CZ285839B6

CZ285839B6 - Použití thermostabilní xylanázy a přídatné krmivo

Info

Publication number: CZ285839B6
Application number: CZ963155A
Authority: CZ
Inventors: Andrew John Morgan; Kathleen A. Clarkson; Elizabeth A. Bodie; William A. Cuevas
Original assignee: Finnfeeds International Limited
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1999-11-17
Also published as: NZ332345A; HUT75662A; AU2394995A; DK0926234T3; NO964549D0; FI964319A; HU9602980D0; DE69521534D1; CN1147271A; DE69516133T2; EP0926234B1; US5683911A; ES2146756T3; US5437992A; JPH11501502A; US6132716A; EP0758379A1; WO1995029998A1; AU681031B2; PL316997A1

Abstract

Použití termostabilní xylanázy, získatelné z mikroorganismů Microtetraspora flexuosa jako přídatného krmiva, přičemž xylanáza je charakterizována stálostí při zahřátí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 .sup.o.n.C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností enzymu snižovat viskozitu 1 % roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,5 a teplotě 40 .sup.o.n.C na stejnou viskositu .+-. 0,01 Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu. Součást řešení tvoří rovněž přidatné krmivo s obsahem tohoto enzymu a krmivo na bazi obilovin, obsahující nejméně 20 % hmotnostních obilovin a 0,00001 až 10 g termostabilní xylanázy na kg krmiva. Obilovinou může být pšenice, ječmen, kukuřice, čirok, rýže, žito, oves a triticale. Krmivo je vhodné pro hospodářská zvířata, zejména drůbež a vepře. ŕ

Description

Použití termostabilní xylanázy, přídatné krmivo a krmivo na bázi obilovin

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití enzymu jako krmného doplňku u zvířat, a to zejména v takových případech, kdy enzym je termostabilní a proto nedochází během působení vysoké teploty při způsobu výroby krmivá k významnějšímu snížení enzymatické aktivity.

Vynález se týká také krmného doplňku a na bázi obilovin založených krmiv, včetně zmíněného termostabilního enzymu.

Dosavadní stav techniky

Zkvalitnění v oblasti krmiv v živočišné výrobě, umožňující zvířatům trávit krmivo mnohem efektivněji, je cílem stálého bádání. Jeden z hlavních problémů spočívá ve zlepšení ukazatele FCR (Feed Conversion Ratio), tj. míra využití krmivá, spočívající v relaci spotřebovaného krmivá ku přírůstku hmotnosti zvířete, aniž se zvýší náklady na jednotku hmotnosti.

Nízká hodnota FCR naznačuje, že dané určité množství krmivá vytváří u zvířete proporcionálně vyšší hmotnostní přírůstky, což znamená, že zvíře je schopné zužitkovat krmivo mnohem efektivněji.

Jedním ze způsobů, jak lze hodnoty FCR snížit, spočívá ve zlepšení trávicích schopností zvířete a tím i zvýšení nutričního efektu, který se u zvířete může projevit.

Existují různé negativní faktory ovlivňující stravitelnost nutričních složek krmivá, jako je např. obsah škrobovin, tuků, proteinů a aminokyselin.

Tyto faktory zahrnují:

I. viskozitu složek přítomných ve střevním traktu zvířat. Tato viskozita je ovlivněna alespoň zčásti, rozpustnými neškrobovými polysacharidy, jako jsou např. beta-glukany a arabinoxylany, se smíšenými vazbami,

II. zadržení nutričních složek uvnitř buněčných stěn krmivá, zejména v aleuronové vrstvě obilovin. Tato zádrž je vyvolána vysokými hladinami neškrobových polysacharidů v buněčných stěnách obilovin, které jsou relativně odolné vůči degradaci systémem zvířecího trávicího traktu, což zabraňuje nutričním složkám, aby byly zadrženy uvnitř buněk a byly zvířetem nutričně využity a

III. nedostatek endogenní enzymatické aktivity, jak u samotného zvířete, tak u střevní mikrobiální populace, zejména u zvířete mladého.

Výše uvedené problémy, působící interferenčně s trávicími schopnostmi, jsou zejména pozoruhodné v případě krmiv, založených na obilovinách, jako např. těch, které se vyznačují vysokým obsahem pšeničného zrna.

Vzhledem k problematice, týkající se nedostatečného trávení nutričních složek krmivá, je normálně nezbytné, upravit složení krmných směsí tak, aby obsahovaly energeticky vysoce hodnotné složky a proteiny, které by postačily pokrýt nutriční potřeby zvířat.

- 1 CZ 285839 B6

K dispozici je už značná část důkazů o tom, že přídavek určitých (doplňkových) enzymů do krmných směsí, založených na obilovinách, může být z aspektů snižování viskozity složek, přítomných ve střevním traktu zvířat, výhodný. Tato redukce může být docílena enzymy, jakými jsou xylanázy, které hydrolyzují rozpustné xylany, čímž snižují při trávení viskozitu, která je významným negativním faktorem v trávicím procesu.

Xylanáty, které jsou přidávány jako doplňky, musí být stabilní a účinné při pH a teplotních podmínkách, zjištěných v gastrointestinálním traktu zvířat, která jsou středem zájmu. V případě, že xylanázy nejsou účinné a stabilní při vystavení podmínkám in vivo, potom nebudou ani schopné snižovat při trávení ve významném rozsahu viskozitu.

V současné době je známo, že jako doplňky jsou v krmných směsích uvažovány xylanázy, odvozené z hub, jako je např. Trichoderma longibrachiatum, Aspergillus niger a Humicola insolens.

Bedford a Classen zjistili, a v odborném časopise The Joumal of Nutrition, 122, strany 560-569, publikovali, že existují významné korelace mezi viskozitou v trávicím traktu, testované in vivo při výkrmu kuřat-broilerů a posuzované na základě přírůstků hmotnosti a hodnot FCR (definice viz výše). V případě krmných směsí s obsahem pšenice a žita, jako základních složek používaných k výkrmu drůbeže se prokázalo, že 70 - 80% variabilita v hmotnostních přírůstcích a FCR spočívá v rozdílech samotné viskozity ve střevním traktu.

Tyto poznatky naznačují značný význam viskozity pro trávení krmných směsích, založených na obilovinách a obsahujících vysoké koncentrace rozpustných arabinoxylanů. Tak, jak vzrůstá viskozita v trávicím traktu, tím se snižuje i stravitelnost všech nutričních složek v důsledku interference s difúzí pankreatických enzymů, substrátů a finálních produktů trávicího procesu.

Bylo také zjištěno, že zahrnutí xylanázy do krmných směsí pomáhá snižovat u skotu viskozitu v trávicím traktu. V důsledku toho je schopnost zvířat trávit potravu zvýšena, stejně jako hodnota hmotnostních přírůstků v relaci k jednotkovému množství spotřebovaného krmivá a FCR krmivá je snížena.

Je běžné zabudovávat enzymatické doplňky, jako např. xylanázu, do krmných směsí obdukcí enzymu fyziologicky akceptovatelným nosičem, např. obilninou. Obdukovaný nosič je smíchán s dalšími složkami krmné směsi a poté slisován do tvaru kostiček nebo pelet, použitelných přímo ke krmení zvířat.

