JP2022126959A - リグニンを含有する酵素組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、セルロース含有バイオマスに対する吸着性が低減した酵素組成物を提供する。【解決手段】ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有する未使用のセルラーゼ、リグニンおよび水を含有する酵素組成物であって、前記セルラーゼおよび前記リグニンは水に溶解し、ブラッドフォード法で測定される水溶液中のタンパク質の質量に対する前記リグニンの質量比率が１以上である、酵素組成物。【選択図】なし

Description

本発明は、セルロース含有バイオマスに対する吸着性が低減した酵素組成物に関する。

近年、エネルギー消費量および環境負荷が少なく、かつ糖収量が多い方法として、セルラーゼを使用したセルロース含有バイオマスの糖化方法が広く検討されてきた。しかしながら、バイオマス中に含まれる結晶セルロースは、難分解性の不溶性基質であり、またバイオマス中に含まれるリグニンは、セルラーゼを非特異的に吸着させる性質を有している。そのため、セルロース含有バイオマスの分解には多くのセルラーゼが必要であり、糖製造工程におけるセルラーゼ費用が高くなるという課題があった。

上記の技術課題を解決する手法として、セルロース含有バイオマスの糖化反応後に、上清中に遊離しているセルラーゼを回収して再利用する方法が検討されている。例えば、特許文献１では糖化残渣に吸着した酵素を上清中に遊離させるために、無機塩類を添加する方法が開示されている。また、非特許文献１においては、セルロース含有バイオマスをセルラーゼで糖化反応させる際に、広葉樹木のエタノール熱抽出物に由来する非水溶性リグニンを添加することで、セルロース含有バイオマスに対するセルラーゼの吸着性をわずかに低減させる方法が開示されている。

特開２０１５－１５９７５５号公報

Ｃｈｅｎｈｕａｎ Ｌａｉら、"Ｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈａｒｄｗｏｏｄ ａｎｄ ｓｏｆｔｗｏｏｄ ｏｒｇａｎｏｓｏｌｖｅ ｌｉｇｎｉｎｓ ｏｎ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ" Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）Ｖｏｌ．１６３、３２０－３２７

セルラーゼの活性を低下させることなく、セルロース含有バイオマスに対する吸着性が低減した酵素組成物を提供することを課題とする。

本発明者らは、セルロース含有バイオマスに対するセルラーゼの吸着性をさらに低減させることができれば、セルロース含有バイオマスの糖化反応後により高い効率でセルラーゼを回収することが可能になると考え、鋭意検討を行った。その結果、ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有する未使用のセルラーゼとリグニンとが溶解した水溶液の酵素組成物を調製すると、セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性は酵素組成物の調製後も維持されることがわかった。さらに、調製した酵素組成物で糖化反応を行った後にも、糖化反応後の糖化物回収したセルラーゼには、ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性が高く維持されていることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）～（４）で構成される。
（１）ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有する未使用のセルラーゼ、リグニンおよび水を含有する酵素組成物であって、前記セルラーゼおよび前記リグニンは水に溶解し、ブラッドフォード法で測定される水溶液中のタンパク質の質量に対する前記リグニンの質量比率が１以上である、酵素組成物。
（２）前記水溶液のｐＨが６以下である、（１）に記載の酵素組成物。
（３）（１）または（２）に記載の酵素組成物を用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
（４）前記糖化物を固液分離してｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有するセルラーゼを含む液成分を得る工程を含む、（３）に記載の糖の製造方法。

ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有する未使用のセルラーゼ、リグニンおよび水を含有する酵素組成物を調製すると、セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性は酵素組成物の調製後も維持される。さらに、調製した酵素組成物で糖化反応を行った後にも、糖化反応後の糖化物回収したセルラーゼには、ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性が高く維持される。

本発明は、ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有する未使用のセルラーゼ、リグニンおよび水を含有する酵素組成物であって、前記セルラーゼおよび前記リグニンは水に溶解し、ブラッドフォード法で測定される水溶液中のタンパク質の質量に対する前記リグニンの質量比率が１以上である、酵素組成物、および当該組成物を用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む糖の製造方法である。

