CN108410924B - 一个属于糖基水解酶家族3的β-木糖苷酶在水解玉米芯木聚糖中的应用 - Google Patents

一个属于糖基水解酶家族3的β-木糖苷酶在水解玉米芯木聚糖中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶学工程技术领域，具体涉及的是一个属于糖基水解酶家族3的β‑木糖苷酶在水解玉米芯木聚糖中的应用。本发明从鞘氨醇单胞菌ATCC31461中克隆到一个β‑木糖苷酶基因spbgl4，将其与克隆表达载体pSE380连接后，转化至大肠杆菌XL1‑Blue中诱导表达，对目的蛋白进行镍亲和层析纯化，纯化得到的SPBGL4蛋白质能够单独水解玉米芯木聚糖，只有单一的水解产物‑木糖，对玉米芯木聚糖的酶解得率达到62.8％。本发明的β‑木糖苷酶SPBGL4在木糖制备中具有重要的工业应用潜力。

Description

一个属于糖基水解酶家族3的β-木糖苷酶在水解玉米芯木聚 糖中的应用
技术领域
本发明属于酶学工程技术领域，具体涉及的是一个属于糖基水解酶家族3的β-木糖苷酶在水解玉米芯木聚糖中的应用。
背景技术
迄今为止，在碳水化合物活性酶数据库(CAZy数据库网址:http://www.cazy.org)中列出来了152个糖基水解酶家族，且该数据库仍在不断更新中。与β-木糖苷酶有关的糖基水解酶家族包括：GH1、GH3、GH30、GH39、GH43、GH51、GH52、GH54、GH116、GH120(Bosetto A,Justo P I,Zanardi B,et al.Research Progress Concerning Fungal and Bacterialβ-Xylosidases[J].Applied Biochemistry&Biotechnology,2016,178(4):766-795.)，其中又以GH3家族中的β-木糖苷酶的报道最多。
β-木糖苷酶(β-D-xylosidase，EC3.2.1.37)，是木聚糖酶的重要组成部分，它与内切木聚糖酶协同作用，降解内切木聚糖酶的降解产物低聚木糖，从非还原端释放出木糖(Rasmussem L.E.,Sorensen H.R.,Vind J.,et al.Mode of action and properties oftheβ-xylosidase from Talaromyces emersonii and Trichoderma reesei.2006,Biotechnology and Bioengineering,94(5):869-876.)。
木聚糖是植物半纤维素的主要组分，广泛分布于高等植物的细胞壁中，是自然界中一类存量巨大的可再生资源，也是较容易提取、降解和利用的一类半纤维素。木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由多个吡喃木糖基通过β-1，4-糖苷键相连，侧链上连着多种不同的取代基：O-乙酞基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基等。一般将木聚糖分为硬木木聚糖和软木木聚糖两种。硬木木聚糖由O-乙酰-4-O-甲基葡萄糖醛县木糖聚合而成，含70个以上的吡喃型木糖残基，以β-1,4-葡萄糖苷键相连，聚合度为150-200，每隔10个木糖残基就有1个4-O-甲基葡萄糖酰酸基团位于C2位。硬木木聚糖包括山毛榉木聚糖、桦木木聚糖和燕麦木聚糖(Anita Teleman,Maija Tenkanen,Anna Jacobs,etal.Characterization of O-acetyl-(4-O-methylglucurono)xylan isolated frombirch and beech[J].Carbohydrate Research,2002,337:373-377.Kay Hettrich,Steffen Fischer,Nils Schroder,et al.Derivatization and Characterization ofXylan from Oat Spelts[J].Macromol Symp,2006,232:37-48.)，软木木聚糖由阿拉伯-4-O-甲基葡萄糖醛酰木聚糖残基聚合而成，聚合度为70-130，平均长度短于硬木木聚糖，分枝也少于硬木残基的C2位。小麦阿拉伯木聚糖属于软木木聚糖(Kay Hettrich,SteffenFischer,Nils Schroder,et al.Derivatization and Characterization of Xylan fromOat Spelts[J].Macromol Symp,2006，232：37-48.)。