Od nedávné doby jsou intenzivně vyvíjeny postupy přípravy různých finálních forem krmných směsí, jako např. kostiček a pelet. V rámci zmíněných, nově vyvinutých postupů, se používají relativně vysoké teploty, které mají v prvé řadě zvýšit efektivnost výrobního procesu, a za druhé vyprodukovat krmné směsi, prosté škodlivých bakterií, zejména Salmonell.

Kromě toho zvyšuje používání vysokých teplot kvalitu a trvanlivost finálních kostiček a pelet, rozšiřuje spektrum složek, které mohou být efektivně zpracovány a umožňuje zvýšení koncentrací tekutých složek, jako např. tuků a melasy, které mohou být do receptury krmivá zabudovány.

Běžně používané výrobní postupy zahrnují působení relativně vysokých teplot po relativně dlouhou dobu na složky krmných směsí. Kromě toho je krmná směs vystavena během výrobního procesu relativně vysokým tlakům, které tak přispívají ku zvýšení trvanlivosti finálních forem krmivá, tj. kostiček a pelet.

Jeden z produkčních postupů, vyvinutých s cílem zlepšit nutriční vlastnosti krmivá, je příprava pelet pomocí páry. Tento postup zahrnuje stupeň, při kterém na slisované krmivo působí za

-2CZ 285839 B6 účelem zvýšení teploty a vlhkosti směsi pára. Tento stupeň je označován jako kondicionování, které probíhá v rozmezí od několika sekund až do několika minut, v závislosti na typu a konečné receptuře směsi. Teplota v příslušném kondicionéru může vystoupit až na 100 °C. Poté se krmná směs zpracuje na peletizačním lisovacím zařízení, při kterém dochází k rychlému zvýšení vnitřní teploty krmné směsi v důsledku tření.

Nedávno bylo do výroby uvedeno nové zařízení pro předběžné zpracování nebo úpravu krmných směsí, nazývané expander, které umožňuje zachování podmínek pro kondicionování pod tlakem, po kterém následuje příprava pelet. Při použití tohoto technologického postupu jsou různé složky krmné směsi, které byly předtím zpracovány kondicionováním parou, předloženy do lisovacího šneku, do kterého je vháněno více páry a hmota je tak vystavena zvýšenému působení tlaků a nožů, a nakonec je prolisována výstupním otvorem různých rozměrů.

Slisovaný produkt je po úpravě na požadovanou velikost částic zpracován ve standardním lise na pelety.

Zpracování jednotlivých složek krmné směsi v expanderu probíhá v časovém rozmezí cca 5 až 20 sekund, přičemž může být dosažena teplota až 145 °C. Dosahuje se lisovacích tlaků až

3,5 MPa, ale zvýšení jak teploty, tak tlaku je velmi rychlé, ale obě tyto veličiny se rychle snižují v momentě, kdy produkt je vytlačován výstupním otvorem.

Použití expanderů je výhodné vzhledem k účinné eliminaci škodlivých bakterií, zejména Salmonell. Kromě toho je možné použít v receptuře směsi, ještě před přípravou pelet, relativně vysoké koncentrace tuků a dalších tekutých složek.

Kromě toho var a působení tlaků a rozmělňovacích nožů má za následek vyšší gelovatění škrobu.

Bohužel výrobní podmínky, při kterých jsou používány vysoké teploty a vysoké tlaky, vyskytující se při produkci pelet, zejména při současném působení vlhkosti, jsou pro určité složky krmných směsí potenciálně destruktivní, což platí zejména pro některé přítomné enzymy, včetně xylanáz.

Jak je všeobecně známo, enzymy jsou proteiny, vytvářené z aminokyselin. Zvláštní sekvence aminokyselin, tj. „primární struktura“, určuje povahu proteinu. Řetězec aminokyselin může být poté uspořádán ve formě řady „sekundárních struktur“, jako jsou např. pláty („skládané listy“) a šroubovice.

Tyto struktury jsou také uspořádány ve vzájemných vztazích a vytvářejí „terciární struktury“. Např. pláty mohou být umístěny ksobě navzájem, spíše jako novinové stránky. Konečně i některé podjednotky mohou být v určitém enzymu navzájem spojeny a tak vytvářejí „kvartemí strukturu“.

Aby enzym byl funkční, musí obsahovat aktivní vazebnou polohu, která je schopna katalyzovat reakci určitého substrátu. Aktivní vazebné centrum se často vyznačuje specifickým uspořádáním, které je determinováno primárními, sekundárními, terciárními a kvartemími strukturami enzymu.

Příčinami deaktivace enzymu jsou pravděpodobně změny ve tvaru katalytické vazebné polohy.

Existuje několik faktorů, včetně tepla, tlaku a pH, které mohou ovlivnit vazebné funkční skupiny enzymu a tedy i aktivní centra. Během technologického výrobního procesu krmných směsí, je už některý enzym, přítomný ve směsích, vystaven vlivům teplot a tlaků, které mohou velmi dobře způsobit, že enzym je alespoň zčásti denaturován, a tak ztrácí část anebo všechnu svoji aktivitu.

Čím vyšší je teplota během výrobního procesu, tím nastává i větší pokles enzymatické aktivity.

-3CZ 285839 B6

Je typické, že mezofilni xylanazy, jsou stalé při teplotách do 65 °C, ale ztrácejí všechnu aktivitu v případě, že jsou vystaveny, alespoň ve vodném roztoku, teplotě 95 °C.

V případě, že se projeví během výrobního procesu krmných směsí v důsledku zmíněné teploty denaturace, je to samozřejmě nevýhodné vzhledem k tomu, že enzym nepřispívá ke zvýšení efektu, pro který byl ke směsi přidán, nebo projevuje-li se jeho působení pouze v omezeném rozsahu.

Jedna z možností, jak se vyrovnat s tímto problémem, by mohla spočívat v přidání podstatně relativně většího množství enzymu do krmné směsi tak, aby se do určité míry deaktivace enzymu vykompenzovala.

Přidávání dodatečného množství enzymu je však z ekonomického hlediska nevýhodné vzhledem k tomu, že enzymy, používané při výrobě krmných směsí, jsou relativně nákladné.

Byla také zkoumána možnost stabilizace enzymů jejich zakotvením na speciální nosiče, nebo jejich obdukcí, za použití speciálních obdukčních technologií, které nelze dosud efektivně využít za relativně tvrdých podmínek u výrobních technologií pelet, za použití páry o vysoké teplotě v expanderu nebo extruderu (vytlačovací lis).

Alternativní řešení by mohla spočívat v přidávání enzymů, jako např. xylanázy, do již předem vylisovaných pelet, které byly již tepelně zpracovány.

To není však ideální řešení, protože pro dosažení relativního množství enzymu, zabudovaného do pelet, je v první řadě nutná dokonalá obdukce enzymu v peletách, která vyžaduje komplexní a nákladné strojní vybavení.

Za druhé, roztoky enzymů, používané při zmíněných obdukčních postupech, vykázaly při skladování omezenou stabilitu a mohou být i kontaminovány bakteriemi.

I když jsou částečná řešení problematiky stability enzymů během výrobního procesu dostupná, žádné z nich se nevypořádává s touto problematikou zcela efektivním způsobem.

V popisu a v dále uvedených patentových nárocích, jsou odkazy zaměřené na jednotky xylanázové aktivity. Tato aktivita, uváděná v předloženém vynálezu, je testována analytickými postupy, uvedenými na dalších stranách.