本発明で用いる「未使用のセルラーゼ」とは、糖化反応に用いられていない状態のセルラーゼを指し、具体的には、セルラーゼの基質と接触していない状態のセルラーゼである。セルラーゼの基質としては、セルラーゼの糖化対象となるグリコシド結合を有するセルロースやヘミセルロースなどの糖類の他、これらを含有するバイオマスも含まれる。したがって、糖化反応後に回収されたセルラーゼは、本発明の「未使用のセルラーゼ」に該当しない。

一般的にセルラーゼとは、セルロースを加水分解する酵素群の総称であるが、本発明で用いるセルラーゼは、ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有することを特徴とする。ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解するセルラーゼの具体例としては、エンドグルカナーゼ活性および／またはセロビオハイドロラーゼ活性を有するセルラーゼが挙げられる。また、本発明で用いるセルラーゼは、エンドグルカナーゼ活性および／またはセロビオハイドロラーゼ活性に加えて、エキソグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、キシログルカナーゼなど、一般的なセルラーゼに含まれる酵素活性が含まれるセルラーゼであってもよい。

エンドグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の中央部分から加水分解することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

セロビオハイドロラーゼとは、セルロースの還元末端または非還元末端から持続的加水分解を開始し、セロビオースを放出する酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドロラーゼに帰属される酵素群が記載されている。

エキソグルカナーゼとは、セルロース分子鎖の末端部分から加水分解することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．７４としてエキソグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

β－グルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβ－グルコシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。

キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

β－キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてβ－キシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。

キシログルカナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシログルカンに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４またはＥＣ３．２．１．１５１としてキシログルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。

ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドの分解活性の測定には、本発明の酵素組成物を適当な濃度に希釈した酵素希釈液１０μＬを１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに添加し３０℃で６０分間反応させる。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。活性は、１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する酵素量を１Ｕと定義する。上記酵素活性の測定方法で、酵素組成物調製後のｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドの分解活性として０．００１Ｕ／ｍＬ以上の活性を有することが好ましい。より好ましくは、０．０１０Ｕ／ｍＬ以上、更に好ましくは、０．０２５Ｕ／ｍＬ以上である。

また、本発明の酵素組成物を調製する前の未使用のセルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドの分解活性は、酵素組成物を調製した後も高く維持される。具体的には、調製前の９５％以上の酵素活性が調製後も維持されている。調製の前後の酵素活性の確認も上記の方法で測定すればよい。

上記の各種酵素は、ゲル濾過、イオン交換、二次元電気泳動などの公知の手法により分離し、分離した成分のアミノ酸配列（Ｎ末端分析、Ｃ末端分析、質量分析）を行い、データベースとの比較により同定することができる。

本発明で使用されるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有するセルラーゼは特に限定されないが、例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｈｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの糸状菌由来セルラーゼを用いることができる。また、これら糸状菌に変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理が施された変異株由来のセルラーゼであってもよい。

糸状菌は、培養液中にセルラーゼを生産するため、その培養液をセルラーゼとしてそのまま使用してもよく、公知の方法で精製し、製剤化したセルラーゼを使用してもよい。

本発明において、水溶液中のタンパク質の質量は、ブラッドフォード法によって測定する。

本発明の酵素組成物は、前記未使用のセルラーゼとリグニンとが溶解した水溶液であって、水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が１以上、好ましくは１～２５、より好ましくは６．３～１２．５であることを特徴とする。

前記水溶液中のリグニンの質量濃度は以下の通り測定を行う。水で適当な濃度に希釈したリグニン溶液の２１０ｎｍにおける吸光度を測定する。クラフトリグニン（シグマアルドリッチジャパン製）を標準物質とし、検量線に基づいて溶液中に含まれるリグニンの質量濃度を算出する。

