JP2016111952A - 耐熱性β−グルコシダーゼ - Google Patents

Abstract

【課題】少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下で、さらには極めて高濃度のグルコースが存在する条件下でも、ＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を示す新規な耐熱性β−グルコシダーゼ、当該耐熱性β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、及び当該耐熱性β−グルコシダーゼを用いたセルロース分解物の製造方法の提供。【解決手段】温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性β−グルコシダーゼを取得した。この酵素は、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有し、特定のアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は特定のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドである。【選択図】なし

Description

本発明は、耐熱性β−グルコシダーゼ、当該耐熱性β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性β−グルコシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体及び当該耐熱性β−グルコシダーゼを用いたセルロース分解物の製造方法に関する。

植物バイオマス、若しくはリグノセルロースは、地球上に最も豊富にある再生可能エネルギー源である。地球環境保全や化石燃料枯渇の観点から、植物バイオマスをエタノールなどのバイオ燃料や化成品の原料として用いるバイオリファイナリーが注目を浴びている。植物バイオマス乾燥重量の主要構成要素は、セルロースやヘミセルロース等の多糖類とリグニンから成るリグノセルロースである。例えば、多糖類はグリコシド加水分解酵素によってグルコースやキシロースなどの単糖に加水分解された後、バイオ燃料や化成品の原料として利用される。

リグノセルロースは複雑な構造を持ち、難分解性であり、単一のグリコシド加水分解酵素では分解、糖化が難しい。リグノセルロースの全分解には、一般的に、エンドグルカナーゼ（セルラーゼ又はエンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ ３．２．１．４）、エキソ型のセロビオハイドロラーゼ（１，４−β−セロビオシダーゼ又はセロビオハイドロラーゼ、ＥＣ ３．２．１．９１、ＥＣ３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）の３種の酵素が必要とされ、その他にも、ヘミセルラーゼであるキシラナーゼ（エンド−１，４−β−キシラナーゼ、ＥＣ ３．２．１．８）や他の植物細胞壁分解酵素も含めた複数酵素の適切な配合が必要であると考えられている。

セロビオハイドロラーゼによってセルロースが加水分解を受けると、主に、二糖のセロビオースが生成する。β−グルコシダーゼは、このセロビオースを単糖のグルコースに加水分解することから、リグノセルロースを最終的に単糖にまで分解するために必要不可欠な酵素の一つである。

従来のリグノセルロースを資源とするバイオエタノール製造では、エタノールの高エネルギー効率変換を目的として、高固体負荷（３０〜６０％ ｓｏｌｉｄ ｌｏａｄｉｎｇ）による糖化処理が試みられている。このような高固体負荷によるリグノセルロースの酵素糖化は、バイオマス糖化液の粘性が高く、リグノセルロースの加水分解反応が進み難い。そこで、耐熱性酵素を用いて、例えば８０℃以上の高温で酵素糖化処理を行うことにより、加水分解反応速度が上昇することに加えて、バイオマス糖化液の粘性が低下することから、糖化反応時間の短縮及び酵素量の削減が達成できると期待される。このため、各種グリコシド加水分解酵素について、より耐熱性に優れた酵素の開発が望まれている。

多くの耐熱性酵素は、高温環境に生息する好熱性微生物から遺伝子をクローニングしてＤＮＡ配列を決定した後、大腸菌や糸状菌などにより発現させることにより得られてきた。例えば、特許文献１には、糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Acremonium cellulolyticus）由来の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度７０℃、至適ｐＨ３．５〜４．０）が、特許文献２には、アクレモニウム・セルロリティカス由来の３種の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度５５℃、至適ｐＨ４．５〜５．１）が、特許文献３には、サーモアナエロバクター（Thermoanaerobactor）由来の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度８０℃、至適ｐＨ５〜６）が、非特許文献１には、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascas auranticus）由来の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度８０℃、至適ｐＨ４．６）が、非特許文献２には、フェルビドバクテリウム・イスランジカム（Fervidobacterium islandicum）由来の耐熱性β−グルコシダーゼ（至適温度９０℃、至適ｐＨ６〜７）が、それぞれ開示されている。

また、一般的にβ−グルコシダーゼは、その分解生成物であるグルコースによって、自身の活性が阻害される特性を持つことから、グルコースの影響を受けにくいβ−グルコシダーゼの開発が進められているが、高耐熱性を有するものはない（例えば、特許文献４、非特許文献３〜４参照。）

特許第４８０１８７２号公報 特許第４６８９８０７号公報 特開平１０−５２２７４号公報 特開２０１１−１１００１１号公報

Neil et al.，Biochemical Journal，2001，vol.353，p.117−127. Jabbour et al.，Applied Microbiology and Biotechnology，2012，vol.93，p.1947−1956. Saha and Bothast，Applied and Environmental Microbiology，1996，vol.62，p.3165−3170. C.Riou et al，Applied and Environmental Microbiology，1998，vol.64，p.3607−3614.

本発明は、少なくとも１００℃の条件下で、さらには極めて高濃度のグルコースが存在する条件下でも、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＰＮＰＧ）を基質とした加水分解活性を示す新規な耐熱性β−グルコシダーゼ、当該耐熱性β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド、当該耐熱性β−グルコシダーゼを発現するための発現ベクター、当該発現ベクターが組込まれた形質転換体、及び当該耐熱性β−グルコシダーゼを用いたセルロース分解物の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく、温泉高温土壌から直接ＤＮＡを抽出し、難培養性微生物叢の大規模メタゲノムシーケンスを行うことにより、新規アミノ酸配列を持つ耐熱性β−グルコシダーゼの取得に成功し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼ、ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体、耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法、グリコシド加水分解酵混合物及びセルロース分解物の製造方法は、下記［１］〜［１２］である。
［１］ （Ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（Ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−グルコシダーゼ。
［２］ １．２Ｍ以下のグルコース存在下におけるｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性が、グルコース非存在下における当該加水分解活性の８０％以上である、前記［１］の耐熱性β−グルコシダーゼ。
［３］ β−ガラクトシダーゼ活性を有する、前記［１］又は［２］の耐熱性β−グルコシダーゼ。
［４］ β−キシロシダーゼ活性を有する、前記［１］〜［３］のいずれかの耐熱性β−グルコシダーゼ。
［５］ （ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
［６］ 前記ポリペプチドの１．２Ｍ以下のグルコース存在下におけるｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性が、グルコース非存在下における当該加水分解活性の８０％以上である、前記［５］のポリヌクレオチド。
［７］ 前記ポリペプチドが、β−ガラクトシダーゼ活性も有する、前記［５］又は［６］のポリヌクレオチド。
［８］ 前記ポリペプチドが、β−キシロシダーゼも有する、前記［５］〜［７］のいずれかのポリヌクレオチド。
［９］ 前記［５］〜［８］のいずれかのポリヌクレオチドが組込まれており、
宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
［１０］ 前記［９］の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
［１１］ 真核微生物である、前記［９］の形質転換体。
［１２］ 前記［９］又は［１０］の形質転換体内で、耐熱性β−グルコシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法。
［１３］ 前記［１］〜［４］いずれかの耐熱性β−グルコシダーゼ、前記［５］〜［８］いずれかのポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−グルコシダーゼ、又は前記［１２］の耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
［１４］ セルロースを含む材料を、前記［１］〜［４］いずれかの耐熱性β−グルコシダーゼ、前記［５］〜［８］いずれかのポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−グルコシダーゼ、前記［１０］若しくは［１１］に記載の形質転換体、又は前記［１２］の耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有する。このため、当該耐熱性β−グルコシダーゼは、高温条件下におけるセルロースの糖化処理に好適である。
また、本発明に係るポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造に好適に用いられる。

オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８のアミノ酸配列（配列番号１）とサーモトーガ門サーモトガ・サーモラムＤＳＭ ５０６９のグリコシドハイドロラーゼファミリー１のアミノ酸配列（配列番号８）のアライメント図である。 実施例１において、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子を大腸菌に発現させて得られたＡＲ１９Ｇ−２２８−１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２８−１タンパク質の各基質に対する加水分解活性（ＰＮＰＧに対する分解活性を１００％とした相対値）の測定結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２８−１タンパク質の各温度におけるＰＮＰＧ加水分解活性（ｐＨ５．５）（１００℃における加水分解活性を１００％とした相対値）を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２８−１タンパク質の各ｐＨにおけるＰＮＰＧ加水分解活性（１００℃）（ｐＨ５．５における加水分解活性を１００％とした相対値）を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２８−１タンパク質のＰＮＰＧ加水分解活性の熱安定性（ｐＨ５．５）（無処理区（保温時間０分）の活性を１００％とした相対値）を計測した結果を示した図である。 実施例１において、大腸菌発現させたＡＲ１９Ｇ−２２８−１タンパク質のグルコース存在下におけるＰＮＰＧ加水分解活性（ｐＨ５．５）（グルコース濃度が０Ｍの場合の活性を１００％とした相対値）を計測した結果を示した図である。

［耐熱性β−グルコシダーゼ］
糸状菌、細菌、アーキアを含む多くの微生物は難培養性であり、土壌など微生物環境に生息する菌の９９％が未知の菌であるといわれている。特に、高温環境に生息する微生物の培養は極めて困難であり、現在の微生物培養技術では土壌中に生息する微生物の０．１％以下を単離・培養しているにすぎないと考えられている。この高温土壌微生物の難培養性が、耐熱性酵素の開発が進まない一因である。

近年、ギガ塩基対の大量配列解読を可能にした次世代ギガシーケンサーが開発されたことにより、土壌等に含まれる微生物叢のゲノムを丸ごと解読することが可能となった。この解析技術を利用して、土壌などの環境サンプルから微生物集団のゲノムＤＮＡを調製し、ゲノム構成が不均一、雑多な集団について直接ゲノムを網羅的に解読し、並列コンピュータにより解読データをアセンブルすることで微生物叢ゲノム配列を再構成するメタゲノム解析法が提案され、難培養性微生物のゲノム解読が急速に進展した。

本発明者らは、後記実施例１に示すように、採取した高温温泉土壌から微生物集団のゲノムＤＮＡ（メタゲノムＤＮＡ）を調製し、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンス及びアノテーションを行い、既知β−グルコシダーゼ酵素と類似したアミノ酸配列を持つオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を得た。得られたＯＲＦのうち、β−グルコシダーゼ触媒領域（触媒ドメイン）が確認できたものについて、ＯＲＦの塩基配列情報に基づいてプライマーを設計し、ＰＣＲ法により、高温温泉土壌メタゲノムＤＮＡから遺伝子候補をクローニングした。ＰＣＲクローニングされたＤＮＡを大腸菌に組込み、当該塩基配列がコードするタンパク質を発現させ、ＰＮＰＧ分解活性アッセイによる機能スクリーニングを行った。最終的に、これらのＯＲＦの中からＰＮＰＧ分解活性を持つ耐熱性β−グルコシダーゼ（以下、「ＡＲ１９Ｇ−２２８−１」）を得た。ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のアミノ酸配列を配列番号２に、塩基配列を配列番号４に、それぞれ表す。

後記実施例１に示すように、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１は、ＰＮＰＧに対して最も高い加水分解活性を示し、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧＡＬ）に対しても高い加水分解活性を示し、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−キシロピラノシド（ＰＮＰＸ）、リン酸膨潤アビセル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｓｗｏｌｌｅｎ Ａｖｉｃｅｌ、ＰＳＡ）、結晶性セルロースであるアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、キシラン（Ｘｙｌａｎ）、及びカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）に対しても若干の分解活性を示す。この基質特異性から、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１はβ−グルコシダーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性を有しており、若干のβ−キシロシダーゼ活性をも有するグリコシド加水分解酵素であることが示唆される。

なお、本発明及び本願明細書において、β−グルコシダーゼ活性とは、β−グルコシド結合を含むグルカンを基質とし、前記基質を加水分解することにより単糖を生成する活性を意味する。
また、本発明及び本願明細書において、β−キシロシダーゼ活性とは、ＰＮＰＸを基質とする加水分解活性を意味する。
また、本発明及び本願明細書において、β−ガラクトシダーゼ活性とは、ガラクトース同士又はガラクトースと他の単糖とのβ−グルコシド結合を加水分解する活性を意味する。

また、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して検索したところ、最も配列同一性が高かったアミノ酸配列は、サーモトガ・サーモラム（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｔｈｅｒｍａｒｕｍ） ＤＳＭ ５０６９のグリコシドハイドロラーゼファミリー１（Ｇｅｎｂａｎｋ 登録ＩＤ：ＡＥＨ５１０９４．１）（配列番号８）であり、その配列同一性（相同性）はＧＨ１触媒領域において６８％であった。基質特異性及び既知のタンパク質とのアミノ酸配列の配列同一性から、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１は、ＧＨファミリー１に属する新規なβ−グルコシダーゼであることが明らかとなった。

ＡＲ１９Ｇ−２２８−１は、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有する。実際に、後記実施例１に示すように、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１は、５０〜１１０℃の温度範囲内でβ−グルコシダーゼ活性を示し、９０〜１０５℃の温度範囲内においても強いβ−グルコシダーゼ活性を示す。より詳細には、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のβ−グルコシダーゼ活性は、５０〜１００℃の範囲内では温度が高くなるにつれて高くなり、１０５℃超では急激に低下する傾向にあった。

一般的に何らかの生理活性を有するタンパク質は、その生理活性を損なうことなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。つまり、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１に対しても、β−グルコシダーゼ活性をはじめとするグリコシド加水分解活性を失わせることなく、１個又は２個以上のアミノ酸を欠失、置換又は付加させることができる。

すなわち、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、下記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかからなるβ−グルコシダーゼ触媒領域を有する、耐熱性β−グルコシダーゼである。
（Ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（すなわち、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８、又は遺伝子クローンＡＲ１９Ｇ−２２８−１）、
（Ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
（Ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド。

本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が欠失する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸の一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が置換する」とは、ポリペプチドを構成しているアミノ酸が別のアミノ酸に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリペプチドにおいてアミノ酸が付加される」とは、ポリペプチド中に新たなアミノ酸が挿入されることを意味する。

前記（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列に対して欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は、１〜２０個が好ましく、１〜１０個がより好ましく、１〜５個がさらに好ましい。

前記（Ｃ）のポリペプチドにおいて、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましく、９８％以上１００％未満であることがよりさらに好ましい。

なお、アミノ酸配列同士の配列同一性（相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明におけるアミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドとしては、人工的に設計されたものであってもよく、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１等のホモログ又はその部分タンパク質であってもよい。

前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、アミノ酸配列に基づいて化学的に合成してもよく、後記の本発明に係るポリヌクレオチドを用いて、タンパク質発現系によって生産してもよい。また、前記（Ｂ）及び（Ｃ）のポリペプチドは、それぞれ、配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに基づいて、アミノ酸変異を導入する遺伝子組換え技術を用いて人工的に合成することもできる。