Analytické postupy při hodnocení xylanázové aktivity

Jedna jednotka xylanázové aktivity je množství enzymu, které uvolňuje ze substrátu během 1,0 minuty, za uvedených podmínek, jeden pmol redukujících cukrů, vyjádřených v ekvivalentech xylózy.

Reagens

1. 1 % (hmotnost/obj em) xylanový substrát

Ke 1,0 g xylanu (Fluka 95590) se přidá 10,0 ml 0,5M roztoku hydroxidu sodného a tato směs se míchá 30 minut pomocí magnetického míchadla. Poté se ku směsi přidá cca 40,0 ml 0,05M pufru octanu sodného (pH 6,50), a pH se upraví na hodnotu 6,50 pomocí 1M kyseliny octové a doplní se na objem 100,0 ml s 0,05M pufru octanu sodného, pH 6,50.

-4CZ 285839 B6

Zmíněný substrát by měl být míchán po celou dobu, kdy výše uvedené operace probíhají.

2. 1M kyselina octová

Do odměmé baničky se napipetuje 5,70 ml ledové kyseliny octové a doplní se na objem 100,0 ml destilovanou vodou.

3. Pufr 0,05M octan sodný; pH 6,50

A. Octan sodný (4,1 g) se rozpustí v destilované vodě a doplní se na objem 1000 ml destilovanou vodou.

B. Naředí se 3,0 g ledové kyseliny octové v destilované vodě a doplní se na objem 1000 ml destilovanou vodou.

Pomocí roztoku B se upraví pH roztoku A na pH 6,50.

4. Reagens z kyseliny dinitrosalicylové

Do cca 800,0 ml destilované vody se nasuspenduje 20,0 g 3,5-dinitrosalicylové kyseliny a za stálého míchání se postupně přidá 300,0 ml roztoku hydroxidu sodného, připraveného rozpuštěním 32,0 g hydroxidu sodného ve 300,0 ml destilované vody. Poté se vzniklá suspenze zahřeje na vodní lázni, přičemž teplota nesmí přesáhnout 48 °C a směs se míchá tak dlouho, dokud nevznikne čirý roztok. Poté se přidá postupně 600,0 g vínanu sodnodraselného a roztok se zahřívá tak, aby teplota nepřesáhla 48 °C a v případě potřeby tak dlouho, dokud se roztok nevyčeří.

Roztok se poté doplní na 2000 ml destilovanou vodou a zfiltruje se přes hrubý skleněný sintr (slinuté zrněné sklo).

Takto připravené reagens se skladuje v tmavé lahvi při teplotě místnosti. Reagens je stálé maximálně po dobu 6 měsíců.

Postup

1. Vzorek enzymu

Teplota zředěného roztoku enzymu (1,0 ml) v 0,05M pufru octanu sodného (pH 6,50), se ustálí na 50 °C. Poté se přidá 1,0 ml xylanového substrátu a směs se míchá a inkubuje při teplotě 50 °C přesně po dobu 30 minut.

Po přidání reagens s kyselinou dinitrosalicylovou (3,0 ml) se směs za míchání povaří přesně po dobu 5,0 minut. Po ochlazení reakční směsi na teplotu místnosti v lázni se studenou vodou, se měří absorbance při 540 nm proti destilované vodě.

2. Slepý pokus s enzymem

Při teplotě 50 °C se inkubuje 1,0 ml xylanového substrátu po dobu 30 minut a poté se přidají 3,0 ml roztoku kyseliny dinitrosalicylové a směs se zamíchá. Poté se přidá 1,0 ml naředěného enzymu (v 0,05M pufru octanu sodného; pH 6,50); a směs se uvede do varu na dobu přesně 5,0 minut.

Po ochlazení v lázni se studenou vodou na teplotu místnosti se měří absorbance směsi při 540 nm proti destilované vodě.

-5CZ 285839 B6

Rozdíly v absorbanci mezi vzorkem enzymu a slepým vzorkem by měly být mezi 0,3 až 0,5.

3. Standardní kalibrační křivka

Připraví se standardní roztoky bezvodé xylózy v 0,05M pufru octanu sodného; pH 6,50. Koncentrace xylózy by se v těchto standardech měla pohybovat v rozmezí od 0,05 do 0,50 mg/ml. Do skleněné zkumavky se napipetuje 1,0 ml standardního roztoku; 1,0 ml xylanového substrátu a 3,0 ml reagens s kyselinou dinitrosalicylovou, a směs se míchá a povaří přesně po dobu 5,0 minut. Po ochlazení v lázni se studenou vodou se měří absorbance při 540 nm opět proti standardnímu slepému roztoku.

Ve standardním slepém roztoku je roztok xylózy nahražen s 1,0 ml 0,05M acetátového pufru; pH 6,50. Jinak je standardní srovnávací roztok zpracován stejným způsobem, jako standard s xylózou. Grafická závislost koncentrace xylózy je funkcí absorbance. Pro každé nové reagens s kys. dinitrosalicylovou je nutné připravit novou std. kalibrační křivku.

Výpočet

Aktivita xylanázy ve vzorku se propočte dle následující rovnice:

(A(X)-A(O)xK + C)x lOOOxDf

Aktivita (J/g) =---------------------------------------MW^xt

V uvedeném vzorci jednotkové symboly znamenají:

A(O) = absorbance slepého vzorku enzymu

A(X) = absorbance vzorku enzymu

K = sklon standardní (kalibrační) křivky

C = úsek xylózové standardní křivky

1000 = faktor; mmol —> pmol

Df = faktor zředění (ml/g)

MW_xyi = molekulární hmotnost xylózy (150,13 mg/mmol) t = reakční doba (30 minut)

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří použití termostabilní xylanázy, získatelné z mikroorganizmů Microtetraspora flexuóza, přičemž xylanáza je charakterizována stálostí při zahřátí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností enzymu snižovat viskozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,5 a teplotě 40 °C na stejnou viskozitu ± 0,01 Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu, jako přídatného krmivá.

Xylanáza je výhodně schopna snižovat, ve srovnání s nezahřívanou kontrolou, viskozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,50 a teplotě 40 °C, na stejnou finální viskozitu, tj. ± 0,0005 Pascal x sekund.

Metoda stanovení aktivity xylanázy, uvedená výše, je založení na snižování viskozity in vitro, za použití pšeničného arabinoxylanu, jako viskózního substrátu, za podmínek, které napodobují podmínky zjištěné v gastrointestinálním traktu zvířete.

-6CZ 285839 B6

Takováto metoda in vitro funguje jako ukazatel, zda xylanáza (nebo směs xylanáz), by mohla vykázat žádaný efekt při snižování viskozity v trávicím traktu v případě jejího (jejich) použití jako doplňku v krmných směsích pro zvířata.

Všechny podrobnosti o metodě, založené na snižování viskozity a používané pro měření účinnosti xylanázy snižovat viskozitu, jsou uvedeny dále.

Metoda je ve všech případech prováděna duplicitně.

Xylanázový enzym, který má být hodnocen, je zředěn s 0,lM pufrem fosforečnanu sodného, majícího pH 6,50, přičemž koncentrace xylanázy je upravena tak, aby výsledný roztok vykazoval xylanázovou aktivitu v koncentracích jedné jednotky na 1,0 ml.

Tato xylanázová aktivita je určována dle metody pro stanovení xylanázové aktivity, popsané podrobněji výše.

