даадасаєес стодаааадца соу9хстоєсс азабааодоза стсаосаєцт астодчасьсо 240 стабтсадса зодасаєсся соасочостсс Естассстос дтзабтдосає кодсесавоє 300. засаоатісто асаадаастє сатоааєтса ассузоссах єстсоєсацо стсзссесода 360

Ясаайцеєсас астасоєста дватоадстаї дасадсадас застсассох сестсвадаа 420 дсасссаада двадуаєссва зсЕсстстає досуатосте досссостсс сабссасаса 80 задасааасс асдатдаваа їзасочдацез састсотяса Ззсастасада тассоєстас 50 асттстадаса астадзадйса зосстасуса чассасттосє тасаттової сбайтестас БО сосавоєсад одсатсаацує сассаасстя Зватстсстіса асуадесстса аттсдссасе б6о ссстаєтсо асасассоєс таасодсаса садостоссо асттсатасо татастаЧоє 7570 дачасзаїса заазасдаца сатссасчає сттасааєса сстастасоа гадсадачає 780 точаатсссс адозадататє здатдасточЕ сСсдастасту дасстоатсс зосазтсаас 840 тасстсаута тсостастда асасдостас дттксассає салассатссо зсеессааса 900 асададаааа сотдасесас соаосавусє дахтстсасад ассауєтсає дссстасасу 960 тЕстасааса ахтадсуоїса додозазоаос асоасстодо сствдассусає ссадасоусо 1020 стстатавато ссазсоссва соЯасстКстс састаазсса чаЯссуауаа сСтсавессасе 1080 засаотостс сдаїсвасат сасссвдслас азадпїсатсс сттссавоза зссодвасс 1140 тссасассст тсаатсоуєє тасСсадаєст ассасссаєс дсатстодзаачс сасоавастсс 1200

ЯпЕжестсторо тсасадссаб стсатттстяЯ азтассдасо атастасєсос дасоасасата 3260 стовасааса асасадссас тсасадтосо свастсасто стстадсає аддхсадаве 1320 ссісатаяст суавоссЯяєє сЕсозссЯаЄ аасествато аспттдаєтоєс сттдааосах Іо тїразодста стаоавадод ттсасттсву астасдаєтс стссссодатсє тсттоєсвдс 1440 тктостасач аєстстааса агдасаатиє састсуаада адасцаєтат чадазестаси 1500 тсбассааді сдассакоєс теодтасуссо дсдтаваєст сстаасаваєс Стаса 1550 псстажЕксо осссадесас зсласвтсає остсаодтУсо седадауссо заскасузаава 1620 ас«устсака адаєсатєтст бдаасстісдас ассаєаадає сссаєсттст ттттсатасе 1650 їФттсстстс тттсасттоо сСаазататос стосттвасає аїссатоєте жссс 1734 «вій» 84 -21ї» 485 «212» БІЛОК «213» Базавіцт мербтсі Гртоев «до» 44 Й

Меї А5п РКО рев бегосцеч сіу без АТа Аза цец бег о бева вео сту тує

Во | 5 І 19 15

Уві сім ма! деп Ре уаї Аїа АТа рве Рго тн Агро 5ег зап 5ег су зег ой уві іви тіє баг маї доп сіУу Ні Ууаї Гуз НІ біз бі їв

Я дер ві Ре сіу Аа 5ег вій АТа РНе сій Ага кі сш Ар тів ей 0 ) У сту ув Або о біу се: бег рує би біУ тТигосій нНіз Уа) ей АБргву б 70 75 Во

Гей РБе бек г у5 яБо те сіу Аїа сіу рве зег ХїЇа Цей Ага тій Фу пе Ту бек бек АБ Зег его Ахроїуз АЗп Ре Меб ап 5ег їі бін 106 105 1ю рго рРБае бек рго б1іу 5ег о рго б1у Аа уз РГо нів тук ма! тер А5р 315. 120 325

Є1у туг бр о5ак біу біп без тпгоуаї АТа бій бЇш Аа Рпе вуз Аго 130 135 3

Оіу гер ух Рйв Гей Туг біу АБр о АТа тер баг Аа Рго пу туго Меї

У 150 155 й 16о0 рух ТигоАзиИ нії А5р о бім дей Ай С1Уу б1у Тук цею Суб ту ма! тир 165 175 й 175 сі Аа АТа су АТа бек б1іу А5роттрогу5 бій АТа тук АТа А5ротуг ї5о 185 190 веч без сп Тгромаї бі РА туго Ага цу зебосіу ча! Гуз маї тВг 195 200 205

А5п ге біу Ре їеу дзп би Рго бів вйесАїа АТа го тує АТа сту 210 І 215 220 мет еп баг о А5п Фіу тик Осій Аїа Аїа Ар оРНе Кі дк маї сей оту 225 2 235 25) ух Тит ї1е Ага уз дго б1у ї1е ніб дер о бви ТВгОїТе АТа Су сСує 245 250 255 дхр о1у 010 біу ТтгроАбо ем біп січ Ахр Меї Мей Ата оту грец твг 250 265 | 270

Аа сіу Рго АБр Рго Аїа Хе А5а туго бец бек ма! маї тиг Ту ні 275 2850 255 сіу Туг уаії бек рго Рго доп оНів го Бей беб тб таб огбує бух г 250. 295 | 300 тер їеи Хв обід Тго Аїа А5робей тб осіу сій ейе те вбго тукотаг 305 350. | 315 320 те туг дхп Аєп его сіу б1п о еїу бій біу Меє Тйготгр АТа С1у го

Шо 325 | 330 ши 335 тів сій твг дій Сец муаї дя АТа деп Ууяі б5ег о1Уу Ре гец тут Тер за 345 350 і тіе іу А1а Є деп чек тик тик АВ 5аг А1а їви те дп Мет ї16 355 360 305

ТУ А5роцуз уаї ЇТе Рго бег Гу5 Агу Ре тр Аїд Ре Аля 5ег Ре 370 й 375 380

Бек Аго Ре Аа Аго Рго б1уУ АЇЗ АГО Аго їїа сіб Аїа тТНг обБег баг зач 390 395 400 ча! Рго Сей УудТ тТйг о Уді 5зег 5ег вне Ге Ай ТИг Ар оо1у ТАК ОУді . 405 410 415

АТа Тк Осій Маї їец А5п Ап Абротйг Уа! АТа нія бег Уа! бі гео 420 425 430

Ууаї Ма! баг с1іу тТиг сту Ага дБ го Ні бег о вей мує Рго Ре рей 435 480. | 445

Тс оАбр о Аей Зег деп дв бен ТигОАТа ге ух ніх їец фу Аїа тис 450 455 4650 сіу туз Ту бек рйе бій Таг отТнг о ІТе вто Рг Агд 5ег сен маї бер 465 А7о 425 480

Бра маї ТК А5р Ре

АВ

«2105 45 «АТ» 137А киїй» ДНК «із» Бивакіцт увесісі11іоіде5 «4005 45 акусастасд стасестсас састтедово стоостства ссассаасує соссосавсао 6о сазадсасад саастассва сстстссааа азїсатодає содсдаадає ссттоцеса 120 пастссатає асоадсісасс Ссасаасода асаавасоїсо асасстесат ассаваєскс ТВО ттоддтяасто асаксаватє саастсадис соасодсоЯто чсодсссаайє сссвесасто 240 пдІсовосса задатудста тозаодатає стсодоссост гсаастсває сттатссзає зба таксуєдсса сосоасааоута тазсоскоас тетатстстток тасстсатоаа сстссааЧх 360 асвдатався часадйдчосес авастесссо ТсссстдосЯ асаатодсва стодастова 420 агудацетає гсходваєсса асстЧхЯссЄ дасстівалова стсабаатає астадааоує ВО сттаєчаїто аїшссЄтадна сразсстдає ассовтаєсє Єбодоавссо сссчедоссВ 540 садстсстто адтаттасаз ссдсасдаєс азастаєттс дасуадестя стастдатсс 500 акасататтї асацтоаоєт застооссоа астадааавда састтсссав аастстесте оо загаЧсссай ссабоосаса гтстессаст стуєссоасо збазатацса тасстаєсс 720 саатсадіаву содосазсва часадціссся чатасттась сстудсаїса дастдасосх 750 кодсозасако айссодасао састастсссс дастетасса ссткосодос дсвататоде 840 деЕКсссоваз воссзаєсоа сетсСсаатдаз стасоастасає асоатоаоса ааакссацес о застесоіст аєтасскстс їсвастапай сотсатааєс ттадаватст тсдсоасазас збо тадаасаасо даєстяасст ссасазссод агосусвасєс тдасттасад састассдах 1020 асстсдавоо ддасесасєта ссстаатуду даасдосяадоо стібасазуса стасусаосс що аєпасаадає здадасттає бассааадса тсатсодаст єбаадєстоа дес ктасе 1140 астаадсаво зссосаадчаї Тавдатєтата оссоЗсасоа одбассосттса асзадутахт 1200 засаєсазай ТсзосОЧстЕ одеазатазса ддастосста адасодоатає чосазваес 1250 содаасетаєс пдаєссозсса дассааусся засодазаад гтоасадосс тастаатсоа 1320

Чадазоаада зотаєЄастта ттсаЗзссвяих асодєбсадса пдсосстстасє сода 1374 «г1і10» 46 «2115 4359 «ій БІДОК «2135 Бузагінт мегтісі! ісіде5 «005 45 мес нів Туг АїТа Тне Гей о твг о тпгосен ув! ів Аід бен Те те деп 1 х ; чаї АТ Аа БІ віп е1у ти й Уа Ав ге Зег цув дБА нів 2 су Рко ка ух АТа сеш ту ний сіу Ре її Туг віУ ТЕвВ РгО Або

Ав їм ТАЄ яег ма! Ав та чек" Іїе. го А5р сбе ен маї тиг АБо т116 губ вве Ап о б5ег доп Аг б1у біх с1у АЇа бій че РТОо бег ра 65 70 7а 80 су тгр АТ Ага щу сіу тує сій У дуг бе С1уУ Ага вив зп зег 95

Тве Сей бег дп туго Ага те таг дея бує тує Аза Аїа дз Ре їТе 100 105 о

Вей гей рго Ні5 Абр Бей тер оту АТа дер сіу біу бій б1у бег Аби 115 120 135 зегорго вне Рго Чаіу А5р Ап біУу АБ Тр оТйг о бЇ Меб Ту їв) рве 130 135 140

ТероАзи бій бен ча! еко Ар Бей їУу5 АТа нія доп Меї геч ої Ту 145 150 155 160

Кей уа! ї112е Ар Уа! ткроАБпП сій РгОо Або І112е Аяр 112 РБе тер АБр 155 170 175 йга Рго Тгробег біп Рйе сво біб Туг Туг аАБп Ага Аїда Те був Гей 150 185 | 150 зей дга уз тег ог ец рго гу тає се бе) бБег с1у Рго Аїа мех Аїа 195 200 205

Ні Зег Рго ЇТе зей 5ег др оАЗр о їує Теронія Тве о тТгтробен ба 5ег -1й ВІ ! 220 чаї Аїа сіу деп гує тб о Уаї РгОо А5р ї1е туго Бек троні ота їте

225 23а 235 440 о1у Аза тгрооів Аг Січ РГОо А5розек ТБ ОТів РГо А5ровне Те т а 250 й 255.

Кен Аг А1Та Єїй тук о сіу мМаї Рго біш бух Рго їі Ар ма! Ап ото 250 285 ау тус Аїа Аза Аго Ар обіч біп деп Рго Аа дБА Зеб ма! тує тукобей 275 280 285 «ег соїп бен оїй Або Ні деп сей Ага біу Се Ака АТа Аби тро сту 790 255 300 ек обБІу баг Ар огеу Ні Ап о тТгроМес с1іу А5п ге Її Тук о бев Тег 305 310 315 | зга тиж біти так озег бів б1у ТвВе тує тує вго Ап оо1уУ бій Тер обі Аїа 325 330 335 тус бує Туг туг АТа АТа меї АТа 51 сій Ага цей уаї Тк обу АТа 340 345 350 аг жег А5роієи 15 РНе Ай уаї Ре АТа тик обу сій сім ака о у5 355 350 365 те губ 116 11е АТа е1у тагодво те Уаї а1п Аа ух тує Аа ЇТе 320 Й ОВ 380 | Й ру Тіе бек біу їец біз ма! Аіа сіу їн рго груз мех сіу лін Уа 355 390 395 400

Гуз маї Ака тйготує АгЯ РПе А5ротгр о АТа бТу Рго Абп Ту бух маї 405 410 15

Ар оіу рго ма! А5р бен бім бін губ у Туг ТВготуг баг Аїа Ар ч2й до 430 тТйг уві 5аб баг РКО бего тат 435 210 47 «211 1426 «дії» ДК «213 Бизавіт уектісі 1 Ноїдез «005 47 ахгасоаостая гсладЯасстЯа сіссдксстс дссастекеє ссассокюаєеє сустдчасавдес 6о сесоаЧчЕссса ссаїсдастт єтсстссяас астадачазе сссаосаєстї состастаде 120 ассстутасо огаїтвсссоя сдатдоозас садятсссао атратеттст стетаасеке 180 асстсявст астатсосоя тосадососе сязосссстє атодасодао єтатоасано 240 остодастсс ваоасадсоссї сдааадсосо сатазсавсс асассоксасє ососсчсас зо засодссаст ссухсстасх дстдазсдає стстудздсе стсахтуєос сеставсвас Зо датасстсас стадтссацу сватааєцос заттоотсає сстаєдасав детсосесва ч20 деседаєтатєто ссзатаєсаз давостасаас зтЯсзодача астсуотсат гсдататстоа я8о засазассяд зоодадасто їтссеопдос сутадсаттд ассаатодєт їсадатокаа 540

Чассасадст досахсааїї сааосазота стадатаєстї стозавасво зходдасааа 500 застдастує статтсадко атоассттсуЯ одасадсаєо ттдаєсасссу дассзастсу 6БО тосадосовго ссодозасаа асдатовста атодасссва тадоєсссааї тсдассазоза 720 савсдастсс атссссуаєс аатасосаєа здсасозоадаа зоадасесад ЗЕ ссаасс 7ва сдадаасаюс тасоцеЯЕсс тосазсазає тстсастаза гасдатстес сссааєусса 540 захсвасаєє двасддатасо стасатксла гозасазатс сесдссачЕт стусстіста 00 даєстсссаю тсдадсосс паїаагостаї соавеЕстЕсоє удсааттодс садоадесає Бо тсвасстсає дасстдассо стазестсст згссааЗесу васссстсов астасостес 1020 сСасодавіас ткквоссвато зазастаоко воховтаїаас тастастскс зсаасатдає то50 чвдазсвосоє Зіттсдассї суЯдсасссс сдас9дуааЗу стбаакассє асосаасаче 1150 бчдасастасу дсосасасоз ствазотаєе дсссвастає сагосасста саассадтає 1200 тТтатцатоахта всаттєксто ЗгстцЗасаза ат стЯ ссасстесту даасасттса 1260

Чустадовсе годаауєтто ссутодосад єдатсутоасає стасадссада сочостстес 1320 тїсаздаєсста устаастата дісасастат гаосаасоозі садчетасстї тоассосеста 1380 тсадастдат сатоссаєта сабасосате пдасттсаза їїстад 1426 «2105 «8 «211» 456. «їй» БІЛОК «135 БО5агіцй егтіст1г1оїбе5 «400» 48

Чет тро во їїТе су АТа Сух бек мВ беш АТа Аа ей бег так уд ; ну 15

Аїа АТа Або Зег ро О1у вго стаг те АЗр пе бег о бег дей ТпгоОсіу : за сій его бій Ніз сего дія АТа о1У ІТ бец тує Ту 112 Рго Ар Ар

35 40 45 «1у А5лобіп те Рго Авр ав Без ге баг Біу ср е1у Ре А5п Тут 50 з. тук Ага б1у Аа сту Аїа сп Уа! 5ек ні с1у Тгро5Зес тус А5р о о1у 655 70 75 80

АТа сім ва іп бій Ага Ре сій бе ве Ні Аз Аби тує рема! 85 90

Твг Ага Ага Ні Ази б1уУу сту Рйе Уді Сей цен цей Ап. АБО Геу тер 105. 10

Є1у Ра А5в Су его баг Ази дп о АбротАе бек орго біу Рго у дер 115 1920 125

Ай сіу Ар тТгробег бег Туг Ар Суб Ре Маї Сів Аїа тів те Аа 130 | 135 | 145

Ап уаї Суб вух Туг Ап Меж біп сій бу Сец Уа! їі А5р о г1е тер 145. 150 4535 360

Азпобіц Рго 510 01у біу Суб5 Ре Тгробіу дго бег т1Т1е Ахр о біп тер 165 1 1275 йеч біп Меб Тер бі Агу Біу Тер нії бій Рае Абп Ар діа РНе 1у ї80 185 190

Ар Бек уд Бен тіг о Бег сту Рго тс цей АТа б1у бу Рго біу Те 195 200 й 295

Ап Або Абв Тер оТгротие бів Тер АТа біл Рве Уа! (уз Ап Абл. Ар 210 715 Ди хе чес їжа рге Ар о сій туг АТа тгронії бій о1ш біу біу 5егобіу че 225 230 235 240

А5п Не бій Аа беготуг с1у маї сени біп бій тів ве тн Бу туг

Й 245 | 250 | 255 сіу гей рго бій дга бій ті Ав те дей сій Тук АТ ТВе РЕ АБИ а. ! 255 270 сін біля маї Рко АТа б1у 5вгоАіїа ре тТеротівє баг сій Рпе 51 Аго 275 яко 285 дей дей Аїа тів бі сей дго бі Абпотеробво б1у біу тоб сот вен х90 295 300

Ні Авр Сен Аа Аїа б5ег о Себ їеу бег о Суз РгОосАБр Рго бег Ар туг 305. 30 815 320

Аа бек Тит сіу 1 Рпе АТяа А5поб1іу Ар отеротгрома! Тук Ай туг 325 , 330 335

Туг бек Ні доп Меї ТПг біу б1п аго уаі бек Тс бек Уді 5ег Баг з 4 350

Ар віу Ага рей Абр Аа ту АТа тнг омаж дер Тиг тТВг о АТа Агу ТВе 355 3650 355

Аа Аго уза! бен цей Ту Суз Ні Рго Бго Те тб осіу Тео тує Авр 370 375 ЗО

Уа! ТВг о рйе бег біу спец Те бух геу Сіу ей Рго бек бего су ТВг 385 390 395 400 сец сій Уаї Аго те тросу РНе АТа маї сіу 5ее Ар маї нія тує 405 І 410 | 415 ваг біп Маї бу 5вг о вго біп абробеу біу Ап тує с1у нія тик Ге 420 ав 430 зе АБ сіу бів ма! твкофїен рго Ре туго біп тбг одер А5р уві тне 435 440 4845

Тег тує Аа тгросій Рпе уз РНе еВ. 455 «10» 45 215 1506 «в» дик «213» трРіспотопає зассаго1туєчтт «4005 58 агдутзавана тазадасасс азазааттсї даїсосазлав азіїсассад сЄадасоазаз. 60 тТатсутутач втасадодад зстдавасте осдєтосаза засадсасат дазіастіта 120 азатттотоа аасаадзатає ааасстсавао татасаадад озсатєдасст тстатосдас 180 оаїдсадата жстассотда сдасотадта дасаасдвст тазодссате ттасаватесс тай асоасататац асавоузаєск: єдатссастт ссддааєтао оуакаавоасс аттсектааа 300 яссддаєтка сосстазава аїттадсасст уосасасада садтатєттта тточоацада 360 затяссассс сісссаваца ссасозаава ГТодаосвасс тгіатавааос тост са 420 сатссєсастає сазозутасод сатапатоай Чсосаадат зоссаєттвда захатодааї 480 дайссазаєсс тазазодавсї сгодазадає дстдатозра аадаакастт саайстотас 540 засостасто сааадоссає тазаодація аатовоазєї босаузєсавдо адоасетосх 0 атасосцого зсостоаста стодатаодза здат ссствоа ваІкстоста сдавдаадає 560

ФЧЕссствІто ат стоабатє Зсудасаєдса батасоєсса адсааодтда атаєасуєса 72О саєстсастаї ассаодачат татоссатст даатасатаос тазасузаєх саазасавта 780 адасозааєса хазаваастс зсаїттттссо аассттссоуїх сссататлас создсасаат 5 асаєстіаса отхссаєтада їсстатасає патасосстт тсаатасоуЄ отарсетоса 900 адааєєтстал агозачасоє адаєтаєоії уаттсвккст сстаттодас утстадсодах або вхдїїсОазо азададасаії пссвацасся садістсато дадЧчаєстца «стадчткаса 1020 тЕдааїзада твсбдаацєс дасісттїсас аїдєттаваї сттЕсаатас гтатоодадаз 1080 цадатасстт асаавдатаа ссатасостє атааствзодах дадаєсаатоо весаастаса 1120 тхдаєтаскх доаасдадає аагудадаза асадавааїс садатааоца агаєвазсто 1200 дзаатасєсто тадоаїссаз аоасЧссІї асаазодазас адаєуасада тдадчаєсає 1260 цасватестт додасасото дакасасато чдчяадусєсда захссссвач сзавовасав 1120 ягтдадасттї гаапйддатає тасазадестї яазабсаваяаа СаЧотядаче сасаєссазає 1380 дасазстаєо саззасссоза аїстадаєсд Ззодазазато стдсдотаєт Чтскозасто 1440 астддагссаа Єрдасвазсс азасасттає атаддчасска акдатадсаа часазасадя 1500 таєтагв | | 15065 киїй» 50 «і» 50й «Ф1йх БІЛОК й «вїаю тгРІіСНОМопає бассагоТуєісит «400» 50 мех ті суб Уві вт ма! Рго дер Ре Бае дер Суз Суб РП ік й Авр