前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドは、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性（β−グルコシダーゼ活性）を有する。このため、前記（Ａ）〜（Ｃ）のいずれかのポリペプチドをβ−グルコシダーゼ触媒領域として有することにより、耐熱性β−グルコシダーゼが得られる。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、ＰＮＰＧを基質とする。当該耐熱性β−グルコシダーゼは、ＰＮＰＧ以外のその他のβグルカン等を基質としてもよい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが基質とし得るものとしては、例えば、ＰＮＰＧＡＬ；ＰＮＰＸ；キシラン；アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）、結晶性バクテリアセルロース(Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、ＢＭＣＣ)、濾紙などの結晶性セルロース、ＰＳＡ、ＣＭＣ、セロビオース等のβ−１，４結合からなるグルカン；リケナン（Ｌｉｃｈｅｎａｎ）等のβ−１，３結合とβ−１，４結合からなるグルカン；ラミナリン等のβ−１，３結合とβ−１，６結合からなるグルカン；β−１，３結合からなるグルカン；ゲンチオビオース等のβ−１，６結合からなるグルカン等が挙げられる。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、ＰＮＰＧに加えてＰＮＰＧＡＬを基質とするものが好ましく、ＰＮＰＧ及びＰＮＰＧＡＬに加えてＰＮＰＸ、ＰＳＡ、アビセル、キシラン、及びＣＭＣからなる群より選択される１種以上を基質とするものがより好ましい。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、少なくともｐＨ５．５の条件で、ＰＮＰＧを基質とする加水分解活性（β−グルコシダーゼ活性）を、８０〜１０５℃の温度範囲内で示すことが好ましく、７０〜１０５℃の温度範囲内で示すことがより好ましく、５０〜１０５℃の温度範囲内で示すことがさらに好ましい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの至適温度は、８０〜１１０℃の範囲内にあることが好ましく、９０〜１０５℃の範囲内にあることがより好ましく、９５〜１０５℃の範囲内にあることがさらに好ましい。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの至適ｐＨは、ｐＨ５．０〜６．５の範囲内にある。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、少なくともｐＨ５．０〜７．０の範囲内においてβ−グルコシダーゼ活性を示すものが好ましく、ｐＨ４．５〜７．０の範囲内においてβ−グルコシダーゼ活性を示すものがより好ましい。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、高濃度のグルコース存在下においても、その影響（阻害）を受けにくいものが好ましい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、１．２Ｍ以下のグルコース存在下におけるＰＮＰＧを基質とした加水分解活性が、グルコース非存在下における当該加水分解活性の８０％以上であることが好ましく、１．２Ｍ以下のグルコース存在下におけるＰＮＰＧを基質とした加水分解活性が、グルコース非存在下における当該加水分解活性の８５％以上であることがより好ましく、１．８Ｍ以下のグルコース存在下におけるＰＮＰＧを基質とした加水分解活性が、グルコース非存在下における当該加水分解活性の６０％以上であることも好ましい。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、β−グルコシダーゼ活性以外のセルロース加水分解活性を有していてもよい。その他のセルロース加水分解活性としては、β−ガラクトシダーゼ活性、キシラナーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、キシロシダーゼ活性、又はセロビオハイドロラーゼ活性等が挙げられる。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、β−ガラクトシダーゼ活性を有するものが好ましく、β−ガラクトシダーゼ活性とβ−キシロシダーゼ活性を有するものがより好ましい。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドのいずれかからなるβ−グルコシダーゼ触媒領域のみからなる酵素であってもよく、その他の領域を含んでいてもよい。その他の領域としては、公知のβ−グルコシダーゼが有する、β−グルコシダーゼ触媒領域以外の領域が挙げられる。例えば、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼには、公知のβ−グルコシダーゼに対し、β−グルコシダーゼ触媒領域を前記（Ａ）〜（Ｃ）のポリペプチドに置換することによって得られる酵素も含まれる。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ触媒領域以外の領域を含む場合、セルロース結合モジュールを含むことが好ましい。セルロース結合モジュールは、β−グルコシダーゼ触媒領域の上流（Ｎ末端側）にあってもよく、下流（Ｃ末端側）にあってもよい。また、セルロース結合モジュールとβ−グルコシダーゼ触媒領域は、直接結合していてもよく、適当な長さのリンカー領域を介して結合していてもよい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼとしては、β−グルコシダーゼ触媒領域の上流又は下流に、リンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものが好ましく、β−グルコシダーゼ触媒領域の上流にリンカー領域を介してセルロース結合モジュールが存在しているものがより好ましい。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが含むセルロース結合モジュールは、セルロースとの結合能、例えば、ＰＳＡや結晶性アビセルとの結合能を有する領域であればよく、そのアミノ酸配列は特に限定されるものではない。当該セルロース結合モジュールとしては、例えば、既知のタンパク質が有するセルロース結合モジュール又はそれを適宜改変したものを用いてもよい。また、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ触媒領域とセルロース結合モジュールを有する場合、これらはリンカー配列を介して結合していることが好ましい。当該リンカー配列のアミノ酸配列やその長さ等は特に限定されるものではない。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、その他にも、そのＮ末端又はＣ末端に、細胞内の特定の領域に移行させて局在させ得るシグナルペプチドや、細胞外へ分泌するシグナルペプチドを有していてもよい。このようなシグナルペプチドとして、例えば、アポプラスト移行シグナルペプチド、小胞体保留シグナルペプチド、核移行シグナルペプチド、又は分泌型シグナルペプチド等がある。小胞体保留シグナルペプチドとして、例えば、ＨＤＥＬのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド等がある。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが、そのＮ末端又はＣ末端にシグナルペプチドを有している場合には、形質転換体中で発現させた耐熱性β−グルコシダーゼを、細胞外へ分泌させたり、細胞中の小胞体等に局在させることができる。

また、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、その他にも、発現系を用いて生産した場合に簡便に精製可能とするため、例えば当該耐熱性β−グルコシダーゼのＮ末端やＣ末端に、各種タグが付加されていてもよい。当該タグとしては、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）タグ、Ｍｙｃタグ、及びＦｌａｇタグ等の組換えタンパク質の発現又は精製において汎用されているタグを用いることができる。

［耐熱性β−グルコシダーゼをコードするポリヌクレオチド］
本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼをコードする。当該耐熱性β−グルコシダーゼは、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクターを宿主に導入することにより、当該宿主の発現系を利用して生産することができる。

具体的には、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記（ａ）〜（ｅ)のいずれかの塩基配列からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチドである。

（ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列。

なお、本願及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が欠失する」とは、ポリヌクレオチドを構成しているヌクレオチドの一部が失われる（除去される）ことを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が置換する」とは、ポリヌクレオチドを構成している塩基が別の塩基に変わることを意味する。
本発明及び本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて塩基が付加される」とは、ポリヌクレオチド中に新たな塩基が挿入されることを意味する。

本発明及び本願明細書において、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液、ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液の組成：２質量％ウシ血清アルブミン、２質量％フィコール、２質量％ポリビニルピロリドン）、０．５質量％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、及び５０％フォルムアミドからなるハイブリダイゼーションバッファー中で、４２〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１質量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。

前記（ａ）〜（ｅ）の塩基配列においては、縮重コドンは、宿主のコドン使用頻度の高いものを選択することが好ましい。例えば、前記（ａ）の塩基配列としては、配列番号３で表される塩基配列であってもよく、配列番号４で表される塩基配列であってもよく、配列番号３又は４で表される塩基配列を、コードするアミノ酸配列は変更せずに、宿主において使用頻度の高いコドンへ改変した塩基配列であってもよい。コドンの改変は、公知の遺伝子配列変異技術又は人工遺伝子合成によって行うことができる。

配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドは、塩基配列情報に基づいて化学的に合成してもよく、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１をコードする遺伝子（「ＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子」ということがある。）の全長若しくはβ−グルコシダーゼ触媒領域を含む部分領域を遺伝子組換え技術によって自然界から取得したものであってもよい。ＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子の全長又はその部分領域は、例えば、自然界から微生物を含むサンプルを取得し、当該サンプルから回収されたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３又は４で表される塩基配列に基づいて常法により設計したフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことによって得ることができる。当該サンプルから回収したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型としてもよい。なお、鋳型となる核酸を回収するサンプルは、温泉土壌等の高温環境下から採取されたサンプルであることが好ましい。