Roztok enzymu o koncentraci 100 μΐ byl přidán ku 400 μΐ roztoku pšeničného arabinoxylanu (získaného od firmy Megazyme, Austrálie) v 0,lM roztoku fosforečnanu sodného; pH 6,50; předloženého ve skleněné zkumavce, takže finální koncentrace enzymu byla 0,2 jednotek/ml a koncentrace pšeničného arabinoxylanu byla 1% (hmotnostní poměr).

Zkumavky, obsahující roztok, byly poté pevně uzavřeny a umístěny ve vodní lázni, nastavené po určitou dobu na teplotu 95 °C, typicky 1,0 minutu, nebo 5,0 minut. Po tomto zahřátí byly zkumavky ochlazeny v ledové lázni.

Viskozita výsledného roztoku byla měřena po 20 minutách při teplotě 40 °C, za použití Bromfieldova SC-IV, CP 40 viskozimetru, nastaveného na měření viskozity jednou za sekundu.

Použití termostabilní xylanázy, jako doplňku pro krmné směsi pro zvířata, je dle předloženého vynálezu výhodné, protože aktivita xylanázy není po smísení s ostatními složkami krmivá podstatněji snížena, a po zpracování konvenčními postupy, používanými při výrobě krmiv, například při použití expanderu nebo extruderu.

Termostabilní xylanázu, použitelnou dle postupu popsaném v předloženém vynálezu, lze získat z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza.

Izolace termostabilních xylanáz z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza je podrobně popsána dále.

Bylo zjištěno, že z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza lze případně izolovat 5 různých termostabilních xylanáz.

Odkaz na tyto xylanázy, označené 1 až 5, je uveden dále.

Tyto xylanázy byly přečištěny tak, až byly homogenní, jak bylo zjištěno pomocí stříbrem značených izoelektrických fokusačních gelů. Xylanázy byly přečištěny kombinovaným použitím chromatografie na iontoměničích a hydrofobní interaktivní chromatografií.

Každá přečištěná xylanáza je v širokém rozsahu pH charakterizována jako termostabilní.

Specificky si každá xylanáza zachovává v rozmezí pH 6,0 až 9,0 vyšší, jak 80% aktivitu.

-ΊCZ 285839 B6

Xylanázy mohou být charakterizovány dále následovně:

Xylanáza 1,	má molekulovou hmotnost cca 33.000 a pl cca 8,5. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje při teplotě 70 °C a v rozmezí pH 7,0 až 7,50.
Xylanáza 2,	má molekulovou hmotnost cca 13,300 a pl cca 7,50. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje při teplotě cca 65 °C a v rozmezí pH 7,0 až 7,50.
Xylanáza 3,	má molekulovou hmotnost cca 31.000 a pl cca 6,20. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje okolo pH 7,50 a při teplotě cca 65 °C.
Xylanáza 4,	má molekulovou hmotnost cca 50.000 a pl cca 5,80. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje při pH cca 7,50 a při teplotě cca 65 °C.
Xylanáza 5,	má molekulovou hmotnost cca 35.000 a pl cca 7,50. Maximální enzymatickou aktivitu vykazuje při pH cca 5,30 a při teplotě cca 70 °C.

Xylanázy z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza mohou být na základě předloženého vynálezu použity buď jako směs pěti xylanáz, tj. jako celkový xylanázový supematant, nebo jednotlivě, nebo jako kombinace jednotlivých xylanáz.

Alternativní způsob přípravy xylanáz, vhodných pro použití dle předloženého vynálezu, zahrnuje jejich získání pomocí technik rekombinace DNA za pomoci vhodného hostitelského mikroorganizmu, který produkuje žádanou termostabilní xylanázu.

Tak může být xylanáza získána z hostitelského mikroorganizmu způsobem, kdy by byl hostitelský bakteriální nebo fungální kmen geneticky manipulován vneseným zakódovaným genem pro termostabilní xylanázu z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza.

Xylanázy 1 až 5, získané z Microtetraspora flexuóza, mohou být odvozeny z kmene, označeného jako ATCC 35.864 a deponovaného ve sbírce mikroorganizmů instituce ATCC, Bethesda, Sev. Dakota (USA), kde lze tento kmen snadno získat.

Izolace nových xylanáz zahrnuje čisticí operace mimobuněčných xylanáz kombinovaným použitím chromatografie na iontoměničích a hydrofobní interaktivní chromatografie v sestavě, závislé na xylanáze, která má být přečištěna.

Dále jsou popsány dva čisticí postupy, použitelné pro izolaci a charakterizaci pěti chemicky odlišných xylanáz, získaných z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza.

Obě metody zahrnují odstranění buněk Microtetraspora flexuóza odstředěním a zahuštěním kultivačního média pomocí ultrafiltrace.

Při prvé metodě jsou odděleny a přečištěny:

Xylanáza 1; (pl = 8,0);

a

Xylanáza 2; (pl = 7,5);

a

Xylanáza 3; (pl = 5,8);

Všechno kultivační médium, zbavené buněk, se aplikuje na sloupec měniče iontů anex a poté se promyje a naředí za zvyšujícího se gradientu chloridem sodným.

-8CZ 285839 B6

Po shromáždění frakcí je xylanázová aktivita měřena pomocí metody, zahrnující použití s remazolovou briliantovou modří zbarveného xylanu z březového dřeva (RBB- xylanová metoda).

Xylanáza 1 a xylanáza 2 se eluují při průchodu sloupcem. Protékající kapalina je shromažďována a znovu nanesena na hydrofobní interaktivní sloupec (fenyl-Sepharosa).

Xylanáza 1 a xylanáza 2 se od sebe separují elucí sloupce, při použití zvyšujících se koncentrací ethylenglykolu.

Xylanáza 4 se váže na sloupci anexu a eluuje se za použití solného gradient spolu s dalšími vázanými xylanázami (xylanázy 3 a 5).

Xylanáza 4 byla oddělena od ostatních xylanáz pomocí hydrofobní interaktivní chromatografie, jak je mnohem obšírněji popsáno dále v příkladu 1.

Přečištěné xylanázy 1; 2; a 4; byly dále analyzovány izoelektrickou fokusací a hmotnostní spektroskopií, nebo elektroforézou na Na-dodecylsulfátovém-polyakiylamidovém gelu.

Při použití druhé metody, je výše popsané, buněk zbavené kultivační médium zpracováno v prvém stupni pomocí hydrofobní interaktivní chromatografie za účelem přečištění xylanázy 3 (pí = 6,20) a xylanázy 5 (pí = 5,30).

Obě zmíněné xylanázy jsou eluovány společně při stejné koncentraci síranu amonného.

Pro vzájemnou separaci xylanázy 3 od xylanázy 5, byla použita pro zpracování shromážděného eluovaného enzymatického materiálu, chromatografie na iontoměniči anexu.

Xylanáza 3 se eluuje na sloupci anexu při nižších koncentracích sole než je to u xylanázy 5. Obě přečištěné xylanázy byly po prvé charakterizovány pomocí izoelektrické fokusace a hmotnostní spektroskopií, nebo elektroforézou na Na-dodecylsulfátovém-polyakrylamidovém gelu.

Každá jednotlivá xylanáza byla odlišena od ostatních na základě svých unikátních biochemických charakteristik, např. molekulové hmotnosti; pí; optimální teploty a pH; hydrofobních vlastností a tepelné stability.