目前，β-木糖苷酶在能源、造纸、医药等多方面具有广泛的应用前景。在能源工业面，利用木聚糖酶和β-木糖苷酶的协同作用能够高效降解木聚糖生成木糖，产生的木糖可以被继续转化为大宗化工原料(如乙醇、乳酸等)(Katahira S.,Fujita Y.,Mizuike H.,etal,Construction of a xylan-fermentating yeast strain through codisplay ofxylanolytic enzyme of the surface of xylose utilizing Saccharomycescerevisiae cells.2004,Appl.Environ.Microbiol.,70(9):5407-5414.)。造纸工业中，β-木糖苷酶可作为生物漂白剂，β-木糖苷酶单独或与木聚糖酶协同作用对麦草浆进行预处理可以明显提高漂白浆的白度(毛连山，尤纪雪，宋向阳等，内切木聚糖酶与木糖苷酶预处理对麦草浆漂白性能的影响，2003，林产化学与工业，23(2)：7-11)。在食品领域中，β-木糖苷酶被应用于食品焙烤、低聚木糖制备、酒类酿造等方面并取得了很好的使用效果。在环境保护方面，β-木糖苷酶的应用使得许多工农业废弃物以及一些生活垃圾可以更彻底的被降解，同时β-木糖苷酶的使用大大减少了许多有害有机或无机化学试剂的使用，从而有利于环境的保护(范圆圆，李秀婷，腾超，微生物产β-木糖苷酶的研究进展，2013，食品研究与开发，34(2)：116-121。)。张明慧等人研究的一个GH43家族的木糖苷酶AX543，能够作用于桦木木聚糖、榉木木聚糖和小麦阿拉伯木聚糖，降解物终产物都为木糖(张明慧，李中媛，仇海燕等，低温木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷酶AX543的基因克隆及性质研究[J].生物技术通报,2016,32(11):215-223.)。赵林果课题组以玉米芯木聚糖为底物，研究木聚糖酶XynB-DT水解玉米芯木聚糖的条件及产物，结果发现该木聚糖酶在温度70℃、pH 6.0、加酶量为400U/g条件下酶解12h，最终酶解得率为44.3％，水解产物主要以木二糖和木三糖为主(李琦，陈明真，赵林果.耐热木聚糖酶基因的克隆表达及其在酶解玉米芯木聚糖中的应用[J].林业工程学报，2017，2(4)：63-69)。
以β-木糖苷酶为发明名称查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现14项发明专利，其中有4项重复内容。在这10项专利中，关于β-木糖酶基因及应用的专利有6项，关于β-木糖酶突变体及应用的专利有2项，关于β-木糖酶应用的专利有2项。其中，专利申请号为201210281598.7的《一种β-木糖苷酶及其应用》中的β-木糖苷酶可以和木聚糖酶协同降解桦木木聚糖，以单独木聚糖酶水解为对照，发现加入β-木糖苷酶后，桦木木聚糖分解为木二糖的量由30％增加到70％。其中，专利申请号为201010033635.3的《β-木糖苷酶及其编码基因与应用》中的玉米芯木聚糖是经过高压罐处理得到木糖及各种木寡糖混合物，然后加入来自嗜热拟青霉Paecilomyces thermophila的β-木糖苷酶进行玉米芯汽爆液的水解，其水解产物主要以木糖为主，水解液中木糖比例达90％以上。
以木聚糖酶为发明名称查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现588项发明专利，主要可以归为以下几类:木聚糖酶基因编码及应用、木聚糖酶突变体及应用、木聚糖酶的制备和固定化方法、木聚糖酶产生菌株及应用和木聚糖酶的应用。在这些发明专利中，木聚糖酶的应用涉及许多方面，包括在造纸行业，增加漂白剂与纤维的接触面积，提高漂白效率。在酿酒行业中可以降低发酵液的粘度，改良啤酒口感，提高产品清澈度。以及与木聚糖反应来制备低聚木糖等多个方面。其中，专利申请号为201510629965.1的《一种重组基因工程菌构建及高活性β-D-1,4-内切木聚糖酶的制备与应用》中木聚糖酶可以专一性水解低粘度阿拉伯木聚糖、高粘度阿拉伯木聚糖、燕麦木聚糖、桦木木聚糖和可溶性木聚糖4-O-Methyl-D-glucurono-D-Xylan。专利申请号为200810225733.X的《一种耐热木聚糖酶及其编码基因与应用》中的木聚糖酶可以水解榉木木聚糖和桦木木聚糖，而且产物以木二糖和木三糖为主。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明从鞘氨醇单胞菌ATCC 31461中克隆到一个β-木糖苷酶基因spbgl4，将其与克隆表达载体pSE380连接后，转化至大肠杆菌XL1-Blue中诱导表达，对目的蛋白进行镍亲和层析纯化，纯化得到的SPBGL4蛋白质能够单独水解玉米芯木聚糖，只有单一的水解产物—木糖，对玉米芯木聚糖的酶解得率达到62.8％。
本发明提供的技术方案如下：
本发明提供了所述的GH3家族一种重组β-木糖苷酶SPBGL4在分解玉米芯木聚糖的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的β-木糖苷酶SPBGL4在加酶量为40.36U/g，温度45℃、pH 5.0条件下酶解玉米芯木聚糖1小时，最终酶解得率为62.8％，而且只有一种产物-木糖。因此，β-木糖苷酶SPBGL4在木糖制备中具有重要的工业应用潜力。
附图说明
图1为重组β-木糖苷酶SPBGL4纯化物的SDS-PAGE图；
图2为重组β-木糖苷酶SPBGL4水解玉米芯木聚糖的HPAE-PAD分析图；
其中，a-木糖标准样品；b-对照组；c-实验组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