前記（ｄ）の塩基配列において、配列番号３又は４で表される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であれば特に限定されないが、８５％以上１００％未満であることが好ましく、９０％以上１００％未満であることがより好ましく、９５％以上１００％未満であることがさらに好ましい。

なお、塩基配列同士の配列同一性（相同性）は、２つの塩基配列を、対応する塩基が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除く塩基配列全体に対する一致した塩基の割合として求められる。塩基配列同士の配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。本発明における塩基配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＮにより得られたアライメントを元にした計算によって得られる。

例えば、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して、１又は２以上の塩基を欠失、置換若しくは付加することによって人工的に合成することができる。また、前記（ｂ）、（ｃ）、又は（ｄ）の塩基配列としては、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子のホモログ遺伝子の全長配列又はその部分配列であってもよい。ＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子のホモログ遺伝子は、塩基配列が既知の遺伝子のホモログ遺伝子を取得する際に用いられる遺伝子組換え技術によって取得することができる。

本発明に係るポリヌクレオチドは、β−グルコシダーゼ触媒領域をコードする領域のみを有するものであってもよく、当該領域に加えて、セルロース結合モジュール、リンカー配列、各種シグナルペプチド、各種タグ等をコードする領域を有していてもよい。

［発現ベクター］
本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドが組込まれており、宿主細胞において、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド（β−グルコシダーゼ）を発現し得る。すなわち、前記本発明に係るポリヌクレオチドが、前記本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを発現し得る状態で組込まれた発現ベクターである。具体的には、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、前記本発明に係るポリヌクレオチド、及びターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現カセットが、発現ベクターに組込まれていることが必要である。なお、周知の遺伝子組み換え技術を用いることにより、ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込むことができる。ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みでは、市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。

本発明及び本願明細書において、発現ベクターとは、上流から、プロモーター配列を有するＤＮＡ、外来ＤＮＡを組込むための配列を有するＤＮＡ、及びターミネーター配列を有するＤＮＡを含むベクターである。

当該発現ベクターとしては、大腸菌等の原核細胞へ導入されるものであってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞へ導入されるものであってもよい。これらの発現ベクターとしては、それぞれの宿主に応じて通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。

本発明に係る発現ベクターは、前記本発明に係るポリヌクレオチドのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された細胞と形質転換されていない細胞の選抜を容易に行うことができるためである。当該薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びビアラホス耐性遺伝子等がある。

［形質転換体］
本発明に係る形質転換体は、本発明に係る発現ベクターが導入されている。当該形質転換体中では、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを発現させ得る。発現ベクターを導入する宿主としては、大腸菌等の原核細胞であってもよく、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、哺乳培養細胞、又は植物細胞等の真核細胞であってもよい。大腸菌の形質転換体を培養することにより、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを、より簡便かつ大量に生産することができる。一方で、真核細胞内ではタンパク質に糖鎖修飾が施されるため、真核細胞の形質転換体を用いることにより、原核細胞の形質転換体を用いた場合よりも、より耐熱性に優れた耐熱性β−グルコシダーゼを生産し得る。

発現ベクターを用いて形質転換体を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換体を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。当該方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、宿主が植物細胞である場合には、パーティクルガン法又はアグロバクテリウム法で行うことが好ましい。

宿主として、原核細胞、酵母、糸状菌、昆虫培養細胞、又は哺乳培養細胞等を用いた場合には、得られた形質転換体は、一般的には、形質転換前の宿主と同様にして、常法により培養することができる。

［耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法］
本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−グルコシダーゼを生産する方法である。前記本発明に係るポリヌクレオチドが、発現の時期等の制御能を有していないプロモーターの下流に組込まれている発現ベクターを用いて製造された形質転換体内では、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが恒常的に発現している。一方で、特定の化合物や温度条件等によって発現を誘導するいわゆる発現誘導型プロモーターを用いて製造された形質転換体に対しては、それぞれの発現誘導条件に適した誘導処理を行うことにより、当該形質転換体内に耐熱性β−グルコシダーゼを発現させる。

形質転換体によって生産された耐熱性β−グルコシダーゼは、当該形質転換体内に留めた状態で使用してもよく、当該形質転換体から抽出・精製してもよい。

形質転換体から耐熱性β−グルコシダーゼを抽出又は精製する方法は、耐熱性β−グルコシダーゼの活性を損なわない方法であれば、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織からポリペプチドを抽出する場合に通常用いられている方法によって抽出することができる。当該方法として、例えば、形質転換体を適当な抽出バッファーに浸し、耐熱性β−グルコシダーゼを抽出した後、抽出液と固形残渣に分離する方法が挙げられる。当該抽出バッファーとしては、界面活性剤等の可溶化剤を含有するものが好ましい。形質転換体が植物である場合には、抽出バッファーに浸す前に、予め当該形質転換体を細断又は粉砕しておいてもよい。また、抽出液と固形残渣を分離する方法としては、例えば、濾過方法、圧縮濾過方法、又は遠心分離処理方法等の公知の固液分離処理を用いることができ、抽出バッファーに浸した状態の形質転換体を搾ってもよい。抽出液中の耐熱性β−グルコシダーゼは、塩析法、限外濾過法、又はクロマトグラフィー法等の公知の精製方法を用いて精製することができる。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを、形質転換体内で分泌型シグナルペプチドを有する状態で発現させた場合には、当該形質転換体を培養した後、得られた培養物から形質転換体を除いた培養液上清を回収することにより、簡便に耐熱性β−グルコシダーゼを含む溶液を得ることができる。また、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼが、Ｈｉｓタグ等のタグを有している場合、当該タグを利用したアフィニティクロマトグラフィ法により、抽出液や培養上清中の耐熱性β−グルコシダーゼを簡便に精製することができる。

すなわち、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法は、前記本発明に係る形質転換体内で、耐熱性β−グルコシダーゼを生産すること、及び所望により前記形質転換体から前記耐熱性β−グルコシダーゼを抽出し精製することを含む。

［グリコシド加水分解酵素混合物］
前記本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼ、又は前記本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を含むグリコシド加水分解酵素混合物として使用することもできる。前記本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼは、形質転換体内に含まれた状態のものであってもよく、形質転換体から抽出又は精製されたものであってもよい。本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼを、その他のグリコシド加水分解酵素との混合物としてセルロースの分解反応に用いることにより、難分解性であるリグノセルロースをより効率よく分解させることができる。

当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記耐熱性β−グルコシダーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、セルロースの加水分解活性を有するものであれば特に限定されるものではない。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる前記β−グルコシダーゼ以外のその他のグリコシド加水分解酵素としては、例えば、キシラナーゼ、若しくはβ−キシロシダーゼ等のヘミセルラーゼ、セロビオハイドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又はエンドグルカナーゼ等が挙げられる。本発明に係るグリコシド加水分解酵素混合物としては、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼの少なくとも一方を含むものが好ましく、ヘミセルラーゼとエンドグルカナーゼを両方含むものがより好ましい。中でも、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼからなる群より選択される１種以上のグリコシド加水分解酵素を含むものが好ましく、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドロラーゼ、及びエンドグルカナーゼを全て含むものがより好ましい。

当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれるその他のグリコシド加水分解酵素は、少なくとも８５℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましく、７０〜９０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることがより好ましい。当該グリコシド加水分解酵素混合物に含まれる全ての酵素が耐熱性であることにより、当該グリコシド加水分解酵素混合物によるセルロースの分解反応を高温条件下で効率よく行うことができる。すなわち、当該グリコシド加水分解酵素混合物が耐熱性グリコシド加水分解酵素のみを含む場合、当該グリコシド加水分解酵素混合物をリグノセルロース糖化処理に用いることにより、糖化温度７０〜９０℃の高温環境下でリグノセルロース加水分解反応を行うことが可能になる。この高温糖化により、酵素量と糖化時間を著しく減らすことができ、糖化コストが大幅に削減される。