Аг тр Аго и Суз ма! сіу тйг Оу Ага ви сі1у цей ще цей віп цуз «ій ту 11ае сш тБг Сей су Тук Уві суз б деп тів Ар. Рне 3 З

С ух у їТа дко оту нів У їен о цву сСух Аз Ак маї біу ї1е тут дга сі А5роуаі Ууаї сіу Ар біо Маї гу го РНе Туг дей РНе тп 70 75 50

Туг ТіЄе д5р Ага те Бе Ар бег РБе і ви 1 їТе о1у тів аг го

Ре ма! Ти т1іє с1у Рпе Мес Рго їу5 Гуз Бе Аїд 5ег б1у тТВк біп 100 105 10

ТвкоУаї ве тус тер ості офу дей ма! ТНг ово ро гу Ар тТуг сін 115 120 125

Буз Тгр б5ег Авр їец уз! вух Аа Маї без ні ні Рйе їїє 56г Ак 130 135 ЕЕ та ДИ

Тук біу ї11е б сти уаї се губ трровго Рйе біш їж ТероАБп СТИ 115 о 155. 160

РгО АБ ге губ 01ц РБе тгр о гух АброА1їа Ав о аій бує ої туго Ре 165 о лУй 175

Муз рей тТуг їу5 Ма! тТнг АТа бух АТа т1е уз біш Уаї депо біц Аби 150 485 190 се їух маї пі 51 РКО Аа їі Суз сіу б1У АЇЗ А5ротує тгрої1е 195 200 205 оІш Ар Ре ви ака Рпе Сує туго бій бі Абп Уаії Рго Уаї Абр Рве 210 515 229 уа! Зег аг нів Ала тТвгОТйК Зеє губ біз сіу бі) тук таб рРго нів 225 . жа 235 240

Мей жшТа тук біп біз ї1е меє Бко его бів туго Меб сей А5а бі ре 245 250 255 ув тик таї вка З т1е ті МСух АБИ Зек нів РМа Рго дви Бей сРгОо

І 26 2655 270 вне нів тіє Тис бі туго Ай так оБаг туг бат РгРо бій доп РКО ма! о ех5 | 280. 285

Ні Ар ТАК оРГО РНе Ази Аза Аа тує тів Аа зга Ії ву баг б 290 295 30 су біу Ар Туг Уаї др оЗве рРНе б5ег тує тео тв РНе 5ег Ар Уа! 305 310 ОЗ. 320 рве біб бій Ага Ар оуа! Рг Ага ек сій Ре нів біу біу вйе су 325 330 335 цей Уа! Аїа сен ап мМеї ЇТе вро бує РКО ТВг ОРВе туго Твге РВе Дух зо 345 | 350

Ре рпе Ап Аа мех о1іу б1ц оіу Мес Бей туг АгО Ахр сі ніх меє 355 350 365

Гецоуаї ТЬг Або Аго др дер сіу 5ег о уаї Аїа Сес їіе АТа Тер АБИ

370 375 380 от Уа! Межє Ар о сує ТпгОСтЮ А5п о Рго АброЗЦІ АЗр тує ої уд! о 385 390 395 Й Ада

ІТе рго уаї АКо Ре Ако Азроуа! Рпе їв бу Аго біп бен 716 А5р 405 410 415 18 у ніз су Ап вгОо ТРО 6Ту таке тТгр оті ні мес сіу Аго Рго 42 25 430

Ага Тук РРО бег губ сій бій Узі Аяп Тпг о беб Ага бТи Уаї Аза був 435 440 445

Рго б!ім І11е Меж тиго5его сій Рго Маї Аїа АвлоАБробіу Ту сем Авп 450 455 4650 мен куб Ба цує бек б1іу Куб А5п о АТа ма? маї ве туго ої рец ти 465 | 70 475 4850 січ аго ї1е Абробвід баг обег тб о Тук о тіе С1У во дер А5р о 5ев Гу 4855 490 495 тів а5п о оіу тує 500 «віз 5 «115 2118 «212» ДНК «й13з дпеорасііїне 5зстеасоспегаюрнті 5 «4005 51 абоссавеса атасаєсеєЕ саасодсссаїт састсассуд ссдУдасясе соссадсе бо зсастзоаодає сгсссодоага аадесєоваада сеудастстод аастсосссз зссяссасой 120 сазаакоаєст ттаттодсає соовотсосся сассазссвоа одстесаєтса саєсстксеса 180 тЕсосабада сассадосуа доаїдазадс авасвастаєо асасідаааа ссстдатсся 240 аакссдсааа аассазасат гстсатессо сттосоазад адоадатсаа асосоваттс 300 тасусоасваа судатасаєу даазостодо часттаасує єтасдаттса єксоссдчка з6о ааадсадЕЗс стовІсссуа йзсвасадсс дачуаачаас їсзадесоае десудеєсса 420 астдтсатто хсоадатуасє дассовтаас асузаєсоудаа сзадаасасо асууаєатее 4ва ттспозттсо запйосассоа сесосатаєс гсодасосоаос доассваєда тасасусеса Зо садстасоса вадссоусса аддосодасєє сідадсасєто васссавада тозудасоє 6500 сдсіслаосоє тасаєтєтай сагодазуат аїсттааєцо садастсксда айзазастовд ббо асоттсоадос стопдаанає соатососса яссоксдата кассчосодо адааяводаай 220 асутатсаай Стас тТЕстассоє ачточскато єсассасачо затадасасс 780 темат асасссоктє сскссатаас агсоазозвау ЕсСодістста тосостадад 40 сачассчасу соссбаазоча усадесУкіс соуттсогасо аастсаєсуа азааозатад 900 сістссоата аїсазаадес сатодатадсо сасасаатеє дсазстаста топосавтася зво саастостіто зоасатозада азасссдаст тпсддтсоуста ассааодсяа отассовата 1020 агазатасоє ЕстодЕстсас сассцаєсвза ССС аддстозадат одвзасссовау. 080 асддказааа ахесустєда сЕКСТатоєс дчадсостаса остатдадоа саке 1150 штсссауЗзад асбадасуда асатсссоас досатсадся тсСастсатоа тагапазохс 1280 дсізасасоє їстсасуксс зсаїтастсу їсатстаєчзауес табсасуєаає садсяЧетас оо тЕжтсосата сдасасясоя асадстсоїс аассудосоус ствсосасуЯс зататвсасе 1320 дзасазасоз аадастуоос асудсасуає сдасодстсяа совестсода зсаасокесс 1580 даагосасоо тосассосаа ксасссддаєс ссвдаааадчс оозасудсає васадчост 1440 чзасзасассс дсассатодо содзасЯдза згсасвасоє аєдататттє одатаєсксе 1500 стсчассааЯ сасусаасваа ссбататста дсаздаззаї охсодастас стасахавсо 1550 стсавачацї кесСтссусоча туссаЗсаза дазозастод ссосаєсодс заддчадсад ївга

Фсразавааст пдсассосоузє састассває сасодєспасад задасадоса сассссадсс 1650

Чгдасодазо зададаазатча стсдазавтс астссоаста стодаодааст соках 1740 састсєстасоя астудссатса чусоттзада даацзасодас дстттарада ссатсаєесоє 1500

Ффоастосдає аасастсаса астактосаста содоаводаз сеЕсоасстате сссодасоаа 1860 заасоазава сстсстсдає аадсяасває єсатоцієба осадаатста сстатоєсад 1920 тттаттоссс пссоусатєстї аддогодудав тодоасууаає заЗдааваса зассдатосо 1980 дстсакоасєта сохтодстсає дсажссдасо стстссаттт сдздетодад саассавату 2040 дісостодсу ааахсадсоя садсааатас сасссососЯ дсосчасчаа саїттстатоа 2100 їедазудава ддодватой 2118 «Ох 5 «їі 705 -212з БІЛОК «213. беорасі!Ти5 5бвагоєпесторні Ти5 «4005. 52 ес го так АЗИ ме Ре Ре дп Аїа нів Ні 5ег Рго уаї сіу А1а 0 15

Рпе АТа 5еє Ре тТйгорец сїу Ре бго біу сух бе оїу о1У гГеи А5р

20 25 | 30 цей би й Аїа Ага Рго рго асо сів Ап оМаї ей ті сіу Маї и ег Гей нія бі) 5ег 01у цем тТук нів уд Кей вто Рйе це св ТАг 53 !

Атїа сіц бін Абр січ 5его вух Агу Туг Ар оті би Ап бРго Ар о рРго б5 7 75 шо о

Азповко біп бує го Ап ї1е тез їв во РБе АТа Гуз 1 Ів І1е 85 ! з сів Аго сі) рбе ніб5 маії АТа Тйг о Аяр оте Тгрогух Аа с1у Ар Гео

І 1 105 0

Тит оРНе таб оЇїе тує бег Рго ма! 1у5 АТа маї Рго Аби РГО б СТАг 124 І 125

Аїа А5р сім сім бій беб бух беч АТа Бей Уаі Рго Аїа Ма! тів ув! 130 135 140

Сі Мет тиг Ї1е Ар Ап тік о А5п сіу Тік о дго Аїх Ако Ага АЗа РНе 145 150 155 їв

Рпе сіу Ре сій сбіу тАйг Ар оРго туго тТвкК баб ме АгЯ Аго тів Ар 165 170 175

Азр о тне Су Рго сіп цен АгЯ сім Уа! сту бій сбіу дгд тіе греч 5ег 180 185 ю те хаї Зего1уз А5р осо оіУу маї Ага сбек АТа ву нія РБе 5ег мех 195 І 200 205 сій дБрохіе ен о тне Аза біп без бій сти Аби Тгротаг Рае біу гей 210 215 220. о1у губ Ма1ї. б1У АТа без чї16 Маї А5рома! Рго Аза 61уУ 1 Су вує 225 с 235 | 240

ТНг туго бій РНе АТа ма! Суб рРпе туг Аго біу сту Туг ма! тк Аза 245 250 258 сту Меб Ахр АТа бег тує Ве Туг ТпгоАго Ре Рае бій Ап ї1е бів 260 265 270. сій ма1ї сіу цей тує АТа цей бій ста Аа бі Уа! сей мух б1ш ов 275 250 285 5ег Ре Аго его А5п Ту ви тіе бів вух Єв Тебе ек Ар оАвр пе Ж | 300 сіпотйє Ре Мет меж Аіа ні АТа їТе с дго 5ег о туг Тут біу деп та 305 ЗО. З 322 сій Сец Геш обі Ні бій біу ух Рго ІТе Ткр Уа! Маї А5о бій Фу 325 330. 335 сій тук дгуо меє мето деп ти о впе ар цен так Уві Аросій цеу вва 340 345 359

Ре Сбіш Цей суб 1ви Аяп РРО Тер оте Уа вух Ап Уді їеи АБ Бей я 335 36 І 365 1 є

Тук Уа! біш Аго Туг бек о Тук сіб Ар о Аго мав Аго РБе о РГО сту біз 379 375 380 І сій те ості тує вго еко біу т16 5егорне тйг о ніх Ар оМмех с1у ма! 385 390 395 400

Аа Аз ТвВг оре бег о дго Рео нНі5 Туг бег бек тує бів бео тук сту

І | 405 0. 415 їїе 5ег біу Суб ре зег ніз мех тТнр нів бі біп вес маї Аза Тер 420 І 425 «30 маї мем Суб Аїд Аіа маї Тук ї1Те бі бій тТИг бує А5р То АТа тТгр 435 40 445

Аго Ар ув Аг ївц АТа тТ1іе ей біб бій Суз ев бі Зег Меє ма! 450 455 1650 дга Ага дер ніє Рго А5р РРО бід сіл одка А5п о біу маї меб сту ей 4655 ! 470 475 аво др бек тТвг Ага Те ме сту у АТа б сів Твг тик тув дер баг 485 4за 7 «ау цен а5р ма! 5ек іви біу сій АТй АгО Ап Ав бе Тут сечу АТа ТУ що 500 сте зіЮ їу5 Сух Це АТа Аїа тує ма! АТа бен сш вує бе Рпе Ак Ар Уві 51 5 . 525 с1у уз бі сі» Сец АТа АТа бен АТа біу бі бій АТЗ ЄТи гує Суз 530 535 | 540 діа Аза тис тІіє маї бек Ні Уа! ти Абр Абросіу Ту ї1е Рго Ала 545 550 555 550 тів МЕЖ бу бін оіу А5а Абробег бує 1Те їі Рго А1Та тів сів о1у 565 570 575

Ммец Уа! Ре сего Туг Ре Тнгодеп Суб НІ5 ОЇ АТ гец АБробій Аа

580 585 , 590 а1У Ага РНЄ б1у Аа тук Хтіе бій АТа бен Аг деп нів без бій туг 595 50 505

Уа! це Аго бі б1у ї11е Суз гей Рібе РгГо А5р Ф1у бі1у тгооує Ї18

БЮ 615 520 5ек баг тйг обег дзп Аз Бег Тер бен бек су Т1е Туг гей См5 о1п 625 630 535 5 ве хів АТЗ Ага нів їіє їез 5іУ ТПтроб10 тТгр АБ от опа сіу вух вав 650 655

АгЯ АТа Азр АТа АЇТд о ніб мМаї дід Тгробеч Тигоні5 Рго Тв? Без Бек

І 60 6565 0. їїе Тер бег ТгроЗег А5р осів 116 1Те А1а Фу сту т1е ТВгосту бер 675 бо 585 Й

Суб туго тув рго АР біу маї те обег тТє Кео тер обер зі б 1у 590 595 700

Ти 705 «2105 53 «їх КО «й1й» ДНК . «213» тТРіСпОтопа5. Коптпдії «4005 53 атоастстсса асастсутає саксасвасо дастотаєта стусадустєє стос КС) дестодосеї охдасаєста сксстсодуас подзасосстї дсоуттаєсяс ссасадсаєс 120 астсдадссс г9сссадсосє статбассодс ссоссатаєс аддсааадс созсессдає 180

Чососсасаз ссяссатаєе пссссістса абтадзтогод ссаасдстує состсавуає 240 дсітестЯасо соддаастас агаєстсато ассассатат асдассадіс даатсасадс 300 здассатстса оддазоусссс дссоадкоас сесадсвосс содазєссаз сеостасдає 360 айсстдуста егосваєтоо досуссудта асастсаасо уссадзачоє осаксадачесе га тїсвтакстс садозасоава пгассодднаї засастясса зсвдсасадс сазадавчає 80 одссосодаоа дсатоататус даєсстсдаї одсасасаєт асаасдясяс стастдєт 540 дастатодса асоссуадас сласадссос дабасадоса асоатсатаї ддзаодссакс 500 тастткдусо асадсастді стуочокасі дасесвобса задожссЯва заксатодсх 660 патстсядаада асудсесЯсх сесапсдсесс адЕсссдоса асаатассоо тасссатес го астсатасс дусісодссаєс тосадсдаєс аададосадс сазассвато даслакесоє 750 чоасдасаата стасосстод сесостдєса ассттестаса дсдасостсо сссасаваєс 840 тссодуатаса акссаакоза сазадаоодос уссассаттс тсдосаттуд содосаасває 900 адсвасцоса ассадуосас астстзтдадч часутсатов сстстазата єесттсесдає 960 псаасзузаа згїсСадсвса адссазсавс чезастоєса 1006 «вій» 548 «їх 500 «012» БІЛОК «2135 тгРісвотюопах Копіпдїі «00» 054

Меї Ген век Ап діа лго їїе її Аїа м сіу Суб тів Аїа ма о1у

Е 5 Ї зег Гец. уді пи діа бі вра су дою тТе туго бек 5ег Б сіу пін ; з5 го сСух ча ліз Аїа ніз зег ле яяе Аго Аїа ви Ре бЗег Аїд тус шо: : тег ву Рго їец Тує вій й Муб Ага сіу 5ег дор аіу Аза те таг зе б

АїТа її беб ргОо гео сег бек о біу маї Аїа деп А1а АТа Аа бій А5в 65 70 75 Во

АТа Рпе Сух Аа щу ТНЕ тТНг Сує гей те Таг ла тів ТУ дов спа бек сіу ага сіу АБ нів сви Аа біш Аїа Рго Рго б1у бу РВе 5аг 00 105 0 іїлю сіу Бго біц бек Ап біу Туг Ар Аяпо Ге АТа баг Аїа І11е 01у Аїа 115 120 125 тго ма! тик без Азт біУу біп о гуз діа Тук сіу ма! Рпє Уа! бек ГО 130 35 140 біу те о б1іу Тукг Аг АБИ Ап АТа АТа бек піу ТО Аїа зуб с1у А5р 145 150 155 | 160

А1з АТа іш біу Меї Туг Ала Уа! їеи дбросіу ТИГОнНі5 туг АзпоОбіУ 165 1790 175

Аїа сух Суб Ре дер ту о1у А5пП Ада с1Ш тИг оАБп Бег Ага АБротг 150 155 19

СТУ Авп сіу ні Меж бін АТа її Туг Ре сіу Аб5ор 5ес таб о маї тер 19 200 205 сіу тв аїу б5ег о біу уз біУу ргРОо тир її Меж АТа А5р Бе су Аби 210 215. 220 сіу це Ре зек оту ваг обег вго с1у дей А5и АТа б1у А5р РгОо Баг 225 230 0. жу 240

ІТе бег туг Аг Ре Уа! Тк Аїа Аїа їі вуз Сіу сій рго Аби бій 245 о и5о 255

Тер Аза ї11е Ага б1у сіу деп Аза АТя Зег о біу багогец зег ТВе РПе 260 265 270

Тук бет Ф1іу АЇа Агу вго бій уа! бек сім туг АБИ рРгОо Меб 5ег ув шу Щ 280 285 сіш біу Аіа Іі І11е сец с1у хіе оїу сіу А5р АБО 5ег Ап оту СТУ 299 г: СІЙ 300 бій с1іу Вт Рве тує бТш біу уаї мес тйг о5ег о біу Туг РгОо ес дер 305 310. 315 І 320

АТа тТне бій Ап 5егоуа! бій А13 Азпот16 ма1 АТа діа Арго тТук літа 325 330 335 уаї А1а вго цей Твгобег б1у Ро діа гео твгоуаї С1у бег Бек ле 340 | 345 350 , сег гГеу зе АЗа тик тик о АТїа Суб Суб ТНг ТВгРОАКу туго тів АТд Ві 355 360 Ши 365 чек сіу зег тб оУаї дело твВеовіяй Маї баї бег зем зає 5ег Аїа тйг 370 375 ЗО.

АТа сер вуз бій сіп діа б5ег тер ТНК Уа1ї Аго Аа біу кеш АТа Ап 385 з39а 395 400

АБ АЛа Суб вне баг пе сш зег бій Ар ї1ійг озегобіу бЗек тук т1е 405 10 415

Ага Ніз хег д5и РПе бу іецй Узі їей Абп Аїа А5поАзробіу бек ув 420 425 430 рей вне ліз біш А5роАТа тйгоРЛЄ Суб ТИб сТй АТа о1у Те д5п у

АЗ5 440 445 біп біу бег б5ег ї1іе алко бек тер обег ту Рго Тг оАго Тут пе Аг 450 | Я | 460

Ні тує Аєп о ди ТК оієн Туг о ї126 Аза бег Аби сту б1у Уді Ні Маї 465 420 475 480

Ре азр Аа Тпг о АТа АТа Ре А5поАБО АБа Маї бек Рпе уУаї Уаї бег 485 440 495 сту сіу вне дів 500 «вух 55 «11» 445 «йТаж БІЛОК , «213» Бцеаєіцшит мегтісіті1оїде5 «З00ж 55 цій Тер бен тс м Рго Бей сей Ре за его Тг оре) се У кец ше 1 те оіу ува! діа Сей АТа дер дп Бго т1а маї біп дер це Тук тв

Аїа. А5р вго Аїа с Рго меє Уаї ро Ап біу дру мМаї туго сен пе ТНг 4 | 45 сіу ній А5роАяВ Ар сту вегОтвг Ар ри АЙ мех ТнНи Азротгр Ага рес Рпе баг бек АТа Абромеї уаї А5п тер оїй ні нНі5 сту ма! бро 79 75 Бо мес бег гец (5 ве РпЄ ек тевоАта дал чек дго Аїа тер Аїа біу 85 в) 95 «іп ха! Уаї Аза Ага Авзпобіу Су ре Тук Ре Туг Ууді Рго Уа! Агу 100 . 105 й 110 депоА1Їйа гує ТВ осі б1у мес А1а ІТе сту Уа! сіу маї 5ег Тбг А5Оп 115 120 125 ті без Ту Рго туго тигр о АТа фе біу бух РгГО веу уд! ої Авй 130 135 140. деп бі Тіе Або Рго тве У8! Туг гТе Ахроїйк азробіу біпсАза тує 155 150 155 160

Бен Туг Тгросіу АбповВго біу ве тТукотук Уа! Гуз Бенц Ап Є! Ар

165 а 175 мех бен чек туг бег о с1у бег І1е Ал гу ма) ек цец трг Того Аїа 1850 185 1. І

Сіу Рбе б1у бег ДГ Рго дей А5п АТа ов АГРО Рго тай таб бпе Ти 195 290 | 205 І сім сіу Рго тгрогео туго суз Агя с1у Аєп ен Туг тує меб же Туг 2410 215 | 220 І

АТЗ діа А5п о Сух Су5 5ег сію Абзр т12 Або Тут бег тйг обі ко Бек 225 | 230 235 240 діа тйг сту ко тео отвготУгб Ага сїу Уаї маії меж дб су АТа ТУ 245 250 255

Ага 5ег Ре ТНг Ап Ні Рго аїу ї18 т11е А5рорРНе б1у АБ Ай 5ег 260 255 279 тук ре вйе тує ні дапоо1у АТа ем др б1у б1у бег о1у тує тг 275 | 2850 | 285