1、β-木糖苷酶基因spbgl4的克隆
从美国模式培养物集存库购买编号为ATCC 31461的鞘氨醇单胞菌菌株，提取菌体总DNA。从NCBI基因数据库中获得编码β-木糖苷酶的基因的核苷酸序列，基因序列号为NZ_AGFU01000123。运用Vector NTI、ORF finder对该基因进行酶切位点和ORF分析，运用SMART和SignalP 4.1对该基因编码的蛋白质进行结构域分析和信号肽的预测。
根据分析结果，采用选好的限制性酶切位点，并在C端加入6个His标签(下划线部分)，设计1对PCR引物扩增目的片段，引物序列具体如下：
4-F：5′-ATTACCATGGCGATGCCGCTTCTCCCCCTGCTCCTC-3′；
4-R：5′-CCTAAGCTTTCAATGGTGGTGGTGGTGGTGTTTCGGC
AACTCCTGCGCGGTGCC-3′。
通过聚合酶链式反应扩增β-木糖苷酶基因spbgl4，扩增产物的大小约为2.6kb，用限制性内切酶NcoⅠ和HindⅢ酶切扩增产物后，与经NcoⅠ和HindⅢ酶切的表达载体pSE380进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XL1-Blue中，涂布到含100μg/mL氨苄青霉素的LA平板上，37℃倒置培养14-16h。
2、重组β-木糖苷酶SPBGL4的诱导表达、纯化及SDS-PAGE分析
(1)蛋白质SPBGL4的诱导表达：将菌种划线活化，从平板上挑取单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB培养基中，37℃、200rpm培养12-14小时，此为一级种子；以1％接种量取一级种子接种到含100μg/mL氨苄青霉素的30mL LB培养基中，37℃、200rpm培养过夜，此为二级种子；以2％接种量取二级种子接种到含100μg/mL氨苄青霉素的1L LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD600达到0.4-0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，在30℃、200rpm条件下诱导8小时。
(2)蛋白质SPBGL4的纯化：离心收集菌体，用7mL的裂解缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬菌体，加入1mL 10mg/mL的溶菌酶，于冰上静置15分钟。然后，用超声波破胞18分钟，结束后4℃、12000rpm离心25分钟，所得上清即为粗酶液。将粗酶液与用1mL裂解缓冲液重悬的填料混合，4℃作用1小时，使带有His标签的目的蛋白与Ni-NTA填料充分结合。用1mL预冷的洗涤缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/LNaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0)洗涤4次，再用500μL预冷的洗脱缓冲液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0)重悬洗涤8次，洗脱下来的蛋白用预冷的EP管收集。蛋白质脱盐：用3mL无菌的去离子水冲洗GE公司的PD MiniTrap G-25脱盐柱3-5次，接着用3mL置换缓冲液(pH 7.0McIlvaine缓冲液)冲洗3次，取500μL镍纯化的蛋白质，让其缓慢流出后，取1mL置换缓冲液(pH 7.0McIlvaine缓冲液)洗脱目的蛋白，用预冷的EP管收集脱盐后的目的蛋白。
(3)纯化的SPBGL4的SDS-PAGE分析：取脱盐后的蛋白质纯化物SPBGL4进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，发现有明显的目的大小的蛋白质条带。
由图1可知，重组β-木糖苷酶SPBGL4纯化物的分子量大约为94kDa。
3、重组β-木糖苷酶SPBGL4的最适温度和最适pH的测定
(1)最适pH的测定：以2mmol/L对硝基苯基-β-D-木糖苷(pNP-Xyl)为底物，在37℃条件下，测定不同pH(pH 4.5-8.0McIlvaine缓冲液)对酶活力的影响。以活力最高的为100％，计算各个pH下该酶的相对活力，活力最高的对应的pH即为该酶的最适反应pH。
以pNP-Xyl为底物时，测得SPBGL4的最适反应pH为5.5。
(2)最适温度的测定：以2mmol/L pNP-Xyl为底物，在最适反应pH条件下，测定不同温度(25-65℃)对酶活力的影响。以活力最高的为100％，计算各个温度下该酶的相对活力，活力最高的对应的温度即为该酶的最适反应温度。
以pNP-Xyl为底物时，测得SPBGL4的最适反应温度为50℃。
4、重组β-木糖苷酶SPBGL4的人工底物活性的测定