Všech pět xylanáz je odolných vůči teplotám až do 90 °C a alkalickému prostředí v rozmezí pH 7,00 až 10,00.

Všech pět přečištěných xylanáz vykazuje poločas při teplotě 80 °C v rozmezí od 30 minut do 110 minut.

Další charakterizace každé z pěti xylanáz, přečištěných do homogenního stavu, je popsána dále v referenčním příkladu 2.

Další aspekt zahrnuje, v rámci předloženého vynálezu, předpokládané krmné směsi, obsahující fyziologicky přijatelný nosič a termostabilní xylanázu, získanou z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza, charakterizovanou schopností tolerovat zahřívání po dobu 1,0 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C, aniž by došlo k podstatnějším ztrátám aktivity, jak bylo zjištěno stanovením schopnosti enzymu snižovat, ve srovnání s nezahřívanou kontrolou, viskozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,50 a při teplotě 40 °C, na stejnou finální viskozitu, tj. ± 0,001 Pascal x sekund.

Vzhledem k tomuto aspektu, může být použita termostabilní xylanáza buď samotná, nebo ve formě směsi výše popsaných xylanáz.

-9CZ 285839 B6

Z aspektů předloženého vynálezu je jako fyziologický vhodný nosič upřednostňována obilovina, nebo produkt z obilovin. Takové obiloviny zahrnují mletou pšenici, kukuřici, sóju a dále cukry, škroby, nebo další produkty ze zmíněných surovin.

Zmíněné nosiče jsou z hledisek předloženého technického řešení běžné a proto nejsou dále podrobněji popisovány.

Z tohoto aspektu, zahrnutého do předloženého vynálezu, jsou krmné doplňky kombinovány s dalšími krmnými složkami, s cílem, zajištění produkce na obilovinách založených krmiv.

Tyto a ostatní krmné složky zahrnují jeden nebo více dalších (výhodně termostabilních) enzymatických doplňků, vitaminové krmné doplňky, krmné doplňky s obsahem minerálů a krmné doplňky s obsahem aminokyselin.

Výsledný (kombinovaný) krmný doplněk může být, včetně některých možných odlišných typů sloučenin, smíchán poté ve vhodném množství s dalšími krmnými složkami, jako jsou např. obiloviny a proteinové doplňky, a tak připravit krmivo pro zvířata.

Výrobní technologie, zahrnující zpracování zmíněných složek do krmných směsí pro zvířata, mohou být realizovány na běžně používaných výrobních aparaturách, jako jsou např. stroje na výrobu dvojitých pelet, parní peletizační zařízení, expander a extruder (výtlačný lis).

Přítomnost termostabilní xylázy ve finálním, na obilovinách založeném krmivu, ovlivňuje snižování ukazatele FCR, tj. míry využití krmivá v relaci spotřebovaného krmivá ku přírůstkům hmotnosti zvířat. Xylanáza může alternativně a nebo dodatečně stimulovat trávicí proces na obilovinách založeného krmivá. Další působení xylanázy může alternativně nebo dodatečně zvyšovat hodnoty přírůstků hmotnosti u zvířete, v závislosti na jednotce množství krmivá, které zvíře zkonzumuje.

Předložený vynález zahrnuje další aspekt, tj. na obilovinách založené krmivo, obsahující alespoň 20% obilovin (hmotnostní poměry) a 0,00001 g až 1,0 g termostabilního, xylanázového proteinu, na 1,0 kg krmivá, přičemž xylanáza, kterou lze získat z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza, je charakterizována schopností tolerovat zahřívání po dobu 1,0 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C, aniž dojde k podstatným ztrátám aktivity, jak bylo stanoveno na základě schopností zmíněné xylanázy snižovat, ve srovnání s nezahřívanou kontrolou, viskozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu, při pH 6,50 a teplotě 40 °C, na stejnou finální viskozitu, tj. ± 0,001 Pascal x sekund.

Na základě uvedeného aspektu, zahrnutého do předloženého vynálezu, může být termostabilní xylanáza použita opět jako samotná nebo ve směsi termostabilních xylanáz, popsané už výše.

V takovémto, na obilovinách založeném krmivu, je výhodnější, aby alespoň jedna z obilovin, byla pšenice, ječmen, kukuřice, čirok, žito, oves, jiné obiloviny pšeničného typu a rýže.

Zejména je výhodné, kdyby obilovina byla pšenice.

Na obilovinách založené krmivo může být dle předloženého vynálezu použito k výkrmu zvířat, jako jsou krocani, husy, kachny, ovce a skot. Je však zejména výhodné, že zmíněné krmivo lze používat ku krmení prasat nebo drůbeže, a zvláště kuřat-broilerů.

Je výhodnější, když na obilovině založené krmivo zahrnuje 0,0001 g až 1,0 g xylanázového proteinu na 1,0 kg krmivá a nej výhodnější je 0,001 g až 1,0 g/kg.

-10CZ 285839 B6

Na obilovině založené krmivo obsahuje alespoň 20 % obiloviny (hmotnostní poměry). Výhodněji by mělo zahrnovat alespoň 30 % (hmotnostní poměry) obilovin a nejvýhodněji alespoň 50 % (hmotnostní poměry) obilovin.

Obilovina může být jedna už z výše zmíněných obilovin, z nichž je zejména pšenice zvláště výhodná.

Ačkoliv obilná složka v krmivu založeném na obilovinách je zdrojem proteinu, je obvykle nutná zahrnout do krmivá ještě dodatkové zdroje proteinu, například takové, které jsou odvozené od rybí moučky, masných produktů nebo rostlinného materiálu.

Zdroje proteinů rostlinného původu zahrnují alespoň jeden z následujících zdrojů, tj. tuky obsahující sojové boby, řepkové semeno, canolu, sojovou moučku, moučku z řepkového semene a moučku z canoly.

Ve srovnání s konvenčními krmivý, relativní množství dalších zdrojů proteinů, jako je rybí moučka, moučka z masných produktů nebo rostlinné proteiny, může být při využití poznatků uváděných v předloženém vynálezu omezováno a tím významně přispět i k úsporám nákladů, protože relativní náklady na obiloviny jsou podstatně nižší než u konvenčních proteinových doplňků.

Z těchto hledisek lze ve srovnání s konvenčními krmivý připravit, na základě poznatků uváděných v předloženém vynálezu, krmivo o stejné nutriční hodnotě, vyjádřenou dostupnou energií, hodnotami aminokyselin a proteinů, které ale obsahuje relativně vyšší podíl obilovin a relativně nižší podíl proteinových doplňků.

Bylo také zjištěno, že zahrnutí termostabilní xylanázy do krmivá pro zvířata umožní snížit obsah energeticky bohatých doplňků, jako jsou tuky a oleje, které je jinak zapotřebí použít, aby se docílilo určitých nutričních efektů.

Použití termostabilní xylanázy v krmivech pro zvířata umožňuje, na základě předloženého vynálezu, zvýšení nutričního využití surových proteinů a/nebo efektivitu trávicího procesu a/nebo obsahu aminokyselin, a/nebo koeficientu trávení krmivá, které umožňuje snížit množství alternativních zdrojů proteinu a/nebo doplňků aminokyselin, které musely být dříve do receptur krmných směsí zabudovány.

V případě, že koeficient trávení a/nebo obsah dostupného surového pšeničného proteinu, je při použití termostabilní xylanázy zvýšen, lze zjistit podstatné úspory v důsledku sníženého obsahu proteinů a/nebo energetických doplňků, které je jinak zapotřebí při konvenční přípravě do krmných směsí dodat.