前記水溶液のｐＨは特に制限はないが、好ましくはｐＨ６．０以下、より好ましくはｐＨ３．０～６．０、特に好ましくはｐＨ４．０～６．０である。

前記リグニンは前記水溶液に溶解しうるリグニンであれば特に制限はなく、試薬のリグニンを用いてもよいし、バイオマスから調製したリグニンを用いてもよい。

試薬のリグニンとしては、シグマアルドリッチジャパン社製のクラフトリグニンが挙げられる。

バイオマスからリグニンを調製する場合には、以下の方法でリグニンを調製することができる。最初に、バイオマスをアルカリ性条件下で熱水処理する。例えば、バガスを０．５％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウム水溶液に浸し、９０℃で２時間加熱処理後、放冷する。続いて、得られた熱水処理液を固液分離し、液体画分（以下、アルカリ処理液と記載する場合がある）と固形物（以下、アルカリ処理バガスと記載する場合がある）に分離する。次に得られたアルカリ処理液に１Ｍ希硫酸を加え、ｐＨを５．０以下に調整し、遠心分離して上清を回収、回収した上清をリグニンとして本発明の酵素組成物に用いることができる。その他、上記アルカリ処理液に１Ｍ希硫酸を加え、ｐＨを５．０に調整し、遠心分離して上清を回収後、回収した上清に１Ｍ希硫酸を加えｐＨを５．０未満に調整した際に沈殿するリグニンは、本発明の酵素組成物に使用することができる。例えば、上記のアルカリ処理液のｐＨを５．０に調整し、遠心分離して上清を回収した後、さらに１Ｍ希硫酸を加え、ｐＨを４．０に調整した際に沈殿したリグニンは本発明の酵素組成物に用いることができる。

本発明の酵素組成物に用いるリグニンの原料は特に限定されないが、例えば、バガス、稲わら、モミなどの草本系由来、スギ、ヒノキ、マツなどの針葉樹由来、ブナ、ナラなどの広葉樹由来のリグニンを用いることができる。

前記リグニンの分子量は特に限定されない。なお、リグニンの一般的な分子量は、数千～数百万程度である。

本発明の酵素組成物には、未使用のセルラーゼ、リグニンおよび水以外に、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤などが添加されていてもよい。ただし、セルラーゼに吸着する物質や、上記のセルラーゼの基質となる物質を含まないものとする。セルラーゼに吸着する物質の具体例としては、セルロースやヘミセルロースなどの多糖類、水に溶解しない固形のリグニンの他、これらを含有するバイオマスなどが挙げられる。

本発明では、本発明の酵素組成物を用いてセルロース含有バイオマスを糖化して糖を製造する。本発明の酵素組成物は、糖化反応を行う際に用時調製してもよいし、あらかじめ調製し糖化反応に用いてもよい。あらかじめ調製する場合には、調製した酵素組成物が安定する条件下で保存することが望ましい。酵素組成物を保存する際の温度およびｐＨは、特に限定されないが、酵素の失活および微生物のコンタミネーションが抑制される、１０℃以下およびｐＨ３．０～６．０の範囲が好ましい。

本発明で用いるセルロース含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実穀、パーム殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスを挙げることができる。セルロース含有バイオマスは糖から構成されるセルロースおよびヘミセルロースの他に、芳香族高分子であるリグニンなどを含有しているため、前処理を施すことにより本酵素組成物による糖化効率を向上させることができる。セルロース含有バイオマスの前処理方法としては、酸処理、硫酸処理、希硫酸処理、酢酸処理、アルカリ処理、苛性ソーダ処理、アンモニア処理、水熱処理、亜臨海水処理、微粉砕処理、蒸煮処理などが挙げられる。

本酵素組成物による糖化反応の温度およびｐＨは特に限定されないが、本酵素組成物に含まれるセルラーゼが高活性を示す４０～６０℃、および、ｐＨ４．０～６．０の範囲であることが好ましい。なお、糖化の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。また、糖化反応の時間は、十分な糖化物が得られ、本酵素組成物の活性が低下しない範囲であれば、特に限定されない。