Ага 5ег ма! А1а Уа! ЄїШ бек вне бу5 Тук БІу 5ег А5робіу Кец т1е 250 295 300 рРго ої ї16 вуз Меб Те оте ой біу Рго А1іа біп Кен Су5 беб те) 305 310 | 315 320

АБп о Рко Тук ма! ру біп Є АТа сій так Ії11е Аїа тер о 5ек б с1у 325 330 335 тіе бі таб ост Маї Сух зег обі) біу біу йей А5п о Уа1 Аа Рпе ї1е 340 | 345 350

АБр АБп біу Ар туго х16 муз уаї ЦШу5 оту маї А5р Ре сіу бег таг 355 360 365 віУу Аїа гу5 ТВгоене б5ег АТа Аго Уа! Аїа 5ег Ай бегобег сіу сіу 37о 375 Бе) іїу5 ХТа Ти грец Аг беб б1у бек губ Твгосіу Ку вен о маї с1у Тс

ЗВ5 390. 395 а сСуз те омаї тве о тее тег обТу ап Теробів ТНК Туг бух тигома! Ар 405 410 415

Су Рго ма! бек 1у АТа тТАгосту твгоб5ес Азрогец вве Ріє Уві Ре кол 45 430 тн обіу бек обі бег біу бек оГец БА Ай Ре Ап То тТкрозій РНе 435 440 Ах зег «210» 56 «21і1» ЗЕ «кое1йх БІЛОК «?13» Вепісі!Тішев билісвіо5ця «4005 56

Мек ес Агу 5ег те їн Рго туг Аї1а Баг маї Ре Ата гей сен Оу ї і : сеіу Аїа Пе дія біз реа Рйе во не Бей Ап бек Ар спе рго Ар

Рго 5ег сви Іа 610 те бег Бег су тук туг А1х гпе сту так тиг ; 5 сіу дей сіу ма! дзп да сів Узі Аа бег вас во Аза РНе доп о Тве то тпробец ей бег біу ТИг Ар оАїВЗ бе) РКО біу Бро Ре Рго бас 65 | 78 75 | во

ТкроУуаї Аа бер й РгОо ой ІТе тео Ата Рго АЗрВ Уаї Ген ма! ГУ діа Ар сіу Тиг Туг уді Меб Тук Ре б5ег діа бег Аїа А1а бег Абр 100 105 116 чек біу гу5 Ні Сух Маії бТу діа АТа Тйг о Аза тТиг обег о рко і с1у 115 120. 125

Рго тТук лвг о РГОо маї А5р о зег діа Ууді АТа Су РГО Сей АвБросіп Ту 130 ше 140 біу Ата т16 дяр АТа Ап о б1іу пе їТе Авр.ТВг одер сіу те Хату 145 | 150 155 160

Уві Маї Тук їує 112 дер су Ах его бер. Ар сіу Азрос1у тек Оотне 165 170 175

Мія Рго ТК Рго Хі Меє Мен біп біп Меї січ дій дер біу Тк отег 180 185 190 вго тб Ру 5ег Рго тів сій во ї16 Ар Аго бек Авроїец Ар обу 195 200 205 вРгОо еп ті бтш АТа рго бег їгу їеу рен баг оазй бі їі тук о туг 210 215 220

Сез бег Ре Заг бек Абп о Туг тук АБпоТЬгодяп о Тугб Туг А5ротве бе иа 230 735 2405 туг АТа тує Аїа 5ег Бек їі Те о біу рко Тер тиг куб б1а 5ег Аа 245 250 2835. рго тує дія го цей гей уді тк о сіу Те біб таб бек АБ А5робіу 259 765 270

Аїа сей бег Аід РгОо біу бі діа АБр Ре 5ег уді А5робїу тпг ог ув 275 280 285

Мет сер ре нів Аа А5о ге Ап осіу с1й А5р Ті бек сту 01уУ АКОо 290 295 300

АТа сей Ре АТа АТа 5ег їІТе тйг обі Аїа бек А5р уві уві т г вв 305 310 311 3120 віп

Claims (6)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб одночасного оцукрювання і ферментації (З5Е), що включає культивування повного середовища для ферментації, причому зазначене повне середовище для ферментації містить щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше одну перетворювальну В-ксилозидазу, протягом періоду і за умов, що придатні для одержання продукту ферментації, який є спиртом, де перетворювальна р-ксилозидаза є ферментом сімейства ЗН43, і повне середовище для ферментації містить більшу кількість перетворювальних рВ-ксилозидаз, ніж кількість зберігаючих В-ксилозидаз, в розрахунку на моль.

2. Спосіб за п. 1, де повне середовище для ферментації містить таку ефективну кількість перетворювальної В-ксилозидази, щоб повне середовище для ферментації давало менше алкіл-ВД-ксилопіранозиду ("АХР") з коротким ланцюгом у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації без перетворювальної В-ксилозидази, повне середовище для ферментації необов'язково давало: - щонайменше на 40, щонайменше на 50, щонайменше на 60, щонайменше на 70 956 менше АХР у порівнянні з контрольним середовищем для ферментації без перетворювальної р- ксилозидази.

3. Спосіб за п. 2, де АХР являє собою метил-рВ-ксилопіранозид ("МХР"), етил-В-ксилопіранозид (СЕХР"), пропіл-ВД-ксилопіранозид ("РХР") або бутил-ВД-ксилопіранозид ("ВХР").

4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де: ї повне середовище для ферментації містить ефективну кількість перетворювальної |В- ксилозидази для збільшення виходу продукту ферментації, у порівнянні з виходом продукту ферментації при культивуванні контрольного середовища для ферментації без перетворювальної В-ксилозидази, де вихід продукту ферментації збільшується щонайменше на 1, щонайменше на 2, щонайменше на 5, щонайменше на 7,5 або щонайменше на 10 905; і/або ії) спиртом є метанол, етанол, пропанол, пропан-1,3-діол або бутанол.

5. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де перетворювальна р-ксилозидаза є поліпептидом Ем430, РІ4ЗА, Ем43ЗЕ, Ем43В, АТЗА, Бо43А, С743А або ХупВ3.

6. Спосіб за п. 5, де: ї) поліпептид Ем43О0 має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗХЕО ІЮО МО: 2 або залишкам 21-350 5ЕО ІО МО: 2; або і) поліпептид РІ4ЗА має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає 5ХЕО ІЮ МО: 8 або залишкам 21-45 5ЕО ІО МО: 8; або ії) поліпептид Ем43Е має щонайменше 9095 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 10 або залишкам 19-530 5ЕО ІЮО МО: 10; або ім) поліпептид Ем43В має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 12 або залишкам 17-574 5ЕО ІЮО МО: 12; або м) поліпептид АТЗА має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 14 або залишкам 15-558 5ЕО ІЮО МО: 14; або мі) поліпептид Бо43А має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 24 або залишкам 21-348 5ЕО ІЮО МО: 24; або мії) поліпептид (3243А має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 22 або залишкам 19-340 5ЕО ІО МО: 22; або мії) поліпептид ХупВ3 має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 25.

7. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де перетворювальна р-ксилозидаза присутня у повному середовищі для ферментації в концентрації: ї) від 0,3 до 10 мг на грам ксилану у ксиланвмісній біомасі; або ії) від 0,4 до 10 мг на грам ксилану у ксиланвмісній біомасі; або ії) від 0,3 до З мг на грам ксилану у ксиланвмісній біомасі.

8. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, який здійснюють у вигляді безперервного, періодичного процесу або процесу 55Е з підживленням.

9. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, що додатково включає етап утворення повного середовища для ферментації.

10. Спосіб за п. 9, де етап утворення повного середовища для ферментації включає комбінування (а) ферментуючого мікроорганізму, (Б) ксиланвмісної біомаси, (с) целюлази, (а) геміцелюлази, (е) перетворювальної В-ксилозидази і (ЇЇ середовища без одного або більше компонентів (а)-(е).

11. Спосіб за п. 10, де целюлаза присутня у формі препарату загальної целюлази, де препарат загальної целюлази необов'язково включає геміцелюлазу.

12. Спосіб за п. 11, де препарат загальної целюлази є культуральною рідиною, що отримана в результаті культивування міцеліального гриба, де міцеліальний гриб необов'язково є 7. геевеї,

13. Спосіб за п. 12, де міцеліальний гриб є 7. геезеї і сконструйований таким чином, щоб нативний ген р-ксилозидази був видалений або інактивований.

14. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де: ї) ферментуючим мікроорганізмом є гриб, де грибом необов'язково є дріжджі басспаготусез сегемізіає; або ії) ферментуючим мікроорганізмом є бактерія, де бактерією необов'язково є 2утотопав торів.

15. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де ксиланвмісна біомаса є кукурудзяною соломою, багасою, сорго, арундо очеретяним, пенісетумом червоним, міскантусом, криптомерією японською, соломою пшениці, просом прутоподібним, масою з листяної деревини або масою з хвойної деревини, де: ї) ксиланвмісна біомаса знаходиться у вигляді суспензії; і/або Зо ї) ксиланвмісну біомасу попередньо обробили.

16. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, що додатково включає етап відновлення продукту ферментації.

17. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де: ї відношення перетворювальних В-ксилозидаз до зберігаючих В-ксилозидаз у повному середовищі для ферментації складає щонайменше 2:1, у розрахунку на моль; або і) фермент(и) зі зберігаючою В-ксилозидазною активністю відсутній або не виявляється в повному середовищі для ферментації; або ії) немає детектованої зберігаючої р-ксилозидазної активності в повному середовищі для ферментації.

18. Клітина 7. геезе/, в якій нативний ген Д-ксилозидази був видалений або яка не має визначувану р-ксилозидазну активність, де клітину 7. геезеі конструюють для рекомбінантної експресії ферменту В-ксилозидази сімейства снаЗ.

19. Клітина 7. геезеї за п. 18, яку конструюють для рекомбінантної експресії поліпептиду Ем430, РАЗА, ЕмаЗЕ, Ем4З3В, АМКЗА, Ро43ЗА, (7243А або ХупВ3.

20. Клітина 7. уеезеї за будь-яким з пп. 18-19, де: ї) поліпептид Ем43О0 має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗХЕО ІЮО МО: 2 або залишкам 21-350 5ЕО ІО МО: 2; і) поліпептид РІ43ЗА має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною БО послідовністю, що відповідає 5ХЕО ІЮ МО: 8 або залишкам 21-445 5ЕО ІО МО: 8; ії) поліпептид Ем43Е має щонайменше 9095 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 10 або залишкам 19-530 5ЕО ІЮО МО: 10; ім) поліпептид Ем43В має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗХЕО ІЮ МО: 12 або залишкам 17-574 5ЕО ІЮО МО: 12; м) поліпептид АТЗА має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 14 або залишкам 15-558 5ЕО ІЮО МО: 14; мі) поліпептид Бо43А має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 24 або залишкам 21-348 5ЕО ІЮО МО: 24; мії) поліпептид (3243А має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною 60 послідовністю, що відповідає 5ХЕО ІЮ МО: 22 або 19-340 залишкам 5ЕО ІЮ МО: 22;

мії) поліпептид ХупВ3 має щонайменше 90 95 ідентичність послідовності з амінокислотною послідовністю, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 25.

21. Композиція, що включає щонайменше один ферментуючий мікроорганізм, щонайменше одну ксиланвмісну біомасу, щонайменше одну целюлазу, щонайменше одну геміцелюлазу і щонайменше одну перетворювальну В-ксилозидазу, де перетворювальна р-ксилозидаза є ферментом сімейства СОН43, і перетворювальна В-ксилозидаза містить більшу кількість перетворювальних рВ-ксилозидаз, ніж кількість зберігаючих В-ксилозидаз, в розрахунку на моль.

22. Композиція за п. 21, де її перетворювальна р-ксилозидаза є перетворювальною В-ксилозидазою, як описано в будь- якому з пп. 5 або 6; і/або ії) ксиланвмісна біомаса є, наприклад, кукурудзяною соломою, багасою, сорго, арундо очеретяним, пенісетумом червоним, міскантусом, криптомерією японською, соломою пшениці, просом прутоподібним, масою з листяної деревини або масою з хвойної деревини; і/або ії) ферментуючим мікроорганізмом є гриб або бактерія, де грибом необов'язково є дріжджі Засспаготусез сегемівіає, або бактерією необов'язково є 7утотопав торбіїв; і/або ім) целюлаза присутня у формі препарату загальної целюлази, де препарат целюлази необов'язково містить геміцелюлазу.

23. Композиція за будь-яким з пп. 21-22, де композиція по суті не містить зберігаючої Вр- ксилозидази або не має визначуваної зберігаючої В-ксилозидазної активності.

24. Спосіб одержання продукту ферментації, що включає культивування композиції за будь- яким з пп. 21-23 протягом періоду часу, достатнього для утворення продукту, де продуктом ферментації є спирт, де спиртом є метанол, етанол, пропанол, пропан-1,3-діол або бутанол.

: ВНХТА, сигнал показника заломлення СЕТ Х-Я7Н--29509 3909-1329 14-29-2ВН ОТ ІВ й І шо і 4 В во, без спирта іі | Ще Н 3 к ч Н | 8 т ; і: ! Ї В і х ОН : ШЕ ух ! ше М не іх ин я і Зедуттилтт р пад нн туя ЗЖрДенннння у тю ріст оеднеттроетятоннттрптннтнн інн т тт ння !

ПОВ. ПДВ ННов ЗАК НН ЗНИК нн: ДІННН нн ГО вШотА синал показника заломлення (НЕК ятН о во во То е : г а я 5 А В. шо. Й і і" Ше жі 0,72 М 'ЕОН І в Р | ! Ж ці ві І Е ШЕ | 5 я ові ЦО, х ШЕ: лу о ше ще и і й ї Ї ри іди 4 гляну Е гасі днетекя ле ай т тні Я ла Е ди -е Шк КУ и и ІН я Ї І Анну яння т т Ї У т

НОМ. ДОД ОО НОСОК НН: ТИН Кия, ЛО н нс: ЛИННИК нн нн ЛИН КУ ГО Ювід, сна сокюнння зломлення (РКК на о ше ще оті я а я що НЕ в іє «БВ ОМ МеОН о, ше По Е ! Є ! і Що ча ше щ Ше я : шк ! неї | | | : і й ' ) Й | вч й ер -- щ-яд он чу скейті і ут й вен: 3 р Й ' ! тр нене нн не ни нн оон и о нин по нн нн ни и ши пн нн нн пн нн он нина ння нн Я Пон ИН вен я п не сен В пи ик А и пі под пннпдачнкин о Континент сон В ! КОТА нгнаа показника звлфилення (НРХЖТНЯ: 19 ЗНЯЯ Пт ННЯ ОЇ | 7 Її жо в: з з й 0,72 М п-РОН : ! у - ага : Х ові п ни з з сї -43 : в Би ! ще і | с х щ- у ни Із в ни ши шин ГЕ ЩО ниття "й я і р нн о ОК дон он он я |. чен лаанянн ет ут : се ШЕ Кн вв Б ШОЕ Мо, і 9 5 ю 5 5 2 хв.

Фіг. 1

І ПемМмеоні окЮН 25 оон нн в ве | вк В КЗ о й оокей са т г.

ІЗ . а Й ! , сот В їх | шо ел ї й а й. М я шт т 4 - - у вки «7 й во. шИш б вн а во во о Часігодлі

Фіг. 2 сеї Просже . ЖАкж, кл ХНУ са Зо злена М 00 зем - пеепсннх МО сжоажжю 0 жа набли Ех ДИ еко мк хьйносовувню Грн нн ЗИМИ лк, ки т " й ве цк І м їжжоскій вв ср кре зжиж м бо - 5 не Не Й з щ : Ж ою ДТЧИЕ жк зу Н як з який п з ох 21 Й сяк м в ти і в. тя яглтяВЕ пики і. «ий ї ї ле ож я пе | Е , вік ож 5 і ; рю н С аж І. ї ща Зм г І сЇ є оовх я і ' Ї й І гликозиди вит. | І ! гликозиди І В В і НИ ! й В КІ Е ї ла | ТД ! гликозиди: ії ЩЕ Е ! ; Ї МНК КЕ І | Е ев: п Ще т Де Ін 5 4 40 3,5 30 24 20 їз то ррт олеЇ од (655 226 2190 З 553 294 бле ол8 1930 026

Фіг. 3

50 ши шо 1 | С Глюкоза

- п. З 4, В : Кс ДЕННЕ ! ВКсилоза - КА НЕНИ в ПЕН ЕН ов т З дек Е 7 ррявон ФБОративхйи! о НН ; ' г ВИН Мо ит ! с ИИТЕН і зі1жЕХе У р кійайьскай вашей ве мо. Ше 55 ННЕННЕ 51 ся ПЕН Те ЕН, | ще НЕЕНН жк ТО вав шк о ! ВЕНИ лей сн ИЙ, ! ЗБЕ іх застосуванням лріжажів; 7555 міг ЗБЕ їз застосуванням дикого тніту Хуйкиповая,. АІ5О0НМЕ; 25 твердої речовини стрижнів ТУЯ г/т ЛІЗОСНМЕ, 1256 твердої вечовиня хичанів- хукурудзи змішаної маси листяної деревини

Фіг. 4 Б вчТининишиншшшяяшшннни Я та Я 54. К ру З суд 7 7 з Я

35 . везе 334 ! ! какЕктнеяе : МИ: Я еакавкани екон а ка я ЕНН НО Ба Не за ЕНН Б ; ТЕКИ у ЕН й і : т Зк 4 ек и ОКУНЬ еуеючучаюя. ОБ щокоза г М Вари ий БЕН В і ро й Н ПЕ 4 їЕ ваших З, Я Е НЕ ЕЕ или ПЕКИ 000 ї ва Пе и пер или 1 пиши Я І Пи ЕН и и вання ще В НН Диня | Ще р то хакі нінкик и Я ЕЕ й Е Но щ Енн НКИ ие | лашЕКР щи во вий ин | ропчння : ж ЖЖ КінК о. жк а: : пе Ам БЕ ИИИ до. Енн їй ния ПИПОНмииии | | Пи ще неви М | пе 2555 мог АІЗО0ВАМЕ окремо: ; амер. тесчеї Вхі ; ІЗ : Без Т. тезі ВХ І ЗТ, тесвеї ВХ : ї ОК м застосуванням лріжджів, : ТУМ тверлої речовини стрижнів качанів Ї кукуруда

Фіг. 5

: 25,6 26 щі 241 поши пи БІ п до Я | ! ві 15 Ії я і ІЙ В | ше | Шо 0 В | Е | ше й ен М оетенісня, пог чеесеронсвавення нан ж пня зни : ; З мг/г 229 Жімр о: ім |і ябмгіт 0 Ом окремо Т.теезерохі 0 Тотеехеі ВХ! | Туотесхеі ВЖИ | Т. тесясі ВХ ЗЕ їз застосуванням рекомбінантного ЄУпотовах, 2595 твердої речовими стрижнів качанів кукурулан

Фіг.

6 Др тн ! Що: є 343 що 85 31,5 о, в'я 36 щ Е у: й МІК: Я як. 23.9 217 | : гі 25 І 95 зви ех Бий | 13 ЕС | | ІЗ. 0 ! і

В 9. й о щ 8 | щ т зу | ї І ! І 3 міс | жзамк о авт | я ме | ее ме ; тус 3мей ЗМ рук меж і змо 3 вк АВМ вИзА | СВУЛА АТ Я ВУЗА ЕЖЖІА | онремо ТУЗА БУЖА ГБвезеї окреме | ксиланаза | ак Й Авц Е Г Я : скремо ! : Нелюлаза жк коилинаа т тес Нелюлата Т. ве конланоза іктесревані ненлазаконланяза о теевеї 1 Дслінех Е 55Е із застосуванням рекомбінантного Лутотопав, : 2535 твердої речовини стрижнів качанів кУКУрВУДЗИ Е

Фіг. 7

Би т Ка р оду М пан над АлААД КАК КАК АНІ лем оееіеуюся че й 4 450; !

дп. Її ні В Зо ! Ж Я (СГ поко і

Ва. 5 5 жна сю. що Ж Ж оавюн о ЕЕ 1 г Два ве ше А Ж : шо ТА 523 зо А. МІЯ д 0 а й я ДЕ: д в я кінов ИЙ ОДН аж ніаіі Ж сенккюнч Пенн в. Ор БаКЕУЄТЯна ЯМ 19 мійбхуйЗ (вчинений) ро ме ки ! СВНЯСВЕОЧЕСОНВЕН, | / ! «(неочишення) ! : окремо | Ї ! 55Е із застосуванням рекомбінантого Уутотопав, Е5те твердої речовини стрижнів качанів кукурудзи З

Фіг. 8 2654 й т5. 5 о в. ! те г ЕЕ зни 49: е 10,9 | вам Й щи нан 96 8 п - се зн Я о а: Що і | | | ! Й 5 Ї ! : | | ! ше ОмогО29 | З мт 1 З жиг сум о Змог оку моє окремо Т.тесвеівхИ| ОЕМЯ4ЗВ 3 РЕЯЗА 0 БМАЕ 0 АББА 3 : ЯВЕ із застосуванням рекомбінантного Яугпотовав, І 750 твердої речовини стрижнів качанів кукурудяи

Фіг. 9 мв- -- - ті ви 3 138 це Еог-

шо. 8 1 Е щ ! ; ! ! ї з и

4. ; | 30 ! 3 зи | 34 359 мг/г зібмгї зм беУА; і мог збу мов | ока му Рон ме 12363 мог АМНКНМЕ ЕЗА, ОО БУАЯЛ СК еЗАНЕУНА ГЕУЗАЖЕКА ЗО БУР АЖЕкЯЗОІ УЗА А. окремо | ! | І БО ! ЗЕ із застосуванням рекомбінантного буття, 2595 твердої речовини стрижнів казанів кукуруджи !