Při alternativě, kdy se po přídavku termostabilní xylanázy zvýší pouze obsah aminokyselin, nebo hodnoty trávicího koeficientu, lze zjistit významné úspory v důsledku sníženého obsahu doplňkových aminokyselin, které by bylo nutné jinak při konvenční přípravě do krmných směsí přidávat.

Krmné směsi, připravené dle předloženého vynálezu, mohou také zahrnovat i jiné enzymatické doplňky, jako jsou například jednu nebo více beta-glukanáz, glukoamyláz, mannáz, alfagalaktosidáz, fytáz, lipáz, alfa-arabinofuranosidáz, proteáz, alfa-amyláz a pektináz.

Zejména výhodné je zahrnout do krmných směsí, jako další enzymatický doplněk, proteázu, jako je například substilisin, získávaný pomocí mikroorganizmu rodu Bacillus.

Takové substilisiny jsou například popsány podrobně v US patentové přihlášce A—4- č. 760.025.

-11CZ 285839 B6

Výhodně lze krmnou směs získat na základě předloženého patentu přípravou krmných doplňků, skládajících se z fyziologicky vhodného nosiče a termostabilních xylanáz, a smíšením těchto doplňků v množstvích od 0,01 g do 50,0 g na 1,0 kg, s ostatními složkami krmivá pro zvířata (včetně obilovin a ostatních zdrojů proteinových doplňků), ještě výhodnější v množstvích 0,1 až 10,0 g/kg, a nejvýhodněji v množstvích cca 1,0 g/kg.

Na následujících stranách je uveden krátký popis každého ze tří obrázků, týkajících se této specifikace.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1, zobrazuje profil pH aktivit pěti přečištěných xylanáz z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza.

Obrázek 2, zobrazuje tepelný profil aktivit pěti přečištěných xylanáz z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza.

Obrázek 3, zobrazuje profil tepelné stability pěti přečištěných xylanáz z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza.

Předložený vynález je dále podrobněji objasněn pomocí dále uvedených Referenčních příkladů a příkladů.

Příklady provedení vynálezu

Referenční příklad 1

Čištění pěti xylanáz získávaných z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza.

Metoda stanovení xylanáz

Přítomnost xylanázy byla stanovena pomocí s ramazalovou briliantovou modří značeného xylanového substrátu z březového dřeva (RBB-xylen), přičemž dodavatelem zmíněného substrátu je firma Magazyne, (Austrálie).

Vzorky (200 μΐ) jsou smíchány s 250,0 μΐ roztoku substrátu (2%; hmotnost/objem) RBB-xylanu, v 50 mM citrátu sodného; pH 6,50; a jsou inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 10,0 minut.

Nestrávený xylan je vysrážen přídavkem 1,0 ml 95% ethanolu a odstředěním je odstraněn.

Uvolněné barvivo, zbývající v roztoku, je kvantitativně vyhodnoceno spektrofotometricky (OD590), ve srovnání s ethanolem, jako slepým vzorkem, aje proporcionálně použito při měření aktivity xylanázy.

Aktivita může být vyjádřena kvantitativně za použití standardní kalibrační křivky a je vyhodnocena ve formě Xaj/ml (XAU/ml), tj. aktivita xylanázy vyjádřená v jednotkách, v 1,0 ml.

Překrývací gelová metoda, použitelná pro zjištění přítomnosti více xylanáz a stanovení jejich izoelektrických bodů (pl), byla rovněž vyvinuta pro použití s RBB-xylanového substrátu.

-12CZ 285839 B6

Izoelektrické fokusační gely (pH gradient 3,0 - 9,0), jsou pokryty mletou agarosovou/suspenzí substrátu (4% /hmota/objem/ agarosy; dále 7,0 mg/ml RBB-xylan; 0,5% /objem/objem/ glycerol v 50,0 ml roztoku citrátu sodného /pH 6,50/), ajsou inkubovány při teplotě 37 °C.

Po cca 1,0 hodině je aktivita xylanázy patrná z vyjasněných zón. Gely jsou ponechány samovolně vyschnout a poté jsou uloženy.

Izoelektrický bod xylanázy je stanoven ve srovnání se současně analyzovanými izoelektrickými fokusačními gely, obsahujícími stříbrem značené standardy izoelektrického bodu.

Vzorek

Buněk prostý supematant fermentačního média mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza; ATCC 15.864, (cca 14 Xaj,/ml), byl 5x zahuštěn pomocí ultrafiltrace (Amicon- míchání buněk; 350 ml; PM-10 membrána).

Všechny vzorky byly filtrací sterilizovány. Koncentrace proteinů byla 12,50 mg/ml, jak bylo stanoveno metodou BCA (Pierce).

Překrývací gelovou analýzou byla stanovena přítomnost pěti xylanáz; izoelektrický bod 8,50; 7,50; 6,20; 5,80 a 5,30.

Těchto pět xylanáz je dále v předložené specifikaci zmiňováno jako xylanázy 1, až případně 5.

Čisticí postupy

Jak je uvedeno dále, byla pro čištění všech pěti xylanáz použita kombinace chromatografie na iontoměničích a hydrofobní interaktivní chromatografie.

Přečištění xylanáz 1 a 2

Jako prvý krok, byla použita pro přečištění xylanázy 1 a 2, chromatografie na iontoměničích.

Zahuštěný vzorek byl kompletně dialyzován proti 10 mM roztoku tris-HCl+ pH 9,0 (pufr A).

Na standardní chromatografický sloupec (Pharmacia C 16/40), vyplněném se 72,0 ml iontoměniče Q-Sepharose-HP (Pharmacia) a uvedeného do rovnovážného stavu s pufrem A, za použití průtoku 1,0 ml/min, a systému Pharmacia PCL, bylo aplikováno 50,0 ml koncentrovaného vzorku.

Sloupec byl promyt s 50,0 ml pufru A a poté eluován se 400,0 ml solného, lineárně stoupajícího gradientu, pufrem A, až ku koncentraci 0,25M chloridu sodného v pufru A.

Poté byl ze sloupce vymyt zbývající, vázaný protein, s 2M NaCl v pufru A.

Byly shromážděny frakce o objemu 10,0 ml, které byly poté hodnoceny výše popsanými postupy.

Xylanázy 1 a 2 se vymývají společně ze sloupce za počátečního průtoku, přičemž značné množství zbytkového proteinu je na sloupci vázáno (xylanázy 1 a 2 představují na sloupci nevázané frakce).

Po přečištění a izolaci xylanázy 1 a 2 byla ve druhém stupni použita hydrofobní interaktivní chromatografie.

-13CZ 285839 B6

Aktivní frakce byly shromážděny a upraveny na konečnou 0,2M koncentraci síranu amonného přídavkem 2M roztoku síranu amonného.

Přidáním 50M roztoku citrátu sodného; pH 6,50; byla upravena finální koncentrace na 10 mM a tento materiál (cca 100 ml) byl aplikován na standardní chromatografický sloupec (Pharmacia C 16/20), naplněný se 36,0 ml Phenyl-Sepharosy Cl—48 (Pharmacia), a uvedeného do rovnovážného stavu se směsí roztoku 0,2M síran amonný /10 mM citrát sodný; pH 6,50; (pufr B), s průtokem 0,5 ml/min.