［セルロース分解物の製造方法］
本発明に係るセルロース分解物の製造方法は、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼにより、セルロースを分解して分解物を得る方法である。具体的には、セルロースを含む材料を、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産する。

セルロースを含む材料としては、セルロースが含まれていれば特に限定されるものではない。当該材料としては、例えば、雑草や農業系廃棄物等のセルロース系バイオマス、又は古紙等が挙げられる。当該セルロースを含む材料は、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼと接触させる前に、破砕若しくは細断等の物理的処理、酸若しくはアルカリ等による化学処理、又は適当なバッファーへの浸漬又は溶解処理等を行っておくことが好ましい。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼによるセルロースの加水分解反応の反応条件は、当該耐熱性β−グルコシダーゼがβ−グルコシダーゼ活性を示す条件であればよい。例えば、６０〜１１０℃、ｐＨ４．５〜７．０で反応を行うことが好ましく、８０〜１０５℃、ｐＨ５．０〜７．０で反応を行うことがより好ましく、９０〜１０５℃、ｐＨ５．０〜６．５で反応を行うことがさらに好ましい。前記加水分解反応の反応時間は、加水分解に供されるセルロースを含む材料の種類、前処理の方法、又は量等を考慮して適宜調整される。例えば、１０分間〜１００時間、セルロース系バイオマスを分解する場合には、１〜１００時間の反応時間で前記加水分解反応を行うことができる。

セルロースの加水分解反応には、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼに加えて、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素を用いることも好ましい。当該その他のグリコシド加水分解酵素としては、前記グリコシド加水分解酵素混合物に含められるグリコシド加水分解酵素と同様のものを用いることができ、少なくとも８５℃で、好ましくは少なくとも７０〜９０℃で、より好ましくは６０〜１００℃で、さらに好ましくは６０〜１１０℃でグリコシド加水分解活性を有する耐熱性グリコシド加水分解酵素であることが好ましい。また、当該セルロース分解物の製造方法には、本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼ、本発明に係る形質転換体、又は本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼに代えて、前記グリコシド加水分解酵素混合物を用いてもよい。

次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実施例１］温泉土壌からの新規耐熱性β−グルコシダーゼのクローニング
＜１＞ 温泉土壌からのＤＮＡ抽出と全ゲノムシーケンス（Ｗｈｏｌｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ、ＷＧＳ）
６０〜１１０℃で活性を示す新規耐熱性β−グルコシダーゼの遺伝子探索を目的として、中性〜弱アルカリ性温泉から土壌ＤＮＡを採取し、これらの土壌を構成する微生物叢メタゲノムＤＮＡの塩基配列解読を行った。
中性〜弱アルカリ性温泉土壌サンプルとして、野外にて高温の温泉が噴き出している日本国内の３ヶ所、５地点（メタゲノムＤＮＡサンプルＮ２、ＡＲ１９、ＡＲ１５、ＯＪ１、及びＨ１）から、土壌、泥、バイオマットを含む温泉水を採取した。これらの温泉土壌サンプルは、採取時の温度５８〜７８℃、ｐＨ７．２〜８のレンジにあった。

採取した温泉土壌サンプル各１０ｇから、ＤＮＡ抽出キット（ＩＳＯＩＬ Ｌａｒｇｅ ｆｏｒ Ｂｅａｄｓ ｖｅｒ．２、ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ社製）を使い、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡのうち５μｇに対して、ロシュダイアグノスティックス社製のシーケンサーＧＳ ＦＬＸ Ｔｉｔａｎｉｕｍ ４５４を用いて、メタゲノムＤＮＡのショットガンシーケンスを行った。残りのＤＮＡは、β−グルコシダーゼ遺伝子のＰＣＲクローニングに用いた。
温泉土壌サンプルＡＲ１９について、メタゲノムＤＮＡの配列解読を行い、平均リード長３９６ｂｐ、総リード数２，７６６,３３２個、総ゲノム解読量１，１０６，２４３，２８０ｂｐの全ゲノムシーケンス（ＷＧＳ）データセットを得た。

＜２＞ 温泉メタゲノムデータのアセンブルと統計量
Ｒｏｃｈｅ ４５４の出力（ｓｆｆファイル）を、ＰｙｒｏＢａｙｅｓ（Quinlan et al., Nature Methods，2008，vol.5，p.179-81.）にて再ベースコールし、ＦＡＳＴＡ形式の配列ファイル及びＱｕａｌｉｔｙ値ファイルを取得した。得られたシーケンスリードは、端を切り落とし品質を上げ、４５４ Ｌｉｆｅ ＳｃｉｅｎｃｅｓのアセンブルソフトウェアＮｅｗｂｌｅｒ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．３を使ってアセンブルした。アセンブルは、「ｍｉｎｉｍｕｍ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｏｖｅｒｌａｐ ｍａｔｃｈ （ｍｉ）＝０．９」、「ｏｐｔｉｏｎ：−ｌａｒｇｅ（ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ，ｓｐｅｅｄｓ ｕｐ ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｂｕｔ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｃｃｕｒａｃｙ．)」に設定して行った。
Ｑｕａｌｉｔｙフィルター処理したリードと１００ｂｐ以上のアセンブルコンティグは、合計１０４，０９６，３１６ｂｐあり、このデータセットをグリコシド加水分解酵素遺伝子解析に用いた。リード総数２，７６６,３３２個のうち２，３０８，６７９個のリードが、平均で１，０２７ｂｐのコンティグにアセンブルされ（計１０１，３７２コンティグ）、このうち最大コンティグ長は１８７，９７０ｂｐであった。

＜３＞ β−グルコシダーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）予測
ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（http://www.uniprot.org/）からＥＣ番号が３．２．１．４（セルラーゼ）、３．２．１．２１（β−グルコシダーゼ)、３．２．１．３７（β−キシロシダーゼ) 、３．２．１．９１（セルロース １，４−β−セロビオシダーゼ)、３．２．１．８（エンド１，４−β−キシラナーゼ）の配列をダウンロードし（アクセス日：２０１１／１２／９）、これらグリコシド加水分解酵素遺伝子のプロテオームローカルデータベースを構築した。アノテーションソフトウェアＯｒｐｈｅｌｉａ（Hoff et al.，Nucleic Acids Research，2009，37(Web Server issue：W101-W105）を使用して、前記＜２＞で得たコンティグ配列から、遺伝子領域（＝オープンリーディングフレーム）を推定した。推定されたＯＲＦからグリコシド加水分解酵素遺伝子を抽出するために、ＢＬＡＳＴＰ（ｂｌａｓｔａｌｌ ｖｅｒ. ２．２．１８）を使い、前記ローカルデータベースに参照した。ＢＬＡＳＴＰのｏｐｔｉｏｎ条件は、「Ｆｉｌｔｅｒ ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ＝ｆａｌｓｅ」、「Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ（Ｅ）＜１ｅ^−２０」［以下、デフォルト値：Ｃｏｓｔ ｔｏ ｏｐｅｎ ａ ｇａｐ＝−１、Ｃｏｓｔ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｇａｐ＝−１、Ｘ ｄｒｏｐｏｆｆ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｇａｐｐｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＝０、Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｆｏｒ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｈｉｔｓ＝０、Ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ＝ｄｅｆａｕｌｔ］とし、前記ローカルデータベース中にエントリーされたＧｌｙｃｏ＿ｈｙｄｒｏ＿３＿Ｃ、Ｅｘｏ−１，４−ｂｅｔａ ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｂｅｔａ−ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｂ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、Ｘｙｌｏｓｉｄａｓｅ、Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １、Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ３、Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １、 Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ ３、Ｂｅｔａ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、Ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅのいずれかにヒットしたＯＲＦ配列をβ−グルコシダーゼの候補配列として収集した。