Фіг. 10 1в- я 7 5 бо ща 7 ше ' сш ! | задавав і В в де. ! не 37 шко о ж Ї З й ' 27 І Е "7 | : зо : | вишня Е і | Е г . Н | ! З УКУмЕ абмг кім БУДА мек ЕІ ківі | жавний ад неті АІЗЮ МЕ УА ї ЕеЛА РУХ А) РУХАМ вує АЗ ЕЕ І КУЗАНЕУВ КАК окрема С і ! ! ен. 1 ЗБЕ іззастовуванням пріжджів, 1525 твердої речовини стрижнів качан кукурудзи

Фіг. 11 що лопне ікс дату от ківі нен че слі іще інв чо ків ок овтеті стен ні РЕВЕ ові ніч Ва тт іріняннв то чені фе усе ннанойо ні неніу мовні Р Фіто петунію то кнйот дек ць Лето льні пор. й вої т3и | І ї Б. - 8,5 -- й я ї ЖЕ 50 «38 56,9 ! - вла Н опктежяхют люте а 5 : ще 45 о НаєЕХР

Б. ше 315 | | с ішЕЮН Я що щу 20 ше А і я ще що ще ще ще о й хг - Б у ши; й 2549 мг/г І мет 259 м/с зі ме | З5мг/б229 0 і мрг А1500МЕ ЕХО А15О0 рка30 окремо | Бх30. окремо | -ї ксндацаза | ! А, підег ! окремо ! ДЦелюлазазксиланаза | Цетолаза Т. гесвсік Інтегровані

Т.хесвсї ! ксиланаза А.пірег целюлаза/ ксиланаза

! Т. есеї 55Е із застосуванням рекомбінантного лЛутотолав, 256 твердої речовини стрижнів качанів кукурудзи

Фіг. 12 70 8 ба 543 па кю. де ; я 40,9 і Глюкоза іч Ї: з К 5 А ! Ж ' БКсилоза ж 30 Ж я У іівЕКкен ше Х /л й ке то й хм ім ; п ! ве 72 Ж щ ме м Ме ХА с 91 зкеемсйзиі й 6 сення» КИ Е й шелак А і 77525 9 мг/г я мог Бу430 щ1 мг/г ЕУ430) ! свНСВНаНЕСо ВВ (очищений) (неочищений) Жхупі окремо ! БЕ Із застосуванням рекомбінантного бутоютопах, ! 1595 твердої речовини стрижнів качанів кукурудзи

Фіг. 13 во й нн у и и І ! і ГУ В тах в во |. З Во 1 св ! ОІяХе що да: В, І я вон в З Ї ма шо: і пи, 2 Ж щ в. | ; йо 5 се ШІ Е гу я и ше з -. С Са са У. 1 збу мг | ЖІ мг БРУНО ку мг/кг БУЯЗІУ | Но міт Ем430 | жо мг/г РУЯ3О 22947. гесвеї ВхЙ окремо і ! ЗБЕ із застосуванням рекомбінантного 7уготопаз, 2595 тверлої речовини стрижнів качанів кукурудзи

Фіг. 14А т ї Я 55 6то ! В гі щ в оЇдрудт

Ж в. шк | Ех,

ВО. 264 ! ш | К ія й | ! 10: | 5б ва жав щ й ук. в Кий, з -М с У С. ш 1 Збьмує229| Збкзмет | Збжзез мог | ЗбкЗкЗмиг 30 зок мот . 229. тсевеі | 229. тесяві | 22ЯТ.теєхві 29947. тесвсі ї ! ьхії і ВХ ку ХП ЕЕоЗА ! ХА ЯЗА ББЕ в застосуванням рекомбінантного гутотопав, І 2562 твердої речовини стрижнів качанів кукурудзі Й

Фіг. 146 зр Жуль ХЕ рода тя НОЯ БЕХВ х Ех. а КУЄІЇ) мендіва ОО в ЯКЕ ксндеїа ЗОВ 5 я3р; кснлвоа а щ АЗАЕХЕ Е ВЗАЕХЕ йо акула канди Е А ЗА ким 8 Ір ж ЗАсилеза рнннит І У Е Дсланнй . . в хо ще г Вес МЕ кеказза Ки - ши А ЕЖТА ксилозх в ТОЮ. одини ко) дн мукиюм і уж г; Н фр І: нка щ 8 ря пн ЕК ксикоза я й ги шо щих МЕЖ»

5. | й онов МЕЖХЕ (Я в дживіня МТ сов ва п затетідкя МеВ В зі ЖИ сороки й Де : спон ВО ЕХ в дентин нти тн чн рт нень во ВХ ої докт У ї Ж. 3. У Б ооо ом її ОМ Оз часно Чис би

Фіг. 15 я ЕХР/УКу мультіфеку колові в ЕХрукантлоза мультіфект зпігомери ксилозії п. уч . ж жк їз ще Й . х « ЕХРІЖУВ ВКА ксилобаза я а ВХРКСипИза КЕУЯЗО олігамери ксилозіх й ж. а ЕХР/КУ ЕКЗА ксипобіоза Ж А ЕХ ксилоза ЕУЗА слітомери косу в т й ке Е вк Я о 5 я вч, к і й ш ж Б ша і Ше хв че ОО Й в хоча й йо я - й «ж т А па а ш ах - Е Бей - ох В аз вк й я Я ви я г м а 4 піз я І ше ж 8 в ся іх в ин М Е М чї Ша діва що во, ве «а ге йо р З дер свв о ж Е древа о (НВ з 2 ко ра Є . се ба т вв А пн вин пив л ни зник их пн зи сн у ртуть, й ге а о во емо Я 086 гу го яке Із ЗД 1«» ЗЕ ВХ ЗНАТІ Час пу Зисатоді

Фіг. 16 хв / / і вхо саке сш, те ПО кін ! б- ; - ; Мн а "вх вв я З й 5Рбпромоюр щу Б с с. -ї Кх ж : ЗРО праймер У сс чу З МІ1З зворотний праймер її: ХУ З Шен МВА На Ван ру Часзн'язуювий репресовано Я Х ет СДСКеВІШПЕ П-ТОРО, ВХИ. делеція, Причохв: Час промотор ; ше ХР 5 ! доза по, Уа ДНЯ тТочкайочатку 0/4 7 і АСК ляти З З : й рейки рЦС р я ге М | й ен Я Г7 промотор «и во вк : се ай че. К ех . Шк Е «М м . Віз промотор і і що вк о» й х фах зи я р тк ж 7 / Ї, х Каши ; І і І М 79: Кап 'врометор і І - цк вий дико КЕ; 7 праймер ойінма АТОМ з рих они я РУ 4234 із У МІЗЕО прямий праймер МІЗС20) прямий праймер

Фіг. 17 «МИХ ни юки му Ми М АК УМ им ЕМ Увии и и УТиОХ ВН Ви и пиву и оо и ким оо ВИМ ТНТИНВИи и и ин Вин в у ВО ОО ро мо поріенератро соня ен и и МИ КК Кн не Мои КО и и и я с ММЗ зворотний сус кн вени Он м кн і в ПИИМИЧ рик пів Я С омя я и нини НКИ пп тИИини: ДЕШНКЯЦНИ ВО ООН о и А КК ни и Килина ати авта но нн в и и и ин МИТИ ТИИ ни а ОО Ж ня Ав КН Ки КК ро у хо и о У шини С я ок о ЕЕ ин А шт о КН НВ и он о в В и ВО МОМ нн Я СОВЕ вон ЗДО ВМ моя Бер Мн КК Ки 45 с оно ям пай она ще лег резнетентность деко о 0 Зк Ух ее вх , (врямни праї меруе ВИШІ Кі СЕ кн Ки Ки ОК вк кн ви в ша В и у В и в и СКК нія о КА В А и п Ні в М я МІН и о й ЯКЕ м ОВК и ники о) й СЕК ЗБУМюЄ Ве. в а с не ие м дао ; в он М и ОП КК НИ НК Мосс Й М и в и р ИН МНК оо В га пен в Ох Пуми КК Мих ме о хх и ва в и они ОК ПИ У НЕО СТОХ пк о о я ПИЛОМ о о КМ он ооо в Кн МЕН Он ик Кияк и ПФК ЕМ НИМИ ен В в ВВ Во ан МНН о Ки ПХТ Ки Мо в Он АХ луіх внести они и ми у ВАМИ ни и КМИН ВОК у М КК Пе в о ВВЕ КИНЕ ЕКОН В ПЕ о в ни проток КВНА МІДНИХ еВ МО о В п се ВО В ІЕМ КМТ Ми и в. о ЕЕ и Он ик и А Ки СИМ лл ки Ки КК НИ я ет са и нин оо и А ні о Кен КК в А Км ен в зм Во Вон Я сен Имя яки фу о А в нн ЕМКОН КЗ а ВОовО и пваймел ки ШОВ ЕК ек пох КВТ Пворогний праймері С ШО ен в о о Ма НВО В МК и я о в у пюТаленнй ен ве КК ЕК в о МО и НК р В В Км ве а нн ВШ в в нн і В ПИИННДиоКриии ЕК Ко ОК и ПК о о МНН р В В Кн МИКОЛИ вн в в Ен р ПраЙМУЮЧИЙ ПрОМЕТОЮ сан с оо еко и Ні М НИ А и о ее о КЕ вн АК шт в МСА прямий Осо о -

Фіг. 15

КОТОВ МО Нуклеотидна послідовність для КУ430), фермент родини ОНЯ3О з Ризхагіши тегйсНПоійех асдсачессвачесестакстссвосаксствоссасссскдассодсавстасастасуовачасас таасдасассссссстстдаєсассовсостстодтсьусадаєссстісаядсесасаєтсстечавовса австстпуосистасссарсісасцчасассцазассяасуксссвасчосассдовдезстсавчтас чЧосасчачачаєсассасасстасєссвіаавозссатстакоадаваядчассосУгсассцассасоє саксостссзссаасссдасчасусоссасєсодссавоасвусваат ссучдасюуссівасстоаосстаса зоазсчуцсаааваєсаєсьстастєссссуссвасдатааачаєчазаєстссачааєсасаь ех чісссспасаадчоссвосцесссгессвааоцсоуасвачасстучассссвавоасасстасачватова тостчосачсокасассодсаствасцдчсчаавосавєассєсавстадчасчагатсгоадосдоссане кЕсачасстудсадсассасаасасетстаасовассоасадссовоасавасазачосасссссзасоас ассаваасосеостатовсстсадассоассаваессавоасавоауасаєсчсасазчатсаєссуачасавссосч счаєсусуєсабсстодсссссдадасвасчсаацчосестбсавцсачауцдасаасаацечасчавься гсзчаздавацзссссозасссасавдссцедасавоссчгсастасосссасчасасісстаседозасасосас хЕссСстсЧаЕссасосчастоссаачаасакстасочсесстаєасстаєссадоочсаасастевосчассс тоскдасчоовкодчастасусагсоадааосассагсвазсасзазцчасачсосьча Евер асао зЕдсосагасткскадавадчаассаєсстовуасадаєєвадусовадаваак студ есдасваднах часлачастстсссттастсоагсостаачастсад

Фіг. 19А ЗО МО: Послідовність білка КУ43Ю тах Е1і58ва11181єдпсаачаєпаіїро1ісазінвайрвавуєвокікУуурзвдаівапутупоасодацу аткауйсувЮКвіудКкаруїаната1вУучаурнакицинаразаУукпЧкутуїутракакцавієгіцдта узвпкраворІкайкачнірасувідйравучУуйсвцезу1їнодінчоЧьсаччапксЯпевмічакзартд Епаізраіаківкатикісеєрга1уії1ареєокрідзейлкухЕгедрчувккЧкіууїтувсоасв Х1ітуаєзкпіусруєсучакі1йрчтіднессвповічеукасинівадавсвокауїісаЧукаккімнуака чкіт1скркі

Фіг. 198

ЗО ІВ МОЗ Нуклеотидна послідовність ВХ, В-ксилозидяза родини СНІ з Т7/іспойстта геехеї зкоЧчецевса дедсадсесє фстсдссосе седесодсбс тесбдсссяє ддсссводеф во садаєсвяке авасатасяс свастасвсь дстсадоадес вудссбдабеї стасссечад ї20 асассєасся сустсвовеє сесувесссс дасеусдаас абадоссссо сзадваснах ї82 сксчтсісчья асссабсаде сучесакаа чачдсдадссо вадессесах срсдскесес 249 асссьсоавоч авасксавсесЕ савсясчсава вастісоууєс ссдасоЯсе ЄсаессаЧаЕ зо ссжтесуаасє ассвавоаєсьо зваасдасуєь стасасоадеє содассцсоє савстітсаос зва асезвоцуаєеч чдесацсєсяа козчедасо Бсужбссаса Еасесаєссть сасвасоадеу 429 ЧиссвЕсадсс дцеасарЕцаї ссзссачаєб чдссдасаєса бсбсдвссся засісувцсв БИ косадесааса зсячесувка содесьсоає чЕсьакусяєс савасурсяа Бадсскссда зай яцдессссвесї учпачесявая сесвзчачасу сесдчцсаавч васдсевевЕк сессауєвеє вай ЧЧестаєвевЕ зсдадснсає сасдацевкс саздусуєея гсдассскча девестсаву 60 спекЕдесосса содкцавуса сЕжкоуєсуда. Касцаєссктєсц адзассддаа савссацвсо то счьстссяцеЕ бсдасдссах сабзаистспу сачавессксь сесдавкаєсса састесссад тво Екссевбедсва садессава бдусазвацеєсв спсачегбцда субсосасвака саасвсесуве ло авсучечеце ссадсесуїує савзсвуєсьєсС есебдсада сусЕжеЕваса свозусьаа зай ччсеЕсссеч вабуцацася субесвсеуубсс чагсдсдаву седбесасаа саке жксаве 360 сстсабуасе зсассацуева ссадксуєса десуссосса зстсасвзсд вдсспдсасе 16260 даваєсавсю дсодесвовс ббассеубуд сасевсаасоя адесовквує дуссадсдав 16890 чзесбсесуса усуадаєсца дсудсссуве асесуєсвцє асуссввссь садесеавево 1460 чазкасесся асладаацва севубассдс кечебсоаЕ дадавадчавує субовадась 1200 чаєуссвода всабсєсуєа сзадаскЧсє дБкдвоудуса ксубсстуєє савдавсуає 4260 аасаскскся сесеціьссва чазосецеяє вдсаєсуєсе сЧакєсцучаєсс асуддаєсавЕ 1320 чесвсавсос вазкдсавод савстастає чусестіасос сабасошесає садсссьсьа і380 чвачесчеса воааччссуч стассасуєє азсебуЧаас гсодцєзсача увбсассчує ї440 аасадсасса сеодсеЕває саадчесВвє дсвуєсцеса вазацісадь Бдссассакс 1565 кассксзасз дааБЕдасва сассавєвува сзудьоваса седнссусає адвсаввцесю 5БО Едасссцава аксацсбаца Естсабсава сацсксачевй зачссудсва ассостєцес 1620 чЕссєдсзла ЄдсдасодЕуЧ ссаддсвдас Есаксевсзс гсзадвуєви савузаяаьс ї680 вастсссвся сссдзачдсуЯ абаєсссоде сачесодозо дечесебдсссє сєксудасаєє 1740 сЕессссоуса засобасбес бдссачеоса стад сасса сесацбассс чдаседвоавайє 1800 ФсЕсасснак Бесссссвова баасвкдавс стіссдассся акдаввавьс заасессбода 1860 сачасєєаса ЕЄсводбасас судсвавссс зєсєвсовуєЄ ссоасачбоя Єсесежсває 1520 ассассттсь адуадасіст суссадссвє сссаадаоєсс ссаадеєсав сассесався 1980 акссвсесья сессвсвссе судавасасе Басаасоазсе ачаєвсессяе сбссаєсьсе 2940 чЧауцесазса Ссававасьс здоссаванся чадвсессає збасадесяк чес 08 кдсасзвасв асзсіцддесес восесссцбає сецаасначу чадсссуєся абссцассов 2160 секуссдаса Есавуєстоя Есасжстксс аачексауєвз бессеєсавссс бассвоцєуєсе 2225 стЕсчасссуся ЕЕЧасссвса содаваєссая ассоцевкасс сезусвачьа саздеєачесс 2280 сЕдвасасся асадвчЕстує дааусівчад ЕСЕЗасекоч содувсваачи часаасявеє 2340 чедзасвоадс саскудадца дсавсвоасс азадавосва сассбаасуєс абва га

Фіг. 20А ЗБОЮ МОЯ Послідовність білка хі. Д-ксилозидаза родини СХНЗ з Трісподстта кеехеї шулпазіїавізаіїрсвідоппосуалузацочриуресіаєсі18Ярасеворіковісовзад учекадаїі51ск1веії1пбспвородауркгісірпучуноваїват1ахзатагкосотенасвертюї ТЕкаатахезіваіайіізсцдчахакзпзоасуЧійууарпувцекзрієцкоацЧчесвцедактівнахчку еузкцісчотйревікуааєчкагачуйіспипидекісідаїісадаївеуусругіїавахуакавтя МасауайвупоравсзпІкіоссі1севидтгречдуузвасватуувуєврпйуазпдчезаааввіхаце аіасодсурипіпенічадетвицеївквуУуєсіуапічкідутккасуквіснкдотиказипівуг зачезітіїкпадсїірівкксквізізуркаваєссчвочиуучваруїїівріезаккадуютввіве еівчпвссдтакаїззакквавііуїЧціавсіздвуайсьйізмрапоц1 аз катет юріхч о сдччтавваіквойккУВаІТУтодурічводтав 1 гОіі8дккарацтіУсесзчураеутвчереавіваїи радЕвпрачеєуічускрууатавцієУєтЕкасіаворквікЕпсавіЇзарпрууусувааьоуУєьЕ еапікавакрезрусатібуктвпапрарурокніїхавакіаціхравезкІівірірузнвівкчйзнва пкгічурчкув'атїпсдевуУукістеїтУуЧевухівспиріввоцікЗатсрав

Фіг. 208

5ЕОТО МО:5 Нуклеотидна послідовність для КУЗА, фермент родини СНІ з Еихайит чепісіПоїде» аїсстостоваєссєссачессассуссачедесветассосстєсьсттствоавссачассацссвсачос гоЧстізсассасакасссєЕссврадассцеассаавадасстесадводсааччвасодаатсьспсчасастх сЧчеЕсасстосзусєтававоовусауессоосстстачскостосісьдасцсссдаазачаачасадасває стчоассачассазаасасасосросссссасзаєсвогаєссядчацахєсосазчосссаскттавсосаасав босазссдосасассаавузаєсочасстосзачоагасаастодсіссзасоаачесстесасдасососа стадасссесадуєочссцесесосодасастсоєссссводасусодссасабсавсссссясоавох соусрсатадсссассдссстсозобаєсатстсасссасоасассадсавсувсцссудсассцдавос доЧеЧчсоасссастзасчасодссочсоасоддачеіодассустудасасссяасоаєсвзасесєтксавад аксстсдсводадісстдастссдазастссазодіїзавчаєдесестісагдссадосадтатдсссас тахкатсоцдесадчсоаасстсчаадоасазтавсзосазсуассєассоєтастасоссдсаацесаставас тоцаавасчасттсовадастучачачастссасоасзссасдасстсдассосазваветастостсаоу астсодвсссаузассасассзадссстєссачддачсосасссоаесцчаєдсазадцьсовесссаєсаєва гтасдсссасзаєчесасоавсодсатссссосасцсдсаввсссусасссосаацачасачаєссстсав, ачадсастчаастдозсасасчасавсавоєсавксастачсддассстососсвесеаоччатнь осяє чосадзаєсасаацсасгоссаадассвасустчааоасосссачасаздзосссгчаддавсоосасасає тсосазссоссвоагаєвсодстасспасчасасссссчасссссасвзачеваччесесстчассчачав чегсасучасстокеозкеЗазосчсекссвсоаачччсесоуссавась оди сссстаасоцеусса аачедсааєссчавсссдессадсессосочаєоатсвзасассвззозвадчетсаччавсствусастсада ссічегдеоачасачеоасьдеЕсстсстсазуддаєдасодсастьсасстстдааусєсвадаадвадоаа сад деЕсссавессаєсочасестоадооссадсоасастсссадаст яса сасаасовзасово сссагссссссасачесссастстувагосвоастзачаачексоосстсосасассавсассацесссчцоє ссдасастчсадаасвачстсасстісаедаєвастодассаєсзазецесче:васьасадсовачавцєє тсахссасаєкстстасьскосабаЧчесеевасосстсгассостаосааодвасазавадаєсаєдачавосс тсчЧчассочсссозаЧчачосасстчасостсстксазвачсьссстачсссваасаадосастазс є асссадосіоагозссавоєсдаєчасассостссг сь двасаасаадзазаєствасадтаєсссьа чассаастассескудссаасясаспчсассосачссасаасссдессасрочасцчазвачачьсстао свооссчастасссчссасоасааєсаєсссадсзаатасаседадчсадчассваосаєзастдаса кода сесадассезосавадссдссдосзуоддадвастьтассдстодінсьсаассссадівстьсесовасод сЕг:сасетссастасассалогсссавоссваціїсаадіссазсавоєєчасаєстаасаєссавда васЕссосаачоассчсвоабасесаласасссоуакастьосусастеасоссссатсосавоассвога о азадаасассудосусаєтасстссдассі вав сЕстстуЧсокесассазодацвовачі є содаєссьва чЧесеєтасссссссвзадчасссттосадерсясздеьооськосасчадєсасасствсавсдасвавоа асагстсастоачадедаасоєсодаваасаєссусаосасцаоаодавачаає ог часа ссває секчачаствасасьстчесдсєдсаєсадессасосааоесазаві ссачоєстасустдастоовав заасастахсстспадвгсзачсчосстсазвавссосаачіссасуєаа