Poté byl sloupec promyt se 60,0 ml pufru B a následně eluován s postupně klesající koncentrací solného roztoku se 70,0 ml 10 mM citrátu sodného; pH 6,5; (pufr C), na postupně klesající 10% koncentraci (objem/objem) ethylenglykolu v 50,0 ml pufru C, při aplikaci 200,0 ml lineárního gradientu ethylenglykolu 10-32%, promytim s 80,0 ml 32% ethylenglykolu a dále se 150,0 ml, gradientovým promytim, 32% - 38% ethylenglykolem a nakonec až postupně se 70,0 ml na 50% zvyšující se koncentraci ethylenglykolu, kterými bylo promytí sloupce dokončeno.

Byly jímány frakce o objemu 10,0 ml, podobným způsobem, jako je popsáno výše.

Za uvedených podmínek byly získány homogenní eluáty xylanázy 2 při promývání s 32% ethylenglykolem, zatímco homogenní eluáty xylanázy 1 byly zaznamenány až v konečných fázích (chvostu) chromatografie, při použití 32- 38% gradientu ethylenglykolu.

Přečištění xylanázy 4

Za použití výše popsaného prvého stupně při čisticích postupech xylanázy 1 a 2 (chromatografie na iontoměničích), byly společně eluovány při cca 0,16M NaCl v pufru A, i xylanázy 4 a 5.

Aktivní frakce byly shromážděny a přeneseny do směsi 0,4M roztoku síranu amonného/10 mM citrát sodný; pH 6,50; (pufr D), podobným postupem, popsaným výše.

Materiál, cca 100,0 ml, byl nanesen rychlostí 1,0 ml/min na sloupec hydrofobní interaktivní chromatografie, popsané výše, který byl stabilizován do rovnovážného stavu s pufrem D.

Poté byl sloupec promyt s 50,0 ml pufru D, a eluován v lineárním gradientu se 30,0 ml pufru D, až k pufru C, a bezprostřední následnou gradientovou elucí se 200,0 ml pufru C, do 50% ethylenglykolu.

Byly jímány frakce o obsahu 10,0 ml a byly vyhodnoceny analyticky stejným postupem, popsaným výše.

Xylanáza 4 se eluuje při cca 20 % ethylenglykolu.

Přečištění xylanáz 3 a 5

V případě xylanáz 3 a 5 byla jako prvý stupeň použita hydrofobní interaktivní chromatografie.

Zahuštěný vzorek byl vnesen do 0,5M roztoku síranu amonného v pufru C, přidáním 2M roztoku síranu amonného a roztoku 50 mM citrátu sodného; pH 6,50; postupem, popsaným už výše.

Po zfiltrování celkového materiálu byly stopy sraženiny odstraněny a 50,0 ml filtrátu bylo aplikováno při rychlosti průtoku 1,0 ml/min na výše popsaný sloupec hydrofobní interaktivní chromatografie, který byl uveden do rovnovážného stavu s 0,5M roztokem síranu amonného v pufru C (pufr E).

-14CZ 285839 B6

Chromatografický sloupec byl poté promyt s 87,50 ml pufru E, a poté byl v lineárním gradientu promyt se 147 ml pufru E až k pufru C.

Byly jímány frakce o obsahu 10,0 ml a vyhodnoceny stejným postupem, popsaným výše.

Xylanázy 3 a 5 byly společně eluovány při koncentraci cca 0,05 síranu amonného.

Pro izolaci a přečištění xynaláz 3 a 5, byl použit postup chromatografie na iontoměničích, popsaný výše v prvém stupni.

Aktivní frakce, získané pomocí hydrofobní interaktivní chromatografie, byly shromážděny (70,0 ml), kompletně dialyzovány proti 10 mM tris-HCl; pH 8,0 (pufr F), a dle výše popsaného postupu byly zahuštěny na cca 20,0 ml.

Při průtoku 1,0 ml/min byl aplikován materiál na chromatografický sloupec s iontoměničem, popsaným výše, a poté byl uveden do rovnováhy s pufrem F.

Po promytí sloupce se 150,0 ml pufru F, byla provedena eluce se 150 ml pufru F v lineárním gradientu ku 0,25M NaCl v pufru F.

Byly jímány frakce o obsahu 10,0 ml a byly vyhodnoceny analytickými postupy, popsanými výše.

Xylanáza 3 byla eluována při cca 0,05M NaCl, zatímco xylanáza 5 byla eluována při cca 0,15M NaCl.

Referenční vzorek 2

Charakterizace pěti xylanáz produkovaných mikroorganizmem Microtetraspora flexuóza.

Po přečištění byla každá xylanáza podrobena izoelektrické fokusaci a dále popsanými postupy byla stanovena molekulová hmotnost.

Výsledky biochemické charakterizace xylanáz jsou uvedeny v tabulce 1.

Techniky izoelektrické fokusace byly realizovány pomocí PhastSysternu (Pharmacia Biotech), dle návodu výrobce.

Markéry (ukazatele) použité pro stanovení izoelektrického bodu (pl) byly k dispozici v široké škále soupravy pro stanovení izoelektrického bodu, tj. v rozmezí 3,5 až 9,3 (Pharmacia Biotech).

Detekce proteinů, byla prováděna na základě příslušných instrukcí, pomocí vizualizace stříbrem vyvolaného značení.

Stanovení molekulární hmotnosti bylo prováděno dvěma postupy:

Elektroforézou na Na-dodecyl-polyakrylamidovém gelu a hmotnostní spektroskopií.

Elektroforéza na Na-dodecyl-polyakrylamidovém gelu a následná vizualizace detekcí stříbrem byla prováděna za použití Phast systému, jak je popsáno výše.

-15CZ 285839 B6

Tabulka 1

Microtetraspora flexuóza

Xylanázy

Číslo	pí	Molekulová hmotnost/kD) - metoda	pH	Teplota
Optimum	Stabilita	Optimum (°C)	Poločas stability při 80°C (min)
1	8,5	33,1-MS	7,0 - 7,50	6,0 - 8,5	70 °C	110
2	7,5	13,3-MS	7,0 - 7,50	6,0 - 8,0	65 °C	55
3	6,2	31,0-SDS	7,50	6,0-9,0	65 °C	30
4	5,8	50,0 - SDS	7,50	6,0-9,0	65 °C	90
5	5,3	35,0-SDS	7,50	6,0-9,0	70 °C	30

Poznámka:

pí = izoelektrický bod

MS = hmotnostní spektroskopie

SDS = elektroforéza na Na-dodecyl-polyakrylamidovém gelu

Markéry, použité pro stanovení molekulové hmotnosti, byly of firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis; Montana/USA/).

Hmotnostní spektroskopie byla prováděna firmou Charles Evans se sp.; (301 Chesapeake Drive; Redwood City; Kalifornie, 94063 /USA/).

Optimum pH bylo stanoveno pomocí metody RBB, popsané už výše, s tím rozdílem, že pufry se lišily v závislosti na měřeném rozsahu pH, např. pH 4,5 až 12 (viz obrázek 1).

Příprava příslušných pufrů o selektivním pH, potřebných pro použití v rámci příslušných metod, je v možnostech příslušných odborných pracovníků.

Teplotní stabilita představuje dobu, po kterou přetrvává při dané teplotě ještě polovina aktivity. Aktivita je měřena přibližně při 18-37 °C. Vzorek je inkubován při dané teplotě a aktivita je měřena pomocí RBB metody.