本発明では、本発明の酵素組成物を用いてセルロース含有バイオマスを糖化して糖を製造した後、セルロース含有バイオマスを糖化した糖化物を固液分離してｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有するセルラーゼを含む液成分を回収すれば、回収した液成分をセルラーゼとして再利用することができる。固液分離の方法としては、固液分離はろ過や遠心分離など任意の方法で行えばよく、フィルタープレス、スクリューデカンタ、連続遠心分離機などを用いることができる。また、固液分離後の液成分を限外濾過膜に通じて濾過することで、透過液として糖を回収し、非透過液としてセルラーゼを回収することができる。

本発明の酵素組成物を用いてセルロース含有バイオマスの糖化を行えば、糖化反応時のセルロース含有バイオマスに対するセルラーゼに対する吸着性を低減させることができる。そのため、糖化反応後の糖化物からセルラーゼを高い収率で回収することが可能となる。さらに、回収したセルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性も、高く保持されている。具体的には、本発明の酵素組成物を用いない場合に比べて、酵素回収率が２％から２５％程度向上する。

酵素組成物に含まれる前記セルラーゼの回収率は、上記の方法を用いて本発明の酵素組成物に含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性と、本発明の酵素組成物を用いてセルロース含有バイオマスを糖化した後の回収セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を測定して、それぞれ活性の測定結果を下記式（１）に代入して、酵素回収率を算出する。ただし、回収セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を測定する際には、酵素組成物に回収セルラーゼの容量を水で合わせて測定する。

酵素回収率（％）＝糖化反応後の回収セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性（Ｕ／ｍＬ）／本発明の酵素組成物に含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性（Ｕ／ｍＬ）×１００ ・・・式（１）。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。

＜参考例１＞トリコデルマ属由来セルラーゼの調製
以下の試験で使用するセルラーゼは、市販されている酵素製剤以外は以下の方法により調製した。

（前培養）
表１の組成に従って調製した前培養培地１００ｍLを５００ｍL容バッフル付き三角フラスコに入れ１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。この前培養培地にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＰＣ－３－７株（ＡＴＣＣ＃６６５８９）の胞子を１．０×１０⁵／ｍＬになるよう植菌し、２８℃、１２０ｒｐｍにて７２時間振盪培養を行った。

（本培養）
表２の組成に従って調製した本培養培地２．５Ｌを５Ｌ容ジャーファーメンターＤＰＣ－２Ａ（ＡＢＬＥ製）に入れ、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。放冷後、前記の方法にて得た前培養液を２５０ｍＬ接種した。その後、２８℃、７００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍにて９６時間深部培養を行った。その後、得られた培養液の固液分離を行い、その上清を孔径０．２２μｍのフィルターで濾過して精製した。得られたろ液は、トリコデルマ属由来セルラーゼとして以下の試験に使用した。

＜参考例２＞セルロース含有バイオマスとして用いるバガスの前処理
糖化反応の基質であるセルロース含有バイオマスとしてアルカリ性もしくは酸性条件下において熱水処理を行ったバガスを使用した。バガスを０．５％（ｗ／ｖ）水酸化ナトリウム水溶液に浸し、９０℃で２時間加熱処理した。放冷後、固液分離を行い、アルカリ処理液とアルカリ処理バガスに分離した。ここで得られたアルカリ処理液およびアルカリ処理バガスは、以下の試験に使用した。また、バガスを１．８％（ｗ／ｖ）希硫酸に浸し、１２１℃で３０分間加熱処理した。放冷後、固液分離により固形物を回収した。ここで得られた固形物を希硫酸処理バガスとして、以下の試験に使用した。なお、前述の前処理を行っていないバガスは、平均粒径１００μｍに粉末化したものは未処理バガスとして以下の試験に使用した。