＜４＞ 遺伝子のグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリー分類
前記＜３＞で収集されたβ−グルコシダーゼの候補配列について、タンパク質の機能領域配列データベースｐｆａｍ ＨＭＭｓ（Ｐｆａｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ２３．０ ａｎｄ ＨＭＭＥＲ ｖ２．３；Finn et al.，Nucleic Acids Research Database，2010，Issue 38，p.D211-222)を基準に、機能分類を行った。具体的には、タンパク質モチーフ検索プログラムＨＭＭＥＲ（Durbin et al.，‘The theory behind profile HMMs. Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids’, 1998，Cambridge University Press.；ｈｍｍｐｆａｍ（Ｖｅｒ．２．３．２）、Ｅ−ｖａｌｕｅ ｃｕｔｏｆｆ＜１ｅ^−５; Ｄａｔａｂａｓｅ＝Ｐｆａｍ＿ｆｓ（ｍｏｄｅｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｉｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．))を用いて、Ｐｆａｍ領域データベースとの相同性からグリコシド加水分解酵素（ＧＨ）ファミリーを決定した。

β−グルコシダーゼの候補配列と推定されたＯＲＦ７６個（完全長ＯＲＦ、不完全長ＯＲＦがそれぞれ３８個）のＧＨファミリー分類結果を表１に示す。ＧＨ触媒ドメインの配列を７０％以上カバーしているものをカウントした。表１に示すように、メタゲノムＡＲ１９から、ＧＨファミリー１に属する完全長ＯＲＦが１０個、ＧＨファミリー３に属する完全長ＯＲＦが２３個、ＧＨファミリー３１に属する完全長ＯＲＦが５個、それぞれ得られた。β−グルコシダーゼ又はβ−キシロシダーゼと推定された全てのＯＲＦについて、プライマーを設計し、温泉土壌メタゲノムＤＮＡからＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。この結果、ＧＨファミリー１に属しているオープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８から、β−グルコシダーゼ候補遺伝子が単離された。

＜５＞ オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８
オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８は、４９３アミノ酸残基からなるポリペプチド（配列番号１）をコードし、１位のアミノ酸残基がメチオニンから開始し、３’末端が終始コドンで終わる完全長配列（配列番号３）であった。モチーフの配列相同性から、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８は、２位のフェニルアラニン（Ｆ）から４７１位のリジン（Ｋ）までの４７０アミノ酸残基がＧｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １の触媒領域をコードしていると推測された。シグナル配列予測ソフトウェアＳｉｇｎａｌＰ ４．１を使った解析によれば、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８は、シグナルペプチドは予想されなかった。当該ＯＲＦは、細菌サーモトーガ門サーモトガ・サーモラムＤＳＭ ５０６９のグリコシドハイドロラーゼファミリー１とＧＨ１触媒領域について６８％のアミノ酸配列同一性を示す、新規な配列であった。配列相同性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムにより算出した。

図１に、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８のアミノ酸配列とサーモトーガ門サーモトガ・サーモラムＤＳＭ ５０６９のグリコシドハイドロラーゼファミリー１のアミノ酸配列（配列番号８）のアライメントを示す。図１中、黒白反転のアミノ酸は、これらの全アミノ酸配列において同一アミノ酸残基（identical）を示し、網掛けのアミノ酸は、これらのアミノ酸配列において類似アミノ酸残基(similar)を示し、「−」は欠失（ギャップ）を示す。

＜６＞ 遺伝子クローニング
配列番号７で表される塩基配列からなるフォワードプライマー（５’−ＣＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＧ−３’：配列番号５で表される塩基配列の５’末端側に４塩基（ＣＡＣＣ）付加したもの。５’側に付加したＣＡＣＣは、ベクターに挿入するための配列である。）と配列番号６で表される塩基配列からなるリバースプライマー（５’−ＴＣＡＡＡＣＧＴＴＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＴＣＴＧ−３’）を用い、ゲノムＤＮＡ増幅キット（ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ Ｖ２ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＧＥヘルスケア社製）で増幅した温泉土壌ＤＮＡをテンプレートにして、ＰＣＲを行った。なお、配列番号５で表される塩基配列は、配列番号３で表される塩基配列の１〜２５位の塩基からなる部分配列と相同的な（同一の）塩基配列である。また、配列番号６で表される塩基配列は、配列番号３で表される塩基配列の１，４５９〜１，４８２位の塩基からなる部分配列と相補的な塩基配列である。増幅したＰＣＲ産物は、Ｃｈａｍｐｉｏｎ ｐＥＴ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）のｐＥＴ１０１／Ｄ−ＴＯＰＯベクターに挿入し、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ ＴＯＰ１０株に形質転換した。コロニーＰＣＲによりポジティブクローンを選抜し、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ液体培地を用いて３７℃、２００ｒｐｍで１７〜２０時間培養した後、ミニプレップキット（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標） ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてプラスミドの調製を行った。調製したプラスミドは、ライフテクノロジーズ社の３７３０ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを用いて配列確認を行った。

ＰＣＲクローニングにより、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８から３個の遺伝子クローンＡＲ１９Ｇ−２２８−１、ＡＲ１９Ｇ−２２８−２、及びＡＲ１９Ｇ−２２８−５を得た。β−グルコシダーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｇ−２２８−１の塩基配列（配列番号４）は、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８（配列番号３）と同様に１，４８２ｂｐを含み、予測されたＯＲＦとは２塩基異なっていた。すなわち、４１６番目の塩基が、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８ではＡ（アデニン）であるが、クローニングされたＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子においてはＧ（グアニン）であり、 １，０６２番目の塩基が、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８ではＧ（グアニン）であるが、クローニングされたＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子においてはＡ（アデニン）であった。このうち１ヶ所の塩基の違いはアミノ酸も異なるものであり、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８のアミノ酸配列（配列番号１）とβ−グルコシダーゼ候補遺伝子ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のアミノ酸配列（配列番号３）は１アミノ酸残基異なっていた。すなわち、１３９位のアミノ酸残基が、オープンリーディングフレームＡＲ１９Ｇ−２２８ではリジン（Ｋ）であるが、クローニングされたＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子においてはアルギニン（Ｒ）であった。

＜７＞ β−グルコシダーゼ酵素タンパク質の発現及び精製
シーケンス確認後、目的遺伝子をもつプラスミドを、ヒートショック法によりタンパク質発現用大腸菌へ導入した。形質転換用コンピテントセルは、Ｃｈａｍｐｉｏｎ（登録商標） ｐＥＴ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ＴＯＰＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔｓ（ライフテクノロジーズ社製）に付属するＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）株を用いた。目的の遺伝子をもつ大腸菌を１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌し、ＯＤ_６００＝０．２〜０．８程度まで培養した後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ（−）−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加し、さらに５〜２０時間培養することによって、目的タンパク質の発現誘導を行った。培養後、遠心分離を行って大腸菌を回収し、培養液の１／１０容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁した。その後、超音波破砕装置ａｓｔｒａｓｏｎ３０００（ＭＩＳＯＮＩＸ社製）を用いて、５分間破砕−５分間休止工程を７〜８回繰り返し、目的タンパク質を含む遺伝子組換え大腸菌の粗抽出物を得た。当該遺伝子組換え大腸菌粗抽出物をフィルター（孔径φ＝０．４５μｍ、ミリポア社製）で濾過し、得られた濾液を遺伝子組換え大腸菌破砕上清とした。