Фіг. ЛА ЗО І МО:6 Послідовність бика ЕУЗА тііпідуааваі5і811іддізаеваєруєірасскорізКкпсісдєзівраксаавічуааісревкучії ТГУ5пАТСАРВІСТРВХУМИИМЕАІНОБАСОРОСЕКАОТРЕУРААТЯЕРМЕОМАААКОООЬІНОТОМУМ СТЕАВАКТМОСИВОУОКИТеМУМРЕКОРАМИСКОВЕТРОБОАБНУВВХАВІТУВОСЬЕСІКЕОВВІМУАТС КНУІАСМОКЕОМОСЕТЕНРЕВАКІТРОВІАБУХУВРКОБСТАВАКУСВІМСАХМНАУМСТІРАСАМВУ СО ТІСНИМИ ТВОНМИ ТВО СсОАМОВТЧОМНКУУКТЧАКОСАОУАКЕМОМОЗзЗсеусьЕЗЧаУВОЗУКОЧІ ітекітдсвіккітеціупЕсЕгаЧакачяипзівсайУпскеаЧчаїаїсзаУуєв;ячсьКМООстТЬРЬКЕ КЕКРБУАМІСЕНАМОТВККОССУВОВАРЕБЬНЯРЬТААЕКІСЬОТМУАНОР,ТОМВВВНОМИТТМАМАА АЖКБОХІБУКОСТЬОАВААСЕОВОКЕМСОМРЕВОБТІБОКЬеВЬОКРІУУТОСЬСООУВОТАБЬКМККІМ ЗІБНУМУРСОПОСТАУМОВІТОВКВРАСВІВУТОУРОКУТЕОТОМТОМОСНЕТКВОРОВТІВИТВТРУ швуІстсьнУтТкКІЧакекзпкістаїскіікасвадчуваксаз1рріЧчУзУукаис Яків кУувЕУКікае торкрурікеіааучкіпатаровикаївієнсійпіаккЧепчд1іУУуравувїїаересакідує ісакЕкаї1іакерадйрква

Фіг. 216

5ЕО 0 МО:7 Нуклестидна послідовність для РІЯЗА, фермент родіви СИЧЯЗ З Репісййшн Пипісвісуцт акдсессачецчасскосьтататтткассасгодесестагкозпсаєтодчастсавадесдасававоссс сс дсачаусаєссасассочсєчасссчосзесваєдвасаєасваєчассосасессагсесстсса Бачассаєчасвасассеачачсетасстастасаасаєаасачаседасасссоессстосасвасауає акчоасчазвісдусавчасснгсасастссазтчадостодссаастссасстячассаасчсчаввдо чечоЧссссосвачесатсссісусавсдассааєєстасскссасцссостоасссовсасвасчата чЕссТтавочессассочг аг воваЧсоаосассассаєсасаочсссасєвссасдавассаєсаоусааа ссоссваубададаасвасуачаєстоассссассотдсвсаєссдасовечасодесазасавєасевога. сіддсодзаагосадасст че сдосасобсаваєтовассаацаєсаєдаєассорасадчедодадесста сесачаєсєсссасбсассасєчасвосатесоадіасісузасудуєвасосьсзасоадесосчассасьстх паачаачстссатоочсасасавасусаасачсасстастатвЕсоасстасссвдссвассоскосе гдадчатахєтсостасіссасччуаассвасоссасссЧЕссгодасьсассдазасєсаксаєце сзасссазвачбаосадессссассаассассвавнацчіастагодастсссачазсвастевсасьскоке табсасвасччсоастстссоссудсдовпзсдчстасслаасчассідсатасосоадачсваєєссазвакя, саасусачасдоавссассссоасчаєсцтчадваєвчассавсоссоусссачсесааарсовчассоссса асеосгстасчєдсодаснуєвначессзазасадсодсасоачЕссссадчсаєсастасодлача сво вус чаачасодваєсчЧасоссдоЧттсагссвзаснагчусчаєссасаєсавзасгсвааасосясачессесва гксвададоссасссессстсадсосооцісастсстдсадагвасаасотсастаєссасазатасаве тсдазвачсасвассусасчсЕсчсачоусасстотасєдксосссачсастчасачссочесачасссацч асквессуєтаєсьяссесаєсачевчсасасстоадасссзадаєдсораєк са ссеЧеваоєад садзавсаччатасобсоєтозасттксаттагсчасазаєєсусаєва

Фіг. 22А 5ЕО Ю МО:8 Послідовність білка РЕЗА. пічгтауіїріазіїзусукадпреуЧеїуєсайрарнуупа кута дасууписаивісввай щапечапсоірота1іапЕскапапачарцуїіркпачЕуєуарукпойовтаїчтудтувасісєсрувавіве рітепдеїйрсуєідадочаут1уиЧораїнучківопівувозречіріссадЕЧеЕккапачереся еваречукхопціууїауавійссвваїгувсцсваворисукоуіюрс оце спвречіїіавопивуєй увпуа1родудучевУстецікупадувіргістосасраціасіпруткокАЕтААМОВСІТТЕУСЯ ЕОБІОУЧЕТМНМООХІКУКСУАРОЗСАВЯКЗАНУАВАМКОСТІДІНЬОСЯТТСТБУСТІСТУРДТОСМОТИ тТтУТеБУДОАБОТОВУХУЕУКССВаТОаХЦЕМЕ ОКО а

Фіг. 2285

ЗОВ МО:9 Нуклебтидна послідовність для КхаЗЕ, фермент родини СНІЗ з Рихагійт уєпісіПоідех асчагаасатасточоссасацсасодассассесьсєучасзссоцсассацестоачессчаєсовчаса седгсесоссассасстєсаасааєсетаєсаєстастсадасссссосадасавсдавотаєтостод зЕссадагєаасстастастасекосєстдссвсосластєссасекоазасосадавасасссяєссвдаад тствазсасессостазастсоацЧассьсактсосссаттсваттссессчсссваасстсчоссасчаска гааєстссстсстоЧчевсасоєтаєсассогтоодчачоовасстадасатсасоссесацасасачававда спеааєсззасачосусавегоасассодссцдсассаастєстоодсачассточвасагсасастассьсаєсо ссачазчацуссабачіасазсвзадчоваастссачЧчсчасавсаассостастасцчасаатачсагасє часссдасзвсзабсаасзесвеасассотасасотгссочсоаачосавлачсаєсссаветатсто зоачасоачагстсачессавчісавасстсавазсаавссІковадаасастсдаваєсоачасосвачаства аздадсвассасаєдгасавозісаасадоассосасвагатсствавсдасадсесавогддсваєса часстоачасссозчасоссчазвзагсассогодочсосутатавасстаачцьосссоссаасавачіса ссссдасестасстстадіаЧчсвасссоассосаксвочаснассоссасавадасссссвасаус часов тасєтсакатсакссасссодасстаєсссідссддесдсссессаЧЕЕсСЕєдсассаастасос дао сазсчаєсдаєсткссесастсстедесаваоасосьваєацесодаєдодоассавевтасссяасаствс стччсасочасоЧсчссасавачазеЕсодасааодасьчагбассусссосодаассссассвасьсся тссбсдсачсддаассазсваєсссцчаасчесаастсосстсастодєсазсавсоадестзассстссосас гасгадсасєсасудавочаєсасєвассачоасовосаасасуєтасстьсассузастссат заєдаєсято саасадозатачедчаачассвасстоссогсссдаєдааочасодсзассоцассоааосстссачеяеє счачасовавогдсагасаєсобтагссаксчачасвасоуаваое г сасаассуссасччазасахоа часчаасасосдаєсзадесцсавнасодазсвасаасадасстодвовсазаахававассасадствасавце стсесадааддассаацатстодестовдасстозастуФаєассвасссяудсачавнастодсайсясть ассессЕсстасасчтсоасчаєосвассвадсагцавасастодасссоссвасттсааассдсвогвагоа ЕксочсаєестЕсаєвсасеЕсасосаєссазсабсеєссаастссоссуздасозсевєаздачеасьсоа гсазУчдсічацкесстсасадссосаєво

Фіг. 23А 5КО ЛИ МОкІй Послідовність білка БУЯЗЕ, пкуучісачасвієраїзадііїісвегаєслвпрііїіуваєрапас1ідрапууугвавпсптзраавчік зкЕдіісчйіідбвіркіпхудоУуйїрраоавгуугудснаввіхуєквпадиунідсіпсецритусаня речриуплкчпгдаопсууйпЧії11аааЗсвуууувдеткувсізчаатацукзЧУуУїкпсаїстцаї едптшвшукіпоіууїіїіпаврававуємічкзКаридрувакУ1айкУєррізадпарідчовіїксрпуди уїшегсСчаурадт1ірУу1арієчЧвадЧЕріїУукдапоодидввурс троса ЧУскписксасгкдевіяюр зченпрпрапвЕсУупочікіхктавіскаїУуЧасвсізвпеепоапргвіУукуйгзрикасчахадізає кадватуічінкапукеіаєкпащакоанвоа свіча касапураду скін іозаєпвраче сн вЕВувийЧУкуєЄєт т цраєкіупанаєєіаукєдієовгавтаїдузікувнЕсав

Фіг. 238

ЗО МО Нуклеотидна послідовність для Ке43В, фермент родини СНІАЗ з Еизатіши чтегісіШоїйеу агасустесесесодстасеосассоссєссєаасокводоавасуєтовЕсосоааасовадасуда сег тсссасасасассазосстасосттссводасцосасісасвгссассоатоасагссаоувазцаса честстехстссасассасктсвасатссасстсотсоссвоадістсесосарстахосстсаааодах стачеЕсазстацеЧЕстсабссаоссасосстодазссосовоавасачессасссвасаєсстачсрсааа чзасчасаодасласадсвадвоаасоасасдсассвассастодатасрасавосовасатастасаєса сгддсчаатасстоацдасогбодвозсаттагвачгсасстссавсассассзаєссугочавсдач асрадесодваєдвосевустассгссаацеосаваєсасаєсЧассссаєссовсосдадасєдаєта сачзазадчиссаєссастасосасдцсаєссасковасгзаацастсозеекодазассодачачссса ЧдессочадчстІгаасасстадчаасоцсасзапачоасзсаєаосстдацзоаЧчіссосатагстаспацеце чассчаестастастасстсассаєссссовадатосуаасісзссодзацчассасостаєсасадьсяссса Ччсосасавуаєссассовссоестатоаауєсеіавсватсавсавосссаяаасстсоассвассисаадасяс сгсачтассессацасьяссоссасаЧчваахзсоасвосзачатавсесававасазсудЧесчачавеке тосстІсдссастсусатсасазсасацчозачтсгезессаводасспідаачесатЕсевассвагод сасагччаасвасочаесдчаатоассосааптс т адсаассацчгасадзацчісчсасосстадааасстсстес сзавассчасосуааасчйєсосочачатдодесостсзасосєдасссадасаастасвасссдаад зачастазавзачаєсссстсстсастсусстоасассасачачесосвааседасаатсчсссссск єс кгЕССсСаавчЧаЧЕссцсасві са бдостачссдавасвасоастассцоатастасассоссаочацасазоз КЕсСовастахссвзчдасвасалпачвчсссавасЕсссагсоадасяссассосавасесасастустастесзавахах ачсчсгозсахксзассссавасессаавдессозедатсаддзачссвознеЕсассЯссєкссасясаса чЕкссчассатакссассвсчосавсисвсусесттестасавассвзачочдсадсаасавдазаєставчо стЧдссстссчассссоцоссасавцацевсацаах сс соасаосзазовчтазчсассоавссссосчає чассадчачаачцусачтаассадчістасасагодауусадссаасодсдасосастасзасссс ад жгсодадссасвовацчсаавуассстсаасассосцасаодсаєссадсаваєсттосдвастодачасасу чсЕСсаЕССсастоЧтацчіссостточассттатастасстасаасзусаавозчасстасачсочаася ссозацадазасатовстахдсадсосвассачастватавоасоссапсадсасаводавчаєтєочассагод кас осЗаваєсазаассчтац

Фіг. 24А 5ЕО 0 МО:12 Поелідовність білка Ку шехви11срііатуза1реєкЕаузсуєпру1рунвадрасідчкадіє1сУуєзсЕі8Ерудіртувнка іУпикііївпупгекаіросівчкіазадастуарсісункуєуучісвуідчоабіїаті кос приде звиваруеТкравідріт Єчсюідктусаєвоістідеійів:цЧеізреїпічпасдудучресрніуки аЧуууїпіаецзадсававвікіакаскітсуруваупнпріїєпкосзеудче пай хавЕкапиннаї стаєхібсадауєрицхвауіЄпосчпедЧенркідругсахпроопі1ркрскатрадортпадрапувік ксЕКІірріЕмМАпсурхадаїзівзкЧіпірзкппусозУїрадвівівациаівгіскуЧНсієку зУуаїаїкреивадцеацчієУуєкІ ча підІдіУукірспасазпккактаїкегсасдадчоураркуурува ЗчекауївійпівезавасвувічаввпкЧксІійіакававічзоукавеУавіїсавуасспакавахУво ркааайукцистукруацеіїспоугУукзеї

Фіг. 248

КО ПО МОЗ Нуклеотидна послідовність для АТЗА, фермент розливи СНЯЗ з АхрекрЙнх Липірайх абчосадссссаачеставсекассссасацатасосааєосусавассватесссссссоссосвчоо чеастессавсссацесососстасчсацдеачадевачасассетсестасосуасакссаскосося гбассврсоссочестьссксістагосаацссчасчаєстчсачаасьчоазассдоасвадсвакатх сЕсазагсуудссосвассачаєссстічасовсодсЧусасудатсачасассаЧчссасптасстаєчовсс састстоасвстассаєдадчовссоваекстаствовісусссобассусоассочсачваставудост гвдссдЕєсасоссоасстдаєссасасоасовідессасосдавзаснаєссдсссавасєсусадвася зЗдсассосассспоатасссгстчачагсасдасочдасачсстасассасатссеваосоазачаєссачає чагсавасавоасасасаєтесдчаєстсаздасодачасчвстодссопогкавастассьстоднаєсзоса соччазчсачисєдчсссаачсоасосасасаєтсвовзачасадасоцдасасвастасстсаєчаєсоса задочазЧчгасеодачсьсудссасссодачассає дЧчсосодаєстачаасосоодасаваєссстяача чегасвсссосасвасссчсссстассзаасавдцоадсасстсядаасастсссвавоссасвоаЧчоса сччасеєкоастссаочагсоачайсозсаассодчесспасосасочеоєдадсасссчаєсаоосстоса Тадаздаассахессаєсччасодочачасодсоассодссессдссоастсдацаваачочв ав коадсо тоссасссаусстоссаоадцссвзазсдсаазаЧосоосвссассассаватавосоачеікссососд псчадуддсосасодаєсвацсаассосдасазадтоосастссадасссодатссавоатрассддсосас еЕссвабасстучсчасатссссазачасадвочасстсассосстссссссочодссасссдавсассояю рсодссгасассотссьстсасавостсассодагастосодастесаацдссодасчатцоаоссясоде Ехо стасасоасавасаузосцасасссгагссасовасассогодвасчсоарсосссвассосвачаяе чесдассвачазасадасаксассосресссссассовасадесаасасаєсчатстстоотассцьсеї сстосадасвзасечадачассоссаєсеасссстссдассссусосоддаацассчсацевастстасазац Фсосестессадаацесасодідсесдсссссаводаасоасчеодасадассаєсссозестєаадасе савцссобсаачесдасассдачіасачесттусцусадссасоссозасісдасасссспсасадацасааває сассачссусуссвастосзссчассуєвсачесоссосагсасоодасачессастодессасттоссосся сусасчссасвогсдчавсоцодасоссоачасссвсцоссосатасаєсачсвовсчЧовоасасаваоца счдачсозчасузе сода єсооссаадсодессссадстасіда

Фіг. 25А КО о МО Послідовність білка АВМЗА таарвізурсдічвуєпріЯручпзарасаутавЧасЕЕсУуєвсгіатроїріуаєхаїдпчківваї ТахраціраїкУсаадцвЧіуавсісувеччтуїїч"вуїсраска115савірудаванварівтахи чійраї нападе ууусвавйчтікЧчуєвів1кЕЧаздрудутчвасадучресрвіуккааутууїнів еццсеісввестатвхсхсодрчерурпоріївакосвеуїЧчетудвпавіЧазвупинатаївсувора чкпуршугестіаразчекцемруїЧчругоцтаоаргррракЕУргдедачікоракудікруазкірай ЇцумнсгурксейЇсуврхцпрахіхкІ1срагупісдстайЕкрайцівіУптЕЧ ігру єчоувкарку адеваччсУуЄісспоацпіаісіУзтіассецівзівЕктЕУувокапувуріреаєчоУуркенсадчісіві чатвасеухутаваракПпрачучіівтапзіїувойсоскЕсовіУудууасвпачацзграуївгикува хачаїаєахутрау

Фіг. 2583

КО ПО МОНІ15 Нуклеотидна послідовність для ЕТ А, фермент родини СНІ з Жиатінт успісіНої бе ахкчоттсечестсауєтсаакссоівасодесгосчоствоссссоцсодссостчачссачссавсавовачоасопає ацесасгдоачсоадазасдставастадсацісассваакасласктсесссасоадуєссосаєсдасасзесассодсЯ асЧчаттчачатсастаасвстазазскадоатассаасзаттсеоцчт сага узсасесасаседчачесссясссяс зассавастітосвасасассаадаваєсзссссто сте ствістачсідчцаасссаєсвастчаєдесавцеєе песесгсавасодісссцасастссксессссуавостстсссоетессасчаассрцвацесіуцавасоевсаву десазаоуазчаєсуцєсссстсвасуачочссассоудуаасодчаєсісаадевасвазаціасассучевсьссо кЧаЧІЕаасдучсасссесавцпасоасвівбасацессстесоассатсотазосксасосасцатс се содеавус чЧЕсааццссааціссаацдоассзасазчаачсачіоачссодадсаєвачзЕЕкчсасссасеостаасвачавксясе секаасадсаасвасасс сс дстассасстаодатсссаацуєдаціазсвассвааастосчассссваєсавах асідасачз«ЕсЕчсададсдстчавочадсесєсдасієсаасстсаєкадесЕцЕссопсессасстасавачає сусаадаасудчесвкссацсічаксекассзацастосссоаачасскссассссцв азс тассоєстсасає чзвакосчеічазсвувспсіЧчасттеаосвазачачосскосіцсзсссссспагчЧчоаасасусісцадодсвасх ссаасзачаєссечесосзасточаазачакасостсочасссстссасаассявсстачеессчазавсасстзоца зстассзасадасссакчаєсстсозаєсєтададесасстссзусооадстааадасаєдаасесставвнаєстова ЧчастстасаваасссачісасоЧетасцкосасоставсацаеат сс ассудеіоєскасастдудевкекосо Есчаєуусєвсесдтсассссовзадцассаастссаусоссісассдасзасасаетодасчачаєсааавссве ся чазоассссусєсасьссазачьчасдазацаацессоссдаосісопдесасоссавососугсзуастоссоссвев скцавчеЕсодагассаоцассчасеечоссоскассссаєточоссудваасесксасавуцчачеасодссессовса гасксоусагоцдсвассавудзаваствассосцаєстьсасоцісвестсссстодівевесвакксассесувів ЧчеЕвачавочаксассоаЧссссуатассостоссосточааксацавстассассесстассчечадеседавоєсє ЕКУустзазччачексзасстассечараасввтазататодссасатсасочсчазУсЕуУсскстасссассося асччгчуазсевсстацаціЗасаасеутароасстгасссосозідоасстстЗзсессуЧсаацассаесасо сскдсоцекавєсаодсесаасасосаєсатаєссссодаасарсстасдстсстаксстсазуаасуадвааєссо є счасачісудосіассассаєсаєсссазавксосесцессцасьссассавдассвессаскссассацевсеутаєовсх ЧессастесттсссачассазссссасцасссасасссвосссассассцчесцчастьтосчзоссестьстаскавнсЯ ссдусаздаасааачасаацодаасьісссассвозаасодсуседсуєаєаасассассавааатЧєсчасаявкс зезсчссесьчЕсстісвацазссксаацчессоцтчсгсавосівацессаст ст всекоцвссвасааачаса ва абостсттЧецкЕсвасчцассоессасазучеасвасаасуУє ус ЧасассаацчаачассчЕссеаачцчесаві дазаацчачічЧесЕксаасстсазоастЕсстаасссчачсчтсасі сті сачассстесзачавоудаавосовх. астстачетай

Фіг. 2бА вЕО 10 МО:16 Послідовність білка БЕУЗ1ІА тукЕззііазаасєуаезспіктуЯазКкадпаєвчпоауав1педіппзудудіуаеїікокгакчувкку рувівздитріпаакізіпріцдсвіздвіртувтпуквакокаквідЕїпедчуччпачУуккаку вав сзукапЕгавісвпісйатедаУукУуквкапекцитенеєт1ївракпараапистаїкуйрксадсвіа Тпуі5Ісросукаскапдісчаївваїеаійрвіїктрозпютеаспксинчнаикагічрікпекрагед тУпузасва1іЧіієуіснаєдЗтпівеіідууазівідцвусркачісвіїЗдаїдеіебікодрУуєвки чккгаеіЧвркобківуувсапейнівоурсднпаукеукїотівеаїКккапраїсуієздавідрха хказохєаірарчічаунрукераутуваєвієдпокуліічеатавспрадасоивЧпіпруричігд чцеауаісцуетпайтірЧче:Гуаріїкпептчочаїстютічтавдвавессивсячучнаі Еацвраєне ірксзаваріуутуаадкпейкоавііч«кЧчазупоскаадйуртувізкааУукроацчае і 11єпке7екартає парвкаппучУасккстУу1кааЧксаїпІкірпізуачівсіккокрузв