＜参考例３＞バガス由来リグニンの調製
参考例２で得たアルカリ処理液に１Ｍ希硫酸を加え、ｐＨを５．０に調整した後、遠心分離により沈殿したリグニン（以降、非水溶性のリグニンと表記）と上清を回収した。次いで、得られた上清にさらに希硫酸を加え、ｐＨを４．０に調整した後、沈殿したリグニン（以降、バガスリグニンＡと表記）を遠心分離により回収した。最後に、得られた上清にさらに希硫酸を加え、ｐＨを１．０に調整した後、沈殿したリグニン（以降、バガスリグニンＢと表記）を遠心分離により回収した。ここで得られたリグニンは、バガス由来リグニンとして以下の実施例に使用した。得られたリグニンは、水で適当な濃度に希釈し、２１０ｎｍにおける吸光度を測定した。クラフトリグニン（シグマアルドリッチジャパン製）を標準物質とし、検量線に基づいて溶液中に含まれるリグニンの質量濃度を算出した。

＜参考例４＞セルロース含有バイオマスの糖化反応
糖化反応の緩衝液として１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）、バイオマスとして、前記の方法で得たアルカリ処理バガス、希硫酸処理バガス、または未処理バガスをそれぞれ固形分重量で５０ｇ／Ｌとなるよう添加し、セルラーゼを０．４ｇ／Ｌとなるよう加えた。糖化反応は５０℃で２４時間行い、糖化物を遠心分離した上清を糖化液として回収した。糖化液は、参考例５では酵素液として使用した。

＜参考例５＞セルラーゼ活性の測定方法と酵素回収率の算出
酵素活性の測定には、測定対象となる酵素液を適当な濃度に希釈した酵素希釈液１０μＬを１ｍＭｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシド（シグマアルドリッチジャパン社製）を含有する５０ｍＭ酢酸バッファー９０μＬに添加し３０℃で６０分間反応させる。その後、２Ｍ炭酸ナトリウム１０μＬを加えてよく混合して反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度の増加を測定する。活性は、１分間あたり１μｍｏｌのｐ－ニトロフェノールを遊離する酵素量を１Ｕと定義する。酵素の回収率は、酵素活性の測定結果を上記式（１）に代入して算出した。

＜参考例６＞水溶液中のタンパク質の質量濃度の測定
タンパク質の質量濃度は、Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｂｒａｄｆｏｒｄ プロテインアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）２５０μＬに、適当に希釈した測定対象のタンパク質溶液を５μＬ加えてよく混合し、室温で１５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度を測定した。牛血清アルブミン溶液を標準液とし、検量線に基づいて水溶液中のタンパク質の質量濃度を算出した。

＜実施例１＞水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が１以上の酵素組成物
参考例１に記載の方法で調製したＰＣ－３－７株由来セルラーゼと、クラフトリグニン（シグマアルドリッチジャパン）を水に溶解し、水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が１．３～２５．０になるようにそれぞれ調整した。さらに、水溶液のｐＨを５．０に調整して、本発明の酵素組成物を調製した。また、ＰＣ－３－７由来セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性は、酵素組成物を調製する前後のいずれにおいても０．０７５Ｕ／ｍＬで変化がないことを確認した。なお、酵素組成物を調製する前の酵素活性については、調製後の容量に合わせて酵素に水を添加して測定した。調製した酵素組成物を用いて参考例２に記載の方法で調整した未処理バガスをセルロース含有バイオマスとして用い糖化反応を行った。糖化反応は、参考例４に記載の方法で行い、糖化液を回収した。糖化反応前の酵素組成物と糖化液に含まれる酵素活性を参考例５に記載の方法で測定し酵素回収率を算出した。その結果を表３に示す。

＜比較例１＞水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が１未満の酵素組成物
参考例１に記載の方法で調製したＰＣ－３－７株由来セルラーゼと、クラフトリグニン（シグマアルドリッチジャパン）を水に溶解し、水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が０、０．３、０．６になるようにそれぞれ調整した。さらに、水溶液のｐＨを５．０に調整して水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が１未満の酵素組成物を調製した。また、ＰＣ－３－７由来セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性は、酵素組成物を調製する前後のいずれにおいても０．０７５Ｕ／ｍＬで変化がないことを確認した。なお、酵素組成物を調製する前の酵素活性については、調製後の容量に合わせて酵素に水を添加して測定した。比較例１で調製した酵素組成物を試験に用いた以外は、実施例１の同様の条件及び操作で試験を行い、酵素回収率を算出した。結果を表３に示す。