取2mmol/L的4-硝基苯基-β-D-木糖苷(pNP-Xyl)、4-硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖苷(pNPNAG)、邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(oNPG)、4-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(pNPGal)、4-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(pNPC)、4-硝基苯基-β-L-阿拉伯糖苷(pNPA)、4-硝基苯基α-L-鼠李糖苷(pNPR)、4-硝基苯基-β-D吡喃葡萄糖苷(pNPG)。在最适反应条件下反应20分钟，以产物生成量计算以水解pNP-Xyl的活力为100％时，SPBGL4水解其他人工底物的相对活力。
由计算得出，SPBGL4水解pNP-Xyl、pNPA和pNPR的相对活力分别为100％、31.05％和4.79％。而SPBGL4对上述的其他人工底物均不反应。
5、重组β-木糖苷酶SPBGL4水解玉米芯木聚糖的测定
(1)重组β-木糖苷酶SPBGL4的酶活测定
重组β-木糖苷酶SPBGL4酶活的测定是通过高效阴离子交换色谱(High-Performance Anion-Exchange chromatography，HPAE-PAD)检测还原糖生成量的方法。向每个反应管中先加入100uL 1％玉米芯木聚糖(pH 5.0McIlvaine buffer配制)，90uL pH5.0McIlvaine buffer，混合均匀后于45℃水浴保温2min，然后加入10uL酶液反应10min，并沸水浴5min，冷却至室温后稀释适当倍数通过高效阴离子交换色谱仪进行检测。利用木糖标准曲线，计算还原糖生成的摩尔数。每组反应均设有3个平行和1个对照(对照组中加入的是已失去活力的酶)。在一定反应条件下，每分钟水解玉米芯木聚糖释放1umol木糖的酶量定义为1个酶活单位(U)。
(2)重组β-木糖苷酶SPBGL4水解玉米芯木聚糖的最适pH的测定
纯化后的重组β-木糖苷酶SPBGL4最适pH的测定是将酶液分别用pH4.0-7.0缓冲液配置的玉米芯木聚糖底物，在37℃下进行酶促反应。
结果表明：SPBGL4的最适pH为5.0。
(3)重组β-木糖苷酶SPBGL4水解玉米芯木聚糖的最适温度的测定酶的最适温度的测定：在pH 5.0的缓冲液中，于35-60℃下进行酶促反应。
酶反应最适温度测定结果表明，其最适温度为45℃。
(4)重组β-木糖苷酶SPBGL4水解玉米芯木聚糖
以玉米芯木聚糖的底物终浓度为0.5％(w/v)，以纯化后的重组β-木糖苷酶SPBGL4为酶解用酶，以还原糖质量浓度为评价指标，在pH 5.0、45℃条件下研究不同加酶量和不同反应时间对酶解玉米芯木聚糖的影响。用高效阴离子交换色谱仪检测反应产物。
利用木糖标准曲线，计算还原糖生成的质量浓度。
酶解得率＝还原糖质量浓度/玉米芯木聚糖质量浓度×100％。
HPAE-PAD具体操作如下：
仪器：Dionex AS-AP、Dionex ICS-5000EG5、Dionex ICS-5000DC5、Dionex ICS-5000SP5；
色谱柱：CarboPac PA100Analytical Column(4×250mm)、CarboPac PA100GuardColumn(4×50mm)；
检测条件：柱温室温，流速1mL/min。
流动相A：18.2Ω超纯水；
流动相B：0.5mol/L NaOH；
流动相C：0.5mol/L NaOAC和0.08mol/L NaOH。
梯度洗脱程序如下(Mandellia F,Brenellia L B,Almeidaa R F,etal.Simultaneous production of xylooligosaccharides and antioxidantcompoundsfrom sugarcane bagasse via enzymatic hydrolysis[J].Industrial Crops andProducts,2014,52(1):770-775.)：
Figure BDA0001605379510000081
Figure BDA0001605379510000091
由图2可知，重组β-木糖苷酶SPBGL4可以单独水解玉米芯木聚糖，且只有单一的水解产物-木糖。经研究发现β-木糖苷酶SPBGL4在加酶量为40.36U/g，温度45℃、pH 5.0条件下酶解玉米芯木聚糖1h，最终酶解得率为62.8％。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (1)

1.一个属于糖基水解酶家族3的β-木糖苷酶SPBGL4在降解玉米芯木聚糖中的应用；
所述β-木糖苷酶SPBGL4是由β-木糖苷酶基因spbgl4编码的，所述β-木糖苷酶基因spbgl4按照以下方法获得：
(1)提取鞘氨醇单胞菌菌株的菌体总DNA，所述鞘氨醇单胞菌菌株从美国模式培养物集存库中购买，产品编号为ATCC 31461；
(2)通过聚合酶链式反应扩增β-木糖苷酶基因spbgl4，聚合酶链式反应的引物序列为：
4-F：5′-ATTACCATGGCGATGCCGCTTCTCCCCCTGCTCCTC-3′；
4-R：5′-CCTAAGCTTTCAATGGTGGTGGTGGTGGTGTTTCGGCAACTCCTGCGCGGTGCC-3′。
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