Фіг. 2665

ЗО МО17 Нуклеотидна послідовність для Хупл, СНІ кеиланази з Ггіспойетта геехві акчаазоасазасоаєсассстгЧчеасстосстцососссстоадеовсоссістссссассоузвасстаєссов. ссісчасссосдЧачстсессустстссасассдаассусассоаадезчаавсаасссасссстчочассясо звацесссусгвазоасаєсодассаосссассавдадаааачасазоастссассскчдсассооссассвас счсчассусстоссаасоасцуазаадаасасоцссаєсасесподезчаасстсодссзадівасчссода чавсачсаєсуаачеідцсачесососсссадаасазссаадцосазстчвастоацоачачасчесчаєстатс ссогсзасссєцесоачсававнозасавосссасасчсоадссасассетваєсстудеасссосадссо вехасчсадасдаасвлагаєсяасзасдрауастасссідсодсавоссасссосасссабаєсьстає счЕсЧатстадасочсвсавоацаасаасає сот уєстучсєдассоссузасассасагдссосскетесю тацсссасссосссссосссекоаваасесстсасачесасавссукагтасадсассодасзвоцааавтхє азчасчасвассастуасідасевссчезс са єоосчасзваасаговчссвагсузаасстссаасо ачдчдасцдаасцсіцесоассссссацчьсьсссссадоасьсоссодсчаччаче ссуєоьсчассоасевко сусастесусзачагоастсасоог т стассоЧіссттасассавсцаставаасогезчассосчосаа стаєчоасвачоєсвасочастчандасєсасоаєстосавчсоваксісссавовавесссеосассоасо зчзгаєтзадгссаадссасовсссставатассосссаксасадьсссттсстадазесаадасесдавосо аєссвуачдасстоасасоададсссвсестасасочаачссачсесссатсвсаасдасоасодаацосоє часасяастдсасасоссссацдсацссодсаасодтасосаісасссассточосассассуауссоса састсачосзосаседасдасоцдаєсасасосзацчі Чі с свачсатоссевадовьстссавасасо Есоцдсаєсассоічіочзусаєсачтозсавоаусаацівдсссессотассеседсставсвастьова ачсацсаасвассчавєчстсассеЧіссесасстачдчастсясочесуєссосадовссаасссоствога хЕкдасосаазастстсзасооссзачосоачсасасазсацсастцьсдасаксьвасватай

Фіг. 27А КО о МОНІВ Послідовність білка ХупЗ3 тпкайпхіїсі1іавіуааірсесійвідраеізаікапісексва1і5йкчавчвідазікукакіутосава кЧа1тЧтекпавіічадіададуєрепввкидеіеппааЧчіпеичавауіпевоаЧдпкнікоавсіїчвпЧі раитпліппайсікучікєвВУасугукакігамнаотпеїіЄовідсікавУїавк1і1цдеєееувіаєха ахгдадрзатіуїпдупійгапучеЕУвсіксутвкніваачрійсісававпізачачвасіваідчатає чтруУуквівісвійічЧчарссауєдутчасізувкостцієтиЧівакавитавепрітгєазатпркрауп вітчіїцч

Фіг. 2785

ОО МО: Нуклеотидна послідовність хінА, кенланази зАхрегрійнх інфіннеенхіх аасчсстаса чососацвасе дЕсСсассявя всуссадасе асзбазбауає ахтасавсевх о діайса«оаьс жодна сса десестассє ссідсаєуаує сеосвобебс басткавькс ра ссбаєтоачеоса жсвачадссосї зуазеоцасе завоас кіс азаччсстач ссосауєнох по чЧессаєдеве даскавшисоза дассечодста застає Бостчбассо обсасесоуває 240 асссссвосо ябаацсузоз СсгЧссасає БосссазеЗа зесесоЧчасуо сессцдоцосча 309 Чпестоасспе Фест сСсасса ссптабасзваз чавассссстов зоссавскоези десощоссве зЗао ццачесссвав чсасосЕсує дасоссесадея свое содсеапцевіво дсодцачеоста 420 аачесічсета савсвваїсла ацачзсасаа ссгсоовЧчта саєасЯессе чсасузосоа що ззаасьасос ЄСсвусзоасасч ассасрадоає асесбаяєсає спаасаєсчасє Єсебдадссяу ЯО дазасестес ссзочовасс зЧессавсева ссесассвсо содесессяє БдазЕцсваує по сесеббсасес дессуссавс саїскгадсся васзБачьсс зі вцсосяа сао юеа о ЖЕсадссава ссбсауілско аодсьсодсує срасасадцда засуЗссаєч авасчрасаса 729 сзвааєтаєсазца аєпруссстоїа Чазваїсваоцеї сзазуєвої зуаусавЕса чдоачпсвчаасоаса тво чсааавсоса бакчасссаят Бсосіїслас збасваадоса зазчузчасвав бачок 840 счсазвасає зазбвузоус аозвзосооцсо сасадсвата сСкіодвссаууа сачадесеЕсе Зо сккссауссу саєаєсассса сСссасацсав Бседстксю ссавесаєса Базадогесає 350 тасчасестЕЄ пдеавоцесЕс Едобоасуцзе асточоесцеє сердосссяч засоєлавех 1070 засЧчоІсуєза вабассудвта гсавссасує зсвааастає авасудсвасс Есе ав 1980 сасстасцчаєс дачачксдссу двзасастскс сабБусбассзда чдаачасдаз сЧвассссоуа 1140 ссбкоссаєЕ дабстозусє доавассасеоя Сесгссбвад ссаосдчасья кассестеваа 1500 ссазачоаєста засссаасоа беспсксачез стаксвасоста стебадседаа сбасадесеее 1260 седчевсоус г сскасстс Чдеровчевсу побдчасева ссабссссва осгідвукаєе 1329 асасссчвосда зчастасузе застасаасо ссбусвессе чассясааце есссдокасост 1380 -чЧбасЕсЕЧа гууавдсаєст бвосвачеіво дсассчасас соспвасвиваєс чеасочссова 1540 ктсасоуцаас лдадсасубес асоусаціас стос тоу зуадводсава содсасасосву 1555 чавсочодаєс соссодссаво сассксаасо ссбозусоса ссасфчучієо зпесвабазчоу 1569 ассссаабсса ссачуєсаба дсоддодаас сасудачсоє Єдссадсаце здораскоєсса Тех са«бстсевс Єбдачасаєе адідсессад сачссодаає агассадозо доаасачеЕссао Оу боссводіда бпессасоабс зсабссодіс ссебудудЕса сабтувууиє забава 1т74й гсцоододдсс двоскоссад содоБасЯвЕ БесадовбрЯс асадараабсо азсьсесобе 80 кестабсвоє тЧчеЧЕкЕссв саседовЕає сстаєссабв часааєсаєс Кксдусосаєста заБо ссасаасссоа Сіобучссаса садссасте соадсаасоє зсссочааабЄ сдоудозасасу 1520 чеачічесасоз гасссессстаа сссачууцдсає Егразауєве асссасесебо сачавасєсеє 1980 веЕасасасач асссессвач ассосоузка зсвсасавад счаваєсксв всачессуає 2980 чсачієсавї сода 2358

Фіг. 28А ЗО 10 КО: Послідовність білка для хіпА МКУТААЕАСЬСИТАКААРАРЕРОБУЗВБАСІМХУОМУМОМЬОрЕТУОЕВАСТКОМУМКОСУВЗО КУМ МТТСОЗМАЇТУВАЕТВАБОЗАВУБАУХОМУМУРОАЛЕУТІУБОУСОХМРОБЗАТВІСТУ ОПО ХОУСТО ТВЕТМЕРБІТСІБТЕТОХЕВУВЕЗТНІЗОТУТУАМНЕМЕМНАННЯКОСМІОЕНЖОУУАУКАМОСАСВАЗУТІВ не:

Фіг. 29835

Ї як їх г ж ЖЕ К о і К чо ч яко г З: В І т 2 х Кз ; ? ОН з хі ї. он СО Ї ан я "Як су а них - ся ши й ї : ї с Я НИ у БУ Вика НО мит ОН он

Фіг. 29 ЗО МО Нуклеотидна послідовність для 2434, фермент родини НАЗ з Спбфегейца тепе зрдчазоктссазвчисовтасесссасссвосстстстсецісосссваацісссуссасвозасоазедастатсоссотсатсвссаво БадассластогочЧасссуссадсесавостткаасзасасстеокадссстассосзсстсаєдасатсчаввстодасьто адвакчаксстсахчаваассадвтасвосаг дачадзассассасдестасестатсвасзацатстасоссстувсацеє чзгсзочубасосстостчссаззвасзочаєцесососсодасогстодасадчасотсоодотсстзасостссссасвадавсує паезасаствостатсзогбссстчссваасцасадозаєсатсатсітсвчавкососчесдссосстсвссавсссссччеуває сатеЕсусссосасвачахекочайсостсасасісксадсассосасоссоссазі сосок суавосат ас сасецвагскає Ехгассатасчузсоотвісасусоссуєсасевесаводасусавацасавувасавутасаасовакстодсасвоадесацчу задсуцдеассостсостсовуссстсадчакксссвадцеечасеваодасатчсасастстоацсадчазаадссьстсзасавує КЕсасустедассссвзадчассодсавуссцевсстсссссоовачасдаваасодасессскістадоуассствчасєтсазсавад сусвзасвачаїїсастассьсасотасістастозсозоаасссзотабетіоєстасзсовогісазазасссоставочесс сбасзссотазссасодсачаассстазадосацтссасочссоовесастсасістадтвусаесааатассзодассачечх чЧасстаксякактсассастесвзасаєвзсссоудсавозастатстісоссадуєаавоствацватаєт т оусастасадсваа ччазадасссксасазгадзвассевяа

Фіг. З0А КО ТО МО:22. Послідовність білка С243А. шкзк11єрвіі5Еч«одвіаєпайсріїсвтисачрзавуєвасініурвпатдачЕепарацчачузисаув чувідкіучвіртуайвокаївтейурнчнавесичаразайкоскууЇУХракакадієсідтатврерау рЕтракачірисевійраветдайахауіачудівшосдЧчіЧхичакпсупевусеарпасазівраїзак ізкасвсізекреатіі1брксакріїзедейкстЇевцрниіЙйктпкіууїсувсцспуїУууаєвЕср УучеусудахііеруйскссіззічкучачинієувсаксвоакауїказкаккімучакакіїсКкКкО

Фіг. 2085

«КО 10 МО: Пуклеотидна послідовність для Ко43А, фермент родини СНЯЗ з Жихалнт охуєрогит авасвзасссавосіссрсествєсаосагсоассостссстстазссвасаваєсдсастосасвачасає ЕЗаєсасасссостосостоассассзассустоцуссусачассссссасосасосссссававцуєа ачевседаугьсассосассссасдасаєсцчаачссзакстсоссаасоадсасадувоачсастсдвзасає чсовсузчузаєстяссвтасстассосатааачадчсаєстатчасазачассосасєуєсзассасов сеесчесстсссачесезасчавовеесссадосуаносадсазавасчачесесствасчсавчессаса адаасочдсаазвтаєсасстстастьссссдессаавазасавазчаєчачасстссадаатєодачачекась чзЕскссавсааусссадесоаессЕсусавцчасесдасавсвостозаєссстодсасасасачраєсоа тссгостсазставоЧісдасастдагвасоаадоасстасстсакстоадасастасствадоасочссяос СссаадссгдасадаагадазачаастстадсчачісугадчастпзасасавдасвасесстаасяЯце ассаагосостасстсстсачаєсочссаацстааосазоачасагєдесасаачаєсасссавасвососо саасстсассасесссосссессвачасадчасваусссстссацастозасасвасазусчасчацось ссазавачсссісддасссасаадсдсодсаавоасєстсастасстсакасастссассдасватасосвс сЕссгвасстасодстастесссзвадзасатсесасодессєтавасстасододасаачастсстдаєся боаєсдасочасочассасетсабсодаавссассосєсачсаєвачачасаЧче чо аЧест с соссссосс акчечсагасочістадіазодасвассовкозасачесуавозсчаддазаассгдасздасаадчаас засзабаєсьтдссвсассассстсва

Фіг. ЛА 52010 МО:16 Послідовність білка Бо43А МаікЕтВваїгЕвісексавцйєпаіррізтаїнвайрвапуєвакінчурввватеапучпасаЧацчу апгчупсуєтквіудкаручапоуаізудауркакостпиаразайкпокууїубракакцдвієхідча чтувпкрасрІкадканірчєувійразучаєйпезуїїчацієчачічанчаккатпевзнісакаарцо жпаївраіаківкатикікесргаїУіїаресукрідзейпккхсСедонівктЧкіууїнвувсЯв тіууаєзвквіучрусусчЧкіїйруУуйансспавісеукдомнійзаапсаЧкауїігаткаткінуйки чкі11пЕр

Фіг. МВ куУ4ЗвВ --МОГХКЬОЗАСЬЬЗОТОМСААООТМОЇЕРЬТТОСКБАДЕЗАНУКРЕСКОМИХеБНОТЕА Жо43А «--МОГКЕСЕВАКЬКЗЬТОКСААОСТМОТРРЬІ ТО КВАВРЗАНУКЕОКІМУТРЗНОЇЕА дх43А ее МКЕЕЦИКВ--СЬОКУЄ--ОВБАТМООСРІТТЕКИТАВРЕАНУЮМОТСИБУРЯНИТОД РЕЯЗА --МООККАУТОВОАБТЯ У -УКАОМ---РЕУОВІУТАВРАРМУХМОКУ УУЮМОКОМТО ЕУє3А «МИГТБРОШЕКЕАЯТЬСЬ ТОУАБАЮК» о РІУОЮТУТАВРАРМУХВСВУУТЕТОНОМОС жУуйаЗВ --МЕКЕНІСРІГАМОВАБРЕТКТОУВТУТМРУВРОИНВВРІС-ІОКОСМЕБСМТЯТРКІ5 ОАЖЯАЗА ------нн нн МААРОБУХРТСТОВХТМРІКРОМНЗВРОСАУУАКОВТЕКСУТВТКІ РЕЯ3В ----МЕВВІДРУДЕСЕАТТСОАІАКРА-- КРУТ МВВЕРОБЗОІЕТеБОУУАКСТТОМОМ ЕУ4ЗЕ МЕУУЙІУАМАТВИТВАСАСЬТОНВВАТТЕММРТІУЗОКРОМОУКСОВОКМУУУКЗАВМЕНЕ Е»430 МУУМСТОСАОТАМКВХНТУЗМКТІУСКОРУТОНОУАБЯУСВУРИАКОСМИАРОЛАХКА-М КоО43А КУУМСТОСАОХАМВОУНТУЄМКОІУОКОРУУВНОХАГЗУВПУРИАКООМИАРОВАНК--М СхЯзА СКЕМБРОССОУАМЕВУНУХУВІОКІУСВЬРАУОНОТАСЯУЕРУРИВЕКОМИАРОААНК--Я вЕЯЗА ------АТУЖММТВУЦКЗВАВМАМИОЮВ- -- НОТ РМЕМАМЕ ТКАМАМАВАРОУТРЕ--М ЕЧАЯА сен - ЗХОЕММІВИВІКЕЗАЮМУМНОН- -- НОУРМОБКТЕЗНАМОВАМАСОУ УАНМ кчаЗв КВ---ОДРУХАБЕрІММИВ НИМ --- КОГРОТВИКТАСОДОСМУАРТІНЯНЯ-К АКАЗА АКЕрР---СІРЬХАЗЕВЬОМНКСАЄМІКМЕР- - БОТРОБВ УТрРОООВСІУАВТЬКУНАЗЕ РЕЯ3В Мо ----АСУАВЗРВЕМТИТО ВТ - 5 --ПАБРОРЕРЕЯУАЗЗРОІНАРОУ СУКА УЮ БКУЙЗЖЕ БР -----САРУБКУКВССМИВЬІСВБІРАСМЕСООУПЬРРОБВЖЕВО-УРМАВВЬКУВКЕМ хУаЗр сОКУУБУКРАК-ОКО ОВІКВІСУАУЄМКРЕСРЕК---АрК-ВИТРОТУВІОРАВУУВТУСЕ то4ЗА СКХХБУКРАК- ОКО ПКІКВІВУАУВМКРЯШРЕК---АОКОВИТРОТУВІВРАЗУУТОМИ Сж4ЗА СКУХЬУЕРАК-ОКОПОТЕКІОУАУЄРТРОСВКУ---РОКОБИТРНІУКЗТОРАВКУЄОГСОВ РЕАЗА СОБХУКУАрРУВ-НМ-ПОБМАТОУСУВОТІТОРУН---ОЛІСКРЬУЕММЕІВРІУК ПОВОСО жУАЗА ОКЕУКУУРУКМАК-ТООМАТОУСУ ВТМ ОВУ Т - ВАБОКАСУБММЕТОНТУЄТОТОСО ке43в СсТУУУТСЕТЬСУВ-ПІТСМІЖКТТМеМНОК и ВрУ-- -ТЕКРМНІВРОБЕЯОСОСК дЕ4ЗА сОКУБТУВУСОвА- ОТКОСОКТВаБРУВТАЛИ В Пр ВЕАМНІТОРОЇКНОНОСТ вЯЯ4ЗВ СТУУМУЕБАЗААВСЗОКНОСУСААТАТОРЕОРУТРУРЕАУАСРООЗОАТРАМОКІОТОСТ Ечазжш СОПУЙТОСІВМ------КТОТИМУТАВБРЕСРИТ ----МКОМиСсПМЧСУХВМО г ТООС ЕФаЗО АЖІМООІ- ИОСОБОАИСОНКТЕМЕВИСООКААРМСТМАСЕРОТАКОЗКОМНКІТЕРЕВ КоЯЗА АУСІТИССТ- МаЛОСОАКОПКХМеМЕсИІОПКААРКОТМАВУРОТАКІОКОМНКІТЕТРНО Ст43А АУБАМОВІ-МОСОСОВЕОСКЕКУМЕВ- -СТЕРО-КОТААБОРОТАКІЗКОМИТОАЕКРЕО ВЕЯ4ЗА ДЖЕМ ЩО нен ля люті істоти М ОПН КОМОрМІСУВОБРТО УЗА ДУБИ нет т тенет ниття ния кнння-- МОВО УУКИМОрМІЗУВОоВІМК ЕУАЗВ УУСАТНО----БТЬОБІОСЕТОВЕРЕСМІЙМОСТОСУЙРЕСЕНІХКВООТУТЬМІАБОССТ АТАЗА УХУТЕАКО- ОМІКОУТИОПКІСАТСРУВУМВИМОТОСУЙРЕСРНІХУКНООСТТМІАКОСТ ВЖАЗВ ІУУУУКІВ нт тт ВІ ВОЛОТТНРТРІМООСМВАЮСТ ЕУйЗЕ МУУУОЗСЕУКУВОВОСОКХОУКВОУУККМТ ІСУС ЕОМЕМУКІМО и ЖЖ ЕУ430 ПМІБАРЕТСКРЕОАКОМККВЕЕ ЩО» - ИМНКВЯКОУУЬМУ В ТО пн тютюн ТОДЗА ІМІБАРЕТОКРЬОАЕРМКЕВККЕСР------МЕНКВБКОХТПМУ ВТ ст схазА МОТООБКТОКРЕЬЗЕОЕСВНЕКЕОР--- -МІВКВМКІХУВТ ВТ ниття РЕЗЗА ІРОТТАСЕСТЕТОМАОВРІТЕКЕАР-- - --МУХКВМОІТХТАЖААО сення ЕУ4ЗА УВІТТАСГСЕНОММАОВРІТЕЕЕСР-----ЯБУКВОМЕТУМІУААМ- сн ЕчтЯЗв ----АКОНАТТІАКАВКІТОРУЮЛУМММРІБТМНОТЗЕТКОТУЄНСОСКОСТКОМНКОгС АЕізА ----БОСНЕВЕТМАНОВІКТОРИРУРНМРЕСББМКСТОКУКОТУВНАЮЬКОПОМОМИМАМА РЕАЗВ --ТЕТОВЕІОСІЮВВОСОВВЬІВАР---- ЗБЕ ДЕМСІ УЖ ЕЕК В ОМ тн ЕуадЕ ІМОсВЕСВОТИТИКЕК РИСРУ яКУБАПКУТРРІВССМЕРНОСВМ ЕК МОДИ ся ЕУаЗО -ОТНЕТУИЖАТЯКМ 1 КОРУ сне МЖК ТОМ сн я МЕТО Жо43А «ВТЕЕБУХАТЗЕМ се КТ УТ - А ВОК БОРУ У Я ОТО схаЗА -ТІВУБУХАТЕКТ--- ВМО оно «МОВ БЕ Др нн МЕТНА РЕЯЗА ССЗКОІКУЯТОТВ не А ТОК нні снннюінн нн УВО МІ МТВ -КЕМНЕ ЖУ43А ССВЕОТАТ ТОР - АТО нс КОМУ УМККАСКЕ- нн КТ ЕУАЗВ ПАТВІТАОСУБРМОВЕАМЬЕМСТИМЕСЕНРКІОРУВОММРОМОБРКРТКМ- нн УВО АТЯЗА СБТВЗОРАНХМУЄМОВЕТИЇАРААМНЕКОВМИРУТОРУНСОМОС-РЕВЕРМКВ -- УРЕ РЕЗЗВ ТУМІМУТПТЕХАХАВВТ КОВІ тн КОВАВЖАРС БУ ВОМ ння о ВЕВКО ЕтАЗЕ ЕМЗЕТМАУРАСВЬРУЦАБІТИЮ------------ - « Ос КРІСУКОВМССИСеБУВТЬРИТ