表３の結果から、水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が１以上の酵素組成物を用いた場合に酵素回収率が向上し、質量比率が１未満の酵素組成物を用いた場合に比べて、酵素回収率が最大で約１３％向上することがわかった。

＜実施例２＞クラフトリグニンを含む本発明の酵素組成物と各種セルロース含有バイオマスの糖化反応
参考例１の方法で調製したＰＣ－３－７株由来セルラーゼと、クラフトリグニン（シグマアルドリッチジャパン）を水に溶解し、水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が２．５～１２．５になるようにそれぞれ調整した。さらに、水溶液のｐＨの５．０に調整して本発明の酵素組成物を調製した。また、ＰＣ－３－７由来セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性は、酵素組成物を調製する前後のいずれにおいても０．０６１Ｕ／ｍＬで変化がないことを確認した。なお、酵素組成物を調製する前の酵素活性については、調製後の容量に合わせて酵素に水を添加して測定した。調製した酵素組成物を試験に用いて、参考例２に記載の方法で調製した未処理バガス、アルカリ処理バガス、希硫酸処理バガスをセルロース含有バイオマスとして用い糖化反応を行った。その他は、実施例１と同様の条件及び操作で試験を行い、酵素回収率を算出した。結果を表４に示す。

＜比較例２＞リグニンを含まない酵素組成物を用いた糖化反応
クラフトリグニンの代わりに水を用いた以外は、実施例２に記載の方法で酵素組成物を調製した。セルロース含有バイオマスとして、参考例２に記載の希硫酸処理バガスを用いた。その他は、実施例２と同様の条件及び操作で試験を行い、酵素回収率を算出した。結果を表４、表５に示す。

表４の結果から、本発明の酵素組成物を用いて未処理バガス、アルカリ処理バガス、および希硫酸処理バガスを糖化した場合、リグニンを含まない酵素組成物を用いた場合に比べて、酵素回収率はそれぞれ最大で１５％、７％、および１０％程度向上した。したがって、本発明の酵素組成物を用いて糖化を行った場合の酵素回収率は、バイオマスの前処理方法に依らず向上することがわかった。

＜実施例３＞各種リグニンを含む本発明の酵素組成物を用いた糖化反応
参考例１の方法で調製したＰＣ－３－７株由来セルラーゼと、リグニンとしてクラフトリグニン（シグマアルドリッチジャパン）、参考例３に記載の方法により調製したバガスリグニンＡ、またはＢを水に溶解し、水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が２．５、６．３、１２．５になるようにそれぞれ調整した。さらに水溶液のｐＨを５．０に調整して、本発明の酵素組成物を調製した。また、ＰＣ－３－７由来セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性は、酵素組成物を調製する前後のいずれにおいても０．０６７Ｕ／ｍＬで変化がないことを確認した。なお、酵素組成物を調製する前の酵素活性については、調製後の容量に合わせて酵素に水を添加して測定した。調製した酵素組成物を用いて、参考例２に記載の方法で調製した未処理バガスをセルロース含有バイオマスとして用い糖化反応を行った。その他は、実施例１と同様の条件及び操作で試験を行い、酵素回収率を算出した。結果を表５に示す。

＜比較例３＞ｐＨ５．０で非水溶性のリグニンを含む酵素組成物を用いた糖化反応
参考例１の方法で調製したＰＣ－３－７株由来セルラーゼを水に溶解し、セルラーゼ水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が、２．５、６．３、１２．５になるように、参考例３に記載の方法により調製した非水溶性のリグニンをそれぞれ添加して混合物を調製した。さらに混合物のｐＨを５．０に調整して、酵素組成物を調製した。また、ＰＣ－３－７由来セルラーゼに含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性は、酵素組成物を調製する前後のいずれにおいても０．０６７Ｕ／ｍＬで変化がないことを確認した。なお、酵素組成物を調製する前の酵素活性については、調製後の容量に合わせて酵素に水を添加して測定した。比較例３で調製した酵素組成物を用いた以外は、実施例３と同様の条件及び操作で試験を行い、酵素回収率を算出した。結果を表５に示す。