Poločas znamená čas v minutách, kdy polovina aktivity už vymizela, (viz obrázek 3).

Teplotní optimum je teplota, při které je zjištěna nejvyšší aktivita.

Na obrázku 2 je vyznačen teplotní profil xylanáz 1 až 5, měřený za použití RBB metody.

V obou obrázcích, tj. 1 a 2, jsou procenta maximální aktivity srovnávána s nejvyšší aktivitou měřenou při dosažené hodnotě 100 % a všechny ostatní údaje jsou vztaženy při měření relativně ku standardům.

Příklad 1

Xylanázy 1 až 5, získané z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza; xylanáza TfxA z mikroorganizmu Termonospora fúsca; a xylanázy, získané z mikroorganizmu Trichoderma viride

-16CZ 285839 B6 a Aspergillus niger, byly testovány za účelem stanovení jejich reaktivních schopností snižovat viskozitu pšeničného arabinoxylanového substrátu, dle metody, používané pro stanovení snížené viskozity, a popsané podrobně výše.

Pro každou směs enzymů byla viskozita stanovena bez tepelného kontrolního zpracování a poté po tepelném zpracování po dobu 1,0 minuty, respektive 5 minut, ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C.

Výsledky těchto stanovení jsou shrnuty v tabulce 2.

Z výše uvedených výsledků vyplývá, že působení teploty 95 °C na všechny xylanázy, nebo směsi xylanáz, po dobu 5 minut, významně snižuje aktivitu xylanáz, jak bylo zjištěno metodou, založené na snižování viskozity.

Je ale nutno také poznamenat, že viskozita měřená u prvé xylanázy, vystavené teplotě 95 °C po dobu 1,0 minuty, se podstatně nelišila od kontrolního stanovení, tj. v rozmezí ± 0,001 Pascal sekund.

Na druhou stranu je ale zřejmé, že xylanázy získané z mikroorganizmů T.viride a A.niger, jsou mnohem citlivější vůči působení tepla, ve srovnání s termostabilními xylanázami, používanými v předloženém vynálezu.

Tabulka 2

Xylanáza	Kontrola (postup bez) zahřívání	Viskozita (Pa.s) - 20 minut (při 40 °C) - po vystavení působení teploty 95 °C po dobu:
1,0 minuta	5,0 minut
Xylanázy 1-5 z mikroorganizmu M. flexuóza Xylanáza TfxA z mikroorganizmu T. fusca Xylanáza z mikroorganizmu T. virida Xylanáza z mikroorganizmu A. niger	1.8 x 10’³ 7.9 x 10’³ 2,0x10’³ 1,4 x 10’³	1,8 x IO’³8,2x10’³ 1.1 x 10’² 7.2 x 10’³	8,8 x 10^-3 1,6 x 10’² 1,1 x 10’² 7,3 x 10’³

Poznámka:

Pa.s = Pascal x sekunda

Příklad 2

Termostability jednotlivých xylanáz 1 a 2, získané z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza, byly stanoveny metodou snížené viskozity, použité v příkladu 1.

Stejně jako v příkladě 1, byla provedena současně pro každou xylanázu kontrola, která nebyla vystavena tepelnému působení.

Opět byly provedeny dvě tepelné operace, kdy enzymy byly zahřívány po dobu 1,0 minuty a 5 minut ve vodní lázni, nastavení na teplotu 95 °C.

Výsledky těchto analýz jsou shrnuty v další tabulce 3.

-17CZ 285839 B6

Z výsledků, uvedených v tabulce 3 vyplývá, že viskozita, měřená u obou xylanáz, tj. 1 a 2, po vystavení teplotě 95 °C po dobu 1,0 minuty, se pohybuje v rozmezí hodnot 0,00006 Pascal sekund, kontrolní viskozity.

Na základě těchto zjištění je zřejmé, že aktivita obou zmíněných xylanáz, není po vystavení teplotě 95 °C po dobu 1,0 minuty, podstatně snížena.

Tabulka 3

Enzym	Kontrola (postup bez) zahřívání	Viskozita (Pa.s) po vystavení působení teploty 95 °C po dobu:
1,0 minuta	5,0 minut
Xylanáza 1 Xylanáza 2	1,7 x 10~³ 1,7 x 10“³	1,9 x 10’³ 2,3 x 10’³	2.4 x 10’³ 2.5 x 10’³

Poznámka:

Pa.s = Pascal x sekunda

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití termostabilní xylanázy, získátelné z mikroorganizmů Microtetraspora flexuóza, přičemž xylanáza je charakterizována stálostí při zahřátí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností enzymu snižovat viskozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,5 a teplotě 40 °C na stejnou viskozitu ± 0,01 Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu, jako přídatného krmivá.
2. Použití podle nároku 1, při němž xylanáza má jeden z následujících souborů vlastností i) až v):

i) molekulová hmotnost 33 100, pí přibližně 8,5 a maximální účinnost při pH v rozmezí 7,0 až 7,5 při teplotě 70 °C, ii) molekulová hmotnost přibližně 13 300, pí přibližně 7,5 a maximální účinnost při pH v rozmezí 7,0 až 7,5 při teplotě 65 °C, iii) molekulová hmotnost přibližně 31 000, pí přibližně 6,2 a maximální účinnost při pH přibližně 7,5 a při teplotě přibližně 65 °C, iv) molekulová hmotnost přibližně 50 000, pí přibližně 5,8 a maximální účinnost při pH přibližně 7,5 a při teplotě přibližně 65 °C a

v) molekulová hmotnost přibližně 35 000, pí přibližně 5,3 a maximální účinnost při pH 7,5 a při teplotě přibližně 70 °C.

-18CZ 285839 B6
3. Přídatné krmivo, vyznačující se tím, že obsahuje fyziologicky přijatelný nosič a termostabilní xylanázu, získatelnou z mikroorganizmu Microtetraspora flexuóza, přičemž xylanáza je charakterizována stálostí při zahřátí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností enzymu snižovat viskozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,5 a teplotě 40 °C na stejnou viskozitu ± 0,01 Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu.
4. Přídatné krmivo podle nároku 3, vyznačující se tím, že nosičem je obilovina nebo materiál, od obiloviny odvozený.
5. Přídatné krmivo podle nároku 4, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje mletou pšenici, kukuřici, sóju nebo vedlejší produkt při zpracování těchto materiálů.
6. Krmivo na bázi obilovin, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň 20% hmotnostních obiloviny a dále obsahuje 0,00001 až lOg termostabilní xylanázy na kg krmivá, přičemž jde o xylanázu, získatelnou z mikroorganizmů Microtetraspora flexuóza, charakterizovanou stálostí při zahřátí na dobu 1 minuty ve vodní lázni, nastavené na teplotu 95 °C bez podstatné ztráty účinnosti, jak je možno stanovit schopností enzymu snižovat viskozitu 1% roztoku pšeničného arabinoxylanu při pH 6,5 a teplotě 40 °C na stejnou viskozitu ± 0,01 Ps, jako je tomu v případě nezahřátého kontrolního vzorku enzymu.
7. Krmivo na bázi obilovin podle nároku 6, vyznačující se tím, že jako obilovinu obsahuje alespoň jeden materiál ze skupiny pšenice, ječmen, kukuřice, čirok, rýže, oves, triticale a žito.