Фіг. 32-1

Еч4З3О БІУБУКСОМИЕКАП-АНТАСКОУБВОУКАВК ТУТ Вб сн КІТ ВЕК Теесняя Кко4ЗА ЗІУБЕЖКСОМИСЕКЛО-АНТЕОСКОУЦВОУКАККІМУВКМО У КІБЬНЕр тя х4ЗА БІУКТОВОМИЬЕУНО- АКТООКОЖОВОУКАККТИХОВКО и КІТ тя РЕ4ЗА ЗІТОКБОМНОУКЕХНМОАМРООСОХОВБУСУВОККУМАЮВ нс ВІВТІВЕМІТАФ БКУ4ЗА СІТОЕЕММЕУККУНМСАБОСОВСУТКОУАУЕВЕКУСВ ОО БІРБІ КМТ ТОВ я ЕУ4АЗВ СРЕЕМАПРОМУМОККТККІРРНКУННВУвВООсАКВОВВКО -- ЬНІМРЕВМНКУТОВУВЕО лЕаЗА ССИІКОБОКУЮКЕРОСКІРАНЕОСУКВУРКТЕОКТУЗРВОНРЕТВІ ТРЕК ЖМЬТО----- РЕЯ4З3В САБЗАРОСАВЕЗУЯТЕМОЕНАМЬМООВІТООВАБЕААВ------ ІТЕАВОУМ ТО -я ЖУуйЗЕ ОСУТКМНИТВТОТЕВОТВОАВВИЕИМИМРОУМОКТУКМАСТМВТАВІТКОТТОДВМ----- вт зт ж аа вен и а и нн Коса А. пе чи оо и по и п оо п в о о о п о ди у и ни Ге ау: нн а и п В а а В и ВЕД сет я ОАОТОТИМОУУВОКАКТААНЕВОІТ ТЕС КОСІ ВУСЕТММО ЕУ4ЗА сект РАКОМ УКОКАЕТІАМЗЕСІВТВУСВКООМУАКІВНО ЕтаАЗВ ПЕТЕБЯЛООВСЬАКІСВНОТВТОККУБУВТОЕКРЕЗПООБАСІТИКВІЕВНІВСЬОІ УВО АЕЯ4ЗА -ТАВЕКЕОрОСЯСУМЕКОТО ТЕТУ ТУСУЗКОРКУАРЕКАСУТУКИ ТООНІПЬСТУЮО г Ій4 ЗД спокої поняттю кюнн кт кн нн в п ЖУЙЗЕ я - - Я УВНВТМНООНЕТОТУКІПКЕРМИКОСОВАСІЗАКВООЗАХІОІНВОМОК Еча ЩЕ сонне о юдіжеткню іо дуниню ст піні дюн пуд ін іошун с ші ту БОйЗдД сон іт пкуєхсюю теняімнеже ор пеня світ КА воно кін дик кет Пе ік дон кн кл от шт ЗА пд лу хАКААХ ля ЖАКА АХ АЛ ААДЛАХ ло АЖА АЛІ ААЛААА АН ЗАЖАЮ ААААААІХА Ал ЖК аг ЛАК ДАН АХ ІААС Аз ла, ЛАК АЛЛАА Хяй я Аао аа А ААЯ ілоажа ХА ААУ УХА лася алі ДЛ Аля. валляа сля. ВЕ4ЗА ОУЇК- нн -УКОМАРСЗ-САНЯЕЗАВУАЗАМЯССТІЛІНЬСЯТТОоТЬМОТСТУ ЖУЧЗА ПХТ К ння МЕОУПЕОВТСАКТЕВАВУАОМОВсоКІБОВІСВКІСКОУВІСТУ ЕУ4ЗВ ТМОС5МККОКЬАКВЕКАТОАОКУВАвК---УУРУРОСНЕКСУТБОНІКААМАТНУМіСА В дЕВЗв ТІЕС- --БЗЕБЕВЕВМЕСЕОКУЕСРІРЕАТУРУРКЕИСООТІВСЕТОАУВОТЕТУКААА в жхА ву: нан у а а и о он Пп а о иа р о ен сне ЖуУуйЗжЖ ЕТІАТ- -- КНОМММОБИМОТТТОБООІКАТАМУуРЕСВТКІНБВрО т МрАСТОоМТІ КЕ іа ен п п в в в в Жко4ЗзА ван на п а нн по о я ек в в а В А о п и РЕАЗА РОТОСИОТИТТУТИ ВУ ВОД ЯТ Он ПИЖЕУ КОСТИК М нн КОКО А Еч4АЗА ТІТОМНИТУКТУрСРУВСАТОТ дае ПЕ ЕЕМУЕ ТОВ ВМ - ЕМВ жУ43В -ЗБНКЕОКТООТАТАВАПУВОСТОЗЕМО ВІР УАТСМОКОсВОУКСВКОсОУХУТОНТЕ АЕ4ЗА РАВИРАОВОТІЗБАМОСІУЗОПІОВЕТОВБУСУХАТВМО САСЕТВ- ---"АУІБНИНУЄ ВЕЖА сегменти ЕК портів сто ЖеаЗЕ УБИОСУКУЮТЬСРМЕКОУМО- ---н-- - - - - М АРЕТАТВЕОТЕМЕАВІАСОСВІКУКЕКУ ШУЙ снення нт ОЙ о-ви хну СЕЗ, пою слтннннннчих можн нн РЕЯЗА сн а они жУйЗв РУДОКІОНСМКУКЕЖІ, АЕезЗа сКоОМІрЕоВуурв у

ВЕ. 4 ТД окоту нка лам ваз мамин сть ЕтАЗЕ Хх Дуже с п вних

Фіг. 32-2

КО 15 40:25 Послідовність білка ХупіВ3, фермент родини СІНА з беобасійих хігатотшенторіийих МЗКІКЕРІСТОЕНРОРЗІСЕУСВОХУІАУВТЕЕМКВОУВІНЯКОЬКМИВСУАНРЬМНВСВОСИМІСМРОВЗ соукдвнізуВоОКЕКТ ЕТ ОУКУуУва КОМУ ТОВТІрСАКБВОвІТЬНВООКВРЕСЕНОВОСЕКУ пУММУКИнНКУуУЮНнНРЕХОІУСОВУЗУКВОККОУСВРЮТІККСТОМВІТЕОРНЬХКІМОХУВОТАКОСТВК НААТІАВОТОЗОТОРТЕУНРОМРІТЗМИВУВЕМНРІОКАСНАБІУНІНТОВНЕУНІТОКРЕРКЕВОРОЬЕН ВСТСРОСВЕТАТОКСЕНКОСМЕТУУСОМОРОБЕТООРЕМЕБУЗИЕКОУОЕКОРЕВСОТЬМННЕОТЬВІРІ, СЕОТАТЬКАВРОНЬВОУСВЕСІТОВЕТОВЕУАВВМНОНЕНЕУАЕТКУВЕВРІТЕООЗАССУМУ УТОМИ БОІТИНЕВКСВІБЕЦМІТСОВНІУУВОРІВОВЕТУУРБВОТЕХУЖХЬВУТУОАТТУКУВУЗЕОСММИТООвУТЕ ЕБУКЬЗОПЖТКОНААКТСАКУСЄМНСВрОВСОМНУАОЕВУКІ КЕ,

Фіг. 33 КО ТО Мов Послідовність білка ВНІ, б-глюкозидази родини СИ з Тліслобетта гестеї тсуксазаіаізвкурсакадввазезодаввеаутррачіристауакаквзатїактпісакудіУуваУцм подротдеєвравзкічурнісіцадріцетувсдасаєсруудаавесчйопіізхекоутідееукава іпУуіБдртачрідкерачацивнеЧчівтарутсцізвтачсівсічводучаєвВЕнНУВЕпечеїпкеьв апрайсс1ВеїіуєнрІайзучаптавчутевупеспосязсейцу сії ка а рцууьакпачії ЕєтУдвапза йшвзпросаєпапахгіздраїспатпзпууревкуййшУускііаакуїЄсойдчачураєй півкпуччппкпокаіакаціУзікававі1іріккразвівутозваїідавахіпвраспакосадца ідтдачсаецатпуруєтуаруйзіпствазадсдУуєіввпсапсзадавазатукауаітбісайздвауй чедпачіахкапійрийпупаїтдатадапаптіучийнУучаіїзечіїзірЧчукатуучаціразчевова іуйоіндйбсарачкічуєіїакерпаупсгітвддаівЕвецієіїйуквгаазвпісрсуеєчудієуєк ЕпузгівтізсакзараєчаучурчорзаїЕЧпасуєчапзоадусцаеуаціуїсурвварктврЕ чЧчіксчбакіпібраоазобаєсєпісхтбівзукієазЧчкнучрвоведЧівудаввкаікісвківува

Фіг. 34

ЗзЕО 10 МО:39 Нуклеотидна послідовність ХО), фермент СНЗ з Ахреге Ших /аропісня дтоостотоссоостСтТоСтТотОсСтТОоосСтТСТАЄТОССТСААССТСТОСОССВАСАТААСАБСАОСТАСО ТОСАТТАСААССІССААСССАЛАТССОСАСТТСТТТССАСААТСТСТАСАСАСААТСТОССТОТОСТТССО СВБАСТОССАСАССССТСЕТСТОАССААСААССТСОТСТОССАСТОВАСТОССТОИСССТАТОДОСОСОСС еСсастТСстТеоОтстСссСстТСстТЕСАСССТССВВОВАСТІАТСССААСАСТОСТААСАССАВССОСВОВКОТСС Стос ТСТОпаТесТОсСсТСсСАТАССАВОТСТОБАСТОАОСССТОСАТаСССТОСТСОСОССААСТТСАС ССАСААСССОССТТАСАССТОССОССАССТОСТТССССТСАСССАТТСТСТОССОСАОСОСОССІТСААТСОС АСССТОАТСААССАСАТООССТОСАТТАТТТССАСТСАОСОСССТОССТІСААСсАдссссооссостТто ПИІСТОСАССТСТАСТСОССАААСАТСААТАССТІССОССАТССВОТСТОсССТОБТОЗАСАСОААвСТОС ТЕО АТССТАСАСТСТТАСООСС СТАС СТАСВААТАСАТСАСОКТАТОСАССЯ КО ТИТО ААСССАСАССАТСТОААВСТОСССОССАСАОССААССАСТІТОССООСТАССАСАТССАСАДСТОСОАСА АССАСТССССОСТОСССААСОАТОТОААСАТІВСОСАССЛАСАССТОВССОАИТАСТАСАСССОБСАСТІ ССТООТСОоССОСпсСосСБАСОСССАССТССАСАССТТСАТОТОСТОСТАСААСОСССТТААСССВСТОоСОС АЗСТВСТССААСАССТТСТТ ТСТОСАВАСССТОСТОСОССАСАССТТІСТОСТТІССТССАССАСОССТАСС ТСТОСООСОАСТОСОБСОССОТСТАССОСОІСТТСААСССССАССБСТАСБССОССАКСОАБСССАОСОС ССЕССОСОСАТОССАТССТССОССССТАСТОАСАТТСАСТОССОСАССТОСТАТСААТАТСАСТТСААССАЄ ТССАТСАССАССОССССТОТСВОССОСОАСВАСАТОВАОССІССТТІСАТОССООСТОТАСОССАВОСТСВ ТЕВАБСТОБОСТАСТІСВАСОБСААСАССАССАССАБСААССССТАСОбССАСССТОвОСТОоСССССАСОТ ССАОААСАСАСАСССАТИСЛАСАТІТСОСТАСОАСОССОСАБТСОААБОСАТССТССТОСТОААСААССАЄ ООСАЄССТОССТСТТОССТООСССТО САБО СААСААСАААТССАТСОСОСТСАТО ССО ОССА АССССАССАСССАССТОСАБОСТААСТАСТАСОССАСОСОСССАТАССТСАТСАаСССССТеСАССССТІ САС НОСОВ ТАСАСАОТАСАСТАСОСССССООСАСОВАСБАТСТССАССААСТОСАСВОССААСТС дасасовсастСтссВСоосоС ССС сАСАССАТСОТАТІСТІОСООТОСАТССАТААСАССАТОС АДЕСССОАДОСССААСАССОСАССТСБАТСИССТОССССООСААССААСТООАОСТОАТСТСОСААСТоВС БОСОСАПАААТОССАССАССАВСОСССТОСТОСТОТАССАСАТОВОСОСССОССАостТосСАСТОСТОСоСС СТСАААТОСКАСССОААООТСВАСОСОСТОСТ СТО ЮВОСТАСССОСВ С СААТССОВОВСООСССКОВССЄ тесасОАСАТССТоАССсСОССОСПОССОСССССОССОСССОССТСАССАСБАСССАСТАСОСоОССОССТА саЕСССАСАССТТСТСОСОСССТОВАСАТИААССТОСООССОДАТОАВАСТАСАСАСААСССОББОСАСАСС ТАСАТСТОСТАСАССОССБАСССССТСТАСОССТТСОСССАСООССТОТЕСТАСАССАССТТСВАСОСТІ ССТСАВСССААССАСССААСАСОВАСТАТАССТІСААСАТСАСОСАССТСАССТОССОССОСАСАСССАВА САССАСОАСССТССОССААСОСАСССТОТТСААСТТСАСАСССТОСАТСАСОСААСТОСОСАСАСАСОСАХ ТтСССАТТАСВМКОССОСТаВТОТАСОССААСАССТОЧАСТОСОСОСССС ОСС СС ТАСССОААТАААТООС тостоовоттОовАсСссостТовссоссстовссАдДесАСООСВОСАСОСССАСТТОААТСоТоСССсСТОоСО СОТОСАТСОоСсТІСОСВБАССОТОСАТОААВСооСТААСАСССТОСТОТІТССшОссосСОоБТАТовосТоОоСС СТСААТААТСАССОССАСОТОСТОСТССАССТООАСТТОСТООСТОАССАБОТТСТОСтТОо ТАТО сС СоашасидестОосСАосоовІ осо АТАОТАЄ

Фіг. З35А КО То МО:40 Паслідовність білка ХіпО тауавіатіа іірчаіїдоапо звухаупчеа праітрцсібй гівівзтрасу зурізкпічс іе5бавруйка даїіовіїє1в еїіапсчпсв роургідірн удує«везінуч ІарабвЕсапо ауєчатажра ріївзаваєпк сііїпЧіавії всдусаїппа чкїЧЗійчува піпсЕкпрує чточесродві аусісаауау еуУухсоіоцеаУ предікінаїє акВпбасуйів пчиЯппзгіда йупіхтчдачтіа еуутраїїуа акчапуважв сзупаупоаур весезаТЕЕтоЕ згас Бауузойсда чудубприду адперзавай аі1адсаійс зсвудупбпе віїссЧачахка аівегутісіу зпіувіЧчутй дпезевивук 5ідчрачаху йдепівуваа увоаічіїкпа дк1іріазрве Ччкпкзіа1і1і9 реапаєсЧчід дпуудааруї ізродаєсвза чуєупуарає евізтпа:сапя задіваатаа ЗсіУє1со3іа псієвеаціак звіачвапочі е1іїізЧізацк задорітууч тосасаоатівва 1квпакупаї іІночурчоза сівікаї1ї3 акарацчкіїж їЧуравузев тТзаіїйшікр песечоразає утечуєЧеруу агчЧчичЧ1суєє тїпаввацавЕ скустпікаї севапраєст уадеЕсіспек авіспзоудеа вдусаїчуап с5еВворарур пкніччбйсі азчаквеоста зіпуртачас іагудеасти уі1ібрдкуєча іппегеутує чУевіучечучі іїіЕчревудуу ацде

Фіг. 3565

«БО МОЯ Нуклеотидна послідовність для ГУЗОА; фермент НЗО з Рихагет уепісиПоїйе5 акастстусссосссдаусосссстасестеЕдссстсснадсовзассссасоасссодеуасасаєссоє бастоассчасассавчссзадаавсіссзаесаєсаасоосс став сісвааачсстасоуосава ссавасєзатссосазаасстссосассссачЧчассасачаавоавочиасстосдасстг стос свасастаса ассчасосачасттавуссабсасссозааасвачатсвастасовсасстссаастосассовзсовосас саасаєссасаасссадагєазацсадсесаЕестассаєтессасоасовісатааг очі совоціавцах Есадсаавасадассзтдасстагчохгадатастаєстасоассваєосстодєстосаостагаєвас аїцавассацсссасазтасзадассУусстстоасаіасасстоаЧсасотссатоастоссЕссТОоОЧачаїсв чадасаєссоєтассссгсазсакЧчатачсізачсасекстсстастасавасачастадасаксссвася счезсчєсочЧасьссссааєчасучсоасачссосудасскасосьсссзастдчосазасачоаскаса. часчссассссстосестасасаЧчсчссссзсазсссазадоассусоасчесчасаєсаачаєсвасасасса тчатаасатсочігсааачісасачассчастагсасосцесвачессодсссаачсеЕтЧчачасчоачааця асстакетассассасаксссасчаіастсосвасаассосааосвассстатзчаавсастасаєссосса асскачасоссосовосазадстоассаасчассачсасссуссвасадостоавсасвесазсдасаате сазсозадуєтссасасодосачссавоаксусасазодсаєсоєсвзасассдасстстьсачсовсата Бстасссодачачоассоазувассвасавсаавчцоадістстасстсасаїсатсовсасоуаєсоабсасо азаесСегтассабассстсчастесоссзассасвосстсасссагтсосассатасссзсостодесасодеа своаасвссодастссадатасваєссвачасасозе са саасусагєсдадчазсоєцасодсачьд ссчгсагоЧеЧесесасоаасістадсастасісестсачастугсосчасетачаса сс ссоадчававчсаче Ес свасаасссаводсЕессастссочатасьдацасосацасоародасассаацчасдасьстьяес счасоччссорзгсазоаєсткасодрсссовобсасЧасассоссассосцаазстьсасавасауесааяад чЧчегссвпаассоуєсосавсоЧчессаессстососзавстцссоссассссвастачьоассвавасвоо ЕсовсєсассадчавчасєреЕстссаасаасастстсассоссвацоассссвасстссастосвзоастас ссостчсачіссазссачссавчасоЧсазаавсасостаєсососссгагсвоасасссадцоасасостсоа зчачрастсссаззаавоччасассазавацассассасазавазвасцчоссессассвабсясасавоцосч сабазсчссасЕсаєсуєстчасассоссаєудвадессасодесаєаоассастоасассваскаа

Фіг. ЗбА 5ЕО 10 МОЯ ПЦослідовзість білка КУЗВА щісвіУгрЕфасавяівіЧеаєвУуєчасвакідтійцідУувваудпакатчпідрарахеЧчійтікнеє тЧацчівіїгокідсаазпвісзспрапракцатупаайааосяацяповісссраузсявойнкоху узтіасутвуукаавірувичаєсІіпечадзаєтізєвецдвайтіріїінваковкатааіКктоссавпід к«кзаптаугакізет1вуекуїзУуїсввбеуазрпартквІрситовцавподатасачучупоцвпевьу мначкзадаіспзаіїзаутучецуєксппхавісвпУТЕйЙЧЕкЕсівБвіїнаїапизхпісроапківЕ вутусцісіччатепудоавутти1спзогаваєча1ідувоузвЕзгадаєєвадеадтудЕктєіваеу кКтеУурУувоУучеУкістакввкоувсаувачазреЕрівУКкпсІспакі вок ізтакарезеосєвуУуує хакаткуруроуазковокаарккас Кк кЕхозпозпкавваєвехсипозусьопсс

Фіг. 3685

КО НІ МО:43 Нуклеотидна послідовність для КУЗОВ, фермент СТ30 з Кихагінт реписіШоїйея агаваєсстттаєсстсгсоуссстсуєсоссесдачестсстадаствсцтоцчогуєсвастсуєсос ачсессссссасодасьсавасссавоастссядадесессасссссуссавсдчссасуєсазасасс ааазастечасуаас сво астссасвадесастосзасчовдссузачасаєсссьссазааачасоц сптасссазачаацачасссассасчрасточасеЕсЧес ці ссачсавоачасассчасосадУєтсоге таксстчечтаагчасаттодессовадсаасаостоссдасвацааст ссасввастсавссдачеса є тстсдсосадастсдсессодассавадессасастасчсстоачаатсдоастассчасачсоасвастсаосс ЧІсосутсаздавосасесаадзсвочагесчеаЧітесвсстасосчасчсткачососастостовсва сасдавдасавассасдаєцачааєзасоочвчсастевсасадедстасачасвоссасстасассо ссудсчастозЗавасваачсстасусачастасгсастусачгоаЧчостчачсессасосчдсаацсєсачуо чісаацассассвасстачцчасесстстазсчачсессаціссоассасксостасассоасасцесого жЕвасусасасасвочстассчасіссасасоасавасідзчсазцасаассачаааасчачцогсаєсссаса ассетсасзаєрсочсстостасчаксоцсчададссодддарссссазозачасаєсаєчасвачЕсЕдЧася чесадчдасстзакссосадсвассаастаессссаччсоссастасосасоаостасЧчвсссассассава ссагссустттсвасзасазацавчасогоасссассадаасадодстдахстсасазаассачексасце пессасасастссасвасаакачодчоассадчоадчавааазчсасааессддасточессасасссацасочеу сеггасачасассааєдссадсодсссссіоваксзоавссададесоазвасссудассассавсавуєсос тобоавссаасасдассуцссасвачоаєсасссстгсозачачасесточацссттсасавсстссаво чеасЕгассяоасстзчсоасуесЗЕсосвссоаацесасцчацокосостссстстассасзссачесса кЕЕстдаакєассдцасодсастассасоасосадвчіассоавасаасчасасвдс т астсасавсоєоса асісасбоаксосссточсвзсавсЧссчааассостсагсвоадстсааачесас іст гсассчатаваєсогаака аксгочастоассстодвачсастсцазодстастчазавцччасєсдікссадастасчатсостосгоецда ссср сачстсгостасадастЕсСтвасавацасвасассаст т узачаачасозастатовочЧчас тасЕксдатсзачісастасаєссвасастассвагсасавзассссссзасаассстассдачссчесе асетсаустсазссасусаасуїсакчсссацеіасоссоааацссоаассасосаваасвудстьсасава авссагресоачвагсгссасасчатсазсассстассуветессвсатасттаексотстстстсасстчи счаватаєчстзкегастваєссасачсссьссс