表５の結果から、クラフトリグニン、バガスリグニンＡ、およびバガスリグニンＢを用いて調製した本発明の酵素組成物は、表４に記載のリグニンを含まない比較例２の酵素組成物を用いた場合に比べて、酵素回収率がそれぞれ最大で１４％、１３％、および２６％程度向上した。また、比較例３の非水溶性のリグニンで調製した酵素組成物を用いた場合は、酵素回収率の向上は確認できなかった。

＜実施例４＞各種セルラーゼを含む本発明の酵素組成物を用いた糖化反応
参考例１の方法により調製したＰＣ－３－７株由来セルラーゼ、ＧＯＤＯセルラーゼ（合同酒精株式会社）、セルクラスト１．５ｌ（ノボザイムズジャパン株式会社）、スクラーゼＸ（三菱ケミカルフーズ株式会社）、またはメイセラーゼ（Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａ ファルマ株式会社）とクラフトリグニン（シグマアルドリッチジャパン）を水に溶解し、水溶液中のタンパク質の質量に対するリグニンの質量比率が、６．３になるようにそれぞれ調整した。さらに水溶液のｐＨを５．０に調整して、本発明の酵素組成物を調製した。また、ＰＣ－３－７株由来セルラーゼ、ＧＯＤＯセルラーゼ（合同酒精株式会社）、セルクラスト１．５ｌ（ノボザイムズジャパン株式会社）、スクラーゼＸ（三菱ケミカルフーズ株式会社）、およびメイセラーゼ（Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａ ファルマ株式会社）に含まれるｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性は、酵素組成物を調製する前後のいずれにおいても、それぞれ０．０５８Ｕ／ｍＬ、０．０５４Ｕ／ｍＬ、０．０６０Ｕ／ｍＬ、０．０３９Ｕ／ｍＬ、および０．０３８Ｕ／ｍＬで変化がないことを確認した。なお、酵素組成物を調製する前の酵素活性については、調製後の容量に合わせて、それぞれの酵素に水を添加して測定した。調製した酵素組成物を用いて、参考例２に記載の方法で調製した未処理バガスをセルロース含有バイオマスとして用い糖化反応を行った。その他は、実施例１と同様の条件及び操作で試験を行い、酵素回収率を算出した。その結果を表６に示す。

＜比較例４＞リグニンを含まない酵素組成物を用いた糖化反応
実施例４で用いた市販の各種セルラーゼを使用し、リグニンの代わりに水を添加してｐＨを５．０に調整し、リグニンを含まない酵素組成物を調製した。リグニンを含まない酵素組成物を用いた以外は、実施例４と同様の操作・条件で糖化反応を行い、酵素回収率を算出した。結果を表６に示す。表６の結果から、ＰＣ－３－７株由来セルラーゼ、ＧＯＤＯセルラーゼ、セルクラスト１．５ｌ、スクラーゼＸ、またはメイセラーゼを用いて本発明の酵素組成物を調製し、それらを用いて糖化を行った結果、それらの酵素回収率は、リグニンを含まない酵素組成物を用いた場合に比べて、それぞれ１９％、１５％、８％、１４％、および１９％程度向上した。すなわち、本発明の酵素組成物の酵素回収率は、使用するセルラーゼの種類に依らず、向上することがわかった。

Claims (4)

1. ｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有する未使用のセルラーゼ、リグニンおよび水を含有する酵素組成物であって、前記セルラーゼおよび前記リグニンは水に溶解し、ブラッドフォード法で測定される水溶液中のタンパク質の質量に対する前記リグニンの質量比率が１以上である、酵素組成物。
2. 前記水溶液のｐＨが６以下である、請求項１に記載の酵素組成物。
3. 請求項１または２に記載の酵素組成物を用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
4. 前記糖化物を固液分離してｐ－ニトロフェニル－β－ラクトピラノシドを分解する酵素活性を有するセルラーゼを含む液成分を得る工程を含む、請求項３に記載の糖の製造方法。