当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したイオン交換カラムＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、中高圧液体クロマトグラフィーシステムＡＫＴＡ ｄｅｓｉｇｎ（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、１ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜５０％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−グルコシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、遠心式の限外濾過膜ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ社製）によって７５０ｍＭの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）へ溶液交換した。溶液交換後のβ−グルコシダーゼ活性分画を、同液で平衡化した疎水性相互作用分離カラムＨｉＴｒａｐ Ｐｈｎｅｎｙｌ ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に充填し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−グルコシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後に、液量が８ｍＬ程度になるまでＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０を用いて濃縮した。濃縮したサンプルは、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で平衡化したゲル濾過カラムＨｉｌｏａｄ２６／６０ ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、カラム体積の１〜１．５倍容の同バッファーを流速２〜３ｍＬ／ｍｉｎで流すことによって分画した。β−グルコシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２０によって１ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）への溶液交換と濃縮を行い、同バッファーで平衡化したヒドロキシアパタイトカラムＣＨＴ５−１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に充填し、４００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ６．８）にて０〜１００％の濃度勾配でタンパク質を分画した。β−グルコシダーゼ活性のあった分画は、まとめて混合した後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）への溶液交換と濃縮を行い、終濃度約１ｍｇ／ｍＬの精製酵素を得た。

遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素（精製したβ−グルコシダーゼ酵素タンパク質）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により確認した。遺伝子組換え大腸菌破砕上清と精製酵素のＳＤＳ電気泳動は、ミニプロティアンＴＧＸステインフリーゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて行った。前記上清又は精製酵素を、それぞれＴｒｉｓ−ＳＤＳ βＭＥ処理液（コスモバイオ社製）と１：１で混合した泳動用サンプルを、１００℃で１０分間処理した後、１サンプルあたり、遺伝子組換え大腸菌破砕上清は１０μＬ、精製酵素は２μｇをそれぞれ泳動させた。泳動終了後、ＣＢＢ染色によって、タンパク質のバンドを検出した。

図２に、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子を導入した形質転換大腸菌から調製された遺伝子組換え大腸菌破砕上清及び当該遺伝子組換え大腸菌破砕上清から精製された精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。レーン１はタンパク質質量指標、レーン２は遺伝子組換え大腸菌破砕上清、レーン３は精製酵素の電気泳動パターンである。この結果、前記遺伝子組換え大腸菌破砕上清（レーン２）において、アミノ酸配列（配列番号２）から予想される質量５７．１ｋＤａ近傍に強いバンドが認められ、精製酵素（レーン３）では、当該バンドに対応する単一バンドが認められた（図中、矢印）。

＜８＞ ＰＮＰＧを基質としたβ−グルコシダーゼ活性
ＡＲ１９Ｇ−２２８−１遺伝子がコードする酵素タンパク質（ＡＲ１９Ｇ−２２８−１）のＰＮＰＧを基質としたβ−グルコシダーゼ活性を調べた。ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を水で溶かし、所定の終濃度となるように調整したものを、基質溶液として用いた。なお、以降の実験に用いたＰＮＰＧ基質溶液は、全て当該方法により調製したＰＮＰＧ水溶液を用いた。β−グルコシダーゼ活性測定には、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）を基質として用いた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．００７５ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。

５０〜９０℃の反応には、サーモミキサー（エッペンドルフ社）を用い、反応容器には１．５ｍＬ容のサンプルチューブを使用し、反応液量を２００μＬとした。反応液の組成は、５μＬの希釈した精製酵素、４５μＬの精製水、 ５０μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、１００μＬの６０ｍＭ ＰＮＰＧ水溶液とした。９５℃〜１１０℃の反応には、リアクティサーモ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用い、反応容器には１．５ｍＬ容のガラスバイアルを使用し、反応液量を４００μＬとした。反応液の組成は、１０μＬの希釈した精製酵素、９０μＬの精製水、 １００μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、２００μＬの６０ｍＭ ＰＮＰＧ水溶液とした。なお、ガラスバイアルは酵素タンパク質吸着抑制のため、あらかじめ１．５質量％ＢＳＡ溶液で内部をコーティングした。

全ての計測において、精製酵素溶液の代わりに５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を入れて同条件で反応させた混合液をコントロール区とした。また、基質溶液と精製酵素溶液は、反応温度で５分間それぞれ別々にプリインキュベーションした後に混合し、反応開始とした。１０分間の反応終了後は、各混合液に対して等量の０．２Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３溶液を加えて撹拌することにより反応を停止させた後、それを遠心分離処理し、上清を得た。上清中のｐ−ニトロフェノール量は、分光光度計を用いて４２０ｎｍの吸光度を計測し、予め作成していたｐ−ニトロフェノール量と４２０ｎｍの吸光度の検量線を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求めた。１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。また各計測は、３回の独立した試行により行い、平均値と標準誤差を求めた。

＜９＞ ＡＲ１９Ｇ−２２８−１の基質特異性
酵素タンパク質ＡＲ１９Ｇ−２２８−１に対して、様々なセルロース基質及びヘミセルロース基質に対する加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．００７５ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。また、基質として、ＰＮＰＧ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＧＡＬ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＮＰＸ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＰＳＡ、アビセル粉末、Ｘｙｌａｎ（ブナ材由来、Ｓｉｇｍａ社製）を用いた。
ＰＳＡはリン酸溶液でアビセル粉末（微結晶性セルロース粉末、Ｍｅｒｃｋ社製）を一旦溶解させた後に滅菌蒸留水を加えて析出させた後、ｐＨが５以上になるまで洗浄することによって調製した。なお、以降の実験に用いたＰＳＡは全て当該方法により調製した。

具体的には、ＰＮＰＸ、ＰＮＰＧ、又はＰＮＰＧＡＬを基質とする場合には、基質溶液として２０ｍＭの各水溶液を用いて１００℃で反応させた以外は前記＜８＞と同様にして酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、比活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
ＰＳＡ、アビセル粉末、ＣＭＣ、又はキシランを基質とする場合には、基質溶液として１質量％の各水溶液を用いて１００℃で反応させた以外は前記＜８＞と同様にして反応させ、反応終了後に等量の３，５−ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅａｇｅｎｔ（ＤＮＳ溶液）を加えて１００℃で５分間加熱処理し、５分間の冷却後に遠心分離処理し、上清を得た。上清中の還元糖量を、分光光度計を用いて５４０ｎｍの吸光度を計測し、グルコースで作成した検量線（キシランを基質とした場合は、キシロースで作成した検量線）を用いて算出し、コントロール区との差分から酵素の加水分解によって生成した還元糖量を求めた。１分間に１μｍｏｌの還元糖を生成する酵素活性を１Ｕとし、タンパク質量で除した値を比活性（Ｕ／ｍｇ）とした。

測定結果を図３に示す。酵素活性は、ＰＮＰＧに対する分解活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。この結果、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１はＰＮＰＧに対し最も高い加水分解活性を示し、ＰＮＰＧＡＬに対しても高い加水分解活性を示した。また、ＰＮＰＸに対しても弱い加水分解活性を示し、ＰＳＡ、アビセル、キシランに対しても非常に弱いが加水分解活性を示した。これらの結果から、ＡＲ１９Ｇ−２２８−１はβ−グルコシダーゼであり、β−ガラクトシダーゼ活性も有しており、若干のβ−キシロシダーゼ活性も持つことが示された。

＜１０＞ ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のβ−グルコシダーゼのカイネティクス
ＡＲ１９Ｇ−２２８−１によるＰＮＰＧ加水分解の最大初速度（Ｖｍａx）、ミカエリス定数（Ｋｍ）及び触媒効率（Ｋｃａt／Ｋｍ）を調べた。カイネティクスの測定は、ＰＮＰＧ水溶液の濃度を、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭ、６０ｍＭ、８０ｍＭ、１００ｍＭとし、１００℃で反応させた以外は、前記＜８＞と同様に行い、ＰＮＰＧ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。最大初速度（Ｖｍａx）とミカエリス定数（Ｋｍ）は、データ分析ソフトＯｒｉｇｉｎ（ライトストーン社製）を用いたミカエリス−メンテンモデルのフィッティングによって求め、得られた数値から触媒効率（Ｋｃａt／Ｋｍ）を算出した。
結果を表２に示す。ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のＶｍａｘは、４３０．３Ｕ／ｍｇ、Ｋｍは４．５ｍＭ、Ｋｃａｔ／Ｋｍは９１．５／ｓｅｃ／ｍＭであった。