Фіг. З37А 5ЕО 10 МО:4 Послідовність білка ЕУЗІОВ кппрівічіваі1зіїдуудупЕтавїрсазпваваутівУупапУкпцез1дагЧавцаєцкаейіїчЧкКаз івхестоапузаї1т1ї5каїзавобвіїіспоїЧевопз5акпІнпвівертаровроаакрпуукнацуайватіє чуачеакскЕчікктусіачзарауткоппдеппцау1саУгсвасазадикцаауаау ії їсцьві уко УкоУкпідЕїіперагзаруацтівзпоасчавабікуїЧксікккц і наїсіассадесиді дцедттаціє зурарзіпуївуусоайоууврроврізсЕккЕбнітенадіс Чай врусбуйоздадедтенадткідчка ііайУзоє1іучідавпасїпзазїіптідактіроксЕкабавївулахтродазккісабивУуріуєсувв ЕїпсазеуасдуїспаєчапвчуцдіусваскторивікрЕ1бапазпаї1бс81квікассказеассірру віУвЕУКИКя

Фіг. 5378

ЗзЕО1О МО45 Нуклеотидна послідовність для КЕУЗ9А, фермент СНЗО з Еизатгінт тенісі Поїдех асєссастасоссасссестсассастссоагостацесеЕстсассассадаводусассдсаозасяадчасас зчсавстогсоавосєстосадааваєсаводассочесчаачуссскс ат есвоосттсасатасаось чусстсасаасзцаасавасуєсуасвсстсосабсассвчахтстовксоодєвзасосвсассозаакссавс сзазссасодчсачечосусссазваєсссаєссасезацссчачессасавас пас аставочатвассх соасссусЕссвасісаассостаїссаастатсосассасосусаастаравсястчастекаєствоє ЕдсоресаєдассьсточаусосячаєасацсазадуєсааасєссосцьЕссстадсдасває9ае заксадасідадаєспаноссассссоааєсачсствососссовсстовзадасссасавсатчстуза вчассстчічассчасчсссодаассвусоєкчЧчасакєдавассисгсазчассоасосаваоесовади ссесссвосзсвасзавсуєссасувесваассастссочЧесастсствосзстцаєссасбасчтаєтьао зу ззоасеЕЧассзЧчссааасгтачававнасастссссвазастоєссросачсуадсссачосагадсаса, ЕсстессоассссЧеЕсссагссасавасосатассточестесавссзасаассаоуєваєсзачасасисс стчакаєттасссстоасаєсачагєоодсосссдоачаасу дадеоддасацчсастаксссосасевх ассассттосадасосавс ас дос сссовадаадссває засо саагсазагсасастасасосяв гавоссававкіссацессвассссасстастасстсьсісаастазазсярсавравссьсвоваЧесько чечсагвастудчоаччсвоасочасстуасссссасазстчаасаласаастсдасегасадсастсассяці асетссочачцоадастсастассстаасочедаакодсаовсттасдаачьастасоасачесагадсвоу чсадЧчасастсосчассазачсагсогсочасттсазассєзасавосстсассассавосавоЯассака ачдасєсвасчассагсацесоасасавазассосєссаазчеаавоаєакаасаєсаааассвасачессосаа дусадсадуассесствачаєоацгасодкяаадаєссувдастсассоавтссуастодчстойдссогва тадчааазочсссасоацдцасессуссчастссозсодадчазчаацчівсастсахосовссаасасадузаєеса чосостстастсода

Фіг. З8А КО 10 КО:46 Послідовність білка КУА пруаєтієсіУтіатЕспуаваччосакУуйі1зкапоракаідзабіудеріпасвчасвіраятУКаВЇКЕп зпходзачірзіснасчдувауїдеЕпасізпуквсукупайтгі1і1рнііновасаддзпазреройп писешпе1іЄмаїтУуваікавоптіодцітзйтнперіазатнакризавівуупхаєкі1скВІрксі15а рашанйзріїіздакевПенісячаціиксураіїуавниціцанегеравсіваксктікацустрекрійуце уаатдечпрапвзуууїваівкнпікчікапичзоваївпчтопііузсгоєвечсуурпденсаукуу затацакічсказзЯа1ктаУутаєкасикікізїазсксудакупіківдізуауіркпцеУкУуксут Ей чадрачкУудорудіцеккує узапесУавра

Фіг. ЗЕ

КО МО:47 Нуклеотидна послідовийсть для ГУЗОВ, фермент СНІЯ з Кихатінт уепіснісійе» агахсадссзассаваЧчосьагессоссстсассоастсеоссссастоагтадвстостчасазососуксс сассассчастустсосстссзасасстзчадчачестовасагстсастасстоасаєсссасасчотатас чсзасчцасачоаассачассссачасчатоссстосвекЧассссодЧсессаастастасовасоавася ччсчосссавчссссссасдчасчсачссасуасчавасьсксоастсссацсасцсчесусдаавасосаса бзасаастасассяссасоасчссчесавсазсчдсасистоессастоастчавсчасстстдачасие тсзассцсбссковаасвасзасасстсасстуасссадасчахтазсочоссастаоісассосасзає запжуостеісаччасчастастоссвасаксазаачеасаасахчсвсодвачЧасесочоссасссвсават скоччаасзасассачачачочастоасссссспдоассзгаусагтчассвагаасттсачасачедЧоцс чоесдастаосассааєсссоазатаацтастачатассістозоасасочассодчаввасаасічастовоє вгссачсчЧасвесесесачачЧчасвосоабассчасасоссоадиассвасустечеачассачессчодчазса в асдаєсастацсодцасессаатодасссавессчесвзадаасазсоастосаєсссодассватасуса гачЗзсасчадаавазавдоастсавадссссаасігсоаадаасачстасоЧчезЕсстоасавсазасьстсвс тазвзасассЧЕсскессссзасассазассаасаєсзасцвасасастасчесесвасдлаасаачососсся ссачесстассогстодасстсссвагссЧчадсачесЧкаатостассуччиссЕсопсдасаазссоЧета чагадсастсгасєтесасцаєстідоассостадеіст сег ссаадосьдассосьсодаєтасчессо сасудчабассетоссавсцодадасьспочеоавтЧчеасавсівстассстсасвасаєдчассчодасаце зеасЕксоассєсвоачсаєсеЕтосовсодзадвостадасосстасосаасчасчаатастасвчсоасоє асадесадачьаскчессодосассаєсозсстасчассоусасстьахчасдучасаресьссадесь часадзачтбоачасстдссагсієстодчазсастссааЧчеітаосассгосаачсстастоуєовоасачоо агосоасасєсасауссацоатоацассоостсаччвсстчадівасстаєсооєсасастаєтацеавсцуї садцдєгассувдосаєвосаєсадастчаєчаєсчедастасасасусаєчачавчьксаваєтссач

Фіг. З9А 5010 кО:45 Послідовність білка КУ39В тегікасвуівааізстаайвроргіЯчЇз5провграпіавоііуспірадопоіїраазі5заксіпуукаЧя чаччейсЧизусачЧЕваегтевавнпуїУусктппоЧі м 1паїчагасваппасзюдройпуаиввуй КЕстЧаіїіапуккуптцедісіді«передустецевідЧци1іспидханнЧаєпаагойзУуїєварітва ероспддкчс:ччачіукппавірдодуанпееодузовпІеввуду ці Екудіроагаіпіпеуве п затрацзаїчізчЧрекупаїцдієчпи т да Чіпаіаазі15крарійуазечутападиеУуавууави тірддкУувсвуввацкійнуаєУуйєтаскагітасврогтасуйутеваікІіЧірввуєістксчикх атоваунузауавзрайтовучнсізгпадУуєірЕучіайуєтуанавкех

Фіг. ЗОВ

5КО Ій МО:49 Нуклеотидна послідовність ХупВ, фермент СНЗО з Тпеітоапаєтовостеь хасспатоїуйснт агаціааааа савацатасо аавазаєтстї цдагбдодсвала заїссассач Сеадасачада таєссчіЧчізач чдіасацдцаач чЕкапцассї дедебддсазла зацаціасає счасасеєта заасєкЧіЧа аапааайагсає ацчассїсаза сабасазово дЧасатачеоб ста чЧедас чаєадвсачеса бЕсСассчєЧча ддасчіваса досаасчаєс сваддссатє Єбасааєеко асчєасасаз згвчааєсЕв бсасеЕсаєте сеЕсчаваєсач чоагавотсесс асстоассодва чесчаакЕїа Босскаана астаасаєсо сдсгбасасадцда сачдбасєсса стодаачова закуєсассс сесссавача Ібаєцазава годацсваєс їбаєяднадо ЄЧЕЕЧЕБЕса састсвагаї свзачстасся сасачаєсава чіодсаазаї здассаєсєєєчЧа забасодває цачессавасс Єзазвачаоєї єбодазасає Чсідаєсдача азувасассє саачеваєас ззацЕсасто свавадсЧчаї гзаачазоаба аасцацзааєє гоасаузсадо асавост ос акахтасачЕчЧ чЧсдссдаста студасачаа часткова агсестоста сдазвазаваєт чЧчеЕгсссевасту акттгсціаїс Чссчасасцеа габасусста адсазоцчічЧа абабассеса саєстсаєбає ассваацачає сабоуссассє дЧчавзсасаєсує сСазасявасє сайавасачет ачасадасєса саазазастіс асаєєєксосу аасссссоде сесататазс чавзабасаає зсассрсаса одсссаєтава їссестасаї саїасуєстть єсСаахаедає сасстєЧеч ачдаєсЕсаа чЕЧаацачсоач ачаєссаєасєє частсаюьсе ссстастоцЧає ЗзсЕсСачечає чаЕЧЕстодвад заайсасаєве чесаачассея сачЕстсабєч чацчаксбоч аставуаєтцса сЕсаасзада бассвазваєсє частсіїсво асЧсстізаає ЄС сласцс багцоачадава пацабчессе асачачасаа ссасасцчекто асвассазаа чоччасчасча чЕсЧаїсоса жЕЕСЯЕСсасТ хе здчазх:Ччачах аасчосвучуааа асачЧазааіс сачастаачча агасчаассу Чдааакаєстс Саачаєссая аЧчабсасоссс асазадавас азаєчатача Єцзочаксас пчсаассоссЄ сдчобасаєу часасасабса чдуаацоссча дає ссосваєд бавадаасва агбаачастх гавочаатає тїсаадачесі аазаассвава сасоцтачецче сасаєсазає часочегата Кааасссдаа абссачаста чудзааааєу сеосачкасє аеесдватса асславобаа Созасєдаасс ааасасттає абасдчассу абчасачева чатавасода баса

Фіг. 40А 5ЕО ТО МО: Носліловність білка Хуп МІКУВУРОКб ОККЕбОВИВУ СУСТОКОСЬА ГОКЕТІТЕТОК УУКЕМІОЕКУ тВБНСЬОСПО увів рУууз ВЕУКРЕУМЕЖ ХІОВІКОБОЕІ БІСІВРЕУБІ ЗЕМРЕКБАБО ТОТУКУМЕОМ УТЕРРКОХЕКИ ЗОБУКАУЬНН ЕТОВУСІЕБВУ ПКМРЕБІМНЕ РМОКЕКМКОВА ОЕКЕЖЕКИУК УТАКАЇКЕУМ ЕМОКУССРАТЇ СОСАОУМІВЕО КЕБМЕСУВБЕМУ РУОБУБВНАТ ТЕКОСЕХТРН ПІУОБІМВОЕ ТМОМЕЕКТУМ ЕШІТКМБНЕРМ ПОРЕНІТВУМІ ЗУБРОМРУНО ТЕЕМААУТАН ІБ5ЕССОУМО ЗЕБУКТЕБОУ ЕЕБЕОУРЕОО РНОСЕСЬУАІ ММІРКРТЕУТЇ ЕКЕКМАМОВЕ МмОтКкОЕНМІОУ ТВВОБОБУАЇ ТАММеУМОКІ ЕМЕОЕВУЕУЮ ІРУВЕВОУКІ КВОБІОЕЕНО МЕКОСТИЇТНМО КРЕУРБКЕОМ МТЬБВБЕУАКРЕ ІМТБОРМАМО ООМОКЕКЕО КМАМУБТЕЬТ ЕВірЕББЗТУІ сБОоББКІМОУ

Фіг. 4ОБ

ЗО НО МО:25 Нуклеотидна послідовність ХУ, фермент СН з беофасійну згеатоїпезторп и». абуссавсса агоабаїсевІї слаасасссає сасєбсассод ЕсаддасеЧЕв бассазсеее зсостачеачЕ сЕосудував аачозчузуча ссууаствуд авасссасосво ассуссаєуа овааваєціст сао дсаєЄ ЧадссчЧесу сагуадесуч частоваєсса такостесза Ебсссуцчава сечсадусча зЗзЧчабдазадо азассатаєє асасєувава бсоссдабссу зассодсказ аасоваасає Єсссаєсссу Сссусцааад вучзадаєсва досусчааєсо: сесасчаспсаа сзуздавстасасу чЧазачебсотф тасскаасяє бБбасчатька сбсоссачеиа авчасассас січассосЧа аасацевзччес пачачзадазо бсаачесоде зо ссса ЧпекчссаксвЯ ссуачаїчас дассосаїзває васоувасоцая савацдазасася асоазасчсЕЕ СссочасссЯа аадасвосяа сссчсатрасс бсзасасаце сдзЕсцлаєча сасасасспу сазссосусч саусссочеса адосдсочає Єсодуасаєсвя басссавчаа сдачачеаве сустсзусус спсаєстсктїад сабодадзчаї агсїсгаасуд сдасеьстьсоа зсазазссоу асзкссєсяде ксСосчавац сещшЕцеаЕка ассасеідава ЄдссоЗсЯча адчдазваццава зсадсаєсаває сЕЗзевавссу БЕ асоде дача бЕассусачея вабаЧаєаес жсСЕБатЕссв асасосассї стбссзїзає аєсчазцаач Есдчайссеєсса Єзсзквадчаа сацуссдачуеа сЧсгзазоадча зЗесаучсуєєс сугесддаака азоссарсца зазадзаєцє сгсссецчаєз абсазвачсї сабзабоцЧод сасуєцаєсс дозастасса гоодсавсаса сазссцеїса васаїцакод аазосодаєс содууссуєса агдазаасуа пбсассоваєу асуаасасує Ессаїсссас сассдассач сс та адсєлаааає чЧаасссосуч асосчізЗаєаа агабсасссда сеЕебаєубс Задсасіаса зстаєдвоада сс сеце тЕсссяочвч асадацасчча згайсссудс засаєссзасї Єсассозсоса сабоаачозцс чЧчеїаасасЯчс гстсоеочвссо Чесаїссастся ссабсаєчЧаче басбзсоадчдааї саФфодаст ус стєтсоадсаба ЄЧасусасца асадсссаєєс аасоюрюкаєс Екс дсчсцодє чзататасако уувзасзаасуа аачастчаос агодсоуєсове одасочесва сузесеісЯце всазбаксво чуазацсагсчу гЕчЧечссасда ссабссодчає сосводладвас чдазасудасої чага асЕ часацеассо чдсассаєчеєб хачадсочав агсасазеяє акєсаєсаФсЕсб дача ссс сЕсоддосаца сусасазсав сага со дозадазазі осБодастао ставасчосо сЕСЯЧвааачі УС ссосча сЯаксадсзаа ЧазазассоЯ сіусаєсаЯдчс авадасвосач чсчцававає чеуссуєсдає засєсцссаче сазсаєцасоч аоддасззуба сажссосадсс чЕчЧчассЧасад зезуаааєсда стсзазаасс аєбссЯадеса стоадуЗасє бчусЧчветося тасЕссасцча астдссасцча зузсостазув уаацаєсочає че Уцчача ставка су Чевсосдссчас азасаттіссса атаєзеоско судузачудаа СЕЕвоставт ссесдуаєсааа ччаїсоцаваа ЕбЕосісдас аачдовасаає єсубоЧЕсса зсадаассБа стбасцссад сг ссс чаосоадсасКЄ адаЗкуЯддаа суусагугаає заацдазааасу аосідатаса чЧсессасзсса сусадсессас чсабсседасу суссссасїє зусчачесвоаодад сдассаватх аксасодасо заассадсзЗу сачсавасас бассгасоаса чсусзасчвая сасєссваєеу Евосазчозод судааєоа

Фіг. АЛЛА ОО МО:50 Послідовність білка ХА прЕВІЖєпай вврууабавї сізїроквоч 1Я1є1ідхрок дле1іїдуєві певаіуйпіїр Еіебсваесдез кЕкуйівепроар проакрпіїїр Бакевіскеї Пптасасиках Я1БЕБіувру Ккатурпресай еевікіаїур ачісстсійп спобхахтгаї ЄЧдбедварує зтехідаєсьо цісцЧцУучаицЕії ї5їУвкаеоао кваїйЕвтей і1їісацієестй сСЕсїічкчцаї зУчУурачеке БучЕасстук чзаучтачийа ЗУЖУЄСЕЕЧО іїееуцчіузів чпаехіквабзї сзпкіївекаю івадоаєЄєтта ВаіїгвУуудчнє «іІвнедкрі чттУупечеукєт пт ЯаїсУуайа 1гЇІвікіпри туУукпуідіух егувуєйстк Жрадвесеураз 955 Натух апсевкопуз вувіуЧівас Евппелеціє пхісааууї езЕкакаюа кгівізївосі евтухкапра редкодутаї ЯаскЕстоадае їістуавійхв іаЧдакппіуї ауксчазлутуа 1іекібЄгйучк ееіазіздеч зексазкічв пУусабоуїра ітуєезповкі іраїєчіутр уєсповпеаій епугтдауїч зісппіЧуті кеісіграз Ч«ківяеєвоа вмівкіутсц Єїаєніїдне «Зецдуктгайа апчтачіспро їівієчвиваді іздеісовку ургдуєвії" 16гечае

Фіг. 416

ЗКО І МО:53 Нуклеотидна послідовність ХУ, фермент СН5Я з Тгісподеттиа Копінвії (Пуростей Копінрі) шо шо АТОСІСТОСААСОСТСОТАТСАТОССАССОСОСІСТАТТОСТОСАСОСТСТСТоСТТОосТ ССТОСОССТІСТСАСАТСТАСТССТООСОСОСААСОССТТОССІТОССОСССАСАССАСС АСТОСОДОСТОоТОСтТТСАОСОСТТАТАССССССССТТАТАССАССТААДОСОССОССТОСОСАТ ССТСССАСААССОССАТАТОСССОССТОТСААСТОСТОТОСССААСОСТОССССТСАВСАТ ОСТТТСТаТОСОСОДАСТАСАТОССТОАТТАССАТСАТАТАССАССАСстТоСоСТоВОсоВС ААССАТСТСАОССАВОССССоСССООоССССТІСАСССОСССОБААТССААССОСТАТОДС ААССТООСТАСТОСААТТОССОССССОСТААСАСТСААСОСССАСААСОССТАТОСАСТХ ТІССТОТСТОСАССААСОСОСТАТСОСААТААСОСТОССАССБОСАСАСССАДАССАСАТ СССОСОСАССОСАТОТАТОСОСІТСТССАТОСТАСАСАСТАСАВССсооСОоССТССТОСТІТ САСТАТООСЛАСОСССАСАССААСАСССОССАТАСАСОСААСОСІСАТАТОСАОСССАТО ТАТТІТСОССАСАССАСТСТСТОСССТАСТООСТОАОССААОСОТОСОТОоСАТСАТоССТ САТСТІССАСАДССОСТІСТІСТСАСССТОСАСТОСССООСААСААТОоССОСТОАТоСсТоС АТСТОСТАССОСТІССТСАСТОСАСССАТСАВАСОСССАСССАЛАССААТОСОСААТОСОТ ССеСОССААТССІОСССТОСТООСТСОСТОТСААСТТТСТАСАОССОСОСТОССССАСАдсТе ТОСОСАТАСААТССБАТОАССАДАСАСОССОССАТСАТТСТОСООСАТТОССООСБАСААС АОСААССОСССССАССССАСАТТІСТАТСАССОССТСАТСАССІСТОСАТАТССТТОССАТ ССААСАСАСААТТСАСТОСААСССААСАТСОТАССТОССА

Фіг. 42А ЕС МО:54 Песліцовність бінка ХУП МЬЯМАВІІАА ОСІДАСЯБУА АСРСОІХБЯС ОТРСУДАНЯТ ТЕАБЕБАХТЯ РОХОУКВОВО САТТАТЯРЬО ЗСУАМАААОЮ АЕСАЄТТСЬІ ТІТУрОЗОВО МНБВЕАВРОС ЕБОРЕЗМОТО МОАЗАЇСАРУ ТОМСОКдУСУу БУЗЕСТОХВМ МАЛОСТАКСО ААКСМУДІЛО ОТНУМОАССЕ ПУСМАБТМБВ ОТОМОНМЕАЇ УКООЗТУМСТ ОЗСКСРМІМА ВІЖЕМСЬКОб5 ВРОММАСВРО ІБУВЕУТААТ КООРМОМАЇВ ОСМААБОСВЬО ТКЕУЗСАВРОУ ЗСУМРМУКЕО АТІБОТОСОМ ЗМОСОСТЕХЕ СУМТОСУРЯЮ АТЕМЯУОАМІ УДАВУАУАРІ. ТЗОРАБТУСЯ ЗІЗЬВАТТАС СТІВТІАНОС СТУМТОУУВО 55АТАБКОСА БИТУКАСЬАМ МАСЕВКЕ5ОЮ ТВОЗУІВНЗМ ЕСІЛЛІМАМОС БКІКАЕСАТЕ СТОАСІМСОО З5ІВ5МИЗУРТ ВУКВНУММТ; ХІАВМОбУНУ ЕПАТАДЕМОЮ УБЕУМОВООСКА

Фіг. 4285