＜１１＞ ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のβ−グルコシダーゼの温度及びｐＨ依存性
ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のＰＮＰＧ加水分解活性の温度依存性を調べた。具体的には、反応温度を５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００、１０５又は１１０℃とした以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＧ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
結果を図４に示す。酵素活性は、最も高い分解活性を示した１００℃の値を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。ＡＲ１９Ｇ−２２８−１は、温度範囲５０〜１１０℃においてＰＮＰＧ加水分解活性を示した（図４）。５０〜１００℃の範囲では、酵素反応温度の上昇と共にＰＮＰＧ加水分解活性も上昇し、最も高い活性を示した至適温度（Ｔ_ｏｐｔ）は、１００℃であった。酵素反応温度を１０５℃以上にした場合には、ＰＮＰＧ加水分解活性は急激に減少した。

ＡＲ１９Ｇ−２２８−１のＰＮＰＧ加水分解活性のｐＨ依存性を調べた。具体的には、５０μＬのマッキルベインバッファー（ｐＨ３〜８）を用い、１００℃で反応させた以外は、前記＜８＞と同様に行い、酵素の加水分解によって生成したｐ−ニトロフェノール量を求め、ＰＮＰＧ加水分解活性（Ｕ／ｍｇ）を算出した。
計測結果を図５に示す。酵素活性は、最も高い分解活性を示したｐＨ５．５の値を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。ｐＨは、基質とバッファーと酵素の混合液の実測値をプロットした。ＡＲ１９Ｇ−２２８−１は、ｐＨ４．５〜７．５の範囲において、ＰＮＰＧ加水分解活性を示した。至適ｐＨは５．６１（基質、バッファーと酵素の混合液の実測値）であった。

＜１２＞ β−グルコシダーゼの熱安定性測定
ＡＲ１９Ｇ−２２８−１によるＰＮＰＧ加水分解活性の熱安定性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．００７５ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。

具体的には、１０μＬの希釈した精製酵素、９０μＬの精製水、１００μＬの２００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）からなる混合液を、９０℃、９５℃、１００℃、１０５℃の各温度で、０、３０、６０、１２０分間保温（プリインキュベーション）した後、ＰＮＰＧ加水分解活性を前記＜８＞と同様に９０℃で測定することにより行った。なお、熱安定性の測定には、リアクティサーモ（ジーエルサイエンス社製）を用い、反応容器には１．５ｍＬ容のガラスバイアルを使用した。

計測結果を図６に示す。酵素活性は、無処理区（保温時間０分）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。酵素活性が無処理区の５０％に低下する保温時間を半減期Ｔ_ｈａｌｆとした。ＡＲ１９Ｇ−２２８−１は、保温温度９０℃の場合、保温時間が１２０分経過しても６０％以上のＰＮＰＧ加水分解活性を保持した。９５℃、１００℃、１０５℃における半減期Ｔ_ｈａｌｆは、それぞれ約４０分、約２５分、約１５分であった。

＜１３＞ グルコース存在下におけるβ−グルコシダーゼ活性の測定
グルコース存在下でのＡＲ１９Ｇ−２２８−１によるＰＮＰＧ加水分解活性を調べた。計測には、前記＜７＞で得られた精製酵素を０．０５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）で０．００７５ｍｇ／ｍＬに希釈して用いた。

具体的には、反応液は、１０μＬの希釈した精製酵素、 ５０μＬの４００ｍＭ 酢酸バッファー（ｐＨ５．５）、１００μＬのＰＮＰＧ水溶液、２４０μＬのグルコース水溶液とした。ＰＮＰＧ水溶液は、終濃度が、５、１５、又は３０ｍＭとなるように調整し、グルコース水溶液は、終濃度が０．６、１．２、１．８、２．４、又は３Ｍとなるように調整した。精製酵素とバッファーとの混合液を、１００℃で５分間プリインキュベーションした後にＰＮＰＧ水溶液とグルコース水溶液を加えて反応開始とした。１００℃で１０分間の反応後、ＰＮＰＧ加水分解活性を前記＜８＞と同様にして求めた。

結果を図７に示す。酵素活性は、各ＰＮＰＧ濃度におけるグルコース非存在下（グルコース濃度０Ｍ）の活性を１００％とした相対値（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ、％）として示した。ＡＲ１９Ｇ−２２８−１は、ＰＮＰＧ濃度に関わらず、グルコース濃度が１．２Ｍにおいても、グルコース非存在下における活性の８０％以上を維持し、２．４Ｍにおいてもなお５０％前後の活性を維持した。これまでに、このような高濃度のグルコース存在下においてＰＮＰＧ加水分解活性を示すβ−グルコシダーゼ活性の報告はない。例えば、非特許文献３又は４において、活性が５０％になるグルコース濃度は、それぞれ、１．４Ｍと１．３６Ｍである。

本発明に係る耐熱性β−グルコシダーゼは、少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でＰＮＰＧを基質とした加水分解活性を有しており、高温条件下におけるセルロース含有バイオマスの糖化処理に好適である。このため、当該耐熱性β−グルコシダーゼ及びその生産に用いられるポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドが組込まれた発現ベクター、当該発現ベクターが導入されている形質転換体は、例えば、セルロース含有バイオマスからのエネルギー産生の分野において利用が可能である。

Claims (14)

1. （Ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
   （Ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
   （Ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチド、
   からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域を有することを特徴とする、耐熱性β−グルコシダーゼ。
2. １．２Ｍ以下のグルコース存在下におけるｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性が、グルコース非存在下における当該加水分解活性の８０％以上である、請求項１に記載の耐熱性β−グルコシダーゼ。
3. β−ガラクトシダーゼ活性を有する、請求項１又は２に記載の耐熱性β−グルコシダーゼ。
4. β−キシロシダーゼ活性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の耐熱性β−グルコシダーゼ。
5. （ａ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、
   （ｂ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列のうちの１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
   （ｃ）配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
   （ｄ）配列番号３又は４で表される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有し、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
   （ｅ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列であり、かつ少なくとも１００℃、ｐＨ５．５の条件下でｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性を有するポリペプチドをコードする塩基配列、
   からなるβ−グルコシダーゼ触媒領域をコードする領域を有する、ポリヌクレオチド。
6. 前記ポリペプチドの１．２Ｍ以下のグルコース存在下におけるｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基質とした加水分解活性が、グルコース非存在下における当該加水分解活性の８０％以上である、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
7. 前記ポリペプチドが、β−ガラクトシダーゼ活性を有する、請求項５又は６に記載のポリヌクレオチド。
8. 前記ポリペプチドが、β−キシロシダーゼ活性も有する、請求項５〜７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
9. 請求項５〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドが組込まれており、
   宿主細胞において、β−グルコシダーゼ活性を有するポリペプチドを発現し得る、発現ベクター。
10. 請求項９に記載の発現ベクターが導入されている、形質転換体。
11. 真核微生物である、請求項１０に記載の形質転換体。
12. 請求項１０又は１１に記載の形質転換体内で、耐熱性β−グルコシダーゼを生産することを含む、耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法。
13. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の耐熱性β−グルコシダーゼ、請求項５〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−グルコシダーゼ、又は請求項１２に記載の耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼと、少なくとも１種のその他のグリコシド加水分解酵素とを含む、グリコシド加水分解酵素混合物。
14. セルロースを含む材料を、請求項１〜４のいずれか一項に記載の耐熱性β−グルコシダーゼ、請求項５〜８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドがコードする耐熱性β−グルコシダーゼ、請求項１０若しくは１１に記載の形質転換体、又は請求項１２に記載の耐熱性β−グルコシダーゼの製造方法によって製造された耐熱性β−グルコシダーゼに接触させることにより、セルロース分解物を生産することを含む、セルロース分解物の製造方法。